KR101983026B1

KR101983026B1 - 소나무재선충에 대해 살선충 활성을 가지며, 스펙티나빌린을 분비하는 스트렙토마이세스 스펙타빌리스 an091965 균주 및 이의 용도

Info

Publication number: KR101983026B1
Application number: KR1020170101156A
Authority: KR
Inventors: 김창진; 서상태; 황병순; 박동진; 고상현; 유민교; 이승규
Original assignee: 한국생명공학연구원; 대한민국(산림청 국립산림과학원장)
Priority date: 2017-08-09
Filing date: 2017-08-09
Publication date: 2019-05-29
Also published as: KR20190016779A

Abstract

본 발명은 소나무재선충에 대해 살선충 활성을 가지며, 스펙티나빌린을 분비하는 스트렙토마이세스 스펙타빌리스(Streptomyces spectabilis) AN091965 균주 및 이의 용도에 관한 것으로, 본 발명의 스트렙토마이세스 스펙타빌리스(Streptomyces spectabilis) AN091965 균주 및 이로부터 분리한 스펙티나빌린은 소나무재선충병 방제에 효과적인 환경친화형 생물농약을 제공할 수 있어, 관련 산업에 매우 유용하다.

Description

소나무재선충에 대해 살선충 활성을 가지며, 스펙티나빌린을 분비하는 스트렙토마이세스 스펙타빌리스 AN091965 균주 및 이의 용도{Streptomyces spectabilis AN091965 strain having nematocidal activity against Bursaphelenchus xylophilus and secreting spectinabilin and uses thereof}

본 발명은 소나무재선충에 대해 살선충 활성을 가지며, 스펙티나빌린(spectinabilin)을 분비하는 스트렙토마이세스 스펙타빌리스(Streptomyces spectabilis) AN091965 균주 및 이의 용도에 관한 것이다.

소나무 재선충(Bursaphelenchus xylophilus)은 선충(nematode)에 속하며, 소나무, 해송, 잣나무, 전나무에서 기생하면서, 기주 식물의 고사를 일으킨다. 소나무 재선충은 매개체인 솔수염하늘소의 체내로 들어가, 솔수염하늘소를 따라 나무들 간에 전파된다. 재선충은 수체 내에 곰팡이를 먹으면서 증식하며, 식물의 가도관 (tracheid)을 막아 수분이동을 차단함으로써 고사를 야기한다. 소나무의 재선충에 의한 고사는 전 세계적이며, 특히 서유럽과 한국을 포함한 동북아시아에서 급격히 확산되어 막대한 삼림 피해를 유발하고 있다. 소나무 재선충병 방제는 솔수염 하늘소를 대상으로 한 방제, 감염목을 벌채한 후 약물처리 하는 방법, 그리고 살선충제를 소나무에 주입하는 방법이 있다. 살선충제인 에버멕틴 (avermectin) 계열의 약물 (emamectin, abamectin, ivermectin 등)은 무척추동물에만 존재하는 특이한 형태의 glutamate-gated chloride channel을 표적으로 하며, 염소 이온에 대한 세포질막의 투과도를 높임으로써 살충 효과를 나타낸다.

근래에 환경 친화적으로 식물기생선충을 방제하는 방법 중 미생물을 이용하는 방법이 있다. 미생물은 생장하면서 다양한 2차 대사산물을 생산하거나 식물병원균에 직접 작용하여 다양한 항균 및 살충 활성을 갖는다는 연구가 수행되었다. 따라서 다양한 미생물 배양액에 대해 살선충 활성 스크리닝을 통해 활성을 갖는 균주를 선발하고 이를 이용하여 식물기생선충병을 방제하는 균주를 개발하는 연구가 계속 진행 중이다.

한편, 한국등록특허 제1101783호에서는 '항균활성과 살충력이 우수한 신규한 스트렙토마이세스속 균주 및 이의 배양방법과 배양물을 이용한 제제'가 개시되어 있고, 한국공개특허 제2005-0072341호에서는 '식물병원 진균에 항균활성을 가지는 스트렙토마이세스 로제오플라브스 엘에스에이-24 균주 및 이 균주로부터 생산되는 항생물질'이 개시되어 있으나, 본 발명에서와 같이 소나무재선충에 대해 살선충 활성을 가지며, 스펙티나빌린을 분비하는 스트렙토마이세스 스펙타빌리스 AN091965 균주 및 이의 용도에 대해서는 밝혀진 바가 전혀 없다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명에서는 토양으로부터 소나무재선충(Bursaphelenchus xylophilus)에 대해 살선충 활성을 가지는 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.) AN091965 균주를 새롭게 분리하였고, 상기 균주로부터 분리한 화합물인 스펙티나빌린(spectinabilin)이 소나무 재선충 방제효과를 보이는 점을 처음으로 확인하였다. 또한, 최종적으로 상기 균주는 스트렙토마이세스 스펙타빌리스(Streptomyces spectabilis)로 동정되었다.

특히, 본 발명의 스펙티나빌린(Spectinabilin)은 다른 선충 (Caenorhabditis elegans, Panagrellus redivivus 및 Heterodera glycines)에 살충 활성이 있다고 보고되었지만 소나무 재선충(Bursaphelenchus xylophilus)에 대한 살선충 활성은 보고된 것이 없었으며, 본 발명의 실험 결과, 토마토 뿌리혹선충(Melodogyne incognita)에 대한 살선충활성이 나타나지 않았고 소나무재선충에만 특이적으로 살선충 활성을 나타내는 점을 확인하였다. 또한, 본 발명의 스펙티나빌린의 살재선충 활성결과 LC₅₀ 값이 1.5 ㎍/mL로, 소나무재선충 방제제로 알려진 아바멕틴 4.1 ㎍/mL보다 약 2.7배 높은 활성을 나타내는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 소나무재선충(Bursaphelenchus xylophilus)에 대해 살선충 활성을 가지며, 스펙티나빌린(spectinabilin)을 분비하는 스트렙토마이세스 스펙타빌리스(Streptomyces spectabilis) AN091965 균주를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 균주, 배양체 또는 이의 배양액을 유효성분으로 함유하는 소나무재선충(Bursaphelenchus xylophilus)에 대한 살선충용 미생물 제제를 제공한다.

또한, 본 발명은 스펙티나빌린(spectinabilin)을 유효성분으로 함유하는 소나무재선충(Bursaphelenchus xylophilus)에 대한 살선충용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 소나무재선충(Bursaphelenchus xylophilus)에 대한 살선충용 미생물 제제 또는 상기 소나무재선충에 대한 살선충용 조성물을 작물, 작물의 종자 또는 재배지에 처리하는 단계를 포함하는 소나무재선충병을 방제하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 균주를 배양하는 단계를 포함하는 소나무재선충(Bursaphelenchus xylophilus)에 대한 살선충용 미생물 제제의 제조 방법을 제공한다.

본 발명의 스트렙토마이세스 스펙타빌리스(Streptomyces spectabilis) AN091965 균주 및 이로부터 분리한 스펙티나빌린은 소나무재선충병 방제에 효과적인 환경친화형 생물농약을 제공할 수 있어, 관련 산업에 매우 유용하다.

도 1은 본 발명에서 분리한 균주들을 대상으로 96 웰 플레이트 상에서의 살 재선충활성 효과를 확인하는 단계를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명에서 분리한 살선충 활성 균주인 AN091965 균주의 16S rDNA 염기서열 비교를 통한 계통분류학적 위치를 나타낸 결과이다.
도 3은 본 발명에서 분리한 살선충 활성 균주인 AN091965 균주의 살선충 활성물질의 분리정제 과정을 나타낸다.
도 4는 본 발명에서 분리한 살선충 활성 균주인 AN091965 균주 유래 소나무 살선충 활성 물질의 ESI-Mass spectrum 결과이다.
도 5는 본 발명에서 분리한 살선충 활성 균주인 AN091965 균주 유래 소나무 살선충 활성 물질의 ¹H-NMR (400MHz, DMSO) 결과를 나타낸다.
도 6은 본 발명에서 분리한 살선충 활성 균주인 AN091965 균주 유래 소나무 살선충 활성 물질의 ¹³C-NMR 결과를 나타낸다.
도 7은 본 발명에서 분리한 살선충 활성 균주인 AN091965 균주 유래 AN091965-1(spectinabilin) 화학 구조를 나타낸다.
도 8은 본 발명에서 분리한 살선충 활성 균주인 AN091965 균주의 항생제 민감성 및 내성을 테스트한 결과이다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 소나무재선충(Bursaphelenchus xylophilus)에 대해 살선충 활성을 가지며, 스펙티나빌린(spectinabilin)을 분비하는 스트렙토마이세스 스펙타빌리스(Streptomyces spectabilis) AN091965 균주를 제공한다.

본 발명에서는 토양으로부터 분리한 약 5000개의 균주를 대상으로 소나무재선충(Bursaphelenchus xylophilus)에 대해 살선충 활성을 가지는지 분석한 결과, AN091965 균주가 살선충 효과가 뛰어난 것을 확인하였고, 상기 균주는 스트렙토마이세스 스펙타빌리스(Streptomyces spectabilis)로 동정되었다. 또한, 상기 균주로부터 살선충 활성 물질을 분석한 결과, 스펙티나빌린(spectinabilin)임을 확인하였다. 따라서, 상기 소나무재선충(Bursaphelenchus xylophilus)에 대해 살선충 활성을 가지며, 스펙티나빌린(spectinabilin)을 분비하는 스트렙토마이세스 스펙타빌리스(Streptomyces spectabilis) AN091965 균주를 한국생명공학연구원에 2016년 9월 21일자로 기탁하였다.(기탁번호: KCTC 13111BP)

또한, 본 발명의 일 구현 예에 따른 균주에서, 상기 균주는 항생제 감수성을 가지며, 바람직하게는 상기 항생제는 날리딕스산(Nalidixic acid), 테트라사이클린(Tetracycline), 아미카신(Amikacin), 카나마이신(Kanamycin), 반코마이신(Vancomycin), 클로람페니콜(Chloramphenicol), 테이코플라닌(Teicoplanin), 스트렙토마이신(Streptomycin), 젠타마이신(Gentamicin) 또는 리팜피신(Rifampicin)인 것일 수 있으며, 가장 바람직하게는 리팜피신일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 미생물 제제는 소나무재선충(Bursaphelenchus xylophilus)에 대해 살선충 활성을 가지는 스트렙토마이세스 스펙타빌리스(Streptomyces spectabilis) AN091965 균주, 포자 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함할 수 있다.

바람직하게는 상기 미생물제제는 액상수화제(SC), 액상현탁제(SM), 흡착식입제(흡착식 GR), 조립식입제(조립식 GR) 또는 분말수화제(WP)일 수 있고, 가장 바람직하게는 분말수화제일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 미생물 제제에서, 상기 스트렙토마이세스 스펙타빌리스(Streptomyces spectabilis) AN091965 균주 또는 이의 배양액을 액상 및 분말화의 형태로서 당 업계에서 사용되는 공지의 방법에 의해 다양하게 변형하여 사용이 가능하나, 바람직하게 스트렙토마이세스 스펙타빌리스(Streptomyces spectabilis) AN091965 균주의 배양액 또는 농축액을 전분, 조단백질 또는 암석분과 같은 담체에 흡착 건조시키는 것이 좋다. 본 발명의 균주의 배양액 또는 농축액과 혼합하여 사용될 수 있는 담체는 당 업계에서 사용되는 어떠한 담체도 될 수 있다. 구체적으로 본 발명에서 담체로서 사용될 수 있는 것들에는 쌀, 밀, 옥수수, 보리, 콩, 조, 수수, 기장, 메밀 등 곡류, 감자 등의 괴경류, 고구마, 카사바 등의 괴근류, 또는 이들의 가공물(예컨대, 분말), 이들로부터 유래된 전분과 그 유도체 등이 포함된다. 그밖에 한천, 젤라틴, 팩테이트(폴리갈락투로닌산염), 키토산, 카복시메틸 셀룰로즈 및 그의 유도체, 겔라이트, 천연왁스, 천연 검, 카올린, 벤토나이트 등의 점토 광물, 또는 지오라이트 등과 같은 규조토 물질이 사용될 수 있다. 이러한 각종 담체들은 개별적으로 사용될 수 있으며, 혹은 2 이상의 담체들을 적당비율로 혼합하여 개선된 물성의 담체를 얻을 수도 있다. 상기와 같은 담체들을 사용할 경우 미생물에 의하여 대사되어 영양원이 될 수 있고, 이들 담체들은 점성이 매우 높아 식물의 표면에 대한 점착성이 증가되어 좋다.

본 발명은 균주 또는 균주 배양액을 건조법으로 얻어진 건조 산물 및 이를 포함하는 생물농약도 포함할 수 있다. 상기 건조 산물은 수화제(WP), 고상제(GM), 입상수화제(WG), 입제(GR), 분제(DP) 및 종자처리수화제(WS)로 이루어진 군에서 선택된 제형으로 생물 농약을 제조할 수 있다. 이러한 생물농약 제제는 기존 액상 제형에 비해 안정성 및 이화학성이 우수하며, 식물병 방제 처리로 사용할 수 있다.

생물 농약에서 수화제는 분상으로서 물에 희석하였을 때 수화되는 농약의 제형을, 고상제는 미생물 배양액을 고상의 물질에 혼합하거나 흡착시킨 제제로 분제, 입제 및 수화제에 해당되지 않는 제형을 의미한다. 또한, 입상 수화제는 과립상으로서 물에 희석하여 사용되는 농약의 제형을, 상기 입제는 입상으로서 원상태로 사용되는 농약의 제형을, 상기 분제는 분상으로서 원상태로 사용되는 농약의 제형을, 종자처리수화제는 분상으로서 종자에 처리하기 전에 수화시켜 현탁액으로 사용되는 농약의 제형을 의미한다.

본 발명의 일 구현예에 따른 수화제는 유효성분(active ingredient)으로서 스트렙토마이세스 스펙타빌리스(Streptomyces spectabilis) AN091965 균주, 흡습제로서 화이트카본(white carbon), 습윤제로서 소듐 비스[2-에틸헥실]설포숙시네이트, 분산제로서 소듐 리그노설포네이트 및 증량제로서 카올린으로 이루어질 수 있으며, 바람직하게는 10 중량% 스트렙토마이세스 스펙타빌리스(Streptomyces spectabilis) AN091965 균주, 1 중량% 화이트카본(white carbon), 1 중량% 소듐 비스[2-에틸헥실]설포숙시네이트, 1 중량% 소듐 리그노설포네이트 및 87 중량% 카올린으로 이루어질 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 따른 액상수화제는 소나무재선충(Bursaphelenchus xylophilus)을 방제하기 위해 사용된다. 본 발명의 미생물제제를 이용하여 소나무재선충(Bursaphelenchus xylophilus)을 방제하기 위해서는 미생물제제를 물을 이용하여 균일하게 희석한 후 동력살포기와 같은 적절한 살포장치를 이용하여 작물, 작물의 종자 또는 재배지에 살포할 수 있다. 본 발명의 액상수화제를 물에 희석하는 경우 액상수화제의 농도는 유효성분이 생물학적으로 유효한 범위가 될 수 있도록 10³내지 10⁵cfu/ml, 바람직하게는 10⁴cfu/ml 내외로 조절할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 본 발명은 상기 균주, 배양체 또는 이의 배양액을 유효성분으로 함유하는 소나무재선충(Bursaphelenchus xylophilus)에 대한 살선충용 미생물 제제 또는 스펙티나빌린(spectinabilin)을 유효성분으로 함유하는 소나무재선충(Bursaphelenchus xylophilus)에 대한 살선충용 조성물을 작물, 작물의 종자 또는 재배지에 처리하는 단계를 포함하는 소나무재선충(Bursaphelenchus xylophilus)을 방제하는 방법을 제공한다.

상기 소나무재선충(Bursaphelenchus xylophilus)을 방제하는 방법으로는 본 발명의 균주를 배양한 배양액 또는 상기 균주를 이용한 미생물 제제를 작물이나 작물의 종자에 침지하거나 관주, 즉, 분무하여 수행할 수 있다. 침지하는 방법의 경우, 배양액 및 제제를 식물체 주변의 토양에 붓거나 또는 종자를 배양액 및 제제에 담가둘 수 있다. 본 발명의 방법에 적용될 수 있는 식물은 특별히 제한되지 않는다.

또한, 본 발명은 상기 균주를 배양하는 단계를 포함하는 소나무재선충(Bursaphelenchus xylophilus)에 대한 살선충용 미생물 제제의 제조 방법을 제공한다. 상기 스트렙토마이세스 스펙타빌리스(Streptomyces spectabilis) AN091965 균주의 배양 방법 및 미생물 제제의 제조 방법은 당 업계에 공지된 임의의 방법을 이용할 수 있으며, 특정 방법에 특별히 제한되는 것은 아니다.

또한, 상기 균주의 배양은 MEB(Malt extract broth) 배지, PDB(Potato dextrose broth) 배지, CDB(Czapek Dox broth) 배지 또는 SDB(Sabouraud dextrose broth) 배지에서 수행될 수 있고, 바람직하게는 PDB(Potato dextrose broth) 배지에서 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 살선충 활성 균주의 선발 및 살선충 활성 분석

토양으로부터 균주를 분리하기 위하여 HV, R2A 한천 배지를 사용하였고, 세균 및 곰팡이의 생육을 억제하기 위하여 적정한 농도의 사이클로헥사마이드(cyclohexamide) 또는 날리딕스산(nalidixic acid)을 첨가하여 사용하였다. 토양시료 각 1 g을 멸균한 생리식염수 10 ml에 첨가하고 볼텍스(vortex)로 충분히 혼합한 후, 각 시료를 분리용 배지에 100 ㎕씩 도말하고 28℃에서 일정기간 동안 배양하며 관찰하였다. 배양기간 동안 주기적으로 배양상태를 관찰하며 배양된 콜로니를 새로운 배지에 접종하여 단일 콜로니를 순수 분리한 후 현미경으로 관찰하면서 선별하였다. 순수분리한 각 균주는 한천(agar) 배지상에서 배양한 후 균체를 모아 20% 멸균 글리세롤에 현탁하여 -70℃ 초저온 냉장고 상에서 보존하였다. 또한, 장기보존을 위해 동결건조 보존을 실시하였는데, 분리된 각 균주를 고체 배지에서 배양한 후 멸균한 10% 탈지유(skim milk)에 현탁하고 동결건조하여 4℃ 이하에 보존하였다.

분리한 5,000개 균주 시료를 대상으로 살 재선충활성 스크리닝을 실시하여 그 중 활성이 우수한 균주 AN091965를 선발하였다(표 1 참고, 표 1에는 5000개 균주 중 일부 결과만 기재함). 살선충 활성은 분리한 균주 배양액으로 처리한 96 웰 플레이트를 25℃ 항온기에 넣고 반응시켜 24시간 후 해부현미경 하에서 곧게 경직되고 움직이지 않는 선충은 죽은 선충으로, 유연하고 움직임이 있는 선충은 산 선충으로 간주하여 살선충율을 조사하였으며, 사멸율에 따라 살선충 활성이 우수한 균주를 선발하였다(도 1). 또한, 선행연구에서 보고된 US 특허 활성균주와 동속동종인 스트렙토마이세스 그리세우스(Streptomyces griseus)를 KCTC에서 분양받아 실험한 결과, KCTC1072, KCTC1073, KCTC1080 균주에서 살 재선충 활성이 없음을 확인하였다.

분리 균주에 대한 살선충 활성시험은 다음과 같다. 소나무재선충병의 원인균인 재선충(Bursaphelenchus xylophilus)을 국립산림과학원에서 분양받아 곰팡이(Botrytis cinerea)가 배양된 PDA(potato dextrose agar) 평판배지에 계대배양하여 시험선충으로 사용하였다. 살재선충 효과는 방선균 배양액 추출물 5μL과 95μL의 선충용액(30~40여 마리 선충 포함)을 96-well Microtest™ Tissue Culture Plate의 각 웰에 2 반복으로 실험하였다.

AN091965 균주와 동속이종의 균주의 살선충 활성 분석

Strains	Scientific name		Time		Strains	Scientific name		Time
Strains	Scientific name	mg/mL	12h	24h	Strains	Scientific name	mg/mL	12h	24h
AN091965	*Streptomyces* *spectabilis*	2	3	3	AN140432	Streptomyces niveus	2	1	1
		1	3	3			1	1	1
		0.5	2	2			0.5	1	1
AN120064	Streptomyces xanthochromogenes	2	1	2.5	AN140398	Streptomyces candidus	2	1	1
		1	1	2			1	1	1
		0.5	1	1.5			0.5	1	1
AN120403	Streptomyces platensis	2	2	2	AN140221	Streptomyces goshikiensis	2	1	1
		1	1.5	1.5			1	1	1
		0.5	1.5	1.5			0.5	1	1
AN091242	Streptomyces pseudovenezuelae	2	2	2.5	AN140207	Streptomyces enissocaesilis	2	1	1
		1	1	1.5			1	1	1
		0.5	1	1.5			0.5	1	1
AN120379	Streptosporangium vulgare	2	1	2	AN140200	Streptomyces violaceorubidus	2	1	1
		1	1	1			1	1	1
		0.5	1	1			0.5	1	1
AN140530	Streptomyces lannensis	2	1	1.5	AN140148	Streptomyces malaysiensis	2	1	1
		1	1	1.5			1	1	1
		0.5	1	1.5			0.5	1	1
AN140161	Streptomyces lomondensis	2	1.5	1.5	AN120432	Streptomyces cyanoalbus	2	1	1
		1	1	1.5			1	1	1
		0.5	1	1.5			0.5	1	1
AN140516	Streptomyces aureus	2	1	1.5	KCTC 1072	*Streptomyces* *griseus*	2	1	1
		1	1	1			1	1	1
		0.5	1	1			0.5	1	1
AN140537	Streptomyces recifensis	2	1	1	KCTC 1073	*Streptomyces* *griseus*	2	1	1
		1	1	1			1	1	1
		0.5	1	1			0.5	1	1
AN140539	Streptomyces novaecaesareae	2	1	1	KCTC 1080	*Streptomyces* *griseus*	2	1	1
		1	1	1			1	1	1
		0.5	1	1			0.5	1	1

(살선충율, 1：alive, 1.5: 20%-40% dead, 2: 40%-75% dead, 2.5: 75-95%, 3: dead）(mg/mL는 방선균 배양액 추출물 농도를 의미함)

실시예 2. 본 발명의 AN091965 균주( KCTC13111BP )와 동속동종의 균주의 살 재선충 활성 비교

본 발명에서 분리한 AN091965 균주(KCTC13111BP)와 동속동종의 균주의 살재선충 활성을 비교실험하기 위하여, KCTC에서 KCTC9218(ATCC27465) 균주를 분양받아서 실험에 사용하였다. 살재선충 비교 실험 결과 AN091965 균주가 KCTC9218 균주보다 살재선충 활성이 1.5 ~ 3.5배 우수하다는 것을 확인할 수 있었다.

Strains	Scientific name	mg/mL	Mortality (%)
AN091965	*Streptomyces* *spectabilis* ( KCTC13111BP )	0.5	83
AN091965	*Streptomyces* *spectabilis* ( KCTC13111BP )	0.25	46
KCTC 9218 ( ATCC27465 )	*Streptomyces* *spectabilis*	0.5	57
KCTC 9218 ( ATCC27465 )	*Streptomyces* *spectabilis*	0.25	13

(mg/mL는 방선균 배양액 추출물 농도를 의미함)

실시예 3. 16S rDNA 유전자 염기서열을 이용한 균주 동정

본 발명에서 분리한 AN091965 균주의 16S rDNA 부분염기서열을 결정하였으며(서열번호 1), BLAST를 통하여 분류학적 위치를 분석하였다(도 2). 그 결과, AN091965 균주는 스트렙토마이세스 스펙타빌리스(Streptomyces spectabilis)로 동정되었다.

실시예 4. 선발된 AN 091965 균주의 살선충 활성물질의 분리정제 및 구조분석

4-1. 살선충 활성물질의 분리 및 정제

AN091965 균주의 살선충 활성 물질의 순수분리 정제를 위한 연구를 다음과 같이 진행하였다(도 3). 균 배양액(2.5 L)을 원심분리(5000 rpm, 30 min)하여 브로스 층과 마이셀리움 케이크(mycelium cake) 층으로 분리하였다. 브로스 층과 마이셀리움 아세톤(mycelium acetone) 추출물을 대상으로 살선충 활성을 확인한 결과 마이셀리움 아세톤 추출물에서 활성을 확인하였다. 아세톤 추출물을 헥산(Hexane) : 에틸 아세테이트(10~1:1, v/v)을 용출용매로 사용하여 실리카겔 컬럼 크로마토그래피를 수행하였다. 활성 분획물을 MeOH을 전개용매로 Sephadex LH20 컬럼 크로마토그래피를 실시하여 노란색 파우더를 얻었다. 순도를 높이기 위하여 최종적으로 Prep. HPLC(preparative high performance liquid chromatography) 단계를 거쳐 살 재선충 활성을 가지는 단일물질 AN091965-1 (6.7 mg)을 획득하였다. HPLC 조건은 기기는 TOSOH, 컬럼은 ODS (senshu pak, 20 x 250 mm) 컬럼, 용매조건은 85% 메탄올, Flow는 5mL/min을 사용하였다.

4-2. 분리한 화합물의 분자량 측정

분자량을 측정하기 위해 ESI-Mass 스펙트럼을 포지티브 모드(positive mode⁾에서 측정하였다. 포지티브 모드에서는 [M+H]⁺가 m/z 478.0에서 관찰되었고 [M+Na]⁺가 m/z 500.4에서 관찰되었다. 이를 통해 분자량이 477.0임을 알 수 있었고 분자식이 C₂₁H₃₁NO₆로 결정되었다(도 4).

4-3. AN 091965 -1의 ¹ H-NMR과 ¹³ C-NMR 스펙트럼

AN091965-1의 ¹H-NMR과 ¹³C-NMR을 통해 compound-1은 21개의 카본(carbon)과 31개의 프로톤(proton)이 존재함을 알 수 있었다. ¹H-NMR 스펙트럼을 측정한 결과, 1.71 ppm과 2.09 ppm에서 5개의 메틸 프로톤이 관찰되었으며, 3.92 ppm에서 메톡시 프로톤(methoxy proton)이 관찰되었다(도 5). ¹³C-NMR 스펙트럼을 측정한 결과, 55.5 ppm에서 1개의 메톡시 카본, 25.3, 19.5, 19.3, 9.0, 6.9 ppm에서 5개의 메틸 카본이 관찰되어 ¹H-NMR과 개연성이 있다는 것을 알 수 있었다(도 6). HMQC 스펙트럼을 측정하여 proton-bearing carbon (¹ J _C _-H)을 규명할 수 있었고, methine proton (dH 6.48, H-8a), methine carbon, bearing oxygen (δ_C 77.2, C-6), methylene carbon (δ_C 35.6, C-7), quaternary sp2 carbon (δ_C 114.9, C-8)과 HMBC 스펙트럼을 측정하여 해석한 결과, 각각의 프로톤으로부터 관찰된 long-range correlation으로부터 2-메톡시-3,5-디메틸-g-피론 모이어티 (C-1 ~ C-5)와 p-니트로페닐 그룹 (C-16 ~ C-19)이 관찰되었고 본 화합물의 화학구조를 결정하였다. 이상의 결과를 근거로 Jacobsen 등의 문헌(Jacobsen MF, Moses JE, Adlington RM, Baldwin JE. Org Lett. 2005 Jun 9;7(12):2473-6) 및 데이터베이스 검색을 실시한 결과, 본 화합물을 스펙티나빌린(spectinabilin)으로 동정할 수 있었다(도 7).

4-4. AN091965 -1( 스펙티나빌린 )의 살 재선충 활성효과

AN091965-1(스펙티나빌린)의 살 재선충 활성결과, LC₅₀ 값이 1.5 ㎍/mL로 소나무재선충 방제제로 알려진 아바멕틴(abamectin) 4.1 ㎍/mL보다 약 2.7배 높은 활성을 나타냈다.

AN091965-1의 LC₅₀

	LC ₅₀ (㎍/ mL ) ^a
AN091965 -1	1.5
아바멕틴	4.1

실시예 5. 본 발명에서 선발된 AN091965 균주의 항생제 감수성 분석

항생제 내성을 확인하기 위하여 Bennet 배지에 100 ㎕씩 도말하고 각각의 항생제 디스크를 표면에 부착시켜 28℃에서 7일 동안 배양하며 관찰하였다. 배양기간 동안 주기적으로 배양상태를 관찰하였다. 그 결과, 날리딕스산(Nalidixic acid), 테트라사이클린(Tetracycline), 아미카신(Amikacin), 카나마이신(Kanamycin), 반코마이신(Vancomycin), 클로람페니콜(Chloramphenicol), 테이코플라닌(Teicoplanin), 스트렙토마이신(Streptomycin), 젠타마이신(Gentamicin) 및 리팜피신(Rifampicin)에 감수성을 나타내는 것을 확인하였고, 리팜피신에 대해 감수성이 가장 큰 것을 확인하였다.

실시예 6. 본 발명에서 선발된 AN091965 균주의 뿌리혹선충 활성 여부 검증

배양액 추출물은 4℃, 13,000 rpm 조건에서 10분 동안 원심분리하여 균체에 아세톤을 넣어 20분 동안 초음파추출 하였고 이를 실험에 사용하였다. 선충(J2 유충) 현탁액(약 70 마리/100 ㎕)을 96-웰 조직 배양 플레이트의 각 웰에 넣은 다음 균주 추출물을 5, 10, 20%를 처리하여 웰당 최종 부피가 50㎕가 되도록 하였다. 대조구로 아마멕틴(abamectin)을 0.5와 1 ㎍/㎖ 수준으로 사용하였고, 무처리 대조구는 멸균수:메탄올(1:1, v/v) 용액을 20% 수준으로 처리하였다. 시료 처리 후 96-웰 마이크로 플레이트는 시료가 균일하게 섞이도록 30초 동안 교반하였으며, 선충의 산소결핍과 건조를 방지하기 위하여 상대습도 100%의 플라스틱 통에 넣은 후 25-27℃ 배양기에서 보관하였다. 실험은 3 반복을 수행하였으며, 시료 처리 24시간과 72시간 후 광학도립현미경(OlympusCKX41, Tokyo, Japan)하에서 곧게 뻗어 움직임이 없는 선충을 죽은 선충으로, 유연한 곡선형으로 움직임이 있는 선충을 살아있는 선충으로 판단하여 Abbott's formula를 이용하여 살선충율을 조사하였다(Abbott, 1925 1925, J. Eco. Entonol, 18, 265-267). AN091965 균주의 배양 추출물에서는 뿌리혹선충 살활성을 나타내지 않았다.

한국생명공학연구원

KCTC13111BP

20160921

<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology National Institute of Forest Science <120> Streptomyces spectabilis AN091965 strain having nematocidal activity against Bursaphelenchus xylophilus and secreting spectinabilin and uses thereof <130> PN17082 <160> 1 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 1391 <212> DNA <213> Streptomyces spectabilis <400> 1 agctccctcc cacaaggggt tgggccaccg gcttcgggtg ttaccgactt tcgtgacgtg 60 acgggcggtg tgtacaaggc ccgggaacgt attcaccgca gcaatgctga tctgcgatta 120 ctagcgactc cgacttcatg gggtcgagtt gcagacccca atccgaactg agaccggctt 180 tttgagattc gctccacctc gcggtatcgc agctcattgt accggccatt gtagcacgtg 240 tgcagcccaa gacataaggg gcatgatgac ttgacgtcgt ccccaccttc ctccgagttg 300 accccggcgg tctcccgtga gtccccagca ccacaagggc ctgctggcaa cacgggacaa 360 gggttgcgct cgttgcggga cttaacccaa catctcacga cacgagctga cgacagccat 420 gcaccacctg tacaccgacc acaagggggc gaccatctct ggccgtttcc ggtgtatgtc 480 aagccttggt aaggttcttc gcgttgcgtc gaattaagcc acatgctccg ccgcttgtgc 540 gggcccccgt caattccttt gagttttagc cttgcggccg tactccccag gcggggcact 600 taatgcgtta gctgcggcac ggacgacgtg gaatgtcgcc cacacctagt gcccaccgtt 660 tacggcgtgg actaccaggg tatctaatcc tgttcgctcc ccacgctttc gctcctcagc 720 gtcagtatcg gcccagagat ccgccttcgc caccggtgtt cctcctgata tctgcgcatt 780 tcaccgctac accaggaatt ccgatctccc ctaccgaact ctagcctgcc cgtatcgact 840 gcagacccgg ggttaagccc cgggctttca caaccgacgt gacaagccgc ctacgagctc 900 tttacgccca ataattccgg acaacgctcg cgccctacgt attaccgcgg ctgctggcac 960 gtagttagcc ggcgcttctt ctgcaggtac cgtcactttc gcttcttccc tgctgaaaga 1020 ggtttacaac ccgaaggccg tcatccctca cgcggcgtcg ctgcatcagg ctttcgccca 1080 ttgtgcaata ttccccactg ctgcctcccg taggagtctg ggccgtgtct cagtcccagt 1140 gtggccggtc gccctctcag gccggctacc cgtcgtcgcc ttggtgagcc attacctcac 1200 caactagctg ataggccgcg ggctcatcct gcaccgccgg agctttccac acaggatcat 1260 gcgatcccgt gtcgtatccg gtattagacc ccgtttccag ggcttgtccc agagtgcagg 1320 gcagattgcc cacgtgttac tcacccgttc gccactaatc caccccgaag ggcttcatcg 1380 ttcgacttgc a 1391

Claims

소나무재선충(Bursaphelenchus xylophilus)에 대해 살선충 활성을 가지며, 스펙티나빌린(spectinabilin)을 분비하고, 날리딕스산(Nalidixic acid), 테트라사이클린(Tetracycline), 아미카신(Amikacin), 카나마이신(Kanamycin), 반코마이신(Vancomycin), 클로람페니콜(Chloramphenicol), 테이코플라닌(Teicoplanin), 스트렙토마이신(Streptomycin), 젠타마이신(Gentamicin) 및 리팜피신(Rifampicin) 항생제에 대해 감수성을 가지는 스트렙토마이세스 스펙타빌리스(Streptomyces spectabilis) AN091965 균주 (기탁번호 KCTC13111BP).
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제1항의 균주, 배양체 또는 이의 배양액을 유효성분으로 함유하는 소나무재선충(Bursaphelenchus xylophilus)에 대한 살선충용 미생물 제제.
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제5항의 소나무재선충(Bursaphelenchus xylophilus)에 대한 살선충용 미생물 제제를 작물, 작물의 종자 또는 재배지에 처리하는 단계를 포함하는 소나무재선충병을 방제하는 방법.
제1항의 균주를 배양하는 단계를 포함하는 소나무재선충(Bursaphelenchus xylophilus)에 대한 살선충용 미생물 제제의 제조 방법.