KR102014467B1

KR102014467B1 - 아토피성 피부염, 탈모, 상처 또는 피부 주름의 개선용 화장료 조성물 및 약학 조성물

Info

Publication number: KR102014467B1
Application number: KR1020170172483A
Authority: KR
Inventors: 오창택; 임민주; 김점용; 박선규; 이종훈; 장민정; 김수애; 임수환; 김범준; 박동호; 권태린; 나정태
Original assignee: (주)녹십자웰빙
Priority date: 2017-12-14
Filing date: 2017-12-14
Publication date: 2019-08-26
Also published as: KR20190071432A; EP3725296A4; WO2019117633A1; JP2021506969A; US20200384082A1; EP3725296A1; CN111712227A

Abstract

본 발명은 자연살해세포의 분비물을 포함함으로써, 아토피성 피부염, 탈모, 상처 또는 피부 주름의 개선과 관련된 다양한 인자들의 증가, 발현 수준의 향상 효과가 우수하여, 상기 증상들의 개선 효과가 우수한 화장료 조성물 및 약학 조성물에 관한 것이다.

Description

아토피성 피부염, 탈모, 상처 또는 피부 주름의 개선용 화장료 조성물 및 약학 조성물{COSMETIC COMPOSITION AND PHARMACEUTICAL COMPOSITION FOR IMPROVING ATOPIC DERMATIS, ALOPETIC, WOUND, OR SKIN WRINKLE}

본 발명은 아토피성 피부염, 탈모, 상처 또는 피부 주름의 개선용 화장료 조성물 및 약학 조성물에 관한 것이다.

면역체계를 구성하는 세포들 중, 특히 자연살해세포(natural killer cell; NK 세포)는 항원에 의한 사전 감작 없이도 종양세포, 박테리아, 세포 내 기생생물 또는 바이러스에 감염된 숙주세포를 제거하는 기능을 수행하며, 부적절한 골수 이식을 거부하고, T세포의 면역반응을 조절하는 등 생체 내 면역계 방어 기작의 제 1선에서 작용하는 행동세포이다.

이러한 NK 세포의 다양한 기능 중 특히, 암세포를 선택적으로 살상하는 능력이 밝혀지면서 많은 관련 연구들이 진행되었는데, 암 환자의 경우, 말초 혈액의 NK 세포 수나 활성이 정상인보다 감소하였으며, 동물실험에서 NK 세포활성이 저하되면 암 발생 및 암전이 위험이 증가하는 것으로 알려졌다.

또한, NK 세포는 숙주에 감염된 병원균 또는 암세포에 대항하기 위한 선천성 면역 반응과 사이토카인 분비를 통한 후천성 면역 반응에 중요한 역할을 하는데, NK 세포가 표적 세포를 살상하는데 사용하는 주된 메커니즘은 퍼포린(perforin) 및 그랜자임(granzyme) B와 같은 세포 용해성 과립을 면역 시냅스를 통하여 표적 세포에 분비하는 것으로, 분비된 퍼포린은 표적 세포벽에 구멍을 만들고, 구멍을 통하여 표적 세포 내로 들어간 그랜자임이 표적 세포의 세포사멸(apoptosis)을 유도한다.

이와 같이, NK 세포는 세포가 악성으로 변형되는 발암과정이나, 바이러스 감염 초기의 방어기전에서 결정적인 역할을 하는 것으로 확인되었으나, 상기 NK 세포 자체가 아닌 이의 분비물질 등에 대한 연구, 이의 새로운 용도 등에 대한 연구는 미진한 실정이다.

KR 1344201; KR1719274

본 발명은 아토피성 피부염, 탈모, 상처 또는 피부 주름의 개선용 화장료 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명은 아토피성 피부염, 탈모, 상처 또는 피부 주름의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

1. 자연살해세포의 분비물을 포함하는 아토피성 피부염, 탈모, 상처 또는 피부 주름의 개선용 화장료 조성물.

2. 위 1에 있어서, 상기 자연살해세포의 분비물은 IL-2, TIMP2, VEGF, PDGF-AA 및 IL-10로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나를 포함하는 조성물.

3. 위 1에 있어서, 상기 자연살해세포 분비물은 자연살해세포를 배양하고, 이를 분리 정제하고 잔재하는 배양액으로부터 얻어진 것인 조성물.

4. 위 3에 있어서, 상기 배양은 원료 세포를 지지세포, 지지세포 자극인자 및 성장인자를 포함하는 배지 중에서 배양한 것인 조성물.

5. 위 4에 있어서, 상기 원료 세포는 자연살해세포로 분화될 수 있는 인체 유래 세포인 조성물.

6. 위 5에 있어서, 상기 인체 유래 세포는 말초혈액, 말초혈 백혈구 세포, PBMC(말초혈 단핵구 세포), 농축된(enriched) 자연살해세포, 분리된 자연살해세포, 제대혈, 조혈모 줄기세포 및 만능유도 줄기세포로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나인 조성물.

7. 위 4에 있어서, 상기 성장인자는 인터루킨인 조성물.

8. 자연살해세포의 분비물을 포함하는 아토피성 피부염, 탈모, 상처 또는 피부 주름의 개선용 약학 조성물.

9. 위 8에 있어서, 상기 자연살해세포의 분비물은 IL-2, TIMP2, VEGF, PDGF-AA 및 IL-10로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나를 포함하는 조성물.

10. 위 8에 있어서, 상기 자연살해세포 분비물은 자연살해세포를 배양하고, 이를 분리 정제하고 잔재하는 배양액으로부터 얻어진 것인 조성물.

11. 위 10에 있어서, 상기 배양은 원료 세포를 지지세포, 지지세포 자극인자 및 성장인자를 포함하는 배지 중에서 배양한 것인 조성물.

12. 위 11에 있어서, 상기 원료 세포는 자연살해세포로 분화될 수 있는 인체 유래 세포인 조성물.

13. 위 12에 있어서, 상기 인체 유래 세포는 말초혈액, 말초혈 백혈구 세포, PBMC(말초혈 단핵구 세포), 농축된(enriched) 자연살해세포, 분리된 자연살해세포, 제대혈, 조혈모 줄기세포 및 만능유도 줄기세포로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나인 조성물.

14. 위 11에 있어서, 상기 성장인자는 인터루킨인 조성물.

본 발명에 따른 분비물은 아토피성 피부염, 탈모, 상처 또는 피부 주름의 개선과 관련된 다양한 인자들의 증가, 발현 수준의 향상 효과가 우수하다. 이에, 이를 포함하는 본 발명의 화장료 조성물은 상기 증상들의 개선 효과가 우수하고, 약학 조성물은 상기 질병의 예방 또는 치료 효과가 우수하다.

도 1은 NK-CM과 NK 배지의 섬유아세포 증식능 차이 평가 결과이다.
도 2는 NK-CM의 HDF-N 세포의 세포 이동능, 세포 증식능 평가 결과이다.
도 3은 NK-CM의 콜라겐 생성능 평가 결과이다.
도 4는 NK-CM 처리에 의한 각질형성 세포의 세포 생존율 확인 결과이다.
도 5는 NK-CM 처리에 의한 외근초 세포 (ORS)의 세포 생존율 확인 결과이다.
도 6은 HaCaT 세포내 침염증성 사이토카인의 발현과 NK-CM의 관계를 나타낸 것이다.
도 7은 HMC-1 세포내 침염증성 사이토카인의 발현과 NK-CM의 관계를 나타낸 것이다.
도 8은 NK conditioned-medium (NK-CM)의 성분 분석 결과이다

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명의 아토피성 피부염, 탈모, 상처 또는 피부 주름 개선용 화장료 조성물은 자연살해세포의 분비물을 포함한다.

자연살해세포(Natural killer cell, NK cell)는 면역반응의 일익을 담당하는 림프구계 세포로, 정상인 혈액 내에 약 10~15% 가량 존재하며, 비자기(nonself)와 반응할 때 높은 살해능을 가진다. 각종 virus에 감염된 세포나 세균 침투, 혹은 비정상 세포의 생성에 있어, NK cell은 비특이적으로 즉각적으로 반응하여 이물질을 제거한다. 이에, 자연살해세포는 면역항암제로서의 적용을 위해 연구되고 있다.

그런데, 본 발명자들은 상기 자연살해세포 자체가 아닌, 자연살해세포가 분비한 분비물이 위의 용도와는 다른, 아토피성 피부염, 탈모, 상처 및 피부 주름 개선에 효과를 가지는 것을 발견하였고, 이에 본 발명을 고안하였다.

본 발명에 따른 자연살해세포의 분비물은 IL-2(interleukin-2), TIMP2(metallopeptidase inhibitor 2), VEGF(vascular endothelial growth factor), PDGF-AA(platelet-derived growth factor-AA) 및 IL-10(interleukin-10)로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나를 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 자연살해세포의 분비물에 포함되는 상기 성분 중, IL-2, TIMP2는 주름 개선과 관련이 있는 인자, VEGF, PDGF-AA는 탈모 개선과 관련이 있는 인자, IL-2, IL-10은 아토피 개선과 관련이 있는 인자이다.

본 발명에 따른 자연살해세포의 분비물은 예를 들면 자연살해세포를 배양하고, 이를 분리 정제하여, 잔재하는 배양액으로부터 얻어질 수 있고, 잔재하는 배양액 자체를 사용할 수도 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

이하 동물세포 배양배지 및 하기 성분들은 통상 세포의 성장에 도움을 주는 성분, 세포를 안정화시키는 성분들로서, 이는 세포의 성장에 영향을 미치는 것으로서, 이들 성분이 달라진다고 하여 세포 성장 정도가 달라질 수는 있으나, 세포의 분비 성분은 그에 영향을 받지 않는 것이고, 하기 예시는 일 구현예일뿐 그에 제한되는 것은 아니다.

자연살해세포의 배양은 당 분야에 공지된 통상의 동물세포배양 배지를 제한 없이 사용할 수 있으며, 예를 들면 CellGro 배지(Cellgenix), AIM-V 배지, RPMI1640 배지, XVIVO 20, RPMI1640 등을 들 수 있다.

자연살해세포의 배양은 원료 세포를 배양하여 자연살해세포를 얻는 것 또는 자연살해세포를 배양하는 것을 포함할 수 있다.

원료세포(seed cell)는 적절한 배양을 통해 자연살해세포로 증식될 수 있는 세포를 의미하며, 구체적으로는 자연살해세포로 분화될 수 있는 인체 유래 세포일 수 있다. 이는 예를 들면 말초혈액, 말초혈 백혈구 세포, PBMC(말초혈 단핵구 세포), 농축된(enriched) 자연살해세포, 분리된 자연살해세포, 제대혈, 조혈모 줄기세포, 만능유도 줄기세포로 구성된 군에서 선택된 하나 이상이 사용될 수 있지만 이에 제한되는 것은 아니다.

원료세포의 배양은 자연살해세포의 배양 촉진을 위한 성분들이 추가로 포함된 배지에서 수행된 것일 수 있다.

상기 배양 촉진을 위한 성분은 예를 들면 지지세포, 지지세포 자극인자, 성장인자 등일 수 있다.

지지세포는 분열증식하지 못하게 하였으나 대사활성이 있기 때문에 여러 가지 대사물질을 생산하여 목적 자연살해세포 증식을 돕는 세포이다.

사용하는 지지세포(feeder cell)로는 자연살해세포의 증식을 돕는 것이라면 제한 없이 적용가능하며, 예를 들면 유전자가 도입된 동물 세포주(cell line)나 각종 사이토카인이나 화합물이 처리된 말초혈 백혈구 세포(PBL), 자기 또는 타인의 말초혈 백혈구 세포(PBL), T-cell, B-cell, 단핵구(monocyte), CD4(+) T 세포 등을 들 수 있으며, 구체적인 예를 들자면 자기 말초혈 백혈구 세포(PBL) 및 CD4(+) T 세포 중 적어도 하나를 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

지지세포는 불활성화시켜 사용함으로써 안전성을 확보할 수 있다. 불활성화시키는 방법으로는 당업계에 공지된 통상의 방법을 사용하여도 무방하며, 예를 들어 감마선(gamma-ray)을 조사하는 방법을 사용할 수 있다. 이와 같은 불활성화시킨 지지세포(feeder cell)는 분리된 T-세포(purified T cell)를 포함한다.

지지세포 자극인자로는 예를 들면 항-CD3 항체를 사용할 수 있다.

항-CD3 항체란, T 세포 수용체(TCR)과 결합하여 항원인식복합체를 형성하는 분자군인 CD3 항원에 특이적으로 결합하는 항체로, CD3 분자는 TCR과 결합하여 항원인식신호를 세포 내에 전달하는 역할을 담당한다.

본 발명에서 사용가능한 항-CD3 항체는 CD3에 결합하는 특성을 가지는 항체라면 제한 없이 이용가능하며, OKT3, UCHT1 및 HIT3a로 이루어진 군에서 선택되는 것이 바람직하지만 이에 한정되는 것은 아니다. 항-CD3 항체는 예를 들면 0.1~100 ng/ml의 범위로 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

성장인자로는 예를 들면 사이토카인을 들 수 있다.

사이토카인은 성장인자로서, 인터루킨 류에서 선택된 하나 이상인 것이 바람직하나, 이에 제한되는 것은 아니다.

인터루킨은 림프구나 단구 및 대식세포 등 면역담당 세포가 생산하는 단백질성 생물활성물질의 총칭으로, 사용가능한 인터루킨으로는 인터루킨-2(IL-2), 인터루킨-12(IL-12), 인터루킨-15(IL-15), 인터루킨-18(IL-18) 및 인터루킨-21(IL-21)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인 것이 바람직하며, 특히 IL-2를 사용하는 것이 바람직하지만 이에 한정되는 것은 아니며, 본 발명에 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 다른 사이토카인도 본 발명의 목적에 부합하는 한 제한없이 이용 가능함은 자명한 것이다. 사이토카인은 예를 들면 10~2000 U/ml의 범위로 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 여기에 혈청 또는 혈장과 림프구의 증식을 지지하는 추가의 증식인자를 첨가하여 배양한 것일 수도 있다. 배지에 첨가하는 혈청 또는 혈장의 종류는 특별히 한정되지 않아, 시판의 각종 동물 유래의 것을 사용할 수 있지만, 인간 유래로서 본인 유래의 것이 더욱 바람직하다. 예를 들어, PBMC로부터 림프구를 증식시키는 사이토카인의 조합이나, 림프구증식을 자극하는 렉틴류 등을 첨가하는 등 당업자에게 알려져 있는 방법을 사용할 수 있다.

또한, 배지는 혈청 또는 혈장과 림프구의 증식을 지지하는 추가의 증식인자를 더 포함하는 것일 수 있고, 혈청 또는 혈장 자체를 포함하는 것일 수 있다. 배지에 첨가하는 혈청 또는 혈장의 종류는 특별히 한정되지 않아, 시판의 각종 동물 유래의 것을 사용할 수 있지만, 인간 유래로서 본인 유래의 것이 바람직하며, 예를 들면 human AB serum 또는 auto plasma일 수 있다.

본 발명에 따른 분비물을 포함하는 화장료 조성물의 경우, 상기 유효 성분 이외에 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함할 수 있으며, 예컨대 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 그리고 담체를 포함한다.

본 발명의 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클렌징, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션, 팩, 마사지크림 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 유연 화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 마사지 크림, 에센스, 아이 크림, 클렌징 크림, 클렌징 폼, 클렌징 워터, 팩, 스프레이 또는 파우더의 제형으로 제조될 수 있다.

본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.

본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소 결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.

본 발명의 제형이 계면활성제 함유 클렌징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물이 비누, 계면활성제 함유 클렌징 제형 또는 계면활성제 비함유 클렌징 제형일 경우, 피부에 도포한 후 닦아내거나 떼거나 물로 씻어낼 수도 있다. 구체적인 예로서, 상기 비누는 액상비누, 가루비누, 고형비누 및 오일비누이며, 상기 계면활성제 함유 클렌징 제형은 클렌징 폼, 클렌징 워터, 클렌징 수건 및 클렌징 팩이며, 상기 계면활성제 비 함유 클렌징 제형은 클렌징크림, 클렌징 로션, 클렌징 워터 및 클렌징 겔이며, 이에 한정되는 것은 아니다.

또한, 본 발명은 자연살해세포의 분비물을 포함하는 아토피성 피부염, 탈모, 상처 또는 피부 주름의 개선용 약학 조성물을 제공한다.

자연살해세포의 분비물은 전술한 범위 내의 것일 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체, 희석제 또는 부형제를 포함하여 퇴행성 신경질환의 예방 및 치료용 의약 제제로 제제화 할 수 있다.

상기 담체, 부형제 및 희석제로는 예를 들면 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘포스페이트, 칼슘실리케이트, 셀룰로즈, 메틸셀룰로즈, 미정질셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 의약 제제로 제조되기 위해 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 또는 멸균 주사용액의 제형으로 제제화될 수 있는데, 일반적으로, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구 투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 약학 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트, 수크로스, 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는 데, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제 , 좌제 등이 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 약학 조성물의 투여량은 환자의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으나, 일반적으로 0.1 내지 100 mg/㎏의 양, 바람직하게는 1 내지 30 mg/㎏의 양을 일일 1회 내지 수회로 나누어 투여할 수 있다. 또한 그 투여량은 투여경로, 질병의 정도, 성별, 체중, 나이, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 등에 따라서도 증감될 수 있다. 따라서, 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 약학 조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 피부 도포, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관 내 주사에 의해 투여될 수 있다.

이하, 본 발명을 구체적으로 설명하기 위해 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다.

실시예 . 자연살해세포 분비물의 수득

1. 자연살해세포 분비물의 습득

1-1. CD3(-) PBMC 원료세포의 준비

건강한 공여자로부터 채취한 PBMC에 PBS(phosphate buffered saline, LONZA, 17-516Q)를 1:1 비율로 추가하여 1500rpm, 4℃에서 10 분간 원심분리 하였다. PBMC 펠렛을 10x10⁶ cells/mL로 MACS 러닝 버퍼(running buffer, 2% FBS와 2 mM EDTA가 포함된 PBS)에 현탁하고, 자동 세포 계수기를 사용하여 세포수를 측정하였다.

CD3(+) 세포를 제거시킨(depletion) 원료세포를 수득하기 위해 5~10x10⁷ cells을 50 mL 튜브로 옮긴 후 1200 rpm, 4℃에서 10분간 원심분리 하였다. 5~10x10⁷ cells의 PBMC 세포에 400 ~ 800 μL의 MACS running buffer와 100 ~200 μL의 CD3 자기비드(Miltenyi biotech, 130050101)를 넣고 4℃에서 20분간 반응시켰다. 10배 이상의 MACS 러닝 버퍼를 넣어 세척한 뒤 1350 rpm, 4℃에서 7분간 원심분리하고 최종 1~2 mL의 MACS 러닝 버퍼에 현탁하였다. VarioMACS (Miltenyi Biotech)에 CS 컬럼(column, Miltenyi Biotech, 130-041-305)을 장착하여 세포를 분리하고, 컬럼을 3회 세척하여 세포를 회수하였다. 자동 세포 계수기를 사용하여 세포수를 측정하였다. 세포는 동결배지에 현탁하여 1 바이알(vial)당 1~2x10⁷ cells을 동결하여 액체 질소에 보관하였다.

배양 개시 날에 얼려둔 CD3(-) PBMC를 37도에서 수조에서 해동하여 50 mL 튜브로 옮기고, 0.6% ACD(Citrate-dextrose solution, Sigma-Aldrich, C3821), 0.2% FBS(Fetal serum bovine)와 2mM EDTA를 포함하는 PBS (ACD-A PBS buffer)로 10배 현탁하여 1200 rpm, 4℃에서 10 분간 원심분리 하였다. CD3(-) PBMC를 CellGro SCGM 배지(Cellgenix, 20802-0500)에 현탁하고, 세포수를 측정하였다. CD3(-) PBMC 원료세포를 1x10⁶ cells/mL에 맞춰 CellGro SCGM 배지에 현탁하였다.

1-2. 지지세포의 준비

말초혈 PBMC 지지세포는 PBS(phosphate buffered saline, LONZA, 17-516Q)를 1:1 비율로 추가하여 1500rpm, 4℃에서 10 분간 원심분리 하였다. PBMC 펠렛을 10x10⁶ cells/mL로 MACS 러닝 버퍼(running buffer, 2% FBS와 2 mM EDTA가 포함된 PBS)에 현탁하고, 자동 세포 계수기를 사용하여 세포수를 측정하였다. PBMC 지지세포는 동결배지에 현탁하여 1 바이알(vial)당 1 x10⁸ cells을 동결하여 액체 질소에 보관하였다.

배양 개시 날에 얼려둔 PBMC 지지세포를 37도 수조에서 해동하여 50 mL 튜브로 옮기고 10배의 ACD-A PBS buffer로 현탁한 후 1200 rpm, 4℃에서 10 분간 원심분리 하였다. 세포수를 측정한 후 CellGro SCGM 배지로 5x10⁶ cells/mL로 현탁하고 감마선 조사기로 2000cGy로 조사하여 불활성화시킨다.

1-3. 자연살해세포의 배양 및 배양액의 회수

자연살해세포 배양 시 Cellgro SCGM 배지에 500 IU/mL의 IL-2(프로류킨 주, 한국노바티스), 10 ng/mL의 OKT-3(eBioscience, 16-0037-85)와 1~2% 공여자 혈장을 넣고 배양배지를 준비한다. 배양 0일째 CD3(-) PBMC 원료세포와 감마선 조사된 지지세포를 1:5의 비율로 섞어준 후 총 세포수를 기준으로 2x10⁶ cells/mL로 세포 농도를 맞추어서 37℃ 인큐베이터에서 4~5일간 정치 배양하였다.

배양 4~5일째에 동량의 배양배지 (Cellgro SCGM+500 IU IL-2+ 1 부피% 공여자 혈장)를 넣고 다시 2~3일간 정치 배양하였다. 배양 7일째 배양 0일째와 동일한 방식으로 배양중인 세포를 1:5비율의 지지세포주, 500 IU/mL IL-2, 10 ng/mL의 OKT-3, 그리고 1 부피% 공여자 혈장을 넣고 총 세포수 기준 1x10⁶ cells/mL로 세포 농도를 맞추어서 재자극을 수행 후 3일간 정치 배양한다. 이후 2~3일 간격으로 세포수를 측정하고 0.5~1x10⁶ cells/mL이 되도록 배양배지를 추가하며 20~21일까지 배양하였다.

배양 20~21일에 배양중인 세포를 1L 원심분리용 튜브에 옮긴 후 1500 rpm, 4℃에서 10 분간 원심분리 하였다. 원심 분리 후 상층액을 회수하였고 이를 NK conditioned-media로 명명하였다.

그리고, 상기 Cellgro SCGM 배지에 500 IU/mL의 IL-2(프로류킨 주, 한국노바티스), 10 ng/mL의 OKT-3(eBioscience, 16-0037-85)와 1~2% 공여자 혈장을 첨가한 배양배지를 NK 세포배지로 명명하였다.

실험예 1. NK -CM의 세포 증식능 평가

인간 섬유아세포에서 NK 세포 배지와 NK-CM의 증식능 차이를 평가하기 위하여 Cell Counting Kit-8 (CCK-8) 을 사용하여 세포 증식능을 측정하였다.

단일 세포로 현탁 되어있는 인간 섬유아세포 (HDF-N) 세포를 96 well plate에 5x10³ cells/well를 분주하여 37℃에서 배양하였다. 이후 24시간 동안 기아상태를 유지시킨 후 NK 세포 배지와 NK-CM을 처리하여 24, 48시간 동안 추가 배양하였다. 세포의 증식능을 측정하기 위해 Cell Counting Kit-8 반응액을 supplement가 제외된 배지에 1/10 희석하고 이를 각 well당 100㎕씩 처리하여 1 시간 동안 반응시킨 후, ELISA microplate reader (Model 680, BIO-RAD)를 이용하여 450 nm에서의 흡광도에서 측정하였다. 양성대조군으로 10 % FBS가 첨가된 배지를 사용하였으며, 각 군의 세포 증식율은 NK 세포 배지(M)와 비교하여 백분율(%)로 계산하였다. 그 결과를 도 1에 나타내었다.

도 1 에 나타난 바와 같이, 24시간에서 NK-CM의 경우 NK 세포 배지와 비교하였을 시 모든 농도에서 상대적으로 높은 증식능을 보였으며 농도의존적으로 증가하는 것을 확인하였다. 48시간에서 NK-CM의 경우 NK 세포 배지와 비교하였을 시 2.5% 농도에서 차이가 없었지만 5% 농도에서 7%, 10% 농도에서 최대 37% 증식능이 증가하는 것을 확인할 수 있었으며 이는 NK 세포 배지보다 NK-CM이 세포에 더 높은 증식 효과를 가지는 것을 의미한다.

실험예 2. NK -CM의 세포 증식능 평가

인간 섬유아세포에서 NK-CM의 세포 이동능 및 상처 회복능을 평가하기 위하여 Cell scratch assay 방법을 이용하여 측정하였다.

HDF-N 세포를 1.0x10⁴ cells/inserts로 60mm dish의 바닥의 ibidi culture inserts (μ-Dish35mm, high Culture-Inserts; Thistle Scientific Ltd, UK)안에 분주한 다음 세포배양 조건에서 24시간 동안 배양하였다. 이후 chamber를 제거하고 시료를 적당한 농도로 배지에 희석한 후 세포에 처리하여 세포 배양 조건에서 48시간 동안 추가 배양하였다. 24, 48시간 후에 전자현미경 (Eclipse TS100, Nikon Instruments Inc., NY, USA)를 통해 세포의 이동능을 촬영하였다.

도 2 (A)에 나타난 바와 같이, 24, 48시간에서 대조군과 비교했을 시 NK-CM 처리군에서 농도가 증가할수록 세포 이동능 및 상처 회복능이 크게 증가하는 것을 확인할 수 있었다.

NK-CM의 증식능을 평가하기 위해 HDF-N 세포에 2.5, 5, 10 %로 처리한 후 24, 48시간에서 Cell Counting Kit-8 (CCK-8)을 사용하여 측정하였다.

도 2 (B,C)에 나타난 바와 같이 24, 48시간에서 NK-CM 처리군과 대조군을 비교했을 시 세포 증식능이 농도의존적으로 증가하는 것을 확인하였다. 특히 최고농도인 NK-CM 10%의 경우 24시간에서 최대 1.6배, 48시간에서 2배 증가하는 결과를 얻었다. 이는 NK-CM이 HDF-N 세포의 이동능 및 상처 회복능을 증가시키고, 세포의 증식능을 향상시킴으로써 주름 개선 효능이 있음을 의미한다.

실험예 3. NK -CM의 콜라겐 생성능 평가

NK-CM의 procollagen 합성능을 알아보기 위해 독성을 보이지 않는 농도 2.5, 5, 10%로 처리한 후 24시간에서 procollagen 합성능을 평가하였다.

HDF-N 세포를 24 well plate에 2.0x10⁴ cells/well로 분주하고 24시간 동안 배양하였다. 이후 배지를 제거하고 24시간 동안 세포의 기아상태를 유지한 뒤, NK-CM을 media supplement가 없는 배지에 희석하여 세포에 처리하였다. 24시간 후에 배양된 세포의 배지를 수거하여 procollagen type-1 c-peptide(PIP) EIA kit (TAKARA, MK101)를 사용하여 procollagen 양을 측정하였다. 바닥에 부착되어 있는 세포는 1 N NaOH로 용해시켜 총 단백질 양을 측정하였으며 일정 단백질당 procollagen 합성양을 구했다. 각 군은 NK 세포 배지(M)와 비교하여 백분율(%)로 계산하였고, 그 결과를 도 3(A)에 나타내었다.

도 3(A)에 나타난 바와 같이, 양성대조군으로 사용한 TGF-β (10 nM)을 처리하였을 경우 대조군에 비해 procollagen 합성이 1.7배 증가하였다. NK 배양액을 처리하였을 때 대조군과 대비하여 procollagen 합성이 모든 농도에서 약 3.4배 증가하였으며, 통계적으로 유의한 결과를 얻었다.

인간 섬유아세포에서 NK 세포 배양액을 이용하여 Western blot 분석법을 통하여 Collagen 단백질의 발현 변화를 측정하였다.

HDF-N 세포를 100 mm plate에 2.0x10⁶ cells로 분주하고 24시간 동안 배양하였다. 이후, 배지를 제거하고 24시간 동안 세포의 기아상태를 유지한 뒤, 시험 물질을 media supplement가 없는 배지에 희석하여 세포에 처리하였다. 24시간 배양 후 배지를 제거하고 DPBS로 세척한 뒤 lysis buffer를 사용하여 세포를 용해시키고, 12,000 rpm로 4 ℃에서 20분간 원심분리하여 얻은 상등액으로 단백질을 정량하였다. 정량한 단백질을 SDS-PAGE 에 전기영동 시킨 후 PVDF membrane 으로 gel의 단백질을 blotting하였다. 5% BSA 로 blocking 후 1차 항체와 4 ℃에서 24 시간 반응 시키고 2 차 항체를 1 시간 동안 반응시켰다. 이후, TBS-T 완충용액으로 10 분 동안 3 회 세척하고 ECL detection solution을 사용하여 단백질의 발현 정도를 확인하였다. 그 결과를 도 3(B)에 나타내었다.

도 3(B)에 나타난 바와 같이, 대조군에 비해 NK-CM 처리군에서 Collagen I, III의 발현이 효과적으로 증가하는 것을 확인하였다. 이는 NK-CM이 인간 섬유아세포의 Collagen 합성 및 발현을 유도하여 주름개선 효능이 있음을 의미한다.

실험예 4. NK -CM 처리에 의한 각질형성 세포의 세포 생존율 확인

세포 생존율 측정 방법 중 하나인 Cell Counting Kit-8(CCK-8) 을 사용하여 일반 상황에서 각질 형성 세포에 대한 NK-CM의 효과를 확인하였다.

단일 세포로 현탁 되어있는 HaCaT 세포를 96-웰 플레이트에 웰 당 1x10⁴개의 세포를 시딩(seeding)한 후, 37℃에서 24시간 동안 CO² 배양기 안에서 배양하였다. 배양 후, 각각 다음과 같이 처리하였다: 세포 배양액 100 uL를 기준으로 100 % NK-CM 첨가량을 최고 농도로 설정하여 1/2 희석으로 최종 128배 희석한 농도까지 HaCaT 세포에 24시간 동안 처리하였다. 그 다음, CCK-8 용액을 각각의 농도로 NK-CM 처리된 HaCaT 배지와 1:10 비율로 희석한 뒤 37℃에서 1시간 동안 CO² 배양기 안에서 배양하였다.

이후, 분광 광도계(spectrophotometer)를 이용하여 450 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다. 이때, reference는 450 nm로 하였다. 각 군의 세포 생존율은 대조군(Con)과 비교하여 백분율(%)로 계산하였다. 그 결과를 도 4에 나타내었다.

NK-CM에 의한 HaCaT 세포의 사멸을 측정한 결과, 농도가 증가할수록 세포 생존율이 증가하는 것을 확인하였고, 이는 NK-CM가 세포에 100%까지 세포에 대한 독성이 없고, 세포 성장 효과를 가지는 것을 의미한다.

실험예 5. NK -CM 처리에 의한 외근초 세포 (ORS)의 세포 생존율 확인

세포 생존율 측정 방법 중 하나인 Cell Counting Kit-8(CCK-8) 을 사용하여 일반 상황 에서 각질 형성 세포에 대한 NK-CM의 효과를 확인하였다.

단일 세포로 현탁 되어있는 ORS 세포를 96-웰 플레이트에 웰 당 1x10⁴개의 세포를 시딩(seeding)한 후, 37℃에서 24시간 동안 CO² 배양기 안에서 배양하였다. 배양 후, 각각 다음과 같이 처리하였다: 세포 배양액 100 uL를 기준으로 100 % NK-CM 첨가량을 최고 농도로 설정하여 1/2 희석으로 최종 4배 희석한 농도까지 ORS 세포에 24시간 동안 처리하였다. 그 다음, CCK-8 용액을 각각의 농도로 NK-CM 처리된 ORS 배지와 1:10 비율로 희석한 뒤 37℃에서 1시간 동안 CO² 배양기 안에서 배양하였다.

이후, 분광 광도계(spectrophotometer)를 이용하여 450 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다. 이때, reference는 450 nm로 하였다. 각 군의 세포 생존율은 대조군(Con)과 비교하여 백분율(%)로 계산하였다. 그 결과를 도 5에 나타내었다.

NK-CM에 의한 ORS 세포의 사멸을 측정한 결과, 농도가 증가할수록 세포 생존율이 증가하는 것을 확인하였고, 이는 NK-CM가 세포에 100%까지 세포에 대한 독성이 없고, 결론적으로 모낭조직의 주요 구성세포 중 하나인 외근초 세포의 성장에 도움을 주는 것을 의미한다

실험예 6. HaCaT 세포내 침염증성 사이토카인의 발현과 NK -CM 처리와의 관계

RT-PCR(Real time-Polymerase Chain Reaction)을 사용하여 세포 내 친염증성 사이토카인 분비에 관여하는 전령 RNA (messenger RNA, mRNA)의 발현량을 측정함으로써 염증 유발 상황에서 NK-CM의 역할을 확인하였다.

HaCaT 세포를 12-웰 플레이트에 웰당 1x10⁵ 세포를 시딩한 후, NK-CM 50% 또는 100% 를 2 시간 동안 처리하였고 친 염증성 사이토카인의 발현을 증가시켜 염증 상황을 유도하기 위해 재조합 단백질 TNF-alpha (50 ng/mL)을 24시간 동안 처리하였다. 이후, 시약이 포함된 모든 배지를 워시 아웃 한 후, 1mL TRIzol® RNA 분리 시약 (Invitrogen, USA)와 혼합하였다. 상기 혼합 용액을 얼음 위에서 30분간 인큐베이션한 후, 400 μL chloroform1를 각각 첨가하여 5분동안 반응시켰다. 16,000 rpm으로 20분동안 원심 분리하였다. 상층 투명액을 분리하여 담은 후, isopropyl alcohol을 상층액과 동량 첨가하여 5분 동안 반응시킨 후, 16,000 rpm으로 10분 원심 분리하였다. 침전 분리된 palette을 70% 알코올을 첨가하여 3회 세척하였다. 마지막으로 4시간 건조 이후 Purified water 50 uL에 희석하여 mRNA 샘플을 획득하였다.

획득된 샘플은 PrimeScriptTM RT master mix (Takara, Japan)를 이용하여 합성된 이중가닥 DNA (cDNA)로 구성되었다. mRNA 샘플 20 uL에 5X PrimeScriptTM RT master mix 5 uL를 첨가하였고 37 ℃ 에서 20분, 85 ℃에서 10초 동안 가열하여, 합성된 DNA 이중나선 구조를 획득하였다.

특정 유전자의 증폭은 CFX-96 (Bio-Rad, USA)를 사용하였다. 모든 유전자를 증폭하는데 사용 된 PCR 조건은 95 ℃에서 10 분, 95 ℃ 에서 30 초, 60 ℃에서 15초를 40 주기로 실시 하였다. 발현 데이터는 정량화 방법인 ΔCt를 사용하여 사이클 임계치 (Ct) 값으로부터 계산되었다. GAPDH를 이용하여 각각 표준화를 실시하였다. 대조군 대비 상대 값으로 표기하였다. 그 결과를 도 6에 나타내었다.

도 6에 나타난 바와 같이, TNF-alpha가 처리된 집단에서 친 염증성 사이토카인의 종류인 TSLP, IL-6, TNF-alpha, IL-8, IL-17a 와 IL-31의 mRNA 수준이 크게 높아진 것을 확인 할 수 있었다. 이는, TNF-alpha의 세포처리는 일반상태의 집단에 비하여 염증성 사이토카인의 발현을 증가시킨다는 것을 의미한다. 하지만, NK-CM이 50% 또는 100% 처리된 집단에서 친 염증성 사이토카인의 발현량을 크게 감소시키는 결과를 얻었다. 이것은 TNF-alpha로 인한 친 염증성 사이토카인의 발현 상승을 NK-CM이 억제하고, 결론적으로 NK-CM이 HaCaT 세포에서 항 염증효과가 있음을 의미한다.

실험예 7. HMC-1 세포내 침염증성 사이토카인의 발현과 NK -CM 처리와의 관계

RT-PCR(Real time-Polymerase Chain Reaction)을 사용하여 세포 내 친염증성 사이토카인 분비에 관여하는 전령 RNA (messenger RNA, mRNA)의 발현량을 측정함으로써 염증 상황에서 NK-CM의 역할을 확인하였다.

사람 유래 비만세포인, HMC-1 세포를 6-웰 플레이트에 웰당 2x10⁶ 세포를 시딩 한 후, NK-CM 50% 또는 100% 를 2 시간 동안 처리하였고, 세포 탈과립을 유도하여 염증 상황을 유도하기 위하여 PMAC [PMA (25nM) + A23187 (1uM)]을 처리하고 12시간 동안 배양하였다.

시약이 포함된 모든 배지를 워시 아웃 한 후, 1mL TRIzol® RNA 분리 시약 (Invitrogen, USA)와 혼합하였다. 상기 혼합 용액을 얼음 위에서 30분간 인큐베이션 한 후, 400 μL chloroform1를 각각 첨가하여 5분 동안 반응시켰다. 16,000 rpm으로 20분동안 원심 분리하였다. 상층 투명 액을 분리하여 담은 후, isopropyl alcohol을 상층액과 동량 첨가하여 5분 동안 반응시킨 후, 16,000 rpm으로 10분 원심 분리하였다. 침전 분리된 palette을 70% 알코올을 첨가하여 3회 세척하였다. 마지막으로 4시간 건조 이후 Purified water 50 uL에 희석하여 mRNA 샘플을 획득하였다.

획득된 샘플은 PrimeScriptTM RT master mix (Takara, Japan)를 이용하여 합성된 이중가닥 DNA (cDNA)로 구성되었다. mRNA 샘플 20 uL에 5X PrimeScriptTM RT master mix 5 uL를 첨가하였고 37 ℃ 에서 20분 85 ℃에서 10초 동안 가열하여, 합성된 DNA 이중나선 구조를 획득하였다.

특정 유전자의 증폭은 CFX-96 (Bio-Rad, USA)를 사용하였다. 모든 유전자를 증폭하는데 사용 된 PCR 조건은 95 ℃에서 10 분, 95 ℃ 에서 30 초, 60 ℃에서 15초를 40 주기로 실시 하였다. 발현 데이터는 정량화 방법인 ΔCt를 사용하여 사이클 임계치 (Ct) 값으로부터 계산되었다. GAPDH를 이용하여 각각 표준화를 실시하였다. 대조군 대비 상대 값으로 표기하였다. 그 결과를 도 7에 나타내었다.

도 7에 나타난 바와 같이, PMAC가 처리된 집단에서 친 염증성 사이토카인의 종류인 TNF-alpha, IL-8, GM-CSF 와 MCP3의 mRNA 수준이 크게 높아진 것을 확인 할 수 있었다. 이는, PMAC의 세포처리는 일반상태의 집단에 비하여 탈과립이 유도되어 염증성 사이토카인의 발현을 증가시킨다는 것을 의미한다. 하지만, NK-CM이 50% 또는 100% 처리된 집단에서 TNF-alpha, IL-8, GM-CSF 3 종의 친 염증성 사이토카인의 발현량을 크게 감소시키는 결과를 얻었다. 추가적으로, MCP3의 발현량은 50% 처리에서는 감소시키지 못하였지만, 고농도인 100%에서 크게 감소하는 것을 확인하였다. 이것은 PMAC 처리로 인한 친 염증성 사이토카인의 발현을 NK-CM 처리에 의하여 억제되고, 이는 결론적으로, NK-CM이 HMC-1의 탈 과립으로 인한 염증반응을 억제함으로써 항 염증효과가 있음을 의미한다.

실험예 8. NK -CM의 성분 분석

NK conditioned-media (NK-CM)의 성분을 분석하기 위해 Human Growth Factor Antibody Array C1, human cytokine array C5, human chemokine array C1 kit (Raybiotech, USA)를 이용하여 분석을 진행하였다.

NK 세포 배지와 NK-CM을 수거하여 Raybiotech에서 제공하는 각 제품의 프로토콜 설명 방법에 따라 분석을 진행하였으며 microarray 결과를 토대로 도 1에 그래프로 나타내었다.

도 8에 나타난 바와 같이, NK 배양액 대비 NK-CM에서 아토피성 피부염과 관련된 인자인 IL-2, IL-10가 증가한 것을 확인하였다. 또한 모발 성장과 관련된 인자인 PDGF-AA, VEGF가 증가를 하였으며, 상처 회복과 관련된 인자인 TIMP-2의 발현 수준이 향상됨을 확인하였다. 이는 NK 세포가 성장 및 증식을 통해 배지로 배출해내는 여러 가지 인자들을 포함하는 NK-CM에서 아토피성 피부염, 모발 성장 및 피부 주름에 관련된 항목들이 증가하였으므로 NK-CM이 항-아토피, 탈모 및 주름 개선에 도움을 줄 수 있음을 의미한다.

Claims

자연살해세포의 분비물을 포함하고, 자연살해세포를 포함하지 않는 탈모 또는 피부 주름의 개선용 화장료 조성물.
청구항 1에 있어서, 상기 자연살해세포의 분비물은 IL-2, TIMP2, VEGF, PDGF-AA 및 IL-10로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나를 포함하는 조성물.
청구항 1에 있어서, 상기 자연살해세포 분비물은 자연살해세포를 배양하고, 이를 분리 정제하고 잔재하는 배양액으로부터 얻어진 것인 조성물.
청구항 3에 있어서, 상기 배양은 원료 세포를 지지세포, 지지세포 자극인자 및 성장인자를 포함하는 배지 중에서 배양한 것인 조성물.
청구항 4에 있어서, 상기 원료 세포는 자연살해세포로 분화될 수 있는 인체 유래 세포인 조성물.
청구항 5에 있어서, 상기 인체 유래 세포는 말초혈액, 말초혈 백혈구 세포, PBMC(말초혈 단핵구 세포), 농축된(enriched) 자연살해세포, 분리된 자연살해세포, 제대혈, 조혈모 줄기세포 및 만능유도 줄기세포로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나인 조성물.
청구항 4에 있어서, 상기 성장인자는 인터루킨인 조성물.
자연살해세포의 분비물을 포함하고, 자연살해세포를 포함하지 않는 탈모 또는 피부 주름의 개선용 약학 조성물.
청구항 8에 있어서, 상기 자연살해세포의 분비물은 IL-2, TIMP2, VEGF, PDGF-AA 및 IL-10로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나를 포함하는 조성물.
청구항 8에 있어서, 상기 자연살해세포 분비물은 자연살해세포를 배양하고, 이를 분리 정제하고 잔재하는 배양액으로부터 얻어진 것인 조성물.
청구항 10에 있어서, 상기 배양은 원료 세포를 지지세포, 지지세포 자극인자 및 성장인자를 포함하는 배지 중에서 배양한 것인 조성물.
청구항 11에 있어서, 상기 원료 세포는 자연살해세포로 분화될 수 있는 인체 유래 세포인 조성물.
청구항 12에 있어서, 상기 인체 유래 세포는 말초혈액, 말초혈 백혈구 세포, PBMC(말초혈 단핵구 세포), 농축된(enriched) 자연살해세포, 분리된 자연살해세포, 제대혈, 조혈모 줄기세포 및 만능유도 줄기세포로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나인 조성물.
청구항 11에 있어서, 상기 성장인자는 인터루킨인 조성물.