KR102119431B1

KR102119431B1 - 5' 보호 의존형 증폭

Info

Publication number: KR102119431B1
Application number: KR1020157000162A
Authority: KR
Inventors: 알렉산더 자이츠; 이름린드 가블러; 루카스 파울
Original assignee: 렉소겐 게엠베하
Priority date: 2012-07-10
Filing date: 2013-07-10
Publication date: 2020-06-08
Also published as: WO2014009413A3; EP2872628B1; JP2015521857A; EP2872628A2; US10538795B2; WO2014009413A2; AU2013288810A1; CA2878421C; DK2872628T3; AU2013288810B2; US20150147785A1; JP6219944B2; CA2878421A1; KR20150028982A; EP2684954A1; CN104428415A; CN104428415B

Abstract

본 발명은 5' 보호기를 포함하는 RNA로부터 라벨링된 핵산을 생성하는 방법에 관한 것이고, 상기 방법은 핵산의 탬플릿 가닥의 혼합물 얻고, 상기 혼합물은 상기 RNA와 5' 보호기를 포함하지 않는 잠재적으로 다른 핵산을 더 포함하고, 상기 RNA와 잠재적으로 다른 핵산의 탬플릿 가닥에 적어도 하나의 올리고뉴클레오티를 어닐링하고, 상기 프라이머를 탬플릿 서열 의존형으로 연장함으로써, 상기 탬플릿 가닥에 어닐링된 상보적 핵산 가닥을 얻고, 또는 2중 가닥 RNA에 그 탬플릿 가닥에 어닐링된 상보적 핵산 가닥을 제공하고, 필요에 따라서, 탬플릿 가닥의 5' 말단 또는 상보적 가닥의 3' 말단 중 어느 하나 또는 모두에 5' 보호기를 포함하지 않는 상기 핵산의 연장 생성물을 수식하고, 수식되지 않은 2중 가닥 핵산의 상보적 핵산을 라벨링하고, 상기 라벨링된 핵산은 RNA 탬플릿 가닥에 5' 보호기를 갖지 않고, 상기 5' 보호기는 수식 후에 필요에 따라서 제거되고, 및/또는 2중 가닥 의존형 라이게이션에 의해 상보적 핵산 탬플릿 RNA 가닥의 5' 보호기의 존재에 따라서 2중 가닥의 상보적 핵산을 라벨링함으로써 특이적으로 적어도 5' 보호기를 본래 포함하는 RNA에 상보적인 라벨링된 핵산을 생성하는 단계를 포함한다.

Description

5' 보호 의존형 증폭{5' PROTECTION DEPENDENT AMPLIFICATION}

본 발명은 핵산의 복합 혼합물을 분석하는 분야, 특히, 5'영역에서 다른 뉴클레오티드를 제공하는 핵산의 선택 및 분석, 특히, 메신저 RNA(mRNA) 등의 캐핑된 RNA의 정제 및 상기 RNA로부터 유래된 cDNA 복제의 농축 분야에 관한 것이다.

핵산은, 예를 들면 총 RNA 추출을 위한 경우와 같이 그들의 5' 말단에 다른 화학 구조를 제공할 수 있다. 예를 들면, 28S 및 18S 리보솜 RNA(rRNA의) 및 마이크로 RNA(miRNA는) 및 5' 분해 RNA는 5'모노포스페이트를 갖는다. 다른 RNA는 5S rRNA 중간체 등의 5' 디포스페이트 또는 18S rRNA 중간체 등의 5' OH 및 트랜스퍼 RNA(tRNA) 중간체를 갖는다. 원핵 세포의 mRNA는 5' 트리포스페이트를 갖고, 진핵 세포의 mRNA는 캡 구조(1)를 갖는다. 상기 캡 구조는 그 본질에 있어서 푸린환의 N7 상에 메틸화되고 그 5위치와 트리포스페이트 가교를 통하여 RNA의 다음 뉴클레오티드의 5' 위치를 연결하는 구아노신이다.

상기 RNA 5' 뉴클레오티드의 5' 위치 상의 다른 화학 구조는 RNA의 기능 및 합성과 분해의 경로에 관한 정보를 제공하기 때문에, 다른 5' 말단을 갖는 RNA를 선택하는 방법은 RNA의 분석을 위한 중요한 도구이다.

또한, DNA 분석을 위해서, PCR 등의 다수의 강력한 방법이 존재하는 바와 같이, 많은 하류 분석을 위해서, RNA가 cDNA로 역전사된다. 따라서, 특이적 5' RNA 말단 동정의 정보는 cDNA에 전사됨과 동시에, 상기 cDNA가 가능한 한 충실하게 RNA의 복제인 것이 가장 바람직하다. 이것은 전장 RNA 분자만이 RNA의 전체 서열 동정을 나타내는 바와 같이, RNA 분자의 전장 분석에 있어서 특히 중요하다.

각종 다른 종류의 RNA를 선택할 수 있는 수개의 방법이 존재한다. 예를 들면 진핵 세포의 mRNA는 캡 구조 및/또는 3' 폴리 A 태일에 기초하여 선택되는 경우가 많다. 본 기술분야에 있어서, 올리고 dT 컬럼크로마토그래피 등의 폴리 A 태일을 표적으로 하는 농축 프로세스가 공지되어 있다. 제 1 가닥 cDNA 합성 중에 올리고 dT 프라이밍은 역전사 동안의 mRNA를 복제하는 다른 프로세스이다. 그러나, 폴리 A 태일을 선택하는 방법은 5' 분해 또는 단편화된 mRNA 및 히스톤 mRNA 등의 폴리아데닐화되지 않은 임의의 RNA 종류에 대해서는 선택하지 않는다.

따라서, 캡 구조의 존재를 사용하여 mRNA 또는 그 cDNA를 정제 또는 농축하는 방법도 개발되어 있다.

예를 들면, 올리고 캐핑(2-4)은 mRNA의 5' 말단에 올리고뉴클레오티드를 부가하기 위해서 사용되는 하나의 방법이다. 이것은 RNA 샘플을 5' OH 및 캡구조만을 남겨 디포스포릴화하는데 요구되는 다단계 프로토콜이다. 이어서, 상기 캡은 연속 반응에 사용될 수 있는 5'모노포스페이트를 남긴 타바코 애시드 포스파타제(TAP)에 의해 분해되어 상기 5'모노포스페이트에 올리고뉴클레오티드를 라이게이팅한다. 본질적으로, 상기 올리고뉴클레오티드는 PCR 증폭에 의해, 예를 들면, 역전사 후에 선택할 수 있는 서열 태그를 제공한다. 본 발명자들은 전장 증폭 생성물의 선택과 관련하여 올리고 캐핑 방법을 사용하는 것(예를 들면, WO2007/062445호 참조)은 긴 RNA 분자를 분해하는, 사용된 복수 효소 단계로 인하여 올리고 캐핑은 짧은 RNA 분자로의 현저한 편향을 유도한다는 것을 발견하였다. 따라서, 방법은 증폭 및 캡 구조 선택 동안에 그 전장 서열 정보 또는 RNA를 보존하는 것이 바람직하다.

캡 트래퍼 방법(5;6)은 첫번째로 상기 캡을 바이오티닐레이팅하여 mRNA 서열을 선택하고, 이어서 상기 RNA를 역전사하는 다른 방법이다. 다른 단계에 있어서, RNAse I는 cDNA와 혼성되지 않는 모든 RNA를 가수분해하는데 사용된다. 이어서, 더욱 처리되는 전장 cDNA 복제를 효과적으로 선택하는, 자기 아비딘 비드와 상기 mRNA/cDNA 혼성물이 결합된다.

유사한 방법은 고체 지지체와 연결된 캡 결합 단백질(진핵 세포 개시 인자 4)을 사용하여 RNAse I 소화 단계와 관련하여 mRNA/cDNA 혼성물을 선택하는 CAPture(7) 및 EP 373 914 A2이다.

Efimove et al.(8) 및 US 6022715는 다단계 절차에 있어서, RNA의 캡과 올리고뉴클레오티드를 화학적으로 라이게이팅하는 방법을 제공한다.

다른 방법은 역전사 효소의 특성을 사용하여 캡에 도달하면 cDNA 가닥에 1-6 시토신(Cs)을 첨가해서 이들 Cs를 선택한다. 예를 들면, cDNA에 3-4 Cs의 존재에 따라서 CapSelect(9)는 어댑터와 cDNA를 라이게이팅하여 상기 태일링된 cDNA에 대한 증폭 동안에 농축된다.

US 5,962,271 및 US 5,962,272에 있어서, 상기 방법은 캡 의존형 C 첨가에 의해 보완되어 전장 cDNA를 농축할 수 있는, 역전사 효소의 능력을 스위칭하는 템플릿에 기초한 cDNA의 3' 말단에 규정된 서열을 첨가하는 것이 개시되어 있다. 상기 템플릿 스위치 및 태일링(CapSelect) 모두에 대해서, Cs의 첨가는 캡이 존재하는 경우(9)에 바람직할 것으로 추정되었다. 그러나, 이들 방법으로 그다지 선택적이게 하지 않는, 캡이 존재하지 않는 경우(10)에 첨가가 발생되는 그 이외의 것이 확인되고 있다. 또한, 상기 역전사 효소가 역전사 동안에 2차 또는 3차 RNA 구조에서 정지되는 경우, 다시 탬플릿 스위칭이 의사 태그의 제공을 발생할 수 있다.

US 2010/159526 A1에 있어서, 상기 방법은 우선, 폴리포스파타아제로 RNA를 인큐베이팅하여 원핵 세포의 mRNA의 5' 트리포스페이트에 태깅 올리고뉴클레오티드를 첨가해서 도너로서 작용하여 태깅 올리고뉴클레오티드의 3'OH를 허용할 수 있는 5'모노포스페이트로 상기 5' 트리포스페이트를 환원시키는 연속 라이게이션 반응이 기재되어 있다. 또한, 상기 원핵 세포의 mRNA의 선택은 cDNA 합성 전에 행해진다.

WO 2007/117039 A1 및 US 2008/0108804 A1은 mRNA가 캡을 제거하고, 캡 제거에 의해 잔류된 잔사 포스페이트에 핵산 분자를 라이게이팅함으로써 선택되는 방법을 기재하고 있다. 다른 RNA로부터 mRNA를 구별하기 위해서, 논캐핑된 RNA 분자는 미리 디포스포릴화되어 라이게이션을 방지한다. 이어서, 수식 RNA가 cDNA로 전사된다.

US 6,174,669 및 US 6,022,715은 5' 캡의 디올 구조가 산화되어 태그로 더 라벨링된 반응성 디알데히드를 형성하는 다른 캡 수식 방법에 관한 것이다. 그러나, 산화는 RNA 내구성에 유해하고, RNA를 분해할 수도 있다.

DE 19,920,611 A1 및 US 2003/0049637 A1은 상보 가닥 합성을 위해 어댑터를 라이게이팅함으로써 cDNA를 수식하는 것이 기재되어 있다. 상기 어댑터는 우선, RT 동안에, 높은 Mg 및 Mn의 이온 농도를 사용하여 수개의 Cs를 합성하고 터미널 트랜스페라제와 짧은 올리고뉴클레오티드를 라이게이팅함으로써 부착된다.

DE 10,105,208 A1에 있어서, RT 효율은 cDNA 합성 동안에 RT 반응에 베타인을 포함시킴으로써 증가할 수 있는 것이 개시되어 있다.

요약하면, 이와 같이, 지금까지 사용되는 방법은 그다지 선택적이지 않거나 다단계 프로토콜이다. 특히, RNA가 불안정하기 때문에, 다단계의 프로토콜은 단편화될 RNA의 기회를 증가시킨다. Mg² ⁺ 등의 2가 양이온 및 고온을 많이 요구하는 복수의 효소 반응의 사용은 그 자체가 RNA의 분해를 초래한다. 또한, 효소 제조는 진정으로 순수하지 않고, 소량의 뉴클레아제라도 RNA 분해의 가능성을 증가시킨다. 또한, 최후에, 각각의 추가 반응 단계는 RNA를 분해시킬 수 있는 RNase의 혼입이 유입될 가능성을 증가시킨다.

보다 긴 RNA 분자는 보다 짧은 RNA분자 보다 분해의 위험성이 증가하기 때문에, 보다 짧은 RNA 분자로의 편향이 소개된다. 따라서, RNA의 전장 서열 정보의 테스트 가능성을 제공함과 동시에, 전사물의 특이적 5' 말단을 태깅하는데 있어서, 선택성 및 감도를 증가시키는 방법이 필요로 되고 있다.

본 발명은 5' 캡 및/또는 5' 폴리포스페이트 구조 등의 5' 보호기를 포함하는 RNA로부터 라벨링된 핵산을 생성하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 이하의 단계를 포함한다.

a) 핵산의 탬플릿 가닥의 혼합물을 얻는 단계로서, 상기 혼합물은 상기 RNA 및 5' 보호기가 없는 잠재적으로 다른 핵산을 더 포함하는 단계,

b1) 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드 프라이머와 상기 RNA 및 잠재적으로 다른 핵산의 탬플릿 가닥을 어닐링하고, 탬플릿 서열 의존성은 상기 프라이머를 연장함으로써 탬플릿 가닥에 어닐링된 상보적 핵산 가닥을 얻는 단계 또는 b2) 2중 가닥의 RNA에 탬플릿 가닥과 어닐링된 상보적 핵산 가닥을 제공하는 단계,

c) 필요에 따라서, 상기 탬플릿 가닥의 5' 말단 또는 상기 상보적 가닥의 3' 말단 중 어느 하나 또는 모두에 5' 보호기를 포함하거나 포함하지 않는 상기 핵산의 연장 생성물을 수식하는 단계, 및

d) RNA의 상보적 핵산을 라벨링하여 특히, 적어도 5' 보호기를 본래 포함하는 RNA에 상보하는 라벨링된 핵산을 생성하는 단계.

d1)단계는 d1)단계 c)에 있어서 수식되지 않는 2중 가닥 핵산의 상보적 핵산을 라벨링하는 단계 및 또는 d2) 2중 가닥 의존성 라이게이션에 의해 상보적 핵산 탬플릿 RNA 가닥 상의 5' 보호기의 존재에 따라서 2중 가닥의 상보적 핵산을 라벨링하는 단계를 선택(조합 가능)함으로써 식별될 수 있다. 각각의 단계는 보호기가 없는 2중 가닥의 경우와 같이, 탬플릿의 5' 말단 근방의 상보적 가닥 상의 3' OH가 접근할 수 없는 원칙에 따른 수개의 선택 사항, 그들 중 대부분을 가능하게 한다. 5' 보호기가 2중 가닥으로 존재하는 경우, 상기 3' OH는 상기 상보적 가닥으로 접근 가능하게 된다. 접근성은 라벨링에 사용할 수 있다.

b) 및 d)단계는 서로 조합 가능한 선택 사항을 포함하여, a)∼d)의 순서로 단계가 행해진다. 예를 들면, d2)단계는 다른 d1)과 조합할 수 있는 c)단계에 따른 수식으로서 생각될 수 있다. 그러나, 또한 d2)단계는 5' 보호기가 없는 핵산(라벨링되어서는 안되는 핵산 샘플에 있어서의 바람직하지 않는 부생성물)에 대한 수식 없이 단독으로 목적을 수행하고 있다.

본 발명은 청구항으로 더욱 규정된다.

본 발명은 우선, 산화 또는 다효소의 노출 등의 임의의 잠재적으로 유해한 단계가 RNA 상에 실시되기 전에, 본질적으로 RNA가 cDNA 등의 상보적 핵산으로 첫번째로 역전사되는 방법에 관한 것이다. 그것에 의해서 상기 RNA의 전장의 정보가 상보적 핵산에 보존된다. 이것은 긴 RNA 서열을 보존함에 있어서 특히 유리하다.

5' 보호기는 천연의 mRNA 종에 있어서 일반적이고, 5'-3' 엑소뉴클레아제에 의한 소화에 대해 보호한다. 5' 보호기의 예로는 진핵 생물에 일반적인 5' 캡 구조 및 원핵 생물에 일반적인 5'-트리포스페이트이다. 본 발명은 이들 양 보호기로 행해질 수 있다. 또한, 5' 말단 상에 임의의 보호기가 사용될 수 있다. 그 예로는 일반적으로 5' 디포스페이트 및 5' 트리포스페이트를 포함하는 5' 폴리포스페이트이다. "폴리포스페이트"는 바람직하게는 에스테르 결합에 의해 연속적으로 연결되는 2, 3, 4, 5 이상의 포스페이트 등의 적어도 2개의 포스페이트기를 지닌 포스페이트 에스테르로서 이해된다. 물론, 임의의 다른 천연 또는 비천연 보호기가 5'-3' 엑소뉴클레아제에 의한 소화에 대해 보호하는데 사용될 수 있지만, 5' 캡 구조 또는 5' 폴리포스페이트가 바람직하고, 5' 트리포스페이트가 특히 바람직하다. 본원에 있어서, 5' 보호기를 지닌 핵산은 "보호" 핵산으로서 언급된다. 본원에 있어서, 5' 보호기가 없는 핵산은 "비보호" 핵산으로서 언급된다.

바람직한 실시형태에 있어서, 상보적 핵산은 DNA이지만, 다른 실시형태에 있어서, RNA 또는 DNA/RNA의 공중합체일 수도 있다.

또한, 바람직한 실시형태에 있어서, 탬플릿 핵산이 수식되는 비보호 핵산 및 보호기를 지닌 목적의 핵산 모두가 RNA이다.

이들은 모두 a)단계의 혼합물에 제공된다.

또한, 스폿 상의 핵산 합성(b1 단계)을 행하기 위해서는 2중 가닥 핵산에 RNA를 제공(b2 단계)하는 것도 가능하다. 예를 들면, cDNA:RNA 또는 RNA:RNA 혼성물이 제공된다. 그들이 동일한 발명 개념과 관련되므로 모든 또 다른 단계가 이들의 선택 사항 중 어느 하나와 조합될 수 있다.

이어서, 상기 캡 구조와 같은 보호기 등을 갖는 목적의 RNA의 특이적 5' 말단과 혼성되지 않는 cDNA 등의 상보적 핵산의 모든 3' 말단 서열을 불활성화하는 선택 반응 c)가 행해져서 d1) 링커 서열 또는 기타 라벨이 라벨링이 여전히 가능한("활성화") 상보적 핵산의 이들의 3' 말단에 2중 가닥 특이적 방식으로만 첨가될 수 있다. d1)단계에 있어서, c)단계에서 수식되지 않는 2중 가닥 핵산의 상보적 핵산이 라벨링되고, 따라서, 여기서, 상기 라벨링된 핵산은 c)단계에 있어서의 RNA 탬플릿 가닥 상에 5' 보호기를 갖고, 필요에 따라서, 상기 5' 보호기는 c)단계를 행한 후(또는 d1)단계 전에 가능)에 제거된다.

비보호 핵산의 수식이 없는 실시형태에 있어서(c 단계), d2 단계가 행해질 수도 있다. 물론, d2)는 상기 c)단계와 결합될 수도 있지만, 필수적이지는 않다. 실시형태 d2)에 있어서, 2중 가닥의 상보적 핵산은 2중 가닥 의존형 라이게이션에 의한 상보적 핵산 탬플릿 RNA 가닥 상의 5' 보호기의 존재에 따라서 라벨링된다.

바람직한 실시형태에 있어서, d2)단계의 반응은 탬플릿(RNA)의 5' 말단에 도착되면, MMLV-RT 등의 역전사 효소에 의한 뉴클레오티드의 논탬플릿 첨가를 조절함으로써 행해진다. RNA 또는 상기 캡 등의 5' 보호기기 없는 임의의 다른 핵산의 경우에 있어서, 이것은 상보적 (cDNA) 가닥 상의 3' 뉴클레오티드 오버행을 지닌 평활 말단 또는 말단을 얻는다. 한편, 캡 등의 5' 보호기를 지닌 RNA의 경우에 있어서, 상기 캡은 오버행으로서 제공된다. 박테리아의 mRNA 등에 있어서, 상기 보호기가 트리포스페이트인 경우, 상기 기를 담지하는 뉴클레오티드는 오버행으로서 제공될 수 있다. 이것은 캐핑된 RNA 또는 5' 트리포스페이트 RNA 등의 5' 보호 RNA와 혼성되는 cDNA와 링커를 선택적으로 라이게이팅하는데 사용될 수 있는 명확한 구조적 차이를 생성한다. 구체적으로 링커 올리고가 5' 오버행을 갖는 어댑터를 사용함으로써, 여기서, 상기 오버행은 상기 cDNA의 3' 말단에 링커 올리고의 2중 가닥 특이적 라이게이션을 촉진하기 위해서, 염기 짝짓기 또는 염기 중첩 등에 의해 5' 보호된 RNA의 오버행과 상호 작용할 수 있다. 이것은 탬플릿 RNA 가닥 상의 5' 보호기의 존재에 따라서, 2중 가닥의 상복적 핵산을 라벨링하는 경우, 2)단계에 있어서의 선택성을 달성하기 위한 예이다. 2중 가닥 의존형 라이게이션은 라벨 또는 수식을 부가하는데 사용될 수 있다. 특히, 바람직하게는 상기 라벨링은 2중 가닥에 특이적이고, 여기서, 상기 RNA 가닥은 5' 보호기를 포함하고, 특히 바람직하게는 상기 5' 보호기는 상기 RNA 가닥 5' 말단에서 오버행이다. 상기 라벨은 링커 가닥 상에 5' 뉴클레오티드 오버행이 제공된 2중 가닥 어댑터 핵산일 수 있고, 상기 상보적 핵산과 라이게이팅된다. 이러한 라이게이션은 2중 가닥 특이적 리가아제를 사용하여 행해질 수 있다. 상기 어댑터는 핵산 라벨의 일례이다. 바람직한 실시형태에 있어서, 상기 어댑터의 링커 가닥의 5' 뉴클레오티드 오버행은 단일 뉴클레오티드로 이루어진다. 상기 오버행은 A, G, C, T 등의 임의의 뉴클레오티드일 수 있지만, 바람직하게는 C 또는 T일 수 있고, 특히 C가 바람직하다.

(선택적) e)단계에 있어서, 라벨의 존재가 실험된다. 라벨이 없은 핵산과 비교하여 라벨을 갖는 핵산을 농축, 선택, 단리 또는 정제가 가능하다. 상기 라벨은 라벨이 존재하는 분자를 증폭시키기 위해서, 및/또는 상기 탬플릿으로부터 분리된 상보적 핵산 단독 상에 또는 cDNA::RNA 혼성물 등의 2중 가닥 상에 태그가 존재하지 않는 분자를 감소시키기 위해서 사용될 수 있다. 상기 라벨은 예를 들면, 라벨 결합 유닛에 의해 특이적으로 결합될 수 있다. 라벨 및 라벨 결합 유닛은 예를 들면, 항원/항체쌍, 리간드/리셉터쌍일 수 있고, 또는 상보적 서열을 지닌 올리고뉴클레오티드를 혼성화할 수 있다. 상기 라벨이 서열 태그인 경우, 예를 들면, 상기 라벨과 결합되는 프라이머를 사용함으로써, 예를 들면, 특이적 증폭에 의해 라벨링된 핵산을 농축시킬 수 있다.

바람직한 실시형태에 있어서, 상기 라벨링 단계는 c)단계에서 수식되지 않는 상기 2중 가닥 핵산과 핵산 서열 태그를 라이게이팅하는 것을 포함한다. 핵산 서열 태그는 농축을 위해서뿐만 아니라, 특정한 상보적 핵산의 이후 동정을 위해서 사용될 수 있다.

c)단계의 수식은 d1)단계의 수식된 2중 가닥의 라벨링을 방지하는 것이 바람직하다. 예로서는 (탬플릿 가닥 상의) 보호기 의존형 방식에 있어서 라벨링 단계의 상보 가닥 상의 3' 말단 OH를 용이하게 제거하고 있다. 용이하게 제거하는 것은 탬플릿 가닥 상의 적어도 1, 5' 말단 뉴클레오티드의 소화, 탬플릿 가닥의 5' 포스페이트와 블로킹 분자를 결합, 상보적 가닥의 3' 말단(예컨대, 3'OH)과 블로킹 분자를 결합 또는 상기 탬플릿 가닥 상의 5' OH 말단을 잔존시킨 포스페이트의 제거를 포함할 수 있다.

이러한 수식의 예로는 i) 논캐핑된 핵산 등의 보호기가 없는 핵산의 5'-3' 엑소뉴클레아제 소화; ii) 상보적 가닥의 3' 말단과 탬플릿 가닥의 5' 말단의 라이게이팅; iii) d1)단계의 상기 라벨이 없는 핵산의 첨가; 또는 iv) 바람직하게는 포스파타아제에 의해 탬플릿 가닥 상의 5' 말단 포스페이트의 제거이고, 특히 바람직하게는 RNA는 여전히 함유하면서, 상기 5' 보호기(본 실시형태에 있어서, 5' 캡이 바람직함)는 이와 같이 5' 디포스포릴화로부터 보호된다.

라벨링은 상보적 핵산을 지닌 보호된 RNA의 2중 가닥의 평활 말단에 작용하는 반응이 바람직하다. 상기 평활 말단은 보호기를 지닌 말단 상에 있다. 따라서, 수식된 비보호 핵산 2중 가닥 상의 템플릿 또는 상보적 가닥 중 어느 하나 상에 오버행을 생성함으로써, 라벨링 동안에 목적하지 않는 이들 핵산을 마스킹하는 것이 가능하다. 이러한 오버행은 바람직하게는, 사이즈가 적어도 2개의 뉴클레오티드, 특히 바람직하게는 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개 또는 그 이상, 예를 들면 적어도 15개, 적어도 20개, 적어도 30개, 적어도 40개 또는 적어도 50개의 뉴클레오티드이다.

예를 들면. 2중 가닥 특이적 리가아제가 임의의 d)단계에서 사용되어 상보적 가닥의 3' 말단(활성 3' OH를 가짐)에 서열 태그를 라이게이팅하면, 상기 탬플릿의 역전사 동안에 오버행을 생성함으로써 및/또는 상보적 뉴클레오티드의 3' 오버행을 재생성한 탬플릿의 5' 말단 서열을 소화시킴으로써 및/또는 iii) 상기 상보적 핵산의 3' 말단에 탬플릿의 5' 말단 서열을 라이게이팅함으로써 c)단계의 cDNA의 3' 말단의 비활성화가 행해질 수 있다.

평활 말단 특이적 리가아제는 100% 평활 말단에 따르지 않는다. 특히, 보호 기를 갖는 핵산의 경우, 특히 5' 캡의 경우에는 라벨링을 위해 탬플릿 가닥 상에 1개의 뉴클레오티드에 의한 오버행도 바람직하다. 따라서, 바람직한 실시형태에 있어서, 상기 라벨링은 2중 가닥, 바람직하게는 최대 1개의 뉴클레오티드 오버행을 지닌 말단 또는 평활 말단을 갖는 2중 가닥에 특이적이다. 예를 들면, 상기 평활 말단은 다른 뉴클레오티드가 계속되는 템플릿 가닥 상의 캐핑 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 상보적 가닥은 캐핑 뉴클레오티드까지이지만 이들과 얼라이닝하지 않는 다른 뉴클레오티드와 얼라이닝된 뉴클레오티드를 지닌 말단일 수 있다. 또한, 상기 캡과 얼라이닝된 뉴클레오티드를 지닌 상보적 가닥 말단이 가능하다. 상기 얼라이닝 뉴클레오티드는 상기 캡과 상보하거나 상보하지 않아도 된다. 따라서, 상기 라벨링 단계는 목적의 RNA의 경우가 아니라, 수식 후의 다른 템플릿 핵산과 2중 가닥으로 존재하는 이들 말단 구조에 특이적이다. 본질적으로는 상기 수식은 5' 보호기가 없는 템플릿과의 2중 가닥 핵산 중의 라벨링 동안에 선택되는 구조를 제거한다.

바람직한 실시형태에 있어서, 미수식 2중 가닥 핵산의 상보적 핵산은 3' 말단 상에 라벨링되고, 바람직하게는 상기 상보적 가닥의 3' 말단 뉴클레오티드는 특히 5' 폴리포스페이트인 경우 또는 5' 보호기, 특히 5' 캡인 경우에 0개 또는 1개의 뉴클레오티드 내에서 5' 말단 뉴클레오티드 또는 보호기, 바람직하게는 5' 캡 뉴클레오티드를 지닌 탬플릿 가닥에 어닐링된다.

바람직한 실시형태에 있어서, c)단계의 불활성화는 상기 cDNA 가닥 상의 평활 말단 또는 3' 오버행과 혼성된 논캐핑 템플릿::상보적 핵산(통상, RNA::cDNA)을 제공함으로써 역전사 반응의 종료시에 행해져서 그 후의 라벨링을 불활성화시킨다. 한편, 캐핑된 RNA::cDNA 혼성물은 RNA 가닥 상의 캡 오버행을 제공하여 후속 라벨링을 활성화시킨다. 상기 방식에 있어서, d2)단계에 있어서, 어댑터의 링커 올리고의 5' 오버행은 캐핑된 RNA와 혼성화된 cDNA의 3' 말단에 2중 가닥 특이적 리가아제에 의해 라이게이팅될 수 있지만, 논캐핑된 RNA와 혼성화된 cDNA에는 라이게이팅될 수 없다.

상기 5' 오버행은 단일 뉴클로에티드이고, 상기 단일 뉴클레오티드는 C인 것이 바람직하다. 또한, 상기 단일 뉴클레오티드는 그것의 5' 말단 상에 포스포릴화되거나 또는 아데닐화되는 것이 바람직하다. 상기 단일 뉴클레오티드는 특히, 캡인 경우 및 폴리포스페이트인 경우(임의의 단일 뉴클레오티드 N이 바람직하다), 5' 보호기와 얼라이닝될 수 있고, 상기 상보적 가닥에 상기 어댑터의 라이게이션을 가능하게 한다.

보호기 선택적 방식에 있어서, 상기 오버행을 유지하는 것은 낮은 Mn² ⁺ 또는 Mg²⁺ 농도 또는 낮은 dNTP 농도에 의해 조절되어 역전사 효소의 탬플릿 독립성 C 부가를 억제할 수 있고, 이것은 상기 보호된 RNA 및 비보호된 핵산 간의 관련 초기 차이를 무시할 수 있다. 바람직한 조건은 예를 들면, 4mM 미만 농도의 Mn² ⁺와Mg² ⁺, 바람직하게는 Mn² ⁺이 없거나 및/또는 0.4mM 미만의 dNTP, 바람직하게는 각각의 0.1mM 등의 0.25mM 미만의 결합이다.

상기 선택사항 iv)에 따라서, 예를 들면, 알칼리포스파타아제 등의 포스파타아제에 의해 탬플릿 가닥 상의 5' 말단 포스페이트, 특히, 모노포스페이트를 제거하는 것도 가능하다. 선택사항 iv)에 있어서, 폴리포스페이트 보호기가 제거될 수도 있다. 상기 단계에서 보호기 제거를 억제하기 위해서(물론, 미보호 2중 가닥이 수식되어 "불활성화"되면, 이후에 제거되어도 된다), 보호기의 불활성화 또는 모노포스페이트만을 디포스포릴레이트화하거나 또는 포스파타아제 내성(예를 들면, 다른 보호기로 치환 또는 디포스포릴화에 대한 에스테르 결합을 강화)을 위한 폴리포스페이트 보호기를 수식하기 위해서 말단 포스파타아제가 사용되는 것이 바람직하다. 상기 5' 보호기를 포함하는 RNA는 포스파타아제에 의해 수식되지 않는다. 또한, 상기 수식은 보호 RNA와 얼라이닝된 상보적 핵산만을 특징적으로 라벨링하는데 바람직하다. 또한, 모노포스페이트 5' 말단을 잔존시키고 보호 RNA와 얼라이닝된 상보적 핵산과 연속적으로 라이게이팅될 수 있는 상기 링커와 라벨링을 혼성화하는데 사용할 수도 있는 링커 서열을 첨가한 보호기를 제거하는 것이 가능하다. 본질적으로 상기 단계는 배경 기술 분야에서 언급한 올리고 캐핑 방법으로부터 공지이다. 본 발명과의 중요한 차이는 본 발명에 따른 수식은 2중 가닥 상에 즉, 상보적 핵산을 생성하여 2중 가닥 내의 수식 동안에 RNA의 서열 정보를 보존한 후에 행해진다. 따라서, 정보의 손실, 특히 종래의 올리고 캐핑 방법에서 확인되는 바와 같은 긴 RNA 서열에 대한 정보의 손실이 회피된다.

i)에 따라서 행해지는 바람직한 실시형태에 있어서, 탬플릿::상보적 가닥 혼성물은 5'-3'의 RNA를 분해하는 엑소뉴클레아제 소화 단계가 실시된다. 5' 보호기(예를 들면, 캡 구조나 디- 및 트리포스페이트 등의 다른 블로킹 수식)를 포함하는 RNA만이 분해 가능하지 않거나 내분해성이다. 이어서, 임의의 d)단계에 있어서, 존재하는 RNA의 어닐링된 5' 말단의 의존형에 있어서, 상보적 가닥의 3' 말단에 라벨이 부가된다. 이것은 예를 들면, cDNA의 3' 말단에 올리고뉴클레오티드를 라이게이팅하는 2중 가닥 특이적 리가아제에 의해 달성될 수 있다.

동일한 효과가 상보적 가닥의 3' 말단에 탬플릿 가닥의 5' 말단을 라이게이팅함으로써 선택사항 ii)에 의해 달성될 수 있다. 이 반응은 비보호 핵산(예를 들면, 5' 캡 또는 5' 폴리포스페이트가 없음)에 대해서만 행할 수 있다. 따라서, 5' 보호기를 지닌 핵산은 미수식인채로 잔존한다. 이어서, 라벨링이 없는 상보적 가닥의 3' 말단만 잔존하고, 여기서, 상기 3' 말단은 얼라이닝된 탬플릿 가닥과 미리 공유 결합되어 있지 않다.

선택 사항 iii)에 따르면, 비보호 2중 가닥의 상보적 가닥의 3' 말단에 다른 링커(또는 연장)을 부가하여 상기 3' 말단을 블로킹하여 불활성화하는 것을 간단하게 할 수도 있다. 하나의 선택 사항은 말단 트랜스페라아제 또는 예를 들면, 비보호 평활 말단에만 작용하는 역전사 효소 등의 효소의 보다 바람직한 연장 활성을 사용하는 것이다. 상기 단계의 후, 5' 말단 또는 5' 보호기를 지닌 RNA가 미리 얼라이닝되어 있는 상보적 가닥의 3' 말단(특히, 5' 캡에 있어서와 같은 뉴클레오티드인 경우)이 임의의 d)단계에 따라서 라벨링될 수 있다.

따라서, 수개의 이들 선택 사항에 따라서, 상기 탬플릿의 5' 말단 근방의 상보적 가닥 상의 3' OH가 보호기가 없는 2중 가닥의 경우와 같이 접근할 수 없다. 2중 가닥으로 존재하는 5' 보호기인 경우, 상기 3' OH는 상보적 가닥 상에 접근 가능한 채 잔존한다. 이어서, 라벨링 단계에 있어서, 예를 들면, 상술한 바와 같은 보호기의 1핵산 거리 내에 탬플릿 또는 보호 뉴클레오티드와 직접적으로 얼라이닝된 탬플릿 상의 보호기 근방인 상보적 가닥 상의 상기 3' OH에 라벨을 라이게이팅할 수 있다.

본 발명에 따라서, 상기 보호기는 제거되어도 되고 제거되지 않아도 된다. 바람직하게는 c)단계에 대한 선택 사항 i), ii) 또는 iii)에 있어서, 상기 보호기는 제거되지 않는다. 선택 사항 iv)에 있어서, 보호기는 제거되는 것이 바람직하지만, c)단계에 있어서, 비보호된 핵산 2중 가닥의 수식 후에만 제거되는 것이 바람직하다. 본 발명에 따라서, 수식은 보호 핵산이 없는 2중 가닥 상에 존재한다. 상기 5' 보호기는 목적의 RNA에 대한 수식을 억제한다. 특히, 바람직하게는 보호기, 예를 들면, 5' 캡인 경우, 본 발명의 단계에 의해 산화되지 않는다.

본 발명의 방법에 따라서, b)단계는 c)단계 전에 행해지고, 예를 들면, 상기 RNA의 역전사는 임의의 RNA 5' 말단에 대한 수식 및 선택 공정에 선행한다. 이러한 방법에 있어서, 배경 기술 부분에서 설명한 바와 같이, 선택 공정 자체에 의한 RNA의 분해는 품질, 특히 cDNA의 전장 서열의 측면에 영향을 주지 않는다. 따라서, 길거나 짧은 RNA의 표현을 초과하거나 이하를 향한 편향 또는 RNA 분자의 일단을 향한 편향은 역전사의 품질에 크게 좌우될 수 있지만 선택을 위한 후전사 이벤트는 아니다. RT 편향을 감소시키거나 영향을 주는 많은 방법이 트레할로스 및 베타인의 첨가(11;12) 등의 해당 기술분야에서 공지되어 있다 2007/062445, US 311754 A1, EP 11181546.0(그 전체가 모두 참고로서 원용된다). 바람직하게는 본 발명은 RNA의 전장 역전사를 포함한다.

RNA 의존형 DNA 또는 RNA 폴리메라아제 활성을 갖는 임의의 효소가 사용되어 상기 탬플릿 RNA의 5' 말단(TSS)에 역상보 가닥을 생성할 수 있고, 따라서 2중 가닥을 생성한다. 바람직한 실시형태에 있어서, 상기 폴리머라제는 RNA 의존형 DNA 폴리머라제이다. 다른 실시형태에 있어서, 상기 폴리머라제는 RNA 의존형 RNA 폴리머라제이다.

다른 실시형태에 있어서, 상기 RNA의 5' 말단에서의 상기 2중 가닥 특징은 예를 들면, 전체적으로 또는 부분적으로 상보적 핵산 분자의 어닐링, 이어서 상기 5' 말단에 상보적 핵산 부분과의 라이게이팅에 의해, RNA의 5' 말단에 서열 상보성을 지닌 올리고뉴클레오티드에 의해 생성될 수도 있다.

RT 의 말단 트랜스페라아제 활성 : 말단 트랜스페라아제형 방법에 있어서, RNA 탬플릿의 5' 말단에 도달하면, 역전사 효소가 여분의 뉴클레오티드를 첨가하는 것이 공지이다. 보호기가 존재하지 않는 경우, 이들 여분의 뉴클레오티드만이 부가되는 방식으로 역전사가 행해지면, 추후에 2중 가닥 특이적 리가아제에 의한 선택 공정을 보조할 수 있다. 예를 들면, 낮은 Mg² ⁺ 농도는 적은 비탬플릿 뉴클레오티드를 부가하는데 사용할 수 있다. 특히 바람직하게는 Mg² ⁺는 3mM 이하, 바람직하게는 2.5mM 이하이다. 적은 비탬플릿형 뉴클레오티드의 부가를 야기하는 다른 방법은 dNTP의 농도를 저하시키는 것이다. 따라서, 역전사 효소는 말단 트랜스페라아제 활성을 억제, 예를 들면, 감소 또는 없애거나 또는 이들 활성을 감소 또는 억제하는 조건이 사용되는 것이 바람직하다. 특히 바람직하게는 b1)단계에 있어서, 역전사 효소는 말단 트랜스페라아지 활성을 억제하거나, 충분한 dNTP으로 Mg² ⁺를 3mM 초과하는 비수식 역전사에 비하여 상기 활성의 감소를 야기하는 조건이 사용된다.

3' cDNA 오버행의 소화 : RT 동안에 예를 들면 2중 가닥 특이적 라이게이션에 의해서, c)단계에 있어서 선택되어야 하는 RNA의 5' 말단에 상보적 핵산 가닥 오버행이 생성되면, 엑소뉴클레아제 T, 엑소뉴클레아제 T5, 쉬림프 뉴클레아제, 녹두 뉴클레아제 또는 DNA 폴리머라제 I 대형 (클레노브) 단편 등의 바람직한 단일 가닥 특이적 3'-5' 엑소뉴클레아제 활성을 지닌 효소를 사용하여 소화시켜 임의의 d)단계의 2중 가닥 특이적 라이게이션에 이용가능한 cDNA를 제조할 수 있다. 따라서, 3' cDNA 오버행이 임의 d)단계 이전에 소화되는 것이 바람직하다.

RT 의 RNAse H 활성 : 역전사 효소가 상보적 핵산 가닥을 RNA에 생성하는데 사용되는 경우, 상기 RT는 감소되거나 없는 RNAse H 활성을 갖는 것이 바람직하다. RNA H 활성은 RNA에서 닉을 생성하고, 상기 RNA는 바람직하지 않는 조건 하에 cDNA로부터 분리되고, 이와 같이 2중 가닥 특이적 라이게이션에 불활성한 cDNA의 3' 말단이 되게 한다. 따라서, 상기 역전사 효소는 없거나 감소된 RNAse H 활성을 갖거나 또는 상기 활성을 감소 또는 저해하는 조건이 사용되는 것이 더욱 바람직하다. RNAse H 활성은 상기 전사 효소의 RNAse H 도메인을 제거함으로써 또는 그 활성을 감소 또는 억제하는 돌연변이에 의해 감소시킬 수 있다. 따라서, 바람직하게는 b1)단계에 있어서, 수식되는 역전사 효소가 사용되고, 여기서, 상기 수식은 상기 역전사 효소의 RNAse H 활성을 감소 또는 억제한다.

의사 제 2 가닥 합성 : 역전사 효소가 이들 cDNA를 불활성화하게 하는 유리 3'cDNA를 사용하여 제 2 가닥 합성을 준비시킬 수 있기 때문에, 제 2 가닥 합성이 억제되는 것이 바람직하다. 예를 들면, 악티노마이신 D는 제 2 가닥 합성을 저해하는데 사용될 수 있다.

RT 프라이머의 보호 : 5'-3'방향으로 cDNA를 소화할 수도 있는 엑소뉴클레아제가 사용되는 경우, 상기 RT 프라이머가 엑소뉴클레아제에 내성일 필요가 있다. 올리고뉴클레오티드에 엑소뉴클레아제 내성을 발휘하는 많은 방법이 해당 기술분야에서 공지되어 있다. 예를 들면, 하나 이상의 포스포로티오에이트(PTO) 또는 잠긴 핵산(LNA) 수식은 엑소뉴클레아제 소화로부터 프라이머를 보호할 수 있다. 바람직하게는 이들 수식은 프라이머의 5' 말단에 또는 그 근방에 있어야 한다. 사용할 수 있는 다른 수식은 예를 들면, 5'-3' 엑소뉴클레아제 활성을 감소, 저지 또는 블로킹하는 비오틴 등의 5' 라벨 또는 C3, C9, C12 스페이서 등의 5'블로커이다. 또한, 2중 가닥 특이적 엑소뉴클레아제에 대해서, 올리고뉴클레오티드의 프라이밍 서열에 5'오버행이 도입될 수 있어 상기 프라이밍 올리고뉴클레오티드의 3' 부분이 RNA와 혼성되고 5' 부분이 단일 가닥으로 유지된다. 바람직한 실시형태에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드 프라이머는 5'-3' 엑소뉴클레아제 소화에 내성이 있다.

포스트 RT 라이게이션 : 상술한 바와 같이, (비보호) 핵산 분자의 5'-포스페이트의 불활성화는 임의의 d)단계에서 행해진 바와 같이 이중 가닥 특이적 라벨링을 위한 상보적 가닥의 3' OH를 효율적으로 불활성화하는 상보적 가닥의 3' OH와 상기 5' 포스페이트를 라이게이팅함으로써 행해질 수 있다. 5'-3' 엑소뉴클레아제 단계와 함께 사용되는 경우, 상기 라이게이션이 상기 엑소뉴클레아제 단계 전이나 후에 행해질 수 있지만, 임의의 d)단계의 2중 가닥 특이적 라이게이션 전에 행해질 수 있다.

포스트 RT 포스포릴화 : 5'-3'엑소뉴클레아제 소화에 대해서, RNA 등의 다른 핵산에 다른 활성 및 5' 포스페이트, 5' OH 및 5' 트리포스페이트를 소화시키는 능력을 갖는 여러가지 효소가 사용될 수 있다. 또한, 상보적 핵산 가닥의 3' 말단, 특히, cDNA를 불활성화하는 것이 바람직한 경우, 5' OH, 핵산 분자의 혼성에 있어서, 5' OH로부터 소화가 개시될 수 없지만, 5' 포스페이트에 특이적인 5'-3' 엑소뉴클레아제가 사용되는 것이 바람직하다. 이어서, RNA 등의 핵산의 5' OH는 포스포릴화에 의해 5'포스페이트로 변환될 수 있다. 포스포릴화는 Optikinase(Affymetrix 사) 등의 폴리뉴클레오티드 키나아제 등에 의해 행해질 수 있다. 따라서, 5'포스포릴화된 핵산 상에 활성화인 엑소뉴클레아제가 사용되는 경우, 바람직하게는 b)단계 후에 RNA 등의 핵산의 5' OH는 5' 포스페이트로 변환되는 것이 바람직하다. 상기 핵산은 비보호인 것이 바람직하다

프리 Exo 디포스포릴화 : 5' OH 핵산에서만 활성화인 5'-3' 엑소뉴클레아제가 사용되는 경우, 상기 엑소뉴클레아제 소화 반응 이전에 디포스포릴화 단계가 행해질 수 있다. 쉬림프 알칼리 포스파타아제, 남극 포스파타아제 또는 송아지 장내 알칼리 포스파타아제 등의 임의의 포스파타아제 종류를 사용할 수 있다. 따라서, 5' OH에서 활성화하는 엑소뉴클레아제가 사용되는 경우, 핵산의 5' 포스페이트, 바람직하게는 RNA는 5' OH로 변환되는 것이 바람직하다. 상기 핵산은 비보호인 것이 바람직하다.

EXO 소화 : 원칙적으로, 핵산에 5'-3' 엑소뉴클레아제 활성을 갖고, 바람직하게는 상보적 가닥과 혼성화된 임의의 효소가 사용될 수 있다. 상기 핵산은 RNA, 특히 비보호 RNA일 수 있고, 상기 상보적 핵산은 그것의 cDNA일 수 있다. 5'-3' 활성을 갖는 엑소뉴클레아제는 예를 들면, T7 엑소뉴클레아제, T5 엑소뉴클레아제, 람다 엑소뉴클레아제, 터미네이터 엑소뉴클레아제, XRN-I의 엑소뉴클레아제 등이다. 5'-3' 엑소뉴클레아제 활성을 갖는 폴리머라제는 예를 들면, Bst 폴리머라제, Taq 폴리머라제, 대장균 DNA 폴리메라아제 I이다.

열안정화제, 활성화제 및 크라우딩제 등의 상기 엑소뉴클레아제의 활성을 증대시킬 수 있는 첨가제를 사용할 수 있다. 크라우딩제는 고농도로 사용할 수 있고, 세포내의 거대분자 크라우딩의 효과를 모방하기 위해서 사용할 수 있는 불활성 분자이다. 예로서는 PEG(폴리에틸렌글리콜), PVP(폴리비닐피롤리돈), 트레할로스, 피콜 및 덱스트란이다. 크라우딩제는 US 5,554,730 또는 US 8,017,339 등에 개시되어 있다.

트레할로스 등의 열안정제는 DNAse I(11) 등의 뉴클레아제의 활성을 증강하는 것이 알려져 있다.

DNA::RNA 혼성물의 형태가 DNA::DNA 혼성물을 바람직하게 하는 엑소뉴클레아제에는 최적이 아닐수도 있으므로 PEG 등의 크라우딩제의 첨가는 형태의 변경 및/또는 체적 배제에 의한 반응을 향상시킬 수 있다. 본 발명의 바람직한 실시형태에 있어서, 엑소뉴클레아제 소화는 트레할로스 또는 PEG과 같은 크라우딩제 등의 엑소뉴클레아제를 활성화 및/또는 핵산 형태를 변경하는 제제의 첨가로 행해진다.

라이게이션 : 임의의 d)단계에 있어서, 라벨링을 위한 라이게이션은 cDNA 등의 상보적 핵산의 3' OH를 라이게이팅할 수 있는 임의의 2중 가닥 특이적 리가아제로 행해질 수 있고, 이것은 단일 가닥 링커 또는 2중 가닥 어댑터 등의 서열 태그의 5' 포스페이트와 cDNA::RNA 혼성물 등의 2중 가닥으로 존재한다. 예를 들면, 아데닐화 도메인이 전혀 없는 것이 바람직한 절단된 T4 DNA 리가아제, T4 RNA 리가아제 2 및 T4 RNA 리가아제 2가 본 발명의 목적에 적합한 리가아제이다.

트레할로스 등의 활성화제 및 열안정제 등의 활성을 증강시킬 수 있는 첨가제가 사용될 수 있다. 또한, 마그네슘 클로라이드 또는 망간 클로라이드 등의 다른 2가 양이온뿐만 아니라 2중 가닥 형태를 향상시킬 수도 있는 상기한 것 중 어느 하나 또는 PEG 등의 크라우딩제가 사용될 수 있다.

바람직한 실시형태에 있어서, 임의의 d)단계는 상기 cDNA의 3' OH에 서열 태그 또는 링커 서열의 2중 가닥 특이적 첨가를 포함하고, 이것은 절단된 T4 DNA 리가아제, T4 RNA 리가아제 2 또는 T4 RNA 리가아제 2 등의 2중 가닥 특이적 리가아제로 행해지는 것이 바람직하다. 피로포스페이트가 폴리머라제 및 (기타)리가아제 등의 효소를 억제할 수 있기 때문에, 상기 피로포스페이트의 첨가가 바람직하다.

cDNA 에 부가되는 라벨 : 상기 라벨은 cDNA를 라벨링할 수 있는 임의의 분자 또는 기일 수 있다. 상기 라벨은 올리고뉴클레오티드 링커인 것이 바람직하다.

태깅을 위한 올리고뉴클레오티드 링커 : 상기 올리고뉴클레오티드는 DNA, RNA, LNA, PNA 또는 임의의 조합으로 해당 기술분야에서 현재 사용되는 임의의 대체물 등의 임의의 핵산일 수 있다. 상기 올리고뉴클레오티드의 5' 말단은 라이게이션을 쉽게 해야 한다. 다른 리가아제는 5' OH 또는 5' 포스페이트 등의 다른 5' 말단이 요구된다. 대부분의 리가아제는 아데닐화 또는 구아닐화를 통해 활성화된 5' 포스페이트를 사용한다. 대부분의 리가아제는 5' 포스페이트를 아데닐화한다. 바람직한 실시형태에 있어서, 라이게이팅된 올리고뉴클레오티드는 그 5' 말단에서 프리아데닐화된다.

링커에 대한 역상보 : 2중 가닥 특이적 리가아제가 도너측(5' 포스페이트)의 2중 가닥도 바람직하기 때문에, 적어도 상기 링커의 5' 말단은 역상보 서열의 올리고뉴클레오티드를 지닌 2중 가닥으로 존재하는 것이 바람직하다. 통상, 이러한 2중 가닥 링커는 어댑터라고 불린다. 상기한 바와 같이, 역상보는 해당 분야에서 공지된 임의의 핵산 또는 유사체일 수 있다. 상기 링커는 어댑터로서 제공되는 것이 바람직하다. 바람직한 실시형태에 있어서, 핵산 서열 태그는 적어도 부분적으로 2중 가닥이고, 특히 바람직하게는 라이게이션 말단(라이게이션이 상보적 핵산과 공유 결합이 되는 5' 말단)이다.

임의의 유리 3' OH가 중합 또는 라이게이션 동안에 잠재적으로 어셉터로서의 역할을 하기 때문에, 링커 또는 어댑터 올리고뉴클레오티드의 유리 3' OH가 블로킹되는 것이 바람직하다. 다수의 블로킹기는 해당 분야에서 공지이다. 디데옥시뉴클레오티드, C-스페이서 및 포스페이트기가 참고로 제공되지민, 이들로 한정되는 것은 아니다. 상기 어댑터 올리고뉴클레오티드의 임의의 유리 3' OH가 블로킹되는 것이 바람직하다.

형광 라벨: 상보적 핵산은 해당 분야에서 공지된 임의의 분자로 라벨링될 수 있다. 예를 들면, 플루오레신 또는 비오틴 등의 형광 분자가 사용되어 직접적 또는 간접적 리포터로서 작용할 수 있다. 올리고뉴클레오티드 태그 또는 역상보체가 라벨링되는 것이 바람직하다.

고상 정제에 의해 라벨링된 핵산의 선택 : 예를 들면, 핵산 서열 태그에 의해 라벨링된 분자를 농축시키는 하나의 방법은 핵산 서열 태그를 사용하여 예를 들면, 비드 선택 등의 고상 선택을 행하는 것이다. 예를 들면, 아비딘 표면을 갖는 비즈가 사용될 수 있고, 비오틴을 지닌 라벨이 사용되어 아비딘 표면과 결합할 수 있다. 그러나, 항원 항체 결합 등의 임의의 다른 라벨 결합 시스템이 사용될 수 있다. 또한, 상기 핵산 서열 태그를 혼성화할 수 있는 역상보 서열을 지닌 올리고뉴클레오티드가 비드에 부착될 수 있다.

라벨링된 상보 핵산이 바람직하게는 비드 상에서 고상 결합 또는 선택에 의해 정제된다. 또한, 핵산 서열 태그 또는 역상보 올리고뉴클레오티드 또는 어댑터가 비즈와 결합되고 2중 가닥 특이적 라이게이션이 비즈에 부착된 라벨에 의해 행해지는 것이 바람직하다. 상기 라벨은 예를 들면, 부착된 역상보 올리고뉴클레오티드와 혼성을 통해 또는 직접적으로 예를 들면, 고체 표면에 부착되어 부동화되고, 임의의 d)단계의 라벨링 반응이 상기 고상에서 행해진다.

엑소뉴클레아제 소화에 의해 라벨링된 핵산의 선택 : 라벨링된 상보적 핵산을 정제하는 다른 가능성은 태그를 갖지 않는 모든 핵산을 소화하는 것이다. 예를 들면, 3'-5' 엑소뉴클레아제 소화가 행해질 수 있다. 이 경우, 라벨은 3'-5' 엑소뉴클레아제 내성이어야 한다. 올리고뉴클레오티드는 많은 수단을 통해서 엑소뉴클레아제 내성으로 제조할 수 있다. 예를 들면, C3, C6, C9 또는 C12, 또는 비오틴 등의 3' 블로킹기의 첨가는 이와 같은 보호를 발휘할 수 있다. 또한, PTO 또는 LNA는 엑소뉴클레아제 분해를 감소 또는 저지할 수 있다.

라벨링된 상보적 핵산은 라벨이 없는 핵산을 제거함으로써, 바람직하게는 3'-5' 엑소뉴클레아제 소화에 의해 정제되는 것이 바람직하고, 상기 라벨은 소화로부터의 보호를 제공한다.

RT 동안에 템플릿 스윗치가 임의의 다른 핵산에서 일어날 수 있는 것이 알려져 있다. RT 프라이머가 주형 RNA보다 과잉으로 제공되기 때문에, RT 프라이머는 상보적 핵산의 3' 말단에 폴리 A 서열을 부가한 템플릿 스윗치일 수 있다. PCR과 같은 증폭 반응이 사용되어 상보적 핵산을 증폭시키는 경우, RT 프라이머의 역상보와 혼성될 수 있는 제 2 프라이머만이 이와 같이 프라이밍된 RT 프라이머 및 탬플릿 스윗칭된 상보적 핵산을 증폭시킬 수 있고, 이와 같이 선택되는 RNA의 5' 말단에 비특이적인 백그라운드를 생성한다. 상기 백그라운드를 감소시키기 위해서, 상기 RT 프라이머는 그 5' 말단에 C3 또는 비오틴 등의 보호 말단 수식을 갖지 않아도 된다. 또한, RT 프라이머는 PTO 또는 LNA 등의 내부 수식을 갖지 않아도 된다. 그러나, 상기 RT 프라이머는 RNA와 혼성되지 않는 5'오버행을 가질 수 있다. 이 방식에 있어서, 상기 5'오버행이 5'-3' 2중 가닥 특이적 엑소뉴클레아제 소화(c단계) (i))에 있어서, 상보적 핵산을 보호할 수 있다. 그러나, 상기 RT 프라이머가 탬플릿 스윗치를 위한 탬플릿으로서 사용되는 경우, 상기 템플릿 스위칭된 RT 프라이머는 상기 엑소뉴클레아제 소화로부터 보호되지 않는다. 이것은 RT 프라이머가 상보적 핵산의 3' 말단과 혼성화되고, 따라서 5'-3' 엑소뉴클레아제 소화에 사용될 수 있기 때문이다. 상기 방식에 있어서, 임의의 d)단계의 2중 가닥 특이적 라벨링을 억제하고, 따라서 라벨링을 위한 연속 선택이 행해지는 경우, 상기 백그라운드를 저감시키는 모든 템플릿 스위칭된 상보적 핵산을 c)단계 동안에 3'cDNA의 오버행이 생성된다.

예를 들면, 상기 어댑터에 있어서, 핵산 서열 태그에 대한 역상보 올리고뉴클레오티드는 그 5' 말단에 수식을 가지고, 아비딘 비드계 선택을 위한 비오틴 태그 등의 상기 수식을 위한 포지티브 선택을 가능하게 하거나 또는 링커 태그 자체가 수식을 가져서 상술한 바와 같은 3'-5'계 엑소뉴클레아제 소화로부터 이것을 보호한다.

상기 올리고뉴클레오티드 프라이머는 5' 오버행을 갖고, 상기 핵산 서열 태그의 하나 또는 양 가닥은 포지티브 선택을 위한 수식을 갖거나 또는 상기 핵산 서열 태그는 뉴클레아제 소화로부터 보호되는 것이 바람직하다.

특이적 중합에 의해 라벨링된 핵산의 선택 : 라벨로서 핵산 서열 태그가 첨가되는 경우, 특이적 복제(증폭)가 행해질 수 있다. 예를 들면, 핵산 서열 태그와 혼성될 수 있는 프라이머에 의한 프라이머 연장 반응을 사용하여 특이적 증폭이 행해질 수 있다. 따라서, 라벨링된 상보적 핵산이 복제된다. 이러한 반응은 예를 들면, PCR에 있어서, 지수 관계적 증폭으로 얻어진 상보적 핵산에 특이적인 제 2 프라이머를 사용하거나 또는 선형 증폭에 의한 다수의 사이클을 통하여 행해질 수 있다. 모든 폴리아데틸화된 RNA가 증폭되는 경우, 상기 제 2 프라이머는 폴리 T 스트레치를 갖는 것이 바람직하다.

본 발명의 다른 실시형태에 있어서, 적어도 부분적으로 2중 가닥 어댑터인 상보적 핵산이 핵산 의존형 뉴클레오티드 중합을 개시할 수 있는 프로모터를 제공할 수 있다. 예를 들면, 상기 어댑터는 T7, T3 또는 SP6 프로모터를 제공할 수 있고, 특이적 DNA 의존성 RNA 폴리머라제를 사용하여 상보적 핵산을 복제할 수 있다. 따라서, 라벨링된 핵산은 특이적 탬플릿 의존성 뉴클레오티드 중합을 통해 증폭되는 것이 바람직하다.

약어:

TSS : 전사 개시 부위, PTO : 포스포로티오에이트 결합, LNA : 잠긴 핵산, RT : (문맥에 따라서) 역전사 또는 역전사 효소, PNA : 펩티드 핵산, PCR : 폴리머라제 사슬 반응.

본 발명의 이들 특정한 실시형태로 한정됨이 없이, 이하의 도면 및 실시예에 의해 본 발명이 더욱 설명된다.

도 1a :
본 발명의 일실시형태의 개략도로서,
탬플릿 RNA 분자에 캡이 존재하는 경우에만 핵산 서열 태그에 의해 3' 말단에 cDNA 분자가 라벨링된다.
a) 5' 캡을 갖는 mRNA(i) 및 5' 포스페이트를 갖는 rRNA(ii)는 랜덤 프라이머 P로 프라이밍되고, 역전사되어 b) RNA::cDNA 혼성물을 생성한다. c) 이들 혼성물은 5' 포스페이트가 존재하지만, 캡이 존재하지 않는 경우의 5' 말단으로부터 RNA 가닥을 소화함으로써 rRNA이지만 mRNA가 아닌 5' 말단을 소화한 5'-3' 특정 엑소뉴클레아제를 노출시킨다. d1)단계에 있어서, 핵산 서열 태그 L은 2중 가닥(ds) 특이적 리가아제를 사용하여 cDNA의 3' 말단에 라이게이팅된다. 그들의 RNA의 5' 말단-서열과 혼성물로 존재하는 3' 말단 서열을 지닌 cDNA만이 상기 라이게이션에 관여한다. 따라서, 캡이 e) 엑소뉴클레아제 소화로부터 보호한 mRNA 분자의 cDAN만이 올리고뉴클레오티드 L과 태깅하고 있다.
도 1b :
본 발명의 다른 실시형태의 개략도로서,
템플릿 RNA 상의 캡의 존재를 보류하면-cDNA 분자는 5'오버행을 지닌 2중 가닥 어댑터를 사용하여 3' 말단에 라벨링된다.
a) 도 1a와 같이, 5' 캡을 갖는 mRNA(i) 및 5' 포스페이트를 갖는 rRNA(ii)는 랜덤 프라이머 P로 프라이밍되고, 역전사되어 b) RNA::cDNA 혼성물을 생성한다. c) 라이게이션 부위에 단일 뉴클레오티드 5' 오버행을 지닌 2중 가닥 어댑터의 형태로 핵산 서열 태그 L이 2중 가닥(ds) 특이적 리가아제를 사용하여 cDNA의 3' 말단에 라이게이팅된다. 이들 RNA의 5' 말단-서열과 혼성으로 존재하지만 캡 구조 이상으로 연장되지 않는 3' 말단 서열을 지닌 cDNA만이 상기 라이게이션에 관여한다. 따라서, d) 캡이 어댑터 라이게이션에 제공된 mRNA 분자의 cDNA만이 올리고뉴클레오티드 L과 태깅하고 있다.
도 2a :
실시예 1A의 결과를 나타낸다. c0/c1 캐핑된 인공 RNA 상의 (절단된) T4 RNA 리가아제에 의한 2중 가닥 특이적 라이게이션이 다른 길이의 cDNA와 혼성된다.
도 2b :
실시예 1B의 결과를 나타낸다. c0 캐핑 또는 논캐핑된 인공 RNA 상의 T4 RNA 리가아제에 의한 2중 가닥 특이적 라이게이션이 다른 길이의 cDNA와 혼성된다.
도 3 :
실시예 2 : 인공 RNA/cDNA 혼성물의 T7 엑소뉴클레아제 소화의 결과를 나타낸다.
도 4:
mRNA::cDNA 혼성물에 대한 핵산 서열 태그의 캡 의존성 라이게이션 및 역전사.
a) 어세이 설치를 설명한다. RNA 분자(서열 번호: 3-5, 7, 8)가 RT 반응 동안에 연장되는 5' PTO 보호 프라이머(서열 번호: 6)로 프라이밍되어 cDNA(서열 번호: 9)를 얻는다. 역상보 서열(서열 번호: 12)과 혼성화되는 링커 올리고뉴클레오티드(서열 번호:11)가 cDNA와 라이게이팅되어 링커 태깅된 cDNA 분자(서열 번호: 13)를 얻는다.
b) 및 c)는 실시예 3의 결과를 나타낸다.
도 5a:
실시예 4 : 처리 또는 미처리된(XRN-1, TAP) cDNA 샘플의 PCR 증폭 생성물의 결과를 나타낸다.
도 5b:
실시예 4B : 다른 실시형태에서 태깅된 cDNA 샘플의 PCR 증폭 생성물의 결과를 나타낸다.

실시예 1A: 정의된 서열의 인공 RNA 분자를 이용한 2중 가닥 특이적 라이게이 션의 조사

캡은 본질적으로 퓨린환의 N7 상에 메틸화되고, 트리포스페이트 가교를 통하여 RNA의 5' 말단과 그 5' 말단 상에 연결되는 구아노신인 구조가 존재하기 때문에, 라벨이 이와 같이 캐핑된 RNA와 혼성된 cDNA와 2중 가닥 특이적 방법으로 라이게이팅될 수 있는 경우는 이전에 공지되어 있지 않았다. 따라서, 인공 어세이에 있어서, 이와 같은 2중 가닥 특이성이 달성되는 경우, 다른 3'오버행 또는 3' 손실 뉴클레오티드를 지닌 올리고뉴클레오티드와 함께 캐핑된 R7 전사는 라이게이션 반응에 설정되어 조사되었다. cDNA에 여분의 뉴클레오티드가 요구되는 경우, 캡과 염기쌍 또는 중첩이 가능한지가 특별한 관심이었다.

라이게이션 :

다른 3' 연장에 의한 cDNA를 나타내는 여러가지 올리고뉴클레오티드(서열 번호: 22-26)는 Microsynth AG(Balgach, CH)에서 구입했고, 28nt PTO 보호된 5'오버행을 지닌 RNA(서열 번호: 4, 5)와 역상보이었다. 서열 번호: 22가 3' 연장을 갖지 않는 반면에, 서열 번호: 23은 캡 구조와 혼성화되는데 첨가되는 여분의 3'C를 갖는다. 다른 cDNA는 논탬플릿된 뉴클레오티드 부가(바람직하게는 Cs)와 유사하고, 첨가된 1(서열 번호: 24), 2(서열 번호: 25) 또는 5(서열 번호: 26)의 Cs를 더 갖는다. 또한, RNA를 전사하는 RT의 분리된 생성물을 모방하기 위해서, RT-프라이머(서열 번호: 6)가 cDNA의 탬플릿으로서 사용되었다.

33nt의 인비트로 전사된 RNA 탬플릿(서열 번호: 4, 5)의 생성에 대해서는 실시예 3을 참조한다. 라이게이션이 9.76pmol의 2중 가닥 프리알데닐화된 어댑터(서열번호: 11, 12) 및 2pmol의 다른 cDNA(서열 번호: 6, 22-26)과 혼합된 2pmol c0(서열 번호: 4) 또는 c1(서열 번호: 5) RNA를 사용한 20㎕ 반응 혼합물로 행해졌다. 링커 올리고(서열 번호: 10)의 프리알데닐화 반응에 대해서는 실시예 3을 참조한다. 버퍼(50mM Tris(pH 7.8), 10mM MnC1₂, 5mM DTT), 20U RNasin Ribonuclease Inhibitor(Promega Corporation, Wisconsin, 미국), 0.033U PPase(Fermentas GmbH, St. Leon-Rot, 독일), 20% PEG 8000 및 절단된 200U T4 RNA 리가아제 2(New England Bi-olabs GmbH, Frankfurt am Main, 독일)를 포함한 모든 필요한 성분이 첨가되었고, 3시간 동안 25℃에서 인큐베이팅되었다. 실리카 웰 플레이트(바인딩 버퍼=20%(v/v) Gu-HCl/80%(v/v) EtOH, 워시 버퍼=20%(v/v) 100mM Tris, 400mM NaCl pH 7.5/80%(v/v) EtOH, 일루션 버퍼=10mM Tris pH 8.0)를 사용하여 실리카 정제 후, 전체 반응 혼합물이 100% 포름아미드 로딩 버퍼와 혼합되었고, 2분 동안 95℃에서 변성되었고, 아이스 상에서 냉각되었으며 15% 아크릴아미드/7M 우레아 겔에서 전기 영동에 의해 분석되었다.

결과를 도 2a에 나타낸다: 다른 레인에 있어서, 레인 2-7의 c0 캐핑된 RNA(서열 번호: 4) 또는 레인 8-13의 c1 캐핑된 RNA(서열 번호: 5) 중 어느 하나를 갖는 레인 2, 8 서열 번호: 22, 레인 3, 9 서열 번호: 23, 레인 4, 10 서열 번호 24, 레인 5, 11 서열 번호: 25, 레인 6, 12 서열 번호: 26 및 레인 7, 13 서열 번호: 6으로 나타내는 여러가지 cDNA가 묘사된다. 레인 1에 있어서, 100ng의 10bp DNA 래더(Life Technologies Corporation, New York, USA)가 로딩된다. cDNA에 따라서, 라이게이션은 소망의 88-94nt의 라이게이션 생성물을 얻을 수 있지만, 도 2a에 나타낸 바와 같이, 레인 2, 8에 있어서의 88nt 생성물(서열 번호: 27) 및 레인 3, 9에 있어서의 89nt 생성물(서열 번호: 28)을 나타내는 cDNA가 그 3' 말단에 1개 또는 여분이 없는 C를 갖는 경우에만 상기 생성물이 나타나므로, 엑소뉴클레아제 소화 단계에 있어서, 상기 RNA가 완전히 소화되지 않는 경우라도 cDNA에 라이게이션이 일어나서는 안된다. 또한, RT 동안에 발생된 cDNA 분리 생성물에 링커가 라이게이팅되지 않는 것을 나타내는 RT-프라이머와 링커의 라이게이션은 확인되지 않았다. 임의의 반응에 있어서만 라이게이션 생성물이 확인되고, cDNA 오버행이 존재하는 경우에는 라이게이션을 확인할 수 없기 때문에, 상기 라이게이션은 2중 가닥 특이적이다. cO 및 c1 캐핑된 RNA에 의해서도 동일한 결과가 얻어졌다. 또한, 캡과 관계없이 여분의 뉴클레오티드(C)가 부가될지의 여부는 링커가 상기 cDNA와 라이게이팅할 수 있는 것에 유의하는 것도 중요하다. 따라서, 바람직하게는 RNA의 캡에 도달할 때 뉴클레오티드를 부가하지 않거나 1개만 부가하도록 상기 RT는 조절되어야 한다.

실시예 1B: 캐핑 또는 논캐핑 RNA :: cDNA 혼성물에 5'오버행을 지닌 어댑터의 2중 가닥 특이적 라이게이션을 조사

상술한 바와 같이, 캐핑 RNA(mRNA)의 역전사 동안에, 역전사 효소가 cDNA에 추가의 뉴클레오티드(C)를 바람직하게 첨가하지 않는 경우, 상기 캡은 1개의 뉴클레오티드 오버행을 제공한다. 그러나, 상기 캡 오버행은 RNA의 5' 말단에 트리포스페이트 가교를 통해 더 연결되는 역뉴클레오티드로 이루어진다. 따라서, 링커 올리고의 2중 가닥 특이적 라이게이션을 cDNA의 3' 말단에 가능하게 하는 방식으로 어댑터의 5'오버행에 의해 캡 오버행이 상호작용할 수 있는 경우(예를 들면, 염기 중첩 또는 염기쌍)에 조사되었다.

상기 캐핑 RNA와는 달리, 역전사 효소는 논캐핑 RNA의 5' 말단에 도달한 경우, 비탬플릿 방식으로 추가 뉴클레오티드를 cDNA에 부가하거나 평활 말단을 잔존시키는 것 중 어느 하나이다. 따라서, 평활 말단 또는 cDNA 오버행을 잔존하는 cDNA와 혼성으로 비캐핑 RNA가 존재하는 대조 반응이 포함되었다. 여기서, 2중 가닥 특이적 리가아제는 cDNA에 5'오버행을 지닌 어댑터를 라이게이팅하지 않아야 한다.

요약하면, 5' 오버행을 지닌 어댑터가 이러한 캐핑 RNA:cDNA 혼성물과 라이게이팅하지만 논캐핑 RNA:cDNA 혼성물과는 라이게이팅하지 않는 경우, 이것은 캐핑 RNA로부터 발생된 cDNA에 대한 선택적 메카니즘을 제공한다.

라이게이션:

여러가지 3' 연장을 갖는 cDNA을 나타내는 여러가지 올리고뉴클레오티드(서열 번호: 36-41)는 Microsynth사 AG(Balgach, CH)에서 구입했다. 이들은 RNA에 역상보(서열 번호: 4)이고, 길이가 26-30nt이다. 서열 번호 36은 캡 구조와 매칭되는 3'잔기를 갖지 않고, 서열 번호 37은 캡구조와 염기쌍 또는 중첩할 수 있는 부가된 여분의 3'C를 갖는다. 다른 cDNA는 논탬플릿 뉴클레오티드 첨가(바람직하게는 Cs)와 유사하고, 부가된 1(서열 번호: 38), 2(서열 번호: 39), 3(서열 번호: 40) 또는 4(서열 번호: 41) Cs를 더 갖는다.

33nt의 인비트로 전사된 RNA 탬플릿(서열 번호: 4)의 생성에 대해서는 실시 예 3을 참조한다. 라이게이션이 20pmol의 2중 가닥 프리알데닐화된 어댑터(서열번호: 34, 35) 및 2pmol의 여러가지 cDNA(서열 번호: 36-41)와 혼합된 2pmol c0(서열 번호: 4) 또는 논캐핑(서열 번호: 3) RNA를 사용한 20㎕ 반응 혼합물로 행해졌다. 링커 올리고(서열 번호: 34)의 프리알데닐화 반응에 대해서는 실시예 3을 참조한다. 버퍼(50mM Tris(pH 7.5), 10mM MnC1₂, 1mM ATP, 10mM DTT), 20U RNasin Ribonuclease Inhibitor(Promega Corporation, Wisconsin, 미국), 0.033U PPase(Fermentas GmbH, St. Leon-Rot, 독일), 20% PEG 8000 및 400U T4 RNA 리가아제(New England Bi-olabs GmbH, Frankfurt am Main, 독일)를 포함한 모든 필요한 성분이 첨가되었고, 3시간 동안 25℃에서 인큐베이팅되었다. 실리카 웰 플레이트(바인딩 버퍼=20%(v/v) Gu-HCl/80%(v/v) EtOH, 워시 버퍼=20%(v/v) 100mM Tris, 400mM NaCl pH 7.5/80%(v/v) EtOH, 일루션 버퍼=10mM Tris pH 8.0))를 사용하여 실리카 정제 후, 전체 반응 혼합물이 100% 포름아미드 로딩 버퍼와 혼합되었고, 2분 동안 95℃에서 변성되었고, 아이스 상에서 냉각되었으며 15% 아크릴아미드/7M 우레아 겔에서 전기 영동에 의해 분석되었다.

결과를 도 2b에 나타낸다: 다른 레인에 있어서, 서열 번호:36-41의 레인 8-13 및 레인 2-7의 세트로 나타내는 여러가지 cDNA가 각각 묘사된다. 반응은 c0 캐핑 RNA(서열 번호: 4, 레인 2-7) 또는 논캐핑 RNA(서열 번호: 3, 레인 8-13) 중 어느 하나를 함유했다. 레인 1에 있어서, 100ng의 10bp DNA 래더(Life Technologies Corporation, New York, USA)가 로딩된다. cDNA에 따라서, 라이게이션은 소망의 50-55nt의 라이게이션 생성물을 얻을 수 있다. 도 2b에 나타낸 바와 같이, RNA 캡 구조 위치의 반대측의 임의의 뉴클레오티드가 없는 c0 RNA 및 cDNA(서열번호: 36)에 의한 반응에 있어서, 생성물이 50nt 밴드(서열 번호: 42)만으로서 나타난다. 논캐핑 RNA(서열 번호: 3)에 의한 반응은 어떠한 라이게이션 생성물(레인 8-13)이 얻어지지 않았다. 이것은 cDNA를 캡 구조의 RNA 바로 하류의 +1 잔기와 상보적 위치를 초과하여 연장하지 않은 채, 논캐핑 RNA이지만 캐핑 RNA가 아닌 위치에서 라이게이션이 일어나지 않는 것을 나타낸다. 서열 번호 36-41 등의 cDNA가 얻어지는 RT에서의 임의의 논탬플릿 뉴클레오티드 첨가가 라이게이팅되지 않는다. 또한, 레인 3-13에 있어서의 비정상적인 라이게이션 생성물이 없는 것은 상기 라이게이션이 2중 가닥 특이적인 것을 나타낸다.

실시예 2: 다른 5' 말단을 갖는 인공 RNA 의 T7 엑소뉴클레아제 소화

다른 cDNA 분자와의 혼성시에 다른 5' 말단의 엑소뉴클레어제 소화의 특이성을 나타내기 위해서, 인공 올리고뉴클레오티드를 사용한 실험이 행해졌다.

혼성:

T7 엑소뉴클레아제 소화를 위한 템플릿은 cDNA(서열 번호: 22, 23)와 유사한 다른 올리고스와 RNA(서열 번호: 4, 7, 8)의 PAGE 정제 혼성물에 대해 행했다. 다른 RNA(서열 번호: 7, 8)는 Eurogentec(Seraing, 벨기에)에서 구입했다. 혼성은 2%의 램프 스피드(ABI 9700, 써멀 실린더) 및 등체적의 2×혼성 버퍼(100mM Tris pH 7.9, 6mM MgCl)의 첨가에 의해 45℃까지 냉각시키면서, 30초 동안 95℃까지 10mM Tris pH 7.0으로 RNA 및 올리고스를 가열함으로써 행해졌다. 15분 동안 유지한 후, 2%의 램프 스피드로 4℃까지 온도가 더욱 감소되었다. 이어서, 네이티브 15% 아크릴아미드겔 상에 정제된 PAGE, 서열 번호: 4/서열 번호: 22, 서열 번호:4/서열 번호:23, 서열 번호7/서열 번호:22, 서열 번호:8/서열 번호:22가 합성되었다.

T7 엑소뉴클레아제 소화:

20㎕ 반응 혼합물에 있어서, 50ng의 모든 혼성물이 버퍼(20mM Tris-아세테이트, 50mM 포타슘아세테이트, 10mM 마그네슘 아세테이트, 1mM DTT, 25℃에서 pH 7.9) 및 New England Bioabs GmbH(Frankfurt am Main, 독일)의 20U의 T7 엑소뉴클레아제(10U/㎕)를 포함하는 모든 필요 성분과 혼합되었다. 상기 반응은 30분 동안 37℃에서 행해졌고, 실리카 웰 플레이트(바인딩 버퍼=20%(v/v) Gu-HCl/80%(v/v) EtOH, 워시 버퍼=20%(v/v) 100mM Tris, 400mM NaCl pH 7.5/80%(v/v) EtOH, 일루션 버퍼=10mM Tris pH 8.0))를 사용하여 실리카 정제했다. 전체 반응 혼합물이 100% 포름아미드 로딩 버퍼와 혼합되었고, 2분 동안 95℃에서 변성되었고, 아이스 상에서 냉각되었으며 15% 아크릴아미드/7M 우레아 겔에서 전기 영동에 의해 분석되었다.

결과는 도 3에 나타낸다:

다른 레인에 있어서, 다른 cDNA(서열 번호: 22, 23)와 혼성된 다른 RNA(서열 번호: 4, 7, 8)로 이루어지는 다른 혼성물을 나타낸다. 레인 2, 4, 6, 8은 엑소뉴클레아제 소화 후의 혼성물을 나타내는 반면에 레인 3, 5, 7, 9에 대해서는 반응을 행하지 않았다. 서열 번호: 22를 지닌 5' OH를 갖는 RNA(서열 번호: 8)가 레인 2, 3에 삽입되고, 레인 4, 5에 서열 번호: 22를 지닌 5'P를 갖는 RNA(서열 번호: 7), 레인 6, 7에 서열 번호: 22를 지니고, 서열 번호: 23을 지닌 5' 캡을 갖는 RNA(서열 번호: 4)를 삽입하여 레인 8, 9에 있어서, 역전사를 통해 캡에 대해 여분의 뉴클레오티드 첨가를 모방하였다. Fermentas GmbH(st. Leon-Rot, 독일)사의 100ng의 GeneRuler^TM 1kb 플러스 DNA 래더가 레인 1 및 10에 나타낸다.

소화 후, 모든 cDNA는 반응 중에 남는 반면에, 5'P(레인 4)를 지닌 RNA는 완전히 소화되면서, 5' OH RNA(레인 22)가 >95% 소화되었다. 상기 캐핑 RNA에 대해서는 cDNA의 길이에 따라서 차이가 보였다. RNA(서열 번호: 22)를 지닌 평활 말단이 존재하면, 캐핑 RNA는 부분적으로 소화되는 반면에(레인 6), 캡 구조에 대해서 cDNA가 여분의 뉴클레오티드를 함유하여 레인 8과 혼성되거나 중첩되는 경우(서열 번호: 23), 엑소뉴클레오제 소화에 대해 더욱 보호된다.

실시예 3: 인공 RNA 분자를 사용한 개념 입증

본 발명의 바람직한 실시형태의 특이성 및 감도를 조사하기 위해서, 개념 실험의 입증이 규정된 서열의 RNA 분자를 사용한 어세이에서 나타내어진다. 어세이 설치의 아웃라인에 대해서는 도 4a를 참조하고, 그 결과에 대해서는 도 4b 및 c를 참조한다.

인비트로 전사 33nt의 RNA 템플릿의 생성:

T7 인비트로 전사를 위한 템플릿이 T7 프로모터 서열을 1개 포함하는 2개의 올리고뉴클레오티드(서열 번호: 1, 2)의 혼성화에 의해 생성되었다. 혼성화는 2%의 (ABI9700 써멀 실린더 상의) 램프 스피드로 45℃로 냉각시키고, 등체적의 2x 혼성 버퍼(100mM Tris pH7.9, 6mM MgCl)의 첨가에 의해, 10mM Tris pH 8.0에서 상기 올리고뉴클레오티드를 30초 동안 95℃까지 가열함으로써 행해졌다. 15분 동안 유지 후, 상기 온도가 2%의 램프 스피드로 4℃까지 더 감소되었다. 이어서, Epicentre's AmpliScribe T7 High Yield Transcription Kit(Epicentre® Biotechnologies, Wisconsin, 미국)를 사용하여 T7 인비트로 전사에 이들 템플릿이 사용되었고, 그 후, PAGE 정제되었다. 5' 트리포스페이트를 지닌 33nt 인비트로 전사 RNA(서열 번호: 3)는 ScriptCap 2'-O-메틸트랜스페라아제를 포함한 ScriptCap m7G Capping System을 사용하여 더 캐핑된 c0(서열 번호: 4) 및 c1(서열 번호: 5)이었다.

cDNA 합성:

제 1 가닥 cDNA 합성은 Promega Corporation(Wisconsin, 미국)(200 U/㎕)사의MMLV -H점 돌연변이를 사용하여 행했다. cDNA 합성을 위한 5'-PTO 보호된 서열 특이성 프라이머(서열 번호: 6)는 Microsynth AG(Balgach, 스위스)로부터 구입되었다. 각각의 20㎕ 반응 혼합물에 있어서, 2pmol의 다른 RNA(서열 번호: 3-5, 7, 8) 및 4pmol의 올리고(서열 번호: 6)를 50mM의 Tris-HCl(pH는 8.3), 75mM의 KCl, 3mM의 MgCl₂, 10mM의 DTT, 각 0.5mM의 dNTP, 20U의 RNasin Ribonuclease Inhibitor(Promega Corporation, Wisconsin, 미국) 및 200U의 역전사 효소를 포함하는 모든 필요한 성분과 혼합하였다. 5' OH(서열 번호: 8)를 지닌 RNA에 대해서 Affymetrix(California, 미국, 1U/㎕)의 1U 오키아나제 및 0.5mM rATP를 반응 혼합물에 첨가했다. 반응은 4분 동안 37℃에서 개시되었고, 이어서 30분 동안 46℃에서 유지되어 55nt 긴 cDNA(서열번호: 9)를 얻었다. 이어서, 제 1 가닥 합성 샘플이 96웰 실리카 플레이트(바인딩 버퍼=20%(v/v) Gu-HCl/80%(v/v) EtOH)를 사용하여 실리카 정제되었고, 워시 버퍼=20% (v/v) 100mM Tris, 400mM NaCl pH 7.5/80% (v/v) EtOH로 2번 세정되었고, 12㎕의 10mM Tris pH 7.0으로 용출했다.

5-3' 엑소뉴클레아제 소화:

cDNA(서열 번호:9): RNA(서열 번호: 3-5, 7, 8) 혼성물은 New England Biolabs GmbH(Frankfrut am Main, 독일)의 람다 엑소뉴클레아제(5U/㎕) 또는 XRN-1(1U/㎕) 중 어느 하나를 사용하여 5'-3' 엑소뉴클레아제 소화에 노출되었다. 상기 XRN-1 반응은 20㎕로 행해졌고, 50mM Tris-HCl(25℃에서 pH 7.9), 100mM NaCl, 10mM MgCl₂, 1mM DTT, 20% PEG 8000 및 1U의 효소가 함유된 반면에, 람다 엑소뉴클레아제에 대해서는 30㎕에 있어서, 상기 반응 성분은 67mM의 글리신-KOH(pH가 9.4, 25℃에서, 2.5mM의 MgCl₂, 50㎍/㎖의 BSA, 20% PEG 8000 및 15U의 람다 엑소뉴클레아제가 포함되었다. 양 반응은 60분 동안 37℃에서 행해졌고, 96웰 실리카 플레이트(바인딩 버퍼=20%(v/v) Gu-HCl/80%(v/v) EtOH, 워시 버퍼=20%(v/v) 100mM Tris, 400mM NaCl pH 7.5/80%(v/v) EtOH, 일루션 버퍼 10mM Tris pH 7.0)를 사용하여 실리카 정제되었다.

올리고뉴클레오티드의 프리알데닐화:

이 단계는 Lau, et al.(13)에 따라서 행해졌다. 요약하면: 15ml의 시약 혼합물(N,N-디메틸포름아미드에 있어서, 66.67mM 트리페닐포스핀, 66.67mM 2,2'-디피리디디술피드(=알드리티올-2), 166.7mM 이미다졸 및 433mM 트리에틸아민으로 이루어짐)에 15ml의 33.3mM 아데노신-5'-모노포스페이트, 유리산(N,N-디메틸포름아미드에 있어서)의 첨가에 의해 Imp A가 제조되었다. 그런 후, 반응액이 격렬하게 교반된 석출 버퍼(26.5mM NaClO₄, 66.18% 아세톤 및 33.82% 디에틸에테르로 이루어지는 340ml)에 첨가되었고, Imp A가 석출될 것이다. 상기 석출물 중량은 아세톤으로 균일화되었고, 50ml의 아세톤 및 50ml 순수 디에틸에테르의 2개의 연속 세정 공정에 의해 5분 동안 3,000x g으로 원심 분리되었고, 20분 동안 3,000x g에서 스핀 다운되었다. 상기 석출물(Imp A)은 진공 데시케이터에서 하룻밤 건조되었다.

5'포스포릴화 링커(Microsynth AG(Balgach, CH)에서 구입, 서열 번호: 10)의 알데닐화는 200μM의 올리고와 25mM MgCl₂ 및 50.05mM Imp A을 혼합하고, 3시간 동안 50℃에서 반응 혼합물을 인큐베이팅함으로써 행해졌다. 이어서, 상기 프리알데닐화 링커(서열 번호: 11)는 PAGE 정제되었다.

라이게이션:

엑소뉴클레아제 소화된 샘플의 cDNA(서열 번호: 9)가 프라이머와 혼성된 프리아데닐화 링커(서열 번호: 11)의 2중 가닥 어댑터를 사용하여 상보 서열(서열 번호: 12)과 라이게이팅되었다. 따라서, 9.76pmol의 양 올리고뉴클레오티드가 50mM Tris(pH 7.8), 10mM MnCl₂, 5mM DTT, 20U RNasin Ribonuclease Inhibitor(Promega Corporation, Wisconsin, 미국), 0.033U PPase(Fermentas GmbH, St.Leon-Rot, 독일), 20% PEG 8000 및 절단된 200U T4 RNA 리가아제 2(New England Biolabs, GmbH, Frankfurt am Main, 독일)를 함유하는 40㎕ 반응 혼합물에 혼합되었고, 3시간 동안 25℃에서 인큐베이팅되었다. EtOH 석출 후, 샘플이 100% 포름아미드 로딩 버퍼와 혼합되었고, 2분 동안 95℃에서 변성되었고, 아이스 상에서 냉각되었고, 15% 아크릴아미드/7M 우레아 겔에서의 전기 영동에 의해 분석되었다. 라이게이션은 82nt 소망의 라이게이션 생성물 및 59 또는 60nt 단편을 얻는 3'OH가 없는 RNA(서열 번호: 14, 서열 번호: 30-32)와의 링커의 백그라운드 라이게이션을 얻을 수 있다.

람다 엑소뉴클레아제 결과에 대해서는 도 4b에 나타내어진다.

다른 레인에 있어서, 역전사, 엑소뉴클레아제 소화 및 라이게이션을 위한 RNA(서열 번호: 3-5, 7, 8)가 다른 5' 말단을 갖고 변경되었다. 모노포스페이트를 지닌 RNA(서열 번호: 7)는 레인 2-4에 있고, 레인 5-7에 OH(서열 번호: 8), 레인 8-10에 c0캡(서열 번호: 4) 및 레인 11-13에 c1캡(서열 번호: 5)이 있다. 55nt 긴 cDNA(M-MLV의 말단 트랜스페라아제 활성으로 인해 첨가된 +1-3nt)를 나타내는 레인 2, 5, 8, 11에 역전사 후 샘플이 묘사된다. 각각의 RNA를 갖는 엑소뉴클레아제 소화 후의 샘플이 3, 6, 9, 12에 나타내어지고, 라이게이션 후에는 레인 4, 7, 10, 13에 나타내어진다. 레인 1 및 14는 100ng의 사이즈 마커(10bp DNA 래더, Life Technologies Corporation, New York, 미국)를 나타낸다.

RNA(P/OH/cap)의 5' 말단에 따라서, cDNA의 3' 말단에 논템플릿 뉴클레오티드 첨가의 양은 변경된다. 5' OH/P 1-3nt를 지닌 RNA에 대해서 첨가되지만, 이것은 라이게이션이 용이한 캡 구조(c0/c1)에 대해서 1nt만이 약 95%인 것이다.

람다 엑소뉴클레아제(레인 3)를 지닌 소화 단계 후, 5'모노포스페이트를 지닌 RNA가 소화되는 한편, 다른 모든 RNA(5' OH, c0, c1)는 보호되고, 82nt(서열 번호: 13)에서 소망의 라이게이션 생성물이 얻어지지만, 또한 링커(서열 번호: 11)와 RNA의 3' 말단의 라이게이션을 나타내는 62-63nt에서 기능한 백그라운드 반응물(59nt 또는 60nt; 서열 번호: 14, 30, 31)이 나타나는 반응 중에 잔존하는 것을 확인할 수 있다. 상기 라이게이션은 RT-프라이머가 폴리 A 태일을 내부로 프라이밍할 때, mRNA에 의해 발생되지 않고, 따라서 상기 RNA의 3' 말단은 프라이머에 의한 2중 가닥 형성에 존재하지 않고, 2중 가닥 특이적 라이게이션이 발생될 수 없다.

XRN-1의 결과는 도 4c에 나타낸다.

레인 14-16에 있어서의 오키나제(Affymetrix California, 미국, 1U/㎕) 및 레인 17-19에 있어서의 트리포스페이트(서열 번호: 3)로 포스포릴화된 5' OH RNA(서열 번호: 8)을 포함한 상기 도 4a의 설명을 참조하고, 또한 레인 14 및 17은 역전사 후, 엑소뉴클레아제 소화 후의 레인 15 및 18, 및 각각의 RNA에 의한 라이게이션 후의 레인 16 및 19의 샘플을 나타낸다. 레인 1 및 20은 100ng의 사이즈 마커(10bp DNA 래더, Life Technologies Corporation, New York, 미국)를 나타낸다. 5'모노포스페이트를 지닌 RNA는 XRN-1(레인 3)로 소화되는 반면에, 5' OH, c0, c1 또한 5'3p를 지닌 RNA도 소화로부터 보호되고, 소망의 라이게이션 생성물(82nt, 서열 번호:13)을 얻는 반응에 잔존한다. 59-60nt 생성물(62-63nt로 기능함)을 나타내는 람다 엑소뉴클레아제에 대해 동일한 백그라운드 반응이 발생한다.

Optikinase에 의한 5' OH를 지닌 RNA의 포스포릴화는 RNA를 제조하고, 또한 엑소뉴클레아제 소화에 용이하며, 또한 2중 가닥 특이적 라이게이션을 발생할 수 없다(도 4c, 레인 16).

실시예 4A: 천연원의 캐핑 또는 디캐핑 RNA 샘플상의 POC 의 확인

프로토콜이 천연원의 캐핑 mRNA에 특이적인지의 여부를 조사하기 위해서, 캐핑 mRNA를 타바코산 피로포스파타아제(TAP)로 디캐핑된 mRNA와 비교하는 어세이를 설정했다. TAP 처리는 5'-3' 엑소뉴클레아제 소화에 감응하는 RNA 분자가 되게 하는 5'모노포스페이트가 되게 한다. 따라서, 이러한 디캐핑 mRNA로부터의 cDNA의 3' 말단이 RT 및 엑소뉴클레아제 소화 후 혼성되지 않고, 따라서 2중 가닥 특이적 라이게션에 참여하지 않는다. 연속 qPCR에 있어서, 글로벌 cDNA 증폭이 행해져 Ct값을 기록했다. 상기 mRNA 샘플(+ cap) 및 Tap 처리 mRNA(- cap) 간의 이들 Ct값의 델타는 프로토콜의 감도를 나타낸다.

총 RNA의 TAP 처리

타바코산 피로포스파타아제(TAP, Epicentre Biotechnologies, Wisconsin, 미국), (1U/㎕)가 마우스 간으로부터의 총 RNA를 디캐핑하는데 사용되었다. 상기 반응은 제조자에 따라서 행해졌고, EtOH 석출에 의해 정제되었다.

cDNA 합성:

제 1 가닥 cDNA 합성은 Promega Corporation(Wisconsin, 미국)(200U/㎕)로부터 MMLV -H점 뮤턴트를 사용하여 행했다. cDNA 합성을 위해 5'PTO 보호된 올리고 dT 프라이머(서열 번호: 15)는 Sigma-Aldrich Handels GmbH(Missouri, 미국)로부터 구입했다. 2μg의 총 RNA, 50nM의 올리고(서열 번호: 15) 및 20U의 RNasin Ribonuclease Inhibitor(Promega Corporation, Wisconsin, 미국)는 10㎕ 체적으로 혼합되었고, 1분 동안 41℃까지 온도의 연속 감소가 지속되면서 30초 동안 70℃에서 변성되었다. 최종 반응 체적 20㎕에 버퍼(50mM Tris-HCl(pH 8.3), 75mM KC1, 3mM MgCl₂ 및 10mM DTT), 각 0.5mM의 dNTP 및 200U의 역전사 효소를 포함하는 모든 다른 필요 성분의 첨가 후, 반응이 41℃에서 2분 동안 더 계속되었고, 이어서, 50분 동안 46℃에서 유지된 후, 페놀/클로로포름 추출 및 EtOH 석출에 의해 정제되었다.

5'-3' 엑소뉴클레아제 소화:

New England Biolabs GmbH(Frankfurt am Main, 독일)(1U/㎕)사의 XRN-1을 사용하여 5'-3' 엑소뉴클레아제 소화에 샘플이 노출되었다. 반응 혼합물 20㎕는 버퍼(50mM Tris-HCl, 100mM NaCl, 10mM MgCl₂, 1mM DTT; (25℃에서 pH 7.9), 20% PEG 8000 및 1U의 효소를 함유했다. 반응이 60분 동안 37℃에서 행해졌고, 이어서 페놀/클로로포름 추출 및 EtOH 석출에 의해 정제되었다.

라이게이션:

상기 cDNA(이전의 엑소뉴클레아제 소화가 있거나 없음)가 올리고뉴클레오티드의 상보 서열(서열 번호: 12)와 혼성된 프리알데닐화된 링커(서열 번호: 11, 실 시예 3 참조)의 2중 가닥 어댑터를 사용하여 라이게이팅되었다. 40㎕의 라이게이션 반응에 대해서, 22.4pmol의 양 올리고뉴클레오티드(~30% 프리알데닐화, 실시예 3 참조, 서열 번호: 11)가 버퍼(50mM Tris(pH 7.8), 10mM MnC1₂, 5mM DTT), 20U RNasin Ribonuclease Inhibitor(Promega Corporation, Wisconsin, 미국), 0.033U PPase(Fermentas GmbH, St. Leon-Rot, 독일), 20% PEG 8000 및 절단된 200U T4 RNA 리가아제(New England Biolabs GmbH, Frankfurt am Main, 독일)(200U/㎕)를 포함하는 모든 필요 성분과 혼합되었고, 3시간 25℃에서 인큐베이팅되었고, 이어서, 페놀/클로로포름 추출 및 EtOH 석출에 의해 정제되었다.

qPCR 증폭:

1㎕ cDNA(2μg 총 RNA로부터 합성, 정제 후 pH 8.0의 20㎕ 10mM Tris에서 용해), 버퍼(50mM Tris-Cl pH 9.2, 16mM 암모늄술페이트, 0.025% Brij 58, 및 5.1mM 마그네슘 클로라이드), 1.3M 베타인, 1.3% DMSO, 각각의 0.4mM dNTP, 0.3μM 5'(서열 번호: 16) 및 3'(서열 번호: 17) 프라이머, 1.2U Klen Taq AC(DNA Polymerase Technology Inc., Missouri, 미국, 5U/㎕), 0.3U Pfu(Promega Corporation, Wisconsin, 미국, 3U/㎕) 및 0.1×SYBR Green I을 포함하는 20㎕ 반응 혼합물에서 실시간 PCR이 행해졌다. 샘플이 15초 동안 95.8℃에서 변성되었고, 15초 동안 95.8℃, 30초 동안 55℃, 20분 동안 74℃에서 42회 반복되었다. PCR 생성물은 실리카겔 컬럼(바인딩 버퍼=20%(v/v) Gu-HCl/80%(v/v) EtOH, 워시 버퍼=20%(v/v) 100mM Tris, 400mM NaCl pH 7.5/80%(v/v) EtOH)을 사용하여 실리카 정제되었고, 20㎕ 10mM 트리스 pH 8.0에 용해되었고, 3㎕가 0.7% 아가로스겔 상에 로딩되었다.

결과는 도 5a에 나타낸다. 레인 2는 엑소뉴클레아제 처리가 없는 총 RNA의 합성된 cDNA의 증폭을 나타내는 반면에, XRN-1 소화 후의 동일한 RNA는 레인 3에 나타내어진다. 레인 4 및 5에 있어서, 소화가 행해지지 않거나(레인 4) 또는 소화가 행해진(레인 5) TAP 처리된 RNA가 사용되었다. 100ng의 GeneRuler™ 1kb 플러스 Fermentas GmbH(St. Leon-Rot, 독일)사의 DNA 래더가 레인 1 및 레인 6에 나타내어진다. 상응하는 Ct-값은 22.44(레인 2), 23.84(레인 3), 22.82(레인 4) 및 26.76(레인 5)이었다. 5' 모노포스페이트에 의해 디캐핑된 RNA는 TAP 처리되지 않는 RNA에 비하여 XRN-1에 의해 소화된 후, 감소된 밴딩 패턴 및 높은 ct-값이 얻어졌다.

실시예 4B: 5'오버행을 지닌 어댑터와 mRNA 의 역전사에 의해 생성된 cDNA ::캐핑 RNA 혼성물의 라이게이팅 확인

실시예 2A에 있어서, 캡이 오버행으로서 제공되는 경우, 5'오버행을 지닌 어댑터가 캐핑 RNA::cDNA 혼성물에 라이게이팅한다. 그러나, 상기 캐핑 RNA::cDNA 혼성물이 캐핑 RNA의 역전사에 의해 생성될 때, 상기 캡 오버행만이 존재하고, 캡 전의 뉴클레오티드를 역전사 후, RT가 정지할 때, 임의의 다른 뉴클레오티드(들)를 더 첨가하지 않는다. 캡에 도달할 때, MMLV-RT(-H)가 바람직하게 1C를 첨가하는 종래 기술[9, 예를 들면, 도 2, 레인 1]에서 나타내는 바와 같이, 역전사 후 충분한 캡 오버행이 존재할 수 있다면, 이것은 명확하지 않았다. 그러나, 다른 발명자들은 예를 들면, 증가된 캡 오버행을 제공하는 dNTP 농도를 저하시킴으로써, 상기 캡 의존형 C 첨가가 감소될 수 있는 것을 발견했다. 따라서, 이러한 바람직한 역전사 조건 하이면, 실시예 4A의 결과가 얻어지는 실시예 2A에 나타낸 바와 같은 5'오버행을 지닌 어댑터와 라이게이팅될 수 있고, 캡오버행을 갖는 캐핑 RNA::cDNA 혼성물일 발생될 수 있는 것을 발견하였다.

cDNA 합성:

제 1 가닥 cDNA 합성은 Promega Corporation(Wisconsin, 미국)(200U/㎕)로부터 MMLV-H점 뮤턴트를 사용하여 행했다. cDNA 합성을 위해 5'PTO 보호된 올리고 dT 프라이머(서열 번호: 43)는 Sigma-Aldrich Handels GmbH(Missouri, 미국)로부터 구입했다. 마우스 간으로부터 2μg의 총 RNA, 50nM의 올리고(서열 번호: 43) 및 20U의 RNasin Ribonuclease Inhibitor(Promega Corporation, Wisconsin, 미국)는 10㎕ 체적으로 혼합되었고, 1분 동안 37℃까지 온도의 연속 감소가 지속되면서 30초 동안 70℃에서 변성되었다. 최종 반응 체적 20㎕에 버퍼(50mM Tris-HCl(pH 8.3), 75mM KC1, 3mM MgCl₂ 및 10mM DTT), 각 0.1mM의 dNTP 및 200U의 역전사 효소를 포함하는 모든 다른 필요 성분의 첨가 후, 반응이 37℃에서 2분 동안 더 계속되었고, 이어서, 50분 동안 46℃에서 유지되었다. 상기 샘플은 실리카 컬럼(바인딩 버퍼=20%(v/v) Gu-HCl/80%(v/v) EtOH, 워시 버퍼=20%(v/v) 100 mM Tris, 400mM NaCl pH 7.0/80%(v/v) EtOH)를 사용하여 정제되었고, 20㎕의 10mM Tris pH 8.0에서 용출되었다.

라이게이션:

상기 cDNA가 올리고뉴클레오티드의 상보 서열(서열 번호: 35)과 혼성된 프리알데닐화 링커(서열 번호: 34, 프리알데닐화에 대해서 실시예 3 참조)의 2중 가닥 어댑터를 사용하여 라이게이팅되었다. 20㎕의 라이게이션 반응 혼합물에 대해서, 4pmol의 양 올리고뉴클레오티드(~30% 프리알데닐화)가 버퍼(50mM Tris(pH 7.8), 10mM MnC1₂, 1mM ATP, 10mM DTT), 20U RNasin Ribonuclease Inhibitor(Promega Corporation, Wisconsin, 미국), 0.033U PPase(Fermentas GmbH, St. Leon-Rot, 독일), 20% PEG 8000 및 400U T4 DNA 리가아제(New England Biolabs GmbH, Frankfurt am Main, 독일)(200U/㎕)를 포함하는 모든 필요 성분과 혼합되었고, 3시간 동안 25℃에서 인큐베이팅되었고, 이어서, 실리카 웰 플레이트(바인딩 버퍼=20%(v/v) Gu-HCl/80%(v/v) EtOH, 워시 버퍼=20%(v/v) 100mM Tris, 400mM NaCl pH 7.5/80%(v/v) EtOH, 일루션 버퍼=10mM Tris pH 8.0)를 사용하여 정제하였다.

qPCR 증폭:

1㎕ cDNA(2μg 총 RNA로부터 합성, 정제 후 pH 8.0의 20㎕ 10mM Tris에서 용해), 버퍼(50mM Tris-Cl pH 9.2, 16mM 암모늄술페이트, 0.025% Brij 58, 및 5.1mM 마그네슘 클로라이드), 1.3M 베타인, 1.3% DMSO, 각각의 0.4mM dNTP, 0.3μM 5'(서열 번호: 45) 및 3'(서열 번호: 44) 프라이머, 1.2U Klen Taq AC(DNA Polymerase Technology Inc., Missouri, 미국, 5U/㎕), 0.3U Pfu(Promega Corporation, Wisconsin, 미국, 3U/㎕) 및 0.1×SYBR Green I을 포함하는 20㎕ 반응 혼합물에서 실시간 PCR이 행해졌다. 샘플이 15초 동안 95.8℃에서 변성되었고, 15초 동안 95.8℃, 30초 동안 55℃, 20분 동안 74℃에서 16회 반복되었다. PCR 생성물은 실리카겔 컬럼(바인딩 버퍼=20%(v/v) Gu-HCl/80%(v/v) EtOH, 워시 버퍼=20%(v/v) 100mM Tris, 400mM NaCl pH 7.5/80%(v/v) EtOH)을 사용하여 실리카 정제되었고, 20㎕ 10mM 트리스 pH 8.0에서 용출되었고, 3㎕가 0.7% 아가로스겔 상에 로딩되었다.

결과는 도 5b에 나타낸다. 레인 2는 총 RNA의 합성된 cDNA의 증폭을 나타낸다. 100ng의 GeneRuler™ 1kb 플러스 Fermentas GmbH(St. Leon-Rot, 독일)의 DNA 래더가 레인 1에 나타내어진다. 천연 RNA 인풋은 400에서 >500bp의 범위의 밴딩 패턴을 얻는 것을 확인할 수 있다.

실시예 5A: mRNA 또는 rRNA 과 cDNA 의 3' 태깅을 비교하는 총 RNA 샘플에 대한 POC 의 확인

리보솜 RNA(rRNA)는 총 RNA 샘플의 주종이다. 그러나, rRNA는 5'포스페이트를 가지기 때문에, 본 발명의 상기 5'-3'엑소뉴클레아제 소화 단계는 rRNA::cDNA 혼성물에서 rRNA를 삭제하고 따라서, 2중 가닥 특이적 라이게이션 단계에 있어서의 이들 cDNA 분자의 3' 말단을 라벨링하지 않는다. 이와 같이, 실시예 4와 동일한 어세이가 설정되어 이들 가설이 실험되었다. RT 동안에 랜덤 프라이머가 사용되어 mRNA 및 rRNA를 프라이밍했다. 원칙적으로, 반응 흐름은 도 1에 나타낸 바와 같다. 라이게이션 반응 동안에 첨가된 링커 서열과 혼성화되는 프라이머와 함께 rRNA(18s RNA) 및 mRNA에 대한 유전자 특이적 프라이머(액틴(act) 및 베타 2마이크로글로볼린(b2m))를 사용하여 qPCR 어세이는 라이게이션이 행해졌다.

+/-엑소뉴클레아제 반응의 Ct의 델타를 비교하면, 델타는 mRNA에 비하여 rRNA가 더욱 높았다. 상기 실시예에 있어서, 2개의 다른 5'-3' 특이적 엑소뉴클레아제는 XRN-1(Act=3.83) 및 람다 엑소뉴클레아제(Act=6.07)가 사용되었다.

cDNA 합성:

제 1 가닥 cDNA 합성은 Promega Corporation(Wisconsin, 미국, 200U/㎕)로부터 MMLV-H점 뮤턴트를 사용하여 행했다. cDNA 합성을 위해 5'PTO 보호된 오버행을 지닌 랜덤 노나머 프라이머(서열 번호: 18)는 Sigma-Aldrich Handels GmbH(Missouri, 미국)로부터 구입했다. 2μg의 총 RNA, 2.5μM의 올리고(서열 번호: 18) 및 20U의 RNasin Ribonuclease Inhibitor(Promega Corporation, Wisconsin, 미국)는 10㎕ 체적으로 혼합되었고, 30초 동안 70℃에서 변성되었고, 아이스 상에 위치되었다. 최종 반응 체적 20㎕에 버퍼(50mM Tris-HCl(pH 8.3), 75mM KC1, 3mM MgCl₂ 및 10mM DTT), 각 0.5mM의 dNTP 및 200U의 역전사 효소를 포함하는 모든 다른 필요 성분의 첨가 후, 20℃에서 1분 동안 유지되면서 46℃까지 온도가 서서히 증가하면서(ABI9700 써멀 사이클러 상의 5%의 램프 속도), 반응이 4℃에서 개시된 후, 페놀/클로로포름 추출 및 EtOH 석출에 의해 정제되었다.

XRN-1 엑소뉴클레아제 소화가 행해진 샘플:

샘플이 New England Biolabs GmbH(Frankfurt am Main, 독일)(1U/㎕)의 XRN-1에 노출되었다. 반응 혼합물(30㎕)은 버퍼(50mM Tris-HCl, 100mM NaCl, 10mM MgCl₂, 1mM DTT, 25℃에서 pH 7.9), 20% PEG 8000 및 3U의 효소를 포함했다. 반응이 60분 동안 37℃에서 행해졌고, 이어서, 페놀/클로로포름 정제되었다.

람다 엑소뉴클레아제 소화가 행해진 샘플:

샘플이 New England Biolabs GmbH(Frankfurt am Main, 독일)(5U/㎕)의 람다 엑소뉴클레아제에 노출되었다. 반응 혼합물(30㎕)은 버퍼(67mM 글리신-KOH, 2.5mM MgCl₂, 50μg/ml BSA, 25℃에서 pH 9.4), 20% PEG 8000 및 15U의 람다 엑소뉴클레아제를 포함했다. 반응이 60분 동안 37℃에서 행해졌고, 페놀/클로로포름 추출 및 EtOH 석출에 의해 정제되었다.

라이게이션은 실시예 4에 기재된 바와 같이 행해졌다.

유전자 특이적 qPCR:

1㎕ cDNA(2μg 총 RNA로부터 합성, 정제 후 pH 8.0의 20㎕ 10mM Tris에서 용해), 버퍼(50mM Tris-Cl pH 9.2, 16mM 암모늄술페이트, 0.025% Brij 58, 및 5.1mM 마그네슘 클로라이드), 1.3M 베타인, 1.3% DMSO, 각각의 0.4mM dNTP, 0.3μM 링커 특이적 5' 프라이머(서열 번호: 16), 0.3μM 유전자 특이적 3' 프라이머(18S에 대한 서열 번호: 19, act에 대한 서열 번호: 20, b2m에 대한 서열 번호: 21), 1.2U Klen Taq AC(DNA Polymerase Technology Inc., Missouri, 미국, 5U/㎕), 0.3U Pfu(Promega Corporation, Wisconsin, 미국, 3U/㎕) 및 1×SYBR Green I을 포함하는 20㎕ 반응 혼합물에서 실시간 qPCR이 행해졌다. 샘플이 15초 동안 95.8℃에서 변성되었고, 15초 동안 95.8℃, 30초 동안 55℃, 30초 동안 74℃에서 50회 반복되었다.

결과:

각 엑소뉴클레아제에 대해서, 각각의 실험이 행해졌다. 양 실험의 결과가 표 1에 나타내어진다.

	ct-값	Δct +/- Exo	ct-값	Δct +/- Exo	ct-값	Δct +/- Exo
XRN-1	18 S		act		b2m
-	23.9	3.83	35.36	-1.45	27.26	1.21
+	27.73		33.91		28.47
람다	18 S		act		b2m
-	22.14	6.07	33.35	1.48	35.64	0.54
+	28.21		34.83		36.18

표 1: 한 측상의 액틴과 베타 2 마이크로글로불린, 및 다른 측 상의 18S rRNA 간의 +/- 엑소뉴클레아제 반응을 비교한 qPCR 어세이의 결과.

상기 엑소뉴클레아제는 RNA::cDNA 혼성물에 있어서의 18S rRNA를 고갈시키는 것을 나타내는 18S rRNA에 대한 델타 Ct(+/- 엑소뉴클레아제)는 XRN-1 샘플에 대해서는 3.83이고, 람다 엑소뉴클레아제 샘플에 대해서는 6.07이다. 한편, mRNA가 소화로부터 대체로 보호되는 것을 나타내는 2개의 유전자에 대한 델타 Ct 평균(+/- 엑소뉴클레아제)는 XRN-1인 경우에는 0.015이고, 람다 엑소뉴클레아제에 대해서는 0.875이다. 그러나, mRNA에 대한 포지티브 델타 Ct는 실제 mRNA의 약간의 분해로 인하여 배제할 수 없었다. 이것은 5' 캡이 존재하는 mRNA로부터 cDNA를 라벨링만하는 것으로 본 발명의 목적 중 하나와 완전히 일치한다. 이들 결과는 mRNA 특이적 cDNA가 XRN-1에 대해서 약 14배 및 람다 엑소뉴클레아제에 대해서 약 62배 평균적으로 농축되어 있는 것을 나타낸다.

실시예 5B. 총 RNA +/- TAP 처리를 사용하여 실시예 4B에서 사용되는 5'오버행 어댑터 라이게이션의 캡 특이성을 확인하는 유전자 특이적 qPCR 어세이 .

라이게이션의 캡 특이성은 TAP 처리(+TAP)되거나 처리되지 않은 마우스 간으로부터 총 RNA를 사용하여 평가하였다. 타바코산 피로포스파타아제(TAP)는 mRNA의 캡 구조를 제거하고, RNA 상에 5' 말단을 잔존시켰다. 여기서, 베타-2-마이크로글로불린 mRNA는 5' 캡 구조를 원래 보호하는 참조용 mRNA로서 사용된 반면에, 18S 리보솜 RNA(18S rRNA)는 네이티브 5'P 말단을 지닌 대조구로서 사용되었다.

어세이:

TAP 처리가 행해지거나 행해지지 않은 총 RNA는 각 dNTP가 0.1mM인 것을 제외하고는 실시예 5A에 기재된 바와 같이 역전사되었다. 캡 의존성 링커 라이게이션은 실시예 1B에 기재된 바와 같고, PCR 어세이는 표 2에 기재된 프라이머에 의한 것을 제외하고는 실시예 5A와 같이 행했다. 내부 프라이머는 5'태깅 서열을 타게팅하지 않지만 유전자 특이적인 반면에, 5'-특이적 증폭은 5'태그 및 유전자 특이적 프라이머 결합 부위를 모두 요구한다.

결과 :

결과는 표 2에 나타낸다. TAP 처리가 행해지지 않은 샘플은 상응하는 내부 앰플리콘 보다 높은 18S rRNA 5'-특이적 앰플리콘에 대한 Ct값을 나타낸다. 9.8사이클의 ΔCt는 TAP 처리 샘플에 대해 거의 동일한 값(ΔCt 9.12)을 갖는 5'태깅의 결여를 나타낸다. 그러나, 상기 베타-2-마이크로글로불린 5'-특이성 및 b2m 내부 앰플리콘은 역전사된 캐핑 mRNA의 매우 효율적인 태깅(>50%)을 암시하는, TAP 샘플에 있어서 매유 유사한 Ct값(ΔCt 0.82)을 나타낸다. 5'-특이적 앰플리콘에 대해 높은 Ct((ΔCt 6.56사이클))에 의해 나타내어지는 바와 같이, TAP 처리는 이들 태깅을 현저하게 감소시킨다. 아울러, 이들 결과는 5'태그가 캐핑 mRNA의 cDNA와 특이적으로 라이게이팅할 수 있는 것을 나타낸다.

앰플리콘	프라이머	-TAP:Ct	+TAP:Ct
18S 5'	서열번호: 16&19	20.92	21.05
18S 내부	서열번호: 19&46	11.12	11.93
B2m 5'	서열번호: 16&21	18.92	25.39
B2m 내부	서열번호: 47&48	18.10	18.83

표 2: 총 RNA 샘플 +/- TAP 처리에서의 18S 리보솜 RNA 와의 비교에 있어서 베타-2-마이크로글로불린의 캡 특이적 5' 태깅을 조사하는 qPCR 어세이의 결과.

실시예 6: 링커와 cDNA 간의 결합을 결정하는 생어 시퀀싱( Sanger sequencing )

실시예 1의 인공 어세이에 있어서, 캡에 뉴클레오티드가 포함되거나 포함되지 않는 cDNA가 라이게이팅됨에 따라서, cDNA의 3' 말단과 링거 간의 결합에서의 서열이 천연원의 RNA 샘플에서의 RT 및 라이게이션 후와 같이 보이는 방법은 명확하지 않았고, 총 RNA의 샘플을 사용한 실험이 행해져 결정되었다.

cDNA 합성은 실시예 5와 동일하게 행했다.

XRN-1 엑소뉴클레아제 소화:

상기 cDNA는 New England Biolabs GmbH(Frankfurt am Main, 독일)(1U/㎕)의 XRN-1에 노출되었다. 상기 반응 혼합물(20㎕)은 버퍼(50mM Tris-HCl, 100mM NaCl, 10mM MgCl₂, 1mM DTT, 25℃에서 pH 7.9), 20% PEG 8000 및 1U의 효소를 포함했다. 상기 반응은 60분 동안 37℃에서 행해졌고, 페놀/클로로포름 추출 및 EtOH 석출에 의해 정제되었다.

람다 엑소뉴클레아제 소화는 실시예 5와 동일하게 행했다.

T7 엑소뉴클레아제 소화:

cDNA는 T7 엑소뉴클레아제에 노출되었다. 반응 혼합물(20㎕)은 버퍼(20mM 트리스-아세테이트, 50mM 포타슘 아세테이트, 10mM 마그네슘 아세테이트, 1mM DTT, 25℃에서 pH 7.9) 및 20U의 New England Biolabs GmbH(Frankfurt am Main, 독일)의 T7 엑소뉴클레아제(10U/㎕)를 포함했다. 반은은 60분 동안 25℃에서 행해졌고, 페놀/클로로포름 추출 및 EtOH 석출에 의해 정제되었다.

라이게이션은 실시예 4와 동일하게 행했다.

유전자 특이적 qPCR은 링커 특이적 5'프라이머(서열 번호: 16) 및 유전자 특이적 3'프라이머(b2m에 대한 서열 번호: 21)를 사용하여 실시예 5와 동일하게 행했다. 20㎕ 반응 혼합물 중 3㎕는 100% 포름아미드 로딩 버퍼와 혼합되었고, 2분 동안 95℃에서 변성되었고, 아이스 상에서 냉각되었으며 12% 아크릴아미드/7M 우레아 겔에서의 전기 영동에 의해 분석되었다. 약 299nt의 소망의 생성물 밴드가 행해졌고, 0.3M 소디움 아세테이트에서 인큐베이팅되었고, EtOH 석출되었으며 동일한 프라이머 및 상기한 바와 같은 반응 조건을 사용하여 23사이클 재증폭하였다. 실리카 컬럼(바인딩 버퍼=20%(v/v) Gu-HCl/80%(v/v) EtOH, 워시 버퍼=20%(v/v) 100mM Tris, 400mM NaCl pH 7.5/80%(v/v) EtOH), 20㎕ 10mM Tris pH 8.0에서 용출)을 사용하여 정제 후, 샘플이 Microsynth AG(Balgach, CH)에 의한 생어 시퀀싱을 위해 송부되었다.

시퀀싱 결과는 모두 추가 뉴클레오티드가 임의의 뉴클레오티드로 이루어질 수 있는 정크션에서의 캡에 나타나는 반면에 T>C>A=G가 바람직한 것을 나타낸다.

참고 문헌 일람표

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SEQUENCE LISTING <110> Lexogen GmbH <120> 5'protection dependent amplification <130> r64264 <150> EP12175694.4 <151> 2012-07-10 <160> 48 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> template nucleotide <400> 1 gctaatacga ctcactatag tt 22 <210> 2 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> template nucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> ribonucleotide <400> 2 aagcctatct atatgttctt gacaggtgac aactatagtg agtcgtatta gc 52 <210> 3 <211> 33 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> template nucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> 5' triphosphate <400> 3 guugucaccu gucaagaaca uauagauagg cuu 33 <210> 4 <211> 33 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> template nucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> 5' m7Gppp (cap structure) <400> 4 guugucaccu gucaagaaca uauagauagg cuu 33 <210> 5 <211> 33 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> template nucleotide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> 5' m7Gppp[m2'-O] (methylated cap structure) <400> 5 guugucaccu gucaagaaca uauagauagg cuu 33 <210> 6 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> RT primer <400> 6 ttcgaccttc agattagcaa cggagcctat ctatatgttc ttgaca 46 <210> 7 <211> 32 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> template <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> 5' monophosphate <400> 7 guugucaccu gucaagaaca uauagauagg cu 32 <210> 8 <211> 32 <212> RNA <213> Artificial <220> <223> template <400> 8 guugucaccu gucaagaaca uauagauagg cu 32 <210> 9 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> cDNA <400> 9 ttcgaccttc agattagcaa cggagcctat ctatatgttc ttgacaggtg acaac 55 <210> 10 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> linker <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> 5' phosphate <220> <221> misc_feature <222> (27)..(27) <223> dideoxynucleotide <400> 10 tatagtgagt cgtattacat atcaatc 27 <210> 11 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> adenylated linker <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> adenylation (ppA) <220> <221> misc_feature <222> (28)..(28) <223> dideoxynucleotide <400> 11 atatagtgag tcgtattaca tatcaatc 28 <210> 12 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> double stranded part for adaptor <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> C3 spacer modification <400> 12 attgatatgt aatacgactc actata 26 <210> 13 <211> 81 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> ligated cDNA <400> 13 ttcgaccttc agattagcaa cggagcctat ctatatgttc ttgacaggtg acaactatag 60 tgagtcgtat tacatatcaa t 81 <210> 14 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> ligation to 3' OH or RNA <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> 5' triphosphate <220> <221> misc_feature <222> (59)..(59) <223> dideoxynucleotide <400> 14 guugucaccu gucaagaaca uauagauagg cutatagtga gtcgtattac atatcaatc 59 <210> 15 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> RT primer <400> 15 ggcgtttttt tttttttttt ttv 23 <210> 16 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 16 ttattgatat gtaatacgac tcactat 27 <210> 17 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 17 ggcgtttttt tttttttttt tta 23 <210> 18 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> random nonamer primer with overhang <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> 5' Amino C12 spacer <220> <221> misc_feature <222> (10)..(18) <223> n is a, c, g, or t <400> 18 tctcaggcgn nnnnnnnn 18 <210> 19 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 19 tagaattacc acagttatcc aagta 25 <210> 20 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 20 gtacttcagg gtcaggatac ct 22 <210> 21 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 21 tatctgacat ctctacttta ggaatt 26 <210> 22 <211> 61 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> complementary nucleic acid <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> 5' C12 Spacer <400> 22 agtctaatcg ttgaatggcc gtcgttttga gcctatctat atgttcttga caggtgacaa 60 c 61 <210> 23 <211> 62 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> complementary nucleic acid <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> 5' C12 Spacer <400> 23 agtctaatcg ttgaatggcc gtcgttttga gcctatctat atgttcttga caggtgacaa 60 cc 62 <210> 24 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> complementary nucleic acid <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> 5' C12 Spacer <400> 24 agtctaatcg ttgaatggcc gtcgttttga gcctatctat atgttcttga caggtgacaa 60 ccc 63 <210> 25 <211> 64 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> complementary nucleic acid <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> 5' C12 Spacer <400> 25 agtctaatcg ttgaatggcc gtcgttttga gcctatctat atgttcttga caggtgacaa 60 cccc 64 <210> 26 <211> 67 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> complementary nucleic acid <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> 5' C12 Spacer <400> 26 agtctaatcg ttgaatggcc gtcgttttga gcctatctat atgttcttga caggtgacaa 60 ccccccc 67 <210> 27 <211> 88 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> cDNA <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> 5' C12 Spacer <220> <221> misc_feature <222> (88)..(88) <223> dideoxynucleotide <400> 27 agtctaatcg ttgaatggcc gtcgttttga gcctatctat atgttcttga caggtgacaa 60 ctatagtgag tcgtattaca tatcaatc 88 <210> 28 <211> 89 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> cDNA <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> 5' C12 Spacer <220> <221> misc_feature <222> (89)..(89) <223> dideoxynucleotide <400> 28 agtctaatcg ttgaatggcc gtcgttttga gcctatctat atgttcttga caggtgacaa 60 cctatagtga gtcgtattac atatcaatc 89 <210> 29 <211> 247 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> cDNA <220> <221> misc_feature <222> (219)..(219) <223> n is a, c, g, or t <400> 29 ttcatgtgag gcgggtggaa ctgtgttacg tagcagttca gtatgttcgg cttcccattc 60 tccggtgggt ggcgtgagta tacttgaatt tgaggggttt tctggatagc atacaggccg 120 gtcagtgaga caagcaccag aaagaccagg gtcaccgagc gagccatgct gacgactgaa 180 gcgaccgcga ctgaagcgcc gagtagcagc cactgaaant atagtgagtc gtattacata 240 tcaataa 247 <210> 30 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> RNA - linker ligation product <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> 5' cap - (m7Gppp) <220> <221> misc_feature <222> (60)..(60) <223> dideoxynucleotide <400> 30 guugucaccu gucaagaaca uauagauagg cuutatagtg agtcgtatta catatcaatc 60 <210> 31 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> ligation product <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> 5' cap - m7Gppp[m2'-O] <220> <221> misc_feature <222> (60)..(60) <223> dideoxynucleotide <400> 31 guugucaccu gucaagaaca uauagauagg cuutatagtg agtcgtatta catatcaatc 60 <210> 32 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> ligation product <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> 5' triphosphate <220> <221> misc_feature <222> (60)..(60) <223> dideoxynucleotide <400> 32 guugucaccu gucaagaaca uauagauagg cuutatagtg agtcgtatta catatcaatc 60 <210> 33 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> non-template nucleotide addition product <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> 5' phosphate <220> <221> misc_feature <222> (28)..(28) <223> dideoxynucleotide (c) <400> 33 ctatagtgag tcgtattaca tatcaatc 28 <210> 34 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> non-template nucleotide addition product <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> 5' adenylation (ppA modification) <220> <221> misc_feature <222> (28)..(28) <223> dideoxynucleotide (c) <400> 34 ctatagtgag tcgtattaca tatcaatc 28 <210> 35 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> non-template nucleotide addition product <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> 5' Biotin modification <220> <221> misc_feature <222> (30)..(30) <223> deoxyA <400> 35 ttggattgat atgtaatacg actcactata 30 <210> 36 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> non-template nucleotide addition product <400> 36 tatgttcttg acaggtgaca ac 22 <210> 37 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> non-template nucleotide addition product <400> 37 tatgttcttg acaggtgaca acc 23 <210> 38 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> non-template nucleotide addition product <400> 38 tatgttcttg acaggtgaca accc 24 <210> 39 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> ligation product <400> 39 tatgttcttg acaggtgaca acccc 25 <210> 40 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> 5'PTO protected oligo dT primer <400> 40 tatgttcttg acaggtgaca acccc 25 <210> 41 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> 3?primer <400> 41 tatgttcttg acaggtgaca accccc 26 <210> 42 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> 5' primer <220> <221> misc_feature <222> (50)..(50) <223> dideoxynucleotide (c) <400> 42 tatgttcttg acaggtgaca acctatagtg agtcgtatta catatcaatc 50 <210> 43 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 43 tctcaggcgt tttttttttt tttttttv 28 <210> 44 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 44 tctcaggcgt tttttttttt ttttttt 27 <210> 45 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> 5' Biotin modification <400> 45 ttggattgat atgtaatacg actcactata 30 <210> 46 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 46 catatgcttg tctcaaagat taag 24 <210> 47 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 47 cagtttctaa tatgctatac aatttatg 28 <210> 48 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 48 tatttaaagt aagatataaa gaaggtga 28

Claims

5' 보호기를 포함하는 RNA로부터 라벨링된 핵산을 생성하는 방법으로서:
a) 핵산의 탬플릿 가닥의 혼합물을 얻는 단계로서, 상기 혼합물은 상기 RNA와 5' 보호기를 포함하지 않는 다른 핵산을 잠재적으로 더 포함하는 단계,
b1) 상기 RNA 및 잠재적으로 다른 핵산의 탬플릿 가닥에 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드 프라이머를 어닐링하고, 상기 프라이머를 탬플릿 서열 의존형으로 연장함으로써, 탬플릿 가닥에 어닐링된 상보적 핵산 가닥을 얻는 단계, 또는 b2) 탬플릿 가닥과 어닐링된 상보적 핵산 가닥을 갖는 2중의 RNA를 제공하는 단계, 및
d2) 2중 가닥 의존형 라이게이션에 의해 상보적 핵산 탬플릿 RNA 가닥 상에 5' 보호기의 존재에 따라서 2중 가닥의 상보적 핵산을 라벨링함으로써, 적어도 5' 보호기를 본래 포함하는 RNA에 상보하는 라벨링된 핵산을 특이적으로 생성하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 RNA로부터의 라벨링된 핵산의 생성방법.
5' 보호기를 포함하는 RNA로부터 라벨링된 핵산을 생성하는 방법으로서:
a) 핵산의 탬플릿 가닥의 혼합물을 얻는 단계로서, 상기 혼합물은 상기 RNA와 5' 보호기를 포함하지 않는 다른 핵산을 잠재적으로 더 포함하는 단계,
b1) 상기 RNA 및 잠재적으로 다른 핵산의 탬플릿 가닥에 적어도 하나의 올리고뉴클레오티드 프라이머를 어닐링하고, 상기 프라이머를 탬플릿 서열 의존형으로 연장함으로써, 탬플릿 가닥에 어닐링된 상보적 핵산 가닥을 얻는 단계, 또는 b2) 탬플릿 가닥과 어닐링된 상보적 핵산 가닥을 갖는 2중의 RNA를 제공하는 단계,
c) 상기 탬플릿 가닥의 5' 말단 또는 상기 상보적 핵산 가닥의 3' 말단 중 어느 하나 또는 모두에 5' 보호기를 포함하지 않는 상기 핵산을 수식하는 단계, 및
d1) 상기 c)단계에서 수식되지 않은 2중 가닥의 상보적 핵산을 라벨링하는 단계로서, 상기 라벨링된 핵산은 상기 c)단계의 RNA 탬플릿 가닥 상에 5' 보호기를 포함하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 RNA로부터의 라벨링된 핵산의 생성방법.
제 2 항에 있어서,
상기 5' 보호기는, 상기 c)단계를 행한 후에 제거되는 것을 특징으로 하는 RNA로부터의 라벨링된 핵산의 생성방법.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
상기 5' 보호기는 5' 캡 또는 5' 폴리포스페이트인 것을 특징으로 하는 RNA로부터의 라벨링된 핵산의 생성방법.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
상기 라벨링은 수식되지 않은 상기 2중 가닥 핵산과 핵산 서열 태그를 라이게이팅하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 RNA로부터의 라벨링된 핵산의 생성방법.
제 5 항에 있어서,
상기 핵산 서열 태그는 적어도 부분적으로 2중 가닥인 것을 특징으로 하는 RNA로부터의 라벨링된 핵산의 생성방법.
제 5 항에 있어서,
상기 핵산 서열 태그는 라이게이션 종료시 적어도 부분적으로 2중 가닥인 것을 특징으로 하는 RNA로부터의 라벨링된 핵산의 생성방법.
제 2 항에 있어서,
상기 수식은 상기 수식된 2중 가닥의 라벨링을 억제하는 것을 특징으로 하는 RNA로부터의 라벨링된 핵산의 생성방법.
제 2 항에 있어서,
상기 c)단계에서의 수식은 i) 언캐핑 핵산의 5'-3' 엑소뉴클레아제 소화; ii) 상기 탬플릿 가닥의 5' 말단과 상기 상보적 핵산 가닥의 3' 말단의 라이게이팅; iii) 미수식 2중 가닥 핵산에 상기 라벨링되지 않은 핵산 서열 태그의 첨가; 또는 iv) 상기 탬플릿 가닥 상의 5' 말단 포스페이트의 제거로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 RNA로부터의 라벨링된 핵산의 생성방법.
제 9 항에 있어서,
상기 iv)에서 상기 탬플릿 가닥 상의 5' 말단 포스페이트는 포스파타아제에 의해 제거되는 것을 특징으로 하는 RNA로부터의 라벨링된 핵산의 생성방법.
제 9 항에 있어서,
상기 iv)에서 상기 탬플릿 가닥 상의 5' 말단 포스페이트는 RNA가 5' 보호기를 포함하는 상태에서 제거되어 5' 디포스포릴화로부터 보호되는 것을 특징으로 하는 RNA로부터의 라벨링된 핵산의 생성방법.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
미수식 2중 가닥 핵산의 상보적 핵산 가닥은 3' 말단에 라벨링되는 것을 특징으로 하는 RNA로부터의 라벨링된 핵산의 생성방법.
제 12 항에 있어서,
상기 상보적 핵산 가닥의 3' 말단 핵산은 5' 말단 뉴클레오티드 또는 5' 보호기의 0개 또는 1개의 뉴클레오티드 내에서, 5' 말단 뉴클레오티드 또는 5' 보호기로 탬플릿 가닥에 어닐링되는 것을 특징으로 하는 RNA로부터의 라벨링된 핵산의 생성방법.
제 13 항에 있어서,
상기 5' 보호기는 5' 캡 뉴클레오티드인 것을 특징으로 하는 RNA로부터의 라벨링된 핵산의 생성방법.
제 13 항에 있어서,
상기 5' 말단 뉴클레오티드는 5' 폴리포스페이트인 것을 특징으로 하는 RNA로부터의 라벨링된 핵산의 생성방법.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
상기 라벨링은 2중 가닥에 특이적인 것을 특징으로 하는 RNA로부터의 라벨링된 핵산의 생성방법.
제 16 항에 있어서,
상기 2중 가닥은 평단 말단 또는 1개 이하의 뉴클레오티드 오버행을 지닌 말단을 갖는 2중 가닥인 것을 특징으로 하는 RNA로부터의 라벨링된 핵산의 생성방법.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
상기 라벨링은 2중 가닥에 특이적이고, RNA 가닥은 5' 캡 또는 5' 폴리포스페이트를 포함하는 것을 특징으로 하는 RNA로부터의 라벨링된 핵산의 생성방법.
제 18 항에 있어서,
상기 5' 폴리포스페이트는 5' 트리포스페이트인 것을 특징으로 하는 RNA로부터의 라벨링된 핵산의 생성방법.
제 18 항에 있어서,
상기 5' 캡 또는 5' 폴리포스페이트는 RNA 가닥 5' 말단에 오버행인 것을 특징으로 하는 RNA로부터의 라벨링된 핵산의 생성방법.
제 1 항에 있어서,
상기 라벨링은 2중 가닥에 특이적이고, RNA 가닥은 5' 캡 또는 5' 폴리포스페이트를 포함하고,
상기 d2)단계에 있어서, 링커 가닥 상에 5' 뉴클레오티드 오버행이 제공된 2중 가닥 어댑터 핵산인 라벨이 상기 상보적 핵산에 라이게이팅되는 것을 특징으로 하는 RNA로부터의 라벨링된 핵산의 생성방법.
제 21 항에 있어서,
상기 라벨이 상기 상보적 핵산에 2중 가닥 특이적 리가아제를 사용하여 라이게이팅되는 것을 특징으로 하는 RNA로부터의 라벨링된 핵산의 생성방법.
제 21 항에 있어서,
상기 어댑터의 링커 가닥의 5' 뉴클레오티드 오버행은 단일 뉴클레오티드로 이루어지는 것을 특징으로 하는 RNA로부터의 라벨링된 핵산의 생성방법.
제 23 항에 있어서,
상기 단일 뉴클레오티드는 C 또는 T인 것을 특징으로 하는 RNA로부터의 라벨링된 핵산의 생성방법.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
e)라벨링된 핵산을 농축, 선택, 단리 또는 정제하는 단계를 더 포함하거나, 혹은 라벨링된 핵산은 탬플릿인 상보적 핵산을 이용하여 탬플릿 의존성 뉴클레오티드 중합에 의해 증폭되는 것을 특징으로 하는 RNA로부터의 라벨링된 핵산의 생성방법.
제 25 항에 있어서,
상기 정제는 고상 바인딩에 의한 정제인 것을 특징으로 하는 RNA로부터의 라벨링된 핵산의 생성방법.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
상기 b1)단계에 있어서 말단 트랜스페라아제 활성을 억제하는 역전사 효소를 사용하거나, 또는 다량의 dNTP로 적어도 3mM Mg²⁺에서 미수식 역전사 효소에 비하여 말단 트랜스페라아제 활성이 감소되는 조건을 사용하는 것을 특징으로 하는 RNA로부터의 라벨링된 핵산의 생성방법.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
상기 d1)단계 또는 d2)단계 전에 상보적 핵산 가닥 상의 잠재적으로 존재하는 3'오버행은 소화되는 것을 특징으로 하는 RNA로부터의 라벨링된 핵산의 생성방법.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
상기 b1)단계에 있어서 수식된 역전사 효소가 사용되고, 상기 효소의 수식은 역전사 효소의 RNAse H 활성을 감소 또는 억제하는 것을 특징으로 하는 RNA로부터의 라벨링된 핵산의 생성방법.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
상기 올리고뉴클레오티드 프라이머는 5'-3' 엑소뉴클레아제 소화에 내성이 있고, 또는 5' 오버행을 가지는 것을 특징으로 하는 RNA로부터의 라벨링된 핵산의 생성방법.
제 30 항에 있어서,
핵산 서열 태그가 라벨로서 사용되고, 상기 핵산 서열 태그는 뉴클레아제 소화로부터 보호되는 것을 특징으로 하는 RNA로부터의 라벨링된 핵산의 생성방법.
제 2 항에 있어서,
핵산 상에 5' OH가 포스포릴화되거나 또는 5' 포스페이트가 디포스포릴화된 것을 특징으로 하는 RNA로부터의 라벨링된 핵산의 생성방법.
제 32 항에 있어서,
상기 c)단계에서의 수식에 있어서 5' 포스페이트 의존형 5'-3' 엑소뉴클레아제가 사용되는 경우 5' OH가 포스포릴화되고, 상기 c)단계에서의 수식에 있어서 5' OH 의존형 5'-3' 엑소뉴클레아제가 사용되는 경우 5' 포스페이트가 디포스포릴화되는 것을 특징으로 하는 RNA로부터의 라벨링된 핵산의 생성방법.
제 2 항에 있어서,
상기 c)단계는 크라우딩제의 존재 하의 5'-3' 엑소뉴클레아제 수식인 것을 특징으로 하는 RNA로부터의 라벨링된 핵산의 생성방법.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
상기 라벨은 형광 분자를 포함하는 것을 특징으로 하는 RNA로부터의 라벨링된 핵산의 생성방법.
제 35 항에 있어서,
상기 라벨은 형광 핵산 서열 태그이고, 또는 상기 라벨은 3'-5' 엑소뉴클레아제 소화로부터의 보호를 제공하는 것을 특징으로 하는 RNA로부터의 라벨링된 핵산의 생성방법.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
상기 라벨은 고상에서 부동화되는 것을 특징으로 하는 RNA로부터의 라벨링된 핵산의 생성방법.