KR102109921B1 - 크기 배제 크로마토그래피를 이용한 세포밖 소포체의 순도 분석 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 크기 배제 크로마토그래피를 이용한 세포밖 소포체의 순도 분석 방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게 본 발명은 크기 배제 크로마토그래피의 크기별 분획능과 단일 또는 2종 이상이 조합된 분광학적 분석법 (spectroscopy)을 이용하여 다양한 시료로부터 세포밖 소포체와 여러 오염 물질의 양을 동시에 정량함으로써 세포밖 소포체의 순도, 총량 및 수율을 분석하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 세포밖 소포체 순도 분석 방법은 세포밖 소포체의 형태나 성질을 보존하면서 효율적으로 분석할 수 있다는 장점이 있다. 또한 본 발명의 세포밖 소포체 순도 분석 방법은 종래의 방법을 이용해 분리된 세포밖 소포체의 순도, 총량 및 수율을 빠른 시간 안에 동시에 결정할 수 있어, 분리된 세포밖 소포체를 이용한 질병 진단, 질병 치료, 다중 오믹스 연구 및 세포밖 소포체의 특성 연구 등에 활용이 가능하다. 또한 본 발명의 순도 분석 방법은 새로운 분리 방법을 개발하는 데도 활용이 가능하다.
Description
본 발명은 크기 배제 크로마토그래피를 이용한 세포밖 소포체의 순도 분석 방법에 관한 것으로서, 보다 구체적으로 본 발명은 크기 배제 크로마토그래피의 크기별 분획능과 시료의 분광학적 특징을 이용하여 세포밖 소포체의 순도를 분석하는 방법 등에 관한 것이다.
세포밖 소포체(extracellular vesicles)는 모든 세포에서 자연적으로 분비되는 나노 크기(20 ~ 1000 nm)의 생체 입자로서 세포 유래 지질이중층 막 구조를 가지고 있으며, 동물의 경우 혈액(blood), 침(saliva), 눈물 (tear), 콧물(nasal mucus), 땀(sweat), 소변(urine), 대변(feces), 뇌척수액(CSF, cerebrospinal fluid), 복수(ascite), 양수(amniotic fluid), 기관지 세척액 (bronchoalveolar lavage fluid), 흉수(pleural effusion), 정액(semen), 유(milk) 등과 같은 체액뿐만 아니라 다양한 암 또는 정상조직에도 존재하고 있다.
이들 세포밖 소포체는 모세포로부터 유래한 단백질, 지질, 핵산, 아미노산 등의 다양한 생리활성 물질로 구성되어 모세포의 생리적, 병리적 특성을 함유하고 있을 뿐 아니라, 다른 세포 및 조직과 결합하여 모세포 유래 생리활성 물질들을 수용 세포 및 조직에 전달하면서 운송체 역할을 한다. 세포밖 소포체의 다양한 생리적, 병리적 기능이 규명되면서, 의생명 분야를 포함한 다양한 분야에서 세포밖 소포체 구성 성분 및 기능에 대한 연구가 활발히 이루어지고 있으며, 이를 활용하여 다양한 질환, 질병을 치료하는 치료제 개발이 동시에 진행 중이다.
따라서 세포밖 소포체의 구성 성분 및 기능을 연구하거나 이를 이용한 치료제를 개발하기 위해서는 다양한 형태의 시료에서 세포밖 소포체를 효과적으로 분리 및 정제하는 것이 필수적이기 때문에, 다양한 분리 방법이 이용되고 있을 뿐 아니라 새로운 기술들이 활발히 개발되고 있다.
통상의 세포밖 소포체 분리 기술로는 초고속 원심분리법(ultra- centrifugation), 밀도 구배법(density gradient), 크기 배제법(size exclusion), 폴리머를 이용한 침전법(polymer-based precipitation), 염 기반 침전법(salt-based precipitation), 유기 용매 침전법(organic solvent-based precipitation), 이온교환 크로마토그래피법(ion exchange chromatography), 친화성 크로마토그래피법(affinity chromatography), 그리고 수용액 이상계법(aqueous two phase system) 등이 있으며, 이 중 초고속 원심분리법이 가장 널리 사용되고 있다.
세포밖 소포체 기반의 신규 바이오 마커 발굴 및 세포밖 소포체 기반의 치료제 개발에 있어서 정제한 세포밖 소포체의 순도 분석은 앞으로 해당 분야의 근간이 되며 매우 중요하게 인식되고 있다. 하지만, 상기 기술한 각 세포밖 소포체 분리 방법 및 분리된 세포밖 소포체의 순도를 평가하기 위한 통상의 분석 방법은'나노 입자 총량/단백질 총량'과 같은 간접적인 방법에 의존하고 있다.
이와 같은 순도 분석 방법은 시료의 나노 입자 농도 분석 및 단백질 정량을 독립적으로 수행해야 할 뿐만 아니라, 상기 나노 입자 분석의 경우 나노 입자 추적 분석법(Nanoparticle tracking analysis, NTA) 또는 나노이온소자(Nanopore)를 이용한 저항성 분석법(Tunable resistive pulse sensing, TRPS) 등의 방법이 이용되는데, 상기 분석은 분석법의 감도와 장비의 설정에 따라 동일 시료를 분석하더라도 나노 입자 농도가 크게 다르게 측정되는 문제점들이 존재한다. 또한, 상기 순도 분석의 목적으로, 시료내 세포밖 소포체와 오염물질의 합을 측정하는 방법이 단백질이라는 한 분류의 물질에 대한 정량으로 한정되기 때문에, 비단백질 물질이 오염되어 있는 경우 오염 물질이 측정되지 않는 문제점으로 인하여 순도가 높게 평가될 수 있고, 반대로 시료의 단백질 정량 시 단백질이 아니면서 단백질 검출 신호를 발생시키는 물질이 시료에 오염된 경우 순도가 낮게 평가되는 문제점이 발생되기도 한다. 또한 시료 내 오염 물질의 흡광도, 분자량과 같은 기본적인 정보도 알 수 없기 때문에, 시료 내 오염 성분을 제거하기 위해서는 이들 오염물에 대한 분석으로 추가적인 비용 및 시간이 소요되는 등 많은 문제점을 가지고 있다.
상기와 비슷하게, 최근 소개되고 있는 크기 배제 크로마토그래피를 통한 세포밖 소포체 시료의 순도 분석 방법의 경우 역시, 시료를 전개하면서 단백질 또는 핵산 측정의 목적으로 자외선 흡광도(254 nm)를 기록하고 분석하기 때문에, 세포밖 소포체와 오염물 밴드를 구분하는 추가적인 나노 입자 분석 또는 세포밖 소포체를 특정하는 분석(예, 웨스턴블럿 분석)이 수반되어야 하며, 상기 상술한 특정 물질 이외의 오염을 검출하지 못한다는 문제점이 있다.
따라서 통상의 분석법과는 차별화되는 직접적이고 간단하며 신속한 세포밖 소포체의 순도 분석 방법의 개발이 시급한 실정이다.
본 발명의 목적은 (a) 세포밖 소포체를 포함하는 시료를 크기 배제 크로마토그래피 컬럼에 주입하여 전개시키는 단계, (b) 상기 전개된 시료의 특정 파장에 대한 흡광 크로마토그램을 검출하는 단계, (c) 상기 단계 (b)의 흡광 크로마토그램으로부터 세포밖 소포체의 흡광 밴드와 불순물의 흡광 밴드를 구별하는 단계, (d) 상기 단계 (b)의 흡광 크로마토그램으로부터 세포밖 소포체의 흡광 밴드 면적 및 불순물의 흡광 밴드 면적을 계산하는 단계 및 (e) 상기 세포밖 소포체의 흡광 밴드 면적 값과 불순물의 흡광 밴드 면적 값으로부터 세포밖 소포체의 순도를 계산하는 단계를 포함하는 세포밖 소포체의 순도 분석 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 (a) 세포밖 소포체를 포함하는 시료를 크기 배제 크로마토그래피 컬럼에 주입하여 전개시키는 단계, (b) 상기 전개된 시료의 제1 파장에 대한 흡광 크로마토그램을 검출하는 단계, (c) 상기 전개된 시료의 상기 제1 파장과 상이한 제2 파장에 대한 흡광 크로마토그램을 검출하는 단계 및 (d) 상기 각각의 흡광 크로마토그램으로부터 세포밖 소포체의 흡광 밴드 면적 또는 불순물의 흡광 밴드 면적을 계산하는 단계를 포함하는 세포밖 소포체의 분석 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 (a) 세포밖 소포체를 포함하는 시료를 크기 배제 크로마토그래피 컬럼에 주입하여 전개시키는 단계, (b) 상기 전개된 시료의 특정 파장에 대한 흡광 크로마토그램을 검출하는 단계, (c) 상기 단계 (b)의 흡광 크로마토그램으로부터 세포밖 소포체의 흡광 밴드 면적을 계산하는 단계 및 (e) 상기 세포밖 소포체의 흡광 밴드 면적으로부터 세포밖 소포체의 총량을 계산하는 단계를 포함하는 세포밖 소포체의 정량 분석 방법을 제공하는 것이다.
본 발명은 상술한 문제점을 해결하기 위한 것으로, 시료 중 세포밖 소포체와 불순물을 크기에 따라 분리할 수 있는 크기 배제 크로마토그래피의 분획능과 분획물로부터 세포밖 소포체와 불순물의 양을 동시에 측정할 수 있는 분광학적 분석 방법을 결합함으로써 신속하고 정확하게 세포밖 소포체의 순도를 분석하는 방법을 제공한다.
본 발명에서 "크기 배제 크로마토그래피(size exclusion chromatography, SEC)"라 함은 다양한 크기의 용질이 다공성 매트릭스를 통과하는 속도(투과도)를 기반으로 혼합물을 분리하는 기술을 의미한다. 즉 분석대상 시료를 젤, 매트릭스, 구슬(bead)과 같은 다공성 정지상(stationary phase)이 채워진 컬럼을 통과시키면, 정지상의 구멍을 통과할 수 없는 큰 분자들은 구멍에 들어가지 못하고 주변의 빈 공간을 통해 빠르게 컬럼을 빠져 나오는 반면, 작은 분자들은 컬럼의 구멍을 통해 나오면서 상대적으로 천천히 이동하여 컬럼을 빠져 나오는 원리를 이용한 것이다. 이 방법은 일반적으로 완충액 교환(buffer exchange)을 위한 탈염화(desalting), 정제를 위한 분리 또는 용질 크기에 따른 분자량 측정에 사용된다.
본 발명에서는 세포밖 소포체를 포함하는 다양한 시료를 크기 배제 크로마토그래피 컬럼에 통과시킴으로써, 시료에 포함된 다양한 분자를 빠르고 쉽게 크기별로 분획할 수 있으며, 다음 단계에서 이렇게 분리된 용출물의 분광학적 특성을 분석함으로써 세포밖 소포체의 분석을 용이하고 효율적으로 할 수 있다.
본 발명의 용어 "세포밖 소포체"는 고세균(Archaea), 원핵생물(Prokarya) 또는 진핵생물(Eukarya)의 세포로부터 유래한 생체 나노입자를 통칭하며, 세포밖 소포체(exosome), 아그로좀(argosomes), 덱소좀(dexosomes), 엑토좀(ectosomes), 엑소베지클(exovesicle), 온코좀(oncosome), 프로미노좀(prominosome), 프로스타좀(prostasome), 톨레로좀(tolerosome), 미세입자(microparticle), 미세소포(microvesicle), 나노소포(nanovesicle), 수포성 소포(blebbing vesicle), 출아성 소포(budding vesicle), 세포밖 소포체-유사 소포(exosome-like vesicle), 매트릭스 소포(matrix vesicle), 막 소포(membrane vesicle), 탈피성 소포(shedding vesicle), 막 입자(membrane particle), 탈피성 미세소포(shedding microvesicle), 막 수포(membrane bleb), 에피디디모좀(epididimosome), 프로미니노좀(promininosome), 텍소좀(texosome) 또는 아키오좀(archeosome)을 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명은 세포밖 소포체의 순도 분석 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 상기 세포밖 소포체의 순도 분석 방법을 도 1에 모식적으로 나타내었다.
본 발명의 세포밖 소포체의 순도 분석 방법은 세포밖 소포체를 포함하는 시료를 크기 배제 크로마토그래피 컬럼에 주입하여 전개시키는 단계[(a) 단계]를 포함한다.
본 발명의 용어 "컬럼"은 크기 배제 크로마토그래피에 사용되는 다공성 고정상이 채워진 단위이며, 상기 고정상은 분자량에 따라 물질을 분획하기 위한 다양한 크기의 구멍이 있는 입자를 의미한다. 상기 고정상에 존재하는 구멍의 크기에 따라 시료 내 존재하는 분자들의 분자 크기에 따른 분리 해상능이 변하게 된다. 예로, 고정상에 존재하는 구멍이 큰 경우는 상대적으로 큰 분자들의 분리에 효율적이고 상대적으로 작은 분자는 분리되지 않고 용출된다. 반면, 고정상에 존재하는 구멍의 크기가 작은 경우 큰 분자들의 분리 정도는 낮게 용출되지만, 일정 크기 이상과 이하의 분자를 분리하는 데는 효율적일 수 있다. 따라서 통상적으로는 분리하고자 하는 분자의 크기와 시료 내 오염물질의 크기를 고려하여 최적의 분리 효율을 제공하는 크기의 구멍을 가진 고정상을 선택하게 된다. 따라서 나노 입자인 세포밖 소포체를 다양한 크기의 단백질과 분리할 수 있는 크기의 구멍을 가진 고정상의 선택이 중요하다. 크기 배제 크로마토그래피에서 가장 널리 사용되는 젤은 세파로즈(Sepharose; GE Healthcare), 수퍼로즈(Superose; GE Healthcare), 세파덱스(Sephadex; Pharmacia), Bio-Gel P(Bio-Rad)와 TSKgel® (silica-based; Sigma) 등의 계열이며, 본 발명의 일실시예에서는 나노 입자인 세포밖 소포체를 다양한 크기의 단백질과 분리할 수 있는 크기의 구멍을 가진 세파크릴(Sephacryl) S500 고정상을 사용하였지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 용어 "시료"는 세포밖 소포체를 포함하는 생체 시료 또는 세포 배양액, 조직 시료 등을 포함하는 것으로서, 구체적으로 포유동물 세포 배양 배지, 박테리아 세포 배양 배지, 효모 배양 배지, 조직 추출물, 암 조직, 혈청, 혈장, 침, 눈물, 땀, 소변, 대변, 뇌척수액(CSF, cerebrospinal fluid), 복수(ascite), 양수(amniotic fluid), 정액, 유(milk), 먼지, 담수, 해수, 토양 및 발효식품으로 이루어진 군에서 하나 이상이 선택될 수 있으나 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 세포밖 소포체의 순도 분석 방법은 상기 전개된 시료의 특정 파장에 대한 흡광 크로마토그램을 검출하는 단계[(b) 단계]를 포함한다.
본 발명에 있어서, 상기 특정 파장은 200 nm ~ 800 nm 범위에서 선택되는 하나 이상의 값이 선택될 수 있다. 본 발명에서 상기 특정 파장은 330 내지 450 nm 범위 중 하나 이상의 파장, 230 nm, 260 nm 및 280 nm의 파장을 모두 포함하는 4종 이상의 파장이 선택될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명은 물질에 따라 특정 파장에서의 흡광도가 특징적으로 나타난다는 분광학적 성질을 이용하여 상기 크기 배제 크로마토그래피의 분획물을 구별할 수 있을 뿐만 아니라 각 물질을 정량적으로 분석할 수 있다.
본 발명의 세포밖 소포체의 순도 분석 방법은 상기 단계 (b)의 흡광 크로마토그램으로부터 세포밖 소포체의 흡광 밴드와 불순물의 흡광 밴드를 구별하는 단계[(c) 단계] 및 세포밖 소포체의 흡광 밴드 면적 및 불순물의 흡광 밴드 면적을 계산하는 단계[(d) 단계]를 포함한다.
본 발명의 용어 "불순물" 또는 "오염물"은 시료 중 포함된 세포밖 소포체 이외의 물질을 나타내는 것으로서, 단백질, 지질, 핵산(RNAs, DNAs), 펩티드, 대사산물, 화합물, 탄수화물 등이 있다.
상기와 같이 시료를 크기 배제 크로마토그래피 컬럼에 통과시키면 시료 중 포함된 세포밖 소포체와 기타 불순물이 시간 순으로 용출된다. 일반적으로 세포밖 소포체는 분자의 크기가 1,000 kDa 이상으로 다른 불순물에 비해 크기가 큰 입자에 속하기 때문에 상대적으로 빠르게 용출된다. 각 물질의 용출 시간은 다공성 정지상의 크기 및 구멍 크기, 컬럼의 길이, 이동상의 유속 등에 따라 상이하며, 동일한 조건에서는 특정 시간에 용출된다. 본 발명의 일실시예에서는 세파크릴 S500으로 채워진 컬럼 (10 x 100 mm)을 HPLC시스템에 연결하여 사용하였으며, 50 ~ 100 mL의 시료를 주입하고 해당 컬럼을 1.0 mL/min의 유속으로 전개하면서, 여러 파장(230 nm, 260 nm, 280 nm, 450 nm)의 자외선/가시광선 흡광 크로마토그램을 기록한 후 분석하였다. 해당 조건의 컬럼 크로마토그래피에서는 세포밖 소포체가 약 3.3분에 송출되고, 알부민(BSA)은 약 7.8분에 용출되었다.
이와 같이 특정 조건에서 크기 배제 크로마토그래피를 수행하였을 때 세포밖 소포체와 기타 불순물들이 각각 일정한 시간에 용출된다는 점을 이용하여, 다양한 파장의 흡광 크로마토그램으로부터 세포밖 소포체의 흡광 밴드와 불순물의 흡광 밴드를 구별할 수 있으며, 각각의 흡광 밴드의 면적을 계산할 수 있다.
본 발명에서 상기 세포밖 소포체의 흡광 밴드는 하기 조건을 모두 만족하는 흡광 밴드이다:
i) 230 nm, 260 nm, 280 nm 에서 모두 흡광도를 가지는 피크; 및
ii) 280 nm 흡광도에 대한 260 nm 흡광도의 비율(260 nm/280 nm)의 값이 1 이상인 피크; 및
iii) 330 nm 내지 450 nm 범위에서 선택되는 하나 이상의 파장에 대한 피크가 존재.
크기 배제 크로마토그래피 컬럼의 조건에 따라 분획물의 용출 시간은 달라지지만, 나노 입자인 세포밖 소포체를 다양한 크기의 단백질과 분리할 수 있는 크기의 구멍을 가진 고정상이 채워진 컬럼을 사용하고 상기 조건에서 전개시킨 분획물에 대해서는 흡광도 측정에 사용되는 파장의 범위와 관계없이 같은 용출 시간대에 관찰되는 피크가 같은 물질을 나타낸다는 특징을 이용하여 세포밖 소포체의 피크를 구별할 수 있다.
본 발명의 상기 세포밖 소포체의 흡광 밴드 면적(AEV)은 상기 조건을 만족하는 흡광 밴드로서, 230 nm 크로마토그램의 해당 피크 면적을 계산하여 얻을 수 있다.
반면, 본 발명에서 상기 불순물의 흡광 밴드는 하기 조건 중 하나 이상을 만족하지 않는 흡광 밴드이다:
i) 230 nm, 260 nm, 280 nm 에서 모두 흡광도를 가지는 피크; 또는
ii) 280 nm 흡광도에 대한 260 nm 흡광도의 비율(260 nm/280 nm)의 값이 1 이상인 피크; 또는
iii) 330 nm 내지 450 nm 범위에서 선택되는 하나 이상의 파장에 대한 피크가 존재.
또한, 본 발명의 상기 불순물의 흡광 밴드 면적(ACONT)은 상기 조건을 만족하는 불순물 흡광 밴드로서, 230 nm 크로마토그램의 해당 피크 면적을 계산하여 얻을 수 있다.
본 발명의 세포밖 소포체의 순도 분석 방법은 상기 세포밖 소포체의 흡광 밴드 면적 값과 불순물의 흡광 밴드 면적 값으로부터 세포밖 소포체의 순도를 계산하는 단계[(e) 단계]를 포함한다.
본 발명의 상기 세포밖 소포체의 순도는 하기 식을 이용하여 계산하는 것을 포함한다:
이때, 상기 A EV 는 세포밖 소포체의 흡광 밴드 면적이고, A CONT 는 불순물의 흡광 밴드 면적이다.
본 발명의 일실시예를 통해 세포밖 소포체와 알부민 혼합물의 순도를 분석한 결과, 실험 전 결정된 순도와 실험을 통해 계산한 순도가 오차 범위 ±2% 이내로 일치하는 것을 확인할 수 있었다.
또한, 본 발명은 세포밖 소포체의 분석 방법을 제공한다.
본 발명의 세포밖 소포체 분석 방법은 세포밖 소포체를 포함하는 시료를 크기 배제 크로마토그래피 컬럼에 주입하여 전개시키는 단계[(a) 단계]를 포함한다.
이에 대한 상세한 설명은 상기한 바와 같다.
본 발명의 세포밖 소포체 분석 방법은 상기 전개된 시료의 제1 파장에 대한 흡광 크로마토그램을 검출하는 단계[(b) 단계], 상기 전개된 시료의 상기 제1 파장과 상이한 제2 파장에 대한 흡광 크로마토그램을 검출하는 단계[(c) 단계]를 포함한다.
본 발명의 상기 제1 파장 및 제2 파장은 200 nm ~ 800 nm 범위에서 선택될 수 있으며, 바람직하게는 230 nm, 260 nm, 280 nm 및 450 nm로 이루어진 군에서 선택될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 일 양상에 있어서, 상기 제1 파장 및 제2 파장은 230 nm, 260 nm, 280 nm, 및 330 내지 450 nm로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 값일 수 있다.
본 발명의 또 다른 일 양상에 있어서, 상기 제1 파장은 330 내지 450 nm 범위 중 하나, 230 nm, 260 nm 및 280 nm의 4종류의 파장이며, 상기 제2 파장은 200 nm ~ 800 nm 범위에서 선택되는 하나 이상의 값일 수 있다.
상기한 바와 같이 특정 물질은 특정 파장에서 흡광도가 특징적으로 나타난다. 본 발명의 세포밖 소포체 분석 방법은 상기 크기 배제 크로마토그래피로부터 용출된 분획물에 서로 다른 파장을 조사하여 각 파장에 대한 흡광도를 검출하고, 파장별 흡광도 차이를 비교함으로써 시료에 포함된 세포밖 소포체의 특성을 분석할 수 있을 뿐만 아니라, 세포밖 소포체 이외의 미지의 불순물을 확인할 수 있으며, 시료의 구성성분을 비교할 수 있다.
본 발명의 일실시예를 통해 세포밖 소포체와 알부민은 260 nm, 280 nm 및 450 nm 파장 각각에 대한 흡광도 특성이 전혀 상이하게 나타난다는 점을 확인할 수 있었다.
본 발명의 세포밖 소포체 분석 방법은 상기 각각의 흡광 크로마토그램으로부터 세포밖 소포체의 흡광 밴드 면적 또는 불순물의 흡광 밴드 면적을 계산하는 단계[(d) 단계]를 포함한다.
본 발명의 상기 흡광 크로마토그램으로부터 세포밖 소포체 흡광 밴드 면적과 불순물의 흡광 밴드 면적을 계산하는 방법은 상기한 바와 같다.
본 발명의 분석 단계는 세포밖 소포체 또는 불순물 중 어느 하나를 단독으로 분석할 수 있고, 세포밖 소포체 및 불순물을 동시에 분석할 수도 있다.
본 발명의 분석 단계는 제1 파장에서 측정된 세포밖 소포체 흡광 밴드 면적에 대한 제2 파장에서 측정된 세포밖 소포체 흡광 밴드 면적의 비율을 계산하여 분석하는 것일 수 있다.
또한, 본 발명의 분석 단계는 제1 파장에서 측정된 불순물 흡광 밴드 면적에 대한 제2 파장에서 측정된 불순물 흡광 밴드 면적의 비율을 계산하여 분석하는 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 세포밖 소포체의 정량 분석 방법을 제공한다.
본 발명의 세포밖 소포체 정량 분석 방법은 세포밖 소포체를 포함하는 시료를 크기 배제 크로마토그래피 컬럼에 주입하여 전개시키는 단계[(a) 단계], 상기 전개된 시료의 특정 파장에 대한 흡광 크로마토그램을 검출하는 단계[(b) 단계], 상기 흡광 크로마토그램으로부터 세포밖 소포체의 흡광 밴드 면적을 계산하는 단계[(c) 단계] 및 상기 세포밖 소포체의 흡광 밴드 면적으로부터 세포밖 소포체의 총량을 계산하는 단계[(d) 단계]를 포함한다.
본 발명의 세포밖 소포체 정량 분석 방법은 시료에 포함된 세포밖 소포체의 양과 특정 파장에서 흡광 밴드 면적이 선형 비례 관계가 있다는 점을 이용하는 것이다.
본 발명의 세포밖 소포체 정량 분석 방법에서 상기 파장 범위는 상기한 바와 같다.
본 발명의 세포밖 소포체 정량 분석 방법에서 상기 흡광 크로마토그램으로부터 세포밖 소포체 흡광 밴드 면적을 계산하는 방법은 상기한 바와 같다.
본 발명에서 세포밖 소포체의 총량은 상기 흡광 크로마토그램으로부터 도출된 세포밖 소포체 흡광 밴드의 면적으로부터 하기 식을 이용하여 계산할 수 있다:
이때, 상기 A EV 는 세포밖 소포체의 흡광 밴드 면적이며, a, b는 상수이다.
본 발명의 일 실시예에서 확인된 표본 세포밖 소포체의 총량과 세포밖 소포체 흡광 밴드의 면적은 하기와 같은 선형 관계를 나타낸다:
본 발명의 세포밖 소포체 분석 방법은 시료량의 제한 없이 빠르고 효과적으로 시료 중에 포함된 세포밖 소포체 또는 불순물의 총량, 세포밖 소포체의 순도를 분석할 수 있다. 뿐만 아니라 세포밖 소포체 분리, 정제 과정 전후에 적용하여 순도를 비교 분석함으로써 세포밖 소포체 분리 방법의 수율 및 효율성을 측정하는 데 활용될 수 있다.
도 1은 다양한 시료에서 크기 배제 크로마토그래피를 이용하여 세포밖 소포체의 순도, 총량 및 수율을 분석하는 방법에 대한 모식도이다.
도 2는 본 발명의 일실시예에 따른 대장암 세포주 SW480으로부터 표본 세포밖 소포체의 분리 모식도(a) 및 분리 결과(b, c)이다.
도 3은 크기 배제 크로마토그래피를 이용한 표본 세포밖 소포체의 흡광 크로마토그램(a), 나노입자분석(b) 및 웨스틴블럿 분석(c) 결과이다.
도 4는 크기 배제 크로마토그래피를 이용한 표본 세포밖 소포체와 알부민을 다양한 파장에서 흡광 크로마토그램으로 분석한 결과이다.
도 5는 크기 배제 크로마토그래피를 이용하여 표본 세포밖 소포체(a)와 알부민(b)의 230 nm 흡광 크로마토그램 및 각 피크의 면적과 총량 간 상관 관계를 분석한 결과이다.
도 6은 크기 배제 크로마토그래피를 이용하여 표본 세포밖 소포체와 알부민이 다양한 비율로 혼합된 혼합액의 순도를 분석한 결과이다.
도 7은 대장암 세포 배양액으로부터 서로 다른 분리 방법(초원심분리, PEG 침전)으로 분리한 세포밖 소포체의 순도를 비교 분석한 결과이다.
도 8 은 인간 체액(소변)으로부터 서로 다른 분리 방법(초원심분리, PEG 침전)으로 분리한 세포밖 소포체의 순도를 비교 분석한 결과이다.
도 2는 본 발명의 일실시예에 따른 대장암 세포주 SW480으로부터 표본 세포밖 소포체의 분리 모식도(a) 및 분리 결과(b, c)이다.
도 3은 크기 배제 크로마토그래피를 이용한 표본 세포밖 소포체의 흡광 크로마토그램(a), 나노입자분석(b) 및 웨스틴블럿 분석(c) 결과이다.
도 4는 크기 배제 크로마토그래피를 이용한 표본 세포밖 소포체와 알부민을 다양한 파장에서 흡광 크로마토그램으로 분석한 결과이다.
도 5는 크기 배제 크로마토그래피를 이용하여 표본 세포밖 소포체(a)와 알부민(b)의 230 nm 흡광 크로마토그램 및 각 피크의 면적과 총량 간 상관 관계를 분석한 결과이다.
도 6은 크기 배제 크로마토그래피를 이용하여 표본 세포밖 소포체와 알부민이 다양한 비율로 혼합된 혼합액의 순도를 분석한 결과이다.
도 7은 대장암 세포 배양액으로부터 서로 다른 분리 방법(초원심분리, PEG 침전)으로 분리한 세포밖 소포체의 순도를 비교 분석한 결과이다.
도 8 은 인간 체액(소변)으로부터 서로 다른 분리 방법(초원심분리, PEG 침전)으로 분리한 세포밖 소포체의 순도를 비교 분석한 결과이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가 진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1. 표본 세포밖 소포체의 분리 및 특성
대장암 세포주 SW480 배양액을 500 xg에서 10분, 2,000 xg에서 20분 간 원심분리하여 침전물을 제거하였다. 세포밖 소포체를 1차 정제하기 위하여 상기 상층액에 폴리에틸렌글리콜 용액(최종 8.4% Polyethylene Glycol 6000, 250 mM NaCl, 20 mM HEPES, pH7.4)을 첨가하여 4℃, 16시간 동안 배양한 후, 12,000 xg에서 30분간 원심분리하여 침전된 세포밖 소포체를 HEPES 완충용액(HEPES-buffered saline, 20 mM HEPES, 150 mM NaCl, pH7.4)에 녹였다. 상기 1차 정제된 세포밖 소포체를 2차 정제하기 위하여 상기 용액을 30% - 20% - 5% 옵티프랩(Optiprep) 부력 밀도 구배 초원심분리에 적용하여 200,000 xg에서 2 시간 동안 수행하였고, 상기 초원심분리 후 세포밖 소포체와 상등 밀도(1.08 ~ 1.12 g/ml)인 영역을 수확하였다. 상기 정제된 세포밖 소포체를 3차 정제하기 위하여, 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC) 시스템에 연결된 세파크릴(Sephacryl) S500으로 충전된 컬럼(10 x 100 mm)으로 상기 2차 정제한 시료를 주입하고 분자 크기별 분획을 통하여 고순도의 표본 세포밖 소포체를 정제하였으며, 상기 표본 세포밖 소포체의 분리 과정을 도 2(a)에 간략히 나타내었다.
상기 표본 세포밖 소포체의 특성 및 순도를 확인하기 위하여, 세포밖 소포체 마커(Alix, CD63, CD9)들의 분포를 웨스턴블럿을 통하여 확인하였고 모세포인 SW480의 WCL(whole cell lysate)과의 비교를 통하여 높은 순도를 확인할 수 있었다(도 2(b)).
상기 정제과정에 따라 최종 분리한 표본 세포밖 소포체를 투과 전자 현미경을 이용하여 표본 세포밖 소포체의 모양 및 크기(약 50 ~ 200 nm)를 확인하였고, 이를 도 2(c)에 나타내었다.
실시예 2. 크기 배제 크로마토그래피를 이용한 표본 세포밖 소포체의 흡광 크로마토그램 및 이의 분석
크기 배제 크로마토그래피 및 분광학적 분석 방법을 이용하여 시료내 세포밖 소포체의 순도를 분석하기 위하여, 상기 실시예 1에서 분리한 표본 세포밖 소포체를 세파크릴 S500을 채운 컬럼(10 x 100 mm)에 주입하여 1.0 ml/min의 유속으로 HEPES 완충용액으로 전개하면서 280 nm에서 흡광도를 측정하였다. 이와 동시에 분 단위로 용출된 분획을 수획하여 나노입자농도를 분석하고, 각각의 분획에서 웨스턴 블럿을 수행하여 세포밖 소포체의 마커를 분석하였다.
그 결과, 도 3에 나타난 바와 같이 280 nm 흡광 크로마토그램에서 3.3 분 용출시간에서 하나의 흡광 밴드가 관찰되었다(도 3(a)). 나노입자분석 결과에서도 동일한 분획에서 강한 신호를 나타내었고(도 3(b)), CD63 과 CD9 마커에 대한 웨스턴블럿에서도 강한 신호를 보였다(도 3(c)). 이로부터 상기 세파크릴 S500 크기 배제 크로마토그래피 컬럼에서는 세포밖 소포체가 3.3분에 용출되는 특징을 가짐을 알 수 있었고, 단일 피크가 관찰되는 것으로부터 표본 세포밖 소포체의 순도가 매우 높음을 알 수 있었다.
실시예 3. 크기 배제 크로마토그래피를 이용한 표본 세포밖 소포체와 알부민의 다파장 흡광 크로마토그램의 분석
각 분석 대상 물질에 대한 파장별 흡광도의 차이를 분석하기 위해, 여러 파장에서 각 물질에 대한 흡광 크로마토그램을 기록하여 분석하였다. 구체적으로, 상기 실시예 2에서 이용된 방법과 동일하게 세파크릴 S500 크기 배제 크로마토그래피 컬럼 시스템을 이용하였으며, 시료는 상기 표본 세포밖 소포체와 세포밖 소포체 정제 시 주 오염 물질인 알부민을 사용하였고, 각 물질에 대한 260 nm, 280 nm, 450 nm 파장의 흡광 크로마토그램을 동시에 기록하고 이를 분석하였다.
그 결과, 도 4(a) 및 (b)에 나타난 바와 같이 260 nm 와 280 nm 에서 표본 세포밖 소포체는 약 3.3분에서, 알부민은 약 5.8분에서 피크가 관찰되는 것을 알 수 있었다. 또한 알부민의 경우 280 nm의 흡광도가 260 nm에서 보다 높았으나, 세포밖 소포체의 경우는 반대로 260 nm에서의 흡광도가 280 nm에서보다 보다 크다는 것을 알 수 있었다. 또한 알부민의 경우, 450 nm에서는 흡광도가 전혀 없는 반면에 세포밖 소포체의 경우 260 nm 흡광도의 약 10%에 해당하는 밴드를 450 nm에서 형성하는 것을 확인하였다. 이는 세포밖 소포체가 나노 입자이기 때문에 생겨나는 빛의 산란(light scattering)과 관련이 있으며 나노 입자가 가지는 중요한 특징이다.
도 4(a) 및 (b)에 나타난 각 파장에서의 흡광도(피크 면적)를 계산한 후, 여러 파장에서의 흡광도를 비교한 결과를 도 4(c)에 나타내었다. 그 결과, 세포밖 소포체의 경우 파장별 흡광도의 비율이 알부민의 경우와 구별되는 특징을 가진다는 것을 알 수 있었다.
이로부터 크기 배제 크로마토그래피로 전개시킨 시료의 분광학적 특징을 분석함으로써 시료 내 세포밖 소포체 또는 불순물의 총량을 분석할 수 있을 뿐만 아니라 불순물의 물리적, 분광학적 특성도 함께 분석할 수 있음을 알 수 있었다.
실시예 4. 크기 배제 크로마토그래피를 이용한 표본 세포밖 소포체와 알부민의 230 nm 흡광 크로마토그램 분석 및 이의 활용
크기 배제 크로마토그래피와 분광학적 분석 결과로부터 물질의 정량 분석을 하기 위해, 상기 표본 세포밖 소포체와 알부민을 상기 실시예 2와 동일한 세파크릴 S500 컬럼에 주입하여 전개시킨 후 230 nm 흡광 크로마토그램에서 각 시료의 흡광 밴드 면적을 분석하였다. 230 nm 파장은 비교적 폭넓은 물질에 흡수되고 감도가 높은 것으로 알려져 있다.
그 결과, 도 5에 나타난 바와 같이 3.3 분에 용출되는 세포밖 소포체의 흡광 밴드 면적과 7.7분에 용출되는 알부민의 흡광 밴드 면적은 각각의 주입량이 증가함에 따라 증가한다는 것을 알 수 있었다. 흡광 밴드의 면적과 주입량의 관계를 분석한 결과 다음과 같은 높은 선형 비례 관계가 있음을 알 수 있었다.
세포밖 소포체(SW480 EVs):
Peak Area(mAU*min) at 230 nm = 3.760 * EV quantity (mg) - 0.380
알부민 (BSA):
Peak Area(mAU*min) at 230 nm = 4.765 * Albumin quantity (mg) - 1.491
또한, 세포밖 소포체와 알부민의 혼합 비율에 따른 흡광도의 차이를 비교 분석하기 위하여, 일정한 양의 표본 세포밖 소포체에 다양한 양의 알부민을 혼합(20%, 33.33%, 50%, 66.67%, 80%, 88.89%)한 혼합 시료를 상기 크기 배제 크로마토그래피 컬럼에 주입하여 전개시킨 후 230 nm에서 흡광도를 측정하였다.
그 결과, 도 6에 나타난 바와 같이 각 혼합 시료에서 세포밖 소포체 흡광 밴드 면적은 거의 동일하게 나타난 반면, 알부민의 흡광 밴드 면적은 주입량에 비례하여 증가하는 것을 알 수 있었다(도 6(a), (b)). 또한, 세포밖 소포체 흡광 밴드 면적과 알부민의 흡광 밴드 면적으로부터 세포밖 소포체의 순도를 계산한 결과 실험을 통해 계산된 순도는 예상 순도와 ±2% 범위 내에서 일치함을 확인할 수 있었다(도 6(c)). 이로부터 상기 표본 시료의 경우 크기 배제 크로마토그래피를 통한 용출물의 230 nm 흡광도를 측정함으로써 시료에 포함된 세포밖 소포체의 총량 및 순도를 분석할 수 있다는 것을 증명하였다.
실시예 5. 대장암 세포 배양액에서 서로 다른 세포밖 소포체 분리 방법의 수율 비교 분석
본 발명의 방법을 통해 종래 세포밖 소포체 분리 방법의 수율을 비교하기 위하여, 대장암 세포 배양액으로부터 종래의 초고속 원심 분리법(100,000 xg, 2h) 또는 폴리에틸렌 글리콜(Polyethylene glycol) 기반 침전 방법을 이용하여 세포밖 소포체를 각각 분리한 후 상기 순도 분석 방법으로 세포밖 소포체의 순도를 분석하였다. 대장암 세포 배양액으로부터 분리된 세포밖 소포체 시료를 세파크릴 S500 컬럼에 주입한 후 크기 배제 크로마토그래피를 전개시켰으며, 각 용출 시료의 230 nm 흡광도를 측정하여 분석하였다.
그 결과, 각 시료의 230 nm 흡광 크로마토그램(도 7(a))에서 3.3분에 검출되는 세포밖 소포체 흡광 밴드의 면적과 그 외의 흡광 밴드 면적을 계산하여 순도를 분석한 결과, 폴리에틸렌글리콜 기반 침전 방법의 세포밖 소포체 순도는 약 69%, 초고속 원심 분리법의 순도는 약 43%로 나타나, 폴리에틸렌글리콜 침전법의 분리 수율이 더 높은 것을 확인할 수 있었다(도 7(b), (c)).
본 발명의 순도 분석 방법을 검증하기 위해 통상적으로 세포밖 소포체의 순도를 평가하는 방법인 단백질 당 나노 입자 분석을 수행한 결과, 상기와 유사하게 폴리에틸렌글리콜 기반 침전 방법으로 분리한 시료의 세포밖 소포체가 더 많다는 것을 확인할 수 있었다(도 7(d)).
실시예 6. 인간 소변에서 서로 다른 세포밖 소포체 분리 방법의 순도 비교 분석
상기 실시예 5와 동일한 방법으로, 초고속 원심 분리법 (100,000 xg, 2h) 또는 폴리에틸렌 글리콜(Polyethylene glycol) 기반 침전 방법을 이용해 인간 소변 시료로부터 분리한 세포밖 소포체의 순도를 분석하였다.
그 결과, 도 8에 나타난 바와 같이 각 시료의 230 nm 흡광 크로마토그램(도 8(a))에서 3.3분에 검출되는 세포밖 소포체 흡광 밴드의 상대 면적을 계산하여 순도를 분석한 결과, 두 분리 방법을 통한 시료 모두 10% 미만의 순도를 나타내었고, 상대적으로 폴리에틸렌글리콜 기반 침전 방법의 순도가 조금 더 높은 것을 확인할 수 있었다(도 8(b), (c)).
이로부터 본 발명의 방법을 이용하여 체액 유래 세포밖 소포체 분리 방법의 효율적인 수율 분석법으로 활용될 수 있음을 알 수 있었다.
Claims (20)
- (a) 세포밖 소포체를 포함하는 시료를 크기 배제 크로마토그래피 컬럼에 주입하여 전개시키는 단계;
(b) 상기 전개된 시료의 특정 파장에 대한 흡광 크로마토그램을 검출하는 단계;
(c) 상기 단계 (b)의 흡광 크로마토그램으로부터 세포밖 소포체의 흡광 밴드와 불순물의 흡광 밴드를 구별하는 단계;
(d) 상기 단계 (b)의 흡광 크로마토그램으로부터 세포밖 소포체의 흡광 밴드 면적 및 불순물의 흡광 밴드 면적을 계산하는 단계; 및
(e) 상기 세포밖 소포체의 흡광 밴드 면적 값과 불순물의 흡광 밴드 면적 값으로부터 세포밖 소포체의 순도를 계산하는 단계를 포함하되,
상기 특정 파장은 230 nm, 260 nm 및 280 nm을 포함한 3종 이상의 파장인 세포밖 소포체의 순도 분석 방법.
- 제1항에 있어서,
상기 시료는 포유동물 세포 배양 배지, 박테리아 세포 배양 배지, 효모 배양 배지, 조직 추출물, 암 조직, 혈청, 혈장, 침, 눈물, 땀, 소변, 대변, 뇌척수액(CSF, cerebrospinal fluid), 복수(ascite), 양수(amniotic fluid), 정액, 유(milk), 먼지, 담수, 해수, 토양 및 발효식품으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 세포밖 소포체의 순도 분석 방법.
- 삭제
- 제1항에 있어서,
상기 특정 파장은 330 내지 450 nm 범위 중 하나 이상, 230 nm, 260 nm 및 280 nm의 4종 이상의 파장인 세포밖 소포체의 순도 분석 방법.
- 제1항에 있어서,
상기 세포밖 소포체의 흡광 밴드는 하기 조건을 만족하는 것인 세포밖 소포체의 순도 분석 방법:
i) 230 nm, 260 nm, 280 nm 에서 모두 흡광도를 가지는 피크;
ii) 280 nm 흡광도에 대한 260 nm 흡광도의 비율(260 nm/280 nm)의 값이 1 이상인 피크; 및
iii) 330 nm 내지 450 nm 범위에서 선택되는 하나 이상의 파장에 대한 피크가 존재.
- 제1항에 있어서,
상기 불순물의 흡광 밴드는 하기 조건 중 하나 이상을 만족하지 않는 것인 세포밖 소포체의 순도 분석 방법:
i) 230 nm, 260 nm, 280 nm 에서 모두 흡광도를 가지는 피크;
ii) 280 nm 흡광도에 대한 260 nm 흡광도의 비율(260 nm/280 nm)의 값이 1 이상인 피크; 또는
iii) 330 nm 내지 450 nm 범위에서 선택되는 하나 이상의 파장에 대한 피크가 존재.
- 제1항에 있어서,
상기 세포밖 소포체의 흡광 밴드 면적(AEV)은 하기 조건을 만족하는 230 nm 피크 아래의 면적을 계산한 것인 세포밖 소포체의 순도 분석 방법:
i) 230 nm, 260 nm, 280 nm 에서 모두 흡광도를 가지는 피크;
ii) 280 nm 흡광도에 대한 260 nm 흡광도의 비율(260 nm/280 nm)의 값이 1 이상인 피크; 및
iii) 330 nm 내지 450 nm 범위에서 선택되는 하나 이상의 파장에 대한 피크가 존재.
- 제1항에 있어서,
상기 불순물의 흡광 밴드 면적(ACONT)은 하기 조건 중 하나 이상을 만족하지 않는 230 nm 피크 아래의 면적을 계산한 것인 세포밖 소포체의 순도 분석 방법:
i) 230 nm, 260 nm, 280 nm 에서 모두 흡광도를 가지는 피크;
ii) 280 nm 흡광도에 대한 260 nm 흡광도의 비율(260 nm/280 nm)의 값이 1 이상인 피크; 또는
iii) 330 nm 내지 450 nm 범위에서 선택되는 하나 이상의 파장에 대한 피크가 존재.
- 제1항에 있어서,
상기 세포밖 소포체의 순도는 하기 식을 이용하여 계산하는 것인
세포밖 소포체의 순도 분석 방법:
위 식에서 AEV 는 세포밖 소포체의 흡광 밴드 면적이고, ACONT 는 불순물의 흡광 밴드 면적임.
- (a) 세포밖 소포체를 포함하는 시료를 크기 배제 크로마토그래피 컬럼에 주입하여 전개시키는 단계;
(b) 상기 전개된 시료의 제1 파장에 대한 흡광 크로마토그램을 검출하는 단계;
(c) 상기 전개된 시료의 상기 제1 파장과 상이한 제2 파장에 대한 흡광 크로마토그램을 검출하는 단계; 및
(d) 상기 각각의 흡광 크로마토그램으로부터 세포밖 소포체의 흡광 밴드 면적 또는 불순물의 흡광 밴드 면적을 계산하는 단계를 포함하되,
상기 제1파장 및 제2파장은 230 nm, 260 nm 및 280 nm을 포함한 3종 이상의 파장인 세포밖 소포체의 분석 방법.
- 삭제
- 삭제
- 제10항에 있어서,
상기 제1 파장은 330 내지 450 nm 범위 중 하나, 230 nm, 260 nm 및 280 nm의 4종류의 파장이며,
상기 제2 파장은 200 nm ~ 800 nm 범위에서 선택되는 하나 이상의 값인 세포밖 소포체의 분석 방법.
- 제10항에 있어서,
상기 세포밖 소포체의 분석은 상기 각 파장에 대한 세포밖 소포체의 흡광 밴드 면적의 비율을 분석하는 단계를 포함하는 것인 세포밖 소포체의 분석 방법.
- 제10항에 있어서,
상기 세포밖 소포체의 분석은 상기 각 파장에 대한 불순물의 흡광 밴드 면적의 비율을 분석하는 단계를 포함하는 것인 세포밖 소포체의 분석 방법.
- (a) 세포밖 소포체를 포함하는 시료를 크기 배제 크로마토그래피 컬럼에 주입하여 전개시키는 단계;
(b) 상기 전개된 시료의 특정 파장에 대한 흡광 크로마토그램을 검출하는 단계;
(c) 상기 단계 (b)의 흡광 크로마토그램으로부터 세포밖 소포체의 흡광 밴드 면적을 계산하는 단계; 및
(d) 상기 세포밖 소포체의 흡광 밴드 면적으로부터 세포밖 소포체의 총량을 계산하는 단계를 포함하되,
상기 특정 파장은 230 nm, 260 nm 및 280 nm을 포함한 3종 이상의 파장인 세포밖 소포체의 정량 분석 방법.
- 삭제
- 제16항에 있어서,
상기 특정 파장은 330 내지 450 nm 범위 중 하나 이상, 230 nm, 260 nm 및 280 nm의 4종 이상의 파장인 세포밖 소포체의 정량 분석 방법.
- 제16항에 있어서,
상기 세포밖 소포체의 흡광 밴드 면적(AEV)은 하기 조건을 만족하는 230 nm 피크 아래의 면적을 계산한 것인 세포밖 소포체의 정량 분석 방법:
i) 230 nm, 260 nm, 280 nm 에서 모두 흡광도를 가지는 피크;
ii) 280 nm 흡광도에 대한 260 nm 흡광도의 비율(260 nm/280 nm)의 값이 1 이상인 피크; 및
iii) 330 nm 내지 450 nm 범위에서 선택되는 하나 이상의 파장에 대한 피크가 존재.
- 제16항에 있어서,
상기 세포밖 소포체의 총량은 하기 식을 이용하여 계산하는 단계를 포함하는
세포밖 소포체의 정량 분석 방법:
위 식에서 AEV 는 세포밖 소포체의 흡광 밴드 면적이며, a, b는 상수임.
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