KR101951933B1

KR101951933B1 - 라이소포스파티딜콜린 또는 이의 유도체를 포함하는 지질나노물질 및 이의 제조방법

Info

Publication number: KR101951933B1
Application number: KR1020130026030A
Authority: KR
Inventors: 정재준; 김명화; 설두진; 구세광; 성수현; 김영삼
Original assignee: 주식회사 아리바이오
Priority date: 2013-03-12
Filing date: 2013-03-12
Publication date: 2019-02-25
Also published as: WO2014142517A1; CN105246487A; ES2690393T3; KR20140112622A; EP2974715A1; EP2974715B1; EP2974715A4; JP6259474B2; JP2016518313A; US10265333B2; US20160022711A1

Abstract

본 발명은 라이소포스파티딜콜린 또는 그의 에테르 유도체-함유 지질나노물질, 이의 제조방법, 상기 화합물의 적혈구 용혈현상과 응집현상을 감소시키는 방법, 그리고 상기 지질나노물질을 포함하는 약제학적 제제에 관한 것이다. 본 발명은 라이소포스파티딜콜린 또는 그의 에테르 유도체를 유효성분으로 하는 패혈증, 세균성 감염 질환 등의 치료제로서 유용하게 활용될 수 있다.

Description

라이소포스파티딜콜린 또는 이의 유도체를 포함하는 지질나노물질 및 이의 제조방법{Lipid nonomaterials comprising lysophosphatidylcholine or its derivative and Methods for preparing the same}

본 발명은 라이소포스파티딜콜린 또는 그의 에테르 유도체-함유 지질나노물질, 이의 제조방법, 상기 화합물의 적혈구 용혈현상과 응집현상을 감소시키는 방법, 그리고 상기 지질나노물질을 포함하는 약제학적 제제에 관한 것이다.

라이소포스파티딜콜린(lysophosphatidylcholine, LPC)은 산화 저밀도 지단백질의 주요구성 성분으로, 단핵구, 탐식세포 및 중성호성 백혈구를 포함한 다양한 면역 담당 세포를 활성화시켜 패혈증에 비교적 유용한 효과를 나타내는 것으로 알려져 있다. 또한, 복막염 동물모델과 맹장 결찰 및 천공(Cecal Ligation and Puncture, CLP) 동물모델에서 LPC 투여에 의하여 복막염에 기인한 사망률이 유의하게 억제되며, 선천성 면역증강 작용에 의하여 복막염, 페렴, 골수염, 봉소염, 골수염 등을 비롯한 다양한 세균성 감염질환 치료에 효과가 있음이 알려져 있다(한국등록특허 제10-0842160호, 한국등록특허 제10-0849448호). 또한, LPC는 급성 호흡곤란 증후군 및 다발성 장기부전의 치료제로서 사용될 수 있음이 알려져 있다(한국등록특허 제10-0842159호).

그러나, LPC 화합물은 수상 매질(aqueous phase)에 대한 용해도가 매우 낮아 멸균수, 주사용수, 탈이온수 및 완충용매와 같은 의약품 제조용 수상에 용해하여 투여 시 체내이용률이 낮거나, LPC 화합물이 가용화된 제제라 할지라도 체내 투여 직후 체액 및 조직에서 석출되는 등 안정한 약제학적 제제의 개발에 한계가 있었다. 또한, LPC 화합물은 적혈구의 용혈 및 응집을 유도하고(Tanaka Y. et al., J Biochem. 94(3):833-40(1983)), 동물실험에서 피하투여 시 현저한 LPC 자체의 국소 자극성이 나타나(Ryborg AK, et al., Acta Derm Venereol. 80(4):242-6(2000)), 이를 극복하기 위한 새로운 제형의 개발이 요구된다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 라이소포스파티딜콜린이 나타내는 낮은 용해도 문제, 국소 자극성 문제 및 적혈구 용혈과 응집현상 문제를 해소하기 위하여 연구 노력하였다. 그 결과, 라이소포스파티딜콜린을 지질나노물질 형태로 제형화하고, 상기 지질나노물질 제형이 국소 자극성을 나타내지 않음을 동물실험을 통하여 확인하였으며, 라이소파티딜콜린의 적혈구 용혈 및 응집현상을 현저히 개선시킬 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 라이소포스파티딜콜린 또는 그의 에테르 유도체를 포함하는 지질나노물질을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 지질나노물질의 제조방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 라이소포스파티딜콜린 또는 그의 에테르 유도체의 독성을 감소시키는 방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 라이소포스파티딜콜린 또는 그의 에테르 유도체의 적혈구 용혈현상 또는 응집현상을 감소시키는 방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 라이소포스파티딜콜린 또는 그의 에테르 유도체를 포함하는 경구 또는 비경구 투여용 약제학적 제제를 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 트리글리세라이드, 오일 및 레시틴을 포함하는 지질구조물; 및 (b) 약제학적 활성성분으로서 라이소포스파티딜콜린 또는 그의 에테르 유도체를 포함하는 지질나노물질을 제공한다.

본 발명자들은 라이소포스파티딜콜린이 나타내는 낮은 용해도 문제, 국소 자극성 문제 및 적혈구 용혈과 응집현상 문제를 해소하기 위하여 연구 노력하였다. 그 결과, 라이소포스파티딜콜린을 지질나노물질 형태로 제형화 하고, 상기 지질나노물질 제형이 국소 자극성을 나타내지 않음을 동물실험을 통하여 확인하였으며, 라이소파티딜콜린의 적혈구 용혈 및 응집현상을 현저히 개선시킬 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

본 명세서에서 사용된 용어, "지질구조물(lipid construct)"은 트리글리세라이드, 오일 및 레시틴을 포함하는 지질혼합물을 사용하여 제조된 나노크기의 물질(예컨대, 나노입자)을 의미하며, 용어 "지질나노물질(lipid nanomaterial)"은 상기 지질구조물과 라이소포스파티딜콜린 또는 그의 유도체를 모두 포함하는 나노크기의 물질을 의미한다. 상기 지질나노물질은 나노크기를 갖는 물질이라면 형태 및 모양은 특별히 한정되지 않는다.

본 발명의 일구현예에 따르면, 상기 지질나노물질은 지질나노입자(lipid nano particle)이다. 하나의 특정예에서 상기 지질나노입자는 1-1000 nm의 직경을 가지고, 다른 특정예에서는 1-500 nm의 직경을 가지며, 또 다른 특정예에서는 20-200 nm의 직경을 갖는다. 상기 지질나노입자의 크기가 1 nm 미만이면 약물 봉입율이 저하되며, 크기가 1000 nm를 초과하면 주사제로서 사용하기 어렵다.

본 발명의 일구현예에 따르면, 본 발명의 지질구조물(혹은 지질나노물질)은 에멀젼상의 나노입자이다.

본 발명의 일구현예에 따르면, 상기 지질구조물의 구성성분에 있어서, 트리글리세라이드 및 오일은 지질구조물(혹은 지질나노물질)의 구조를 형성하는 지질성분이며, 레시틴은 유화제(emulsifier)이다.

본 발명의 일구현예에 따르면, 상기 트리글리세라이드는 중간 사슬 트리글리세라이드(middle chain triglyceride, MCT)일 수 있다. 상기 중간 사슬 트리글리세라이드는 글리세롤(glycerol)의 C₆-C₁₂ 지방산 에스터 화합물이다. 본 발명에서 사용할 수 있는 중간 사슬 트리글리세라이드는 Miglyol 812(Caprylic/Capric Triglyceride), Miglyol 818(Caprylic/Capric/Linoleic Triglyceride), Miglyol 829(Caprylic/Capric/Succinic Triglyceride) 및 이들의 조합을 포함한다.

본 발명의 일구현예에 따르면, 상기 오일은 식물성 오일이다. 본 발명에서 사용가능한 식물성 오일은 대두유, 야자유, 유채유, 해바라기씨유, 땅콩 오일, 면화씨 오일, 야자핵유, 코코넛유, 양귀비씨 오일, 홍화유, 참기름, 옥수수유, 올리브유, 카놀라유 및 이들의 조합을 포함한다.

본 발명의 일구현예에 따르면, 상기 레시틴은 에그 레시틴, 대두유 레시틴, Non-GMO 레시틴, 평지씨(rapeseed) 레시틴, 해바라기 레시틴, 리소레시틴(Lysolecithin) 및 이들의 조합을 포함한다.

본 발명의 일구현예에 따르면, 상기 지질구조물은 이의 구조를 형성할 수 있는 인지질, 지질구조물이 서로 응집되는 것을 방지할 수 있는 이온성 지질, 또는 지질구조물의 구조를 안정화 할 수 있는 안정화제를 더 포함할 수 있다.

하나의 특정예에 따르면, 상기 지질구조물에 첨가할 수 있는 인지질은 임의의 인지질 또는 리포좀을 형성할 수 있는 인지질의 조합체이다. 예를 들면, 계란, 대두, 또는 기타 식물원으로부터 얻어진 천연 인지질, 반합성 인지질 또는 합성 인지질을 포함하는 포스파티딜콜린(HSPC), 지질 사슬의 길이가 다양한 인지질, 및 불포화 인지질이 본 발명에서 사용될 수 있다. 구체적으로, 디스테아로일포스파티딜콜린(DSPC), 수소화 콩 파스파티딜콜린(HSPC), 콩 포스파티딜콜린(Soy PC), 계란 포스파티딜콜린(Egg PC), 수소화 계란 포스파티딜콜린(HEPC), 디팔미토일포스파티딜콜린(DPPC), 디마이리스토일포스파티딜콜린(DMPC) 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상을 사용할 수 있다.

하나의 특정예에 따르면, 상기 지질구조물에 첨가할 수 있는 이온성 지질은 음이온성 지질 또는 양이온성 지질이다. 상기 음이온성 지질의 예로는 디마이리스토일포스파티딜글리세롤(DMPG), 디라우릴포스파티딜글리세롤(DLPG), 디팔미토일포스파티딜글리세롤(DPPG), 디스테아로일포스파티딜글리세롤(DSPG), 디마이리스토일포스파티드산(DMPA), 디스테아로일포스파티드산(DSPA), 디라우릴포스파티드산(DLPA), 디팔미토일포스파티드산(DPPA) 및 이들의 조합을 들 수 있다. 또한, 상기 양이온성 지질의 예로는 디올레릭트리메틸암모늄프로판(DOTAP), 디메틸옥타덱시암모늄(DMOA), 디올레릭포스파틸에탄올아민(DOPE), 디알킬디메틸암모늄브로마이드(DXDAB), 디알킬트리메틸암모늄프로판(DXTAP) 및 이들의 조합을 들 수 있다.

하나의 특정예에 따르면, 상기 지질구조물에 첨가할 수 있는 안정화제는 EDTA(ethylenediaminetetraacetate) 또는 이의 염(예컨대 나트륨염)이다.

본 발명의 일구현예에 따르면, 상기 지질 구조물의 트리글리세라이드:오일:레시틴의 중량비는 1:0.5-10:1-15일 수 있다. 하나의 특정예에서 상기 중량비는 1:0.5-3:2-10이며, 다른 특정예에서는 1:0.5-2:2-5이다.

본 발명의 지질나노물질은 약제학적 활성성분으로서 라이소포스파티딜콜린 또는 그의 에테르 유도체를 포함한다. 상기 라이소포스파티딜콜린 또는 유도체는 패혈증, 세균성 감염 질환(예컨대, 복막염, 폐렴), 급성 호흡곤란 증후군 및 다발성 장기부전 등의 질병(질환)에 효과가 있는 것으로 알려져 있다.

본 발명의 일구현예에 따르면, 상기 라이소포스파티딜콜린은 하기 화학식 1로 표시될 수 있다.

화학식 1

상기 식에서, R₁은 C_4-30의 알킬이거나, 하나 또는 그 이상의 이중결합을 지닌 C_4-30의 알케닐이다.

하나의 특정예에 따르면, 상기 화학식 1로 표시되는 라이소포스파티딜콜린은 _L-_α-라이소포스파티딜콜린, 스테아로일; _L-_α-라이소포스파티딜콜린, 미리스토일; _L-_α-라이소포스파티딜콜린, 팔미토일; _DL-_α-라이소포스파티딜콜린, 팔미토일; 및 _L-_α-라이소포스파티딜콜린, 올레오일로 구성된 군으로부터 선택된다.

본 발명의 일구현예에 따르면, 상기 라이소포스파티딜콜린의 에테를 유도체는 하기 화학식 2로 표시될 수 있다.

화학식 2

상기 식에서, R₂는 C_4-30의 알킬이거나, 하나 또는 그 이상의 이중결합을 지닌 C_4-30의 알케닐이다.

하나의 특정예에 따르면, 상기 화학식 2로 표시되는 라이소포스파티딜콜린의 유사체는 _L-_α-라이소포스파티딜콜린, _γ-O-알크-1-에닐; _L-_α-라이소포스파티딜콜린, _γ-O-알킬; _DL-_α-라이소포스파티딜콜린, _γ-O-헥사데실; 및 _L-_α-라이소포스파티딜콜린, _γ-O-헥사데실로 구성된 군으로부터 선택된다.

본 발명의 일구현예에 따르면, 상기 라이소포스파티딜콜린 또는 그의 에테르 유도체와 지질구조물의 중량비는 1:1-50일 수 있다. 하나의 특정예에서 상기 중량비는 1:1-10이고, 다른 특정예에서는 1:3-7이다.

본 발명의 일구현예에 따르면, 상기 지질나노물질은 라이소파티딜콜린 또는 그의 에테르 유도체에 비하여 (i) 용해도 향상, (ii) 독성 감소, (iii) 적혈구 용혈현상 감소, 및/또는 (iv) 적혈구 응집현상 감소의 특성을 갖는다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 상기 지질나노물질의 약제학적 유효량; 및 (b) 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 경구 또는 비경구 투여용 약제학적 제제를 제공한다.

본 발명에 따른 지질나노물질은 다양한 경구 또는 비경구 투여 형태로 제형화 될 수 있다. 경구 투여용 제형으로는, 예를 들면 정제, 환제, 경/연질 캅셀제, 액제, 시럽제, 과립제, 엘릭시르제(elixir) 등이 있으며, 이들 제형은 상기 유효성분 외에 통상적으로 사용되는 충진제, 증량제, 습윤제, 붕해제, 활택제, 결합제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제와 같은 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 사용하여 제조될 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences(19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.

상기 붕해제로는 한천, 전분, 알긴산 또는 이의 나트륨염, 무수인산일수소 칼슘염 등이 사용될 수 있고, 활택제로는 실리카, 탈크, 스테아르산 또는 이의 마그네슘염 또는 칼슘염, 폴리에틸렌 글리콜 등이 사용될 수 있으며, 결합제로는 마그네슘 알루미늄 실리케이트, 전분 페이스트, 젤라틴, 트라가칸스, 메틸셀룰로오스, 나트륨 카복시메틸셀룰로오스, 폴리비닐피롤리딘, 저치환도 하이드록시프로필셀룰로오스 등이 사용될 수 있다. 이외에도 락토즈, 덱스트로오스, 수크로오스, 만니톨, 소르비톨, 셀룰로오스, 글리신 등을 희석제로 사용할 수 있으며, 경우에 따라서는 일반적으로 알려진 비등 혼합물, 흡수제, 착색제, 향미제, 감미제 등을 함께 사용할 수 있다.

본 발명에 따른 약제학적 제제는 비경구 투여할 수 있으며, 비경구 투여는 피하주사제, 정맥주사제, 근육 내 주사제 또는 흉부 내 주사제를 주입하는 방법, 또는 경피 흡수제에 의해 경피 투여하는 방법을 포함한다. 이때, 주사제로 제제화하기 위해서는 라이소포스파티딜콜린 또는 그의 에테르 유도체를 안정제 또는 완충제와 함께 물에서 혼합하여 용액 또는 현탁액으로 제조하고, 이를 앰플 또는 바이알의 단위 투여형으로 제조할 수 있다. 또한, 경피흡수제로 제제화하기 위해서는 약물보호층, 약물저장층, 방출속도조절막 및 점착제 등으로 구성되는 패치형의 약물저장층에 저장시켜 제제화 될 수 있다.

상기 약제학적 제제는 멸균되거나 또는 방부제, 안정화제 또는 삼투압 조절을 위한 염, 완충제 등의 보조제, 및 기타 치료적으로 유용한 물질을 함유할 수 있으며, 통상적인 방법인 혼합, 과립화 또는 코팅 방법에 따라 제제화 될 수 있다. 필요한 경우, 본 발명의 약제학적 제제는 기타의 약제, 예를 들면, 다른 패혈증 치료제와 병용 투여할 수도 있다.

상기 약제학적 제제는 수상의 용매(물)를 포함할 수 있다.

본 발명의 약제학적 제제를 단위 용량 형태로 제형화 하는 경우, 유효성분으로서 라이소포스파티딜콜린 또는 그의 에테르 유도체가 약 0.1-1,500 mg의 단위 용량으로 함유되도록 할 수 있다. 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적(상처) 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 성인 치료에 필요한 투여량은 투여의 빈도와 강도에 따라 하루에 약 1-500 mg 범위가 보통이다. 성인에게 근육 내 또는 정맥 내 투여 시 일 회 투여량으로 분리하여 하루에 보통 약 5-300 mg의 전체 투여량이면 충분할 것이나, 일부 환자의 경우 더 높은 일일 투여량이 바람직할 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 약제학적 제제는 에틸렌디아민사초산, 에리솔빈산, 디부틸히드록시톨루엔, 부틸히드록시아니솔, 몰식자산프로필, 아스콜빈산, 알파-토코페롤, 베타-토코페롤, 감마-토코페롤 및 델타-토코페롤 등의 통상적으로 사용되는 항산화제를 포함할 수 있다. 나아가, 본 발명에 따른 약제학적 제제는 수크로즈, 만니톨 등의 통상적으로 사용되는 장성 조절제(tonicity modifier)를 포함할 수 있다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 라이소포스파티딜콜린 또는 그의 에테르 유도체-함유 지질나노물질의 제조방법을 제공한다:

(a) 라이소포스파티딜콜린 또는 그의 에테르 유도체를 수상 용매, 트리글리세라이드, 오일 및 레시틴과 혼합하여 지질혼합물 용액을 얻는 단계;

(b) 단계 (a)의 지질혼합물 용액을 균질화 하는 단계;

(c) 단계 (b)에서 균질화한 지질혼합물 용액의 pH를 3-7로 조절하는 단계; 그리고

(d) 단계 (c)에서 pH가 조절된 지질혼합물 용액을 에멀젼화 하여 나노 크기의 지질나노물질을 형성하는 단계.

본 발명의 지질나노물질의 제조방법과 상기에서 설명한 지질나노물질 사이의 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 생략한다.

본 발명의 단계 (a)에서는 트리글리세라이드, 오일 및 레시틴을 포함하는 지질혼합물과 라이소포스파티딜콜린 또는 그의 에테르 유도체를 수상 용매에 첨가하여 지질혼합물 용액을 얻는다.

본 발명의 일구현예에 따르면, 상기 라이소포스파티딜콜린 또는 그의 에테르 유도체:트리글리세라이드:오일:레시틴의 중량비는 1:0.5-10:0.5-10:1-15일 수 있다. 하나의 특정예에서 상기 중량비는 1:0.5-3:0.5-3:2-10이며, 다른 특정예에서는 1:0.5-2:0.5-2:2-5이다.

본 발명의 일구현예에 따르면, 상기 지질혼합물 용액에서 트리글리세라이드, 오일, 레시틴 및 라이소포스파티딜콜린(또는 그의 에테르 유도체)의 농도는 1-100 mg/㎖일 수 있다.

본 발명의 일구현예에 따르면, 단계 (a)에서는 항산화제 또는 장성 조절제를 첨가하여 지질혼합물 용액을 제조할 수 있다.

본 발명의 단계 (b)에서는 통상의 균질화 방법을 통하여 지질혼합물 용액을 균질화한다.

본 발명의 일구현예에 따르면, 상기 균질화는 호모게나이져를 사용하여 2,000-10,000 rpm(예컨대, 3,000-7,000 rpm)으로 균질화 할 수 있다. 균질화 시간은 특별이 제한되지 않으며, 2-4시간 동안 균질화 할 수 있고, 이러한 균질화 과정을 2회 이상 반복하여 실시할 수 있다.

본 발명의 단계 (c)에서는 균질화한 지질혼합물 용액에 산 혹은 염기를 가하여 용액의 pH가 3-7이 되도록 조절한다. 상기와 같이 pH를 조절하는 경우 지질나노물질의 약제학적 이용 및 안정성에 유리하다.

본 발명의 일구현예에 따르면, 단계 (c)에서는 지질혼합물 용액의 pH가 4-6이 되도록 조절할 수 있다.

본 발명에서는 pH 조절된 지질혼합물 용액을 추가적으로 균질화 할 수 있다.

본 발명의 단계 (d)에서는 pH 조절된 지질혼합물 용액을 에멀젼화 하여 나노 크기의 지질나노물질을 형성시킨다. 상기 에멀젼화는 마이크로플루이딕 시스템 또는 인캡슐레이터를 사용하여 실시할 수 있다.

본 발명의 일구현예에 따르면, 최종적으로 제조된 지질나노물질은 반투명한 에멀젼이다.

본 발명의 일구현예에 따르면, 단계 (d)에서는 필요에 따라서 포어(pore) 크기가 0.1-0.5 ㎛인 막을 이용하여 여과멸균을 추가로 수행할 수 있다. 상기 막의포어 크기가 0.1 ㎛ 미만일 경우에는 일부 지질나노물질이 통과하지 못하게 되며, 0.5 ㎛를 초과하는 경우에는 주사제에 적합하지 못한 크기의 지질나노물질이 함유될 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 (a)-(d) 단계를 포함하는 라이소포스파티딜콜린 또는 그의 에테르 유도체의 독성을 감소시키는 방법을 제공한다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 (a)-(d) 단계를 포함하는 라이소포스파티딜콜린 또는 그의 에테르 유도체의 적혈구 용혈현상 또는 적혈구 응집현상을 감소시키는 방법을 제공한다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 (a)-(d) 단계를 포함하는 라이소포스파티딜콜린 또는 그의 에테르 유도체의 용해도를 향상시키는 방법을 제공한다.

하기 실시예에서 확인된 바와 같이, 본 발명의 지질나노물질은 라이소포스파티딜콜린(또는 그의 에테르 유도체)이 나타내는 독성 문제, 적혈구 용혈 문제 및 적혈구 응집 문제를 개선하는 효과를 나타낸다. 따라서, 상기 (a)-(d) 단계를 통하여 상기 화합물을 지질나노물질로 제형화함으로써 라이소포스파티딜콜린 또는 그의 에테르 유도체의 안전성을 향상시킬 수 있으며, 이를 통하여 의학적 이용을 보다 촉진시킬 수 있다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(i) 본 발명은 라이소포스파티딜콜린 또는 그의 에테르 유도체-함유 지질나노물질, 이의 제조방법 및 이의 용도에 관한 것이다.

(ii) 본 발명의 지질나노물질은 용해도, 독성, 적혈구 용혈 및 응집현상에 있어서, 라이소포스파티딜콜린 및 또는 그의 에테르 유도체에 비하여 현저히 개선된 특성을 나타낸다.

(iii) 따라서, 본 발명은 라이소포스파티딜콜린 또는 그의 에테르 유도체를 유효성분으로 하는 패혈증, 세균성 감염 질환 등의 치료제로서 유용하게 활용될 수 있다.

도 1은 실시예 1에서 제조한 지질나노물질의 입자크기를 보여준다.
도 2는 LPC 농도계산을 위한 표준품 검량 곡선이다.
도 3은 LPC의 국소 자극성(독성)을 보여주는 마우스 피부 사진이다.
도 4a 및 4b는 LPC-F 또는 LPC-API 투여에 따른 국소 자극성(독성)을 보여주는 마우스 사진이다.
도 5a 및 5b는 LPC-F 또는 LPC-API 투여에 따른 국소 자극성(독성)을 보여주는 조직병리학적 결과를 나타낸다. EP: 상피, ED: 표피, DM: 진피, HL: 모낭, CM: 몸통피부근(cutaneous trunci muscle), 스케일바: 160 ㎛.
도 6a 및 6b는 적혈구 용혈현상에 대한 LPC 생리식염수 현탁액(LPC-API) 또는 LPC 지질나노물질 제제(LPC-F)의 영향을 보여준다.
도 7a 및 7b는 적혈구 응집현상에 대한 LPC 생리식염수 현탁액(LPC-API) 또는 LPC 지질나노물질 제제(LPC-F)의 영향을 보여준다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

실시예 1. LPC를 포함하는 지질나노물질 제조

라이소포스파티딜콜린(LPC 18:0, NOF) 5.00g, 에그 레시틴(Lipoid E-80) 15.00g, 대두유 5.00g, 수크로오스 50.00g, EDTA2Na2H₂O 27.5 mg 및 중간 사슬 트리글리세라이드(Miglyol 812) 5.00g에 정제수를 투입하여 총 중량 500g으로 만들었다. 20-25℃로 유지하면서 호모게나이저(L5M-A, Silverson)로 5000 rpm에서 3시간 동안 혼합된 용액을 균질화 하였다. 위 과정을 두 번 수행하여 균질화한 용액 1,000g을 0.1N 수산화나트륨 용액 또는 0.1N 염산 용액을 사용하여 pH 5.5로 조절하였다. pH 조절 후 30분간 더 균질화한 후 다시 한 번 pH를 5.5로 조절하였다. pH 조절을 한 용액을 10℃ 이하에서 냉장 보관하였다. 상기와 같은 과정을 8회 반복하여 pH 5.5로 조절된 용액 8,000g을 제조하였다.

상기 라이소포스파티딜콜린 화합물을 포함하는 지질혼합물 용액을 마이크로플루다이져(M-110EH-30, MFIC Corp.)를 이용하여 25,000 psi의 압력으로 균질화 하여 에멀젼화 하였다. 이러한 균질화 과정을 5회 반복한 다음 0.2 ㎛ 막에 여과하여 라이소포스파티딜콜린 화합물을 포함하는 액체 상태의 지질나노입자를 제조하였다.

실시예 2. LPC를 포함하는 지질나노물질의 크기 측정

실시예 1의 지질나노입자 크기를 입자분석기(ELS-Z2, Otsuka)를 이용하여 측정하여 결과를 표 1 및 도 1에 나타내었다.

	분산방법	입자크기(nm)
실시예 1	지질혼합물 용액에 물을 첨가하여 분산시킴	87.2

실시예 3. LPC 농도 계산

실시예 1에서 제조된 지질나노입자가 함유된 제제 내의 라이소포스파티딜콜린 화합물의 농도계산은, 18:0 LPC 표준용액을 사용하여 ELSD 정량 HPLC 조건으로 분석한 라이소포스파티딜콜린 화합물의 면적비를 도 1에서 나타낸 표준곡선의 면적비와 대비하여 계산하였다.

실시예 4. LPC를 포함하는 지질나노물질의 안정성 평가

실시예 1에서 제조된 지질나노입자를 냉동, 냉장, 실온 및 가온하면서 보관하는 동안 안정성을 평가하였다. 평가 결과는 표 2에 나타내었다.

표 2에 나타난 바와 같이, 액상의 지질나노입자는 1개월 동안 냉동, 냉장, 실온 및 가온보관(30℃)한 후에도 형상, 순도, 입자크기 및 pH를 유지하는 안정성을 나타내었다.

실시예 5. LPC 를 포함하는 지질나노물질 제제의 마우스 피하 투여 국소 자극성 실험

5-1. 실험방법

실시예 1에서 제조된 LPC를 포함하는 지질나노입자 제제(LPC-F; 18:0 LPC 농도: 10 mg/㎖)의 국소 자극성을 평가하기 위하여, 제모된 마우스의 등쪽 피부에 20, 10 및 5 ㎖/kg(18:0 LPC 200, 100 및 50 mg/kg)의 용량으로 단회 피하 투여하고, 한국식품의약품안전청 고시 제2009-116 "의약품 등의 독성시험 기준" [2009]에 의거하여 14일 동안의 사망률, 체중 변화, 임상증상, 및 투여부위 주위 피부의 육안 및 조직병리학적 변화를 동일한 농도의 라이소포스파티딜콜린 원료(LPC-API) 10 mg/㎖ 생리식염수 현탁액 피하 투여군과 각각 비교 검토하였다. 본 실험에서 음성 대조물질로 생리식염수를 사용하였으며, 최고 투여량 200 mg/kg은 설치류 최대 허용 투여용량인 20 ㎖/kg(Flecknell, 1996; KFDA Guidelines, Notification 2009-116, 2009; OECD Guidelines, #423, 2001)을 기준으로 설정하여 중간 및 저용량 투여군에서는 각각 10 및 5 ㎖/kg으로 설정하였다.

실험동물은 수컷 ICR 마우스로서 입수 시 6주령(체중 30-32g)을 28일 순화 후 10주령(체중 36.4-49.0g)을 사용하였고, 하기와 같이 그룹을 분류하여 실험을 진행하였다.

모든 데이터는 5마리 마우스의 평균 ± 표준편차로 표현하였다. 복용량이 다른 그룹을 위한 다중비교 검사를 수행하였다. 변이 균질성(Variance homogeneity)은 Levene test(Levene A, Clin Otalary, 1981;6:145-51)를 사용하여 조사하였다. Levene test 결과가 변이 균질성으로부터 유의성 없는 편차가 도출된 경우, 그룹 비교의 어느 그룹 쌍이 상당히 상이한가를 결정하기 위하여, 얻어진 데이터를 one way ANOVA test 후의 Scheffe test에 의하여 분석하였다. 또한, 변이 균질성으로부터 유의성 있는 편차가 Levene test에서 관찰되는 경우에는 non-parametric comparison test 및 Kruskal-Wallis H test를 수행하였다. Kruskal-Wallis H test에서 유의성 있는 차이가 관찰된 경우, 상당히 다른 차이를 보이는 특정 그룹 쌍을 결정하기 위하여 Mann-Whitney U-Wilcoxon Rank Sum W test를 수행하였다. 통계학적 분석은 SPSS(Release 14.0K, SPSS Inc., USA; Ludbrook, Clin Exp Pharmacol Physiol, 1997;24:294-6)를 사용하여 수행하였다. p < 0.05를 통계적 유의성으로 고려하였다.

5-2. 실험결과

<사망률>

LPC-F 투여와 관련된 사망례는 14일간의 관찰기간 동안 발생하지 않았다.

<임상증상>

음성매체 대조군 및 모든 3용량의 LPC-F 투여군에서는 별 다른 이상증상이 관찰되지 않았다. 그러나, LPC-API 200, 100 및 50 mg/kg 투여군에서는 경미 [1+] 하거나 중등도 [2+]의 투여부위 주위 피부 궤양 소견이 투여 종료 48시간 후부터 나타나기 시작하여, LPC-API 200, 100 및 50 mg/kg 투여군에서 다양한 [1-3+] 정도의 투여부위 주위 피부궤양 소견이 투여 후 3일부터 각각 5례(5/5; 100%), 3례(3/5; 60%) 및 3례(3/5; 60%) 확인되었다(표 4 및 도 3).

<육안부검 소견>

음성매체 대조군 및 모든 3용량의 LPC-F 투여군에서는 투여부위 주위에서 의미 있는 육안부검 소견이 확인되지 않은 반면, LPC-API 200, 100 및 50 mg/kg 투여군에서는 다양한 [1-3+] 정도의 투여부위 주위 피부 궤양 소견이 각각 5례(5/5; 100%), 3례(3/5; 60%) 및 3례(3/5; 60%) 확인되었다(표 5 및 도 4).

<조직병리학적 소견>

음성매체 대조군 및 모든 3용량의 LPC-F 투여군에서는 투여부위 주위 피부에서 의미 있는 조직병리학적 변화가 확인되지 않았다. 그러나, LPC-API 200, 100 및 50 mg/kg 투여군에서는 다양한 [1-3+] 정도의 국소 피부탈락, 상피 증생, 진피 결합조직의 coarse화, 염증세포 침윤 및 동피근의 용해소견 등의 전형적인 피부 궤양 소견이 각각 5례(5/5; 100%), 3례(3/5; 60%) 및 3례(3/5; 60%) 확인되었다(표 6 및 도 5).

<결 론>

실험물질의 피하투여 후 관찰되는 투여부위 주위의 육안 및 조직병리학적 변화는, 피하투여 물질의 국소 자극성에 대해 빠르고 신뢰성 있는 증거를 제공해주며, 이를 통해 다양한 물질의 국소 자극성이 평가되어 왔다(Gunzel VP, et al., Arzneimittelforschung. 26:1476-9(1976); Limberger and Lenz, Dtsch Stomatol. 41:407-10(1991); Reuling et al., Dtsch Zahnarztl Z. 46:694-81991(1991)). 본 실험의 결과, LPC-API의 단회 피하투여는 현저한 투여부위 주위의 피부 궤양을 유발하였으나, LPC-F 투여군에서는 음성 매체 대조군과 비교하여 별다른 투여부위 주위 피부의 이상 소견이 확인되지 않았다.

이러한 결과는, LPC가 나타내던 국소 자극성이 본 발명의 지질나노입자 제제에 의해 현저히 개선되었음을 나타낸다.

실시예 6. LPC를 포함하는 지질나노물질 제제의 용혈 및 적혈구 응집 평가

6-1. 실험방법

실시예 1에서 제조된 LPC를 포함하는 지질나노입자(LPC-F; 18:0 LPC 농도: 10 mg/㎖)의 용혈 및 적혈구 응집 유발 정도를 평가하기 위하여, 200 ㎕의 생리식염수, 멸균증류수, 6 농도(원액, 2, 4, 8, 16 및 32배 희석)의 LPC-F, 또는 제제화 되지 않은 라이소포스파티딜콜린(LPC-API) 10 mg/㎖ 생리식염수 현탁액을 1 ㎖의 헤파린 처리 랫트(SD rat) 전혈에 첨가한 다음, 37℃의 온도로 진탕배양기(shaking incubator)에서 100 rpm으로 3시간 동안 인큐베이션 하였다. 제조된 LPC-F는 생리식염수로 배수 희석하여 6 농도를 준비하였으며, LPC-API를 생리식염수에 현탁하여 10 mg/㎖ 농도로 준비한 다음 역시 생리식염수로 배수 희석하여 원액을 포함하여 6 농도로 준비하였다. 실험은 5회 반복 실시하였으며, 가능하면 동일 동물에서 채혈된 혈액을 동일 실험에 사용하였다. 진탕 배양기에서 100 rpm으로 인큐베이션 한 다음 형성된 적혈구 응집소를 반정량(semiquantitative)적으로 평가하고, 12,500 rpm으로 10분간 원심분리한 다음 상층액에서 570 nm의 흡광도를 측정하여 용혈성을 각각 평가하였다. 적혈구의 용혈은 하기 수학식 1에 따라 계산하였으며, 용혈지수가 5% 이상인 경우를 용혈 반응이 양성인 것으로 판단하였다.

[수학식 1]

용혈지수(%) = (OD 샘플 - OD 음성 / (OD 양성 - OD 음성) X 100

음성 = 식염수, 양성 = 증류수

적혈구 응집소의 반정량적 평가 기준은 다음과 같았다:

반정량 적혈구 응집 점수(최대=3)

0 = 비응집; 1 = 약간 응집; 2 = 중간 정도 응집; 3 = 심한 응집.

OD 값 및 반정량 적혈구 응집 점수는 5번의 독립적인 실험의 평균 ± 표준편차로 표현하였다. 복용량이 다른 그룹을 위한 다중비교 검사를 수행하였다. 변이 균질성(Variance homogeneity)은 Levene test(Levene A, Clin Otalary, 1981;6:145-51)를 사용하여 조사하였다. Levene test 결과가 변이 균질성으로부터 유의성 없는 편차가 도출된 경우, 그룹 비교의 어느 그룹 쌍이 상당히 상이한가를 결정하기 위하여, 얻어진 데이터를 one way ANOVA test 후의 least-significant differences (LSD) multi-comparison test에 의하여 분석하였다. 또한, 변이 균질성으로부터 유의성 있는 편차가 Levene test에서 관찰되는 경우에는 non-parametric comparison test 및 Kruskal-Wallis H test를 수행하였다. Kruskal-Wallis H test에서 유의성 있는 차이가 관찰된 경우, 상당히 다른 차이를 보이는 특정 그룹 쌍을 결정하기 위하여 Mann-Whitney U-Wilcoxon Rank Sum W test를 수행하였다. 통계학적 분석은 SPSS(Release 14.0K, SPSS Inc., USA; Ludbrook, Clin Exp Pharmacol Physiol, 1997;24:294-6)를 사용하여 수행하였다. p < 0.05를 통계적 유의성으로 고려하였다.

6-2. 실험결과

<용혈지수 변화>

LPC-F 4, 8, 16 및 32배 희석액, LPC-API 생리식염수 현탁액 16 및 32배 희석액 처리군에서는 양성 대조군인 멸균 증류수 처리군에 비해 유의성 있는 (p<0.01) 흡광도의 감소를 각각 나타내었다. 따라서, LPC-F 원액, 2, 4, 8, 16 및 32배 희석 처리군의 용혈지수(%)는 각각 144.28±18.82, 110.66±11.23, 53.70±6.57, 11.60±6.92, 8.65±2.38 및 -1.54±3.16%로 산출되었으며, LPC-API 생리식염수 현탁액 원액, 2, 4, 8, 16 및 32배 희석 처리군에서는 157.68±10.44, 148.65±15.01, 129.70±7.23, 117.67±5.97, 78.74±3.30 및 26.86±6.40%로 각각 산출되었다(도 6).

흡광도의 증가는 적혈구 용혈에 따른 혈색소의 혈장 내 노출을 의미하는 것이다(Kang C, et al., Comp Biochem Physiol C Toxicol Pharmacol. 150:85-90(2009); Zaporowska H, et al., Folia Histochem Cytobiol. 34:99-100(1996)). 본 실험의 결과, LPC-F 32배 희석액 처리군에서는 유의성 있는 OD값 증가가 나타나지 않았고, 용혈지수가 5% 미만이었으며, LPC-F 4배 희석액 처리군에서는 멸균증류수 양성 대조군에 비하여 적은 용혈효과를 나타내었으므로, LPC가 나타내는 용혈 효과가 본 발명의 지질나노입자 제제에 의하여 현저하게 감소되었음을 확인할 수 있었다. 반면, LPC-API 생리식염수 현탁액 처리군에서는 현저한 OD값의 증가가 확인되었으며, 처리 최저 농도인 32배 희석액 처리군을 포함한 모든 농도의 처리군에서 5% 이상의 용혈지수가 나타났다. LPC-API 생리식염수 현탁액 원액, 2, 4 및 8배 희석액 처리군에서는 멸균 증류수 양성 대조군에 비하여 유의성 있는 OD값의 증가가 확인되었다.

이러한 결과는 본 발명의 지질나노물질 제제에 의하여 LPC가 나타내는 용혈 반응이 현저히 개선될 수 있음을 나타낸다.

<적혈구 응집성 평가>

비처리 및 식염수 음성 대조군에 비하여 유의성 있는(p<0.01 또는 p<0.05) 적혈구 응집 점수의 증가가 LPC-API 생리식염수 현탁액 원액, 2 및 32배 희석액 처리군에서 확인되었으나, 최저 처리 농도인 32배 희석액을 포함한 모든 농도의 LPC-API 생리식염수 현탁액 처리군에서 적혈구 응집 점수의 현저한 증가가 관찰되었다. 그러나, 본 발명의 LPC-F 처리군에서는 멸균증류수 양성 대조군에 비해 현저히 낮은 적혈구 응집이 모든 처리군에서 인정되었고, 비처리 및 음성 대조군에 비해 유의성 있는 적혈구 응집 점수의 증가가 확인되지 않았다(도 7).

적혈구 응집의 증가는 혈류 장애 및 다양한 혈관 자극성을 유발하므로 잠재적 독성과 직결된다(Michel and Seipp, Arzneimittelforschung. 40:817-22(1990); Prasanthi K, et al., Toxicol In Vitro. 19:449-56(2005)). 본 실험 결과, LPC는 최저 처리 농도인 32배 희석액까지도 현저한 적혈구 응집 점수의 증가를 나타내었으나, 본 발명의 지질나노입자 제제는 원액을 포함한 모든 처리군에서 의미 있는 적혈구 응집 점수의 증가가 확인되지 않았다.

이러한 결과는 본 발명의 지질나노물질 제제에 의하여 LPC가 나타내는 적혈구 응집이 해소될 수 있음을 의미한다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims

(a) 중간 사슬 트리글리세라이드, 오일 및 레시틴을 포함하는 지질구조물; 및
(b) 약제학적 활성성분으로서 라이소포스파티딜콜린 또는 그의 에테르 유도체를 포함하며,
상기 중간사슬 트리글리세라이드:오일:레시틴의 중량비는 1:0.5-3:2-10 인 것을 특징으로 하는 지질나노물질로서,
상기 라이소포스파티딜콜린은 하기 화학식 1로 표시되고,
[화학식 1]

상기 화학식 1에서, R₁은 C_4-30의 알킬이거나, 하나 또는 그 이상의 이중결합을 지닌 C_4-30의 알케닐이고,
상기 에테르 유도체는 하기 화학식 2로 표시되며,
[화학식 2]

상기 화학식 2에서, R₂는 C_4-30의 알킬이거나, 하나 또는 그 이상의 이중결합을 지닌 C_4-30의 알케닐인 것인, 지질나노물질.
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제 1 항에 있어서, 상기 라이소포스파티딜콜린 또는 그의 에테르 유도체와 지질구조물의 중량비는 1:1-50인 것을 특징으로 하는 지질나노물질.
제 1 항에 있어서, 상기 지질나노물질은 1-1000 nm 크기를 갖는 나노입자인 것을 특징으로 하는 지질나노물질.
제 1 항에 있어서, 상기 지질나노물질은 라이소포스파티딜콜린 또는 그의 에테르 유도체에 비하여 (i) 용해도 향상, (ii) 독성 감소, (iii) 적혈구 용혈현상 감소, 또는 (iv) 적혈구 응집현상 감소를 나타내는 것을 특징으로 하는 지질나노물질.
라이소포스파티딜콜린 또는 그의 에테르 유도체를 수상 용매, 중간 사슬 트리글리세라이드, 오일 및 레시틴과 혼합하여 상기 중간 사슬 트리글리세라이드:오일:레시틴의 중량비가 1:0.5-3:2-10 인 것을 특징으로 하는 지질혼합물 용액을 얻는 단계;
지질혼합물 용액을 균질화 하는 단계;
균질화한 지질혼합물 용액의 pH를 3-7로 조절하는 단계; 그리고
pH가 조절된 지질혼합물 용액을 에멀젼화 하여 나노 크기의 지질나노물질을 형성하는 단계;를 포함하고,
상기 에테르 유도체는 하기 화학식 2로 표시되며,
[화학식 2]

상기 화학식 2에서, R₂는 C_4-30의 알킬이거나, 하나 또는 그 이상의 이중결합을 지닌 C_4-30의 알케닐인 것인, 라이소포스파티딜콜린 또는 그의 에테르 유도체-함유 지질나노물질의 제조방법.
제 8 항에 있어서, 상기 지질혼합물 용액을 균질화 하는 단계에서는 지질혼합물 용액을 호모게나이저(homogenizer)에 투입하여 2,000-10,000 rpm으로 균질화 하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
라이소포스파티딜콜린 또는 그의 에테르 유도체를 수상 용매, 중간 사슬 트리글리세라이드, 오일 및 레시틴과 혼합하여 상기 중간 사슬 트리글리세라이드:오일:레시틴의 중량비가 1:0.5-3:2-10 인 것을 특징으로 하는 지질혼합물 용액을 얻는 단계;
지질혼합물 용액을 균질화 하는 단계;
균질화한 지질혼합물 용액의 pH를 3-7로 조절하는 단계; 그리고
pH가 조절된 지질혼합물 용액을 에멀젼화 하여 나노 크기의 지질나노물질을 형성하는 단계;를 포함하고,
상기 에테르 유도체는 하기 화학식 2로 표시되며,
[화학식 2]

상기 화학식 2에서, R₂는 C_4-30의 알킬이거나, 하나 또는 그 이상의 이중결합을 지닌 C_4-30의 알케닐인 것인, 라이소포스파티딜콜린 또는 그의 에테르 유도체의 독성을 감소시키는 방법.
라이소포스파티딜콜린 또는 그의 에테르 유도체를 수상 용매, 중간 사슬 트리글리세라이드, 오일 및 레시틴과 혼합하여 상기 중간 사슬 트리글리세라이드:오일:레시틴의 중량비가 1:0.5-3:2-10 인 것을 특징으로 하는 지질혼합물 용액을 얻는 단계;
지질혼합물 용액을 균질화 하는 단계;
균질화한 지질혼합물 용액의 pH를 3-7로 조절하는 단계; 그리고
pH가 조절된 지질혼합물 용액을 에멀젼화 하여 나노 크기의 지질나노물질을 형성하는 단계;를 포함하고,
상기 에테르 유도체는 하기 화학식 2로 표시되며,
[화학식 2]

상기 화학식 2에서, R₂는 C_4-30의 알킬이거나, 하나 또는 그 이상의 이중결합을 지닌 C_4-30의 알케닐인 것인, 라이소포스파티딜콜린 또는 그의 에테르 유도체의 적혈구 용혈현상 또는 적혈구 응집현상을 감소시키는 방법.
(a) 제 1 항 및 제 5 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 따른 지질나노물질의 약제학적 유효량; 및
(b) 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 경구 또는 비경구 투여용 약제학적 제제.