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KR101896615B1 - 핵산 물질의 팩킹방법 - Google Patents

핵산 물질의 팩킹방법 Download PDF

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KR101896615B1
KR101896615B1 KR1020160132850A KR20160132850A KR101896615B1 KR 101896615 B1 KR101896615 B1 KR 101896615B1 KR 1020160132850 A KR1020160132850 A KR 1020160132850A KR 20160132850 A KR20160132850 A KR 20160132850A KR 101896615 B1 KR101896615 B1 KR 101896615B1
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Abstract

본 발명은 주형 핵산, 상기 주형에 적어도 부분적으로 상보적인 서열을 갖는 프라이머, 폴리머라제 및 변형된-NTP(nucleoside triphosphate)를 포함하는 반응 혼합물을 인큐베이션 시켜 상기 프라이머를 연장시키는 단계를 포함하는, 변형된-NTP를 적어도 부분적으로 포함하는 핵산 물질을 증폭하는 방법으로서, 상기 변형된-NTP는 ATP, TTP, CTP, GTP 및 UTP로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상이 변형된 것을 포함하는 것인 방법 및 상기 방법에 의해 생산된 핵산 물질을 포함하는 조성물에 관한 것이다. 또한 본 발명은 상기 방법에 이용될 NTP를 포함하고, 상기 NTP가 변형된-NTP를 포함하는 적어도 부분적으로 핵산 패킹 키트를 제공한다.

Description

핵산 물질의 팩킹방법 {A METHOD FOR PACKING POLYNUCLEOTIDE}
핵산 물질을 안정하게 보관하거나 형질주입 효율을 증가시키기 위한 핵산 물질을 패킹하는 방법에 관한 것이다.
DNA와 RNA로 이루어지는 핵산 물질은 세포 내에서 만들어지는 유전물질로서 생명체의 다양한 형질을 다음 세대로 전달하는 역할을 한다. 또한, 단백질 발현을 위해 필요한 코드를 저장하거나, 자체로 효소 기능을 수행하는 것을 포함하여 다양한 생물학적 기능을 수행하는 물질이다. 세포 내 뿐 아니라 세포 외 인 비트로 상에서도 생화학적 기능을 지니는 genomic DNA, 안티센스 올리고뉴클레오티드, mRNA, siRNA, microRNA, sgRNA, 앱타머 형태로 중합효소나, 올리고 합성기를 이용하여 제조될 수 있다. 핵산 물질은 생화학적인 활성을 위해 사용되기도 하지만, 그 자체로 자기 조립에 의해 다양한 구조체를 형성할 수 있으므로, 이러한 구조적 특성을 바탕으로 유용한 기능 (예를 들면, 약물전달체, 칩, 논리회로 등)을 수행하는 소재로 활용될 수도 있다. 핵산 물질의 경우 세포로부터 추출하여 추가적인 분석을 위해 세포 외부에서 보관해야 할 필요도 있는데, 세포 외에서는 세포 내에서 핵산에 결합하여 핵산을 보호하는 (예를 들면, 히스톤 단백질, RNA 결합 단백질 등) 물질이 결여되어 있으므로, 핵산이 쉽게 손상되거나, 분해될 수 있다. 이를 방지하기 위해서는 핵산에 결합하여 핵산을 손상시키는 환경으로부터 보호해주는 물질을 사용하거나, 핵산 자체가 보다 안정적인 구조로 스스로 팩킹 되어 분해나 손상이 어렵게 하는 방법을 고려할 수 있다. 이 중, 자체 팩킹이 되는 방법은 유전물질의 보관 뿐 아니라, 세포 외에서 만들어지는 상기에서 언급한 다양한 핵산 물질의 구조나 크기를 조절할 수 있는 용도로도 활용이 가능하므로 유용성이 높다고 할 수 있다. 이러한 핵산 물질을 팩킹하는 기술로 최근에 핵산을 중합하는 중합효소의 양을 조절함으로써 생성되는 핵산 물질의 크기가 조절될 수 있다는 것이 알려진 바 있다
일 양상은 주형 핵산, 상기 주형에 적어도 부분적으로 상보적인 서열을 갖는 프라이머, 폴리머라제 및 변형된-NTP(nucleoside triphosphate)를 포함하는 반응 혼합물을 인큐베이션 시켜 상기 프라이머를 연장시키는 단계를 포함하는, 변형된-NTP를 적어도 부분적으로 포함하는 핵산 물질을 증폭하는 방법으로서, 상기 변형된-NTP는 ATP, TTP, CTP, GTP 및 UTP로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상이 변형된 것을 포함하는 것인 방법을 제공한다.
다른 양상은 상기 방법에 의해 생산된 핵산 물질을 포함하는 조성물을 제공한다.
다른 양상은 상기 방법에 이용될 NTP를 포함하고, 상기 NTP가 변형된-NTP를 포함하는 적어도 부분적으로 핵산 패킹 키트를 제공한다.
일 양상은 주형 핵산, 상기 주형에 적어도 부분적으로 상보적인 서열을 갖는 프라이머, 폴리머라제 및 변형된-NTP(nucleoside triphosphate)를 포함하는 반응 혼합물을 인큐베이션 시켜 상기 프라이머를 연장시키는 단계를 포함하는, 변형된-NTP를 적어도 부분적으로 포함하는 핵산 물질을 증폭하는 방법으로서, 상기 변형된-NTP는 ATP, TTP, CTP, GTP 및 UTP로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상이 변형된 것을 포함하는 것인 방법을 제공한다.
상기 주형은 상기 핵산 물질을 증폭시키기 위해, 프라이머 결합 부위 및 목적하는 핵산 물질을 생성시키기 위해 적절한 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 따라서 사용되는 프라이머 서열 또는 목적하는 핵산 물질의 뉴클레오티드 서열에 따라 상기 주형의 형태가 변할 수 있다.
용어 '프라이머'는 자유 3 말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 15 내지 35개의 뉴클레오티드 서열로 상보적인 핵산의 주형과 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고, 핵산 주형의 가닥 복사를 위한 시작 지점으로부터 기능하는 것을 의미하며, "올리고뉴클레오티드(oligonucleotide)" 또는 "폴리뉴클레오티드(polynucleotide)"와 혼용될 수 있다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서, DNA 폴리머라제 또는 역전사효소를 이용한 중합반응을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오티드 트리포스페이트의 존재 하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다.
용어 '폴리머라제'는 핵산의 긴 사슬 또는 폴리머를 합성하는 효소로서, 상기 폴리머라제가 DNA 폴리머라제인 경우 대장균 DNA 폴리머라제 I, 클레나우 단편, phi29 DNA 폴리머라제, vent DNA 폴리머라제, T4, T7 DNA 폴리머라제, 및 Taq 폴리머라제로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다. 상기 폴리머라제가 RNA 폴리머라제인 경우 RNA 폴리머라제 I, RNA 폴리머라제 Ⅱ, RNA 폴리머라제 Ⅲ 및 T7 RNA 폴리머라제로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다. 또한 상기 폴리머라제는 말단 데옥시뉴클레오티드 전달효소(Terminal Deoxynucleotidyl Transferase; TDT) 또는 역전사효소(Reverse Transcriptase)일 수 있다.
용어 '변형된-NTP'는 자연적으로 존재하는 NTP(본 명세서에서 상기 'NTP'는 'dNTP'를 포함하는 개념으로 사용될 수 있다)의 특정 부분을 조작하여 생성된 것을 의미하는 것으로서, 상기 '변형'은 NTP의 화학식 기본 구조를 크게 세 구성요소, 즉 5탄당, 인산기, 및 염기로 나누는 경우, 각 구성요소의 특정 부분의 원소 또는 잔기가 다른 원소, 잔기, 또는 작용기로 치환되는 것을 의미한다. 자연적으로 존재하는 NTP는 예를 들어 각각 하기의 화학식을 갖는 ATP, TTP (또는 m5UTP), CTP, GTP 및 UTP일 수 있다.
Figure 112016099331691-pat00001
ATP
Figure 112016099331691-pat00002
TTP
Figure 112016099331691-pat00003
CTP
Figure 112016099331691-pat00004
GTP
Figure 112016099331691-pat00005
UTP
따라서, '변형된-NTP'는 상기의 화학식을 갖는 ATP, TTP (또는 m5UTP), CTP, GTP 및 UTP의 특정 위치의 원소 또는 잔기가 다른 원소, 잔기, 또는 작용기로 치환된 것일 수 있다.
용어 '연장'은 상기 폴리머라제가 상기 프라이머로부터 핵산(NTP 또는 변형된-NTP)을 연결하여 핵산으로 이루어진 사슬 또는 폴리머를 합성하는 것을 의미하고, 용어 '인큐베이션'은 상기 폴리머라제가 상기 프라이머를 연장시키는 기능을 수행할 수 있는 조건을 만들어 상기 폴리머라제의 활성 반응이 일어나도록 하는 것을 의미한다. 예를 들어, 상기 폴리머라제가 phi25 DNA 폴리머라제인 경우, 핵산(NTP 또는 변형된-NTP), 프라이머, phi25 DNA 폴리머라제 및 상기 폴리머라제가 활성하기에 적절한 완충액(제조사의 지침에 따름)을 포함하는 반응 혼합물을 37℃에서 1시간 동안 방치하는 것일 수 있다. 따라서, 상기 방법에 사용되는 폴리머라제의 종류, 핵산의 조성(예를 들어, NTP 또는 변형된-NTP가 혼합되어 있는 경우 그 비율), 프라이머의 길이, 프라이머의 핵산 서열 조성, 주형의 핵산 서열 조성, 및 생성되는 핵산 물질의 길이, 양 또는 조성 등에 따라 상기 조건은 달라질 수 있다.
상기 '인큐베이션'이 NTP 및 변형된-NTP의 조합을 포함하는 반응 혼합물에 대해 이루어지는 경우, 상기 반응 혼합물로부터 생성된 핵산 물질은 변형된-NTP를 적어도 부분적으로 포함할 수 있다. 필요한 경우 반응 혼합물 중의 NTP 및 변형된-NTP의 비율을 조절할 수 있고, 따라서 그에 따라 생성된 핵산 물질의 NTP 및 변형된-NTP의 비율 또한 달라질 수 있다.
용어 '증폭'은 시작 핵산 물질 또는 1회의 반응에 따라 생성된 핵산 물질이 반복적인 반응에 의하여 다수 또는 기하급수적으로 복제되는 것을 의미하며, 이는 예를 들어, 프라이머 신장법(primer extension), 회전환 증폭법(rolling circle amplification), 회전환 전사(rolling circle transcription), 인 비트로 전사(in vitro transcription), 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction) 및 핵산 말단 트란스퍼라제 반응(nucleotide terminal transferase reaction)으로 이루어진 군으로부터 선택된 방법에 의해 수행될 수 있다.
일 구체예에서 상기 증폭된 핵산 물질은 스스로 패킹되는 것일 수 있다.
용어 '패킹(packing)'은 핵산 물질을 일정한 범위의 크기 또는 모양으로 존재하도록 하는 것을 의미한다. 일반적인 증폭 반응에 의해 생성된 핵산 물질이 선형을 이루거나, 성긴 실 뭉치 모양, 또는 비정형의 해면 구조(섬유상의 골격이 다수의 미세한 구멍을 이루어 뭉쳐있는 모양)를 이루는 반면, 패킹된 핵산 물질은 예를 들어, 상기 일반적인 증폭 반응의 산물에 비해 높은 밀도의 실 뭉치 또는 비교적 구형의 모양을 이룰 수 있어, 더 작은 표면적을 가질 수 있다. 예를 들어, 도 3C를 참조하면 변형된-NTP인 5-알릴아미노-dUTP가 포함된 핵산을 이용하여 RCA 반응시킨 경우(변형된-NTP가 20%인 경우 105.71±4.79nm), 변형되지 않은 NTP만을 이용하는 경우(190.13±2.97nm)에 비하여 더 작은 크기로 뭉쳐 더 적은 표면적을 갖게 할 수 있다.
이러한 패킹은 외부의 조작 또는 다른 보조 인자에 의하지 않고, 생성된 핵산 물질 내 특정 뉴클레오티드 서열, 또는 변형된-NTP를 포함하는 뉴클레오티드 서열에 의해 자연적으로 이루어질 수 있다. 상기 핵산 물질이 헤어핀 구조 또는 앱타머 구조를 이룰 수 있는 특정 뉴클레오티드 서열을 갖는 경우 폴리머라제에 의해 생성된 후 수소결합 또는 이온결합에 의하여 특정 구조를 이룰 수 있는 바와 같이, 예를 들어 상기 핵산 물질이 자연적인 NTP에 비해 더 강한 양전하를 가지는 변형된-NTP를 포함하는 뉴클레오티드 서열을 가지는 경우(그 비율 또는 NTP의 변형에 적용된 잔기의 특성에 따라 영향을 받을 수 있으나, 변형된-NTP로 5-알릴아미노-dUTP를 이용한 경우) NTP가 갖는 인산기에 의해 유발된 음전하에 의해 핵산 물질은 일반적으로 음전하를 가지므로 양전하를 갖는 변형된-NTP에 의해 유발된 이온결합에 의해 상기 핵산 물질이 스스로 패킹될 수 있다.
그러나, 이러한 패킹은 패킹의 목적에 따라 표면적을 더 크게 하거나, 특정한 핵산 구조를 이루도록 하는 것을 포함할 수 있고, 따라서 상기 패킹의 목적에 따라 선택되는 변형된-NTP의 종류, 총 NPT 중 변형된-NTP의 비율, 변형된-NTP 내 변형된-ATP, 변형된-TTP (즉, 변형된-m5UTP), 변형된-CTP, 변형된-GTP 및 변형된-UTP 각각의 비율, 변형 방법, 및 뉴클레오티드 서열 등이 달라질 수 있다.
일 구체예에서, 상기 NTP는 dNTP(deoxyribonucleoside triphosphate)일 수 있다. NTP는 핵산을 이루는 염기(아데닌, 구아닌, 티민, 우라실 및 시토신을 포함하는 nitrogenous base, nucleobase 또는 base를 의미) 및 5-탄당으로 이루어진 뉴킬레오시드(nucleoside)에 3개의 인산기가 결합된 구조를 이루는데, 여기서 상기 5-탄당은 리보스 또는 데옥시리보스를 포함하고, 상기 NTP의 5-탄당이 데옥시리보스인 것이 dNTP이다. 따라서, 자연적으로 존재하는 dNTP는 예를 들어 각각 하기의 화학식을 갖는 dATP, dTTP, dCTP, dGTP 및 dUTP일 수 있다.
Figure 112016099331691-pat00006
dATP
Figure 112016099331691-pat00007
dTTP
Figure 112016099331691-pat00008
dCTP
Figure 112016099331691-pat00009
dGTP
Figure 112016099331691-pat00010
dUTP
일 구체예에서, 상기 주형 핵산은 DNA 또는 RNA일 수 있다. 상기 주형 핵산이 DNA인, DNA 주형을 이용하여 폴리머라제(인간의 경우 RNA 폴리머라제 Ⅱ일 수 있음)에 의한 전사(transcription) 과정을 통해 RNA 가닥(이 경우 상기 RNA 가닥은 mRNA일 수 있음)을 생성할 수 있거나, 또는 DNA 폴리머라제에 의한 복제(replaication) 과정을 통해 DNA 가닥을 복제할 수 있다. 또한 상기 주형 핵산이 RNA인, RNA 주형을 이용하여 RNA-의존적 RNA 폴리머라제에 의한 복제 과정을 통해 RNA를 복제할 수 있다. 상기 RNA 주형을 이용한 복제는 상기 복제 과정을 위해 상기 RNA-의존적 RNA 폴리머라제를 사용하는 RNA 바이러스(예를 들어, 폴리오바이러스)에 의해 가능할 수 있다. 상기 DNA 또는 RNA 주형의 구성, 형태(단일 가닥, 이중가닥, 원형 또는 선형 등), 및 뉴클레오티드 서열은 상기 방법을 이용하여 생성하고자 하는 핵산 물질의 종류 및 뉴클레오티드 서열에 따라 달라질 수 있다.
다른 구체예에서, 상기 주형 핵산은 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다. 상기 주형 핵산이 이중 가닥일 경우, 목적하는 핵산 물질을 증폭시키기 위하여 상기 핵산 물질을 증폭시키는 방법은 상기 주형 핵산에 프라이머가 결합하고, 폴리머라제가 활성하기 위해 필요한 인큐베이션 조건을 달리할 수 있다. 예를 들어, 상기 주형 핵산이 이중 가닥인 DNA이고 상기 인큐베이션이 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction)인 경우, 이중 가닥 DNA를 단일 가닥 DNA로 분리시키는 DNA를 변성(Denaturation)시키는 단계; 상기 주형 핵산에 적어도 부분적으로 상보적인 프라이머를 상기 주형 핵산에 결합시키는 단계; 및 Tag 폴리머라제가 프라이머를 신장시키는 단계를 포함하는 반응에 의하여 목적하는 핵산 물질인 DNA를 증폭시킬 수 있다. 이 경우, 상기 변성시키는 단계는 90℃ 내지 95℃로 가열하는 단계를 포함할 수 있으며, 상기 결합시키는 단계는 50℃ 내지 65℃로 냉각시키는 단계를 포함할 수 있으며, 및 상기 신장시키는 단계는 70℃ 내지 75℃로 가열하는 단계를 포함할 수 있으나, 상기 각 단계의 조건은 주형 핵산의 길이 또는 뉴클레오티드 서열의 조성; 프라이머의 길이, 주형 핵산과의 상보성 정도, 또는 뉴클레오티드 서열의 조성; 및 Tag 폴리머라제의 종류 또는 효율성 정도에 따라 달라질 수 있다. 또한 상기 주형 핵산이 단일 가닥일 경우에도, 상기 주형 핵산의 길이, 종류, 및 뉴클레오티드 서열의 조성 또는 특징 등에 따라 폴리머라제가 상기 주형 핵산에 결합하여 목적하는 핵산 물질을 생성시키기 위해 적절한 인큐베이션 조건을 달리할 수 있다.
다른 구체예에서, 상기 주형 핵산은 원형 또는 선형일 수 있다. 상기 주형 핵산이 원형인 경우는 예를 들어, 플라스미드 또는 벡터일 수 있다. 핵산 물질을 증폭시키는 방법에 사용되는 인큐베이션 조건, 예를 들어, 상기 인큐베이션이 중합효소 반응일 경우 상기 중합효소 반응의 종류에 따라 사용되는 주형 핵산의 형태를 달리 할 수 있다. 예를 들어, 상기 중합효소 반응이 회전환 증폭법(rolling circle amplification) 또는 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction)일 경우 상기 주형 핵산은 원형일 수 있다.
일 구체예에서, 상기 변형된-NTP 또는 변형된-dNTP는 5탄당, 인산기, 및 염기 부분 중 하나 이상이 변형된 것일 수 있다. 여기서 용어 '변형'은 상기에 기재된 바와 같이 상기 5탄당, 인산기, 및 염기 부분 중 특정 위치의 원소 또는 잔기가 다른 원소, 잔기, 또는 작용기로 치환되는 것을 의미한다. 상기 5-탄당은, 자연적으로 존재하는 것으로는 리보스(ribose) 또는 데옥시리보스(deoxyribose)를 포함할 수 있고, 5-탄당 부분이 변형된 변형된-NTP는 예를 들어, 리보스 또는 데옥시리보스의 2번 또는 3번 탄소(변형된-dNTP일 경우, 3번 탄소)의 히드록실기가 다른 원소, 잔기, 또는 작용기로 치환된 것일 수 있다. 리보스 또는 데옥시리보스의 3번 탄소의 히드록실기 부분이 특정 작은 치환기로 치환된 경우 (예를 들어, 알릴기), DNA 폴리머라제의 활성이 계속 유지되므로(Proc Natl Acad Sci U S A. 2006, 103(52): 19635-19640) 그러한 변형된-dNTP를 이용하여도 중합반응을 수행할 수 있으며, 상기 변형에 사용될 수 있는 치환기는 다양할 수 있다. 상기 인산기는 NTP에서 세 개의 인산기를 갖는데, 인산기 부분이 변형된 변형된-NTP는 예를 들어, 세 개의 인산기 중 하나 이상이 다른 원소, 잔기, 또는 작용기로 치환된 것일 수 있다. 상기 염기는 퓨린계 염기 또는 피리미딘 염기일 수 있고, 상기 염기가 퓨린계 염기인 경우 상기 염기는 아데닌 또는 구아닌일 수 있고, 및 상기 염기가 피리미딘계 염기인 경우 상기 염기는 티민, 우라실, 시토신일 수 있다. 따라서 상기 염기 부분이 변형된 변형된-NTP는 상기 아데닌, 구아닌, 티민, 우라실 또는 시토신의 하나 이상의 특정 위치의 원소가 다른 원소, 잔기, 또는 작용기로 치환된 것일 수 있다.
일 구체예에서, 상기 변형된-NTP(또는 dNTP)는 상기 변형된-NTP의 염기가 아데닌 또는 구아닌인 경우 퓨린 고리의 7번 탄소의 수소, 시토신 또는 우라실인 경우 피리미딘 고리의 5번 탄소의 수소, 및 티민인 경우 피리미딘 고리의 5번 탄소의 메틸기가 변형된 것일 수 있다. 종래에 알려진 바에 따르면 아데닌 또는 구아닌의 퓨린 고리에서 7번 탄소 및 티민 또는 시토신의 경우 피리미딘의 5번 탄소에는 에너지 전환 염색물질과 같은 큰 분자가 결합되어도 DNA 폴리머라제의 중합활성이 유지된다(Proc Natl Acad Sci U S A. 2006, 103(52): 19635-19640). 그러나 중합반응에 사용되는 폴리머라제의 활성이 유지되는한 변형된-NTP(또는 dNTP)는 이에 제한되지 않는다.
일 구체예에서, 상기 변형은 양이온성 잔기, 음이온성 잔기, 중성 잔기, 소수성 잔기 및 수소결합성 잔기로 이루어진 군으로부터 선택된 것으로 치환된 것일 수 있다. 용어 '양이온성 잔기'는 핵산 물질이 존재하는 환경(예를 들어, PCR 반응에 사용되는 완충액의 경우 pH 8.0 내지 8.5)에서 양전하를 갖는 것을 의미하며, 예를 들어 아민 잔기와 같은 것일 수 있다. 용어 '음이온성 잔기' 또한 상기와 마찬가지로 핵산 물질이 존재하는 환경에서 음전하를 갖는 잔기를 의미하고, 예를 들어 카복실기와 같은 것일 수 있고, 용어 '중성 잔기'는 핵산 물질이 존재하는 환경에서 쌍극자는 유발하나 전하를 갖지 않는 잔기를 의미하고, 예를 들어 디에틸티오에테르 같은 것일 수 있으며, 용어 '소수성 잔기'는 물과 친화력을 갖지 않는 잔기를 의미하고, 예를 들어 알킬기 또는 벤젠 고리와 같은 것일 수 있고, 및 용어 '수소결합성 잔기'는 수소결합을 할 수 있는 잔기를 의미하는 것으로서 예를 들어 히드록실기 등이 있을 수 있다.
일 구체예에서, 상기 양이온성 잔기는 아민(암모늄), 구아니딘(구아니디니움), 피리딘(피리디니움) 또는 이미다졸(이미다졸리움)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상으로 치환된,
치환 또는 비치환된 C1 내지 C30 알킬, 치환 또는 비치환된 C1 내지 C30 알케닐, 치환 또는 비치환된 C1 내지 C30 알키닐, 치환 또는 비치환된 C1 내지 C30 시클로알킬, 치환 또는 비치환된 C5 내지 C30 아릴, 치환 또는 비치환된 C5 내지 C30 아릴알킬, 치환 또는 비치환된 C5 내지 C30 아릴알케닐, 치환 또는 비치환된 C5 내지 C30 아릴알키닐, 치환 또는 비치환된 C5 내지 C30 헤테로아릴, 치환 또는 비치환된 C1 내지 C30 헤테로시클릴, 치환 또는 비치환된 C1 내지 C30 헤테로시클로알킬, 치환 또는 비치환된 C1 내지 C30 헤테로시크릴알킬, 치환 또는 비치환된 C5 내지 C30 헤테로아릴알킬, 치환 또는 비치환된 C5 내지 C30 헤테로아릴알케닐, 또는 치환 또는 비치환된 C5 내지 C30 헤테로아릴알키닐일 수 있다.
일 구체예에서, 상기 음이온성 잔기는 카복실산(카복실레이트)으로 하나 이상 치환된,
치환 또는 비치환된 C1 내지 C30 알킬, 치환 또는 비치환된 C1 내지 C30 알케닐, 치환 또는 비치환된 C1 내지 C30 알키닐, 치환 또는 비치환된 C1 내지 C30 시클로알킬, 치환 또는 비치환된 C5 내지 C30 아릴, 치환 또는 비치환된 C5 내지 C30 아릴알킬, 치환 또는 비치환된 C5 내지 C30 아릴알케닐, 치환 또는 비치환된 C5 내지 C30 아릴알키닐, 치환 또는 비치환된 C5 내지 C30 헤테로아릴, 치환 또는 비치환된 C1 내지 C30 헤테로시클릴, 치환 또는 비치환된 C1 내지 C30 헤테로시클로알킬, 치환 또는 비치환된 C1 내지 C30 헤테로시크릴알킬, 치환 또는 비치환된 C5 내지 C30 헤테로아릴알킬, 치환 또는 비치환된 C5 내지 C30 헤테로아릴알케닐, 치환 또는 비치환된 C5 내지 C30 헤테로아릴알키닐, 치환 또는 비치환된 C1 내지 C30 알킬아마이드, 치환 또는 비치환된 C1 내지 C30 히드록시알킬, 치환 또는 비치환된 C1 내지 C30 알콕시, 치환 또는 비치환된 C1 내지 C30 알킬아미노, 치환 또는 비치환된 페닐아미노, 치환 또는 비치환된 카바모일, 치환 또는 비치환된 옥사다이아졸, 또는 치환 또는 비치환된 카르밤산일 수 있다.
일 구체예에서, 상기 중성 잔기는 히드록실, 할로겐, 아미드, 우레아, 카보닐, 카바메이트, 이미드, 티오카바메이트, 카보네이트, 에스테르, 티오에스테르, 티오우레아, 이민 및 에나민으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상으로 치환된,
치환 또는 비치환된 C1 내지 C30 알킬, 치환 또는 비치환된 C1 내지 C30 알케닐, 치환 또는 비치환된 C1 내지 C30 알키닐, 치환 또는 비치환된 C1 내지 C30 시클로알킬, 치환 또는 비치환된 C5 내지 C30 아릴, 치환 또는 비치환된 C5 내지 C30 아릴알킬, 치환 또는 비치환된 C5 내지 C30 아릴알케닐, 치환 또는 비치환된 C5 내지 C30 아릴알키닐, 치환 또는 비치환된 C5 내지 C30 헤테로아릴, 치환 또는 비치환된 C1 내지 C30 헤테로시클릴, 치환 또는 비치환된 C1 내지 C30 헤테로시클로알킬, 치환 또는 비치환된 C1 내지 C30 헤테로시크릴알킬, 치환 또는 비치환된 C5 내지 C30 헤테로아릴알킬, 치환 또는 비치환된 C5 내지 C30 헤테로아릴알케닐, 치환 또는 비치환된 C5 내지 C30 헤테로아릴알키닐, 치환 또는 비치환된 C1 내지 C30 알킬아마이드, 치환 또는 비치환된 C1 내지 C30 히드록시알킬, 또는 치환 또는 비치환된 C1 내지 C30 알콕시일 수 있다.
일 구체예에서, 상기 소수성 잔기는 치환 또는 비치환된 C1 내지 C30 알킬, 치환 또는 비치환된 C1 내지 C30 알케닐, 치환 또는 비치환된 C1 내지 C30 알키닐, 치환 또는 비치환된 C1 내지 C30 시클로알킬, 치환 또는 비치환된 C5 내지 C30 아릴, 치환 또는 비치환된 C5 내지 C30 아릴알킬, 치환 또는 비치환된 C5 내지 C30 아릴알케닐, 또는 치환 또는 비치환된 C5 내지 C30 아릴알키닐로 이루어진 군으로부터 선택된 것일 수 있다.
일 구체예에서, 상기 수소결합성 잔기는 히드록실, 할로겐, 아미드, 우레아, 카보닐, 카바메이트, 이미드, 티오카바메이트, 카보네이트, 에스테르, 티오에스테르, 티오우레아, 이민 및 에나민으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상 치환된,
치환 또는 비치환된 C1 내지 C30 알킬, 치환 또는 비치환된 C1 내지 C30 알케닐, 치환 또는 비치환된 C1 내지 C30 알키닐, 치환 또는 비치환된 C1 내지 C30 시클로알킬, 치환 또는 비치환된 C5 내지 C30 아릴, 치환 또는 비치환된 C5 내지 C30 아릴알킬, 치환 또는 비치환된 C5 내지 C30 아릴알케닐, 치환 또는 비치환된 C5 내지 C30 아릴알키닐, 치환 또는 비치환된 C5 내지 C30 헤테로아릴, 치환 또는 비치환된 C1 내지 C30 헤테로시클릴, 치환 또는 비치환된 C1 내지 C30 헤테로시클로알킬, 치환 또는 비치환된 C1 내지 C30 헤테로시크릴알킬, 치환 또는 비치환된 C5 내지 C30 헤테로아릴알킬, 치환 또는 비치환된 C5 내지 C30 헤테로아릴알케닐, 치환 또는 비치환된 C5 내지 C30 헤테로아릴알키닐, 치환 또는 비치환된 C1 내지 C30 알킬아마이드, 치환 또는 비치환된 C1 내지 C30 히드록시알킬, 치환 또는 비치환된 C1 내지 C30 알콕시, 치환 또는 비치환된 C1 내지 C30 알킬아미노, 치환 또는 비치환된 페닐아미노, 치환 또는 비치환된 카바모일, 치환 또는 비치환된 옥사다이아졸, 또는 치환 또는 비치환된 카르밤산일 수 있다.
상기 양이온성 잔기, 음이온성 잔기, 중성 잔기, 소수성 잔기 및 수소결합성 잔기의 치환 또는 비치환된 C1 내지 C30 알킬, 치환 또는 비치환된 C1 내지 C30 알케닐, 치환 또는 비치환된 C1 내지 C30 알키닐, 치환 또는 비치환된 C1 내지 C30 시클로알킬, 치환 또는 비치환된 C5 내지 C30 아릴, 치환 또는 비치환된 C5 내지 C30 아릴알킬, 치환 또는 비치환된 C5 내지 C30 아릴알케닐, 치환 또는 비치환된 C5 내지 C30 아릴알키닐, 치환 또는 비치환된 C5 내지 C30 헤테로아릴, 치환 또는 비치환된 C1 내지 C30 헤테로시클릴, 치환 또는 비치환된 C1 내지 C30 헤테로시클로알킬, 치환 또는 비치환된 C1 내지 C30 헤테로시크릴알킬, 치환 또는 비치환된 C5 내지 C30 헤테로아릴알킬, 치환 또는 비치환된 C5 내지 C30 헤테로아릴알케닐, 치환 또는 비치환된 C5 내지 C30 헤테로아릴알키닐, 치환 또는 비치환된 C1 내지 C30 알킬아마이드, 치환 또는 비치환된 C1 내지 C30 히드록시알킬, 치환 또는 비치환된 C1 내지 C30 알콕시, 치환 또는 비치환된 C1 내지 C30 알킬아미노, 치환 또는 비치환된 페닐아미노, 치환 또는 비치환된 카바모일, 치환 또는 비치환된 옥사다이아졸, 또는 치환 또는 비치환된 카르밤산에서,
상기 치환기는 할로겐, 히드록시, 니트로, 시아노, 옥소(=O), 티옥소(=S), 아지도, 니트로소, 아미노, 히드라지노, 포르밀, 알킬, 알콕시, 아릴, 할로알킬, 할로알콕시, 아릴알콕시, 시클로알킬, -O-시클로알킬, 헤테로시클릴, 헤테로아릴, 알킬아미노, -0-CH2- 시클로알킬, -COORa , -C(0)Rb, -C(O)NRaRb, -NRaC(0)NRbRc, -NRaC(O)ORb, -NRaRb, -NRaC(O)Rb, -0Ra, -0RaC(0)0Rb, -C(0)NRaRb, -OC(O)Ra, -RaNRbRc, 및 -Ra0Rb 중 선택된 것이고;
상기 Ra, Rb 및 Rc는 각각 독립적으로 수소, 알킬, 알킬렌, 아릴, 아릴알킬, 시클로알킬, 헤테로시클릴, 헤테로아릴 및 헤테로아릴알킬로부터 선택된 치환된 또는 치환되지 않은 그룹이거나, 또는 결합되어 0 내지 2개의 이종 원자를 갖는 3 내지 7개의 원자로 된 고리를 형성하는 것일 수 있다.
일 구체예에서, 본 발명의 방법에서 이용되는 상기 변형된-NTP는 하기 화학식 1 내지 6 중 어느 하나의 화학식을 갖는 것일 수 있다.
Figure 112016099331691-pat00011
상기 화학식은 모두 하기의 화학식을 갖는 dUTP를 변형한 것으로서,
Figure 112016099331691-pat00012
dUTP
화학식 1을 갖는 변형된-dUTP는 본 명세서에서 5-HP(5-Hydroxypentynyl-2'-deoxyuridine-5'-Triphosphate), 화학식 2는 5-HM(5-Hydroxymethyl-2'-deoxyuridine-5'-Triphosphate), 화학식 3은 5-CA(5-Carboxy-2'-deoxyuridine-5'-Triphosphate), 화학식 4는 5-AA(5-Aminoallyl-2'-deoxyuridine-5'-Triphosphate), 화학식 5는 5-PP(5-Propynyl-2'deoxyuridine-5'-Triphosphate), 및 화학식 6은 5-PA(5-Propargylamino-2'-deoxyuridine-5'-Triphosphate)으로 명명될 수 있다.
일 구체예에서 상기 중합효소 반응은 프라이머 신장법(primer extension), 회전환 증폭법(rolling circle amplification), 회전환 전사(rolling circle transcription), 인 비트로 전사(in vitro transcription), 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction) 및 핵산 말단 트란스퍼라제 반응(nucleotide terminal transferase reaction) 중 선택된 것일 수 있다.
용어 '프라이머 신장법'은 RNA의 5' 말단을 맵핑하는 기술로서 상기 RNA에 상보적으로 결합할 수 있는 프라이머로부터 역전사효소(reverse trnascriptase)가 DNA를 합성하는 것을 의미한다. 따라서 예를 들어 주형 핵산이 RNA인 경우 상기 프라이머 신장법이 사용될 수 있고, 일 구체예에서 상기 RNA가 mRNA인 경우 프라이머 신장법에 의하여 생성되는 핵산 물질은 cDNA일 수 있다.
용어 '회전환 증폭법'은 롤링 서클 증폭법 (Rolling circle amplification; 이하 RCA라고도 함)이라고도 하며, 단일가닥 환형 DNA를 주형으로 하고, 여기에 상보적인 프라이머를 사용하여 등온에서 중합반응을 수행하여, 상기 주형 DNA가 연속적으로 증폭되도록 하는 것을 의미한다. 일 구체예에서 상기 핵산 물질을 증폭하는 방법이 상기 RCA 반응을 위해 최적화된 주형 핵산 사슬을 필요로 하는 경우, 상기 방법은 RCA 중합 반응을 위한 환형 주형 사슬을 제조하기 위한 주형, 상기 주형에 상보적인 프라이머, 리게이션(ligation) 완충액, 및 T4 DNA 리가제를 포함하는 반응 혼합물을 인큐베이션 시켜 상기 프라이머를 연장시키는 단계를 더 포함할 수 있다.
용어 '회전환 전사(rolling circle transcription; RCT)'는 단일 가닥 환형 DNA를 주형으로 하고, 여기에 상보적인 프라이머를 사용하여 등온에서 중합반응을 수행하여, 상기 환형 DNA에 상보적인 RNA가 연속적으로 합성 및 증폭되도록 하는 것을 의미한다. 상기 합성을 위하여 T7 또는 E. coli RNA 폴리머라제가 이용될 수 있다.
용어 '인 비트로 전사(in vitro transcription)'는 시험관 상으로 DNA 주형으로부터 RNA를 합성하는 것을 의미하며, 상기 인 비트로 전사를 이용하여 블롯 혼성화 분석 또는 핵산분해효소 방어 분석(nuclease protection assay) 등에 이용될 수 있는 RNA(예를 들어, 방사선 표지된 RNA 프로브)를 생산할 수 있다. 일 구체예에서, 상기 인 비트로 전사를 위해서는 프로모터 서열을 함유하는 정제된 DNA 주형, NTP(특히, ribonucleotide triphosphate), 반응 완충액, 및 적절한 파지 RNA 폴리머라제를 포함하는 반응 혼합물을 인큐베이션하는 단계를 필요로 할 수 있으며, 상기 인큐베이션 조건은 목적하는 RNA의 양, 뉴클레오티드 서열 및 구조적 특징 등에 의해 달라질 수 있다.
용어 '중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction; PCR)'은 DNA를 주형으로 하여, 여기에 상보적인 프라이머를 사용하여 상기 프라이머로부터 핵산 물질을 증폭시키는 것을 의미하며, 예를 들어 이중 가닥 DNA를 단일 가닥 DNA로 분리시키는 DNA를 변성(Denaturation)시키는 단계; 상기 주형 핵산에 적어도 부분적으로 상보적인 프라이머를 상기 주형 핵산에 결합시키는 단계; 및 Tag 폴리머라제가 프라이머를 신장시키는 단계를 포함할 수 있으나, PCR의 종류에 따라 각 단계 및 반응 조건을 달리할 수 있다.
용어 '핵산 말단 트란스퍼라제 반응'은 미성숙 림프구, pre-B 림프구, 및 pre-T 림프구에 발현하는 DNA 폴리머라제인 말단 데옥시뉴클레오티딜 트란스퍼라제(Terminal deoxynucleotidyl transferase)에 의한 반응으로서, 상기 핵산 말단 트란스퍼라제 반응에 의해서 3' 말단으로부터 뉴클레오티드 서열을 연장시키는 것을 의미한다. 예를 들어 항체 유전자 재조합 과정에서 상기 핵산 말단 트란스퍼라제 반응을 이용하는 경우 TCR 및 BCR의 V, D, 및 J 엑손에 N-뉴클레오티드를 결합시킬 수 있다.
일 구체예에서, 상기 핵산 물질은 게놈 DNA, 안티센스 올리고뉴클레오티드, mRNA, siRNA, 마이크로 RNA, sgRNA 및 앱타머로 이루어진 군으로부터 선택된 것일 수 있다. 상기 핵산 물질 중 목적하는 핵산 물질에 따라 선택되는 인큐베이션 조건 또는 중합효소 반응의 종류를 달리할 수 있다. 용어 '게놈 DNA'는 유전자 상에 존재하는 DNA를 의미하는 것으로서, 스플라이싱 전후의 DNA를 모두 포함할 수 있다. 용어 'mRNA'는 폴리펩티드를 생산하기 위한 번역 과정에서 주형 가닥이 되는 RNA를 의미하며, 용어 'siRNA(Small interfering RNA)'는 단간섭 RNA(short interfering RNA) 또는 침묵 RNA(silencing RNA)와 병행되어 사용될 수 있으며, 상기 siRNA는 RNA 간섭 과정(RNA interference pathway)에서 상기 siRNA에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 갖는 특이적 유전자의 발현을 방해한다. 용어 'sgRNA(single-stranded guide RNA)'는 Cas9 시스템과 함께 작용함으로써 상기 sgRNA의 뉴클레오티드 서열과 상보적인 서열을 갖는 DNA를 인식하여 상기 DNA를 절단 또는 분해할 수 있는 RNA를 의미한다. 용어 '앱타머'는 특정 표적물질에 대해 높은 특이성과 친화도를 가지는 단일 가닥 DNA 또는 RNA를 의미한다.
다른 양상은 주형 핵산, 상기 주형에 적어도 부분적으로 상보적인 서열을 갖는 프라이머, 폴리머라제 및 변형된-NTP(nucleoside triphosphate)를 포함하는 반응 혼합물을 인큐베이션 시켜 상기 프라이머를 연장시키는 단계를 포함하는, 변형된-NTP를 적어도 부분적으로 포함하는 핵산 물질을 증폭하는 방법으로서, 상기 변형된-NTP는 ATP, TTP, CTP, GTP 및 UTP로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상이 변형된 것을 포함하는 것인 방법을 이용하여 핵산 물질을 패킹하는 방법을 제공한다.
일 구체예에서, 상기 패킹은 핵산 물질의 보관 또는 핵산 물질의 형질주입을 조절하기 위한 것일 수 있다. 반응 혼합물의 인큐베이션 후 상기 반응 혼합물에 잔존하는 무기염류 또는 효소 작용에 의해 생성된 핵산 물질은 분해되거나 변질될 수 있고, 정제된 완충액에 상기 생성된 핵산 물질을 보관하더라도 장기 보관하는 경우 서서히 자체 분해되거나 변질될 수 있다. 그러나 생성된 핵산 물질이 상기 핵산 물질 내 특징적인 뉴클레오티드 서열, 특히 변형된-NTP에 의해 유발된 뉴클레오티드 서열 간의 상호작용으로 인하여 스스로 패킹되면 표면적이 감소할 수 있으므로, 패킹되지 않은 핵산 물질에 비해서 상기 무기염류 또는 효소 작용의 영향을 적게 받을 수 있다. 따라서 목적하는 핵산 물질을 보다 안정하게 저장할 수 있고, 다른 구체예에서 장기 보관하는데 유리할 수 있다. 또한 상기 핵산 물질의 저장 환경에 따라 핵산 물질 내 총 NTP 대비 변형된-NTP의 비율 또는 변형된-NTP의 종류를 달리할 수 있다.
또한 생성된 핵산 물질은 선형으로 존재하거나 세포막을 통과하기에 적절하지 않은 크기를 이루며 존재하므로 상기 핵산 물질을 세포 내로 이동시키기 위해 적절한 형질주입 시약을 필요로 할 수 있다. 그러나 적절하게 패킹된 핵산 물질은 세포막을 통과하기에 적절한 크기를 이룰 수 있어 형질주입 시약 없이도 세포 내로 이동될 수 있다. 따라서 상기 패킹된 핵산 물질을 이용하는 경우 형질주입을 위해 사용되는 시약에 의한 세포독성 효과를 피할 수 있다. 다른 구체예에서 상기 패킹된 핵산 물질의 세포 내 이동량을 증가시키기 위해 형질주입 시약과의 조합으로 형질주입 될 수 있다.
다른 양상은 주형 핵산, 상기 주형에 적어도 부분적으로 상보적인 서열을 갖는 프라이머, 폴리머라제 및 변형된-NTP(nucleoside triphosphate)를 포함하는 반응 혼합물을 인큐베이션 시켜 상기 프라이머를 연장시키는 단계를 포함하는, 변형된-NTP를 적어도 부분적으로 포함하는 핵산 물질을 증폭하는 방법으로서, 상기 변형된-NTP는 ATP, TTP, CTP, GTP 및 UTP로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상이 변형된 것을 포함하는 것인 방법에 의해 생산된 핵산 물질을 포함하는 조성물을 제공한다. 상기 조성물은 핵산 물질을 안정하게 보존하거나 또는 형질 주입을 위한 것일 수 있다. 따라서 상기 조성물은 예를 들어 장기 저장에 유리하도록 적절한 무기염류 또는 화합물을 포함할 수 있다. 또한 상기 조성물은 예를 들어 형질주입에 유리하도록 적절한 양의 형질주입 시약을 포함할 수 있다.
일 구체예에서, 상기 핵산 물질은 선형 또는 환형인 것일 수 있다.
다른 구체예에서, 상기 핵산 물질은 변형된-NTP를 적어도 부분적으로 포함하는 조성물일 수 있다. 상기 변형된-NTP는 상기 핵산 물질 내에 패킹에 적절한 양으로 NTP와 특정 범위의 비율을 이루며 존재할 수 있다. 예를 들어, 상기 변형된-NTP는 총 NTP 대비 10%, 20%, 50%, 80%, 또는 100%의 비율로 상기 핵산 물질을 증폭하는 방법에 사용될 수 있으며, 따라서 생성된 핵산 물질 또한 사용된 변형된-NTP 비율에 따라 총 NTP 대비 10%, 20%, 50%, 80%, 또는 100%의 비율로 변형된-NTP를 포함할 수 있다. 상기 비율은 각 NTP에 따른 기준(즉, ATP, TTP, CTP, GTP 및 UTP 각각에 대한 변형된-ATP, -TTP, -CTP, -GTP 및 -UTP 각각의 비율)으로 설정된 것일 수 있다.
일 양상은 방법에 이용될 NTP를 포함하고, 상기 NTP는 변형된-NTP를 적어도 부분적으로 포함하는 핵산 패킹 키트를 제공한다.
상기 키트는 하나 이상의 반응 시약을 갖는 포장단위를 포함하는 키트 형태로 제공될 수 있다. 또한 상기 키트는 하나 이상의 하기의 품목을 포함할 수 있다: 완충액, 사용설명서, 주형 핵산, 상기 주형에 적어도 부분적으로 상보적인 서열을 갖는 프라이머, 폴리머라제, NTP 및 변형된-NTP. 키트는 본 명세서에 기술된 방법을 수행하기 위해 적절한 비율로 혼합된 반응 시약들의 용기들을 포함할 수 있다. 반응 시약 용기들은 바람직하게는 상기 방법을 수행할 때 측정하는 단계를 생략할 수 있도록 단위 수량의 반응 시약을 포함한다. 다른 구체예에서, 상기 키트 시약은 반응 생성물로부터 생성된 핵산 물질을 추출하기 위한 시약을 더 포함한다. 또한, 키트 시약은 상기 생성된 핵산 물질을 정량, 정성 또는 검출하기 위한 시약을 포함할 수 있다.
일 양상에 따른 주형 핵산, 상기 주형에 적어도 부분적으로 상보적인 서열을 갖는 프라이머, 폴리머라제 및 변형된-NTP(nucleoside triphosphate)를 포함하는 반응 혼합물을 인큐베이션 시켜 상기 프라이머를 연장시키는 단계를 포함하는, 변형된-NTP를 적어도 부분적으로 포함하는 핵산 물질을 증폭하는 방법으로서, 상기 변형된-NTP는 ATP, TTP, CTP, GTP 및 UTP로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상이 변형된 것을 포함하는 것인 방법에 의해서 스스로 패킹되는 핵산 물질을 생성할 수 있다.
다른 양상에 따른 상기 방법에 의해 생산된 핵산 물질을 포함하는 조성물은 상기 생성된 핵산 물질의 장기 보존이 가능하게 하거나 상기 핵산 물질의 세포 내 형질주입 효율을 증가시킬 수 있다.
다른 양상에 따른 상기 방법에 이용될 NTP를 포함하고, 상기 NTP가 변형된-NTP를 포함하는 적어도 부분적으로 핵산 패킹 키트는 장기 보존 또는 증가된 형질 주입을 위해 상기 스스로 패킹되는 핵산 물질을 생성할 수 있도록 한다.
도 1은 2차 구조를 형성할 수 있는 서열 및 5-알릴아미노-dUTP를 이용함으로써 크기-조절된 RCA 산물을 제작하는 것을 도식화한 것이다.
도 2A는 RCA 산물을 아가로스 겔 상에 분석한 것이고, 도 2B는 RCA 산물의 유체역학적 크기를 보여주는 DLS 분석 결과(P1은 회색, P2는 적색 및 P3는 청색)를 나타내고, 도 2C는 RCA 산물의 AFM 이미지를 나타낸 것다.
도 3A는 5-아미노알릴-dUTP를 포함하는 RCA 산물을 아가로스 겔 상에 분석한 것이고, 도 3B는 5-아미노알릴-dUTP의 농도를 변화시킴에 따라 수득된 RCA 산물의 유체역학적 크기를 보여주는 DLS 분석 결과를 나타내고, 도 3C는 RCA 산물의 AFM 이미지를 나타낸 것이다.
도 4는 변형된-NTP를 이용한 RCA 반응에 의해 핵산 물질이 패킹되는 과정을 도식화한 것으로서, 상기 변형된-NTP로서 사용된 5-HP, 5-HM, 5-CA, 5-PP, 및 5-PA의 화학식을 나타낸 것이다.
도 5A는 RCA 반응에 사용된 변형된-NTP 종류에 따른 RCA 산물을 아가로스 겔 상에 분석한 것을 나타내고, 도 5B는 변형된-NTP 종류에 따라 수득된 RCA 산물의 유체역학적 크기를 보여주는 DLS 분석 결과를 나타낸 것이고, 도 5C는 각 변형된-NTP 종류에 따라 수득된 RCA 산물의 AFM 이미지를 나타낸 것이다.
도 6A은 RCA 반응에 사용된 변형된-NTP 종류에 따라 생산된 핵산 물질이 세포에 전달되는 정도를 보여주는 형광 현미경 이미지이고, 도 6B는 세포 내 전달된 정도를 유동세포계측기로 측정하여 나타낸 것이다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 핵산 물질 팩킹 효과의 확인
본 실시예에서는 RCA 반응을 이용하여 생성된 핵산 물질이 팩킹되는 효과를 확인 하였다.
1. RCA 중합 반응을 이용한 핵산 물질의 생성
(1) RCA 중합 반응을 위한 환형 주형 사슬 제조
모든 DNA 올리고뉴클레오티드는 바이오니어(대한민국, 대전)로부터 구입하였다. 5'-말단이 인산화되어 있는 T1, T2, T3를 하기 표1의 서열을 갖는 프라이머, 리게이션 완충액(ligation buffer), 및 T4 DNA 리가제(ligase)와 혼합하여 16℃에서 밤새 인큐베이션 하였다. 리게이션 반응 후, 환형 주형 사슬 산물은 10%-변성(denaturing) 폴리아크릴아미드 겔 전기영동을 통해 분리하였고, 에탄올 침전법을 이용하여 정제하였다.
상기 반응에 사용된 프라이머, 주형 및 생성물의 염기서열을 하기 표 1에 기재하였다. (주형 내 프라이머 결합부위를 밑줄로 표시하였고, P2 및 P3 내 앱타머 서열을 볼드체로 표시하였다)
서열 (5' → 3')
프라이머 CTCTGGTGAGGACAGGACTT


주형 및
생성물
서열


 T1 CTCACCAGAGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGTCCTGTC
P1 (GACAGGACTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCTCTGGTGAG)n
T2 CTCACCAGAGCCGCATGCCATCCGCCCAGTTGACAAAAAAACCGCATGCCATCCGCCCAGTTGACAAGTCCTGTC
P2 (GACAGGACTTGTCAACTGGGCGGATGGCATGCGGTTTTTTTGTCAACTGGGCGGATGGCATGCGGCTCTGGTGAG)n
T3 CTCACCAGAGCCACCACCACCAACACCACCACCACCAAAAAAACCACCACCACCAACACCACCACCACCAAGTCCTGTC
P3 (GACAGGACTTGGTGGTGGTGGTGTTGGTGGTGGTGGTTTTTTTGGTGGTGGTGGTGTTGGTGGTGGTGGCTCTGGTGA G)n
상기 표 1에서 각각 환형 주형사슬 T1, T2 및 T3은 상기 주형 사슬에 의해 생성되는 RCA 중합반응 산물인 P1, P2 및 P3이 그 염기 서열 중, P1은 티민(thymidine) 염기서열이 단순히 나열되어 있는 형태임에 반해, P2및 P3의 서열 내에는 2차 구조를 형성할 수 있는 MUC1 및 AS1411 앱타머 서열이 각각 삽입되도록 하는 서열을 갖는다.
(2) RCA 중합 반응
환형 주형사슬, dNTP, 프라이머, 및 phi29 DNA 중합효소를 포함하는 반응 완충액을 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 변형된-NTP 삽입을 위해서는 5-위치에 변형기를 지니는 변형된-dUTP를 dTTP와 다양한 비율로 (NTP 및 변형된-NTP의 합 대비 변형된-NTP 비율 0%, 20%, 50%, 80% 또는 100%) 혼합하여 사용하였다. 변형된-NTP인 5-HP(5-Hydroxypentynyl-2'-deoxyuridine-5'-Triphosphate), 5-HM(5-Hydroxymethyl-2'-deoxyuridine-5'-Triphosphate), 5-CA(5-Carboxy-2'-deoxyuridine-5'-Triphosphate), 5-AA(5-Aminoallyl-2'-deoxyuridine-5'-Triphosphate), 5-PP(5-Propynyl-2'deoxyuridine-5'-Triphosphate), 및 5-PA(5-Propargylamino-2'-deoxyuridine-5'-Triphosphate)는 TriLink Biotechnologies사(San Diego, USA)에서 구매하여 사용하였다. 그런 다음, 상기 반응물을 65℃에서 10분간 인큐베이션하여 중합효소를 비활성화 하였다.
2.RCA 중합 반응에 의해 생산된 핵산 물질의 팩킹 효과
(1) 아가로스 ( Agarose ) 젤 전기영동
상기 RCA 중합 반응에 의해 생성물이 핵산 물질의 크기를 측정하기에 충분한 양으로 생성되는지 확인하기 위해 아가로스 젤에 상기 생성물을 전기 영동하였다.
상기 전기 영동은 0.5% 아가로스 젤에서 0.5X TBE 용액을 사용하여 상기 RCA 중합 반응으로 얻은 생성물을 100V로 45분 동안 25℃에서 수행하였다. 전기 영동한 젤을 SYBR gold로 염색한 뒤, 형광스캐너 (GelDoc, DNR, Israel)로 이미지를 얻었다.
그 결과 도 2A에서 보이는 바와 같이, P1, P2 및 P3 모두 RCA 중합 반응에 의하여 핵산 물질의 크기를 측정할 수 있을 만큼 생성된 것을 확인하였다. 변형된-NTP를 이용한 RCA 중합 반응을 위해 dUTP의 변형된-NTP인 5-알릴아미노-dUTP를 dNTP들과 같이 섞어 사용하였는데, 그 결과 도 3A에서 볼 수 있는 바와 같이, dTTP가 100% 5-알릴아미노-dUTP로 대체되었을 경우, RCA 중합 산물의 양이 많지는 않았으나, 이보다 적은 80%, 50%, 20% 정도 대체되었을 경우에는 RCA 중합 반응 생성물의 양이 충분하여서 핵산 물질의 크기를 측정할 수 있었다. 반면, 변형된-NTP 5-HM, 5-CA, 5-AA, 5-PP, 5-PA 및 5-HP를 사용한 경우 도 5A에서 확인할 수 있는 바와 같이, 상기 6가지 변형된-NTP 모두 RCA 중합 반응에 사용되어 크기를 측정하기 충분한 양으로 핵산 물질이 생성된 것을 확인하였다.
(2) 동적 광산란 (Dynamic light scattering; DLS) 측정
RCA 중합 반응 생성물의 염기 서열의 특수성이 팩킹에 영향을 미쳐 핵산 물질의 크기 변화가 유발되는지 분석하기 위해 동적 광산란 측정을 수행하였다.
상기 RCA 중합반응의 생성물의 유체역학적(hydrodynamic) 크기를 Zetasizer (Malvern, UK)를 이용하여 측정하였다. DLS측정을 위한 샘플의 농도로 150 nM을 사용하였다.
그 결과 도 2B를 참조하면, P2 및 P3는 P1과 달리 서열 내에 2차 구조를 형성할 수 있는 염기 서열을 갖고 있어 상대적으로 P1에 비해 스스로 뭉치려는 힘이 강해 팩킹이 잘 되었고, 그 결과로 얻어진 핵산 물질의 크기도 더 작은 것으로 보였으며, P3가 가장 패킹이 잘되는 것으로 보였다. 뿐만 아니라, 크기 분포도에 있어서도 특정 구조를 가질 것으로 예상되는 P2 및 P3는 P1에 비하여 보다 일정한 수준의 크기 분포를 갖는 것으로 보였다. 이러한 팩킹은 염기 서열 자체를 이용하여 얻어진 결과이다.
이와 같은 결과에 더하여 또 다른 레벨의 팩킹을 위해 dUTP의 변형된-NTP인 5-알릴아미노-dUTP를 RCA 중합반응 시 dNTP들과 같이 섞어 사용하였다. 그 결과 도 3B에 보인 바와 같이, 5-알릴아미노-dUTP를 dNTP와 섞어서, 상기 중합 반응을 수행한 경우, dNTP만 이용하여 중합반응 했을 때보다, 생성 된 핵산물질의 크기가 좀 더 작게 조절 될 수 있음을 확인하였다.
이를 바탕으로, 좀 더 다양한 변형된-NTP 5-HM, 5-CA, 5-AA, 5-PP, 5-PA 및 5-HP (20% dTTP를 대체하는 조건으로)를 RCA 중합 반응에 사용하였고, 그 결과 도 5B에서 확인할 수 있는 바와 같이 생성된 핵산 물질의 팩킹정도가 사용된 뉴클레오티드의 변형에 사용된 잔기의 화학적인 성질과 연관이 있음을 확인하였다. 음이온성 잔기를 지니는 5-CA가 삽입되어 얻어진 핵산 물질은 변형된-NTP가 삽입되지 않은 산물보다 크기가 증가하였고, 양이온성 잔기를 지니는 5-AA 및 5-PA의 경우, 생성된 핵산 물질의 크기가 감소하였다. 수소결합을 할 수 있으나 중성 잔기를 지니는 5-HM 및 5-HP의 삽입에 의해서는 핵산 산물의 크기가 많이 변하지는 않았으며, 소수성의 중성 잔기를 지니는 5-PP가 삽입되어 얻어진 산물의 크기는 약간 증가하였다. 따라서, 염기 서열 자체에 의해 생성된 2차 구조 등에 의해 핵산 물질의 패킹 정도가 달라질 수 있으며, 상기 팩킹에 변형된-NTP의 특이적인 전하 또는 결합 특성이 영향을 미침을 알 수 있다.
(3) 원자력현미경 (Atomic force microscopy) 측정
염기 서열 특수성 및 변형된-NTP에 의해 유발되는 패킹 효과를 시각적으로 분석하기 위해 원자력 현미경을 이용하여 상기 RCA 중합 반응 생성물의 크기를 측정하였다.
원자력 현미경을 이용한 측정을 위하여, 상기 RCA 중합반응 생성물 시료를 마이카(mica)에 올린 후, 1시간 후 상기 마이카 표면을 증류수로 세척하고 곧바로 질소 가스로 건조시켰다. 상기 시료를 Park XE-100 (Park System Corp. Korea) AFM 장비에서 비접촉 모드와 PPP-NCHR tip (Park System Corp. Korea)을 사용하여 측정하였다. AFM 이미지는 XEI 4.1.0 소프트웨어를 사용하여 분석하였다.
그 결과 도 2C에서 볼 수 있는 바와 같이, P2 및 P3가 P1에 비해 핵산 물질의 크기가 훨씬 작은 것으로 보였으며, 크기도 보다 일정한 것으로 보였고, 그 정도는 P3가 가장 큰 것으로 확인되었다.
마찬가지로 도 3C에서 볼 수 있는 바와 같이, 변형된-NTP인 5-알릴아미노-dUTP를 RCA 중합반응 시 dNTP들과 같이 섞어 사용한 경우에서도, dNTP만 이용하여 중합반응 했을 때보다 생성된 핵산 물질의 크기가 잘 팩킹되어 더 작고, 보다 일정한 형태를 유지함을 확인하였다.
변형된-NTP인 5-HM, 5-CA, 5-AA, 5-PP, 5-PA 및 5-HP (20% dTTP를 대체하는 조건으로)가 삽입된 핵산 물질의 경우, 도 5C에서 확인할 수 있는 바와 같이 음이온성 잔기를 지니는 5-CA 또는 소수성의 중성 잔기를 지니는 5-PP에 비하여 양이온성 잔기를 지니는 5-AA 및 5-PA의 경우, 크기가 비교적 일정하며 특히 5-AA의 경우 매우 작고 고른 크기의 핵산 물질을 생성할 수 있음을 알 수 있다. 이는 상기 DLS 측정 결과와 일치하여 핵산 물질의 팩킹에 변형된-NTP의 특이적인 전하 또는 결합 특성이 영향을 미침을 알 수 있다.
실시예 2: 팩킹된 핵산 물질의 세포 내 전달 효율 확인
본 실시예에서는 변형된-NTP를 이용한 RCA 중합 반응에 의해 생성된 핵산 물질이 팩킹되어 세포 내 전달 효율이 증가되는지 확인하였다.
1. 패킹된 핵산 물질의 세포 내 주입
열로 불활성화한 10% 우태아 혈청, 1% 페니실린 및 스트렙토마이신을 포함하는 DMEM 배지(Gibco, USA)가 들어있는 유리바닥 35 mm 페트리 접시에 HeLa 세포를 넣었다. 2.5×104개 세포를 각각의 접시에 접종하고, 5% CO2를 포함하는 37℃의 습한 대기 환경 중에서 상기 접시를 밤새 배양하였다. 각각의 세포 시료로부터 성장 배지를 제거하고, PBS(Gibco, USA)를 사용하여 세포를 2회 세척하였다. 혈청 및 항생제가 없는 신선한 배지(250 ㎕) 중에 있는 RCA 중합반응 생성물인 팩킹된 핵산 물질을 세포 시료에 첨가하고, 5% CO2를 포함하는 37℃의 습한 대기 중에서 6시간 동안 배양하였다.
2. 세포 내 핵산 물질의 전달 효율 확인
(1) 형광 현미경 측정
세포 내 전달된 핵산 물질의 양을 측정하기 위해 세포에 상기 RCA 중합 반응에 의하여 생성된 핵산 물질을 처리한 후 세포를 관찰하였다.
구체적으로 현미경 시험을 위해, Cy5가 부착된 프라이머 및 변형된-NTP인 5-HM, 5-CA, 5-AA, 5-PP, 5-PA 및 5-HP를 이용하여 RCA 중합 반응을 상기와 같이 동일하게 수행하여 팩킹된 핵산 산물을 제조하였다. Hoechst 34580(3 ㎍/mL, Invitrogen, USA)을 사용하여 핵을 염색하고, PBS(200 ㎕)로 세포를 2회 세척하였다. 그런 다음 세포 배양 배지(200 ㎕)를 첨가하였다. 형광 현미경(LMS 700, Carl Zeiss Microscopy, Germany)으로 살아있는 세포를 영상화하였다. Cy5 및 Hoechst 34580를 위하여 사용된 여기/발광 필터는 각각 630-650/665-705 nm와 340-380/432-482 nm이었다.
그 결과 도 6A에서 볼 수 있는 바와 같이, 음이온성 잔기를 지니는 5-CA 및 소수성의 중성 잔기를 지니는 5-PP가 삽입되어 얻어진 핵산 물질은 수소결합을 할 수 있으나 중성 잔기를 지니는 5-HM 및 5-HP에 비해 세포 내로 전달된 핵산 물질의 양이 적은 것으로 보였으며, 양이온인 5-AA 및 5-PA의 경우와 비교해서는 그 차이가 현저한 것으로 보였다. 이는 상기 AFM 분석 결과와 일치하는 것으로 핵산 물질의 팩킹 정도가 상기 핵산 물질의 세포 내 전달 효율에도 영향을 미치는 것을 알 수 있다.
(2) 유동 세포 측정(Flow cytometer )
유동 세포 측정을 위해, HeLa세포를 1×105 세포/mL의 밀도로 12-웰 플레이트에 접종하고, 24시간 동안 배양한 다음, PBS로 2회 세척하였다. 상기 형광 현미경 측정에서와 같이 Cy5가 부착된 프라이머를 이용한 RCA 중합 반응을 수행하여 생성된 팩킹된 핵산 물질과 함께 배양 및 수득하고, PBS로 3회 세척하였다. 그런 다음 트립신 보충물(TrypLETM, Gibco, USA) 0.2 mL를 각각의 시료에 첨가하고, 37℃에서 5분간 배양하였다. 그런 다음 각각의 시료에 배지 1 mL를 첨가하고, 얻어진 세포 현탁액을 원뿔형 튜브(FalconTM tubes, BD Biosciences, USA)로 이전한 후, 2500 rpm에서 3분간 원심분리하였다. 상등액을 제거하고, 세포 펠렛을 PBS 1 mL에 재현탁시켰다. 유세포 분석기(Guava, Millipore, USA)를 사용하여 세포의 Cy5 강도를 측정하였다. 적어도 10,000개 세포의 시료를 3회 분석하였다.
그 결과 도 6B에서 볼 수 있는 바와 같이, 잘 팩킹된 핵산 물질이 세포 내로 용이하게 전달 될 수 있음이 확인되었다. 전달 효율은 팩킹된 구조의 크기가 작을수록 높음이 관찰 되었으므로, 인 비트로에서 제조된 생화학적 활성을 지니는 핵산 물질의 팩킹에 의해 크기를 조절하여 상기 핵산 물질을 고효율로 전달할 수 있는 방법으로 활용될 수 있음을 시사한다.

Claims (25)

  1. 주형 핵산, 상기 주형에 적어도 부분적으로 상보적인 서열을 갖는 프라이머, 폴리머라제 및 변형된-NTP(nucleoside triphosphate)를 포함하는 반응 혼합물을 인큐베이션 시켜 상기 프라이머를 연장시키는 단계를 포함하는, 변형된-NTP를 적어도 부분적으로 포함하는 핵산 물질을 증폭하는 방법으로서,
    상기 변형된-NTP는 ATP, TTP, CTP, GTP 및 UTP로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상이 변형된 것을 포함하는 것이고,
    상기 핵산 물질은 스스로 패킹되는 것이고,
    상기 변형된-NTP는 상기 변형된-NTP의 염기가 아데닌 또는 구아닌인 경우 퓨린 고리의 7번 탄소의 수소, 시토신 또는 우라실인 경우 피리미딘 고리의 5번 탄소의 수소, 및 티민인 경우 피리미딘 고리의 5번 탄소의 메틸기가 변형된 것이고,
    상기 변형은,
    아민, 구아니딘, 피리딘 또는 이미다졸로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상으로 치환된, C1 내지 C30 알킬, C1 내지 C30 알케닐, 또는 C1 내지 C30 알키닐;
    히드록실 하나 이상으로 치환된 C1 내지 C30 알킬, 또는 C1 내지 C30 알케닐; 또는
    C1 내지 C30 알킬, C1 내지 C30 알케닐, 또는 C1 내지 C30 알키닐로 치환되는 것인 방법.
  2. 삭제
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 변형된-NTP는 변형된-dNTP(deoxyribonucleoside triphosphate)인 방법.
  4. 청구항 1에 있어서, 상기 주형 핵산은 DNA 또는 RNA인 방법.
  5. 청구항 1에 있어서, 상기 주형 핵산은 단일 가닥 또는 이중 가닥인 방법.
  6. 청구항 1에 있어서, 상기 주형 핵산은 원형 또는 선형인 방법.
  7. 삭제
  8. 삭제
  9. 삭제
  10. 삭제
  11. 삭제
  12. 삭제
  13. 삭제
  14. 삭제
  15. 청구항 1에 있어서, 상기 변형된-NTP는 하기 화학식 2, 및 4 내지 6 중 어느 하나의 화학식을 갖는 것인 방법.
    Figure 112017101809506-pat00020

    Figure 112017101809506-pat00021
  16. 청구항 1에 있어서, 상기 인큐베이션은 중합효소 반응인 방법.
  17. 청구항 16에 있어서, 상기 중합효소 반응은 프라이머 신장법(primer extension), 회전환 증폭법(rolling circle amplification), 회전환 전사(rolling circle transcription), 인 비트로 전사(in vitro transcription), 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction) 및 핵산 말단 트란스퍼라제 반응(nucleotide terminal transferase reaction) 중 선택된 것인 방법.
  18. 청구항 1에 있어서, 상기 핵산 물질은 게놈 DNA, 안티센스 올리고뉴클레오티드, mRNA, siRNA, 마이크로 RNA, sgRNA 및 앱타머로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
  19. 청구항 1에 있어서, 상기 방법은 핵산 물질을 패킹하기 위한 방법.
  20. 청구항 19에 있어서, 상기 패킹은 핵산 물질의 보관 또는 핵산 물질의 형질주입을 조절하기 위한 것인 방법.
  21. 청구항 1에 따른 방법에 의해 생산된 핵산 물질을 포함하는 조성물.
  22. 청구항 21에 있어서, 상기 핵산 물질은 선형 또는 환형인 것인 조성물.
  23. 청구항 21에 있어서, 상기 핵산 물질은 청구항 1의 변형된-NTP를 적어도 부분적으로 포함하는 조성물.
  24. 청구항 21에 있어서, 상기 조성물은 형질주입을 위한 것인 조성물.
  25. 청구항 1에 기재된 변형된-NTP를 포함하는 핵산 패킹 키트.
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