KR101964907B1 - 상이한 생분해 속도를 갖는 콜라겐층이 적층된 복합 콜라겐 멤브레인 및 이의 제조 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은, 서로 다른 생분해 속도를 갖는 복수의 콜라겐층이 적층되어, 골 재생술이나 골 이식술에 사용되는 치과용 복합 멤브레인 및 이의 제조 방법에 관한 것으로, 골 형성을 위한 충분한 공간의 확보 기능 및 연조직과 다양한 세균을 효과적으로 차폐할 수 있는 기능을 원하는 기간동안 유지할 수 있으면서도, 골이 완전히 재생된 이후에는 빠르게 체내에서 분해되는 흡수성 치주조직 재생 유도 복합막에 관한 것이다. 가교도가 상이하여 생분해 속도가 각각 다른 복수의 콜라겐 이 적층된 복합 콜라겐 멤브레인을 사용하여 각 층의 생분해속도를 다르게 조절함으로써, 원하는 기간(즉, 골 형성이 완료되는 기간)까지 충분한 체적을 유지하여 기능을 유지할 수 있도록 하고, 원하는 기능 유지 기간이 지난 이후(즉, 골 형성이 완료된 이후)에는 빠르게 분해되는 특유의 분해 속도를 갖는 복합 콜라겐 멤브레인을 제공함으로써, 기존의 흡수성 차폐막이 갖는 체내 빠른 분해성, 원하는 기간 동안의 기능 유지 어려움, 체내에서 차폐막으로서의 효율적인 기능 유지 등을 수행할 수 있는 장점이 있다.

Description

상이한 생분해 속도를 갖는 콜라겐층이 적층된 복합 콜라겐 멤브레인 및 이의 제조 방법{A Composite membrane stacked with collagen with different decomposition rate and a preparation method thereof}

본 발명은, 서로 다른 생분해 속도를 갖는 복수의 콜라겐층이 적층되어, 골 재생술이나 골 이식술에 사용되는 치과용 복합 멤브레인 및 이의 제조 방법에 관한 것으로, 골 형성을 위한 충분한 공간의 확보 기능 및 연조직과 다양한 세균을 효과적으로 차폐할 수 있는 기능을 원하는 기간동안 유지할 수 있으면서도, 골이 완전히 재생된 이후에는 빠르게 체내에서 분해되는 흡수성 치주조직 재생 유도 복합막에 관한 것이다.

치과용 멤브레인은 치조골 등의 경조직(뼈)을 재생하는 과정 중에서 사용되는 막(membrane)으로, 교정 시술이나 임플란트 시술 과정 중에서 치조골의 두께가 얇거나 치조골이 손상, 소실된 경우 등 치조골의 재생이 필요한 때에 골 재생술이나 골 이식술을 위해 사용되는 막이다.

구체적으로 설명하면, 교정 시술이나 임플란트 시술 시에, 뼈의 질이 좋지 않거나 뼈의 양이 부족한 경우 혹은 치주염으로 인해 치조골이 파괴, 소실된 경우에는 치조골을 증가시키기 위한 시술이 필요한데, 이와 같이 골 재생(혹은 골 조성)이 필요한 경우에 골유도 재생술(guided bone regeneration, GBR)이나 골이식술(bone grafting)이 수행된다.

이러한 골유도 재생술은, 골 재생 부위에 골이식재를 삽입한 후 차폐막인 멤브레인으로 덮음으로써. 미분화된 섬유아세포가 신생골이 재생되는 공간으로 침입을 차단하면서 동시에 치조골의 생장을 유도하는 치조골 재생술의 하나이다.

일반적으로 조직의 생장속도는 조직의 유형별로 차이가 있는데, 골 재생의 경우, 치은조직의 섬유아세포 성장 및 재생속도는 골의 성장 및 재생 속도보다 빠르다. 따라서, 골 유도 재생술시 차폐막인 멤브레인이 사용되지 않을 경우에는, 치은 조직의 섬유아세포 및 세균 등이 골이 재생되는 공간으로 침입하여 골 재생을 저하시키게 되고, 예후가 좋지 않게 된다.

이러한 골의 부진한 재생의 문제점을 해결하기 위해 흔히 치과용 멤브레인을 사용하게 되는데, 치과용 멤브레인의 주요 기능인 골 재생이 되는 시기에 치은 조직의 섬유아세포 및 다양한 세균 등의 침입을 효과적으로 방지할 수 있는 충분한 차폐의 기능이 매우 중요하다.

일반적으로 치과용 멤브레인은 소재의 특성에 따라 크게 비흡수성과 흡수성 치과용 멤브레인으로 구분될 수 있는데, 비흡수성 치과용 멤브레인의 경우 치조골이 재생된 후에 멤브레인의 제거를 위한 2차 수술이 요구된다. 하지만, 흡수성 멤브레인의 경우 골 재생이 완료된 후 자연히 체내에 흡수되므로, 별도의 제거를 위한 2차 수술이 필요하지 않은 장점이 존재한다.

이러한 흡수성 치과용 멤브레인은 다양한 종류의 소재를 이용하여 제조될 수 있는데, 그 중에서도 치과용 멤브레인으로 많이 사용되고 있는 소재로 콜라겐 (collagen)을 들 수 있다.

콜라겐 유래 치과용 멤브레인의 경우에는, 체내 이식 이후 생체 내 존재하는 효소로 인해 콜라겐이 분해되는데, 일반적으로 콜라겐 멤브레인은 체내에서 꾸준히 지속적으로 분해되므로, 차폐 및 공간유지의 기능을 하는 기간을 조절하기 어려운 단점이 존재한다.

이러한 흡수성 치주조직 재생 유도막으로, PEG 유래 수화젤과 콜라겐이 적층된 다중층 흡수성 치주조직 재생 유도막이 특허로 공지되어 있다(등록특허 제1260757호). 하지만, 이러한 공지된 다중층 흡수성 치주조직 재생 유도막의 경우에는 차폐막의 안쪽으로 연조직이 침투하는 것을 효과적으로 방지할 수 있지만, 차폐막의 분해 속도를 효과적으로 제어하기 어렵다는 문제점이 여전히 존재한다.

즉, 흡수성 치과용 멤브레인의 차폐 및 공간유지 기간이 짧을 경우에는 충분한 골 형성이 일어나기 전에 연조직 및 세균 등이 골 재생 공간으로 침입하여 골 재생의 예후가 좋지 못하다는 문제점이 존재하고, 반대로 차폐 및 공간유지 기간이 불필요하게 증가할 경우에는 체내의 잔류 기간이 길어짐에 따라, 멤브레인 내에 잔류하는 가교제에 의해 골 재생의 예후가 좋지 않게되는 문제점이 발생하게 된다.

따라서 흡수성 치과용 멤브레인의 경우, 차폐막으로서의 기능을 유지해야 하는 기간동안은 체내에 충분히 존재해야 하고, 기능유지 기간이 지난 이후에는 체내에 길게 유지될 필요가 없어, 그 분해 속도가 보다 효과적으로 제어될 필요성이 존재한다. 즉, 골 형성을 위한 충분한 공간 확보 및 연조직과 다양한 세균을 차폐할 수 있는 기능을 원하는 기간 동안 유지해주고, 골이 완전히 재생된 기간 이후에는 빠르게 체내에서 분해되어 잔존하지 않는 흡수성 치주조직 재생 유도막의 개발이 요구된다.

등록특허 제1260757호 (2013.05.06. 등록공고)

이러한 종래기술의 문제점을 해결하기 위해 본 발명에서는, 콜라겐 합성시 각기 다른 가교도를 갖는 복수의 콜라겐층을 제조한 후, 골 재생기간 동안 멤브레인의 생분해가 천천히 진행되어 차폐 또는 공간 유지기능이 유지되고, 일정 시간이 경화 후 멤브레인의 기능이 더이상 필요치 않은 시기에는 멤브레인의 생분해 속도가 빠르게 진행될 수 있도록, 서로 다른 가교도를 갖는 복수의 콜라겐 층이 적층된 다층 구조의 콜라겐 멤브레인 및 이의 제조 방법을 제공한다.

좀 더 구체적으로는, 흡수성 멤브레인의 최외곽(최상부 및 최하부)는 조밀한 화학적 가교로 형성된 콜라겐이 위치하고, 흡수성 멤브레인의 최상부와 최하부의 사이의 중간층에는 상대적으로 덜 조밀한 화학적 가교로 형성된 콜라겐이 위치하게 된다.

이러한 구조로 형성된 본 발명에 따른 복합 콜라겐 멤브레인의 최외곽층은 골 재생기간 동안 생분해 속도가 낮아 골격을 유지하고, 중간층은 상기 외부층을 형성한 콜라겐층에 비해 생분해 속도가 상대적으로 빠르다. 하지만, 중간층의 상부와 하부가 생분해 속도가 낮은 가교도가 높은 콜라겐 멤브레인으로 둘러싸여 있어, 고유의 빠른 생분해 속도를 초기에 나타내기는 곤란하며, 최외곽층의 콜라겐층이 분해되어 중간층이 노출될 경우에는 빠르게 생분해될 수 있다.

따라서, 복합 콜라겐 멤브레인은 시술 초기에는 멤브레인의 최외곽층(최상부 및 최하부)은 낮은 생분해 속도로 인해 일정 기간 동안 멤브레인의 고유 기능(차폐 또는 공간 유지능)을 유지하다가, 골 형성이 완료되는 일정시간이 경과된 후에는, 외부층의 생분해가 완료되고, 복합 콜라겐 멤브레인의 중간층인 상대적으로 덜 조밀한 화학적 가교로 형성된 콜라겐이 빠르게 생분해된다.

본 발명에 따른 복합 콜라겐 멤브레인은, 최외곽층의 콜라겐 가교도를 조절하여 그 분해속도(혹은 분해 시간)를 골 형성이 완료되는 시간과 동일하게 함으로써, 기존의 흡수성 치과용 차폐막이 갖는 빠른 분해성, 차폐막으로서의 기능 유지 기간 조절의 어려움 등을 효과적으로 해결할 수 있다.

본 발명의 일 실시 형태에 따른 치과용 복합 콜라겐 멤브레인은, 최외곽에 위치하면서 가교도가 C1인 외부 콜라겐 멤브레인; 및 상기 최외곽에 위치하는 외부 콜라겐 멤브레인의 내측에 위치하는 가교도가 C2인 내부 콜라겐 멤브레인;을 포함하고, 상기 외부 콜라겐 멤브레인의 가교도 C1은, 내부 콜라겐 멤브레인의 가교도 C2보다 높아, 외부 콜라겐 멤브레인의 생분해 속도가 내부 콜라겐 멤브레인의 생분해 속도보다 느린 것을 특징으로 한다.

상기 외부 및 내부 콜라겐 멤브레인의 가교도 C1과 C2는, 가교제의 함량, 가교처리 시간, 가교 용매의 종류 및 함량, 가교 처리 온도 중에서 선택된 어느 하나 이상의 조건으로 조절될 수 있으며, 상기 외부 콜라겐 멤브레인과 내부 콜라겐 멤브레인은 물리적인 압착 혹은 열압착에 의해 하나의 복합 콜라겐 멤브레인으로 형성된 것이 바람직하다.

상기 외부 콜라겐 멤브레인은, 내부 콜라겐 멤브레인의 위와 아래에 위치하거나, 상기 내부 콜라겐 멤브레인이 외부 콜라겐 멤브레인에 의해 둘러 쌓인 형태로 일 수 있다.

본 발명에 따른 상이한 생분해 속도를 갖는 콜라겐층이 적층된 복합 콜라겐 멤브레인은, 골 재생기간 동안의 생분해 속도가 골 재생기간 이후의 생분해 속도에 비해 느린 것을 특징으로 한다.

본 발명의 다른 실시 형태로, 상이한 생분해 속도를 갖는 콜라겐층이 적층된 복합 콜라겐 멤브레인의 제조 방법을 들 수 있는데, 포유류 유래 콜라겐인 type 1 및/또는 type 3 콜라겐을 수용액 상태로 용해시키는 콜라겐 용해 단계; 상기 콜라겐이 용해된 수용액에 인산염, 칼슘염, 나트륨염 또는 이들의 혼합물인 염화합물 수용액을 0.1 ~ 10 M의 농도 범위로 첨가하는 염처리 단계; 염처리 단계를 거친 콜라겐 수용액에 가교제를 사용하여 서로 다른 가교도를 갖는 복수의 콜라겐매트릭스를 형성하는 가교 단계; 상기 복수의 콜라겐 매트릭스를 각각 유기용매와 물이 부피비로 1:1 혼합된 유기용매 혼합 수용액에 침지시키는 유기용매 처리 단계; 및 유기용매 처리된 복수의 콜라겐 매트릭스를 물리적 압착 및/혹은 열 압착시키는 압착 단계;를 포함한다.

상기 가교제는 formaldehyde, α-hydroxyadipaldehyde, glutaraldehyde, 또는 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide/N-hydroxy succinimide (EDC/NHS) 로부터 선택될 수 있으며, 상기 가교 단계에서, 4 내지 24 시간의 가교 처리 시간과 10 ~ 37℃의 가교 처리 온도의 범위 내에서 가교제의 농도, 가교처리 시간 또는 가교처리 온도를 변화시킴으로써, 가교도가 상이한 복수의 콜라겐 멤브레인 매트릭스를 제조할 수 있다.

상기 유기용매는, 에틸 알코올, 에틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, 에틸에테르, 부탄올, 이소프로필 알코올, 메탄올, 메톡시에탄올 및 아세톤 중에서 선택되는 어느 하나 이상인 것이 바람직하고, 상기 유기용매 처리 단계에서, 복수의 콜라겐 매트릭스에 대해 처리되는 유기용매의 종류와 사용량의 변화에 따라 콜라겐 매트릭스 내의 분자간 가교도를 변화시키는 것도 가능하다.

종래의 흡수성 차폐막은 생분해기간이 최소 2주부터 최대 54주까지 다양하게 존재하며, 단일층 또는 이중층의 흡수성 차폐막으로 체내에 이식 후 모든 방향으로부터 등방성(isotropic)으로 급격한 분해와 함께 연조직의 침투가 시작되어, 골 형성이 일어나는 특정 시간 동안 차폐막으로서 완벽한 차단이 어려운 문제점이 존재한다.

본 발명에서는 가교도가 상이하여 생분해 속도가 각각 다른 복수의 콜라겐 이 적층된 복합 콜라겐 멤브레인을 사용하여 각 층의 생분해속도를 다르게 조절함으로써, 원하는 기간(즉, 골 형성이 완료되는 기간)까지 충분한 체적을 유지하여 기능을 유지할 수 있도록 하고, 원하는 기능 유지 기간이 지난 이후(즉, 골 형성이 완료된 이후)에는 빠르게 분해되는 특유의 분해 속도를 갖는 복합 콜라겐 멤브레인을 제공함으로써, 기존의 흡수성 차폐막이 갖는 체내 빠른 분해성, 원하는 기간 동안의 기능 유지 어려움, 체내에서 차폐막으로서의 효율적인 기능 유지 등을 수행할 수 있는 장점이 있다.

즉, 본 발명에서 제공하는 흡수성 차폐막은 골 형성 기간 동안 즉, 차폐의 기능유지를 원하는 기간 동안에는 복합 콜라겐 멤브레인의 최외곽층에 위치하는 조밀한 구조의 콜라겐층이 연조직 및 다양한 세균의 침투를 효과적으로 차단할 수 있으며, 소정의 기능 유지기간 동안 유지되면서 서서히 분해된다.

이후 골 형성이 완료된 이후에 최외곽층의 조밀한 콜라겐 멤브레인의 일부가 분해되어, 상대적으로 덜 조밀한 콜라겐 중간층이 노출될 경우, 잔류하는 최외곽층의 조밀한 콜라겐 멤브레인과 함께 빠르게 분해되면서, 원하는 기능 유지기간 이후에는 빠르게 흡수되는 효과가 존재한다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 복합 콜라겐 멤브레인의 구조를 도식적으로 나타낸 것으로, 시간의 변화에 따른 생분해 특성을 도식적으로 표현한 것이다.
도 2는 상기 도 1의 형태로 제조된 본 발명의 복합 콜라겐 멤브레인의 실제 생분해 정도를 측정한 결과(in vitro)이다
도 3은 본 발명의 실시예로 제시된 복합 콜라겐 멤브레인(R1 내지 R3)의 생분해과정 중에서 시간의 흐름에 따른 두께의 변화(in vitro)를 관찰한 결과이다.
도 4는 본 발명의 실시예로 제시된 복합 콜라겐 멤브레인의 시간 변화에 따른 변화를 동물 실험을 통해 확인한 결과(in vivo)이다.

이하 도면을 참조하여 본 발명의 바람직한 실시예를 상세히 설명하기로 한다. 이에 앞서, 본 명세서 및 청구범위에 사용된 용어나 단어는 통상적이거나 사전적인 의미로 한정하여 해석되어서는 아니되며, 본 발명의 기술적 사상에 부합하는 의미와 개념으로 해석되어야 한다.

본 명세서 전체에서, 어떤 부재가 다른 부재 "상에" 위치하고 있다고 할 때, 이는 어떤 부재가 다른 부재에 접해 있는 경우뿐 아니라 두 부재 사이에 또 다른 부재가 존재하는 경우도 포함한다.

본 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함" 한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.

"제 1", "제2" 등의 용어는 하나의 구성요소를 다른 구성요소로부터 구별하기 위한 것으로, 이들 용어들에 의해 권리범위가 한정되어서는 아니 된다. 예를 들어, 제 1 구성요소는 제 2 구성요소로 명명될 수 있고, 유사하게 제 2 구성요소도 제 1 구성요소로 명명될 수 있다.

각 단계들에 있어 식별부호는 설명의 편의를 위하여 사용되는 것으로 식별부호는 각 단계들의 순서를 설명하는 것이 아니며, 각 단계들은 문맥상 명백하게 특정 순서를 기재하지 않는 이상 명기된 순서와 다르게 실시될 수 있다. 즉, 각 단계들은 명기된 순서와 동일하게 실시될 수도 있고 실질적으로 동시에 실시될 수도 있으며 반대의 순서대로 실시될 수도 있다.

본 발명은 생분해 속도가 서로 상이한 콜라겐 멤브레인이 적층된 구조를 갖는 치과용 흡수성 복합 차폐막 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 다층의 구조를 가지는 복합 콜라겐 멤브레인에 있어서, 이러한 다층 구조를 갖는 콜라겐 층들 중에서 적어도 한층 이상이 다른 콜라겐 층의 생분해 속도와 상이한 것을 특징으로 한다. 좀 더 자세하게는 생분해 속도가 각각 C1, C2 및 C3인 콜라겐 멤브레인 층이 차례로 적층된 도 1과 같은 복합 콜라겐 멤브레인에서, 각 콜라겐 층의 생분해속도는 C2>C1=C3, C1<C2<C3, C1>C2>C3, C1=C2>C3, C1=C2<C3, C1>C2=C3 혹은 C1<C2=C3 등과 같이 각 층의 콜라겐 멤브레인의 분해 속도가 상이한 것을 특징으로 한다.

이렇게 본 발명의 복합 콜라겐 멤브레인을 구성하는 각 콜라겐 층의 화학적 가교 또는 물리적 가교도의 변화를 통해 생분해 속도를 상이하도록 조절함으로써, 원하는 기간 이내에 분해가 가능한 효과가 있는 흡수성 복합 콜라겐 멤브레인을 제공할 수 있다.

예를 들어 도 1과 같은 3개의 콜라겐 층이 적층된 복합 콜라겐 멤브레인에 있어서(이하에서는, 이해의 편의를 통해 3개의 콜라겐 층이 적층된 구조를 중심으로 설명하였으나, 반드시 3개의 콜라겐 층의 적층 형태만으로 한정되는 것은 아님을 미리 밝혀둔다), 최상층과 최하층의 최외곽층은 원하는 기능유지 기간동안 충분한 체적를 유지하면서 서서히 분해됨으로써, 연조직 및 차단의 기능과 골형성을 위한 공간 확보 및 혈관 및 유골조직 재생등의 기능을 유지할 수 있다. 반면에 중간층은 원하는 기능유지 기간 이후에 급속히 분해됨으로써, 치과용 흡수성 차폐막으로써 체내에 (골 형성 유도 기간 동안) 효과적으로 잔존될 수 있는 고기능성 복합 콜라겐 멤브레인을 제공할 수 있다.

도 1에서 확인되듯이, 각 층에 따라 화학적 가교의 정도가 다른 다층 구조를 갖는 본 발명의 복합 콜라겐 멤브레인은, 각 층의 가교 정도를 다르게 조절함으로써, 상하층(즉, 최외곽층)과 중간층의 생분해속도가 각기 다른 다층으로 구성되며, 각 층의 생분해속도 및 분해되는 시점을 콜라겐 층의 가교도를 제어함으로써 다양하게 조절할 수 있다.

즉, 예를 들어 C1 및 C3 층이 C2 층에 비해 높은 가교효율을 갖기 때문에, C1 및 C3층은 원하는 기능유지 시점(즉, 골 형성이 완료되는 시점)까지 서서히 생분해되고, 기능유지 시점 이후에 C2층이 노출되어 급속히 분해되게 된다.

기능적인 측면에서도 최외곽층인 C1 및 C3 층은 연조직 및 세균의 침입 차단의 기능과 골 형성을 위한 공간 확보, 혈관 및 유골조직 재생 등의 기능을 원하는 기능 유지 시점까지 유지되고, C2층은 기능유지기간 이후에 빠르게 분해됨으로써, 기능유지기간에만 효과적으로 체내에 유지될 수 있다.

도 1에서는 상기 최외곽층인 C1과 C3층이 중간층인 C2의 위와 아래에 각각 적층되는 구조로 설명하였으나, 이러한 적층 형태 뿐만 아니라, C1 층과 C3 층이 중간층인 C2층의 주위를 완전히 둘러쌓는 형태로 이루어질 수 있으며, C2층의 측면 양 말단의 두께를 (C1층의 두께 혹은 C3 층의 두께에 비해) 상대적으로 얇게 형성하는 것도 가능하다.

이하에서는 본 발명에 따른 복합 콜라겐 멤브레인의 제조 방법에 대해서 좀 더 구체적으로 설명하고자 한다.

본 발명의 치과용 흡수성 복합 콜라겐 멤브레인은, 콜라겐 용해 단계, 염처리 단계, 가교 단계를 거쳐 제조된 복수의 콜라겐 층들에 대해서, 압착 단계, 동결 건조 단계 및 멸균 단계를 수행함으로써 제조된다. 선택적으로 상기 가교 단계와 압착 단계의 사이에 유기용매 처리 단계를 더 포함할 수 있다.

또한 상기 압착 단계과 동결 건조 단계 사이에, 후속되는 멸균처리 과정에서 발생되는 라디칼을 포집하고, 콜라겐의 손상을 감소시키기 위해, 정제수와 인산 완충 식염수(PBS: Phosphate Buffer Saline)가 혼합된 수용액에 EDTA(에틸렌디아민테트라아세트산)과 아스코빅산(Ascobic acid) 또는 아스코빅 유도체가 혼합된 멸균보호 용액에 상기 콜라겐을 침지시키는 멸균보호 용액 처리 단계;가 추가로 더 포함될 수 있다.

콜라겐 용해 단계는 포유류 유래 콜라겐인 type 1 및/또는 type 3를 수용액 상태로 용해하는 단계로서, 바람직한 콜라겐 수용액의 농도는 약 0.5 ~ 3 wt%이다. 상기 콜라겐 수용액의 농도가 0.5 wt% 미만일 경우에는 후속되는 염처리 단계에서 콜라겐 섬유가 잘 형성되지 않고, 3 wt%를 초과하는 고농도의 경우에는 콜라겐이 수용액 형태로 잘 용해가 되지 않는 문제점이 있다.

수용액 형태로 용해된 콜라겐 수용액에, 인산염, 칼슘염, 나트륨염 또는 이들의 혼합물 등과 같이 수용액 상태에서 염 이온으로 해리 가능한 염화합물 수용액을 0.1 ~ 10 M의 농도 범위로 첨가하여 10 ~ 37 ℃의 온도 범위에서 약 4 ~ 24 시간 동안 유지시키는 염처리 단계를 수행한다.

상기 염처리 단계에서 사용되는 염화합물 수용액의 농도가 0.1M 미만일 경우에는 후속 단계인 가교 단계에서 콜라겐 분자들 사이의 가교결합이 형성되지 아니하고, 10M을 초과하는 고농도의 경우에는 고농도의 염 이온이 콜라겐 분자간의 가교결합을 오히려 방해하여 매트릭스화를 방해하게 되므로 바람직하지 아니하다.

이렇게 염처리 단계를 거친 콜라겐 수용액에 formaldehyde, α-hydroxyadipaldehyde, glutaraldehyde, 또는 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide/N-hydroxy succinimide (EDC/NHS)등의 가교제를 사용하여 가교 단계를 수행하게 된다. 이러한 가교 단계 역시 염처리 단계와 유사한 조건인 10 ~ 37 ℃의 온도 범위에서 약 4 ~ 24 시간 동안 수행하는 것이 바람직하다.

이때 사용될 수 있는 가교제의 양은 통상적으로 약 1 wt%의 범위로 사용되는데, 각 콜라겐 멤브레인의 가교도를 변화시키기 위해 사용되는 가교제의 양을 변화시킬 수 있다. 특히, 가교제의 경우 너무 많이 사용될 경우 세포 독성의 문제를 일으킬 수 있으므로, 세포 독성을 일으키지 않을 수 있는 정도로 최대 사용될 수 있는 가교제의 양으로 상기 조건을 통해 얻을 수 있는 가교도를 100%이라고 설정하고, 가교제의 양을 감소시켜 가교도를 각각 약 20 내지 60%의 범위로 조절하는 것이 바람직하다.

이러한 가교도의 범위는 가교제의 양 뿐만 아니라, 가교 처리 시간을 4 시간 내지 24 시간의 범위 내에서 짧게 하거나, 증가시킴으로써 제어할 수 있으며, 동일한 가교 시간과 가교제의 양인 경우에도 가교 처리 온도를 10 ~ 37 ℃의 범위 내에서 변화시킴으로써 제어가 가능하다.

이렇게 가교 단계가 수행된 콜라겐은 메트릭스 형태의 층상으로 얻어지게 되며, 이렇게 수득된 콜라겐 메트릭스를 유기용매와 물이 부피비로 1:1 혼합된 유기용매 혼합 수용액에 침지시키는 유기용매 처리 단계를 거치게 된다.

이러한 유기용매 처리 단계에 사용되는 유기용매로는 에틸 알코올, 에틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, 에틸에테르, 부탄올, 이소프로필 알코올, 메탄올, 메톡시에탄올, 아세톤 등의 비할로겐족 유기용매를 사용하는 것이 바람직하다. 특히, 할로겐 유기용매는 인체 피해를 주는 물질로 알려져 있으며, 약 10 ~ 100ppm의 인체 허용 한계 농도를 갖는 화합물이므로 사용하는 것이 바람직하지 않다. 유기용매 처리 단계 역시 가교 단계의 조건과 유사하게 10 ~ 37 ℃의 온도 범위에서 약 4 ~ 24 시간 동안 수행되는 것이 바람직하다.

유기용매 처리 단계 과정 중에서 사용되는 유기용매의 종류와 사용량에 따라, 콜라겐 매트릭스 내의 분자간 가교도 역시 변화될 수 있는데, 이는 콜라겐 섬유 분자들 사이에 존재하는 수분이 유기용매로 대체되는 일종의 탈수 반응을 일으킴으로써, 콜라겐 섬유 간격 사이의 치밀도 높은 가교 결합을 유도하게 된다. 즉, 본 발명에서 사용되는 각각의 콜라겐 층은 앞서 설명한 가교제의 양뿐만 아니라, 유기용매 처리 단계를 거치는 과정 중에서 사용되는 유기 용매의 종류와 양에 따라 가교도의 제어가 가능하다.

유기용매 처리 과정을 거쳐 가교도가 각각 최종 제어된 적어도 복수개의 콜라겐 층을 물리적 압착 혹은 열압착 단계를 통해 0.3 ~ 0.5 mm의 두께를 갖는 복합 콜라겐 멤브레인을 제조할 수 있다. 열압착의 경우에는 80 ~ 120℃의 온도 범위에서 수행될 수 있는데, 상기 물리적 압착과 동시에 열을 가하여 수행되는 것이 더욱 바람직하다.

물리적 압착 단계는, 유기용매 처리 단계를 거친 콜라겐 매트릭스에 대하여 높은 압력을 가하는 기계적 압착 과정을 수행함으로써 콜라겐 매트릭스 내 수분을 제거하는 과정으로, 이러한 압착 단계를 통해 각 콜라겐 층의 섬유 및 섬유층 사이의 거리가 조밀해져 더욱 치밀한 구조를 갖는 복합 콜라겐 멤브레인을 형성할 수 있다. 이때 가해지는 압력은 약 1kgf/㎠이며, 바람직하게는 기존의 상용화된 프레스 장치를 사용하여 상온에서 약 1 ~ 10 분 동안 압력을 가하여 수분을 제거하면서 압착시키는 것이 바람직하다.

이렇게 압착 단계를 거친 후에, 필요에 따라 상기 압착 단계를 거친 복합 콜라겐 매트릭스에 대하여 동결 건조 단계 이전에 멸균보호 용액 처리 단계를 추가로 더 거칠 수 있다.

상기 멸균보호 용액 처리 단계는, 이후의 방사선 멸균 단계가 수행될 때, 복합 콜라겐 멤브레인 내에 남아 있는 수분이 방사선 조사로 인해 반응성이 큰 라디칼을 생성할 수 있는데, 이렇게 생성된 라디칼은 멸균이 진행되는 동안 콜라겐 멤브레인 내의 가교결합을 파괴하고 조직의 손상, 단백질 구조의 변형/손상을 가져올 수 있으므로, 이를 방지하기 위한 것이다.

즉, 상기 콜라겐 매트릭스를 멸균보호 용액을 처리함으로써, 이후 방사선 조사가 이루어지는 멸균 단계에서 발생할 수 있는 라디칼을 쉽게 포집하는 기능을 부여할 수 있으며, 이를 통해 추후 멸균 단계에서 발생할 수 있는 콜라겐 멤브레인의 손상을 최소화시킬 수 있다.

상기 멸균보호용액의 조성은, 정제수와 인산 완충 식염수(PBS: Phosphate Buffer Saline)를 부피비로 1:1 혼합된 수용액에 EDTA(에틸렌디아민테트라아세트산)과 아스코빅산(Ascobic acid) 또는 아스코빅 유도체가 혼합된 것으로, 이러한 조성을 갖는 멸균보호 용액에 상기 콜라겐 매트릭스를 침지시킨 후, 상온에서 90 ~ 150분 동안 약 60 ~ 80 rpm 정도로 교반시키는 과정을 통해 멸균보호 용액 처리 단계가 수행된다.

상기 멸균보호 용액에 EDTA는 0.5 M의 농도로 포함되고, 아스코빅산 또는 아스코빅 유도체는 0.1~ 5 mM의 범위로 포함되는 것이 바람직하며, 상기 아스코빅 유도체로는 ascorbic acid 2-glucoside(AA-2G), ascorbic acid 2-phosphate(AA-2P), 또는 ascorbic acid 2-sulfate (AA-2S)가 더욱 바람직하다.

즉, 이러한 추가적인 압착 단계를 통해 본 발명의 복합 콜라겐 멤브레인을 형성할 수 있을 뿐만 아니라, 콜라겐 층간의 조밀도를 높이고, 콜라겐 층들 사이의 간격을 좁혀 치밀도가 높은 복합 콜라겐 멤브레인 구조를 형성함으로써, 외부 박테리아 및 감염에 대한 저항력을 향상시킬 수 있으며, 방사선 멸균 단계(예를 들어 전자멸균, 감마멸균 등)에 의한 콜라겐 멤브레인 내부의 가교결합의 절단 혹은 손상을 방지하기 위해 멸균보호 용액 처리 단계를 통해 콜라겐 멤브레인의 가교결합을 보존함으로써 체내 유지 기간 증대 효과를 더욱 높일 수 있게 된다.

이렇게 제조된 복합 콜라겐 멤브레인은 후속 처리 과정으로 동결건조 단계 및 멸균처리 단계를 거치게 되는데, 상기 동결건조는 동결건조기를 사용하여 콜라겐 내의 수분 함유량이 6%를 넘지 않도록 18 ~ 36 시간 동안 수행되는 것이 바람직하며, 멸균 단계는 5 ~ 40kGy의 방사선 멸균을 통해 수행되는 것이 바람직하다.

이하에서는 구체적인 실험예를 포함하는 비교예와 실시예를 통하여 본 발명을 좀 더 구체적으로 설명하고자 하며, 이러한 구체적인 실시예는 단지 본 발명의 기술적 특징과 기술적 사상을 설명하기 위한 예에 불과할 뿐, 본 발명의 기술적 범위를 한정하는 것이 아님은 너무도 당연한 것이다.

[ 실시예 1]

도 1에 도식적으로 제시된 것과 같이, 가교도가 서로 상이한 콜라겐층을 적층시켜 제조한 복합 콜라겐 멤브레인의 in vitro 생분해 속도 측정 결과를 관찰한 결과를 도 2에 정리하였다. 이때 최상층인 C1 콜라겐 층의 가교도를 100이라 할 때, 최하층의 C3 콜라겐 층의 가교도 역시 100으로 조절하였으며, 가교제의 양을 감소시켜 중간의 C2 콜라겐 층의 가교도를 60으로 변화시켰다. 이렇게 제조된 복수의 콜라겐 층을 도 1에 도식적으로 제시된 적층 구조를 갖도록 앞서 설명한 방법으로 복합 콜라겐 멤브레인을 제조하였으며, 이렇게 제조된 복합 콜라겐 멤브레인의 시간에 따른 두께의 변화(즉, 분해 속도)를 관찰하였다.

분해 속도의 측정은, 0.5 Unit/ml의 collagenase 효소가 녹아있는 PBS(phosphate buffered saline) 용액에, 앞서 살펴본 제조 과정을 거쳐 제조된 복합 콜라겐 멤브레인을 넣고, 37 ℃에서 시간 별로 잔존하는 복합 콜라겐 멤브레인의 두께의 변화를 측정함으로써 수행하였다. 초기 복합 콜라겐 멤브레인의 두께를 기준으로 시간이 흐름에 따라 잔존하는 복합 콜라겐 멤브레인의 두께를 측정하여 이들의 비(ratio)를 도시하였다.

도 1에 도식적으로 제시된 것과 유사하게, 초기 생분해 기간(약 24시간) 동안 복합 콜라겐 멤브레인의 분해 속도는 천천히 이루어지다가, 30시간 이상의 시간이 흐른 뒤에는 급격하게 분해 속도가 증가하여 잔존하는 복합 콜라겐 멤브레인의 두께가 급격히 감소하는 것을 확인할 수 있었다.

[ 실시예 2]

앞서 실시예 1과 같은 형태로 제조된 복합 콜라겐 멤브레인의 생분해 시점을 좀 더 명확히 확인하기 위해, 최외곽층인 C1, C3층의 가교도의 차이 및 전체 복합 콜라겐 멤브레인의 두께 대비 최외곽층의 두께비를 변화시켜가면서 아래의 표 1과 같이 가교도와 그 두께가 제어된 R1 내지 R3의 복합 콜라겐 멤브레인 시편을 제조하였다.

		가교도	두께 비			가교도	두께 비			가교도	두께 비
R1	C1	100%	40%	R2	C1	70%	40%	R3	C1	70%	30%
	C2	60%	20%		C2	40%	20%		C2	40%	40%
	C3	100%	40%		C3	70%	40%		C3	70%	30%

이렇게 제조된 복합 콜라겐 멤브레인 시편에 대해서, 앞선 실시예 1과 동일한 방법으로 잔존하는 전체 복합 콜라겐 멤브레인의 두께의 시간에 따른 변화를 측정하였으며, 그 결과는 도 3과 같다.

상기 표 1에 제시된 본 발명에 따른 복합 콜라겐 멤브레인과의 비교를 위해, 가교도가 조절된 (적층구조가 아닌) 단일 콜라겐 멤브레인(A, B, C)을 하기의 표 2와 같이 (R1, R2, R3의 복합 콜라겐 멤브레인과) 동일한 두께로 제조하여, 동일한 분해 실험을 수행하였으며, 그 결과를 도 3에 같이 도시하였다.

시료	가교도 [%]	두께비 [%]
A	100	100
B	70	100
C	40	100

상기 표 2의 A, B, C의 콜라겐 멤브레인은, 멤브레인 전체가 동일한 가교도를 갖는 단일(homogeneous) 층의 콜라겐 멤브레인으로, A의 경우 전체가 가교도 100%, B의 경우 가교도 70%, C의 경우 가교도 40%를 갖는다.

상기 도 3의 측정 결과에서 확인되듯이, 전체 층이 동일한 가교도를 가질 경우에는 가교도를 조절하여 최종 분해시점을 조절할 수는 있으나, 최종분해시점까지 지속적으로 분해가 되는 경향을 보인다.

하지만, 가교도가 서로 상이한 콜라겐 층을 적층시켜 제조한 복합 콜라겐의 경우, 각 층의 가교도와 전체 두께에서 차지하는 두께 비율을 조절하여 차폐막으로서의 기능유지를 할 수 있는 기간 동안 기능 유지를 하고, 기능을 다한 후 빠르게 분해되도록 제조가 가능하다.

상기 도 3의 측정 결과에서 확인되듯이, C1 및 C3층의 가교도가 높고 그 두께가 두꺼울수록 콜라겐 분해 효소 하에서 상대적으로 강한 저항성을 나타내어 상대적으로 서서히 분해되고, 장기간 차폐막으로서의 기능을 유지할 수 있음을 알 수 있으며, 이러한 결과를 토대로, C1,C3 층의 가교도 및 두께의 차이를 통하여 생분해속도와 최종 분해 시점을 제어할 수 있고, 그 기능을 다한 직후에 빠르게 분해 될 수 있는 치과용 고기능성 복합 콜라겐 멤브레인 차폐막을 제조할 수 있음을 확인하였다.

[ 실시예 3]

앞선 실시예 1 및 실시예 2의 결과를 토대로, 전체 두께가 0.4mm이고, 전체 두께의 1/3씩 각각 가교도가 40%, 20% 및 40%인 C1, C2 및 C3 콜라겐 층을 제조한 후, 이를 적층하여 열 압착(@95℃)함으로써, 복합 콜라겐 멤브레인을 제조하였으며, 이를 in vivo 동물실험에 적용하였으며, 그 결과를 도 4에 정리하였다.

상기 도 4의 결과에서 확인되듯이, 전체 두께의 1/3씩 서로 가교도가 다르게 형성된 콜라겐 층을 열압착하여 제조된 복합 콜라겐 멤브레인의 경우, 12주차까지 안정적으로 그 구조와 형태가 유지되고 있음을 알 수 있었으며, 16주에는 급격히 생분해되었음을 확인할 수 있다(도 3의 두번째 행과 세번째 행의 사진은 동일한 이미지이며, 보다 명확한 비교를 위해 세번째 행 사진에 빨간색 점선으로 본 발명에 따른 복합 멤브레인을 표시하였음).

즉, 각 주(week)차에 해당하는 조직슬라이드의 이미지에서 확인되듯이 본 발명의 복합 콜라겐 멤브레인의 각 층이 분리되지 않고, 안정적으로 실험 대상 동물의 체내에 잔존하고 있음을 확인할 수 있으며, 가교도가 높은 상/하층의 콜라겐이 가교도가 낮은 가운데 콜라겐 층을 감싸주면서 천천히 분해되고, 가운데 부분이 상/하층이 분해된 이후에 빠르게 분해되는 것을 실험적으로 확인할 수 있었다.

Claims (11)

1. 치과용 콜라겐 멤브레인에 있어서,
   가교도가 C1인 외부 콜라겐 멤브레인;과 가교도가 C2인 내부 콜라겐 멤브레인;을 포함하고,
   상기 외부 콜라겐 멤브레인의 가교도 C1은, 내부 콜라겐 멤브레인의 가교도 C2보다 높아, 외부 콜라겐 멤브레인의 생분해 속도가 내부 콜라겐 멤브레인의 생분해 속도보다 느리고,
   상기 외부 콜라겐 멤브레인은, 내부 콜라겐 멤브레인의 위와 아래에 위치하여, 상기 내부 콜라겐 멤브레인이 외부 콜라겐 멤브레인에 의해 둘러 쌓인 것을 특징으로 하는, 상이한 생분해 속도를 갖는 콜라겐층이 적층된 복합 콜라겐 멤브레인
   
2. 제1항에 있어서,
   상기 외부 및 내부 콜라겐 멤브레인의 가교도 C1과 C2는, 가교제의 함량, 가교처리 시간, 가교 용매의 종류 및 함량, 가교 처리 온도 중에서 선택된 어느 하나 이상의 조건으로 조절되는 것을 특징으로 하는, 상이한 생분해 속도를 갖는 콜라겐층이 적층된 복합 콜라겐 멤브레인
   
3. 제1항에 있어서, 상기 외부 콜라겐 멤브레인과 내부 콜라겐 멤브레인은 물리적인 압착 혹은 열압착에 의해 하나의 복합 콜라겐 멤브레인으로 형성된 것을 특징으로 하는, 상이한 생분해 속도를 갖는 콜라겐층이 적층된 복합 콜라겐 멤브레인
   
4. 삭제
5. 삭제
6. 제1항에 있어서,
   상기 상이한 생분해 속도를 갖는 콜라겐층이 적층된 복합 콜라겐 멤브레인은, 골 재생기간 동안의 생분해 속도가 골 재생기간 이후의 생분해 속도에 비해 느린 것을 특징으로 하는, 상이한 생분해 속도를 갖는 콜라겐층이 적층된 복합 콜라겐 멤브레인
   
7. 복합 콜라겐 멤브레인의 제조 방법에 있어서,
   포유류 유래 콜라겐인 type 1 및/또는 type 3 콜라겐을 수용액 상태로 용해시키는 콜라겐 용해 단계;
   상기 콜라겐이 용해된 수용액에 인산염, 칼슘염, 나트륨염 또는 이들의 혼합물인 염화합물 수용액을 0.1 ~ 10 M의 농도 범위로 첨가하는 염처리 단계;
   염처리 단계를 거친 콜라겐 수용액에 가교제를 사용하여 서로 다른 가교도를 갖는 복수의 콜라겐매트릭스를 형성하는 가교 단계;
   상기 복수의 콜라겐 매트릭스를 각각 유기용매와 물이 부피비로 1:1 혼합된 유기용매 혼합 수용액에 침지시키는 유기용매 처리 단계; 및
   유기용매 처리된 복수의 콜라겐 매트릭스를 물리적 압착 및/혹은 열 압착시키는 압착 단계;를 포함하고,
   상기 복수의 콜라겐 매트릭스는, 가교도가 C1인 외부 콜라겐 멤브레인;과 가교도가 C2인 내부 콜라겐 멤브레인;을 포함하며,
   상기 외부 콜라겐 멤브레인의 가교도 C1은, 내부 콜라겐 멤브레인의 가교도 C2보다 높아, 외부 콜라겐 멤브레인의 생분해 속도가 내부 콜라겐 멤브레인의 생분해 속도보다 느리고,
   상기 외부 콜라겐 멤브레인은, 내부 콜라겐 멤브레인의 위와 아래에 위치하여, 상기 내부 콜라겐 멤브레인이 외부 콜라겐 멤브레인에 의해 둘러 쌓인 것을 특징으로 하는, 상이한 생분해 속도를 갖는 콜라겐층이 적층된 복합 콜라겐 멤브레인의 제조 방법.
   
8. 제7항에서,
   상기 가교제는 formaldehyde, α-hydroxyadipaldehyde, glutaraldehyde, 또는 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide/N-hydroxy succinimide (EDC/NHS) 로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 상이한 생분해 속도를 갖는 콜라겐층이 적층된 복합 콜라겐 멤브레인의 제조 방법.
   
9. 제7항에 있어서,
   상기 가교 단계는, 4 내지 24 시간의 가교 처리 시간과 10 ~ 37 의 가교 처리 온도의 범위 내에서 가교제의 농도, 가교처리 시간 또는 가교처리 온도를 변화시킴으로써, 가교도가 상이한 복수의 콜라겐 멤브레인 매트릭스를 제조하는 것을 특징으로 하는, 상이한 생분해 속도를 갖는 콜라겐층이 적층된 복합 콜라겐 멤브레인의 제조 방법.
   
10. 제7항에 있어서,
    상기 유기용매는, 에틸 알코올, 에틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, 에틸에테르, 부탄올, 이소프로필 알코올, 메탄올, 메톡시에탄올 및 아세톤 중에서 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 상이한 생분해 속도를 갖는 콜라겐층이 적층된 복합 콜라겐 멤브레인의 제조 방법.
    
11. 삭제

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