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KR102080554B1 - 세포의 자성 비드 부착을 통한 자성 기반 바이오 패닝 방법 - Google Patents

세포의 자성 비드 부착을 통한 자성 기반 바이오 패닝 방법 Download PDF

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KR102080554B1
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남도현
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사회복지법인 삼성생명공익재단
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Abstract

본 발명은 자성 비드를 포함하는 세포를 이용하여 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 스크리닝하는 방법에 관한 것으로 보다 구체적으로는, 세포막에 바이오티닐화된 인지질을 포함하고, 표면에 스트렙타비딘-자성-비드 복합체가 융합된 세포와 자성기반 시스템을 이용하여 항원 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 스크리닝하는 방법에 관한 것이다.

Description

세포의 자성 비드 부착을 통한 자성 기반 바이오 패닝 방법 {Method of Biopanning Using Magnetic Bead attached cell}
본 발명은 자성 비드가 부착된 세포를 이용하여 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 스크리닝하는 방법에 관한 것으로 보다 구체적으로는, 표면에 인지질-바이오틴-스트렙타비딘-자성 비드 복합체를 포함하고, 항원 단백질을 과발현하는 세포를 이용하여 항원 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 자성기반 시스템으로 스크리닝하는 방법에 관한 것이다.
1975년 단일클론항체 개발 기술은 처음 하이브리도마 기술로 시작했다. 하이브리도마 기술이란, 쥐에 면역반응을 유발시킨 후에 B cell을 Myeloma cell과 융합시켜 immortal 상태를 유지시켜 단일 클론 항체를 선별하는 기술이다. 이 기술의 경우, 쥐의 항체를 얻는 기술이므로 인간에게 적용시 쥐 항체를 항원으로 인식하여 면역반응을 일으키는 부작용을 지니고 이를 HAMA(human anti-mouse antibody response)라 한다(Tiandra JJ et al., Immunol Cell Biol, Vol. 66, pp. 367-76, 1990).
상기 부작용을 극복하기 위해, 쥐 항체를 인간 항체와 유사하게 변형시키는 기술을 적용하여 키메릭(Chimeric antibody)항체와 인간화(Humanized antibody) 항체를 개발했다. 하지만, 여전히 면역반응이 초래되는 경우가 있으며 개발 기간이 상당히 오래 걸리는 문제점이 제시되었다.
1985년에는 박테리오 파지 표면에 단백질이나 펩타이드를 발현시키는 파지 디스플레이 기술(PHage display)이 개발되었다. 파지 디스플레이는 다양한 항체 절편을 가진 파지 라이브러리(PHage library)를 제작하여 항체 선별에 사용하는 방법으로, 선별 속도가 빠르고 기술 적용이 상대적으로 간단하여 개발사들이 지속적으로 사용하고 있다.
파지 라이브러리를 이용해서 원하는 항원에 대한 특이적인 항체 절편을 선별하고 회수하여 증폭하는 방법을 거쳐서 항체를 선별하는데 이를 패닝(Biopanning)이라 한다. 패닝에는 다양한 방법이 존재하는데, 대표적으로 재조합 단백질을 이용한 패닝, 세포 패닝, 자성 비드 기반 패닝, in vivo 패닝, 조직을 이용한 패닝 등이 있다(McGuire MJ et al., Method Mol Biol, Vol. 504, pp. 291-321, 2009).
재조합 단백질을 이용한 패닝을 일반적으로 많이 사용하지만, 특정 항원에 대한 항체 라이브러리의 한계 문제와 순도 높은 정제된 항원의 필요성이 요구된다. 정제된 단백질의 경우에는 단백질의 번역후변형(post translation modification, PTM) 구현이 어렵기 때문에 항체 발굴을 하더라도 실제 생체 내에서 작용을 하지 않을 수 있다.
이를 극복하고자, 세포 패닝법이 개발되었으며 특이적인 막단백질(G protein coupled receptors, ligand-gated ion channels, receptor tyrosine kinases, immunoglobulin-like receptors)에 결합하는 항체 개발이 용이 해졌다. 이 방법은 세포의 자연상태 그대로를 항원으로 이용하므로 단백질의 3차원 구조와 PTM을 그대로 구현한 상태로 항체를 선별할 수 있다.
하지만, 세포 패닝의 경우에 노동 집약적이며 실험 개인 편차 빈도가 발생할 수 있어, 이러한 문제점들을 해결하고 극복하기 위한 차세대(Next generation) 세포 패닝법이 필요한 실정이다.
현재까지 다양한 진단용, 치료용 항체가 파지 디스플레이를 통해 개발되고 있으며, 신속하고 정확한 패닝법 확립을 위해 자동화 시스템과 융합하여 고속대량스크리닝 시스템 방법들도 개발되고 있다.
이에, 본 발명자들은 항체를 고속으로 대량 스크리닝 할 수 있는 방법을 개발하기 위하여 예의 노력한 결과, 자성 비드와 항원 단백질을 포함하고 있는 세포와 자성기반 시스템을 이용하여 항체 라이브러리를 스크리닝하는 경우, 속도가 빠를 뿐만 아니라, 민감도와 정확도가 높고, 부작용이 적은 항체를 선별할 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 표면에 자성 비드를 포함하고, 항원 단백질을 과발현하는 세포와 자성기반 시스템을 이용한 항체 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (i) 세포막에 바이오티닐화된 인지질이 삽입되고, 상기 바이오티닐화된 인지질과 스트렙타비딘-자성 비드 복합체가 결합되어 있는 항원 단백질 과발현 세포를 준비하는 단계; (ii) 상기 세포에 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 라이브러리를 처리하고, 자성기반 시스템으로 항원 단백질에 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 스크리닝하는 단계; (iii) 상기 스크리닝된 항체 또는 그의 항원 결합 단편 라이브러리를 항원 단백질이 발현되지 않은 세포와 반응시켜 항원 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편만을 선별하는 단계; 및 (iv) 상기 선별된 항체 또는 그의 항원 결합 단편 중에서 항원 단백질 이외의 항원에 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 분리 및 제거하는 단계를 포함하는 항원 단백질에 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 스크리닝하는 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 살아있는 세포에 자성 비드를 부착하는 기술은 자성 유도된 세포를 이용하여 파지 디스플레이기반 바이오 패닝에 적용할 수 있는 방법이다. 세포 표면 단백질의 구조를 유지한 상태로 항체 선별이 가능하며 재조합 단백질을 이용한 패닝 방식보다 항원 특이적인 항체 선별 가능성이 높다. 또한, 자성 기반 고속 대량 스크리닝 기기 및 시스템에 적용하여 적은 노동력으로 대량의 다양한 항원에 대한 항체를 선별 할 수 있다.
도 1은 본 발명의 방법을 나타낸 개념도이다.
도 2의 (A)는 본 발명의 일 실시예에서 이용한 DHPE-FITC의 화학식을 나타낸 것이고, (B)는 상기 물질의 개략도를 나타낸 것이며, (C)는 FACS로 본 발명의 일실시예에 따른 세포를 분리하는 과정을 나타낸 모사도이다.
도 3의 (A)는 본 발명의 일 실시예에 따른 세포막 유사물질이 포함된 세포에서 반응 시간(30min, 60min) 및 에 따른 형광 세기를 측정한 결과이며, (B)는 상기 (A)의 세포가 6시간이 지나도 세포막 유사물질을 포함하고 있음을 확인한 결과이다.
도 4의 (A)는 본 발명의 일 실시예에서 이용한 B-X-DHPE의 화학식을 나타낸 것이고, (B)는 상기 물질의 개략도를 나타낸 것이며, (C)는 FACS로 본 발명의 일실시예에 따른 세포를 분리하는 과정을 나타낸 모사도이다.
도 5의 (A)는 본 발명의 일 실시예에 따른 세포막 유사물질이 포함된 세포에서 유사물질의 농도에 따른 결합효율을 측정한 것이며, (B)는 상기 물질의 농도 및 반응온도에 따른 결합 효율을 측정한 결과이다.
도 6의 (A)는 세포막 유사물질의 융합 유무에 따른 세포막 표면 단백질의 발현량을 측정한 결과이며, (B)는 세포막에 세포막 유사물질이 결합한 경우를 나타낸 개략도이다.
도 7의 (A)는 본 발명의 일 실시예에 따른 인지질-바이오틴-스트렙타비딘-자성 비드 복합체와 세포의 융합 방식을 나타낸 개략도이며, (B)는 상기 두 방식의 융합 효율을 관찰한 결과이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 자성 비드의 부착률을 배양 배지 조건에 따라 측정한 결과이다.
도 9는 본 발명의 일 실시에 따른 세포의 인지질-바이오틴-스트렙타비딘-자성 비드 복합체 형성 효율을 측정한 결과이다.
도 10은 자성기반 자동화 세포 패닝 장치의 개략도 및 운전 단계를 나타낸 것이다.
도 11은 본 발명의 일 실시예에 따른 자성을 가지는 비드를 이용한 자동화 시스템에서의 세포 패닝 단계를 나타낸 것이다.
도 12는 본 발명의 일 실시예에 따른 세포의 인지질-바이오틴-스트렙타비딘-자성 비드 복합체 형성 후, 자성 기반기기에 적용하여 자동 패닝을 하였을 때 최종 단계 후 남은 세포 수를 수동 패닝방법과 비교한 결과이다.
도13의 (A)는 자성기반 기기를 이용한 자성 부착 비드 세포 패닝에 필요한 reagent를 정리한 것이고, (B)는 자성기반 기기를 이용한 자성 부착 비드 세포 패닝 프로토콜(BindIt Software 3.3.1 for KingFisher Instruments)을 정리한 것이다.
도14의 (A)는. 자성기반 기기를 이용한 특정 항원 과발현 환자유래세포 자동 패닝 결과로서, 항원 고정 방식을 통한 바이오 패닝 결과물을 이용하였으며 강력한 세척조건과 가벼운 세척조건에서의 결과를 의미하며, (B)는 자성기반 기기를 이용한 특정 항원 과발현 환자유래세포 자동 패닝 결과로서, 자성 비드 부착 항원을 통한 자동 바이오 패닝 결과물 이용하였으며, 가벼운 세척조건에서의 결과를 의미한다.
도15의 (A)는. 자동 패닝 결과물을 이용한 특정 항원 특이적 결합능을 지닌 ELISA 기반 항체 스크리닝 결과로서, 항원 고정 방식을 통한 바이오 패닝 결과물을 이용하였으며, 강력한 세척조건과 가벼운 세척조건에서의 결과를 의미하며, (B)는 자동 패닝 결과물을 이용한 특정 항원 특이적 결합능을 지닌 ELISA 기반 항체 스크리닝 결과로서, 자성 비드 부착 항원을 통한 자동 바이오 패닝 결과물을 이용하였으며, 가벼운 세척조건에서의 결과를 의미한다.
도16은 선별된 항체의 ELISA 수치 비교결과로서, Positive/Negative 재조합 단백질에 대한 상대값을 그래프로 나타낸 것이다.
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명자들은 사용자 별로 편차가 심한 세포 패닝의 단점을 개선하고자 노력하였다. 그 결과, 본 발명자들은 자성 비드를 함유한 세포를 이용하여 자성 기반 시스템에서 세포 패닝을 수행할 경우, 세포 패닝의 효율이 증가하고, 고속 대량 스크리닝이 가능함을 확인하고자 하였다.
또한 본 발명자들은 향후 임상에서 성공 가능성이 높고, 내재화(internalization)되어 세포 내부에서 효과적으로 작용할 수 있는 항체를 선별하기 위하여, 항원 단백질을 함유하고 있는 환자 유래 세포를 이용하여, 항암 치료용 항체를 개발하기 위해 노력하였다. 그 결과, 본 발명자들은 파지 디스플레이 기술을 응용하여, 항원 단백질에 높은 친화력으로 결합하고, 세포 내로 내재화하는 항체를 선별하고, 이러한 항체가 세포 내로 내재화하는 것을 확인하고자 하였다.
이에, 본 발명의 일 실시예에서는 세포막에 바이오틴이 결합된 인지질을 함유하고, 표면에 스트렙타비딘-자성 비드 복합체를 포함하는 세포를 이용하여 세포 패닝을 수행하였다. 그 결과, 고속으로 항체를 스크리닝 할 수 있었다(도 12).
따라서, 본 발명은 일 관점에서, (i) 세포막에 바이오티닐화된 인지질이 삽입되고, 상기 바이오티닐화된 인지질과 스트렙타비딘-자성 비드 복합체가 결합되어 있는 항원 단백질 과발현 세포를 준비하는 단계; (ii) 상기 세포에 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 라이브러리를 처리하고, 자성기반 시스템으로 항원 단백질에 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 스크리닝하는 단계; (iii) 상기 스크리닝된 항체 또는 그의 항원 결합 단편 라이브러리를 항원 단백질이 발현되지 않은 세포와 반응시켜 항원 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편만을 선별하는 단계; 및 (iv) 상기 선별된 항체 또는 그의 항원 결합 단편 중에서 항원 단백질 이외의 항원에 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 분리제거하는 단계를 포함하는, 항원 단백질에 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 스크리닝하는 방법에 관한 것이다.
본 발명에서 사용되는 용어 "항체"는 IgA, IgE, IgM, IgD, IgY 및 IgG로 이루어진 군으로부터 선택되는 면역글로불린으로, 목표 항원에 특이적으로 결합할 수 있다. 경쇄(light chain)와 중쇄(heavy chain) 각각 2개씩 모여 이루어지며, 각각의 사슬은 아미노산 서열이 가변적인 가변영역(variable domain)과 일정한 서열을 가지는 고정영역(constant domain)으로 이루어져 있다. 가변영역의 3차원구조 말단에 항원이 결합하는 부위가 위치하며, 이 부위는 경쇄와 중쇄에 각각 3개씩 존재하는 상보성결정부위(complementarity determining region)들이 모여서 형성된다. 상보성결정부위는 가변영역 중에서도 아미노산 서열의 가변성이 특히 높은 부분이며, 이러한 높은 가변성에 의해 다양한 항원에 대해 특이적 항체가 찾아질 수 있다. 본 발명의 범위에는 완전한 항체 형태뿐 아니라, 상기 항체 분자의 항원 결합 단편도 포함된다.
본 발명에서 사용되는 용어 "ScFv (single-chain Fv, 단일사슬단편항체 또는 항체 단편)"는 경쇄 및 중쇄의 가변영역을 연결한 항체이다. 경우에 따라서, 15개 내외의 아미노산이 연결된 펩타이드 사슬로 이루어진 링커(linker, 연결부위)를 포함할 수 있으며, 이 때, ScFv는 경쇄 가변영역-연결부위-중쇄 가변영역, 또는 중쇄 가변영역- 연결부위-경쇄 가변영역의 구조를 가질 수 있으며, 원 항체와 동일 혹은 유사한 항원특이성을 가진다.
완전한 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 구조이며 각각의 경쇄는 중쇄와 다이설파이드 결합으로 연결되어 있다. 중쇄 불변영역은 감마(γ), 뮤(μ), 알파(α), 델타(δ) 및 엡실론(ε) 타입을 가지고 서브클래스로 감마1(γ1), 감마2(γ2), 감마3(γ3), 감마4(γ4), 알파1(α1) 및 알파2(α2)를 가진다. 경쇄의 불변영역은 카파(κ) 및 람다(λ) 타입을 가진다.
항체의 항원 결합 단편 또는 항체 단편이란 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 의미하며, Fab, F(ab'), F(ab')2 및 Fv 등을 포함한다. 항체 단편 중 Fab는 경쇄 및 중쇄의 가변영역과 경쇄의 불변영역 및 중쇄의 첫 번째 불변영역(CH1)을 가지는 구조로 1개의 항원 결합 부위를 가진다. Fab'는 중쇄 CH1 도메인의 C-말단에 하나 이상의 시스테인 잔기를 포함하는 힌지 영역(hinge region)을 가진다는 점에서 Fab와 차이가 있다. F(ab')2 항체는 Fab'의 힌지 영역의 시스테인 잔기가 디설파이드 결합을 이루면서 생성된다. Fv는 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역만을 가지고 있는 최소의 항체조각으로 Fv 단편을 생성하는 재조합 기술은 PCT 국제 공개특허출원 WO88/10649, WO88/106630, WO88/07085, WO88/07086 및 WO88/09344에 개시되어 있다. 이중쇄 Fv(two-chain Fv)는 비공유 결합으로 중쇄 가변영역과 경쇄 가변영역이 연결되어 있고 단쇄 Fv(single-chain Fv, scFv)는 일반적으로 펩타이드 링커를 통하여 중쇄의 가변영역과 경쇄의 가변영역이 공유결합으로 연결되거나 또는 C-말단에서 바로 연결되어 있어서 이중쇄 Fv와 같이 다이머와 같은 구조를 이룰 수 있다. 이러한 항체 단편은 단백질 가수분해 효소를 이용해서 얻을 수 있고(예를 들어, 전체 항체를 파파인으로 제한 절단하면 Fab를 얻을 수 있고 펩신으로 절단하면 F(ab')2 단편을 얻을 수 있다), 유전자 재조합 기술을 통하여 제작할 수도 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 "항체(또는 ScFv) 라이브러리"는 서로 다른 서열을 가지는 다양한 항체 유전자들의 집합이다. 항체 라이브러리로부터 임의의 항원에 대해 특이적 항체를 분리하기 위해서는 매우 높은 다양성이 요구되며, 서로 다른 항체 클론들로 이루어진 라이브러리가 구축되어 사용된다. 이러한 항체라이브러리를 이루는 항체 유전자는 예를 들어, 파지미드(pHagemid) 벡터에 클로닝되어 형질전환체(대장균)에 형질전환될 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 상기 "핵산"은 유전자 또는 뉴클레오티드와 혼용될 수 있으며, 예를 들어 천연/합성 DNA, 게놈 DNA, 천연/합성 RNA, cDNA 및 cRNA로 이루어지는 군으로부터 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 사용되는 용어 "파지미드" 벡터는 파지 디스플레이에 사용되고, 파지복제시작점(pHage origin of replication)을 가지는 플라스미드 DNA이며, 통상적으로 항생제내성유전자를 선택 마커(selection marker)로 가지고 있다. 파지 디스플레이에 사용되는 파지미드 벡터의 경우 M13 파지의 gIII 유전자 또는 그 일부가 포함되어 있으며, ScFv 유전자는 gIII 유전자의 5' 말단에 라이게이션(ligation)되어 형질전환체를 통해 발현된다.
본 발명에서 사용되는 용어 "헬퍼 파지(helper pHage)"는 파지미드가 파지 입자로 조립되도록 필요한 유전정보를 제공하는 파지이다. 파지미드에는 파지 유전자 중 gIII 혹은 그 일부만이 존재하므로 파지미드로 형질전환된 숙주세포(형질전환체)를 헬퍼 파지로 감염시켜 나머지 파지 유전자를 공급하게 된다. M13K07 혹은 VCSM13 등의 종류가 있으며 대부분 카나마이신(kanamycin) 등 항생제 내성 유전자를 포함하여 헬퍼 파지에 감염된 형질전환체를 선택할 수 있도록 하고 있다. 또한 조립신호(packaging signal)에 결함이 있으므로 헬퍼 파지 유전자보다 파지미드 유전자가 선별적으로 파지입자 속으로 조립된다.
본 발명에서 사용되는 용어 "신호서열"은 유전자의 5' 말단부분에 위치하여, 유전자로부터 코딩된 단백질이 외부로 분비될 때 필요한 신호로 기능하는 염기서열 혹은 그에 상응하는 아미노산 서열이다.
본 발명에서 사용되는 용어 "파지 디스플레이"는 변이체 폴리펩티드를 파지, 예를 들어 섬유상 파지 입자의 표면 상에 외피 단백질의 적어도 일부와의 융합 단백질로서 디스플레이하는 기술이다. 파지 디스플레이의 유용성은 무작위화 단백질 변이체의 큰 라이브러리를 대상으로 하여, 표적 항원과 고 친화도로 결합하는 서열을 신속하고도 효율적으로 분류할 수 있다는 사실에 있다. 펩티드 및 단백질 라이브러리를 파지 상에 디스플레이하는 것은 특이적 결합 특성을 지닌 폴리펩티드를 알아보기 위해 수 백만개의 폴리펩티드를 스크리닝하는데 사용되어 왔다.
파지 디스플레이 기술은 특정 리간드 (예: 항원)와 결합하는 신규 단백질을 생성 및 선별하기 위한 강력한 도구를 제공하였다. 파지 디스플레이 기술을 사용하여, 단백질 변이체의 큰 라이브러리를 생성시키고, 표적 항원과 고 친화성으로 결합하는 서열을 신속하게 분류할 수 있다. 변이체 폴리펩티드를 암호화하는 핵산을 바이러스성 외피 단백질, 예를 들어 유전자 III 단백질 또는 유전자 VIII 단백질을 암호화하는 핵산 서열과 융합시킨다. 단백질 또는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열을 유전자 III 단백질의 일부를 암호화하는 핵산 서열과 융합시킨 1가 파지 디스플레이 시스템이 개발되었다. 1가 파지 디스플레이 시스템에서는, 유전자 융합물이 저 수준으로 발현되고 야생형 유전자 III 단백질이 또한 발현되어 입자 감염성이 유지된다.
섬유상 파지 표면 상에서의 펩티드의 발현과 숙주세포의 주변세포질에서의 기능성 항체 단편의 발현을 입증하는 것이 항체 파지 디스플레이 라이브러리를 개발하는 데에 있어 중요하다. 항체 또는 항원 결합성 폴리펩티드의 라이브러리는 수 많은 방식, 예를 들어 무작위 DNA 서열을 삽입함으로써 단일 유전자를 변경시키는 방법 또는 관련 유전자 계열을 클로닝하는 방법으로 제조하였다. 라이브러리를 대상으로 하여, 목적하는 특징을 수반한 항체 또는 항원 결합성 단백질의 발현에 관하여 스크리닝할 수 있다.
파지 디스플레이 기술은 목적하는 특징을 지닌 항체를 제조하기 위한 통상적인 하이브리도마 및 재조합 방법에 비해 몇 가지 이점을 지니고 있다. 이러한 기술은 동물을 사용하지 않고서도 짧은 시간에 다양한 서열을 지닌 큰 항체 라이브러리를 생성시킬 수 있도록 한다. 하이브리도마의 제조나 인간화 항체의 제조는 수 개월의 제조기간을 필요로 할 수 있다. 또한, 면역이 전혀 요구되지 않기 때문에, 파지 항체 라이브러리는 독성이거나 항원성이 낮은 항원에 대해서도 항체를 생성시킬 수 있다. 파지 항체 라이브러리를 또한 사용하여 신규한 치료적 항체를 생성 및 확인할 수 있다.
파지 디스플레이 라이브러리를 사용하여 면역시킨, 비-면역시킨 인간, 생식세포계 서열, 또는 미감작 B 세포 Ig 레퍼토리 (repertory)로부터 인간 항체를 생성시키는 기술을 사용할 수 있다. 각종 림프계 조직을 사용하여, 미감작 또는 비면역 항원 결합성 라이브러리를 제조할 수 있다.
파지 디스플레이 라이브러리로부터 고친화성 항체를 확인 및 분리할 수 있는 기술은 치료용 신규 항체 분리에 중요하다. 라이브러리로부터 고친화성 항체를 분리하는 것은 라이브러리의 크기, 세균성 세포 중에서의 생산 효율 및 라이브러리의 다양성에 좌우될 수 있다. 라이브러리의 크기는 항체 또는 항원 결합성 단백질의 부적절한 폴딩과 정지 코돈의 존재로 인한 비효율적 생산에 의해 감소된다. 세균성 세포에서의 발현은 항체 또는 항원 결합성 도메인이 적절하게 폴딩되지 않는 경우에는 억제될 수 있다. 발현은 가변/불변 계면의 표면이나 선별된 CDR 잔기에서의 잔기를 교대로 돌연변이시킴으로써 개선시킬 수 있다. 골격 영역의 서열은 세균성 세포에서 항체 파지 라이브러리를 생성시키는 경우에 적절한 폴딩을 제공하기 위한 하나의 요소이다.
고 친화성 항체 분리에서 항체 또는 항원 결합성 단백질의 다양한 라이브러리를 생성시키는 것이 중요하다. CDR3 영역은 이들이 종종 항원 결합에 참여하는 것으로 밝혀졌다. 중쇄 상의 CDR3 영역은 크기, 서열 및 구조적 입체 형태 면에서 상당히 다양하므로, 이를 이용하여 다양한 라이브러리를 제조할 수 있다.
또한, 각 위치에서 20개 아미노산 모두를 사용하여 가변 중쇄 및 경쇄의 CDR 영역을 무작위화함으로써 다양성을 발생시킬 수 있다. 20개의 모든 아미노산을 사용하면 다양성이 큰 변이체 항체 서열이 생성되고 신규한 항체를 확인할 기회가 증가할 수 있다.
본 발명의 항체는 단일클론 항체, 다특이적 항체, 인간 항체, 인간화 항체, 키메라 항체, 단쇄 Fvs(scFV), 단쇄 항체, Fab 단편, F(ab') 단편, 다이설파이드-결합 Fvs(sdFV) 및 항-이디오타입(항-Id) 항체, 또는 상기 항체들의 에피토프-결합 단편 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 단일클론 항체는 실질적으로 동질적 항체 집단으로부터 수득한 항체, 즉 집단을 차지하고 있는 개개의 항체가 미량으로 존재할 수 있는 가능한 천연 발생적 돌연변이를 제외하고는 동일한 것을 지칭한다. 단일클론 항체는 고도로 특이적이어서, 단일 항원 부위에 대항하여 유도된다.
상기 "인간화" 형태의 비-인간 (예: 뮤린) 항체는 비-인간 면역글로불린으로부터 유래된 최소 서열을 함유하는 키메라 항체이다. 대부분의 경우, 인간화 항체는, 수용자의 초가변 영역으로부터의 잔기를 목적하는 특이성, 친화성 및 능력을 보유하고 있는 비-인간 종 (공여자 항체), 예를 들어 마우스, 랫트, 토끼 또는 비-인간 영장류의 초가변 영역로부터의 잔기로 대체시킨 인간 면역글로불린 (수용자 항체)이다.
상기 "인간 항체"는 인간 면역글로불린으로부터 유래하는 분자로서 상보성 결정영역, 구조 영역을 포함한 항체를 구성하는 모든 아미노산 서열 전체가 인간의 면역글로불린으로 구성되어 있는 것을 의미한다.
중쇄 및/또는 경쇄 일부가 특별한 종으로부터 유래되거나 특별한 항체 부류 또는 아부류에 속하는 항체 내의 상응하는 서열과 동일하거나 이와 상동성인 반면, 나머지 쇄(들)는 또 다른 종으로부터 유래되거나 또 다른 항체 부류 또는 아부류에 속하는 항체 내의 상응하는 서열과 동일하거나 이와 상동성인 "키메라" 항체 (면역글로불린)뿐 아니라 목적하는 생물학적 활성을 나타내는 상기 항체의 단편이 포함된다.
본원에 사용된 바와 같은 "항체 가변 도메인"은 상보성 결정 영역 (CDR; 즉, CDR1, CDR2, 및 CDR3), 및 골격 영역 (FR)의 아미노산 서열을 포함하는 항체 분자의 경쇄 및 중쇄 부분을 지칭한다. VH는 중쇄의 가변 도메인을 지칭한다. VL은 경쇄의 가변 도메인을 지칭한다.
"상보성 결정 영역" (CDR; 즉, CDR1, CDR2, 및 CDR3)은 항원 결합을 위해 필요한 존재인, 항체 가변 도메인의 아미노산 잔기를 지칭한다. 각 가변 도메인은 전형적으로, CDR1, CDR2 및 CDR3으로서 확인된 3개의 CDR 영역을 갖는다.
"골격 영역" (FR)은 CDR 잔기 이외의 가변 도메인 잔기이다. 각 가변 도메인은 전형적으로, FR1, FR2, FR3 및 FR4로서 확인된 4개의 FR을 가진다.
본 발명의 용어 "바이오틴(biotin)"은 비타민 H 또는 조효소 R(coenzyme [0020] R)이라고도 하는 수용성 B-비타민(vitamin B7)이다. 상기 바이오틴은 테트라히드로티오펜 고리와 융합된 우레이도(테트라히드로이미디자론) 고리(ureido (tetrahydroimidizalone) ring fused with a tetrahydrothiopHene ring)로 구성된다.
바이오틴은 테트라히드로티로펜 고리의 하나의 탄소원자에 결합된 발레르산(Valeric acid)을 포함한다. 바이오틴은 카르복실라제 효소에 대한 조효소로 지방산, 이소루신 및 발린의 합성과 글루코스신합성(gluconeogenesis)에 관여한다. 바이오틴은 상기한 조효소로서의 특징 이외에 10-14 내지 10-15M 수준의 해리상수 Kd로 아비딘(avidin), 스트렙타비딘(streptavidin) 및 뉴트라비딘(또는 탈당화아비딘; neutravidin or deglycosylated avidin) 등의 단백질과 강하게 결합하는 특징을 갖는다. 특히, 스트렙타비딘과의 특이적인 결합은 매우 독한(harsh) 조건에서도 유지될 수 있으므로, 상기 스트렙타비딘-바이오틴 결합은 생물공학분야에 다양하게 응용되고 있다. 바이오틴은 크기가 작아 이를 포함하는 단백질등 생리활성 물질의 활성에 영향을 주지 않으므로, 다양한 생리활성 물질에 결합시켜 생화학적 에세이 등에 이용할 수 있다. 이러한 과정 즉, 생리활성 물질에 바이오틴을 결합시키는 과정을 바이오틴화(biotinylation)이라고 한다.
본 발명에 있어서, 상기 인지질은 PE(PHospHoethanolamine) 계열의 인지질, PA(PHospHatidic acid) 계열의 인지질, PG(PHospHatidylglycerol) 계열의 인지질, PS(PHospHatidylserine) 계열의 인지질, PI(PHospHatidylinositol) 계열의 인지질, 스핑고 지질(spHingolipid) 계열의 인지질 및 스테롤(sterol) 계열의 인지질로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 인지질은 DHPE(1,2-dihexadecanoyl-sn-glycero-3-pHospHoethanolamine), Fluorescein DHPE (N-(Fluoresceine-5-Thiocarbamoyl)-1-2-dihexadecanoyl-sn-glycero-3-pHospHoethanolamine), B-X DHPE(N-((6-(Biotinoyl)amino)hexanoyl)-1-2--dihexadecanoyl-sn-glycero-3-pHospHoethanolamine) Biotin PS(1-oleoyl-2-(12-biotinyl(aminododecanoyl))-sn-glycero-3-phospho-L-serine (ammonium salt)) 및 Biotin PC(1-oleoyl-2-[12-biotinyl(aminododecanoyl)]-sn-glycero-3-phosphocholine) 로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 세포막에 바이오티닐화된 인지질이 삽입되고, 상기 바이오티닐화된 인지질과 스트렙타비딘-자성 비드 복합체가 결합되어 있는 항원 단백질 과발현 세포는, (a) 바이오티닐화된 인지질 존재 하에 항원 단백질 과발현 세포를 배양하여 세포막에 바이오티닐화된 인지질이 삽입된 세포를 수득하는 단계; 및 (b) 상기 수득된 세포의 바이오티닐화된 인지질에 스트렙타비딘-자성 비드 복합체를 처리하여 세포막에 바이오티닐화된 인지질이 삽입되고, 상기 바이오티닐화된 인지질과 스트렙타비딘-자성 비드 복합체가 결합되어 있는 항원 단백질 과발현 세포를 수득하는 단계를 통해 제조된 것임을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 상기 세포막에 바이오티닐화된 인지질이 삽입되고, 상기 바이오티닐화된 인지질과 스트렙타비딘-자성 비드 복합체가 결합되어 있는 항원 단백질 과발현 세포는, (a) 바이오티닐화된 인지질과 스트렙타비딘-자성 비드를 반응시켜, 인지질-바이오틴-스트렙타비딘-자성 비드 복합체를 준비하는 단계; 및 (b) 상기 인지질-바이오틴-스트렙타비딘-자성비드 복합체를 항원 단백질이 과발현된 세포에 융합시켜, 세포막에 바이오티닐화된 인지질이 삽입되고, 상기 바이오티닐화된 인지질과 스트렙타비딘-자성 비드 복합체가 결합되어 있는 항원 단백질 과발현 세포를 수득하는 단계를 통해 제조된 것임을 특징으로 할 수 있다.
본 발명 있어서, 상기 세포는 계면활성제를 포함하는 배지에서 스트렙타비딘-자성 비드 복합체를 융합시키는 것을 특징으로 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 계면활성제는 알킬 폴리글리코사이드(alkyl polyglycoside), 세틸 알코올(cetyl alcohol), 데실 글루코사이드(Decyl glucoside), 데실 폴리글루코사이드(Decyl polyglucoside), 말토사이드(Maltosides), NP-40, 올레일 알코올(Oleyl alcohol), 폴록사머(Poloxamer), 폴리소르베이트(Polysorbate), 소비탄(Sorbitan), 트리톤 X-100(Triton X-100) 및 트윈 80(Tween 80)로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 자성기반 시스템은 자성을 이용하여 세포를 분리하는 장치인 것을 특징으로 할 수 있으며, 바람직하게는 Kingfisher Flex일 수 있지만 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 세포 내로 내재화되는 항체 또는 그의 항원 결합 단편인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명은 또한, (ii) 자성 비드를 포함하고, 항원 단백질을 과발현하는 세포에, 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 라이브러리를 처리하여, 항원 단백질에 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 스크리닝하는 단계를 포함한다.
상기 과발현 세포 및 정상 세포의 항원 단백질 함유량을 측정하는 방법은 항원 단백질을 코딩하는 유전자 또는 단백질의 발현량을 측정하여 비교하는 것을 특징으로 할 수 있고, 바람직하게는 FACS, ELISA, Whole exome sequencing 및 RNA sequencing으로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 방법으로 수행되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명은 또한, (iii) 상기 스크리닝된 항체 또는 그의 항원 결합 단편 라이브러리를 항원 단백질이 발현되지 않는 세포에 처리하여 항원 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편만을 선별하는 단계를 포함한다.
상기 단계 (iii)는 단계 (ii)에서 선택된 항체 또는 그의 항원 결합 단편에 대한 음성 선별(negative selection) 단계로, 이를 통해 항원에 대해 높은 선택성을 갖는 항체를 스크리닝 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 단계 (iii)의 항원 단백질이 발현되지 않도록 제거된 세포는 자연적으로 항원 단백질을 발현하지 않는 세포 일 수 있고, 항원 단백질이 발현되지 않도록 인위적으로 조작한 환자 유래 세포일 수 있으며, 인위적으로 조작하는 방법은 항원 단백질이 발현되지 않도록 만드는 방법이면 어떤 방법이든 사용할 수 있으나, 바람직하게는 항원 단백질에 결합하는 압타머, siRNA, single-stranded siRNA, microRNA, 및 shRNA로 구성된 군에서 선택된 하나 이상을 처리하여 수득되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에서, 상기 항원 단백질이 발현되지 않는 환자 유래 세포를 이용하여 항원 단백질에 결합하는 항체만을 선별하는 단계는 음성 선별과정으로서, 바로 앞의 양성 선별단계 다음에 수행되어 선별된 항체의 항원 단백질에 대한 정확도를 향상시키는 효과가 있다.
본 발명은 더욱이, 상기 선별된 항체 또는 그의 항원 결합 단편 중에서 항원 단백질 이외의 항원에 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 분리제거하는 단계를 포함한다.
상기 분리제거는 전기영동, 원심분리, 겔여과, 침전, 투석, 크로마토그래피(이온교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 면역흡착 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피 등), 등전점 포커싱 및 이의 다양한 변화 및 복합 방법 등이 이용가능하지만 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 분리제거는 예를 들어 원심분리 또는 한외여과에 의해 불순물을 제거하고, 그 결과물을 예를 들어 친화 크로마토그래피 등을 이용하여 정제할 수 있다. 추가의 기타 정제 기술 예를 들어 음이온 또는 양이온 교환 크로마토그래피, 소수성 상호 작용 크로마토그래피, 히드록실아파타이트 크로마토그래피 등이 사용될 수 있다.
본 발명에 의해 선별된 항체 또는 이의 결합 단편은 예를 들어 IgG 형태, Fab' 단편, F(ab')2 단편, Fab 단편, Fv 단편, 또는 단일 사슬 Fv 단편(scFv)일 수 있으나, 바람직하게 IgG 형태로 제작될 수 있다.
본 발명은 다른 관점에서, 상기 방법으로 스크리닝된 항체 또는 그의 항원 결합 단편에 관한 것이다.
본 발명의 항체 또는 항체 단편은 항원 단백질을 특이적으로 인식할 수 있는 범위 내에서, 항체뿐만 아니라, 이의 생물학적 균등물도 포함할 수 있다. 예를 들면, 항체의 결합 친화도 및/또는 기타 생물학적 특성을 보다 더 개선시키기 위하여 항체의 아미노산 서열에 추가적인 변화를 줄 수 있다. 이러한 변형은 예를 들어, 항체의 아미노산 서열 잔기의 결실, 삽입 및/또는 치환을 포함한다. 이러한 아미노산 변이는 아미노산 곁사슬 치환체의 상대적 유사성, 예컨대, 소수성, 친수성, 전하, 크기 등에 기초하여 이루어진다. 아미노산 곁사슬 치환체의 크기, 모양 및 종류에 대한 분석에 의하여, 아르기닌, 라이신과 히스티딘은 모두 양전하를 띤 잔기이고; 알라닌, 글라이신과 세린은 유사한 크기를 가지며; 페닐알라닌, 트립토판과 타이로신은 유사한 모양을 갖는다는 것을 알 수 있다. 따라서, 이러한 고려 사항에 기초하여, 아르기닌, 라이신과 히스티딘; 알라닌, 글라이신과 세린; 그리고 페닐알라닌, 트립토판과 타이로신은 생물학적으로 기능 균등물이라 할 수 있다.
변이를 도입하는 데 있어서, 아미노산의 소수성 인덱스(hydropathic index)가 고려될 수 있다. 각각의 아미노산은 소수성과 전하에 따라 소수성 인덱스가 부여되어 있다: 아이소루이신(+4.5); 발린(+4.2); 루이신(+3.8); 페닐알라닌(+2.8); 시스테인/시스타인(+2.5); 메티오닌(+1.9); 알라닌(+1.8); 글라이신(-0.4); 쓰레오닌(-0.7); 세린(-0.8); 트립토판(-0.9); 타이로신(-1.3); 프롤린(-1.6); 히스티딘 (-3.2); 글루타메이트(-3.5); 글루타민(-3.5); 아스파르테이트(-3.5); 아스파라긴 (-3.5); 라이신(-3.9); 및 아르기닌(-4.5).
단백질의 상호적인 생물학적 기능(interactive biological function)을 부여하는 데 있어서 소수성 아미노산 인덱스는 매우 중요하다. 유사한 소수성 인덱스를 가지는 아미노산으로 치환하여야 유사한 생물학적 활성을 보유 할 수 있다는 것은 공지된 사실이다. 소수성 인덱스를 참조하여 변이를 도입시키는 경우, 바람직하게는 ± 2 이내, 보다 바람직하게는 ± 1 이내, 보다 더 바람직하게는 ± 0.5 이내의 소수성 인덱스 차이를 나타내는 아미노산 사이에 치환을 한다.
한편, 유사한 친수성 값(hydropHilicity value)을 가지는 아미노산 사이의 치환이 균등한 생물학적 활성을 갖는 단백질을 초래한다는 것도 잘 알려져 있다. 미국 특허 제4,554,101호에 개시된 바와 같이, 다음의 친수성 값이 각각의 아미노산 잔기에 부여되어 있다: 아르기닌(+3.0); 라이신(+3.0); 아스팔테이트(+3.0± 1); 글루타메이트(+3.0±1); 세린(+0.3); 아스파라긴(+0.2); 글루타민(+0.2); 글라이신(0); 쓰레오닌(-0.4); 프롤린(-0.5±1); 알라닌(-0.5); 히스티딘(-0.5); 시스테인(-1.0); 메티오닌(-1.3); 발린(-1.5); 루이신(-1.8); 아이소루이신 (-1.8); 타이로신(-2.3); 페닐알라닌(-2.5); 트립토판(-3.4).
분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다(H. Neurath, R.L.Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979). 가장 통상적으로 일어나는 교환은 아미노산 잔기 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thr/PHe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu 및 Asp/Gly 간의 교환이다.
상술한 생물학적 균등 활성을 갖는 변이를 고려한다면, 본 발명의 항체 또는 이를 코딩하는 핵산 분자는 서열번호에 기재된 서열과 실질적인 동일성(substantial identity)을 나타내는 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 상기의 실질적인 동일성은, 상기한 본 발명의 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 61%의 상동성, 보다 바람직하게는 70%의 상동성, 보다 더 바람직하게는 80%의 상동성, 가장 바람직하게는 90%의 상동성을 나타내는 서열을 의미한다. 서열비교를 위한 얼라인먼트 방법은 당업계에 공지되어 있다. NCBI Basic Local Alignment Search Tool(BLAST)은 NBCI 등에서 접근 가능하며, 인터넷 상에서 blastp, blasm, blastx, tblastn 및 tblastx와 같은 서열 분석 프로그램과 연동되어 이용할 수 있다. BLSAT는 www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/에서 접속 가능하다. 이 프로그램을 이용한 서열 상동성 비교 방법은 www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/blast_ help.html에서 확인할 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예1; 세포막 유사물질의 세포막 융합 확인
세포 표면에 마그네틱 비드를 부착시키기 위해 전 처리 과정으로 세포막과 유사한 물질에 Biotin이 결합된 물질이 세포 표면에 융합되는지를 유세포분석기로(Flow cytometer) 확인하였다. 세포막 유사 물질은 DHPE(1,2-dihexadecanoyl-sn-glycero-3-pHospHoethanolamine)를 사용하였다(도 2). DHPE에 형광이 부착된 물질인 Invitrogen 사의 Fluorescein DHPE (N-(Fluorescein-5-Thiocarbamoyl)-1,2-Dihexadecanoyl-sn-Glycero-3-PHospHoethanolamine, Triethylammonium Salt)을 농도조건(1:250, 1:500, 1:1000, 1:2000), 온도조건(상온, 4℃), 반응시간조건(30분, 60분)별로 각각 진행하였다.
먼저, 암세포주인 HCC.95를 조건별 500,000개로 분주하고, 반응 부피 300ul로 시행하였다. 배양이 완료된 시료는 1% FBS 용액으로 1500rpm, 3분동안 원심분리를 진행한 후, 상층액을 제거하는 세척 단계를 진행하였다. 이를 두 번 반복 진행하였다. 진행 후에는 유세포분석기(FACS Aria III)를 통해 분석을 수행하였다,
그 결과 모든 조건에서 농도에 비례하게 형광 강도가 측정되는 것을 확인하였다(도 3A). 이를 통해, 세포막 유사물질이 살아있는 세포표면에 융합됨을 확인하였고, 동일 시료를 6시간동안 4℃ 배양 후 유세포분석기를 통한 형광 강도 측정 결과도 동일한 양상이 나타나는 것을 확인하였다(도 3B). 이는 세포막 유사물질이 세포막에 융합되어도 세포는 안정적임을 의미한다.
실시예2; 바이오틴이 결합된 세포막 유사 물질의 세포 융합 확인 및 최적화
실제 마그네틱 비드 부착에 사용할 물질인 Invitrogen 사의 B-X DHPE (N-((6-(Biotinoyl)amino)hexanoyl)-1,2-Dihexadecanoyl-sn-Glycero-3-PHospHoethanolamine, Triethylammonium Salt)를 농도조건(0.5mg/ml, 0.25mg/ml, 0.125mg/ml, 0.0625mg/ml)별로 각각 진행하였다(도 4).
HCC.95 암세포주를 조건별 500,000개로 분주하고, 반응 부피는 300ul로 시행하였다. 배양이 완료된 시료는 1% FBS 용액으로 1500rpm, 3분동안 원심분리를 진행한 후 상층액을 제거하는 세척 단계를 진행하였다. 이를 두 번 반복 진행하였다. 그 후, 바이오틴에 특이적인 결합력을 가진 스트렙타비딘(Streptavidin)-FITC(형광물질)을 4℃, 1시간 조건에서 반응시켰다. 배양이 완료된 시료는 1% FBS 용액으로 1500rpm, 3분동안 원심분리를 진행한 후 상층액을 제거하였다. 이를 두 번 반복 진행하였다. 진행 후에는 유세포분석기(FACS Aria III)를 통해 분석하였다.
그 결과, 실시예1과 같은 양상의 형광 강도를 확인하였다(도 5A).
본 물질에 대한 세포막 융합 조건을 최적화 하기 위하여, B-X DHPE 농도조건(0.5mg/ml, 0.25mg/ml, 0.125mg/ml, 0.0625mg/ml), 온도조건(4℃, 상온), 반응시간조건(30분, 60분)별로 각각 진행하였으며, 시료 준비는 동일한 방법으로 진행하였다.
그 결과, B-X DHPE 농도(0.5mg/ml), 상온, 30분 반응조건에서 세포막으로 물질이 융합이 가장 잘 되는 것으로 확인하였다(도 5B).
실시예3; 세포막 유사 물질 융합된 세포의 표면 단백질 발현 확인
세포막 유사 물질이 세포에 융합이 되더라도, 표면 단백질 발현에 변화가 있으면 파지 디스플레이기반 세포패닝에 사용하기에 부적합하다. 그러므로, B-X DHPE의 최적화된 조건이 세포 표면 단백질에 영향을 끼치지 않음을 확인하였으며, 마찬가지로 B-X DHPE의 세포 표면 융합양도 확인하였다.
환자유래세포인 GBM15-682T를 사용하였다. 이 세포는 FGFR3 세포 표면 단백질이 과발현되어 있으므로 발현량 비교하기에 적합하다. 세포막 유사 물질 융합된 조건(B-X DHPE)과 그렇지 않은 조건에 대해서 FGFR3 세포 표면 단백질의 발현량을 유세포분석기를 통해서 측정하였다. GBM15-682T를 각 조건별로 500,000개씩 분주한 후에 반응 부피는 300ul로 B-X DHPE(0.5mg/ml)를 상온에서 30분 반응시켰다. 배양이 완료된 시료는 1% FBS 용액으로 1500rpm, 3분동안 원심분리를 진행한 후 상층액을 제거하는 세척 단계를 진행하였다. 이를 두 번 반복 진행하였다.
그 후, 스크렙타비딘(Streptavidin)-FITC(형광물질)와 FGFR3-PE(형광물질)항체를 각각 처리하여 4℃, 1시간 반응시켰다. 위와 같은 세척방법을 2번 진행 후에 B-X DHPE는 FITC 형광으로 분석하고, FGFR3는 PE 형광으로 분석하였다.
그 결과, B-X DHPE 세포 표면 융합량과 FGFR3 세포 표면 발현량에 차이가 없는 것을 확인하였다(도 6). 즉, 세포막 유사 물질(B-X DHPE)이 세포막에 융합되어도, 세포 표면에 변형을 야기하지 않음을 의미한다.
실시예4; 세포막 유사 물질이 융합된 세포의 마그네틱 비드 부착을 통한 자성화 유도 및 조건 최적화
4-1: 복합체 결합 방법 효과 확인
세포에 융합된 B-X DHPE의 경우에는 Biotin 성분을 포함하고 있으므로, 스트렙타비딘과 특이적인 결합력을 지니고 있다. 그러므로, 스트렙타비딘과 접합된 마그네틱 비드(Streptavidin Dynabeads_ Dynabeads? M-280 Streptavidin; Invitrogen 사)를 사용함으로써 세포에 자성을 유도할 수 있다. 세포에 마그네틱 비드를 부착하여 자성화를 유도하는 방법으로 직접적 방법(Direct method)과 간접적 방법(Indirect method)을 비교하였다. 직접적 방법은 B-X DHPE와 Streptavidin Dynabeads를 먼저 반응 시킨 후에 세포에 융합하는 방법을 말하며, 간접적 방법은 세포에 B-X DHPE를 융합시킨 후에 Streptavidin Dynabeads를 반응시키는 방법을 의미한다.
직접적 방법은 B-X DHPE 3.0ug와 미리 자석 분리기(Magnet separator)로 PBS (PH 7.4) 완충용액으로 세척된 Streptavidin Dynabeads 500ug를 상온에서 30min 반응시켰다. 그 후, 동일한 완충용액으로 자석 분리기를 이용하여 2번 세척 하였다. 미리 PBS (pH 7.4) 완충용액으로 세척된 1.0-5.0e+6개 세포를 미리 반응된 B-X DHPE와 Streptavidin Dynabeads 접합체와 상온에서 1시간 배양시켰다. 이 때, 반응 부피는 1ml로 지정하였다.
간접적 방법은 PBS (PH 7.4) 완충용액으로 세척된 1.0-5.0E+6개세포를 B-X DHPE 3ug와 상온에서 30분 배양시켰다. 그 후, PBS (pH 7.4) 완충용액으로 자석 분리기를 이용하여 2번 세척하였다. 자석 분리기를 통해 PBS (pH 7.4) 로 미리 세척된 Streptavidin Dynabeads 500ug를 B-X DHPE가 융합된 세포와 상온에서 1시간 배양시켰다. 반응 부피는 직접방법과 동일하게 하였다.
두 방법 중, 본 발명에서는 직접적 방법이 마그네틱 비드가 세포에 더 부착이 잘 되는 것을 확인하였다(도 7). 즉, 직접적 방법이 마그네틱 비드를 통한 세포의 자성 유도가 효과적이다.
4-2: 자성 비드 부착률 최적화
세포 마그네틱 비드 부착률을 높이기 위해 반응 완충용액 최적화를 진행하였다. ①배양 배지, ②PBS(PH 7.4), ③2mM EDTA/0.1% BSA, ④ 0.1 % Pluronic F-68(Gibco 사)를 위에서 진행한 직접적 방법에 적용하였다. B-X DHPE와 Streptavidin Dynabeads 접합체와 미리 준비된 세포를 배양시킬 때, 위 4가지 완충용액 조건 별로 진행하였다. 배양 종료 후에는 각 시료를 6well plate에 이전하여 현미경(20X, 40X)으로 분석하였다.
그 결과, 0.1% Pluronic F-68 배양조건이 더 효과적으로 세포에 마그네틱 비드 부착률이 높은 것을 확인하였다(도 8).
실제 세포 패닝에 사용되는 세포 수를 이용하여 마그네틱 비드가 부착하여 자성화가 유도되는 세포 수를 측정하였다. 세포 패닝에 일반적으로 사용하는 2e+6개 세포에 B-X DHPE 6ug, Streptavidin Dynabeads 2mg 조건으로 세포에 자성화를 유도하였다. 이를, 자성 기반 기기(Kingfisher Flex_ Thermo scientific) 또는 자석 분리기를 이용하여 세포에 자성을 가하여 자석에 세포를 부착시킨 후 상층액을 제거 한 후에 다시 PBS(PH 7.4)1m 완충용액으로 부유 시킨 후에 세포 수를 c-Chip으로 계산하였다. 반복 실험을 통해 약 90% 이상의 세포가 자성이 유도되어 자석에 반응하는 것을 확인하였다(도 9).
실시예5; 마그네틱 비드 부착 세포의 자성 기반 기기로의 적용과 자동 세포패닝
본 발명에서는 자성 기반 기기를(Kingfisher Flex_ Thermo scientific)를 통해서, 마그네틱 비드가 부착된 세포를 이용해 파지 디스플레이 기술을 융합하여 자동 세포 패닝법을 개발하였다. 따라서, 마그네틱 비드가 부착된 세포가 자성 기반 기기 또는 자석 분리기에 이끌려서 자성을 통해 이동 또는 고정되는지 확인을 하였다.
자성 기반 기기는 8개의 plate 위치를 지정할 수 있다. 8개의 플레이트 위치에 24 deep well plate를 위치시킨 후, 각 위치마다 PBS 1ml을 분주하였다. 그리고 마그네틱 비드가 부착된 세포를 첫번째 plate에 지정한 후 분주하고, 자성 기반 기기의 운영 소프트웨어(BindIt 3.3 for KingFisher)를 통해 기기의 자석 막대로 첫번째 plate에서 두번째 플레이트로 이동시키도록 하였다. 이때 마그네틱 비드가 부착된 세포는 첫번째 plate에서 두번째 plate로 이동하는 것을 확인하였다. 이를 여덟 번째 플레이트까지 반복해서 진행하였다(도 11).
완료 후에 각 플레이트의 PBS(pH 7.4) 완충용액 속에 남아있는 세포 수를 c-Chip측정하였다. 그리고, 최종적으로 여덟 번째 플레이트까지 이동된 세포수와 일반적인 세포 패닝법 후의 남은 세포 수와 비교하였다.
그 결과, 자성기반 기기를 통한 세포 패닝법과 실험자가 직접 시행하는 세포 패닝법과 비슷한 세포수가 남는 것을 확인하였다(도 12).
자동 세포 패닝의 경우에는 동시에 24개에서 최대 96개를 세포 패닝을 시행할 수 있으며, 고속 대량 스크리닝 시스템 구현이 가능하다. 또한 각 패닝 단계별로 Binding, Wash, Elution, Lysis 조건을 유연하게 조절할 수 있으며, 시간 단축도 가능하다.
실시예6; 항원 과발현 환자유래세포 자성 비드 부착 및 이를 통한 자성 기반 기기를 통한 자동 세포 패닝 적용
본 발명에서 개발한 실험법을 통하여 살아있는 세포에 자성 비드를 부착하고 이를 자성 기반 기기를 통해 자동 세포 패닝을 실시하였다. 실시예에서 사용한 항원은 섬유아세포증식인자 수용체 3(Fibroblast growth factor receptor 3, FGF3)으로, 재조합 항원은 R&D system 社의 Recombinant Human FGF R3 (IIIc) Fc Chimera Protein을 사용하였다.
먼저, 통상적이고 보편적으로 알려진 면역튜브에 항원 고정 방식을 통해 바이오 패닝을 4회차 진행하여, 4회차 바이오 패닝을 통해 항원 특이적인 파지들이 증폭된 파지 풀 (Phage pool)을 자성 기반 기기를 통한 자동 세포 패닝을 각각 강력한 세척 조건(Kingfisher Flex 장비 소프트웨어인 BindIt Software 3.3.1에서 Wash step에 서 Wash 강도를 Fast로 설정)과 가벼운 세척 조건(Wash step에서 Wash 강도를 Medium 또는 Slow로 설정)으로 1회차 적용한 후, 세포 패닝 결과물을 계수 및 회수하였다.
그 다음으로는 자성 기반 기기인 Kingfisher Flex(ThermoFisher Scientific, USA)를 이용하여 재조합 단백질 기반 자성 비드 패닝을 통해 자동화 패닝을 4회차 진행하여, 4회차 바이오 패닝을 통해 항원 특이적인 파지들이 증폭된 파지 풀 (Phage pool)을 자성 기반 기기를 통한 자동 세포 패닝을 가벼운 세척 조건(Wash step에서 Wash 강도를 Medium 또는 Slow로 설정)으로 1회차 적용한 후 세포 패닝 결과물을 계수 및 회수하였다.
통상 조건에서 회수한 풀과 자동화 패닝에서 회수한 풀에서 실제 세포 표면에 발현된 특정 항원 구조에 더욱 특이적 결합능을 지닌 파지를 회수 및 계수하기 위하여 본 발명에서 개발한 패닝 방법을 통해 자성 기반 기기를 통한 자성 부착 세포 패닝을 자동으로 진행하였다.
항원이 과발현된 환자유래세포 PDC#1과 항원이 저발현되어 있는 환자유래세포 PDC#2를 자동 세포 패닝에 이용하였는데, 먼저 PBS로 미리 세척된 항원이 저발현된 PDC#2 (2x10E+6 cells/library) 와 미리 세척된 자성 비드 (Dynabeads)를 항원에 4회차 증폭된 파지 풀과 상온에서 1시간 반응시킨 다음, 시료는 원심분리기를 통해 상층액만 회수하여 항원 비특이적인 파지와 자성 비드 특이적인 파지를 제거하는 과정을 거쳤다.
회수한 상층액은 미리 본 발명에서 개발한 방법을 통해 자성 부착되어 있는 환자유래세포와 함께 자동화 기기 (Kingfisher flex, Thermo scientific, USA)에 도입하였으며, 해당 운영 소프트웨어 프로토콜은 도13 에 개시된 바와 같다.
자동 세포 패닝으로 회수된 파지들은 TG1 숙주세포에 감염시켜 LB/암피실린 배양 배지에 계수하였고, 회수된 파지의 양을 확인하기 위해 회수용액을 희석하여 숙주세포에 감염시킨 후, LB/암피실린 agar 배지에 도말하여 다음날 콜로니 개수를 통해 정량 하였다(도14). 잔여 회수용액은 15cm 배양배지에 도말하여 배양 후, 5ml의 SB 배양배지(50% 글리세롤)를 첨가하여 콜로니들을 회수 및 보관 (-80℃)하였다.
실시예7; 자동 패닝 결과물을 이용한 특정 항원 특이적 결합능을 지닌 ELISA 기반 항체 스크리닝 결과
통상적이고 보편적인 scFv ELISA 스크리닝을 통해 FGFR3 특이적인 항체를 선별하였다. 각각의 조건에서 자동 세포 패닝하여 회수한 파지 풀은 숙주세포(TG1)에 감염된 상태이고, 이를 단일 콜로니로 확보하여 ELISA 검증에 사용하였으며, 각 단일 콜로니를 96웰 플레이트에 SB/암피실린 200ul씩 분주된 웰에 각각 접종한 다음(37℃, 3시간), 단백질 발현 유도를 위해 배양중인 배지에 최종농도 1mM IPTG되도록 처리한 후, 16hr 이상 28℃에서 배양하였다.
다음날 배양 플레이트는 원심분리 및 상층액 제거 후, 각 웰에 남아있는 E. Coli 숙주세포의 주변 세포질 부위에 있는 scFv를 회수하기 위해 TES 용액 (20% w/v 수크로오스, 50 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8.0)을 처리하여 4℃에서 정치시킨 후 원심분리기를 통해 상층액을 회수하여, 미리 특정 항원이 코팅된 96웰 플레이트에 처리하고 상온에서 1시간 반응시켰다. 반응 후엔 세척 과정을 거친 다음, 항-HA HRP를 블로킹 버퍼와 함께 1시간 처리 후, 동일한 세척 과정을 거친 후, TMB 기질을 처리하여 O.D 450nm로 분석하였다.
그 결과, 도 16에 기재된 바와 같이, 재조합 단백질을 이용한 바이오 패닝을 통해 확보한 FGFR3에 특이적 결합력을 지닌 scFv 풀에서 실제 세포 표면에 발현된 FGFR3에 보다 더 특이적이고 구조적으로 안정한 scFv를 자동으로 선별할 수 있으며, 다양한 라이브러리와 다양한 항원 또는 세포에 특이적인 항체를 자성 기반 기기를 통해 자동으로 선별할 수 있음을 확인할 수 있었다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (10)

  1. 다음 단계를 포함하는, 항원 단백질에 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 스크리닝하는 방법:
    (i) 세포막에 바이오티닐화된 인지질이 삽입되고, 상기 바이오티닐화된 인지질과 스트렙타비딘-자성 비드 복합체가 결합되어 있는 항원 단백질 과발현 세포를 준비하는 단계;
    (ii) 상기 세포에 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 라이브러리를 처리하고, 자성기반 시스템으로 항원 단백질에 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 스크리닝하는 단계;
    (iii) 상기 스크리닝된 항체 또는 그의 항원 결합 단편 라이브러리를 항원 단백질이 발현되지 않은 세포와 반응시켜 항원 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편만을 선별하는 단계; 및
    (iv) 상기 선별된 항체 또는 그의 항원 결합 단편 중에서 항원 단백질 이외의 항원에 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 분리제거하는 단계.
  2. 제1항에 있어서, 상기 인지질은 PE(PHospHoethanolamine) 계열의 인지질, PA(PHospHatidic acid) 계열의 인지질, PG(PHospHatidylglycerol) 계열의 인지질, PS(PHospHatidylserine) 계열의 인지질, PI(PHospHatidylinositol) 계열의 인지질, 스핑고 지질(spHingolipid) 계열의 인지질 및 스테롤(sterol) 계열의 인지질로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제2항에 있어서, 상기 인지질은 DHPE(1,2-dihexadecanoyl-sn-glycero-3-pHospHoethanolamine), Fluorescein DHPE (N-(Fluoresceine-5-Thiocarbamoyl)-1-2-dihexadecanoyl-sn-glycero-3-pHospHoethanolamine), B-X DHPE(N-((6-(Biotinoyl)amino)hexanoyl)-1-2--dihexadecanoyl-sn-glycero-3-pHospHoethanolamine) Biotin PE(1-oleoyl-2-(12-biotinyl(aminododecanoyl))-sn-glycero-3-phosphoethanolamine), Biotin PS(1-oleoyl-2-(12-biotinyl(aminododecanoyl))-sn-glycero-3-phospho-L-serine (ammonium salt)) 및 Biotin PC(1-oleoyl-2-[12-biotinyl(aminododecanoyl)]-sn-glycero-3-phosphocholine) 로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 세포막에 바이오티닐화된 인지질이 삽입되고, 상기 바이오티닐화된 인지질과 스트렙타비딘-자성 비드 복합체가 결합되어 있는 항원 단백질 과발현 세포는,
    (a) 바이오티닐화된 인지질 존재 하에 항원 단백질 과발현 세포를 배양하여 세포막에 바이오티닐화된 인지질이 삽입된 세포를 수득하는 단계; 및
    (b) 상기 수득된 세포의 바이오티닐화된 인지질에 스트렙타비딘-자성 비드 복합체를 처리하여 세포막에 바이오티닐화된 인지질이 삽입되고, 상기 바이오티닐화된 인지질과 스트렙타비딘-자성 비드 복합체가 결합되어 있는 항원 단백질 과발현 세포를 수득하는 단계를 통해 제조된 것임을 특징으로 하는 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 세포막에 바이오티닐화된 인지질이 삽입되고, 상기 바이오티닐화된 인지질과 스트렙타비딘-자성 비드 복합체가 결합되어 있는 항원 단백질 과발현 세포는,
    (a) 바이오티닐화된 인지질과 스트렙타비딘-자성 비드를 반응시켜, 인지질-바이오틴-스트렙타비딘-자성 비드 복합체를 준비하는 단계; 및
    (b) 상기 인지질-바이오틴-스트렙타비딘-자성비드 복합체를 항원 단백질이 과발현된 세포에 융합시켜, 세포막에 바이오티닐화된 인지질이 삽입되고, 상기 바이오티닐화된 인지질과 스트렙타비딘-자성 비드 복합체가 결합되어 있는 항원 단백질 과발현 세포를 수득하는 단계를 통해 제조된 것임을 특징으로 하는 방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 세포는 계면활성제를 포함하는 배지에서 스트렙타비딘-자성 비드 복합체를 융합시키는 것을 특징으로 하는 방법
  7. 제6항에 있어서, 상기 계면활성제는 알킬 폴리글리코사이드(alkyl polyglycoside), 세틸 알코올(cetyl alcohol), 데실 글루코사이드(Decyl glucoside), 데실 폴리글루코사이드(Decyl polyglucoside), 말토사이드(Maltosides), NP-40, 올레일 알코올(Oleyl alcohol), 폴록사머(Poloxamer), 폴리소르베이트(Polysorbate), 소비탄(Sorbitan), 트리톤 X-100(Triton X-100) 및 트윈 80(Tween 80)로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제1항에 있어서, 상기 자성기반 시스템은 자성을 이용하여 세포를 분리하는 장치인 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제1항에 있어서, 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 세포 내로 내재화되는 항체 또는 그의 항원 결합 단편인 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제1항에 있어서, 상기 방법에 의해 선별된 항체 또는 그의 항원 결합 단편으로부터 IgG를 제작하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
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