KR101985941B1

KR101985941B1 - Method for stimulating the secretion of exosome by stem cell and cosmetic composition comprising thereof

Info

Publication number: KR101985941B1
Application number: KR1020170067805A
Authority: KR
Inventors: 김윤배; 최은경; 서다움
Original assignee: 충북대학교 산학협력단; 주식회사 디자인셀
Priority date: 2017-05-31
Filing date: 2017-05-31
Publication date: 2019-06-04
Also published as: KR20180131158A

Abstract

본 발명은 줄기세포로부터 엑소좀 분비를 촉진시키는 방법 및 줄기세포 유래 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 기능성 화장료 조성물에 관한 것으로, 구체적으로 본 발명은 줄기세포 배양액에 TNF-α를 처리하고 1~8%의 산소농도 조건 하에서 배양하는 단계를 포함하는 줄기세포로부터 엑소좀을 대량 생산하는 방법, 줄기세포로부터 엑소좀의 분비를 증가시키는 방법 및 줄기세포 유래 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 기능성 화장료 조성물에 관한 것이다. The present invention relates to a method for promoting the secretion of exosomes from stem cells and a functional cosmetic composition comprising stem cell-derived exosomes as an active ingredient. More specifically, the present invention relates to a method for treating stem cell cultures by treating TNF- A method of mass-producing exosomes from stem cells comprising culturing under the condition of oxygen concentration of 1 to 5%, a method of increasing secretion of exosome from stem cells, and a functional cosmetic composition containing stem cell-derived exosomes as an active ingredient .

Description

TECHNICAL FIELD The present invention relates to a method for promoting the secretion of exosomes from stem cells and a method for stimulating the secretion of exosomes from stem cells,

본 발명은 줄기세포로부터 엑소좀 분비를 촉진시키는 방법 및 줄기세포 유래 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 아토피 피부염 개선, 주름개선 및 미백활성을 갖는 기능성 화장료 조성물에 관한 것이다.The present invention relates to a method for promoting the secretion of exosomes from stem cells and a functional cosmetic composition having atopic dermatitis improvement, wrinkle improvement and whitening activity, which comprises stem cell derived exosomes as an active ingredient.

최근 도시인들의 생활환경이 변화함에 따라 집안의 카펫에 서식하는 진드기, 습도 저하로 인한 먼지, 주변국의 사막화 및 공업화에 의해 날아오는 황사, 미세먼지, 애완동물의 털, 꽃가루, 새로운 과일 및 음식, 식품첨가물 등 면역 과민반응을 유발하는 다양한 알러젠에 노출되는 기회가 점차 커지고 있다. 이중 아토피 피부염(atopic dermatitis)은 영유아에서 10-20%, 성인에서 1-3%의 비율로 발병하고 있으며 최근 유병율이 꾸준히 증가하는 추세이다. 웰빙을 추구하는 현대인들에 있어서 피부주름 개선, 보습, 미백 등은 피부미용적인 측면에서 자외선을 차단하고 노화를 방지해 줄 수 있는 다양한 기능성 화장품류의 사용으로 상당한 효과를 얻을 수 있지만, 아토피 피부염은 지속적인 항원의 작용으로 인해 심각한 피부염과 가려움증은 물론 그로 인한 심리적 스트레스가 유발되는 중증 질환으로 치료가 매우 어렵고 치료 및 개선을 위해서는 장기간의 시간이 필요하다.Recent changes in the living environment of urban people have led to the development of mites that live on the carpets in the house, dust due to humidity reduction, dust and dirt coming from the desertification and industrialization of neighboring countries, fine dust, pet hair, pollen, There is an increasing opportunity to be exposed to various allergens that cause immune hyperresponsiveness such as additives. Atopic dermatitis occurs in 10-20% of infants and 1-3% of adults, and the prevalence rate is steadily increasing recently. In modern people seeking wellbeing, skin wrinkle improvement, moisturizing, whitening, etc. can be considerably effective by using a variety of functional cosmetics that can block ultraviolet rays and prevent aging from the viewpoint of skin beauty, but atopic dermatitis Due to the continuous action of the antigen, severe dermatitis and itching, as well as serious psychological stress caused by it, is very difficult to treat and long time is needed for treatment and improvement.

또한, 알러지 반응은 우리 몸의 과도한 면역반응으로, 기전적으로 4가지 유형 중 하나이다. 제1형 과민반응으로 알려진 아토피는 면역글로불린 E (immunoglobulin E, IgE)에 의해 비만세포(mast cells) 등이 과도하게 활성화되는 것이 특징인데, 면역글로불린 E에 의해 매개되는 담마진이나 혈관부종과는 다르게 병리현상 발현에 있어서 세포매개와 면역글로불린 E 매개기전 모두가 관여한다.In addition, the allergic reaction is an excessive immune response in our body, one of the four major types. Atopy, known as type 1 hypersensitivity reaction, is characterized by overexpression of mast cells by immunoglobulin E (IgE), which is different from immunoglobulin E-mediated inflammation or angioedema Both cell mediated and immunoglobulin E mediators are involved in pathological manifestations.

초기단계에서 아토피 과민반응을 유발하는 알러젠은 interleukin-4 (IL-4)와 같은 사이토카인(cytokines)을 분비하는 2형 helper T 세포(Th2 cells)을 유도한다. 이어 면역글로불린 E를 포함하는 항체를 생산하는 B-세포와 반응한다. 알러젠이 비만세포 표면의 Fcε receptor I (FcεRI)에 교차연결되어 있는 면역글로불린 E와 반응하면 비만세포로부터 히스타민(histamine)이 유리되어 즉각적인 과민반응, 즉 아나필락시스 쇼크반응(anaphylaxis)이 유발된다. 아토피 피부염에서 Th2 세포가 IL-4를 다량으로 생산하고, 이는 형질세포(plasma cells)로 하여금 면역글로불린 E 생산을 촉진시킨다. 그러므로 가장 효과적인 항알러지 및 항아토피 후보물질로는 비만세포로부터의 히스타민 유리를 억제함은 물론, 초기 Th2 세포와 후기 Th1 세포를 포함한 Th 세포의 활성화를 차단하는 물질이 될 수 있다. Allergens that induce atopic sensitization in the early stages induce type 2 helper T cells (Th2 cells) that secrete cytokines such as interleukin-4 (IL-4). And then reacts with B-cells producing antibodies comprising immunoglobulin E. Allergen reacts with immunoglobulin E cross-linked to Fcε receptor I (FcεRI) on the surface of mast cells to release histamine from mast cells, leading to an immediate hypersensitivity reaction, anaphylaxis. In atopic dermatitis, Th2 cells produce a large amount of IL-4, which promotes the production of immunoglobulin E by plasma cells. Therefore, the most effective anti-allergic and anti-atopy candidate substances can inhibit histamine release from mast cells, as well as block the activation of Th cells including early Th2 cells and late Th1 cells.

한편, 최근에는 줄기세포(stem cells)가 세포대체, 뇌보호 및 면역조절 기전을 통해 비가역적 뇌손상을 개선시켜 주는 것으로 밝혀졌다. 예를 들어, 신경줄기세포(neural stem cells, NSC)를 혈관 내로 주사했을 때 말초 면역계를 조절함으로써 자가면역질환인 다발성 경화증 모델동물의 임상증상을 완화시키는 것으로 보고되었고, 또한 뇌실 내로 주사한 신경줄기세포는 뇌세포를 보호하고 손상된 세포를 대체함으로써 중주이상을 개선시켜 주는 것으로 나타났다. 이러한 결과는 줄기세포가 면역조절 기능을 통해 자가면역질환 및 과민반응을 개선해 줄 수 있다는 것을 시사한다. 따라서 줄기세포는 제1형 과민반응이며 Th1과 Th2 세포가 관여하는 피부과민반응인 아토피 피부염을 예방하고 치료해 줄 수 있을 것으로 기대된다.Recently, stem cells have been shown to improve irreversible brain damage through cell replacement, brain protection and immunoregulatory mechanisms. For example, neural stem cells (NSC) injected into the blood vessels have been reported to modulate the peripheral immune system to alleviate clinical symptoms in animal models of multiple sclerosis, an autoimmune disease. In addition, neural stem cells injected into the ventricle It has been shown that it protects brain cells and replaces damaged cells, thereby improving the quadratic abnormality. These results suggest that stem cells can improve autoimmune diseases and hypersensitivity through immune regulation. Therefore, it is anticipated that stem cells will be able to prevent and treat atopic dermatitis, type 1 hypersensitivity reaction, a skin hypersensitive reaction involving Th1 and Th2 cells.

나아가 줄기세포 또는 줄기세포의 배양액은 항산화 및 창상치유 효능을 가지고 있는 것으로 알려져 있고, 특히 지방줄기세포는 콜라겐 생성을 촉진시키고 분해를 억제하여 피부주름을 개선해 줌은 물론, 최근에는 피부미백 효능이 알려져 피부미용을 위한 새로운 소재로 관심을 모으고 있다. Furthermore, the culture medium of stem cells or stem cells is known to have antioxidant and wound healing efficacy. In particular, adipose stem cells promote collagen production and inhibit degradation, thereby improving skin wrinkles and, in recent years, It is attracting attention as a new material for skin beauty.

하지만 줄기세포의 주름개선 및 미백효능은 줄기세포 자체를 피하에 주사하여 얻어진 결과이며, 줄기세포 배양액(conditioned medium, CM)을 피부에 도포하여 효능을 확인한 연구결과는 아직 없다. 이는 줄기세포 배양액 내 유효성분이 주로 단백질로 구성되어 있어 피부를 잘 침투하지 못하기 때문이다. 따라서 피부 침투율의 개선을 위해 유효 단백질을 리포좀(liposomes)으로 싸주도록 하여 피부침투율을 향상시키고자 하는 연구가 진행되고 있다. 하지만 배양액 내에 낮은 농도로 녹아 있는 유효 단백질을 리포좀 지질층으로 포집하는 기술은 아직 개발이 미비하며 포집율이 저조하여 실용성이 낮은 것이 현재의 실정이다. However, the wrinkle improvement and whitening effect of stem cells have been obtained by injecting the stem cells themselves under the skin, and no studies have been conducted to confirm the efficacy by applying the conditioned medium (CM) to the skin. This is because the active ingredient in the stem cell culture fluid is composed mainly of proteins and does not penetrate the skin well. Therefore, in order to improve the penetration rate of the skin, researches are being carried out to improve the permeability of the skin by wrapping the effective protein with liposomes. However, the technique of collecting the effective protein dissolved in the culture liquid at a low concentration into the liposome lipid layer has not yet been developed, and the collection efficiency is low and the practicality is low.

이에 본 발명자들은 줄기세포로부터 피부 개선, 주름 개선, 미백활성 및 아토피 피부염의 기능을 갖는 유효성분을 다량 확보하고 피부 침투율을 향상시킬 수 있는 방법으로서, 줄기세포로부터 유효성분이 분비될 때에 피부 침투효과가 우수한 엑소좀 형태로의 분비를 촉진시키는 방법을 확립함으로써 본 발명을 완성하였다.Accordingly, the present inventors have succeeded in obtaining a large amount of active ingredients having the functions of skin improvement, wrinkle improvement, whitening activity and atopic dermatitis from stem cells and improving the skin permeation rate, and have found that when the active ingredient is secreted from the stem cells, The present inventors have completed the present invention by establishing a method for promoting secretion in the form of excellent exosome.

대한민국 특허출원 제10-2016-0061004호Korean Patent Application No. 10-2016-0061004

본 발명에서는 줄기세포로부터 엑소좀의 분비를 향상시킬 수 있는 최적의 조건을 확립하였고, 본 발명에서 수득한 다량의 엑소좀 형태의 유효성분이 비만세포 및 아토피 피부염 모델동물에서 히스타민 분비와 피부염증을 효과적으로 완화시킬 수 있으며, 콜라겐 분해효소인 MMP-1 (matrix metalloproteinase-1)과 티로시나제(tyrosinase)를 억제함으로써 피부 주름개선 및 미백 효능이 우수함을 확인하였다.In the present invention, an optimal condition for enhancing the secretion of exosome from stem cells was established, and a large amount of exosome-type active ingredient obtained in the present invention was effectively administered to mast cell and atopic dermatitis model animals effectively for histamine secretion and skin inflammation (Matrix metalloproteinase-1) and tyrosinase (collagenase), thereby improving skin wrinkles and whitening efficacy.

따라서 본 발명의 목적은 줄기세포로부터 엑소좀을 대량 생산하는 방법을 제공하는 것이다.Accordingly, an object of the present invention is to provide a method for mass-producing exosomes from stem cells.

본 발명의 다른 목적은 줄기세포로부터 엑소좀의 분비를 증가시키는 방법을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a method for increasing the secretion of exosome from stem cells.

또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 본 발명의 방법으로 수득한 줄기세포 유래 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 기능성 화장료 조성물을 제공하는 것이다. Another object of the present invention is to provide a functional cosmetic composition comprising the stem cell-derived exosome obtained by the method of the present invention as an active ingredient.

또한, 본 발명의 다른 목적은 본 발명의 줄기세포 유래 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 아토피 피부염의 예방 또는 치료를 위한 약학적 조성물을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for preventing or treating atopic dermatitis comprising the stem cell-derived exosome of the present invention as an active ingredient.

상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 줄기세포 배양액에 tumor-necrosis factor-α (TNF-α)를 5~500 ng/mL의 농도로 처리하고 1~8%의 산소농도 조건 하에서 12~72시간 배양하는 단계를 포함하는, 줄기세포로부터 엑소좀을 대량 생산하는 방법을 제공한다.In order to achieve the object of the present invention, the present invention provides a method for treating a stem cell culture with tumor necrosis factor-α (TNF-α) at a concentration of 5 to 500 ng / For 12 to 72 hours under the same conditions.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 줄기세포는 신경줄기세포, 희소돌기교전구세포, 지방줄기세포, 양막줄기세포, 양수줄기세포, 태반줄기세포 및 제대혈 줄기세포로 이루어진 군 중에서 선택되는 것일 수 있다.In one embodiment of the present invention, the stem cells may be selected from the group consisting of neural stem cells, rare progenitor precursor cells, adipose stem cells, amniotic stem cells, amniotic stem cells, placental stem cells and cord blood stem cells .

본 발명의 일실시예에 있어서, 줄기세포 배양액은 DMEM (Dulbecco’s modified Eagle’s medium) 배지일 수 있다.In one embodiment of the present invention, the stem cell culture solution may be DMEM ( Dulbecco's modified Eagle's medium) medium.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 줄기세포는 1x10⁴~1x10⁶세포수일 수 있다.In one embodiment of the present invention, the stem cells may be in the range of 1 × ¹⁰ ⁴ to 1 × 10 ⁶ cells.

또한, 본 발명은 신경줄기세포, 희소돌기교전구세포, 지방줄기세포, 양막줄기세포, 양수줄기세포, 태반줄기세포 또는 제대혈 줄기세포 배양액에 TNF-α를 5~500 ng/mL의 농도로 처리하고 1~8%의 산소농도 조건 하에서 12~72시간 배양하는 단계를 포함하는, 줄기세포로부터 엑소좀의 분비를 증가시키는 방법을 제공한다.The present invention also provides a method of treating TNF-α at a concentration of 5 to 500 ng / mL in a neural stem cell, a rare prostatic precursor cell, adipose stem cell, amniotic stem cell, amniotic stem cell, placental stem cell or cord blood stem cell culture medium And culturing the cells for 12 to 72 hours under an oxygen concentration of 1 to 8%, to thereby increase the secretion of exosome from the stem cells.

또한, 본 발명은 상기 본 발명의 방법으로 수득한 줄기세포 유래 엑소좀을 유효성분으로 포함하는, 화장료 조성물을 제공한다. The present invention also provides a cosmetic composition comprising the stem cell-derived exosome obtained by the method of the present invention as an active ingredient.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 줄기세포 유래 엑소좀은 아토피 피부염 개선효과, 피부주름 개선효과 또는 피부미백 효과를 갖는 것일 수 있다.In one embodiment of the present invention, the stem cell-derived exosome may have atopic dermatitis-improving effect, skin wrinkle-improving effect, or skin whitening effect.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 화장료는 스킨로션, 스킨소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스쳐 로션, 영양로션, 마사지크림, 영양크림, 모이스처크림, 핸드크림, 파운데이션, 에센스, 영양에센스, 팩, 비누, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디로션, 바디클렌저, 세안제, 트리트먼트, 미용액, 미용팩, 연고제, 겔제, 리니멘트제, 액제, 패치 및 분무제로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나의 제형일 수 있다.In an embodiment of the present invention, the cosmetic material may be a skin lotion, a skin softener, a skin toner, an astringent, a lotion, a milk lotion, a moisturizing lotion, a nutrition lotion, Wherein the composition is selected from the group consisting of a nutritional essence, a pack, a soap, a cleansing foam, a cleansing lotion, a cleansing cream, a body lotion, a body cleanser, a cleanser, a treatment, a serum, a cosmetic pack, an ointment, a gel, a liniment, It may be any one of the formulations.

또한, 본 발명은 줄기세포 유래 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 아토피 피부염의 예방 또는 치료를 위한 약학적 조성물을 제공한다.The present invention also provides a pharmaceutical composition for preventing or treating atopic dermatitis comprising stem cell-derived exosomes as an active ingredient.

본 발명은 줄기세포 배양액에 TNF-α를 5~500 ng/mL의 농도로 처리하고 1~8%의 산소농도 조건 하에서 12~72시간 배양하는 단계를 포함하는 줄기세포로부터 엑소좀을 대량 생산하는 방법, 줄기세포로부터 엑소좀의 분비를 증가시키는 방법 및 줄기세포 유래 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 기능성 화장료 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 방법은 피부개선, 피부미백 및 아토피 피부염 개선 효과를 갖는 줄기세포 유래 유효성분들이 효과적으로 피부에 침투될 수 있고 그 기능을 온전히 발휘할 수 있도록 줄기세포로부터 엑소좀의 분비를 최대화 할 수 있는 최적 조건을 확립하였고, 줄기세포 유래 엑소좀 함유 조성물이 우수한 피부개선, 피부미백 및 아토피 피부염 개선 효과가 있어 기능성 화장품의 제조에 유용하게 사용할 수 있는 효과가 있다.The present invention relates to a method for mass-producing exosomes from stem cells, which comprises culturing stem cell cultures in a concentration of 5-500 ng / mL of TNF-α and culturing for 12-72 hours under an oxygen concentration of 1-8% A method for increasing secretion of exosome from stem cells, and a functional cosmetic composition comprising stem cell-derived exosomes as an active ingredient. The present invention relates to a functional cosmetic composition comprising a stem having a skin improving effect, skin whitening effect and atopic dermatitis It has been established that the cell-derived efficacious substances can effectively penetrate into the skin and can maximize the secretion of exosome from the stem cells so as to exert its function fully. The stem cell-derived exosome-containing composition is excellent in skin improvement, Whitening, and atopic dermatitis, which is effective for the production of functional cosmetics.

도 1은 히스타민(His)으로 유도된 가려움증에 대한 줄기세포 배양액의 개선 정도를 분석한 결과를 나타낸 것으로, 빗금 그래프는 대조군 줄기세포 배양액을 나타낸 것이고, 회색의 그래프는 본 발명의 엑소좀 풍부 줄기세포 배양액을 나타낸 것이며, AFSC는 양수줄기세포를, AMSC는 양막줄기세포를, PSC는 태반줄기세포를, UCBSC는 제대혈 줄기세포를, NSC는 신경줄기세포를, OPC는 희소돌기교전구세포를, ASC는 지방줄기세포를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 엑소좀 풍부 줄기세포 배양액과 대조군 줄기세포 배양액에 대한 히스타민으로 유도된 피부 출혈반응(Evan’s blue 누출)의 개선 정도를 분석한 결과이다.
도 3은 본 발명의 엑소좀 풍부 줄기세포 배양액과 대조군 줄기세포 배양액에 대한 난백알부민으로 유발된 만성 아토피 피부염 모델에서의 피부염 완화정도를 분석한 결과이다.
도 4는 본 발명의 엑소좀 풍부 줄기세포 배양액과 대조군 줄기세포 배양액에 대한 난백알부민으로 유발된 만성 아토피 피부염 모델에서 혈청 IgE의 억제 효과를 분석한 결과이다.
도 5는 본 발명의 엑소좀 풍부 줄기세포 배양액과 대조군 줄기세포 배양액에 대한 난백알부민으로 유발된 만성 아토피 피부염 모델에서 히스타민 억제 효과를 분석한 결과이다.
도 6은 본 발명의 엑소좀 풍부 줄기세포 배양액과 대조군 줄기세포 배양액에 대한 난백알부민으로 유발된 만성 아토피 피부염 모델에서 혈청 내 인터루킨-4 (IL-4) 억제 효과를 분석한 결과이다.
도 7은 MMP-1 (matrix metalloproteinase-1) 활성도에 대한 발명의 엑소좀 풍부 줄기세포 배양액과 대조군 줄기세포 배양액의 억제 효과를 분석한 결과이다.
도 8은 티로시나제 활성도에 대한 발명의 엑소좀 풍부 줄기세포 배양액과 대조군 줄기세포 배양액의 억제 효과를 분석한 결과이다.
도 9는 멜라노사이트에서 멜라닌 생산에 대한 본 발명의 엑소좀 풍부 줄기세포 배양액과 대조군 줄기세포 배양액의 억제 효과를 분석한 결과이다.
참고로 본 발명의 도면에서 빗금 그래프는 대조군 줄기세포 배양액 처리군을 나타낸 것이고, 회색의 그래프는 본 발명의 엑소좀 풍부 줄기세포 배양액 처리군을 나타낸 것이다.FIG. 1 shows the result of analyzing the degree of improvement of stem cell culture fluid against histamine (His) -induced itching. The hatched graph shows the culture of the control stem cells, and the gray graph shows the results of the exosome- AMSC represents amniotic stem cells, PSC for placental stem cells, UCBSC for cord blood stem cells, NSC for neural stem cells, OPC for rare proliferating progenitor cells, ASC for AFSC, This is an illustration of adipose stem cells.
FIG. 2 shows the results of analysis of histamine-induced skin bleeding response (Evan's blue leakage) in the culture medium of the stem cell of the present invention and the stem cell culture of the control.
FIG. 3 shows the results of analysis of the degree of dermatitis relief in a chronic atopic dermatitis-induced model of albumin-induced albumin for the exo-somatic stem cell culture medium and the control stem cell culture medium of the present invention.
FIG. 4 shows the results of analysis of the inhibitory effect of serum IgE in a model of chronic atopic dermatitis induced by egg albumin for the exosome-rich stem cell culture medium and the control stem cell culture medium of the present invention.
FIG. 5 shows histamine inhibitory effects in the chronic atopic dermatitis-induced asthma albumin-induced model of the exosome-rich stem cell culture and the control stem cell culture of the present invention.
FIG. 6 shows the results of analysis of serum IL-4 inhibitory effect in the chronic atopic dermatitis-induced asthma albumin-induced culture of the exosome-rich stem cell culture medium and the control stem cell culture medium of the present invention.
FIG. 7 shows the results of analysis of the inhibitory effect of the inventive exo-somatic stem cell culture medium and control stem cell culture medium on MMP-1 (matrix metalloproteinase-1) activity.
FIG. 8 shows the results of analysis of the inhibitory effect of the inventive exosome-rich stem cell culture medium and control stem cell culture medium on tyrosinase activity.
FIG. 9 shows the results of analysis of the inhibitory effect of melanocyte-producing melanocyte-producing medium of the present invention on exosome-rich stem cell culture and control stem cell culture.
For reference, the hatched graph in the drawings of the present invention represents the group treated with the control stem cell culture solution, and the gray graph shows the group treated with the exosome-rich stem cell culture of the present invention.

본 발명은 줄기세포를 기능성 화장품의 원료로 사용함에 있어서, 피부 침투율의 향상과 줄기세포 또는 줄기세포 유래 유효성분의 효능 증진을 위한 방법으로써, 줄기세포로부터 엑소좀의 분비를 증가시키는 최적의 조건을 확립한 점에 특징이 있다.The present invention relates to a method for improving the permeability of skin and enhancing the efficacy of an effective ingredient derived from stem cells or stem cells in using stem cells as a raw material for functional cosmetics, It is characterized by what we have established.

본 발명에 따른 줄기세포로부터 엑소좀의 분비를 증가시킬 수 있는 조건은, 줄기세포 배양액에 TNF-α를 처리하고 저산소 농도 조건 하에서 배양하는 단계를 포함하며, 바람직하게는 TNF-α를 5~500 ng/mL의 농도로 처리하고 1~8%의 산소농도 조건 하에서 12~72시간 배양하는 단계를 포함한다. 더욱 바람직하게는 줄기세포 배양액에 TNF-α를 50 ng/mL의 농도로 처리하고 5%의 산소농도 조건 하에서 24시간 배양하는 단계를 포함할 수 있다.The conditions under which the secretion of exosome from the stem cells according to the present invention can be increased include a step of treating the stem cell culture medium with TNF-? And culturing under hypoxic conditions, preferably TNF-? ng / mL and culturing for 12 to 72 hours under an oxygen concentration of 1 to 8%. More preferably, the step may include culturing the stem cell culture solution at a concentration of 50 ng / mL of TNF-a and culturing for 24 hours under an oxygen concentration of 5%.

본 발명에서 상기 ‘줄기세포’는 특정 세포로 분화가 진행되지 않은 세포로서 필요한 경우, 신경, 혈액, 연골 등 신체를 구성하는 모든 종류의 세포로 분화할 능력을 가진 세포를 말한다.In the present invention, the term 'stem cell' refers to a cell that has not undergone differentiation into a specific cell, and is capable of differentiating into all kinds of cells constituting the body such as nerve, blood, cartilage and the like.

본 발명에서 엑소좀이 분비될 수 있는 줄기세포의 종류로는 이에 제한되지는 않으나, 신경줄기세포, 희소돌기교전구세포, 지방줄기세포, 양막줄기세포, 양수줄기세포, 태반줄기세포 또는 제대혈 줄기세포일 수 있다.In the present invention, the types of stem cells from which exosomes can be secreted include, but are not limited to, neural stem cells, rare progenitor precursor cells, adipose stem cells, amniotic stem cells, amniotic stem cells, placental stem cells, Lt; / RTI >

한편, ‘엑소좀(exosome)’은 정교한 RNA 및 단백질 운반물질이 들어있는 작은크기(30~150 nm)의 소포로서, 여러 종류의 세포들로부터 분비되는 막 구조의 소낭체이다. 엑소좀의 분비, 흡수, 조성에 대한 정확한 분자기전과 기능은 아직까지 연구가 미비한 실정이며 다만, 다른 세포 및 조직에 결합하는 막 구성요소, 단백질 및 RNA를 전달하는 역할을 하는 것으로 알려져 있다.On the other hand, 'exosome' is a vesicle of small size (30 ~ 150 nm) containing sophisticated RNA and protein transport material, and it is a membrane-structured necrosis secreted from various kinds of cells. The precise molecular mechanisms and functions of secretion, absorption, and composition of exosomes have not yet been studied, but they are known to play a role in delivering membrane components, proteins and RNAs that bind to other cells and tissues.

이에 본 발명자들은 줄기세포 또는 줄기세포 배양액의 유효성분에 대한 피부 흡수율을 높이기 위해 지질로 구성된 리포좀을 유효성분과 접목시키는 종래 기술에 비해 더욱 효과적인 방법으로서 줄기세포로부터 엑소좀이 다량 분비될 수 있는 조건을 규명하였고, 이러한 조건을 적용할 경우, 리포좀 접목 방법에 따른 별도의 처리과정, 외부 물질의 오염 및 리포좀 포접 시 배양액 성분의 변질과 같은 문제점을 해결할 수 있음을 알 수 있었다.Accordingly, the present inventors have found that, as a more effective method than the conventional technique of grafting a liposome composed of lipid with an active ingredient to increase the skin absorption rate of an effective ingredient of a stem cell or a stem cell culture liquid, a condition in which a large amount of exosomes can be secreted from stem cells It was found that when these conditions are applied, the problems such as the separate treatment according to the liposome grafting method, contamination of external substances, and deterioration of the culture liquid component when the liposome is enclosed can be solved.

따라서 본 발명에서 규명한 줄기세포 배양액에 TNF-α를 5~500 ng/mL의 농도로 처리하고 1~8%의 산소농도 조건 하에서 12~72시간 배양할 경우, 줄기세포로부터 엑소좀의 분비를 증가시킬 수 있어 줄기세포로부터 엑소좀이 풍부하게 함유된 배양액을 생산할 수 있고, 동시에 줄기세포로부터 엑소좀을 대량생산할 수 있다.Therefore, when TNF-α is cultured in the culture medium of the present invention for 5 to 500 ng / mL and cultured for 12 to 72 hours under an oxygen concentration of 1 to 8%, the secretion of exosomes from stem cells So that a culture medium rich in exosomes can be produced from the stem cells, and at the same time, the exosomes can be mass-produced from the stem cells.

특히 본 발명자들은 줄기세포로부터 엑소좀의 분비를 촉진할 수 있는 촉진제를 연구하던 중, 많은 물질들 중에서 TNF-α가 효과적으로 엑소좀 분비를 촉진하는 것을 알 수 있었고, 최대 엑소좀 분비를 위한 TNF-α의 적정 처리량은 5~500 ng/mL의 농도로 처리하는 것이 바람직하다는 것을 알 수 있었다.In particular, the present inventors have studied accelerators capable of promoting the secretion of exosomes from stem cells, and it has been found that TNF-α effectively promotes exocrine secretion among many substances, and TNF- the optimal treatment amount of? is preferably 5 to 500 ng / mL.

상기 범위를 초과하여 처리할 경우, 줄기세포에 손상을 주어 세포가 정상적인 기능을 발휘하지 못하는 문제점이 생길 수 있고, 반면 상기 범위에 미치지 못하는 양으로 처리할 경우 엑소좀의 분비량이 충분치 못하는 문제점이 생긴다.In the case of exceeding the above range, there is a problem that the stem cells are damaged and the cells can not exert their normal functions. On the other hand, when the treatment is carried out in an amount not exceeding the above range, there arises a problem that the exosome secretion amount is not sufficient .

줄기세포는 대식세포(macrophages)와 마찬가지로 TNF-α에 의해 이동하고 활성화된다. 활성화된 대식세포는 활성산소 라디칼(active oxygen radicals)을 분비하여 체내에 유입된 미생물과 종양을 공격하는 데 비해, 활성화된 줄기세포는 성장인자(growth factors, GF)와 신경성장인자(neurotrophic factors, NF)를 분비하여 조직을 보호하고 재생한다. 이러한 GF/NF 단백질은 엑소좀에 싸여 분비되는 것으로 밝혀졌다. 따라서 본 발명에서는 줄기세포 배양과정에서 TNF-α를 처리할 경우, 다량의 GF/NF 함유 엑소좀의 분비를 촉진시킬 수 있음을 규명하였고, 또한 다량의 GF/NF 함유 엑소좀을 수득할 수 있음을 규명하였다.Stem cells, like macrophages, are transported and activated by TNF-α. Activated macrophages secrete active oxygen radicals to attack microorganisms and tumors that enter the body, whereas activated stem cells have growth factors (GF) and neurotrophic factors NF) to secrete and protect tissue. These GF / NF proteins were found to be encapsulated in exosomes. Therefore, it has been found that, in the present invention, when TNF-a is treated in the stem cell culture, the secretion of a large amount of GF / NF-containing exosomes can be promoted, and a large amount of GF / NF-containing exosomes can be obtained Respectively.

또한, 줄기세포로부터 다량의 엑소좀 분비를 유도할 수 있는 요건으로 정상농도(약 20%)보다 현저히 낮은 산소농도 하에서의 배양이 필요함을 확인하였는데, TNF-α 처리 후 1~8%의 저산소 조건 하에서 12~72시간 배양하는 것이 바람직함을 알 수 있었다. 산소농도 조건이 1% 미만일 경우 세포의 정상적인 증식 및 성장에 문제를 발생시킬 수 있으며, 8%를 초과할 경우 엑소좀 분비가 충분하지 않을 수 있다. 따라서 1~8%의 저산소 조건 하에서 수행하는 것이 바람직하고 더욱 바람직하게는 5%의 산소 농도로 배양하는 것이 좋다.In addition, it was confirmed that culturing under the oxygen concentration significantly lower than the normal concentration (about 20%) is required as a requirement to induce a large amount of exocase secretion from the stem cells. The TNF-α treatment is performed under 1 to 8% It is preferable to cultivate for 12 to 72 hours. If the oxygen concentration is less than 1%, it may cause problems in normal cell proliferation and growth, and if it exceeds 8%, exosome secretion may not be sufficient. Therefore, it is preferable to conduct under the condition of 1 to 8% hypoxic, more preferably 5% of the oxygen concentration.

또한, 본 발명에 따른 방법에서 상기 줄기세포 배양액은 줄기세포를 배양하는 배지라면 모두 사용가능하며, 본 발명의 일실시예에서는 DMEM (Dulbecco’s modified Eagle’s medium) 배지를 사용하였다. In addition, in the method according to the present invention, the stem cell culture solution can be used as long as it is a medium for culturing stem cells. In one embodiment of the present invention, DMEM ( Dulbecco's modified Eagle's medium) medium is used.

상기 TNF-α를 5~500 ng/mL의 농도로 처리되어지는 줄기세포는 바람직하게 1x10⁴~1x10⁶세포수의 줄기세포일 수 있다.The stem cells treated with the TNF-α at a concentration of 5 to 500 ng / mL may preferably be stem cells of 1 × 10 ⁴ to 1 × 10 ⁶ cells.

이와 같이 본 발명의 조건으로 줄기세포를 배양할 경우, 줄기세포가 증식하는 과정에서 분비되는 줄기세포의 세포증식, 분화, 재생관련 유전자, 단백질, 성장인자 등 생리활성 물질들을 함유하고 있는 엑소좀의 분비를 촉진 및 증진시킬 수 있으며, 일반 줄기세포 배양액 수득 방법(즉 TNF-α 및 저산소 조건 하에서의 배양을 수행하지 않은 방법)에 비해 엑소좀의 분비 및 생산량을 월등히 증가시킬 수 있음을 알 수 있었다.As described above, when the stem cells are cultured under the conditions of the present invention, it is possible to prevent the proliferation of the stem cells and the exosomes containing the physiologically active substances such as cell proliferation, differentiation and regeneration related genes, Secretion can be promoted and promoted, and secretion and production of exosome can be significantly increased as compared with the method for obtaining a culture medium for general stem cell (i.e., the method without culturing under conditions of TNF-α and hypoxic conditions).

나아가 본 발명은 상기 본 발명의 방법으로 수득한 줄기세포 유래 엑소좀을 유효성분으로 포함하는, 화장료 조성물을 제공함에 특징이 있다.The present invention further provides a cosmetic composition comprising the stem cell-derived exosome obtained by the method of the present invention as an active ingredient.

본 발명의 일실시예에 의하면, 본 발명의 방법으로 수득한 엑소좀 풍부 줄기세포 배양액과 대조군 줄기세포 배양액에 대해 피부염 아토피 개선효과를 분석한 결과, 일반 줄기세포 배양으로 수득한 배양액에 비해 엑소좀이 풍부한 본 발명의 줄기세포 배양액이 월등히 우수한 아토피 개선 효과가 있는 것을 알 수 있었다.According to one embodiment of the present invention, the effect of improving the atopic dermatitis on the exosome-rich stem cell culture solution and the control stem cell culture solution obtained by the method of the present invention was found to be superior to the culture solution obtained by the general stem cell culture, It was found that the enriched stem cell culture solution of the present invention has a remarkably excellent atopy improving effect.

뿐만 아니라, 본 발명의 다른 일실시에에 의하면, 본 발명의 방법으로 수득한 엑소좀 풍부 줄기세포 배양액과 대조군 줄기세포 배양액에 대해 피부 주름 개선과 피부 미백 효과를 분석한 결과, 피부 주름의 원인이 되는 MMP-1의 억제를 본 발명의 엑소좀 풍부 줄기세포 배양액이 대조군 배양액에 비해 월등히 우수한 억제 효과를 보임을 알 수 있었고, 티로시나제 및 멜라닌 생성 억제 효과도 매우 우수한 것을 알 수 있었다.In addition, according to another embodiment of the present invention, the skin wrinkle improvement and skin whitening effect on the exosome-rich stem cell culture solution and the control stem cell culture solution obtained by the method of the present invention were analyzed, The inhibitory effect of MMP-1 on the exosome-rich stem cell culture of the present invention was superior to that of the control culture medium, and the inhibitory effect on tyrosinase and melanin production was also excellent.

따라서 본 발명에 따른 줄기세포 유래 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 조성물은 피부 주름 개선, 피부 미백 활성 또는 아토피 피부염 개선을 위한 화장료 조성물로 사용될 수 있다.Accordingly, the composition comprising the stem cell-derived exosome according to the present invention as an active ingredient can be used as a cosmetic composition for improving skin wrinkles, skin whitening activity, or atopic dermatitis.

본 발명에 따른 상기 화장료는 스킨로션, 스킨소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스쳐 로션, 영양로션, 마사지크림, 영양크림, 모이스처크림, 핸드크림, 파운데이션, 에센스, 영양에센스, 팩, 비누, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디로션, 바디클렌저, 세안제, 트리트먼트, 미용액, 미용팩, 연고제, 겔제, 리니멘트제, 액제, 패치 및 분무제로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나의 제형인 것이나, 특정 제형에 한정되는 것은 아니고 통상적인 화장료 조성물의 제형을 가질 수 있다. The cosmetics according to the present invention may be used as cosmetics such as skin lotions, skin softeners, skin toners, astringents, lotions, milk lotions, moisturizing lotions, nutrition lotions, massage creams, nutritional creams, moisturizing creams, hand creams, It may be any one selected from the group consisting of soaps, cleansing foams, cleansing lotions, cleansing creams, body lotions, body cleansers, cleansers, treatments, essences, cosmetic packs, ointments, gels, liniments, liquids, patches and sprays , It is not limited to a specific formulation and may have a formulation of a conventional cosmetic composition.

상기 각각의 제형에 첨가물 역시 한정되지 않으며 화장료 분야의 일반적인 첨가물이 첨가될 수 있다. 상기 화장료 분야의 일반적인 첨가물의 예로는 항생제, 결합제, 붕해제, 희석제, 활택제, 안정제, 보존료, 향료, 유분, 물, 계면활성제, 보습제, 저급알콜, 증점제, 킬레이트제, 색소 및 방부제로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 들 수 있다.The additives for each of the formulations are also not limited, and common additives in the field of cosmetics may be added. Examples of common additives in the cosmetic field include antibiotics, binders, disintegrants, diluents, lubricants, stabilizers, preservatives, fragrances, oils, water, surfactants, moisturizers, lower alcohols, thickeners, chelating agents, pigments and preservatives And the like.

또한, 본 발명에 따른 줄기세포 유래 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 조성물은 아토피 피부염 치료 및 예방을 위한 약학적 조성물로도 사용될 수 있다. The composition comprising the stem cell-derived exosome according to the present invention as an active ingredient may also be used as a pharmaceutical composition for the treatment and prevention of atopic dermatitis.

또한, 본 발명에서 상기 약학 조성물은 통상의 방법에 따른 적절한 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 약학 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 메틸히드록시 벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 등을 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. In addition, the pharmaceutical composition of the present invention may further comprise an appropriate carrier, excipient or diluent according to a conventional method. Examples of carriers, excipients and diluents that can be included in the pharmaceutical composition of the present invention include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, acacia rubber, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium silicate But are not limited to, cellulose, methylcellulose, microcrystalline cellulose, polyvinylpyrrolidone, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil.

본 발명에 따른 약학 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 또는 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 상세하게는, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구 투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 본 발명의 약학 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트 (calcium carbonate), 수크로스 (sucrose), 락토오스 (lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는 데, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제 및 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.The pharmaceutical composition according to the present invention may be formulated in the form of oral, granule, tablet, capsule, suspension, emulsion, syrup, aerosol or the like oral preparation, external preparation, suppository or sterilized injection solution according to a conventional method . More specifically, when formulating the composition, it can be prepared using a diluent or an excipient such as a filler, an extender, a binder, a wetting agent, a disintegrant, a surfactant, and the like. Solid formulations for oral administration include tablets, pills, powders, granules, capsules and the like. Such solid preparations can be prepared by mixing the pharmaceutical composition of the present invention with at least one excipient such as starch, calcium carbonate, Sucrose, lactose, gelatin, and the like. In addition to simple excipients, lubricants such as magnesium stearate and talc may also be used. Examples of the liquid preparation for oral use include suspensions, solutions, emulsions, syrups and the like. In addition to water and liquid paraffin which are commonly used simple diluents, various excipients such as wetting agents, sweeteners, fragrances and preservatives . Formulations for parenteral administration include sterile aqueous solutions, non-aqueous solutions, suspensions, emulsions, freeze-dried preparations and suppositories. Examples of the suspending agent include propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oil such as olive oil, injectable ester such as ethyl oleate, and the like. Examples of the suppository base include witepsol, macrogol, tween 61, cacao paper, laurin, glycerogelatin and the like.

본 발명에 따른 약학 조성물의 투여 경로는 이들로 한정되는 것은 아니지만 구강, 정맥내, 근육내, 동맥내, 골수내, 경막내, 심장내, 경피, 피하, 복강내, 비강내, 장관, 국소, 설하 또는 직장이 포함된다. 경구 또는 비경구 투하가 바람직하다. 본 발명에서 사용된 용어 "비경구"는 피하, 피내, 정맥내, 근육내, 관절내, 활액낭내, 흉골내, 경막내, 병소내 및 두개골내 주사 또는 주입기술을 포함한다. 본 발명의 약학 조성물은 또한 직장 투여를 위한 좌제의 형태로 투여될 수 있다. The route of administration of the pharmaceutical compositions according to the present invention may be, but is not limited to, oral, intravenous, intramuscular, intraarterial, intramedullary, intrathecal, intracardiac, transdermal, subcutaneous, intraperitoneal, intranasal, Sublingual or rectal. Oral or parenteral administration is preferred. The term "parenteral" as used herein includes subcutaneous, intradermal, intravenous, intramuscular, intraarticular, intrasynovial, intrasternal, intrathecal, intralesional and intracranial injection or infusion techniques. The pharmaceutical compositions of the present invention may also be administered in the form of suppositories for rectal administration.

본 발명의 약학 조성물은 사용된 특정 유효성분의 활성, 연령, 체중, 일반적인 건강, 성별, 정식, 투여시간, 투여경로, 배출율, 약물 배합 및 예방 또는 치료될 특정 질환의 중증을 포함한 여러 요인에 따라 다양하게 변할 수 있고, 상기 약학 조성물의 투여량은 환자의 상태, 체중, 질병의 정도, 약물 형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있고, 1일 0.0001 내지 50 mg/kg 또는 0.001 내지 50 mg/kg으로 투여할 수 있다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다. 본 발명에 따른 약학적 조성물은 환제, 당의정, 캡슐, 액제, 겔, 시럽, 슬러리, 현탁제로 제형될 수 있다.The pharmaceutical composition of the present invention may be administered orally or parenterally depending on various factors including the activity, age, weight, general health, sex, diet, time of administration, route of administration, rate of excretion, drug combination and the severity of the particular disease to be prevented or treated, And the dose of the pharmaceutical composition may be appropriately selected by a person skilled in the art depending on the condition of the patient, the body weight, the degree of disease, the type of drug, the route of administration and the period of time, and is preferably from 0.0001 to 50 mg / kg or 0.001 to 50 mg / kg. The administration may be carried out once a day or divided into several times. The dose is not intended to limit the scope of the invention in any way. The pharmaceutical compositions according to the present invention can be formulated into pills, dragees, capsules, solutions, gels, syrups, slurries, suspensions.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples. These examples are for further illustrating the present invention, and the scope of the present invention is not limited to these examples.

<실시예 1> &Lt; Example 1 >

재료 및 실험방법Materials and Experimental Methods

(1) 줄기세포(1) stem cells

본 발명의 실시예에서 사용한 줄기세포는 다음과 같다. 양수줄기세포(AFSC), 신경줄기세포(NSC) 및 희소돌기교전구세포(OPC)는 충북대학교(CBNU)에서 기존에 확립한 줄기세포주로서 각각 CBNU-AFSC, CBNU-NSC 및 CBNU-NSC.olig2 세포주를 사용하였고, 양막줄기세포(AMSC), 태반줄기세포(PSC) 및 제대혈줄기세포(UCBSC)는 정상적인 출산 후 기관윤리위원회의(Institutional Review Board, IRB) 심의를 거쳐 본인의 동의서를 받아 채취한 것을 사용하였고, 지방줄기세포(ASC)는 53세의 정상인 여성으로부터 복부 지방흡입술을 통해 기관윤리위원회 심의를 거쳐 본인의 동의서를 받아 채취한 것을 사용하였다.The stem cells used in the examples of the present invention are as follows. (AFSC), neural stem cells (NSC), and rare proliferative progenitor cells (OPC) were established in Chungbuk National University (CBNU) as CBNU-AFSC, CBNU-NSC and CBNU-NSC.olig2 cell lines (AMSC), placental stem cell (PSC), and cord blood stem cell (UCBSC) were obtained from the Institutional Review Board (IRB) (ASC) was obtained from a 53 - year - old normal woman through abdominal liposuction, after reviewing the Institutional Ethics Committee and obtaining his consent.

(2) 줄기세포 배양 및 (2) Stem cell culture and 엑소좀Exosome 풍부 배양액의 채취 Collection of abundant culture

줄기세포(1 x 10⁶ 세포/mL)를 DMEM 배지를 이용하여 5% 이산화탄소(CO₂) 공급 배양기에서 37℃의 온도로 24시간 동안 배양하였다. 이후 줄기세포로부터 엑소좀이 풍부하게 함유된 배양액(ERCM)을 수득하기 위해, 상기 배양 배지에 TNF-α를 50 ng/mL의 농도로 첨가하고 산소 농도를 5%로 낮춘 후, 24시간 동안 배양한 다음, 배양액을 채취하여 필터로 거른 후 저온에서 10배 농축하여 본 발명에 따른 엑소좀 풍부 배양액을 수득하였다. 이때 대조군인 일반 배양액(CM) 수득을 위해 상기 실험에 사용한 동일 줄기세포를 대상으로 세포 배양을 37℃의 온도에서 산소(O₂) 농도를 21%가 유지된 상태로 24시간 배양 후 배양액을 채취하여 필터로 거른 후 저온에서 10배 농축하였다.Stem cells (1 × 10 ⁶ cells / mL) were cultured in DMEM medium at 37 ° C. for 24 hours in a 5% carbon dioxide (CO ₂ ) feeding incubator. In order to obtain a culture medium (ERCM) rich in exosomes from stem cells, TNF-α was added to the culture medium at a concentration of 50 ng / mL, the oxygen concentration was lowered to 5%, and cultured for 24 hours Then, the culture solution was sampled, filtered, and concentrated 10 times at a low temperature to obtain an exosome rich culture solution according to the present invention. At this time, in order to obtain a normal culture medium (CM) as a control, the same stem cells used in the above experiment were cultured for 24 hours at a temperature of 37 ° C. maintained at an oxygen (O ₂ ) concentration of 21% Filtered, and concentrated 10 times at low temperature.

(3) β-(3) β- HexosaminidaseHexosaminidase 분비 억제효능 분석 Secretion inhibition efficacy analysis

비만세포 과립 분비를 과립의 지표인 β-hexosaminidase를 분석하여 측정하였다. 이를 위해, 비만세포주인 RBL-2H3 세포를 48-웰 플레이트에 2.5×10⁵cells/well수로 분주하고, 12시간 동안 1 μg/mL의 IgE를 처리한 후 HEPES 버퍼로 4회 세척하였다. 이후 배양세포에 시험물질인 상기(2)의 방법으로 수득한 대조군 줄기세포 배양액(CM) 및 본 발명에 따른 엑소좀 풍부 줄기세포 배양액(ERCM)의 10배 농축액을 각각 1%가 되도록 첨가하고, 이어 0.1% BSA 함유 extracellular buffer에 희석한 DNP-BSA (400 ng/mL)를 처리하고 37^oC에서 1시간 동안 배양하였다. 이후 상층액을 수득하고 50 μL의 상층액에 200 μL의 1 mM p-nitrophenyl N-acetyl-beta-D-glucosamine를 첨가하여 37^oC에서 3시간 반응시켰고, 500 μL의 0.05 M sodium carbonate buffer를 첨가하여 효소반응을 정지시킨 후, 405 nm에서 흡광도로 β-hexosaminidase의 분비량을 측정하였다.Mast cell granule secretion was measured by analyzing β-hexosaminidase, an indicator of granule. For this purpose, RBL-2H3 cells were plated in a 48-well plate at 2.5 × 10 ⁵ cells / well and treated with 1 μg / mL IgE for 12 hours and then washed four times with HEPES buffer. Then, the control stem cell culture (CM) obtained by the method of (2), which is the test substance, and the 10-fold concentrated solution of the exosome-rich stem cell culture solution (ERCM) DNP-BSA (400 ng / mL) diluted in 0.1% BSA-containing extracellular buffer was treated and incubated at 37 ^° C for 1 hour. After the supernatant was obtained, 200 μL of 1 mM p- nitrophenyl N- acetyl-beta-D-glucosamine was added to 50 μL of the supernatant and reacted at 37 ^° C for 3 hours. 500 μL of 0.05 M sodium carbonate buffer After the enzyme reaction was stopped, the secretion of β-hexosaminidase was measured at 405 nm with absorbance.

(4) 아토피 피부염 개선효능 평가(4) Assessment of improvement efficacy of atopic dermatitis

a) 실험동물 준비a) Preparation of experimental animals

암컷 ICR 마우스(6주령, 25-30 g)를 코아텍(경기도 평택)으로부터 공급받아 약 1주간 실험실 순화과정을 거친 후 사용하였다. 동물을 마우스용 케이지에 5마리씩 수용하고, 동물실험실의 환경을 온도 23±2℃, 상대습도 55±10%, 환기횟수 12 회/시간, 조명주기 12시간(07:00-19:00), 조도 150-300 lux로 조절하였다. 실험동물용 펠렛형 고형사료인 Purina Rat Chow^®를 바이오피아(경기도 군포)로부터 공급받아 급여하였으며, 음수는 멸균정제수를 자유롭게 섭취하도록 하였다. 본 실험은 충북대학교 실험동물연구지원센터의 동물실험윤리위원회(Institutional Animal Care and Use Committee, IACUC)의 승인 하에 동 기관의 표준작업지침서(Standard Operation Procedures, SOP)에 따라 수행되었다.Female ICR mice (6 weeks old, 25-30 g) were supplied from Koatech (Pyeongtaek, Gyeonggi Province) and used for about 1 week after laboratory purification. Animals were housed in a mouse cage in an amount of 5 animals per animal, and the environment of the animal laboratory was maintained at a temperature of 23 ± 2 ° C, a relative humidity of 55 ± 10%, a ventilation frequency of 12 times / hour, a lighting cycle of 12 hours (07:00 to 19:00) The illumination was adjusted to 150-300 lux. Purina Rat Chow ^® , a pelleted solid feed for laboratory animals, was supplied and received from Biopia (Gyeonggi Province Gunpo), and the drinking water was fed free of sterile purified water. This study was carried out in accordance with the Standard Operation Procedures (SOP) of the Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) of Chungbuk National University.

b) Compound 48/80 유도 전신성 b) Compound 48/80 Induced Systemic 아나필락시스Anaphylaxis 쇼크 억제효능 분석 Shock suppression efficacy analysis

마우스에 시험물질인 상기(2)의 방법으로 수득한 대조군 줄기세포 배양액(CM) 및 본 발명에 따른 엑소좀 풍부 줄기세포 배양액(ERCM)의 10배 농축액(0.1 mL/mouse)을 각각 복강 내로 주사하고, 30분 후 비만세포 탈과립인자(mast cell degranulator)인 Compound 48/80 (8 mg/kg)를 복강 내로 주사하였다. 1시간 동안 전신적인 아나필락시스 쇼크 반응에 따른 동물의 사망률을 기록하였다.Mice were injected intraperitoneally with the control stem cell culture (CM) obtained by the method of (2) above and the 10-fold concentrated solution (0.1 mL / mouse) of the exosome-rich stem cell culture solution (ERCM) And 30 minutes later Compound 48/80 (8 mg / kg), a mast cell degranulator, was injected intraperitoneally. The mortality rate of the animals according to the systemic anaphylactic shock reaction for 1 hour was recorded.

c) 히스타민 유도 가려움증 및 피부출혈 억제효능 분석c) Histamine induced itching and skin bleeding inhibition efficacy analysis

마우스의 등 부위를 제모하고, 상기(2)의 방법으로 수득한 대조군 줄기세포 배양액(CM) 및 본 발명에 따른 엑소좀 풍부 줄기세포 배양액(ERCM)의 10배 농축액(50 μL)과 동량(50 μL)의 histamine dihydrochloride (0.5 μg/site) 혼합액을 피하로 각각 주사하고, 이어 0.25 mL의 Evan’s blue 용액(0.5%)을 혈관 내로 주사하였다. 30분 동안 가려움증으로 인해 뒷발로 긁는 횟수(scratching behavior)를 측정하였다. 가려움증 측정 후 피부를 절제하여 Evan’s blue를 formamide로 추출하여 혈관 누출량을 측정하였다.The mice were sacrificed and the same amount (50 μL) of the control stem cell culture solution (CM) obtained by the method of the above (2) and the 10-fold concentrated solution of the exosome-rich stem cell culture solution (ERCM) μL of histamine dihydrochloride (0.5 μg / site) was injected subcutaneously, and 0.25 mL of Evan's blue solution (0.5%) was injected intravascularly. Scratching behavior was measured for 30 minutes due to itching. After the itching was measured, the skin was excised and Evan's blue was extracted with formamide to measure the blood vessel leakage.

d) 만성 아토피 유발 및 시험물질 투여d) Chronic atopic induction and test substance administration

마우스에 10 μg ovalbumin/4 mg aluminum hydroxide (OVA/alum in 200 μL saline)를 1주일 간격으로 총 3회(0, 7 및 14일) 복강 내로 투여함으로써 감작을 유도하였다. 마지막 감작 7일 후(21일) 대조군 줄기세포 배양액 및 본 발명의 엑소좀 풍부 배양액(ERCM)의 10배 농축액(100 μL)과 동량(100 μL)의 OVA (100 μg)를 sterile gauze patch (1.5 x 1.5 cm)에 점적하여 제모한 마우스의 등에 각각 적용하고 transparent dressing을 이용하여 고정하였다. Patch는 2일에 한 번씩 교체하였으며 총 14일(21~35일) 동안 유지하였다.Sensitization was induced by intraperitoneal administration of 10 μg ovalbumin / 4 mg aluminum hydroxide (OVA / alum in 200 μL saline) to the mice three times a week (0, 7 and 14 days) (100 μg) and the same volume (100 μL) of the 10-fold concentrated (100 μL) of the exosome-rich culture medium (ERCM) of the present invention were applied to a sterile gauze patch x 1.5 cm), and fixed with a transparent dressing. Patches were replaced every two days and maintained for a total of 14 days (21-35 days).

e) 피부병변의 평가e) Assessment of skin lesions

피부병변은 patch를 제거하고 24시간 후 다음의 지표에 따라 점수화하였다. 증상(symptoms): 0, 무증상(no sign); 1, 발적 및 출혈(erythema & hemorrhage); 2, 부종(edema); 3, 찰과장 및 미란(excoriation & erosion); 4, 건조(dryness). 정도(score): 0, 무증상(no sign); 1, 미약(mild); 2, 중등도(moderate); 3, 심함(severe). 각각의 증상에 대한 score의 합을 개체별 dermatitis score로 하였다.Skin lesions were scored according to the following index after 24 hours of patch removal. Symptoms: 0, no sign; 1, erythema &hemorrhage; 2, edema; 3, excoriation &erosion; 4, dryness. Score: 0, no sign; 1, mild; 2, moderate; 3, severe. The sum of scores for each symptom was defined as the individual dermatitis score.

f) 조직병리학적 평가f) Histopathological evaluation

부검 시 피부 병변부위의 일부를 채취하여 Bouin's solution에 고정한 후 paraffin 절편을 만들어 hematoxylin & eosin (H&E)으로 염색하였다. 광학현미경을 이용하여 염증세포의 침윤정도를 평가하였다. Epidermal hyperplasia를 평가하기 위해 epidermal thickness를 Image analysis software program (ImagePartner, Seoul, Korea)을 이용하여 측정하였다. 또 비만세포의 침윤정도를 평가하기 위해 조직절편을 acidic toluidine blue (pH 4.0)로 염색하고, 1,000 배율 하에서 20개 시야의 비만세포를 계수하였다.During autopsy, a portion of the skin lesion was harvested, fixed in Bouin's solution, and paraffin sections were stained with hematoxylin and eosin (H & E). The degree of infiltration of inflammatory cells was evaluated using an optical microscope. Epidermal thickness was measured using an image analysis software program (ImagePartner, Seoul, Korea) to evaluate epidermal hyperplasia. To evaluate the extent of mast cell infiltration, tissue sections were stained with acidic toluidine blue (pH 4.0) and mast cells in 20 fields were counted under 1,000 magnification.

g) 혈청 total g) serum total IgEIgE , IL4 및 히스타민 농도 측정, IL4 and histamine concentrations

부검 시 복대정맥으로부터 채혈한 혈액을 3,000 rpm으로 20분간 원심분리하여 혈청을 얻었다. 혈청 내 total IgE는 mouse IgE ELISA kit (Immunology Consultant Laboratory, Inc., Newberg, USA)로, interleukin-4 (IL4)는 mouse IL4 ELISA kit (Koma Biotechnology, Inc., Seoul, Korea)로, 그리고 히스타민 농도를 histamine ELISA kit (Labor Diagnostika Nord GmbH & Co. KG, Eichenhain, Germany)을 이용하여 분석하였다.Blood collected from the abdominal vein at the time of autopsy was centrifuged at 3,000 rpm for 20 minutes to obtain serum. (IL4) was measured by mouse IL4 ELISA kit (Koma Biotechnology, Inc., Seoul, Korea) and histamine concentration was measured using a mouse IgE ELISA kit (Immunology Consultant Laboratory, Inc., Newberg, USA) Were analyzed by histamine ELISA kit (Labor Diagnostika Nord GmbH & Co. KG, Eichenhain, Germany).

(5) 피부주름 개선효능 평가(5) Evaluation of skin wrinkle improving efficacy

피부 주름 개선효능은 콜라겐을 분해하여 소멸시키는 콜라게나제(collagenase) 효소 중의 하나인 MMP-1(matrix metalloproteinase-1)에 대한 억제효능으로 평가하였다. Bovine tendon collagen (25 mg)을 0.05 M tris(hydroxymethyl)-methyl-2-aminoethane sulfonate (TES) 버퍼에 녹인 후 37℃에서 15분간 정치시켰다. 이어 콜라게나제 타입-1과 시험물질인 대조군 줄기세포 배양액(CM) 및 본 발명의 엑소좀 풍부 배양액(ERCM) 10배 농축액의 1%를 첨가한 뒤 5시간 동안 추가 반응시켰다. 반응액 0.2 mL를 취하여 1 mL의 A buffer [4% ninhydrin in Methyl Cellosolve^® (2-methoxyethanol) + 0.2 M sodium citrate with 0.71 mM stannous chloride, pH 0.5]에 첨가하였다. 20분간 끓인 뒤 n-propanol을 첨가하고, 15분간 정치한 후 600 nm에서 흡광도로 효소의 활성도를 측정하였다.The skin wrinkle-reducing effect was evaluated by the inhibitory effect on MMP-1 (matrix metalloproteinase-1), one of the collagenase enzymes that decompose and extinguish collagen. Bovine tendon collagen (25 mg) was dissolved in 0.05 M tris (hydroxymethyl) -methyl-2-aminoethane sulfonate (TES) buffer and allowed to stand at 37 ° C for 15 minutes. Then, collagenase type 1, a control stem cell culture medium (CM) as a test substance, and 1% of a 10-fold concentration of an exosome-rich culture medium (ERCM) of the present invention were added, followed by further reaction for 5 hours. Taking a 0.2 mL reaction mixture was added to 1 mL of the A buffer [4% ninhydrin in Methyl Cellosolve ® (2-methoxyethanol) + 0.2 M sodium citrate with 0.71 mM stannous chloride, pH 0.5]. After boiling for 20 minutes, n-propanol was added, and the enzyme activity was measured by absorbance at 600 nm after standing for 15 minutes.

(6) 피부 (6) Skin 미백효능Whitening efficacy 평가 evaluation

a) a) 티로시나제Tyrosinase 억제효능 Inhibitory efficacy

티로신(tyrosine)으로부터 멜라닌(melanin)의 생산에 관여하는 효소인 티로시나제에 대한 줄기세포 배양액의 억제효능을 평가하였다. 시험관에 0.1 M phosphate-buffered saline (PBS), 시험물질인 줄기세포 CM 및 ERCM 10배 농축액의 1% 및 mushroom tyrosinase (1,500~2,000 U/mL)를 순서대로 넣고, 이 용액에 1.5 mM tyrosine 용액을 첨가한 후, 37℃에서 15분 동안 반응시켰다. ELISA reader를 이용하여 490 nm에서 흡광도로 효소의 활성도를 측정하였다.The inhibitory effect of tyrosinase, an enzyme involved in the production of melanin, from stem cells was evaluated. To the test tube, add 0.1 M phosphate-buffered saline (PBS), 1% of stem cell CM and ERCM 10-fold concentrate and mushroom tyrosinase (1,500 ~ 2,000 U / mL) After the addition, the reaction was allowed to proceed at 37 DEG C for 15 minutes. Enzyme activity was measured by absorbance at 490 nm using an ELISA reader.

b) 세포 내 멜라닌 생산 억제효능b) Efficacy of inhibiting intracellular melanin production

Murine melanoma B16 F10 세포를 10% fetal bovine serum (FBS)이 함유된 DMEM 배지로 6-well plate에 1×10⁵ cells/well로 접종한 후 37℃에서 세포가 well 바닥에 약 80% 이상 부착될 때까지 배양하였다. 배지를 제거하고 시험물질인 대조군 줄기세포 배양액(CM) 및 본 발명의 엑소좀 풍부 배양액(ERCM) 10배 농축액의 1%가 함유된 DMEM 배지로 교체한 후 72시간 동안 추가로 배양하였다. 배지를 제거한 세포를 PBS로 세척하고, 트립신으로 처리하여 세포를 회수하였다. Hemacytometer를 이용하여 세포수를 측정한 후 10,000 rpm으로 10분간 원심분리한 다음 상등액을 제거하여 pellet을 확보하였다. 세포 pellet을 60℃에서 건조한 후 10% dimetyl sulfoxide (DMSO)가 함유된 1 M NaOH 용액(100 μL)을 melanin을 용출시켰다. Microplate reader로 490 nm에서 흡광도를 측정하여 세포수당 melanin의 양을 구하였다.Murine melanoma B16 F10 cells were inoculated in DMEM medium containing 10% fetal bovine serum (FBS) at a concentration of 1 × 10 ⁵ cells / well in a 6-well plate. Lt; / RTI > The medium was removed and replaced with DMEM containing 1% of the control stem cell culture medium (CM) and the 10-fold concentrated exo-rich medium (ERCM) of the present invention, followed by further culturing for 72 hours. Cells from which the medium had been removed were washed with PBS and treated with trypsin to recover the cells. The cells were counted using a hematoxeter, centrifuged at 10,000 rpm for 10 minutes, and the supernatant was removed to obtain a pellet. The cell pellet was dried at 60 ° C and melanin was eluted with 1 M NaOH solution (100 μL) containing 10% dimethyl sulfoxide (DMSO). Absorbance was measured at 490 nm using a microplate reader to determine the amount of melanin per cell.

(7) 통계학적 분석(7) Statistical analysis

상기 실험에서 수행한 모든 시험결과는 mean±SEM으로 표시하였고, 집단 간 차이는 oneway analysis of variance (ANOVA) (SPSS 12.0 version)을 이용하여 분석하였으며 P value<0.05 미만일 때 통계학적으로 유의성이 있다고 판단하였다.All test results were expressed as mean ± SEM, and the difference between groups was analyzed using an analysis of variance (ANOVA) (SPSS 12.0 version). When P <0.05 was considered statistically significant Respectively.

<실시예 2> &Lt; Example 2 >

본 발명에 따른 엑소좀 풍부 줄기세포 배양액의 IgE에 의한 β-hexosaminidase 유리 억제효과 분석Inhibitory effect of β-hexosaminidase inhibition by IgE on exosome-rich stem cell culture according to the present invention

비만세포주인 RBL-2H3 세포를 IgE (1 μg/mL)로 감작시켰을 때 분비되는 βhexosaminidase에 대해, 양수줄기세포(AFSC), 양막줄기세포(AMSC), 태반줄기세포(PSC), 제대혈줄기세포(UCBSC), 신경줄기세포(NSC), 희소돌기교전구세포(OPC) 또는 지방줄기세포(ASC)로부터 수득한 대조군 줄기세포 배양액(CM)을 10배 농축액의 1% 양으로 RBL-2H3 세포에 처리한 결과, 상기 줄기세포 종류에 대해 각각 31.2%, 30.7%, 23.3%, 26.6%, 34.2%, 38.8% 및 19.5%의 억제효과를 나타내었다. 즉, 희소돌기교전구세포 > 신경줄기세포 > 양수줄기세포 > 양막줄기세포 > 제대혈줄기세포 > 태반줄기세포 > 지방줄기세포의 순으로 효과적인 것으로 나타났다. 이에 비해 본 발명의 방법으로 수득한 엑소좀 풍부 줄기세포 배양액 농축액(ERCM)을 처리한 경우는 양수줄기세포, 양막줄기세포, 태반줄기세포, 제대혈줄기세포, 신경줄기세포, 희소돌기교전구세포 및 지방줄기세포에서 각각 60.5%, 59.2%, 45.7%, 51.3%, 62.4%, 65.8% 및 39.3%의 억제효과를 나타냄에 따라 대조군에 비해 월등히 우수한 비만세포 분비 억제효능을 보여 주었으며, 이러한 효능은 희소돌기교전구세포 > 신경줄기세포 > 양수줄기세포 ≥ 양막줄기세포 > 제대혈줄기세포 > 태반줄기세포 > 지방줄기세포의 순으로 나타났다(하기 표 1 참조).(AFSC), amniotic stromal cell (AMSC), placental stem cell (PSC), cord blood stem cell (AMSC), and cord blood stem cell (RBC) (CM) obtained from UCBSC, NSC, OPC, or ASC was treated with 1% of 10-fold concentrated RBL-2H3 cells As a result, the inhibitory effect was 31.2%, 30.7%, 23.3%, 26.6%, 34.2%, 38.8% and 19.5%, respectively, on the stem cell types. In other words, it was found that squamous cell progenitor cells> neural stem cells> amniotic stem cells> amniotic stem cells> cord blood stem cells> placental stem cells> fat stem cells were effective in that order. In contrast, when treated with the exo-rich stem cell culture concentrate (ERCM) obtained by the method of the present invention, amniotic stem cells, amniotic stem cells, placental stem cells, cord blood stem cells, neural stem cells, The inhibitory effect was 60.5%, 59.2%, 45.7%, 51.3%, 62.4%, 65.8% and 39.3%, respectively, in the stem cells, and showed superior mast cell secretion inhibitory effect than the control group. Amniotic stem cells> amniotic stem cells> cord blood stem cells> placental stem cells> adipose stem cells (see Table 1 below).

<< 실시예Example 3> 3>

본 발명에 따른 엑소좀 풍부 줄기세포 배양액의 전신성 아나필락시스 쇼크반응 억제효과 분석Inhibition of systemic anaphylactic shock response of exosome-rich stem cell culture according to the present invention

RBL-2H3 세포에서 탈과립 억제효과에 근거하여 동물에서의 전신성 아나필락시스 쇼크반응 억제효능을 평가하였다. 비만세포 탈과립 인자로 알려진 compound 48/80를 8 mg/kg의 용량으로 복강 내로 투여했을 때 모든 동물이 쇼크로 사망하였는데, 본 발명의 엑소좀 풍부 줄기세포 배양액에 대한 동물 쇼크 사망 정도를 분석하였다.The inhibitory effect of systemic anaphylactic shock reaction in animals was evaluated based on the degranulation inhibitory effect in RBL-2H3 cells. All animals died of shock when compound 48/80, a known mast cell degranulation factor, was administered intraperitoneally at a dose of 8 mg / kg, and the degree of animal shock death of the exosome-rich stem cell culture of the present invention was analyzed.

그 결과, 상기 표 2에 나타낸 바와 같이, 양수줄기세포, 양막줄기세포, 태반줄기세포, 제대혈줄기세포, 신경줄기세포, 희소돌기교전구세포 또는 지방줄기세포의 대조군 배양액(CM)의 10배 농축액을 0.1 mL/mouse의 용량으로 사전에 투여했을 때에는 각각 50%, 50%, 66.7%, 66.7%, 50%, 33.3% 및 66.7%의 동물이 사망하여 희소돌기교전구세포 > 양수줄기세포 = 양막줄기세포 = 신경줄기세포 > 태반줄기세포 = 제대혈줄기세포 > 지방줄기세포의 순으로 동물쇼크 사망정도를 억제하는 것으로 나타났다. 그러나 본 발명의 엑소좀 풍부 줄기세포 배양액의 농축액을 투여했을 때에는 희소돌기교전구세포에서는 모든 동물이 생존하였고, 양수줄기세포, 양막줄기세포, 태반줄기세포, 제대혈줄기세포, 신경줄기세포 및 지방줄기세포에서는 16.7%만이 사망하여 본 발명의 엑소좀풍부 배양액이 대조군 배양액에 비해 전신성 아나필락시스 쇼크 반응을 억제하는 활성이 있음을 알 수 있었다.As a result, as shown in Table 2, a 10-fold concentrated solution (CM) of amniotic fluid stem cells, amniotic stem cells, placental stem cells, cord blood stem cells, neural stem cells, rare progenitor precursor cells or adipose stem cells 50%, 66.7%, 66.7%, 50%, 33.3% and 66.7% of the animals died when the mice were pre-administered at a dose of 0.1 mL / mouse. Cellular neural stem cells> placental stem cells = umbilical cord blood stem cells> fat stem cells in the order of animal shock death was suppressed. However, when the concentrate of the exosome-rich stem cell culture solution of the present invention was administered, all animals survived in the rare proliferating progenitor cells, and amniotic stem cells, amniotic stem cells, placental stem cells, cord blood stem cells, neural stem cells, , It was found that the exosome rich culture medium of the present invention had an activity of suppressing the systemic anaphylactic shock reaction as compared with the control culture medium.

<실시예 4> <Example 4>

본 발명의 엑소좀 풍부 줄기세포 배양액에 대한 히스타민 유도 가려움증 개선효과 분석Analysis of histamine-induced itching improvement effect of the exosome-rich stem cell culture of the present invention

나아가 본 발명자들은 히스타민(histamine)으로 유도된 가려움증에 대한 줄기세포 배양액의 완화효과를 평가하였다. 컨트롤 군으로서 히스타민(0.5 μg/site)을 마우스의 피하로 주사했을 때 30분간 평균 75회의 긁는 횟수를 나타냈으며, 이러한 가려움증에 대해 대조군 줄기세포 배양액 및 본 발명의 엑소좀 풍부 줄기세포 배양액을 각각 처리할 경우, 가려움 개선 정도를 분석하였다.Furthermore, the inventors evaluated the mitigation effect of stem cell culture medium on histamine-induced itching. As a control group, when histamine (0.5 μg / site) was injected subcutaneously in the mouse, the number of scratches was 75 times on average for 30 minutes. The control stem cell culture solution and the exosome-rich stem cell culture solution of the present invention were treated , The degree of itching improvement was analyzed.

분석 결과, 도 1에 나타낸 바와 같이, 양수줄기세포, 양막줄기세포, 태반줄기세포, 제대혈줄기세포, 신경줄기세포, 소돌기교전구세포 또는 지방줄기세포의 대조군 줄기세포 배양액(CM)의 10배 농축액(50 μL)을 투여했을 때는 긁는 횟수가 각각 46회, 51회, 63회, 61회, 43회, 39회 및 65회로 줄어들어 희소돌기교전구세포 > 신경줄기세포 > 양수줄기세포 > 양막줄기세포 > 제대혈줄기세포 > 태반줄기세포 > 지방줄기세포의 순으로 효과를 보였지만, 본 발명의 엑소좀 풍부 줄기세포 배양액의 농축액을 투여했을 때에는 양수줄기세포, 양막줄기세포, 태반줄기세포, 제대혈줄기세포, 신경줄기세포, 희소돌기교전구세포 및 지방줄기세포에서 각각 15회, 22회, 35회, 29회, 17회, 12회 및 38회로 가려움 증상이 현저하게 감소된 것으로 나타났고, 이러한 개선 정도는 대조군 줄기세포 배양액을 처리하였을 때보다 월등히 감소된 숫자이다. 또한 본 발명의 엑소좀 줄기세포 배양액 처리에 따른 가려움증 개선 정도는 희소돌기교전구세포 > 양수줄기세포 > 신경줄기세포 > 양막줄기세포 > 제대혈줄기세포 > 태반줄기세포 > 지방줄기세포의 순으로 나타났다.As a result of the analysis, as shown in Fig. 1, a 10-fold concentration of a control stem cell culture (CM) of amniotic fluid stem cells, amniotic stem cells, placental stem cells, cord blood stem cells, neural stem cells, 50 μL), the number of scratches decreased 46 times, 51 times, 63 times, 61 times, 43 times, 39 times and 65 times, respectively. Rarely proliferating progenitor cells> neural stem cells> amniotic stem cells> amniotic stem cells> cord blood Stem cells, placental stem cells, and adipose stem cells. However, when the concentrate of the exo-somatic stem cell culture medium of the present invention was administered, amniotic stem cells, amniotic stem cells, placental stem cells, cord blood stem cells, , 15 times, 22 times, 35 times, 29 times, 17 times, 12 times, and 38 times in the rare proliferative progenitor cells and adipose stem cells, respectively, Is a significantly reduced number than was treated for cell culture. In addition, the degree of itching improvement according to the treatment of exosomal stem cell cultures of the present invention was in the order of rare proliferating progenitor cells> amniotic stem cells> neural stem cells> amniotic stem cells> cord blood stem cells> placental stem cells> adipose stem cells.

<실시예 5> &Lt; Example 5 >

본 발명의 엑소좀 풍부 줄기세포 배양액에 대한 히스타민으로 유도된 피부 출혈반응 개선효과 분석Analysis of histamine-induced skin hemorrhagic response improvement effect of the exosome-rich stem cell culture of the present invention

히스타민으로 가려움증이 유발된 마우스 피부에서 본 발명의 엑소좀 풍부 줄기세포 배양액이 피부 출혈반응을 억제하는 효과가 있는지를 Evan’s blue 누출량으로 정량하여 분석하였다.Evan's blue leakage amount was used to analyze whether the exosome-rich stem cell culture medium of the present invention had an inhibitory effect on skin bleeding reaction in mouse skin in which histamine-induced itching was induced.

그 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, 히스타민만을 투여한 경우 3.04 μg/site의 Evan’s blue가 누출되었는데, 양수줄기세포, 양막줄기세포, 태반줄기세포, 제대혈줄기세포, 신경줄기세포, 희소돌기교전구세포 또는 지방줄기세포로부터 수득한 대조군 배양액의 농축액(10배 농축)을 투여했을 때는 누출량이 각각 2.20, 2.01, 2.53, 2.72, 2.10, 1.81 및 2.76 μg/site로 줄어든 것으로 나타났고, 희소돌기교전구세포 > 양막줄기세포 > 신경줄기세포 > 양수줄기세포 > 태반줄기세포 > 제대혈줄기세포 > 지방줄기세포의 순으로 효과적인 것으로 나타났다. As a result, as shown in FIG. 2, when histamine alone was administered, Evan's blue of 3.04 μg / site was leaked, indicating that amniotic stem cells, amniotic stem cells, placental stem cells, cord blood stem cells, neural stem cells, 2.01, 2.53, 2.72, 2.10, 1.81 and 2.76 μg / site, respectively, when the concentrate (10-fold concentration) of the control culture obtained from the adipose stem cells was administered. > Amniotic Stem Cells> Neural Stem Cells> Amniotic Stem Cells> Placental Stem Cells> Umbilical Cord Blood Stem Cells> Adipocyte Stem Cells.

한편, 본 발명의 엑소좀 풍부 줄기세포 배양액의 농축액을 투여했을 때는 양수줄기세포, 양막줄기세포, 태반줄기세포, 제대혈줄기세포, 신경줄기세포, 희소돌기교전구세포 및 지방줄기세포에서 각각 1.01, 0.85, 1.50, 1.40, 0.92, 0.83 및 1.62 μg/site로 줄어들어 대조군 배양액에 비해 훨씬 높은 출혈반응 억제효과를 보여 주었으며, 이러한 효능은 희소돌기교전구세포 ≥ 양막줄기세포 > 신경줄기세포 > 양수줄기세포 > 제대혈줄기세포 > 태반줄기세포 > 지방줄기세포의 순으로 나타났다.On the other hand, when the concentrate of the exosome-rich stem cell culture medium of the present invention was administered, it was 1.01 and 0.85 in amniotic stem cells, amniotic stem cells, placental stem cells, cord blood stem cells, neural stem cells, rare progenitor precursor cells, , 1.50, 1.40, 0.92, 0.83, and 1.62 μg / site, respectively, which showed a much higher hemorrhagic response inhibitory effect than that of the control culture medium. These efficacies were rare proliferating progenitor cells ≥ amniotic stem cells> neural stem cells> amniotic stem cells> Stem cells> placental stem cells> fat stem cells.

<실시예 6> &Lt; Example 6 >

아토피 피부염 완화 효과 분석Atopic dermatitis relieving effect analysis

난백알부민(Ovalbumin; OVA)으로 유발시킨 만성 아토피 피부염 마우스 동물 모델에서 홍반, 부종, 인설, 건조증상의 피부병변 정도를 dermatitis score로 평가하였고, 아토피 피부염 증상에 대한 본 발명의 엑소좀 풍부 줄기세포 배양액의 완화정도를 분석하였다.The degree of skin lesions on erythema, edema, sclerosis, and dryness was evaluated as dermatitis score in an animal model of chronic atopic dermatitis caused by ovalbumin (OVA), and the degree of dermatitis score was evaluated as a dermatitis score. The degree of mitigation was analyzed.

그 결과, 아토피 피부염 발생에 따른 증상은 dermatitis score로 3.88점에 달하는 것으로 나타났으며, 대조군 줄기세포 배양액을 피부 병변에 도포했을 때의 피부 병변은 각각 3.11, 2.87, 3.11, 3.65, 3.12, 2.83 및 3.71점으로 완화되었으며, 희소돌기교전구세포 > 양막줄기세포 > 양수줄기세포 = 태반줄기세포 = 신경줄기세포 > 제대혈줄기세포 > 지방줄기세포의 순인 것으로 나타났다. 하지만 희소돌기교전구세포 외에는 통계학적으로 유의한 효과를 보여 주지 못했다. As a result, symptoms associated with the development of atopic dermatitis were 3.88 points in dermatitis score. Skin lesions when applied to skin lesions of control stem cell cultures were 3.11, 2.87, 3.11, 3.65, 3.12, 2.83 3.71 points. Rare embryonic stem cells> amniotic stem cells> amniotic stem cells = placental stem cells = neural stem cells> umbilical cord blood stem cells> fat stem cells. However, it was not statistically significant except for the progenitor cells.

이에 비해 본 발명의 엑소좀 풍부 줄기세포 배양액 농축액을 도포했을 때는 양수줄기세포, 양막줄기세포, 태반줄기세포, 제대혈줄기세포, 신경줄기세포, 희소돌기교전구세포 및 지방줄기세포에서 각각 1.30, 1.10, 1.83, 1.72, 1.22, 1.13 및 1.97점으로 완화되어 대조군 배양액에 비해 훨씬 높은 피부병변 완화효과를 보여 주었으며, 이러한 효능은 양막줄기세포 = 희소돌기교전구세포 > 신경줄기세포 > 양수줄기세포 > 제대혈줄기세포 > 태반줄기세포 > 지방줄기세포의 순으로 나타났고, 모든 줄기세포의 종류로부터 수득한 엑소좀 풍부 줄기세포 배양액이 유의한 정도로 개선 효과를 보였다(도 3 참조). In contrast, when the exo-rich stem cell culture concentrate of the present invention was applied, it was found to be 1.30, 1.10, and 1.30 in amniotic stem cells, amniotic stem cells, placental stem cells, cord blood stem cells, neural stem cells, 1.83, 1.72, 1.22, 1.13, and 1.97 points, respectively, and showed a much higher skin lesion mitigation effect than the control culture medium. These effects are amniotic membrane stem cell = rare proliferative progenitor cell> neural stem cell> amniotic stem cell> cord blood stem cell > Placental stem cells> adipose stem cells, and the exosome-rich stem cell culture obtained from all types of stem cells showed a significant improvement (see FIG. 3).

<실시예 7> &Lt; Example 7 >

만성 아토피 피부염 모델에서 상피세포의 두께 완화 및 비만세포 침윤 억제효과 분석Mitigation of epithelial thickness and inhibition of mast cell infiltration in chronic atopic dermatitis model

난백알부민(OVA)으로 유발한 만성 아토피 피부에서 OVA 첩포 부위에 상피증식(epidermal hyperplasia)과 함께 진피(dermis)의 염증세포 침윤(inflammatory cell infiltration)이 확인되었다. 특히 톨루이딘 블루(toluidine blue)로 염색했을 때 dermis 조직 내에 많은 수의 비만세포가 분포하여 면역 과민반응이 확인되었다. In chronic atopic skin induced by ovalbumin (OVA), inflammatory cell infiltration of the dermis with epidermal hyperplasia was observed in the area of OVA patch. In particular, when stained with toluidine blue, a large number of mast cells were distributed in the dermis tissues and immunosuppression was confirmed.

한편, 알러지 반응에 대해 본 발명의 줄기세포 배양액 처리 시 증상 완화 효과가 있는지 확인한 결과, 하기 표 3에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 엑소좀 풍부 줄기세포 배양액 농축액의 피부 알러지반응 완화효과는 대조군 줄기세포 배양액에 비해 월등히 우수한 것으로 나타났고, 특히 상피세포 두께 완화는 희소돌기교전구세포 > 양수줄기세포 > 신경줄기세포 = 양막줄기세포 > 지방줄기세포 > 제대혈줄기세포 > 태반줄기세포의 순이 효과적인 것으로 나타났으며, 비만세포 침윤 억제효과는 희소돌기교전구세포 > 양수줄기세포 > 신경줄기세포 > 양막줄기세포 > 지방줄기세포 > 제대혈줄기세포 > 태반줄기세포의 순으로 효과적인 것으로 나타났다. As shown in Table 3, the skin allergic response effect of the concentrate of the exo-rich stem cell cultures of the present invention was evaluated in the case of control stem cells The results showed that epithelial cell thickness mitigation was more effective than that of cultured embryonic stem cells, but the epithelial cell thickness was more effective in the order of rare proliferating progenitor cells> amniotic stem cells> neural stem cells = amniotic stem cells> adipose stem cells> cord blood stem cells> placental stem cells , And mast cell infiltration inhibitory effect was shown to be effective in order of rare proliferating progenitor cells> amniotic stem cells> neural stem cells> amniotic stem cells> adipose stem cells> cord blood stem cells> placental stem cells.

<< 실시예Example 8> 8>

만성 아토피 피부염 모델에서 본 발명의 In a chronic atopic dermatitis model, 엑소좀Exosome 풍부 줄기세포 배양액 처리에 따른 혈청 내 Serum from Stem Cell Culture IgEIgE , 히스타민 및 인터루킨-4의 억제 효과 분석, Histamine and interleukin-4

만성 아토피 피부에서 난백알부민 감작 마우스의 혈청 내 총 IgE, 히스타민 및 IL-4 농도를 분석하였다. Total IgE, histamine and IL-4 concentrations in serum of the egg-sensitized mice of the albumin were examined in chronic atopic skin.

분석 결과, 본 발명의 엑소좀 풍부 줄기세포 배양액을 처리한 군이 대조군 줄기세포 배양액을 처리한 군에 비해 알러지 인자들인 혈청 내 총 IgE, 히스타민 및 IL-4를 유의적으로 억제하는 것으로 나타났으며, 특히 혈청 IgE 억제는 대조군 배양액에서는 유의미한 효과를 보이지 못했고 반면 본 발명의 엑소좀 풍부 배양액은 양수줄기세포 > 제대혈줄기세포 > 양막줄기세포 > 태반줄기세포 > 희소돌기교전구세포 > 신경줄기세포 > 지방줄기세포의 순으로 유의적인 효과를 나타내었다(도 4 참조). As a result of the analysis, the group treated with the exosome-rich stem cell culture of the present invention significantly inhibited the total IgE, histamine and IL-4 in allergy factors, compared to the group treated with the stem cell culture of the control group In particular, the serum IgE inhibition did not show a significant effect in the control culture medium, whereas the exosome-rich culture medium of the present invention was found to contain amniotic stem cells> cord blood stem cells> amniotic membrane stem cells> placental stem cells> rare proliferating progenitor cells> neural stem cells> (Fig. 4).

또한, 혈청 내 히스타민 분석 결과, 엑소좀 풍부 배양액은 양수줄기세포 > 제대혈줄기세포 > 양막줄기세포 > 태반줄기세포 > 희소돌기교전구세포 > 신경줄기세포 > 지방줄기세포의 순으로 효과적인 것으로 나타났다(도 5 참조).As a result of histamine analysis in the serum, the exosome-rich culture was found to be effective in the order of amniotic stem cells> cord blood stem cells> amniotic membrane stem cells> placental stem cells> rare progenitor precursor cells> neural stem cells> adipose stem cells Reference).

나아가, 혈청 내 IL-4 분석 결과, 엑소좀 풍부 배양액은 양수줄기세포 > 제대혈줄기세포 > 양막줄기세포 > 태반줄기세포 > 희소돌기교전구세포 > 신경줄기세포 > 지방줄기세포의 순으로 효과적이었다(도 6 참조).In addition, serum IL-4 analysis showed that exo-rich cells were effective in the order of amniotic stem cells> cord blood stem cells> amniotic stem cells> placental stem cells> spindle progenitor cells> neural stem cells> adipose stem cells 6).

이러한 결과를 통해 본 발명자들은 혈액 내 모든 알러지반응 지표들에 대해 본 발명의 엑소좀 풍부 줄기세포 배양액이 효과적으로 이들 지표물질들의 생성을 억제하여 아토피 피부염을 개선 및 치료할 수 있음을 알 수 있었다. From these results, the inventors of the present invention have found that the exo-somatic stem cell culture medium of the present invention effectively inhibits the production of these indicator substances and improves and treats atopic dermatitis against all the allergic response indicators in blood.

<실시예 9> &Lt; Example 9 >

본 발명의 엑소좀 풍부 줄기세포 배양액의 피부 주름 개선 효과 분석Analysis of skin wrinkle improvement effect of the exosome-rich stem cell culture of the present invention

콜라겐을 분해하여 피부주름의 원인을 제공하는 MMP-1의 활성에 대한 본 발명의 엑소좀 풍부 줄기세포 배양액의 억제효과를 분석하였다. The inhibitory effect of the exosome-rich stem cell culture liquid of the present invention on the activity of MMP-1, which degrades collagen and causes skin wrinkles, was analyzed.

분석 결과, 대조군 줄기세포 배양액은 양수줄기세포, 양막줄기세포, 태반줄기세포, 제대혈줄기세포, 신경줄기세포, 희소돌기교전구세포 및 지방줄기세포의 대조군 배양액에 의해 MMP-1의 활성이 각각 63.1%, 59.2%, 71.0%, 72.5%, 53.2%, 57.0% 및 62.1%로 감소되는 것으로 나타난 반면, 본 발명의 엑소좀 풍부 줄기세포 배양액에 의해서는 양수줄기세포, 양막줄기세포, 태반줄기세포, 제대혈줄기세포, 신경줄기세포, 희소돌기교전구세포 및 지방줄기세포에서 각각 33.2%, 29.1%, 43.3%, 48.0%, 26.2%, 25.3% 및 33.7%로 감소되어 대조군 배양액에 비해 월등히 우수한 MMP-1 억제활성을 나타내었다. 특히 이러한 효능은 희소돌기교전구세포 > 신경줄기세포 > 양막줄기세포 > 양수줄기세포 = 지방줄기세포 > 태반줄기세포 > 제대혈줄기세포의 순으로 나타났다(도 7 참조).As a result, the activity of MMP-1 in the control stem cell culture medium was 63.1% by the control culture medium of amniotic stem cell, amniotic stem cell, placental stem cell, cord blood stem cell, neural stem cell, rare progenitor precursor cell and adipose stem cell, , 59.2%, 71.0%, 72.5%, 53.2%, 57.0% and 62.1%, respectively, whereas the exo-somatic stem cell cultures of the present invention showed amniotic stem cells, amniotic stem cells, placental stem cells, The inhibition of MMP-1 inhibition was significantly higher than that of the control culture medium, which was decreased to 33.2%, 29.1%, 43.3%, 48.0%, 26.2%, 25.3% and 33.7% in stem cells, neural stem cells, rare progenitor precursor cells and adipose stem cells, Activity. Especially, these efficacies were in the order of rare proliferating progenitor cells> neural stem cells> amniotic stem cells> amniotic stem cells = adipose stem cells> placental stem cells> cord blood stem cells (refer to FIG. 7).

따라서 본 발명자는 본 발명의 엑소좀 풍부 줄기세포 배양액을 피부 주름 개선을 위한 화장료 조성물의 용도로 사용할 수 있음을 알 수 있었다.Therefore, the inventor of the present invention has found that the culture medium of exosome-rich stem cell of the present invention can be used as a cosmetic composition for improving skin wrinkles.

<실시예 10>&Lt; Example 10 >

본 발명의 엑소좀 풍부 줄기세포 배양액의 피부 미백효과 분석 The skin whitening effect analysis of the exosome-rich stem cell culture of the present invention

티로신(tyrosine)으로부터 멜라닌(melanin)의 생산에 관여하는 티로시나제의 활성 억제 효과를 측정하여, 본 발명의 엑소좀 풍부 줄기세포 배양액이 피부 미백 활성이 있는지의 여부를 분석하였다.The inhibitory effect of tyrosinase activity, which is involved in the production of melanin, from tyrosine was measured to determine whether the exosome-rich stem cell culture medium of the present invention had skin whitening activity.

그 결과, 양수줄기세포, 양막줄기세포, 태반줄기세포, 제대혈줄기세포, 신경줄기세포, 희소돌기교전구세포 및 지방줄기세포의 대조군 배양액은 각각 75.1%, 73.2%, 85.0%, 88.1%, 43.5%, 47.8% 및 69.0%로 티로시나제 활성이 감소되는 것으로 나타난 반면, 본 발명의 엑소좀 풍부 배양액은 양수줄기세포, 양막줄기세포, 태반줄기세포, 제대혈줄기세포, 신경줄기세포, 희소돌기교전구세포 및 지방줄기세포에서 각각 55.0%, 49.2%, 63.3%, 68.0%, 21.0%, 20.2% 및 42.3%로 감소되어 대조군 배양액에 비해 티로시나제 활성 억제효과가 월등히 우수한 것으로 나타났고, 특히 본 발명의 배양엑에 대한 피부 미백 효과(티로시나제 활성 억제효과)는 희소돌기교전구세포 ≥ 신경줄기세포 > 지방줄기세포 > 양막줄기세포 > 양수줄기세포 > 태반줄기세포 > 제대혈줄기세포의 순으로 나타났다(도 8 참조).As a result, the control cultures of amniotic stem cells, amniotic stem cells, placental stem cells, cord blood stem cells, neural stem cells, rare progenitor precursor cells and adipose stem cells were 75.1%, 73.2%, 85.0%, 88.1%, 43.5% , 47.8% and 69.0%, respectively, whereas the exosome-rich culture of the present invention showed amniotic stem cells, amniotic stem cells, placental stem cells, cord blood stem cells, neural stem cells, The inhibition of tyrosinase activity was significantly higher in the stem cells than in the control culture medium, and decreased to 55.0%, 49.2%, 63.3%, 68.0%, 21.0%, 20.2% and 42.3% Skin whitening effect (inhibition of tyrosinase activity) was in the order of rare proliferating progenitor cells ≥ neural stem cells> adipose stem cells> amniotic stem cells> amniotic stem cells> placental stem cells> umbilical cord blood stem cells 8).

또한, 멜라노사이트에서의 직접적인 멜라닌 생산에 대한 억제효능을 분석하였는데, 그 결과, 대조군 줄기세포 배양액은 양수줄기세포, 양막줄기세포, 태반줄기세포, 제대혈줄기세포, 신경줄기세포, 희소돌기교전구세포 및 지방줄기세포 유래 배양액에 의해 각각 80.1%, 77.2%, 83.2%, 91.1%, 49.0%, 52.8% 및 74.2%로 줄어들어 신경줄기세포 ≥ 희소돌기교전구세포 > 지방줄기세포 > 양막줄기세포 > 양수줄기세포 > 태반줄기세포 > 제대혈 줄기세포의 순으로 효과적임이 확인되었다. 한편, 본 발명에 따른 엑소좀 풍부 줄기세포 배양액은 대조군 배양액에 비해 월등히 우수한 멜라닌 생성 억제효과를 나타내었는데, 구체적으로 양수줄기세포, 양막줄기세포, 태반줄기세포, 제대혈줄기세포, 신경줄기세포, 희소돌기교전구세포 및 지방줄기세포에서 각각 64.1%, 59.0%, 73.0%, 77.2%, 31.1%, 28.2% 및 52.0%로 감소된 것으로 나타났고, 희소돌기교전구세포 ≥ 신경줄기세포 > 지방줄기세포 > 양막줄기세포 > 양수줄기세포 > 태반줄기세포 ≥ 제대혈줄기세포의 순으로 나타났다(도 9 참조).In addition, the inhibitory effect on melanin production in melanocyte was directly analyzed. As a result, the control stem cell culture medium was found to be an amniotic stem cell, a amniotic stem cell, a placental stem cell, a cord blood stem cell, a neural stem cell, The number of stem cells was reduced to 80.1%, 77.2%, 83.2%, 91.1%, 49.0%, 52.8% and 74.2% respectively by adipose stem cell-derived culture medium. Adipose stem cells> amniotic stem cells> amniotic stem cells > Placental stem cells> umbilical cord blood stem cells. Meanwhile, the exosome-rich stem cell culture solution according to the present invention showed much better melanin production inhibitory effect than the control culture medium, and specifically, amniotic stem cells, amniotic stem cells, placental stem cells, cord blood stem cells, neural stem cells, The number of cells was decreased to 64.1%, 59.0%, 73.0%, 77.2%, 31.1%, 28.2%, and 52.0% in the progenitor cells and adipose stem cells, respectively, and the rare proliferating progenitor cells ≥ neural stem cells> Stem cells> amniotic stem cells> placental stem cells ≥ cord blood stem cells (see FIG. 9).

따라서 이러한 결과를 통해 본 발명자들은 본 발명에 따른 방법으로 수득한 엑소좀 풍부 줄기세포 배양액은 멜라닌 생성 억제 효과 및 티로시나제 활성 억제효과가 우수하여 피부 미백을 위한 화장품의 제조에 사용할 수 있음을 알 수 있었다.Accordingly, the inventors of the present invention have found that the culture medium of exosome-rich stem cells obtained by the method according to the present invention is excellent in the effect of inhibiting melanin formation and inhibiting tyrosinase activity, and thus can be used for the production of cosmetics for skin whitening .

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.The present invention has been described with reference to the preferred embodiments. It will be understood by those skilled in the art that various changes in form and details may be made therein without departing from the spirit and scope of the invention as defined by the appended claims. Therefore, the disclosed embodiments should be considered in an illustrative rather than a restrictive sense. The scope of the present invention is defined by the appended claims rather than by the foregoing description, and all differences within the scope of equivalents thereof should be construed as being included in the present invention.

Claims

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TNF-α was treated at a concentration of 50 ng / ml in DMEM (Dulbecco's modified Eagle's medium) containing stem cells selected from the group consisting of progenitor precursor cells, amniotic membrane stem cells and amniotic stem cells, and 5% oxygen Containing culture medium containing the exosome-containing stem cell culture obtained by culturing the cells for 24 hours under conditions of concentration,
A cosmetic composition having atopic dermatitis improvement effect, skin wrinkle improvement effect and skin whitening effect.

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8. The method of claim 7,
The cosmetic may be at least one selected from the group consisting of a skin lotion, a skin softener, a skin toner, an astringent, a lotion, a milk lotion, a moisturizing lotion, a nutrition lotion, a massage cream, a nutrition cream, a moisturizing cream, a hand cream, a foundation, Wherein the composition is any one selected from the group consisting of a cleansing lotion, a cleansing cream, a body lotion, a body cleanser, a cleanser, a treatment, a serum, a cosmetic pack, an ointment, a gel, a liniment, , Atopic dermatitis improvement effect, skin wrinkle improvement effect and skin whitening effect.

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