KR102109829B1 - 화장료 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 미나리아재비 추출물을 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 추출물을 함유하는 화장료 조성물은 인체 지방유래 줄기세포의 증식, 지방세포로의 분화 촉진, 세포성장인자 분비 활성 유도, 상처치유능으로 인한 피부재생력 향상, 피부볼륨감, 피부탄력, 피부주름 개선 효과에 우수하며, 천연 추출물을 이용함으로써 부작용이 없다.

Description

화장료 조성물{Cosmetic Composition}

본 발명은 미나리아재비(Ranunculus japonicus Thumb) 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부재생 증진용 화장료 조성물에 관한 것이다.

사람의 피부는 나이를 먹으면서 끊임없이 변화하게 된다. 피부 노화는 크게 자연 노화와 외적 노화로 구분되며, 자연 노화는 유전적인 요소에 영향을 받기 때문에 인위적인 조절이 어려운 반면, 외적 노화는 환경적인 요소에 영향을 받기 때문에 인위적인 조절이 비교적 용이하다. 대표적인 외적 노화인자로는 자외선을 들 수 있으며, 가장 두드러진 외적 노화현상이 바로 주름형성이다.

생체 내에서 콜라겐과 같은 세포외기질의 합성과 분해는 적절하게 조절되나 노화가 진행되면서 그 합성이 감소하며 콜라겐을 분해하는 효소인 기질 금속단백질분해효소(matrix metalloproteinase, MMP)의 발현이 촉진되어 피부의 탄력이 저하되고 주름이 형성된다.

피부 주름 개선에 효과적이라고 알려진 물질로는 아데노신, 레티노인산(retinoic acid) 등이 있으나, 아데노신은 임상에서의 효능이 미미하고, 레티노인산은 가임여성에게 사용할 수 없고, 홍반 등 자극의 우려가 높다.

한편, 피부의 기본적인 구조가 피하지방조직에 의해서 유지되고, 이러한 피하지방조직은 피부의 볼륨과 강도를 좌우하는 역할을 하므로, 피부 외곽층의 진피나 표피에 탄력을 부여하는 방법 외에 지방조직의 부피를 증가시키는 것이 피부의 볼륨감 유지 및 주름 개선에 좋은 해결책이 될 수 있다.

줄기세포는 살아있는 동안 끊임없이 세포분열을 통해 증식하고 다양한 활성화 물질을 분비하여 주위 세포들을 활성화시킴으로써 유해한 환경에 따른 세포들의 노화를 억제하고 문제가 있는 부위를 재생하거나 복구한다고 알려져 있다. 그러나 줄기세포 역시 세포군이기 때문에 나이에 따라 점차 그 기능을 서서히 소실하게 된다. 피부에서의 줄기세포도 노화에 따라 그 활성이 점차 감소하기 때문에 세포분열 능력이 떨어지고 점차 비활성화됨으로써 노화에 따른 주름, 검버섯, 더딘 상처치유, 더딘 복구 등의 여러 문제들이 발생하게 된다.

따라서, 줄기세포를 이용한 다양한 분야에서 연구가 활발하게 진행되고 있으며, 최근 발표된 연구를 보면, 노화에 따라 비활성화 되는 피부 줄기세포의 세포 증식을 촉진시키고(J. Lee et al., Cell Prolif. 2009, 42, 595-601), 줄기세포의 지방세포로의 분화를 촉진시켜 피부의 탄력, 볼륨감 유지, 주름을 완화하며((Kim WS et al., J. Dermatol. Sci. 2009, 53(2): 96-102 ; Trottier V et al., Stem Cells. 2008 26(10):2713-23 ; Park BS et al., Dermatol. Surg.　2008, 34(10):1323-1326), 줄기세포의 활성을 증가시켜 다양한 사이토카인을 분비하도록 조절함으로써 주위 세포들의 활성이나 증식을 돕거나 상처치유, 피부재생을 촉진하는 연구들이 진행되고 있다.

상기 문제점을 해결하기 위한 본 발명의 목적은 천연유래의 미나리아재비 추출물을 포함하여 인체에 안전하며, 장기간 사용하여도 부작용이 없는 화장료 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은, 인간 지방유래 줄기세포를 증식시키고, 지방유래 줄기세포를 지방세포로 분화를 촉진시키며, 지방유래 줄기세포를 활성화시켜 배양액 내로 다양한 사이토카인을 분비하게 함으로써 각질형성 세포의 상처치유능을 증진시키며, 피부재생 증진 능력을 나타내는 화장료 조성물을 제공하는 것이다.

상기의 목적을 달성하기 위한 본 발명의 양상은,

미나리아재비 추출물을 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 화장료 조성물은 미나리아재비 추출물을 유효성분으로 포함하여 인간 지방유래 줄기세포의 증식, 줄기세포가 지방세포로 분화되도록 촉진, 줄기세포 배양액의 사이토카인 분비 촉진 및 상처치유 효과, 기질 금속단백질분해효소(matrix metalloproteinase, MMP) 활성 억제능으로 인한 피부 재생, 피부 탄력 및 피부 주름 개선에 효과적이고, 또한 피부에 자극이 적고 천연 유래의 식물을 포함하여 인체에 안전하며 장기간 사용하여도 부작용이 없다.

또한, 본 발명의 화장료 조성물은 다양한 제형으로 제형화가 가능하다.

도 1은 본 발명의 실험예 2에 따른 조성물을 산화 스트레스를 가한 지방유래 줄기세포에 처리했을 때, (a) CD29, (b) CD44 단백질의 발현을 비교하는 그래프이다.
도 2는 본 발명의 실험예 4에 따른 세포 긁힘 상처를 유도한 HaCaT 세포에 미나리아재비를 적용한 줄기세포 배양액을 처리했을 때, 세포 긁힘 상처(wound healing)가 회복되는 정도를 비교하는 사진이다.
도 3은 미나리아재비 추출물을 지방유래 줄기세포에 처리하였을 때, 사이토카인 발현 정도를 나타낸 그래프이다.

본 발명은 미나리아재비 추출물을 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 화장료 조성물의 유효성분인 미나리아재비는 다음과 같은 특징을 가지고 있다.

상기 미나리아재비(Ranunculus japonicus Thunb)는 미나리아재비목 미나리아재비과의 여러해살이풀로서, 우리나라의 산과 들의 볕이 잘 들고 습기가 있는 곳에서 자란다. 중국, 대만, 일본에도 분포한다. 전초 및 뿌리를 모간이라 하며 약용한다. 잎을 생약으로 사용하기도 하며 어릴 때는 식용으로도 한다. 전초에는 프로토아네모닌(protoanemonin)과 그의 이중체 아네모닌(anemonin)이 함유되어 있다. 말라리아, 황달, 편두통, 위통, 류머티성 관절염, 관절결핵, 골결핵, 기관지천식, 치통, 결막염 등에 효능이 있다고 알려져 있다.

상기 미나리아재비 추출물은 총 조성물에 대하여 0.001 내지 10중량%로 포함될 수 있으며, 바람직하게는 0.01 내지 1중량%, 보다 바람직하게는 0.05 내지 0.5중량%이다.

상기 미나리아재비 추출물이 0.001중량% 미만으로 포함되는 경우 피부재생, 피부탄력, 주름 개선, 피부볼륨감 증진 효과가 미미할 수 있으며, 10중량%를 초과하여 포함되는 경우 제형의 안정성이 저하되어 피부탄력, 피부주름, 피부볼륨감 증진 효과가 미미해질 수 있으며, 화장료 등으로 제조 시 향이 좋지 않을 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 화장료 조성물은 피부볼륨감 증진용, 피부재생 증진용, 피부탄력 증진용, 피부주름개선 증진용 또는 피부상처 치료 증진용 조성물일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 화장료 조성물은 지방 조직을 증가시켜 피부볼륨감을 증가시킬 수 있다. 피부볼륨감 증가는 피부층의 볼륨이 늘어나고 증가하는 것을 의미하며, 또는 피부 겉표면의 모양이 볼륨감이 증진되고, 팽팽해져 건강하게 보이는 것을 의미하거나, 손상된 피부 조직이 수복되어 원 상태에 가까워지는 것을 의미할 수 있다.

따라서, 피부볼륨감 증가는 늘어났던 피부층의 부분의 체적이 증가하면서 피부 표면이 함께 펴지게 되어 피부 탄력의 손실에 따른 주름 생성 등과 같은 피부 노화현상을 방지할 수 있다.

상기 피부 재생은 전반적인 피부 노화 및 피부 표피 등에 유발된 상처 등에 대응하여 새로운 각질세포를 생성하는 능력을 포함하는 광의의 개념이다.

상기 피부탄력, 피부주름개선은 피부의 탄력 및 주름과 관련된 능력을 유지 또는 강화시키는 것을 의미한다.

피부 진피층의 교원섬유인 콜라겐(collagen)과 탄력 섬유인 엘라스틴(elastin)이 그러한 역할을 하는 주요 단백질로서 피부 탄력을 주관하는데, 콜라겐의 생합성은 피부의 내, 외적 영향을 받게 된다. 구체적으로, 피부세포는 자연 노화로 인하여 세포 활성이 감소되면 콜라겐 섬유의 감소가 일어나거나, 또는 외적 요인으로서 자외선의 과량 조사되거나 스트레스 등에 의해 콜라겐, 엘라스틴 등의 분해 효소의 발현을 증가시켜 피부의 주름을 증가시키고 탄력을 감소시켜 피부 노화가 진행되는 것이다.

상기 피부상처 치료는 인간 지방유래 줄기세포를 증식시키고, 지방유래 줄기세포를 지방세포로 분화를 촉진시키며, 지방유래 줄기세포를 활성화시켜 배양액내로 다양한 사이토카인을 분비하게 함으로써 피부의 겉 부분만이 소실되는 찰과상, 긁혔을 때 나타나는 열상, 외부의 물리적, 화학적 환경에 의해 일어나는 피부 손상이 일어났을 때 이를 빠른 시간에 회복시키는 것을 의미한다.

본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 미나리아재비 추출물은 지방유래 줄기세포(Adipose derived stem cell: ADSC) 증식을 촉진할 수 있다.

상기 지방유래 줄기세포는 인간의 지방유래 줄기세포(human adipose derived stem cells, hADSCs)일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 줄기세포는 개체의 모든 조직의 세포로 분화할 수 있는 다능성(pluripotent)이거나, 전능성(totipotent)이 있는 자가-재생산능(self-renewal)을 갖는 세포를 의미하며, 배양하는 줄기세포는 특정의 줄기세포로 한정되지 않으며 배아줄기세포(embryonic stem cell)와 성체줄기세포(adult stem cell)를 모두 포함하나, 바람직하게는 인간 유래 성체줄기세포이며, 가장 바람직하게는 인간 탯줄혈액 유래 중간엽 줄기세포(human cord blood-derived stem cells, CB-MSCs), 피부 유래 줄기세포, 또는 인간 지방유래 줄기세포(human adipose-derived stem cells, ADSCs) 이다.

상기 인간 지방유래 줄기세포는 인간의 지방조직으로부터 분리된 일종의 성체 줄기세포일 수 있다. 지방조직은 통상적으로 시행되는 지방흡입 과정에서 부수적으로 얻을 수 있어 충분한 양의 줄기세포를 용이하게 얻고 배양할 수 있다는 장점이 있으며, 또한 골수 채취에 비해 안전성이 우수하다.

본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 미나리아재비 추출물은 상기 지방유래 줄기세포 표지마커인 분화 클러스터 29(cluster of differentiation 29; 이하 CD29) 및 분화 클러스터 44(cluster of differentiation 44; 이하 CD44)의 발현량을 증가시킬 수 있다.

상기 CD29 및 CD44의 발현량 증가는 지방유래 줄기세포의 활성이 증가된다는 것을 의미한다.

따라서, 지방조직을 증가시켜서 피부에 볼륨감을 증가시키는 효능을 가질 수 있고, 또한 피부노화 및 재생 등에 실용적이며, 상처 치료에 치료효과를 극대화 시킬 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 미나리아재비 추출물은 지방유래 줄기세포가 지방세포로의 분화를 촉진시킬 수 있다.

여기서, 분화란 덜 특화된 세포가 특정한 세포로 발달하여 세포의 크기나 모양, 막전위, 대사활성, 신호에 대한 반응이 특정한 유형의 세포로 변화하는 현상을 의미한다.

상기 지방세포의 분화는 지방조직이 부피를 증가시키기 위하여, 지방세포의 분화를 촉진하는 것으로, 지방조직 성장에 있어서 지방전구세포(preadipocyte)가 지방세포(adipocyte)로 전환되는 일련의 과정을 일컬으며 우리 몸에서 일생동안 지속적으로 일어난다.

상기 지방유래 줄기세포로의 분화는 동물, 바람직하게는 포유동물의 지방전구세포 또는 중간엽줄기세포가 지방세포로 분화하는 것이고, 보다 바람직하게는 인간의 중간엽줄기세포가 지방세포로 분화하는 것이며, 가장 바람직하게는 인간의 지방유래 줄기세포가 지방세포로 분화하는 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 미나리아재비 추출물은 기질 금속단백질 분해 효소(matrix metalloproteinase, MMP)의 활성을 억제시킬 수 있으며, 이로 인하여 피부볼륨감, 피부 재생, 피부 탄력 및 피부 주름 개선에 효과적이다. 그러나 콜라겐을 분해하는 효소인 기질 금속단백질 분해 효소가 활성되면 피부의 탄력이 저하되고 주름이 형성된다.

본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 미나리아재비 추출물은 물, 유기용매 또는 이들의 혼합물을 사용하여 당업계에 잘 알려진 통상적인 추출 방법에 의해 추출할 수 있으며, 유기용매를 사용하여 추출하는 것이 바람직하다.

상기 유기용매는 탄소수 1 내지 4의 알코올일 수 있으며, 바람직하게는 무수 또는 함유 메탄올, 에탄올, 프로필알코올, 부틸알코올, 글리세린, 프로필렌글리콜 및 부틸렌글리콜로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상일 수 있다.

상기 미나리아재비 추출물은 미나리아재비를 분쇄하여 추출용매를 첨가하여, 일정 시간 침적시키면서 적절한 시간 간격으로 교반 한 후 얻어진 용액을 여과하여 회수하는 통상의 천연물 추출방법에 따라 얻을 수 있다. 이때, 식물 재료에 가해지는 추출용매의 양은 식물 재료 전체 부피 대비 1 내지 50 배 정도로 할 수 있고, 바람직하게는 미나리아재비의 건조 중량 1g 당 5~20㎖로 한다. 실온에서 1~7일간 침적 추출하거나 50~95℃의 가온 조건에서 1~5 시간 정도 추출하는 방법 등 종래의 일반적인 용매추출방법으로 할 수 있다.

여기서, 상기 온도 범위를 유지하는 것이 부패, 변색 및 변취의 예방에 효과적일 수 있으며, 상기 추출 시간이 상기 범위를 벗어나는 경우 추출 자체가 제대로 이루어지지 않거나, 또는 추출되더라도 활성 성분이 충분히 확보되지 못하는 문제점이 있다.

본 발명에 있어서, 상기 피부 외용제 조성물은 화장료 조성물 또는 약학 조성물일 수 있다.

상기 화장료 조성물은 피부볼륨감, 피부탄력 및 피부주름 개선 증진용 조성물로써, 제형은 특별히 제한되지 않으며, 목적하는 바에 따라 적절히 선택할 수 있다. 예를 들어 유연 화장수, 수렴 화장수, 영양 화장수, 마사지 크림, 에센스, 영양크림, 팩 등의 제형으로 제조할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 약학 조성물은 상처치유 및 피부재생용 조성물로써, 로션, 연고, 겔, 크림, 패취 또는 분무제와 같은 경피 투여형 제형일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

각 제형에 의한 피부 외용제 조성물에 있어서, 본 발명의 조성물 이외의 다른 성분들을 기타 피부 외용제의 제형 또는 사용 목적 등에 따라 당업자가 어려움 없이 적의 선정하여 배합할 수 있으며, 이 경우 다른 원료와 동시에 적용할 경우 상승효과가 일어날 수 있다.

또한, 본 발명에 의한 조성물이 약학 조성물로 사용될 경우에, 방부제, 안정화제, 수화제 또는 유화 촉진제, 삼투압 조절을 위한 염 또는 완충제 등의 약학적 보조제 및 기타 치료적으로 유용한 물질을 추가로 함유할 수 있으며, 통상적인 방법에 따라 다양한 경구 또는 비경구 투여 형태로 제형화할 수 있다.

본 발명에 따른 조성물에 의한 줄기세포 증식, 지방조직의 증가 효과로, 피부 볼륨감 증가 효과 외에도 피부 탄력 증대 효과, 피부 주름 개선 효과, 피부 재생 효과, 피부 노화 방지 효과 등이 있으나, 이에 한정되지는 않는다.

이하, 실시예 및 실험예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명한다. 이는 본 발명의 설명을 위한 것일 뿐, 이로 인해 본 발명의 범위가 제한되지 않는다.

< 제조예 1> 미나리아재비 추출물 제조

미나리아재비를 분쇄하여 분말화 한 후, 80 % 에탄올을 미나리아재비 양의 2 배 정도의 부피만큼 가하여 3일간 냉침 시킨 뒤에 용액을 모두 모아 여과지로 여과한 후, 증발기를 이용하여 용매를 제거한 뒤에 동결 건조기에서 건조하여 48시간 이상 건조시켜 분말 상태로 만들었다.

< 실험예 1> 지방유래 줄기세포 증식 실험

상기 제조예 1에 따른 미나리아재비 추출물에 의한 지방유래 줄기세포의 증식 효과를 확인하기 위해 MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2-5-diphenyltetra-zolium bromide) 시약을 이용하여 세포 활성을 측정하였다.

인간 지방유래 줄기세포(Human adipose-derived stem cells, ADSCs)는 Invitrogen (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)으로부터 구입하였다. 동결보존된 세포들을 37℃에서 녹인 후 곧 바로 MesenPRO RSTM 배지(Gibco, Carlsbad, CA, USA)에서 배양하였다. 이어서, 세포들을 MesenPRO RSTM 배지를 이용하여 증식시켰다.

상기 인간 지방유래 줄기세포를 배양하여 1 X 10⁴ 세포/웰 (cells/well)의 농도로 96웰 플레이트에 접종한 후, 24시간 후에 미나리아재비 추출물을 10, 20, 50 μg/ mL의 농도가 되도록 하여 지방유래 줄기세포에 적용하였다. 24시간 후에 MTT 시험을 수행하여 세포 증식 효과를 확인하였다. 음성대조군과 비교하여 세포 증식능을 평가하였다. 세포 증식율의 결과는 하기 수학식 1에 의하여 계산하였으며, 결과를 표 1에 나타내었다.

<수학식 1>

세포증식율 (%) = (미나리아재비 추출물의 흡광도 - 음성대조군의 흡광도) / 음성대조군의 흡광도 X 100

	줄기세포 증식율 (%)
음성대조군	-
미나리아재비 추출물 10 μg/ mL	28
미나리아재비 추출물 20 μg/ mL	32
미나리아재비 추출물 50 μg/ mL	35

상기 표 1에서 보듯이 미나리아재비 추출물은 지방유래 줄기세포의 증식을 촉진시켰다.

< 실험예 2> 지방유래 줄기세포의 유세포 분석

인간 지방유래 줄기세포를 트립신(Trypsin-EDTA)으로 75 cm² Ti 플라스크로부터 분리한 뒤 1500 rpm에서 5분간 세포를 가라앉힌 다음, 배양액을 제거한 뒤에 3ml의 차단버퍼(Blocking buffer), 2 % 우태아 혈청(Fetal calf serum: FCS), 2 % 소의 혈청 알부민(Bovine Serum Albumin(BSA) KGM-2)을 넣어주어 세포를 현탁하였다. 4 ℃에서 15분 동안 세포 (약 10⁶개의 세포)를 적용시킨 다음, FITC (Fluorescein isothiocyanate)가 부착된 CD44 항체(Cat No. 555478)(BD Pharmingen, CA, US)와 PE-Cy(phycoerythrin-cyanine)가 부착된 CD29 항체(Cat No. 559882) (BD Pharmingen)을 각각 100: 1로 넣어주어, 4℃ 하에서 45분 동안 반응시켰다. 한편, 음성대조군으로 사용되는 세포에는 FITC Rat IgG2a, k 아이소타이프(isotype)(Cat No. 555742) (BD Pharmingen)와 PE-Cy5 mouse IgG1 k 아이소타이프(Cat No. 555750) (BD Pharmingen)를 역시 100: 1로 넣어주어, 4℃ 하에서 45분 동안 반응시켰다.

반응이 끝난 후 3ml의 워싱 버퍼(2 % Bovine Serum Albumin (BSA) KGM-2)로 두 번 세척한 후, 세포를 현탁하였다. 이후 FACS CantoⅡ (BD Bioscience, San Jose, CA, U.S)로 지방유래 줄기세포에서 CD29, CD44을 발현하는 세포들의 활성의 변화를 관찰하고, 이를 도 1((a)CD29, (b)CD44) 및 표 2에 나타내었다.

	음성대조군	미나리아재비 추출물
CD29를 발현하는 지방유래 줄기세포	1,913	3,659
	증가 %	91 %
CD44를 발현하는 지방유래 줄기세포	1,417	1,744
	증가 %	23 %

도 1 및 표 2에서 볼 수 있듯이, 음성대조군에 비해서 CD29는 91 %, CD44는 23 % 증가하였음을 확인할 수 있었다.

< 실험예 3> 지방세포로의 분화 실험

인간 지방유래 줄기세포를 지방세포로의 분화 유도는 Invitrogen 社에서 권장하는 분화 배지를 사용하였다. 구체적으로, 지방유래 줄기세포를 StemPro® Adipogenesis Differentiation Kit 배지 (Gibco, Carlsbad, CA, USA) 조건 하에서 배양하여 줄기세포를 지방세포로 분화시켰으며, 지방세포 분화 유도 시에 분화 배지 조건하에서 미나리아재비 추출물을 10 μg/mL 배지에 첨가하였다.

지방유래 줄기세포의 지방세포 분화를 시작한 지 14일 후, 세포 배양액을 제거하고, 인산염 완충액(Phosphate Buffered Saline, PBS)으로 세포를 세척한 다음, 10% 포르말린 용액을 사용하여 세포를 30분간 고정시켰다. 고정된 세포를 60% 이소프로판올 용액으로 1회 세척하고, 오일레드 O(Oil Red O) 염색시약을 60% 이소프로판올에 녹인 염색액으로 5분간 지방세포 내의 지질체를 염색하였다. 이어서, 헤마톡실린(hematoxylin)으로 재염색을 행하여 세포핵을 쉽게 구분되도록 한 후 현미경으로 관찰하였다.

이후 오일레드 O 시약으로 염색된 지질을 100 % 이소프로판올 용액으로 용출시킨 후 500 nm의 파장에서 흡광도를 측정하였으며, 분화배지만을 넣은 음성대조군 대비 미나리아재비 추출물에 의한 지방분화 촉진 증가율을 표 3에 나타내었다.

	지방분화 촉진 증가율 (%)
미나리아재비 추출물	20

표 3에서 볼 수 있듯이, 미나리아재비 추출물은 지방유래 줄기세포의 지방세포로의 분화를 촉진시킬 수 있음을 확인할 수 있다.

< 실험예 4> 시험관 내 상처 치유 측정법(in vitro wound healing assay)을 통한 상처 치유 활성

인간의 각질형성세포인 HaCaT 세포를 10 % (v/v) FBS, 페니실린 100 U/㎖ 및 스트렙토마이신 100 ㎍/㎖를 포함하는 DMEM 배지에 주입하고 37 ℃, 5 % CO₂ 하에서 배양하였다. 시험관 내 상처 치유 측정법 (in vitro wound healing assay)은 보통 피펫팁을 이용한 세포 긁힘 상처 유도법이 주로 사용되나, 세포 상처 간격의 재현성 문제를 해결하기 위해 ibidi 社의 culture-insert 2 well을 사용하여 세포 긁힘 상처를 유도하였다. HaCaT 세포를 트립신 처리로 떼어낸 후, 3 ~7 X 10⁵ cells/mL 농도로 맞추어 culture-insert 각 well에 70 μL씩 주입하였다. 37 ℃, 5 % CO₂ 하에서 24시간 배양 후, culture-insert를 제거하고 세포를 PBS로 세척하였다.

한편, 지방유래 줄기세포에 미나리아재비 추출물 20 μg/mL을 처리하여 24시간 배양시킨 배양액을 DMEM 배지에 희석하여 준비하고, 위의 세포 긁힘 상처가 유도된 HaCaT 세포에 처리하였다. 음성대조군은 미나리아재비 추출물을 처리하지 않은 배양액을 사용하였다. 세포 긁힘 상처가 회복되는 정도를 시간 경과에 따라 현미경으로 관찰하였고, 그 결과를 도 2에 나타내었다. 도 2의 결과에서 확인할 수 있듯이, 음성대조군으로 처리된 세포의 긁힘 상처는 8시간 후에 상대적으로 치유되지 않은 채로 남아 있었는데 반해, 미나리아재비로 처리된 세포에서는 상처 가장자리의 세포 증식과 이동으로 긁힘 상처가 치유되어 8시간 후 긁힌 면적이 거의 복구되었다. 따라서, 본 발명의 미나리아재비가 피부 상처치유 및 피부 재생 효과가 우수함을 알 수 있다.

< 실험예 5> 성장인자 분석 실험

상기 실험예 1에서 미나리아재비 추출물이 지방유래 줄기세포의 증식을 촉진한다는 것을 실험을 통해 확인하였다. 또한, 실험예 4에서 미나리아재비 추출물을 처리한 줄기세포 배양액 성분에 의해서 인간 각질형성세포의 긁힘 상처 치유가 촉진됨을 확인하였다. 실험예 5에서는 추가적으로 미나리아재비 추출물이 줄기세포의 증식과 상처치유능에 어떠한 메카니즘을 통해 영향을 미치는지 확인하였다.

인체 지방유래 줄기세포의 배양 시 미나리아재비 추출물에 의해 EGF, FGF, Flt-3 ligand, G-CSF, GM-CSF, IL-3, IL-6, TNF-α 및 VEGF 등의 사이토카인들의 발현 프로파일에 어떠한 변화가 유도되는지를 확인하였다.

지방유래 줄기세포를 MesenPRO RSTM 배지를 이용하여 5 ％ CO₂ 및 37 ℃ 하에서 증식시킨 후, 5 X 10⁴개의 세포를 6웰 플레이트(well plate)에 접종하여 24시간 배양하였다. 미나리아재비 추출물 20 μg/mL 처리하여 72 시간 경과한 후, 줄기세포 배양 상등액을 이용하여 사이토카인 분석 시험을 진행하였다. 사이토카인 분석은 Magnetic Luminex® Screening Assay multiplex kits (R&D Systems, Inc., USA)를 사용하여 제조자 프로토콜에 따라 실험을 실시하였다.

도 3에 나타난 바와 같이, 미나리아재비 추출물을 지방유래 줄기세포에 처리한 경우, 사이토카인 EGF, FGF, G-CSF, VEGF-A의 생성량이 음성대조군 대비 증가한 것을 확인할 수 있었다.

도 3에 나타난 구체적 결과에서, 인간 지방유래 줄기세포를 미나리아재비 추출물로 처리한 경우 EGF와 FGF의 생성은 음성대조군에 비해 약 20 % 증가하였고, G-CSF의 생성은 음성대조군에 비해 약 380 % 증가하였다. VEGF-A의 생성은 음성대조군에 비해 약 10 % 증가하였다. 따라서, 미나리아재비 추출물에 의한 줄기세포 증식 촉진 효과는 EGF, FGF, G-CSF, VEGF-A에 의해 매개되는 효과로 보여진다.

< 실험예 6> MMP -1 활성 억제효과 실험

기질 금속단백질 분해 효소-1(matrix metalloproteinase-1, MMP-1) 활성 억제 평가는 상업적으로 판매되고 있는 assay kit(Enzo 社, BML-AK404)를 이용하여 수행하였다. 96-웰 플레이트(well plate)의 각 웰에 기질 금속단백질 분해 효소(MMP-1) 20 ㎕, 추출물 시료 20 ㎕, 완충용액 50 ㎕를 넣은 후에 37 ℃에서 30~60분 동안 반응시켰다. 마지막 단계로 기질(substrate)로서 1 mM 티오펩타이드(thiopeptide)를 넣은 후 ELISA reader를 이용하여 37℃ 조건, 475 nm에서 15분 동안 1분 간격으로 흡광도를 측정했다. MMP-1 활성 억제율는 다음의 수학식 2로 산출했으며, 시료의 MMP-1 활성 억제율은 기존에 알려져 있는 기질 금속단백질 분해 효소 저해제(NNGH, N-Isobutyl-N-(4-methoxyphenylsulfonyl)-glycyl hydroxamic acid)와 비교했다. MMP-1 의 활성 억제 평가 결과는 하기 표 4에 나타내었다.

<수학식 2>

MMP-1 활성 억제율 (%) = (1 - A / B) X 100

A : 시료의 시간에 따른 흡광도 변화 기울기

B : 대조군의 시간에 따른 흡광도 변화 기울기

	MMP-1 활성 억제율 (%)
미나리아재비 추출물 10 μg/ mL	41
미나리아재비 추출물 20 μg/ mL	44
미나리아재비 추출물 50 μg/ mL	52
NNGH (1.3 μM)	86

상기의 결과로부터 미나리아재비 추출물의 기질 금속단백질 분해 효소-1(matrix metalloproteinase-1, MMP-1) 활성 억제 효과가 우수하다는 사실을 확인할 수 있었고, 이를 바탕으로 본 발명의 화장료 조성물은 MMP-1의 발현을 효과적으로 억제함으로써 피부볼륨감 증진 효과와 피부의 탄력 저하 및 주름 형성을 예방할 수 있음을 기대할 수 있다.

< 실험예 7> 피부에 대한 안전성 시험

피부에 대한 자극 정도를 평가하기 위하여 피부첩포시험(Human patch test)을 시행하였다. 피부첩포시험은 20세 이상의 정상인 30명을 대상으로 실시하였으며, 시료를 1%, 10% 수용액으로 만든 다음 핀 챔버(Finn chamber)를 이용하여 48시간 동안 상박 안쪽 부위에 부착한 뒤 제거한 후에 첫 판독을 하고, 72시간이 경과한 후에 2차 판독을 시행하여 피부 반응 결과를 판정하였다. 평가기준과 자극지수의 계산은 다음과 같으며 그 결과를 표 6에 나타내었다.

반응	가중치	평가기준
-	0.0	무반응
±	0.5	의심되는 양성 반응
+	1.0	약양성반응
++	2.0	강양성반응
+++	3.0	극양성반응

<수학식 3>

피부자극지수 = Σ(가중치 X 반응인 수)/(최고 가중치 X 총 피험자 수) × 100

	피부자극지수	자극정도
미나리아재비 추출물 (1 중량%)	0.0	무자극
미나리아재비 추출물 (10 중량%)	0.8	무자극

실험 결과, 미나리아재비 추출물은 10 중량% 이하에서는 피부에 대하여 무자극인 것으로 나타났으며, 화장료의 원료로 사용 시 피부에 자극이 없을 것으로 판단된다.

< 실험예 8> 피부 탄력, 피부 주름개선 및 피부 볼륨감 증진 효과 측정

하기 표 7의 조성으로 실시예 1 및 비교예 1, 2의 크림 조성물을 제조하였다(단위: 중량%).

성분명	함량 (중량%)
	실시예 1	비교예 1	비교예 2
미나리아재비 추출물	1.0	-	20
글리세린	5.0	5.0	5.0
스테아린산	8.0	8.0	8.0
스쿠알란	5.0	5.0	5.0
자기유화형 모노스테아린산 글리세린	2.5	2.5	2.5
모노스테아린산 폴리옥시에틸렌 소르비탄	1.5	1.5	1.5
프로필렌 글리콜	4.0	4.0	4.0
스테아릴글리시레티네이트	0.2	0.2	0.2
바셀린	2.0	2.0	2.0
산화방지제	적량	적량	적량
향료	적량	적량	적량
방부제	적량	적량	적량
정제수	잔량	잔량	잔량

본 발명의 미나리아재비 추출물의 사용 시 인체의 피부 탄력 증진, 피부 주름개선 및 피부 볼름감 증진 효과를 알아보기 위하여 여성 30명을 대상으로 인체적용시험을 실시하였다.

실시예 1 및 비교예 1, 2에서 제조한 크림을 10명씩 3그룹으로 나누어 1일 2회씩 아침 세안 후와 저녁 세안 후, 4주 동안 사용하게 하였다.

제품 사용 후 피부탄력 증진효과를 측정하기 위하여 피부에 음압을 걸어주었다 놓았다 하는 방식으로 피부 탄력을 측정하는 기기인 큐토미터(Cutometer, Courage+Khazaka Electronic GmbH., Cologne, Germany)를 이용하여 얼굴 부위의 탄력을 측정하여 도포하기 전과 비교하였으며, 그 결과를 하기 표 8에 나타내었다.

	피부 탄력 개선도 (%)
실시예 1	53
비교예 1	30
비교예 2	34

사용 전과 사용 후의 피부 주름개선 정도는 전안촬영시스템(facial stage DM-3(Moritex, 일본))을 이용하여 측정하였고, 분석 프로그램을 이용하여 4주 경과후의 주름 면적 변화량을 구해 효과를 비교하였다. 그 결과를 표 9에 나타내었다.

<수학식 4>

주름 면적 변화량 = 사용 전 주름 면적 - 4주 사용 후 주름 면적

	주름 면적 변화량 (mm2)
실시예 1	9
비교예 1	2
비교예 2	2.8

피부 볼륨감 증진은 3차원 이미지를 이용한 안면 피부 처짐 촬영을 통해 확인하였다. 안면 3차원 촬영장치인 PRIMOS® body (GFMesstechnikGmbH (Germany))를 이용하여 얼굴 측면을 사진촬영 하였고, 이미지 분석 장치를 이용하여 얼굴 측면의 볼륨을 분석하여 변화 정도를 수치화하였다.

	피부 볼륨감 증진 (%)
실시예 1	9.8
비교예 1	1.5
비교예 2	1.9

상기 표 8 내지 표 10의 결과에서, 미나리아재비 추출물을 함유한 실시예 1을 4주 동안 사용했을 때, 비교예 1, 2와 비교하여 피부 탄력 증진, 주름 개선 및 피부볼륨감 증진 효과가 우수한 것을 확인할 수 있다.

이하, 상기한 실험예의 결과를 근거로 하여, 미나리아재비 추출물을 이용한 여러 제형예를 조성하여 제시한다. 그러나, 이들 제형예는 본 발명을 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 제형이 이들 제형예에만 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명한 것이다.

< 제형예 1> 유연 화장수(skin toner)

성분명	함량 (중량%)
미나리아재비 추출물	0.5
글리세린	5.0
1,3 - 부틸렌글리콜	3.0
에탄올	5.0
폴리옥시에틸렌노닐페닐에테르	0.5
향료	적량
방부제	적량
정제수	잔량

< 제형예 2> 수렴 화장수(astringent)

성분명	함량 (중량%)
미나리아재비 추출물	0.5
글리세린	3.0
구연산	0.1
에탄올	10.0
폴리옥시에틸렌올레일에테르	1.0
소르비톨	2.0
향료	적량
방부제	적량
정제수	잔량

< 제형예 3> 로션( 에멀젼 )

성분명	함량 (중량%)
미나리아재비 추출물	0.5
글리세린	5.0
1,3-부틸렌글리콜	8.0
스쿠알란	10.0
모노올레인산폴리옥시에틸렌소르비탄	2.0
트리에탄올아민	1.5
글리세릴스테아레이트	0.5
스테아릴글리시레티네이트	0.2
카르복시비닐폴리머	0.1
아르기닌	0.1
향료	적량
방부제	적량
정제수	잔량

< 제형예 4> 크림(cream)

성분명	함량 (중량%)
미나리아재비 추출물	0.5
글리세린	5.0
스테아린산	8.0
스쿠알란	5.0
자기유화형 모노스테아린산 글리세린	2.5
모노스테아린산 폴리옥시에틸렌 소르비탄	1.5
프로필렌 글리콜	4.0
스테아릴글리시레티네이트	0.2
바세린	2.0
산화방지제	적량
향료	적량
방부제	적량
정제수	잔량

< 제형예 5> 연고제(ointment)

성분명	함량 (중량%)
미나리아재비 추출물	0.5
세토스테아릴알코올	2.0
자기유화형 모노스테아린산	2.0
스테아린산	1.0
밀납	4.0
스쿠알란	7.0
모노스테아린 글리세린	3.0
모노스테아린산 소르비탄	1.0
폴리솔베이트 80	3.0
글리세린	5.0
프로필렌글리콜	4.0
향료	적량
바세린	잔량

본 발명에 있어서, 상기 표 11 내지 15와 같이 미나리아재비 추출물을 이용한 여러 제형을 조성한 화장료 조성물은 인체의 피부볼륨감, 피부탄력, 피부 주름개선, 피부재생 및 피부상처 치료에 우수한 효과를 나타낼 수 있다.

Claims (11)

1. 미나리아재비(Ranunculus japonicus Thumb) 추출물을 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물로서,
   상기 화장료 조성물은 피부재생 증진용인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
   
2. 제1항에 있어서,
   상기 미나리아재비 추출물은 조성물 총 중량에 대하여 0.001~10중량%로 포함되는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
   
3. 제1항에 있어서,
   상기 미나리아재비 추출물은 지방유래 줄기세포 증식을 촉진하는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
   
4. 제1항에 있어서,
   상기 미나리아재비 추출물은 지방유래 줄기세포 표지 마커인 분화 클러스터 29(CD29) 및 분화 클러스터 44(CD44)의 발현량을 증가시키는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
   
5. 제1항에 있어서,
   상기 미나리아재비 추출물이 지방유래 줄기세포가 지방세포로 분화되도록 촉진시키는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
   
6. 제1항에 있어서,
   상기 미나리아재비 추출물은 기질 금속단백질 분해 효소(MMP)의 활성을 억제시키는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
   
7. 제1항에 있어서,
   상기 미나리아재비 추출물은 물, 유기용매 또는 이들의 혼합물로 추출되는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
   
8. 제7항에 있어서,
   상기 유기용매는 메탄올, 에탄올, 프로필알코올, 부틸알코올, 글리세린, 프로필렌글리콜 및 부틸렌글리콜로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
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