KR101870316B1

KR101870316B1 - 음이온성 약물을 함유하는 고분자 미셀의 제조방법

Info

Publication number: KR101870316B1
Application number: KR1020160172716A
Authority: KR
Inventors: 남혜영; 김상희; 서민효; 손지연
Original assignee: 주식회사 삼양바이오팜
Priority date: 2015-12-18
Filing date: 2016-12-16
Publication date: 2018-06-22
Also published as: AU2016372321A1; DK3391875T3; CN108366964B; KR20170073528A; CN108366964A; EP3391875A4; EP3391875B1; CA3008788C; AU2016372321B2; JP2019501900A; ES2901102T3; NZ743320A; PT3391875T; EP3391875A1; JP6599560B2; WO2017105138A1; CA3008788A1; US20180344638A1

Abstract

본 발명은 수상에서 음이온성 약물과 양이온성 화합물을 정전기적 결합을 이용하여 나노입자를 형성시키는 단계; 및 상기 나노입자를 양친성 고분자 및 임의로 폴리락트산염으로 이루어진 고분자 미셀 안에 포함시키는 단계를 포함함으로써, 정전기적 결합과 소수성 결합을 증가시켜 제형의 음이온 약물 봉입률을 높임으로써 음이온성 약물 전달용 조성물의 제조 수득률을 증가시키는 제조 방법에 관한 것이다.

Description

음이온성 약물을 함유하는 고분자 미셀의 제조방법{Preparation Method of Polymeric Micelle Containing Anionic Drugs}

본 발명은 음이온성 약물을 함유하고, 이를 전달하기 위한 약제학적 조성물 및 그 제조방법에 관한 것이다.

많은 질병은 여러 요인으로 인하여 질병 유전자의 발현이 증가하거나 돌연변이에 의해 비정상적인 활성이 나타남으로써 발생하게 된다. siRNA(short interfering RNA)는, 전사 후 공정에서 서열 특이적으로 특정 유전자의 발현을 억제하므로, 유전자 치료제로서 많은 관심이 집중되고 있다. 특히, siRNA의 높은 활성과 정밀한 유전자 선택성으로 인해, 기존의 안티센스 뉴클레오티드나 리보자임 등의 문제점을 해결할 수 있는 핵산 치료제로 기대되고 있다. siRNA는 짧은 이중 나선의 RNA 가닥으로, 이들과 염기 서열이 상보적인 유전자의 mRNA를 절단함으로써 해당 유전자의 발현을 억제시킨다 (McManus and Sharp, Nature Rev. Genet. 3:737 (2002); Elbashir, et al., Genes Dev. 15:188 (2001). 그러나, 이러한 장점에도 불구하고, siRNA는 혈중에서 핵산 분해 효소에 의해 빠르게 분해되고, 신장을 통하여 빠르게 체외로 배설될 뿐 아니라, 강한 음전하를 띄어 세포막을 쉽게 통과하지 못하는 것으로 알려져 있다.

이러한 siRNA를 포함하는 핵산 물질, 음이온성 약물을 이용한 치료에 있어서, 안전하고 효율적인 약물 전달기술은 오랫동안 연구되어 왔으며, 다양한 전달체 및 전달기술이 개발되어 왔다. 전달체는 크게 아데노바이러스나 레트로바이러스 등을 이용한 바이러스성 전달체와 양이온성 지질 및 양이온성 고분자 등을 이용한 비바이러스성 전달체로 나뉜다.

바이러스성 전달체의 경우는 비특이적 면역 반응 등의 위험성에 노출되어 있으며 생산 공정이 복잡하여 상용화하는 데 많은 문제점이 있는 것으로 알려져 있다. 따라서, 최근 연구 방향은 비바이러스성 전달체를 이용하여 그 단점을 개선하는 방향으로 진행되고 있다. 비바이러스성 전달체는, 바이러스성 전달체에 비하여 효율성에서 뒤떨어지지만, 생체 내 안전성의 측면에서 부작용이 적고, 경제성 측면에서 생산 가격이 저렴하다는 장점을 가지고 있다.

비바이러스성 전달체중 가장 대표적인 것은 양이온성 지질을 이용한 양이온성 지질과 핵산의 복합체(lipoplex) 및 폴리양이온성(polycation) 고분자와 핵산의 복합체(polyplex)이다. 이러한 양이온성 지질 혹은 폴리양이온성 고분자는, 음이온성 약물과 정전기적 상호 작용을 통해 복합체를 형성함으로써 음이온성 약물을 안정화시키고, 세포 내 전달을 증가시킨다는 점에서 다양한 연구가 진행되어 왔다. 그러나, 충분한 효과를 얻기 위해 필요한 양을 사용할 경우에, 바이러스성 전달체보다는 덜하지만, 심각한 독성을 유발하여 의약품으로 사용이 부적당하다는 결과를 나타내었다. 따라서, 독성을 유발할 수 있는 양이온성 고분자 또는 양이온성 지질의 사용량을 최소화하여 독성을 감소시키면서, 혈중 및 체액 내에서 안정하고, 세포 내 전달이 가능하여 충분한 효과를 얻을 수 있는 음이온성 약물 전달 기술의 개발이 필요하다.

한편, 양친성 블록 공중합체를 이용하여 고분자 미셀의 형태로 난용성 약물을 가용화하고 수용액상에서 안정하게 함으로써 약물 전달체로서 이용하려는 노력이 다양하게 진행되었다(한국등록특허 제0180334호). 그러나, 이러한 양친성 블록 공중합체는 내부에 소수성을 띄는 고분자 미셀을 형성함으로써 소수성을 띄는 난용성 약물을 가용화할 수는 있지만, 음이온을 띄는 핵산 등의 친수성 약물은 고분자 미셀 내부에 봉입할 수 없으므로, 이들 핵산을 포함하는 음이온성 약물의 전달에는 적당하지 않다. 이에, 본 발명자들은 핵산과 양이온성 화합물의 정전기적 상호작용에 의한 복합체를 형성하여 상기 복합체가 양친성 블록 공중합체의 미셀 구조 내부에 봉입되도록 하는 음이온성 약물 전달 조성물 및 다양한 제조 방법을 개시한 바 있다. 그러나, 여전히 이러한 음이온성 약물 전달 조성물의 제조 수득률 및 핵산의 안정성 강화를 위한 제형 제조 방법의 개선이 필요하다.

이러한 배경하에서, 본 발명자들은 음이온성 약물 전달용 조성물의 제조 수득률 및 상기 음이온성 약물의 안정성 강화를 위한 제조방법 개발에 예의 노력한 결과, siRNA와 같은 음이온성 약물과 양이온성 화합물을 각각 수성 용매에 용해시켜 이를 혼합하여 단일상 시스템하에서(monophse system) 복합체를 형성시켜 이를 고분자 미셀 내에 봉입하는 경우, 탁월하게 음이온성 약물의 수득률을 향상시키고 음이온성 약물의 안정성을 강화시킬 수 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은, 음이온성 약물 함유 조성물 제조 수득률 및 핵산의 안정성이 강화된 음이온성 약물 전달용 조성물의 제조방법 및 그로부터 제조되는 음이온성 약물 전달용 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은

수상에서 음이온성 약물과 양이온성 화합물을 정전기적 결합을 이용하여 나노입자를 형성시키는 단계; 및 상기 나노입자를 양친성 고분자 및 임의로 폴리락트산염으로 이루어진 고분자 미셀 안에 포함시키는 단계를 포함함으로써, 정전기적 결합과 소수성 결합을 증가시켜 제형의 음이온 약물 봉입률을 높임으로써 음이온성 약물 전달용 조성물의 제조 수득률을 증가시키는 제조 방법에 관한 것이다.

구체적으로, 본 발명에 따른 제조방법으로 제조하고자 하는 조성물은, 미셀 구조체를 포함하는 음이온성 약물 전달용 조성물로, 양친성 블록 공중합체와 임의로 폴리락트산염의 미셀 구조체에 약물 및 양이온성 화합물의 복합체가 포함된 구조를 가지며, 유효성분으로서

음이온성 약물;

양이온성 화합물;

양친성 블록 공중합체; 및

임의로, 폴리락트산염

을 포함하며, 상기 음이온성 약물은 상기 양이온성 화합물과 정전기적 상호작용에 의해 복합체를 형성하고, 이와 같이 형성된 복합체가 양친성 블록 공중합체 및 임의로 폴리락트산염에 의하여 형성된 미셀 구조체 내부에 봉입되는 것을 특징으로 한다.

상기 제조방법은, 구체적으로 다음과 같은 단계를 포함한다:

(a) 음이온성 약물과 양이온성 화합물을 각각 수성 용매에 용해시켜 혼합하는 단계; 및

(b) 양친성 블록 공중합체와 임의로 폴리락트산염을 수성 용매 또는 유기 용매에 용해시켜 단계 (a)에서 얻어진 혼합물과 혼합하는단계.

이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.

본 발명에 따른 제조방법에서 상기 단계 (a)에서는 음이온성 약물과 양이온성 화합물의 복합체를 제조하기 위해, 이들을 각각 수상, 즉 수성 용매에 용해시켜 혼합한다.

상기 (a) 단계에서, 수성 용매에 용해된 음이온성 약물과 양이온성 화합물은 정전기적 상호작용에 의해 나노입자 형태의 음이온성 약물과 양이온성 화합물과의 복합체를 이룬다. 상기 단계에서 사용되는 수성 용매는 증류수, 주사용수, 또는 완충액일 수 있다. 상기 음이온성 약물과 양이온성 화합물이 각각 용해된 수용액간의 혼합비율은 특별한 한정은 없으며, 예컨대 부피 기준으로 음이온성 약물 수용액 대비 양이온성 화합물 수용액의 비율(양이온성 화합물 수용액/음이온성 약물 수용액)이 1 내지 20, 보다 구체적으로 1 내지 4 일수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 수용액들은 당업계에 알려진 적절한 혼합 수단을 통해 혼합되는데, 이러한 방법의 예로서, 초음파 분쇄기 등을 들 수 있다.

상기 단계 (a)에서 사용되는 음이온성 약물은 최종적으로 제조되는 조성물의 유효성분으로서, 수용액 중에서 분자 내에 음전하를 띄는 약리학적 활성을 가진 모든 물질을 포함하는 개념이다. 구체적인 일 양태로서, 상기 음이온성은, 카르복시기, 포스페이트기 및 설페이트기로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 작용기로부터 부여될 수 있다. 또한, 본 발명의 일 양태로서 음이온성 약물은 펩타이드, 단백질 또는 헤파린 등의 다중 음이온성 약물 또는 핵산일 수 있다.

또한, 상기 핵산 물질은, 디옥시리보 핵산, 리보 핵산 또는 백본(backbone), 당 또는 염기가 화학적으로 변형되거나 말단이 수식된 폴리뉴클레오타이드 유도체 등의 핵산 약물일 수 있으며, 보다 구체적으로는 RNA, DNA, siRNA(short interfering RNA), 압타머(aptamer), 안티센스 ODN(antisense oligodeoxynucleotide), 안티센스 RNA(antisense RNA), 리보자임(ribozyme) 및 디엔에이자임(DNAzyme) 등으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 핵산일 수 있다. 나아가, 상기 핵산은 혈중 안정성을 증가시키거나 면역 반응을 약화시키는 등의 목적을 위해 백본(backbone), 당 또는 염기가 화학적으로 변형되거나 말단이 수식될 수 있다. 구체적으로, 핵산의 포스포다이에스테르(phosphodiester) 결합의 일부를 포스포로티오에이트(phosphorothioate) 또는 보라노포스페이트 (boranophosphate) 결합으로 대체하거나, 일부 리보오스 염기의 2'-OH 위치에 메틸기, 메톡시에틸기, 불소 등의 다양한 작용기가 도입된 수식된 뉴클레오티드를 1종 이상 포함할 수 있다.

또한, 상기 핵산의 하나 이상의 말단은 콜레스테롤, 토코페롤 및 탄소수 10 내지 24개의 지방산으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상으로 수식될 수 있다. 예를 들어, siRNA의 경우 센스 및/또는 안티센스 가닥의 5' 말단, 또는 3' 말단, 또는 양 말단에 수식될 수 있으며, 바람직하게 센스 가닥의 말단에 수식될 수 있다.

상기 콜레스테롤, 토코페롤 및 탄소수 10 내지 24개의 지방산에는 콜레스테롤, 토코페롤 및 지방산의 각 유사체, 유도체, 및 대사체가 포함된다.

상기 siRNA는, 표적 유전자와 동일한 세포에 존재하는 경우에 siRNA의 서열에 상보적인 mRNA의 분해를 매개함으로써, 표적 유전자의 발현을 감소시키거나 억제할 수 있는 이중가닥 RNA(duplex RNA), 또는 단일가닥 RNA 내부에서 이중가닥의 형태를 띄는 단일가닥 RNA를 지칭한다. 이중가닥 사이의 결합은, 뉴클레오티드 간의 수소 결합을 통해 이루어지며, 이중가닥 내부의 모든 뉴클레오티드가 상보적으로 서로 결합해야 하는 것은 아니며, 상기 양 가닥은 분리되어 있거나(separate) 분리되어 있지 않을 수 있다. 일 양태로서, 상기 siRNA의 길이는 약 15 내지 60 개의(이중 가닥 RNA의 한쪽 뉴클레오티드의 갯수, 즉, 염기쌍의 갯수를 의미하며, 단일 가닥 RNA인 경우에는 단일 가닥 RNA 내부의 이중 가닥의 길이를 의미한다) 뉴클레오티드이며, 구체적으로는, 약 15 내지 30 개의 뉴클레오티드이고, 보다 구체적으로는 약 19 내지 25 개의 뉴클레오티드인 siRNA를 포함한다.

일 양태로서, 이중가닥 siRNA는 3' 또는 5' 말단에 1-5 뉴클레오티드의 돌출부(overhang)를 한쪽 말단에, 또는 양쪽 말단에 가질 수 있다. 또 다른 예에서는 양 말단이 돌출부를 갖지 않는 블런트(blunt) 형태일 수 있다. 구체적으로는 미국특허공개 제2002-0086356호, 미국특허 제7,056,704에 개시된 siRNA일 수 있다(상기 문헌은 본 명세서에 참조로서 포함된다).

또한, 상기 siRNA는 두 가닥의 길이가 동일한 대칭적인 구조를 갖거나, 한 가닥이 다른 가닥보다 짧은 비대칭적인 이중가닥 구조일 수 있다. 구체적으로, 19 내지 21 뉴클레오티드(nucleotide, nt)의 안티센스(antisense); 및 상기 안티센스에 상보적인 서열을 갖는 15 내지 19nt의 센스(sense)로 구성되는 이중가닥(double strand)의 siRNA 분자(small interfering RNA molecule)로서, 상기 siRNA는 안티센스의 5' 방향의 말단이 블런트 말단(blunt end)이고 안티센스의 3' 말단에 1-5 뉴클레오타이드 돌출부(overhang)를 갖는 비대칭 siRNA일 수 있다. 구체적으로 국제특허공개 제09/078685호에 개시된 siRNA일 수 있다.

본 발명에서, 음이온성 약물은, 최종 제조되는 전체 조성물의 중량을 기준으로, 0.001 내지 10 중량%, 구체적으로는 0.01 내지 5중량%로 포함되는 것이 좋다. 상기 음이온성 약물의 함량이 0.001 중량% 미만이면 약물에 비하여 사용되는 전달체의 양이 너무 많아서 전달체에 의한 부작용이 있을 수 있고, 10 중량%을 초과하면, 미셀의 크기가 너무 커져 미셀의 안정성이 저하되고 필터 멸균시 손실율이 커질 우려가 있다.

구체적인 일 양태에서, 상기 양이온성 화합물과 음이온성 약물은 수상에서 정전기적 상호작용에 의해 결합되어 복합체를 형성하고, 상기 복합체는 동결건조를 통해 물을 제거하여 단단한 음이온성 약물과 양이온성 화합물로 구성된 복합체를 형성한다. 따라서, 상기 양이온성 화합물은, 음이온성 약물과 정전기적 상호작용에 의해 복합체를 형성할 수 있으며 수상에 용해 가능한 형태의 지질 종류일 수 있다.

상기 양이온성 화합물은, 음이온성 약물과 정전기적 상호작용에 의해 복합체를 형성할 수 있는 모든 형태의 화합물을 포함하며, 예를 들어, 지질과 고분자 종류일 수 있다. 양이온성 지질은, 예를 들어, 이에 제한되는 것은 아니나, N,N-디올레일-N,N-디메틸암모늄클로라이드(DODAC), N,N-디스테아릴-N,N-디메틸암모늄브로마이드(DDAB), N-(1-(2,3-디올레오일옥시)프로필-N,N,N-트리메틸암모늄클로라이드(DOTAP), N,N-디메틸-(2,3-디올레오일옥시)프로필아민(DODMA), N,N,N-트리메틸-(2,3-디올레오일옥시)프로필아민(DOTMA), 1,2-디아실-3-트리메틸암모늄-프로판(TAP), 1,2-디아실-3-디메틸암모늄-프로판(DAP), 3베타-[N-(N',N',N'-트리메틸아미노에탄)카바모일]콜레스테롤(TC-콜레스테롤), 3베타-[N-(N',N'-디메틸아미노에탄)카바모일]콜레스테롤(DC-콜레스테롤), 3베타-[N-(N'-모노메틸아미노에탄)카바모일]콜레스테롤(MC-콜레스테롤), 3베타-[N-(아미노에탄)카바모일]콜레스테롤(AC-콜레스테롤), 콜레스테릴옥시프로판-1-아민(COPA), N-(N'-아미노에탄)카바모일프로파노익 토코페롤(AC-토코페롤) 및 N-(N'-메틸아미노에탄)카바모일프로파노익 토코페롤(MC-토코페롤)로 구성된 군으로부터 선택된 하나 또는 둘 이상의 조합일 수 있다. 이러한 양이온성 지질을 사용하는 경우, 양이온성 지질로부터 유발되는 독성을 감소시키기 위하여 분자 내의 양이온 밀도가 높은 폴리양이온성 지질을 적게 사용하는 것이 바람직하고, 보다 구체적으로는 분자당 수용액상에서 양이온을 나타낼 수 있는 작용기가 하나일 수 있다. 이에 따라, 보다 바람직한 일 양태에서, 상기 양이온성 지질은 3베타-[N-(N',N',N'-트리메틸아미노에탄)카바모일]콜레스테롤(TC-콜레스테롤), 3베타[N-(N',N'- 디메틸아미노에탄)카바모일]콜레스테롤(DC-콜레스테롤), 3베타[N-(N'- 모노메틸아미노에탄)카바모일]콜레스테롤(MC-콜레스테롤), 3베타[N-(아미노에탄)카바모일]콜레스테롤(AC-콜레스테롤), N-(1-(2,3-디올레오일옥시) 프로필-N,N,N-트리메틸암모늄클로라이드(DOTAP), N,N-디메틸-(2,3-디올레오일옥시)프로필아민(DODMA), 및 N,N,N-트리메틸-(2,3-디올레오일옥시)프로필아민(DOTMA)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 것일 수 있다.

또한, 상기 양이온성 지질은 분자 당 수용액상에서 양이온을 나타낼 수 있는 작용기가 여러 개인 지질 종류일 수 있다. 구체적으로, N,N-디올레일-N,N-디메틸암모늄클로라이드 (DODAC), N,N-디스테아릴-N,N-디메틸암모늄브로마이드 (DDAB), 1,2-디아실-3-트리메틸암모늄-프로판 (TAP), 1,2-디아실-3-디메틸암모늄-프로판 (DAP) 으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 것일 수 있다.

또한, 상기 양이온성 지질은 1 내지 12 개의 올리고알킬렌아민 (oligoalkyleneamine)의 아민 작용기에 탄소수 11 내지 25 개의 포화 또는 불포화 탄화수소를 결합시킨 양이온성 지질일 수도 있으며, 상기 양이온성 지질은 다음의 화학식 1로 표현될 수 있다.

[화학식 1]

상기 식에서,

n과 m 및 l은 각각 0 내지 12이되, 1 ≤ n + m + l ≤ 12이며, a와 b 및 c는 각각 1 내지 6이며, R1, R2 및 R3는 각각 독립적으로 수소 또는 탄소수 11 내지 25개의 포화 및 불포화 탄화수소로서, R1, R2 및 R3 중 적어도 하나는 탄소수 11 내지 25개의 포화 및 불포화 탄화수소이다.

바람직하게는, n과 m 및 l은 독립적으로 0 내지 7이며, 1 ≤ n+m+l ≤ 7일 수 있다.

바람직하게는, a와 b 및 c는 2 내지 4일 수 있다.

바람직하게는, R1, R2 및 R3는 각각 독립적으로, 라우릴 (lauryl), 미리스틸 (myristyl), 팔미틸 (palmityl), 스테아릴 (stearyl), 아라키딜 (arachidyl), 베헨닐 (behenyl), 리그노세릴 (lignoceryl), 세로틸 (cerotyl), 미리스트올레일 (myristoleyl), 팔미트올레일 (palmitoleyl), 사피에닐 (sapienyl), 올레일 (oleyl), 리놀레일 (linoleyl), 아라키도닐 (arachidonyl), 에이코사펜타에닐 (eicosapentaenyl), 에루실 (erucyl), 도코사헥사에닐 (docosahexaenyl), 및 세로틸 (cerotyl)로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있다.

상기 양이온성 지질의 구체적인 예는 모노올레오일트리에틸렌테트라마이드, 디올레오일트리에틸렌테트라마이드, 트리올레오일트리에틸렌테트라마이드, 테트라올레오일트리에틸렌테트라마이드 모노리놀레오일테트라에틸렌 펜타마이드, 디리놀레오일테트라에틸렌펜타마이드, 트리리놀레오일 테트라에틸렌펜타마이드, 테트라리놀레오일테트라에틸렌펜타마이드, 펜타 리놀레오일테트라에틸렌펜타마이드, 모노미리스톨레오일디에틸렌트리 아마이드, 디미리스톨레오일디에틸렌트리아마이드, 모노올레오일펜타에틸렌 헥사마이드, 디올레오일펜타에틸렌헥사마이드, 트리올레오일펜타에틸렌 헥사마이드, 테트라올레오일펜타에틸렌헥사마이드, 펜타올레오일펜타에틸렌 헥사마이드 및 헥사올레오일펜타에틸렌헥사마이드로 구성된 그룹으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있다.

한편, 양이온성 고분자는 키토산(chitosan), 글라이콜 키토산(glycol chitosan), 프로타민(protamine), 폴리라이신(polylysine), 폴리아르기닌(polyarginine), 폴리아미도아민(PAMAM), 폴리에틸렌이민 (polyethylenimine), 덱스트란(dextran), 히알루론산(hyaluronic acid), 알부민(albumin), 고분자폴리에틸렌이민(PEI), 폴리아민 및 폴리비닐아민(PVAm)으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하며, 바람직하게는 고분자폴리에틸렌이민(PEI), 폴리아민 및 폴리비닐아민(PVA)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 것일 수 있다.

본 발명에서 사용되는 양이온성 화합물은, 최종적으로 제조되는 전체 조성물의 중량을 기준으로, 0.01 내지 50 중량%, 구체적으로는 0.1 내지 10 중량% 사용될 수 있다. 상기 양이온성 화합물의 함량이 0.01 중량% 미만이면 음이온성 약물과 복합체를 형성할 수 있는 충분한 양이 되지 못하고, 50 중량%을 초과하면, 미셀의 크기가 너무 커져 미셀의 안정성이 저하되고 필터 멸균시 손실율이 커질 우려가 있다.

상기 양이온성 화합물과 음이온성 약물은, 수상에서 정전기적 상호작용을 통해 결합하여, 복합체를 형성한다.

구체적인 일 양태로서, 상기 양이온성 화합물(N)과 음이온성 약물(P)의 전하량의 비율(N/P; 음이온성 약물의 음이온 전하에 대한 양이온성 화합물의 양이온 전하 비율)은, 0.1 내지 128이며, 구체적으로는 0.5 내지 64, 더 구체적으로는 1 내지 32이고, 보다 더 구체적으로는 1 내지 24, 가장 구체적으로는 6 내지 24인 것이 좋다. 상기 비율(N/P)이 0.1 미만인 경우에는 양이온성 화합물이 음이온성 약물과 충분히 결합하지 못하기 때문에, 상기 비율이 0.1 이상이어야 양이온성 화합물과 음이온성 약물이 정전기적 결합에 의해 충분한 양의 음이온성 약물을 포함하는 복합체를 형성할 수 있어서 유리하다. 반면, 비율(N/P)이 128 초과시에는 독성을 유발할 우려가 있으므로, 128 이하로 하는 것이 좋다.

상기 단계 (b)는 양친성 블록 공중합체와 임의로 폴리락트산염을 수성 용매 또는 유기 용매에 용해시켜 단계 (a)에서 얻어진 혼합물과 혼합하는 단계이다.

양친성 블록 공중합체와 임의로 폴리락트산염을 수성 용매에 용해시켜 혼합하는 경우 나노입자 형태의 음이온성 약물-양이온성 화합물과의 복합체를 양친성 블록 공중합체와 임의로 폴리락트산염이 형성하는 미셀 구조체 내부에 봉입하는 음이온성 약물 전달용 조성물의 제조가 수상에서 이루어지게 된다.

이때, 상기 수성 용매는 단계 (a)에서 사용된 수성 용매와 동일하다.

또한, 상기 양친성 블록 공중합체는, 친수성 A 블록 및 소수성 B 블록을 포함하는 A-B 형 블록 공중합체일 수 있다. 상기 A-B 형 블록 공중합체는, 수상에서, 소수성 B 블록이 코어(내벽)를 형성하고 친수성 A 블록이 쉘(외벽)을 형성하는 코어-쉘 타입의 고분자 미셀을 형성한다.

이와 관련하여, 상기 친수성 A 블록은 폴리알킬렌글리콜, 폴리비닐알콜, 폴리비닐피롤리돈, 폴리아크릴아미드 및 그 유도체로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있다. 보다 구체적으로, 친수성 A 블록은 모노메톡시폴리에틸렌클리콜, 모노아세톡시폴리에틸렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 폴리에틸렌과 프로필렌글리콜의 공중합체 및 폴리비닐피롤리돈으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있다. 상기 친수성 A 블록은 수평균분자량이 200 내지 50,000달톤, 보다 구체적으로는 1,000 내지 20,000달톤, 보다 더 구체적으로는 1,000 내지 5,000달톤인 것일 수 있다.

또한, 필요에 따라 친수성 A 블록의 말단에 특정 조직이나 세포에 도달할 수 있는 작용기, 리간드, 또는 세포내 전달을 촉진할 수 있는 작용기를 화학적으로 결합시켜 양친성 블록 공중합체와 임의로 폴리락트산염으로 형성된 고분자 미셀 전달체의 체내 분포를 조절하거나 상기 미셀 전달체가 세포 내로 전달되는 효율을 높일 수 있다. 상기 작용기나 리간드는 단당류, 다당류, 비타민, 펩타이드, 단백질 및 세포 표면 수용체에 대한 항체로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 작용기나 리간드는 아니사마이드(anisamide), 비타민 B9(엽산), 비타민 B12, 비타민A, 갈락토오스, 락토오스, 만노오스, 히알루론산, RGD 펩타이드, NGR 펩타이드, 트랜스페린, 트랜스페린 수용체에 대한 항체 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.

상기 소수성 B 블록은, 생체적합성 생분해성 고분자로서, 일실시예에서, 폴리에스테르, 폴리언하이드라이드, 폴리아미노산, 폴리오르소에스테르 및 폴리포스파진으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 소수성 B 블록은 폴리락타이드, 폴리글리콜라이드, 폴리카프로락톤, 폴리디옥산-2-온, 폴리락타이드와 글리콜라이드의 공중합체, 폴리락타이드와 폴리디옥산-2-온의 공중합체, 폴리락타이드와 폴리카프로락톤의 공중합체 및 폴리글리콜라이드와 폴리카프로락톤의 공중합체로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있다. 또 다른 일실시예에서, 상기 소수성 B 블록은 수평균분자량이 50 내지 50,000달톤, 보다 구체적으로는 200 내지 20,000달톤, 보다 더 구체적으로는 1,000 내지 5,000달톤인 것일 수 있다. 또한, 소수성 블록의 소수성을 증가시켜 미셀의 안정성을 향상시키기 위하여 토코페롤, 콜레스테롤, 또는 탄소수 10 내지 24개의 지방산을 소수성 블록 말단의 히드록시기에 화학적으로 결합시킬 수 있다.

상기 친수성 블록(A)과 소수성 블록(B)을 포함하는 양친성 블록 공중합체의 함량은, 조성물 전체 건조중량을 기준으로, 40 내지 99.98중량%이며, 구체적으로는 85 내지 99.8중량%, 더 구체적으로는 90 내지 99.8중량%인 것이 좋다. 상기 양친성 블록 공중합체의 함량이 40 중량% 미만이면 미셀의 크기가 너무 커져 미셀의 안정성이 저하되고 필터 멸균시 손실율이 커질 우려가 있고, 함량이 99.98 중량%를 초과하면 함입할 수 있는 음이온성 약물의 함량이 너무 적어지게 된다.

나아가, 상기 양친성 블록 공중합체에 있어서, 친수성 블록(A)과 소수성 블록(B)의 조성비는, 공중합체 중량을 기준으로, 친수성 블록(A)이 40 내지 70중량%, 구체적으로는 50 내지 60중량% 범위일 수 있다. 친수성 블록(A)의 비율이 40중량% 미만이면 고분자의 물에 대한 용해도가 낮아서 미셀을 형성하기 어렵기 때문에, 공중합체가 미셀을 형성하기에 충분한 물에 대한 용해도를 갖기 위하여 친수성 블록(A)의 비율이 40중량% 이상인 것이 좋은 한편, 70중량%를 초과하면 친수성이 너무 높아 고분자 미셀의 안정성이 낮아져서 음이온성 약물/양이온성 화합물 복합체의 가용화 조성물로 사용하기 어려우므로, 미셀 안정성을 고려하여 친수성 블록(A)의 비율이 70중량% 이하인 것이 좋다.

상기 소수성 B 블록의 말단 히드록시기는 콜레스테롤, 토코페롤, 및 탄소수

10 내지 24개의 지방산으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상으로 수식된 것일 수 있다.

또한, 폴리락트산염(예를 들어, PLANa)은 상기 양친성 블록 공중합체와 별도의 성분으로 미셀 내벽에 포함될 수 있는 것으로, 미셀의 코어(내벽)에 분포하여 코어의 소수성을 강화시켜 미셀을 안정시킴과 동시에 체내에서 세망내피계(RES)를 효과적으로 회피하는 역할을 한다. 즉, 폴리락트산염의 카르복실산 음이온이 폴리락트산보다 효과적으로 양이온성 복합체와 결합하여 고분자 미셀의 표면전위를 감소시켜 폴리락트산염을 포함하지 않는 고분자 미셀에 비해 표면전위의 양전하가 감소하여 세망내피계에 의해 덜 포획되고, 이로 인하여 목적하는 부위(예컨대, 암세포, 염증세포 등)로의 전달 효율이 우수하다는 장점이 있다.

이러한 폴리락트산염은 수평균분자량이 500 내지 50,000달톤, 구체적으로 1,000 내지 10,000달톤인 것이 좋다. 분자량이 500달톤 미만이면 소수성이 너무 낮아 미셀의 코어(내벽)에 존재하기 어렵고, 분자량이 50,000달톤을 초과하면 고분자 미셀의 입자가 커지는 문제가 있다.

상기 폴리락트산염은 양친성 블록 고분자 100 중량부에 대하여 1 내지 200중량부, 구체적으로 10 내지 100중량부, 더 구체적으로 30 내지 60중량부로 사용될 수 있다. 폴리락트산염의 함량이 양친성 블록 고분자 100 중량부 대비 200 중량부를 초과하면 미셀의 크기가 증가하여, 멸균막을 사용한 여과가 어렵게 되고, 1 중량부 미만이면 소수성을 강화하여 미셀을 안정시키고 세망내피계를 효과적으로 회피하고자 하는 목적하는 효과를 충분히 얻을 수 없다.

일 구체예에서, 음이온성 약물 1 중량부 대비 양친성 블록 공중합체를 10 내지 1,000 중량부, 폴리락트산염을 5 내지 500 중량부로 사용할 수 있다. 바람직하게는 양친성 블록 공중합체를 50 내지 800 중량부, 보다 바람직하게는 100 내지 500 중량부로 사용할 수 있다. 바람직하게는, 폴리락트산염을 10 내지 300 중량부, 보다 바람직하게는 50 내지 100 중량부로 사용할 수 있다.

바람직한 하나의 양태로서, 본 발명의 폴리락트산염은 하기 화학식 2 내지 7의 화합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 한다.

[화학식 2]

상기 식 2에서, A는 -COO-CHZ-이고; B는 -COO-CHY-, -COO-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂- 또는 -COO-CH₂CH₂OCH₂이며; R은 수소원자, 또는 아세틸, 벤조일, 데카노일, 팔미토일, 메틸, 또는 에틸기이고; Z와 Y는 각각 수소원자, 또는 메틸 또는 페닐기이며; M은 Na, K, 또는 Li이고; n은 1 내지 30의 정수이며; m은 0 내지 20의 정수이다.

[화학식 3]

상기 식 3에서, X는 메틸기이고; Y'는 수소원자 또는 페닐기이며; p는 0 내지 25의 정수이고, q는 0 내지 25의 정수이되, 단 p+q는 5 내지 25의 정수이고; R은 수소원자, 또는 아세틸, 벤조일, 데카노일, 팔미토일, 메틸 또는 에틸기이며; M은 Na, K, 또는 Li이고; Z 는 수소 원자, 메틸 또는 페닐기이다.

[화학식 4]

상기 식 4에서, W-M'는

또는

이고; PAD는 D,L-폴리락트산, D-폴리락트산, 폴리만델릭산, D,L-락트산과 글리콜산의 공중합체, D,L-락트산과 만델릭산의 공중합체, D,L-락트산과 카프로락톤의 공중합체 및 D,L-락트산과 1,4-디옥산-2-온의 공중합체로 구성된 그룹으로부터 선택되는 것이며; R은 수소원자, 또는 아세틸, 벤조일, 데카노일, 팔미토일, 메틸 또는 에틸기이고; M은 독립적으로 Na, K, 또는 Li이다.

[화학식 5]

상기 식 5에서, S는

이고; L은 -NR₁- 또는 -0-이며, 여기서 R₁은 수소원자 또는 C_1- ₁₀알킬이고; Q는 CH₃, CH₂CH₃, CH₂CH₂CH₃, CH₂CH₂CH₂CH₃, 또는 CH₂C₆H₅이고; a는 0 내지 4의 정수이며; b는 1 내지 10의 정수이고; M은 Na, K, 또는 Li이며; PAD는 D,L-폴리락트산, D-폴리락트산, 폴리만델릭산, D,L-락트산과 글리콜산의 공중합체, D,L-락트산과 만델릭산의 공중합체, D,L-락트산과 카프로락톤의 공중합체, 및 D,L-락트산과 1,4-디옥산-2-온의 공중합체로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상이다.

[화학식 6]

또는

상기 식 6에서, R'는 -PAD-O-C(O)-CH₂CH₂-C(O)-OM이고, 여기서 PAD는 D,L-폴리락트산, D-폴리락트산, 폴리만델릭산, D,L-락트산과 글리콜산의 공중합체, D,L-락트산과 만델릭산의 공중합체, D,L-락트산과 카프로락톤의 공중합체, D,L-락트산과 1,4-디옥산-2-온의 공중합체로 구성된 그룹으로부터 선택되는 것이고, M은 Na, K, 또는 Li이며; a는 1 내지 4의 정수이다.

[화학식 7]

상기 식 7에서, X 및 X'은 독립적으로 수소, 탄소수가 1~10인 알킬 또는 탄소수가 6~20인 아릴이고; Y 및 Z는 독립적으로 Na, K, 또는 Li이며; m 및 n은 독립적으로 0 내지 95의 정수이되, 5 < m + n < 100이고; a 및 b는 독립적으로 1 내지 6의 정수이며; R은 -(CH₂)_k-, 탄소수가 2~10인 2가 알케닐(divalent alkenyl), 탄소수가 6~20인 2가 아릴(divalent aryl) 또는 이들의 조합이고, 여기서 k는 0 내지 10의 정수이다.

상기 폴리락트산염은 화학식 2 또는 화학식 3의 화합물인 것인 바람직하다.

구체적인 일 양태에서, 상기 양친성 블록 공중합체는 임의로 폴리락트산염과 함께 미셀 벽을 형성하여 수용액 상에서 음이온성 약물과 양이온성 화합물 복합체를 미셀 구조 내부에 봉입시키는데, 이 때 양친성 블록 공중합체의 중량(b) 대비 음이온성 약물 및 양이온성 화합물 복합체의 중량(a) 비율[a/b X 100; (음이온성 약물 중량+양이온성 화합물 중량)/양친성 블록 공중합체 중량 X 100]은, 0.001 내지 100중량%, 구체적으로는 0.01 내지 50중량%, 보다 구체적으로는 0.1 내지 10중량%일 수 있다. 상기 중량 비율이, 0.001중량% 미만인 경우에는 음이온성 약물 및 양이온성 화합물 복합체의 함량이 지나치게 낮아져서 음이온성 약물이 효과적으로 작용할 수 있는 유효 함량을 충족시키기 어려우며, 반대로 100중량% 초과시에는 양친성 블록 공중합체의 분자량과 음이온성 약물 및 양이온성 화합물 복합체의 양을 고려할 때 적절한 크기의 미셀 구조를 형성하지 못하기 때문이다.

본 발명의 일 양태에서, (c) 단계 (b)에서 얻어진 혼합물을 0 ~ 50 ℃의 온도에서 5 ~ 60 분간 안정화하는 단계;를 추가로 포함할 수 있다. 상기 안정화는 혼합물을 가만히 또는 스터링(stirring) 하에 방치(allow to stand)함으로써 수행될 수 있다. 상기 안정화 조건은 0 내지 50℃, 보다 구체적으로는 4 내지 30℃에서 5분 내지 1시간, 보다 구체적으로는 10분 내지 30분인 것이 좋으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 5분 이하일 경우는 복합체가 안정화 되지 않고, 1시간을 초과하면 복합체의 침전이 발생하는 문제가 있다.

한편, 또 다른 하나의 추가적인 양태로서, 본 발명에 따른 음이온성 약물 전달용 조성물의 제조방법은 이하의 단계를 포함할 수 있다.

(a') 음이온성 약물과 양이온성 화합물을 각각 수성 용매에 용해시켜 혼합한 후, 동결건조하는 단계;

(b-1) 단계 (a')에서 얻어진 동결건조물을 유기 용매에 용해시키는 단계;

(b-2) 단계 (b-1)에서 얻어진 용액을 수성 용매와 혼합하는 단계; 및,

(b-3) 단계 (b-2)에서 얻어진 혼합물로부터 유기용매를 제거하는 단계.

이때, 상기 양친성 블록 공중합체와 임의로 폴리락트산염을 단계 (b-1)의 유기 용매 또는 단계 (b-2)의 수성 용매에 용해시킬 수 있다.

상기 단계 (a')에서는, 음이온성 약물과 양이온성 화합물을 각각 수성 용매에 용해시켜 혼합하여 얻어진 혼합물을 동결건조하게 된다. 단계 (a')에서 정전기적 결합에 의해 효과적으로 복합체를 형성하게 되는데, 이렇게 형성된 복합체는 동결건조를 통해 물을 제거하는 과정에서 결합력이 증가한다.

나아가, 상기 단계 (b-1)에서는 건조된 나노입자 형태의 복합체를 유기 용매상에 녹이는데, 이때 사용되는 유기 용매는 아세톤, 에탄올, 메탄올, 메틸렌 클로라이드, 클로로포름, 다이옥산, 디메틸설폭사이드, 아세토니트릴, 에틸아세테이트 및 아세트산으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 하나 이상 일 수 있다. 바람직하게는 에탄올, 다이메틸설폭사이드, 에틸아세테이트 및 아세트산으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 하나 이상일 수 있다.

상기 유기용매는 융합성 지질(fusogenic lipid)을 포함하는 것일 수 있다. 상기 융합성 지질은 디라우로일 포스파티딜에탄올아민(dilauroyl phosphatidylethanolamine), 디미리스토일 포스파티딜에탄올아민(dimyristoyl phosphatidylethanolamine), 디팔미토일 포스파티딜에탄올아민(dipalmitoyl phosphatidylethanolamine), 디스테아로일 포스파티딜에탄올아민(distearoyl phosphatidylethanolamine), 디올레오일 포스파티딜에탄올아민(dioleoyl phosphatidylethanolamine), 디리놀레오일 포스파티딜에탄올아민(dilinoleoyl phosphatidylethanolamine), 1-팔미토일-2-올레오일 포스파티딜에탄올아민(1-palmitoyl-2-oleoyl phosphatidylethanolamine), 1,2-디피타노일-3-sn-포스파티딜에탄올아민(1,2-diphytanoyl-3-sn-phosphatidylethanolamine), 디라우로일포스파티딜콜린(dilauroyl phosphatidylcholine), 디미리스토일 포스파티딜콜린(dimyristoyl phosphatidylcholine), 디팔미토일 포스파티딜콜린(dipalmitoyl phosphatidylcholine), 디스테아로일 포스파티딜콜린(distearoyl phosphatidylcholine), 디올레오일 포스파티딜콜린(dioleoyl

phosphatidylcholine), 디리놀레오일 포스파티딜콜린(dilinoleoyl phosphatidylcholine), 1-팔미토일-2-올레오일 포스파티딜콜린(1-palmitoyl-2-oleoyl phosphatidylcholine), 1,2-디피타노일-3-sn-포스파티딜콜린(1,2-diphytanoyl-3-sn-phosphatidylcholine), 디라우로일 포스파티딘산(dilauroyl phosphatidic acid), 디미리스토일 포스파티딘산(dimyristoyl phosphatidic acid), 디팔미토일 포스파티딘산(dipalmitoyl phosphatidic acid), 디스테아로일 포스파티딘산(distearoyl phosphatidic acid), 디올레오일 포스파티딘산(dioleoyl phosphatidic acid), 디리놀레오일 포스파티딘산(dilinoleoyl phosphatidic acid), 1-팔미토일-2-올레오일 포스파티딘산(1-palmitoyl-2-oleoyl phosphatidic acid), 1,2-디피타노일-3-sn-포스파티딘산(1,2-diphytanoyl-3-sn-phosphatidic acid), 콜레스테롤, 및 토코페롤로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.

상기 단계 (b-2)는 단계 (b-1)에서 얻어진 용액을 수성 용매 중에 혼합시켜 나노입자 형태의 음이온성 약물-양이온성 화합물과의 복합체를 양친성 블록 공중합체와 임의로 폴리락트산염이 형성하는 미셀 구조체 내부에 봉입시키는 단계로서, 이때 사용되는 상기 수성 용매는 증류수, 주사용수, 또는 완충액일 수 있다. 상기 수성 용매의 사용양은 특별한 한정은 없으며, 예컨대 단계 (b-1)의 유기 용매 대비 부피 기준으로 1 내지 10, 보다 구체적으로 1 내지 5 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한 상기 단계 (b-1) 또는 (b-2)에서 사용되는 상기 양친성 블록 공중합체 및 폴리락트산염은 앞서 언급한 양친성 블록 공중합체 및 폴리락트산염과 동일한 종류 및 함량을 사용할 수 있다.

나아가, 상기 단계 (b-3)에서는 상기 단계 (b-2)에서 제조된 혼합물에서 유기용매를 증발시키는 것에 의해 제거하여 고분자 미셀 수용액을 수득하게 된다.

나아가, 바람직한 하나의 양태로서, 본 발명의 제조방법은 상기 단계 (b-3) 이후에, (d) 동결건조 보조제를 가하여 동결건조 하는 공정을 더 포함할 수 있다.

또 다른 하나의 추가적인 양태로서, 본 발명의 제조방법은, 상기 단계 (d) 의 동결 건조 전에, 단계 (b-3)에서 얻은 고분자 미셀 수용액을 멸균 필터로 멸균하는 공정을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명에서 사용되는 동결건조 보조제는 동결건조된 조성물이 케이크 형태를 유지할 수 있도록 하거나, 양친성 블록 공중합체 조성물을 동결건조 후, 재건(reconstitution)하는 과정에서 빠른 시간 내에 균일하게 녹는 것을 도와주기 위해 첨가하는 것으로, 구체적으로, 락토스, 만니톨, 솔비톨 및 슈크로스로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있다. 상기 동결건조 보조제의 함량은, 동결건조 조성물 전체 건조중량을 기준으로, 1 내지 90 중량%, 더 구체적으로는 10 내지 60 중량% 이다.

이상과 같은 본 발명의 제조방법에 의하면, 음이온성 약물과 양이온성 화합물을 단일상인 수상에서 복합체를 형성시켜 정전기적 결합에 의해 나노입자 형태의 복합제가 효과적으로 형성되고, 동결건조를 통해 수용액을 제거하는 과정에서 결합력이 증가하여, 최종적으로 제조되는 고분자 미셀이 수득률이 매우 향상되게 된다. 나아가, 이러한 제조방법은 유기용매를 상대적으로 적게 사용하므로 환경친화적일뿐 아니라, 양이온성 지질이 복합체 형성 이후의 단계에서 제조기구, 용기 등에 달라 붙어 조성물 비율이 변경되는 것을 방지하여 재현성이 유지되고, 제조가 매우 편이하며, 음이온성 약물을 복합체 형성을 통해 소수성 약물 입자로 바꾸어 대량 생산이 용이하다는 특징을 갖는다.

또한, 본 발명에 따라 제조된 조성물에서는 상기 음이온성 약물과 양이온성 화합물 복합체는 상기 양친성 블록 공중합체 및 임의로 폴리락트산염에 의해 형성되는 미셀 구조체 내에 봉입된 상태를 유지하기 때문에, 혈중 또는 체액 내에서의 안정성이 향상된다.

한편, 또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 제조방법에 의해 제조된 고분자 미셀을 포함하는 음이온성 약물 전달용 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 제조방법에 따르면, 상기 음이온성 약물과 양이온성 화합물은 정전기적 상호작용을 통해 서로 결합하여, 음이온성 약물-양이온성 화합물 복합체를 형성하고, 이 복합체가 양친성 블록 고분자와 임의로 폴리락트산염에 의하여 형성된 미셀 구조 내부에 봉입된 고분자 미셀 구조체가 제조되게 된다. 이와 같이 본 발명의 일 태양에 의해 제조된 고분자 미셀 전달체의 대략적인 구조를 도 1에 나타내었다.

도 1에 나타낸 바와 같이, 양친성 블록 공중합체 및 폴리락트산염에 의해 형성되는 미셀 구조체는 수상 환경에서 양친성 블록 공중합체의 친수성 부분이 미셀의 외벽을 형성하고 양친성 블록 공중합체의 소수성 부분과 상기 양친성 블록 공중합체와 별도의 성분으로 함유된 폴리락트산염이 미셀의 내벽을 형성하고, 그 형성된 미셀의 내부에 음이온성 약물과 양이온성 화합물 복합체가 봉입된 구조이다.

상기 조성물의 구성성분인 음이온성 약물, 양이온성 화합물, 양친성 블록 고분자 및 폴리락트산염 등에 관한 사항은 상기 본 발명에 따른 제조방법에서 기재된 바와 동일하다.

바람직한 일 양태에서, 상기 조성물 중 미셀의 입자 크기는, 10 내지 200 nm이며, 더욱 구체적으로는 10 내지 100 nm인 것이 좋다. 또한, 상기 미셀 입자의 표준 전하는 -20 내지 20 mV 이며, 더욱 구체적으로 -10 내지 10 mV인 것이 좋다. 상기 입자 크기 및 표준 전하는, 미셀 구조의 안정성 및 구성성분들의 함량과 체내에서 음이온성 약물의 흡수도 및 안정성 면에서 가장 바람직하다.

본 발명에 따른 양친성 블록 공중합체 및 임의로 폴리락트산염 미셀 구조체에 봉입된 음이온 약물-양이온성 화합물 복합체 함유 조성물은, 혈관, 근육, 피하, 경구, 뼈, 경피 또는 국소 조직 등의 투여 경로를 통하여 투여될 수 있고, 이러한 투여 경로에 적합하게, 다양한 경구 또는 비경구 투여 제제로 제형화될 수 있다. 상기 경구 투여 제제로는 정제, 캡슐, 분체 제제, 액제 등, 비경구 투여 제제로는 점안제, 주사제 등 다양한 제제를 예시할 수 있는데, 바람직한 일 양태로서, 상기 조성물은 주사용 제제일 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 따른 조성물을 동결건조하는 경우, 이를 주사용 증류수, 0.9% 생리식염수 및 5% 덱스트로스 수용액 등으로 재건하여 주사용 제제 형태로 제조할 수 있다.

본 발명에 따른 제조방법은 음이온성 약물과 양이온성 화합물을 수상에서 복합체를 형성시켜 정전기적 결합에 의해 나노입자 형태의 복합체가 효과적으로 형성되고, 동결건조를 통해 수용액을 제거하는 과정에서 결합력이 증가하여, 최종적으로 제조되는 고분자 미셀의 수득률이 매우 향상되게 된다. 나아가, 이러한 제조방법은 유기용매를 상대적으로 적게 사용함으로 환경친화적일뿐 아니라, 제조가 매우 편이하며, 대량 생산이 용이하다는 특징을 갖는다. 또한, 본 발명의 제조방법에 의해 제조된 음이온성 약물 전달용 조성물은 체내에 투여하였을 경우 음이온성 약물의 혈중 혹은 체액 내 안정성을 높일 수 있으며, 특히 세망내피계를 회피하여 음이온성 약물이 세포 내로 효율적으로 전달될 수 있다는 장점이 있다.

도 1은 본 발명의 제조방법에 의해 제조된 고분자 미셀 전달체의 대략적인 구조를 도식화한 도면이다.

이하, 본 발명을 하기 실시예에 의거하여 보다 자세하게 설명하나, 이들은 본 발명을 설명하기 위한 것일 뿐 이들에 의하여 본 발명의 범위가 어떤 식으로든 제한되는 것은 아니다.

[ 비교예 1] siRNA /1,6- 디올레오일 트리에틸렌테트라미드 (dio-TETA)/mPEG-PLA-토코페롤 (2k- 1.7k ) / PLANa ( 1.7k ) 함유 조성물 제조

1,6 dioTETA 126 ㎍을 클로로포름 6.3 ㎕에 녹이고 siRNA 5 ㎍을 증류수 4 ㎕에 녹였다. PLANa (1.7k) 0.5 ㎎을 클로로포름 10 ㎕에 녹이고 mPEG-PLA-토코페롤 (2k-1.7k) 1 ㎎을 클로로포름 20 ㎕에 녹였다. 전체적으로 수층에 대한 유기층의 부피비율이 10배가 되도록 클로로포름 3.7 ㎕를 추가하였다. 상기 mPEG-PLA-토코페롤 1 ㎎을 클로로포름에 녹인 용액 중 mPEG-PLA-토코페롤 0.2 ㎎ (20 중량%)에 해당하는 양인 4 ㎕에 클로로포름 44 ㎕을 첨가하여 1-구 둥근 플라스크에 넣고 증류농축장치 (rotary evaporator)에서 감압 증류하여 용매를 제거하였다.

상기 dioTETA 용액, PLANa 용액 그리고 mPEG-PLA-토코페롤 0.8 ㎎ 용액을 섞어주고, siRNA 수용액을 한 방울씩 가하면서 초음파 분쇄기를 이용하여 유상액을 제조하였다. 유상액을 mPEG-PLA-토코페롤 0.2 ㎎이 도포된 1-구 둥근 플라스크에 넣고 증류농축장치 (rotary evaporator) 에서 감압 증류하여 용매를 제거하였다. 플라스크에 증류수 100 ㎕를 가하고, 부드럽게 흔들어 녹임으로써 siRNA/dioTETA/mPEG-PLA-토코페롤 (2k-1.7k)/PLANa 함유 조성물을 제조하였다(비교예 1).

[ 비교예 2-3] siRNA /1,6- 디올레오일 트리에틸렌테트라미드 (dio-TETA)/mPEG-PLA-토코페롤 (2k- 1.7k ) /DOPE / ( PLANa ) 함유 조성물 제조

비교예 2와 3의 경우, 비교예 1과 동일한 방법으로 조성비를 달리하여 제조하였다. siRNA 5 ㎍을 증류수 4 ㎕에 녹이고 수층 대비 유기층의 비율이 10배가 되도록 siRNA를 제외한 나머지 조성물을 클로로포름에 녹여 주었다. 비교예 2의 경우, 클로로포름에 1,6 dioTETA 94.5 ㎍을 5 ㎕에 녹이고, mPEG-PLA-토코페롤 (2k-1.7k) 1 ㎎을 20 ㎕에 녹이고, DOPE 104 ㎍을 5.2 ㎕에 녹이고 9.8 ㎕의 클로로포름을 추가하였다. 비교예 3의 경우, 클로로포름에 1,6 dioTETA 94.5 ㎍을 5 ㎕에 녹이고, mPEG-PLA-토코페롤 (2k-1.7k) 1 ㎎을 20 ㎕에 녹이고, PLANa 0.3 ㎎을 9.8 ㎕에 녹이고, DOPE 104 ㎍을 5.2 ㎕에 녹였다. 상기 mPEG-PLA-토코페롤 1 ㎎을 클로로포름에 녹인 용액 중 mPEG-PLA-토코페롤 0.2 ㎎ (20 중량%)에 해당하는 양인 4 ㎕에 클로로포름 44 ㎕을 첨가하여 1-구 둥근 플라스크에 넣고 증류농축장치 (rotary evaporator)에서 감압 증류하여 용매를 제거하였다.

상기 dioTETA 용액, mPEG-PLA-토코페롤 0.8 ㎎ 용액 그리고 (또는) PLANa 용액 또는 DOPE 용액을 섞어주고, siRNA 수용액을 한 방울씩 가하면서 초음파 분쇄기를 이용하여 유상액을 제조하였다. 유상액을 mPEG-PLA-토코페롤 0.2 ㎎이 도포된 1-구 둥근 플라스크에 넣고 증류농축장치 (rotary evaporator) 에서 감압 증류하여 용매를 제거하였다. 플라스크에 증류수 100 ㎕를 가하고, 부드럽게 흔들어 녹임으로써 siRNA/dioTETA/mPEG-PLA-토코페롤 (2k-1.7k)/DOPE 함유 조성물 (비교예 2), siRNA/dioTETA/mPEG-PLA-토코페롤 (2k-1.7k)/PLANa/DOPE 함유 조성물 (비교예 3)을 제조하였다.

	조성물	조성비	siRNA	lipid	고분자 1	고분자 2	융합 지질
비교예 1	siRNA/dioTETA/mPEG-PLA-토코페롤 (2k-1.7k)/PLANa (1.7k)	5-24-1-0.5	5 ㎍	150 ㎍	1 ㎎	0.5 ㎎	0 ㎎
비교예 2	siRNA/dioTETA/mPEG-PLA-토코페롤 (2k-1.7k)/ DOPE	5-18-1-1	5 ㎍	94.5㎍	1 ㎎	0 ㎎	104.2 ㎎
비교예 3	siRNA/dioTETA/mPEG-PLA-토코페롤 (2k-1.7k)/PLANa (1.7K)/DOPE	5-18-1-0.3-1	5 ㎍	150 ㎍	1 ㎎	0.3 ㎎	104.2 ㎎

(조성비에서 각 성분의 단위는 siRNA: ㎍, 지질: N/P 비율, 고분자: ㎎, 융합 지질: 지질 대비 몰 비율이다. 고분자 1은 mPEG-PLA-토코페롤: 고분자 2는 PLANa 를 의미한다. 이하 표에서 동일하게 적용된다.)

[ 실시예 1-2] siRNA /1,6- dioTETA /mPEG- PLA -토코페롤 (2k- 1.7k ) / PLANa (1.7k) 함유 조성물 제조 (수상에서 제형 제조)

1,6 dioTETA 는 126 ㎍ 을 252 ㎕ 의 증류수에 녹인 후 초음파 세척기에 10분간 두어 입자를 작게 해주었다. siRNA 5 ㎍ 을 증류수 4 ㎕에 녹이고, mPEG-PLA-토코페롤 (2k-1.7k) 1 ㎎과 PLANa (1.7k) 500 ㎍ 을 각각 증류수 10 ㎕, 2 ㎕에 녹였다. siRNA와 1,6 dioTETA 을 먼저 섞어 준 후, mPEG-PLA-토코페롤과 PLANa을 섞어 주었다. 부피 비율이 1:1이 될 수 있게 증류수를 첨가해주었다. siRNA, 1,6 dioTETA 혼합물과 mPEG-PLA-토코페롤, PLANa 혼합물을 초음파 분쇄 상태에서 한 방울씩 섞어주었다. 제형 안정화를 위해 10분간 4℃에서 보관 후 0.45㎛ 친수성 PVDF 필터로 여과시켜 입자가 큰 제형은 배제하였다. (실시예 1)

실시예 1에서 mPEG-PLA-토코페롤 (2k-1.7k) 500 ㎍ 과 PLANa (1.7k) 100 ㎍를 사용한 것을 실시예 2로 하였다.

	조성물	조성비	siRNA	lipid	고분자1	고분자2
실시예 1	siRNA/dioTETA/mPEG-PLA-토코페롤(2k-1.7k)/PLANa (1.7k)	5-24-1-0.5	5 ㎍	126 ㎍	1 ㎎	0.5 ㎎
실시예 2	siRNA/dioTETA/mPEG-PLA-토코페롤(2k-1.7k)/PLANa (1.7k)	5-24-0.5-0.1	5 ㎍	126 ㎍	0.5 ㎎	0.1 ㎎

[ 실시예 3] siRNA /1,6- dioTETA /mPEG- PLA -토코페롤 (2k- 1.7k )/ PLANa ( 1.7k ) 함유 조성물 제조 (수상에서 siRNA / dioTETA 나노입자 형성 후 유상액 내에서 고분자 미셀에 봉입하는 제조법)

siRNA 5 ㎍ 은 증류수 4 ㎕에 녹이고, dioTETA 126 ㎍은 126 ㎕의 증류수에 녹인 후 초음파 분쇄 상태에서 한 방울씩 섞어주었다. 이 혼합물을 동결건조 시켜 분말 상태로 만들어 준 후 PLANa 300 ㎍을 에틸 아세테이트 50 ㎕에 녹인 용액으로 분말을 녹여주었다. mPEG-PLA-토코페롤 (2k-1.7k) 1 ㎎을 증류수 100 ㎕에 녹여준 용액에 siRNA, dioTETA, PLANa 가 섞인 혼합물을 한 방울씩 가하면서 초음파 분쇄기를 이용하여 유상액을 제조하였다. 제조한 유상액을 1-구 둥근 플라스크에 넣고 증류농축장치 (rotary evaporator)에서 감압 증류함으로써 에틸 아세테이트를 선택적으로 제거하여 siRNA/1,6-디올레오일 트리에틸렌테트라아마이드(dio-TETA)/mPEG-PLA-토코페롤 (2k-1.7k) /PLANA 함유 고분자 미셀을 제조하였다.

[ 실시예 4-6] siRNA /1,6- dioTETA /mPEG- PLA -토코페롤 (2k- 1.7k )/ PLANa ( 1.7k ) 함유 조성물 제조 (수상에서 siRNA / dioTETA 나노입자 형성 후 유상액 내에서 고분자 미셀에 봉입하는 제조법)

실시예 3과 유사한 방법이나 조성물을 섞는 순서를 달리하여 siRNA/dioTETA /mPEG-PLA-토코페롤 (2k-1.7k) /PLANa (1.7k) 함유 조성물을 제조하였다. 조성물, 용매의 종류와 양, 제조 순서는 동일하되, 조성물을 어느 용매에 녹이느냐에 따라 다음과 같은 실시예로 구분된다. siRNA와 dioTETA 분말을 mPEG-PLA-토코페롤 (2k-1.7k)이 함유된 에틸 아세테이트로 녹인 후 PLANa를 녹인 증류수로 복합 유상액을 제조하거나 (실시예 4), 분말을 에틸 아세테이트로 녹인 후 mPEG-PLA-토코페롤 (2k-1.7k) 과 PLANa 가 녹여진 증류수로 복합 유상액을 제조하였다 (실시예 5). 또한 분말을 mPEG-PLA-토코페롤 (2k-1.7k)과 PLANa가 함유된 에틸 아세테이트로 녹인 후 증류수로 복합 유상액을 제조하였다 (실시예 6).

	조성물	조성비	siRNA	lipid	고분자1	고분자2
실시예 3-6	siRNA/dioTETA/mPEG-PLA-토코페롤(2k-1.7k)/PLANa (1.7k)	5-24-1-0.3	5 ㎍	126 ㎍	1 ㎎	0.3 ㎎

[ 실시예 7-12] siRNA /1,6- dioTETA /mPEG- PLA -토코페롤 (2k- 1.7k )/ PLANa (1.7k) 함유 조성물 제조 (수상에서 siRNA / dioTETA 나노입자 형성 후 유상액 내에서 고분자 미셀에 봉입하는 제조법)

실시예 3과 동일한 방법으로 조성을 달리 하여 siRNA/dioTETA/ mPEG-PLA-토코페롤 (2k-1.7k)/PLANa (1.7k) 함유 조성물을 제조하였다.

실시예 7 내지 12에서 얻어진 조성물은 아래의 표 4에 정리하였다:

	조성물	조성비	siRNA	lipid	고분자1	고분자2
실시예 7	siRNA/dioTETA/mPEG-PLA-토코페롤(2k-1.7k)/PLANa (1.7k)	5-24-2-0.3	5 ㎍	126 ㎍	2 ㎎	0.3 ㎎
실시예 8	siRNA/dioTETA/mPEG-PLA-토코페롤(2k-1.7k)/PLANa (1.7k)	5-24-0.5-0.3	5 ㎍	126 ㎍	0.5 ㎎	0.3 ㎎
실시예 9	siRNA/dioTETA/mPEG-PLA-토코페롤(2k-1.7k)/PLANa (1.7k)	5-18-1-0.1	5 ㎍	95 ㎍	1 ㎎	0.1 ㎎
실시예 10	siRNA/dioTETA/mPEG-PLA-토코페롤(2k-1.7k)/PLANa (1.7k)	5-18-0.5-0.1	5 ㎍	95 ㎍	0.5 ㎎	0.1 ㎎
실시예 11	siRNA/dioTETA/mPEG-PLA-토코페롤(2k-1.7k)/PLANa (1.7k)	5-12-1-0.05	5 ㎍	63 ㎍	1 ㎎	0.05 ㎎
실시예 12	siRNA/dioTETA/mPEG-PLA-토코페롤(2k-1.7k)/PLANa (1.7k)	5-12-0.5-0.05	5 ㎍	63 ㎍	0.5 ㎎	0.05 ㎎

[ 실시예 13-14] siRNA /1,6- dioTETA /mPEG- PLA -토코페롤 (2k- 1.7k )/DOPE 함유 조성물 제조 (수상에서 siRNA / dioTETA 나노입자 형성 후 유상액 내에서 고분자 나노 입자에 봉입하는 제조법)

실시예 6과 동일한 방법으로 조성을 달리 하여 siRNA/dioTETA/ mPEG-PLA-토코페롤 (2k-1.7k)/DOPE 함유 조성물을 제조하였다.

실시예 13 내지 14에서 얻어진 조성물은 아래의 표 5에 정리하였다:

	조성물	조성비	siRNA	lipid	고분자1	융합 lipid
실시예 13	siRNA/dioTETA/mPEG-PLA-토코페롤(2k-1.7k)/DOPE	5-18-1-0.5	5 ㎍	95 ㎍	1 ㎎	52 ㎍
실시예 14	siRNA/dioTETA/mPEG-PLA-토코페롤(2k-1.7k)/DOPE	5-18-1-1	5 ㎍	95 ㎍	1 ㎎	104 ㎍

[ 실시예 15-16] siRNA /1,6- dioTETA /mPEG- PLA -토코페롤 (2k- 1.7k )/ PLANa (1.7K)/DOPE 함유 조성물 제조 (수상에서 siRNA / dioTETA 나노입자 형성 후 유상액 내에서 고분자 나노 입자에 봉입하는 제조법)

실시예 6과 동일한 방법으로 조성을 달리 하여 siRNA/dioTETA/ mPEG-PLA-토코페롤 (2k-1.7k)/PLANa (1.7K)/DOPE 함유 조성물을 제조하였다.

실시예 15 내지 16에서 얻어진 조성물은 아래의 표 6에 정리하였다:

	조성물	조성비	siRNA	lipid	고분자1	고분자2	융합 lipid
실시예 15	siRNA/dioTETA/mPEG-PLA-토코페롤(2k-1.7k)/PLANa(1.7k)/DOPE	5-18-1-0.1_1	5 ㎍	95 ㎍	1 ㎎	0.1 ㎎	104 ㎍
실시예 16	siRNA/dioTETA/mPEG-PLA-토코페롤(2k-1.7k)/PLANa(1.7k)/DOPE	5-18-1-0.3_1	5 ㎍	95 ㎍	1 ㎎	0.3 ㎎	104 ㎍

[ 실험예 1] 제법에 따른 고분자 미셀의 siRNA 함량 비교

각 제조법 및 조성에 따라 나노 입자의 수득률이 어떻게 변화하는지 확인하기 위하여 siRNA 함량을 정량하였다.

변형된 Bligh & Dyer 추출법을 사용하여 제조된 고분자 미셀에서 siRNA양을 정량 하였다. 고분자 미셀을 50mM 소듐 포스페이트 (sodium phosphate), 75mM NaCl (pH 7.5) 용액에 녹이고, Bligh & Dyer 단일상을 만든 뒤, 100mM 소듐 포스페이트, 150mM NaCl (pH 7.5) 및 클로로포름으로 추출하여 수용액 층의 siRNA를 리보그린(Ribogreen) 시약(Invitrogen)으로 정량 하였다.

수상에서 제형 제조 및 수상에서 siRNA/dioTETA 나노입자 형성 후 고분자 미셀에 봉입하는 제조법에 따른 siRNA/dioTETA/mPEG-PLA-토코페롤(2k-1.7k)/PLANa (1.7k) 고분자 미셀의 siRNA 함량을 아래의 표 7에 나타내었다.

	제법	조성비	siRNA 함량 (%)
비교예 1	수혼화 용매 이용	5-24-1-0.5	42
실시예 1	수상제조	5-24-1-0.5	72
실시예 2	수상제조	5-24-0.5-0.1	82
실시예 3	수상에서 siRNA/dioTETA 나노입자 형성 후 유상액 내에서 고분자 미셀에 봉입하는 제조법	5-24-1-0.3	63
실시예 4		5-24-1-0.3	61
실시예 5		5-24-1-0.3	71
실시예 6		5-24-1-0.3	60

수상에서 siRNA/dioTETA 나노입자 형성 후 유상액 내에서 고분자 미셀에 봉입하는 제조법에서 조성을 달리한 실시예 7-12의 siRNA 함량을 아래의 표 8에 나타내었다.

	조성물	조성비	siRNA 함량 (%)
실시예 7	siRNA/dioTETA/mPEG-PLA-토코페롤(2k-1.7k)/PLANa (1.7k)	5-24-2-0.3	70
실시예 8		5-24-0.5-0.3	69
실시예 9		5-18-1-0.1	50
실시예 10		5-18-0.5-0.1	54
실시예 11		5-12-1-0.02	42
실시예 12		5-12-0.5-0.02	44

수상에서 siRNA/dioTETA 나노입자 형성 후 유상액 내에서 고분자 나노 입자에 봉입하는 제조법에서 조성을 달리한 실시예 13-16의 siRNA 함량을 아래의 표 9에 나타내었다.

	조성물	조성비	siRNA 함량 (%)
비교예 2	siRNA/dioTETA/mPEG-PLA-토코페롤(2k-1.7k)/DOPE	8-18-1-1	52
실시예 13		5-18-1-0.5	62
실시예 14		5-18-1-1	67
비교예 3	siRNA/dioTETA/mPEG-PLA-토코페롤(2k-1.7k)/PLANa (1.7K)/DOPE	5-18-1-0.3-1	60
실시예 15		5-18-1-0.1-1	85
실시예 16		5-18-1-0.3-1	89

표 7, 8 및 9 에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 제조방법에 따라 제조된 실시예 1-16의 조성물 중 siRNA 함량은 비교예 대비 현저하게 우수함을 알 수 있다. 이러한 결과는 수상에서 siRNA/dioTETA의 나노입자를 형성하는 제조방법이 siRNA와 양이온성 지질간의 효율적인 결합을 증가시킴으로써 효율적으로 siRNA를 미셀 안에 봉입시켜줌을 알 수 있다.

[ 비교예 4] siRNA /1,6- dioTETA /mPEG- PLA -토코페롤 (2k- 1.7k ) 함유 조성물 제조 (복합 유상액 제조법)

dioTETA 126 ㎍을 클로로포름에 녹이고 siRNA 5 ㎍을 증류수에 녹였다. mPEG-PLA-토코페롤 (2k-1.7k) 1 ㎎을 클로로포름에 녹였다. dioTETA와 mPEG-PLA-토코페롤을 섞어주고, siRNA를 한 방울씩 가하면서 초음파 분쇄기를 이용하여 유상액을 제조하였다. 유상액을 증류수에 가하면서 초음파 분쇄기를 이용하여 복합 유상액을 제조하였다. 복합 유상액을 1-구 둥근 플라스크에 넣고 증류농축장치(rotary evaporator)에서 감압 증류함으로써 클로로포름을 제거하여 siRNA/dioTETA/mPEG-PLA-토코페롤 (2k-1.7k) 함유 조성물을 제조하였다.

	조성물	조성비	siRNA	lipid	고분자
비교예 4	siRNA/1,6-dioTETA/mPEG-PLA-토코페롤 (2k-1.7k)	5-24-1	5 ㎍	126 ㎍	1 ㎎

[ 실시예 17] siRNA /1,6- dioTETA /mPEG- PLA -토코페롤 (2k- 1.7k ) 함유 조성물 제조 (수상에서 siRNA / dioTETA 나노입자 형성 후 유상액 내에서 고분자 미셀에 봉입하는 제조법)

siRNA 5 ㎍ 은 증류수 4 ㎕에 녹이고, dioTETA 126 ㎍ 은 126 ㎕ 의 증류수에 녹인 후 초음파 분쇄 상태에서 한 방울씩 섞어주었다. 이 혼합물을 동결건조 시켜 분말 상태로 만들어 준 후 에틸 아세테이트 50 ㎕ 로 분말을 녹여 주었다. mPEG-PLA-토코페롤 (2k-1.7k) 1 ㎎ 을 증류수 100 ㎕에 녹여준 용액에 siRNA, dioTETA, PLANa 가 섞인 혼합물을 한 방울씩 가하면서 초음파 분쇄기를 이용하여 유상액을 제조하였다. 제조한 유상액을 1-구 둥근 플라스크에 넣고 증류농축장치 (rotary evaporator)에서 감압 증류함으로써 에틸 아세테이트를 선택적으로 제거하여 siRNA/1,6-디올레오일 트리에틸렌테트라아마이드(dio-TETA)/mPEG-PLA-토코페롤 (2k-1.7k) 함유 고분자 미셀을 제조하였다.

	조성물	조성비	siRNA	lipid	고분자1
실시예 17	siRNA/dioTETA/mPEG-PLA-토코페롤(2k-1.7k)	5-24-1	5 ㎍	126 ㎍	1 ㎎

[ 실험예 2] siRNA /1,6- dioTETA /mPEG- PLA -토코페롤 (2k- 1.7k ) 고분자 미셀의 제법에 따른 siRNA 함량 비교

각 제조법에 따라 나노 입자의 수득률이 어떻게 변화하는지 확인하기 위하여 siRNA 함량을 정량하였다.

변형된 Bligh & Dyer 추출법을 사용하여 제조된 siRNA/dioTETA/mPEG-PLA-토코페롤 (2k-1.7k) 함유 고분자 미셀에서 siRNA양을 정량 하였다. 고분자 미셀을 50mM 소듐 포스페이트 (sodium phosphate), 75mM NaCl (pH 7.5) 용액에 녹이고, Bligh & Dyer 단일상을 만든 뒤, 100mM 소듐 포스페이트, 150mM NaCl (pH 7.5) 및 클로로포름으로 추출하여 수용액 층의 siRNA를 리보그린(Ribogreen) 시약(Invitrogen)으로 정량 하였다.

비교예 4와 실험예 17의 미셀 내에 봉입된 siRNA 함량 비교 결과는 아래 표 12에 나타내었다.

	제법	조성비	siRNA 함량 (%)
비교예 4	복합 유상액 제조	5-24-1	50
실시예 17	수상에서 siRNA/dioTETA 나노입자 형성 후 유상액 내에서 고분자 미셀에 봉입하는 제조법	5-24-1	72

표 12 에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 제조방법에 따라 제조된 실시예 17의 siRNA 함량은 비교예 대비 현저하게 우수함을 알 수 있다.

[ 실험예 3] 고분자 미셀의 안정성 비교 (헤파린 경쟁분석법)

각 제조법 및 조성에 따른 in vitro 안정성을 살펴보기 위해 헤파린 경쟁분석법을 실시하였다. 제형 10 ㎕ (siRNA 300 ng)에 헤파린 40 ㎍을 처리하여 10분간 상온에 반응시킨 후 전기영동을 통해 와해된 siRNA을 측량하였다. siRNA 와해도가 낮을수록 안정성이 우수한 제형이며 조성비에 따른 안정성 비교는 아래의 표 13에 나타내었다.

	제법	조성비	siRNA 와해도(%)
비교예 1	수혼화 용매 이용	5-24-1-0.5	43
실시예 1	수상제조	5-24-1-0.5	25
실시예 2	수상제조	5-24-0.5-0.1	15
실시예 3	수상에서 siRNA/dioTETA 나노입자 형성 후 유상액 내에서 고분자 미셀에 봉입하는 제조법	5-24-1-0.3	9
실시예 4		5-24-1-0.3	9
실시예 5		5-24-1-0.3	13
실시예 6		5-24-1-0.3	13
실시예 7		5-24-2-0.3	27
실시예 8		5-24-0.5-0.3	2
실시예 9		5-18-1-0.1	38

또한, 수상에서 siRNA/dioTETA 나노입자 형성 후 유상액 내에서 고분자 나노 입자에 봉입하는 제조법에서 조성을 달리한 실시예 13-16의 안정성 비교는 아래의 표 14에 나타내었다.

	조성물	조성비	siRNA 와해도(%)
비교예 2	siRNA/dioTETA/mPEG-PLA-토코페롤(2k-1.7k)/DOPE	8-18-1-1	46
실시예 13		5-18-1-0.5	22
실시예 14		5-18-1-1	12
비교예 3	siRNA/dioTETA/mPEG-PLA-토코페롤(2k-1.7k)/PLANa (1.7K)/DOPE	5-18-1-0.3-1	32
실시예 15		5-18-1-0.1-1	9
실시예 16		5-18-1-0.3-1	8

표 13과 14는 고분자 미셀 전달체의 헤파린 경쟁을 통한 안정성 비교 결과를 나타낸 것이다. 수상제조 또는 수상에서 siRNA/dioTETA 나노입자를 형성 한 후 유상액 내에서 고분자 미셀에 봉입하는 본 발명에 따른 제조법을 통해 통해 제조된 전달체의 경우 헤파린에 의한 와해도가 낮음을 알 수 있다. 이러한 결과는 siRNA 가 고분자 미셀안에 안정적으로 봉입되어 혈중 또는 체내에서도 안정성이 유지 될 수 있음을 나타낸다.

[ 실험예 4] 제법에 따른 고분자 미셀 제조 재현성 비교

특정 조성비와 제법을 선정하여 siRNA 기준 200㎍ 스케일로 제형을 제조하였다. 동일한 실험을 3회 반복함으로써 제형의 제조 재현성을 siRNA 함량(수득률)을 기준으로 비교하였다.

제법에 따른 제조 재현성은 비교예 1과 실시예 3, 7을 비교 하였고, 결과는 아래 표 15에 나타내었다.

	1차 함량 (%)	2차 함량 (%)	3차 함량 (%)	CV (%)
비교예 1	25	42	10	16
실시예 3	55	63	58	4
실시예 7	70	75	79	4

(CV: Coefficient of Variation)

[ 실험예 5] 제법에 따른 고분자 미셀 제조양 증가에 따른 siRNA 함량(수득률) 비교

특정 조성비와 제법을 선정하여 siRNA 기준 200 ㎍, 500 ㎍, 1000 ㎍ 스케일로 제형을 제조하였다. 동일한 실험을 2회 반복함으로써 제조양 증가에 따른 수득률을 비교해보았다.

제조양 증가에 따른 수득률은 비교예 1과 실시예 7을 비교하였고, 결과는 아래 표 16에 나타내었다.

	200 ㎍ 시 함량(%)	500 ㎍ 시 함량(%)	1000 ㎍ 시 함량(%)
비교예 1	25	12	5
실시예 7	78	81	85

[ 실험예 6] 고분자 미셀의 혈중 농도 분석

제조된 제형을 동물에 투여하고 투여 0.5시간, 6시간 후에 채혈을 하여 RT (Reverse Transcription)과 qRT-PCR (quantitative Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction) 방법을 이용해 아래와 같은 방법으로 미셀의 혈중 농도를 분석한다.

제형을 1㎎/㎏로 Balb/c 마우스에 정맥주사하여 0.5시간, 6시간 후에 각각 채혈한다. 혈액을 13000 rpm, 4℃에서 15분간 원심분리기를 돌려 상층 부분만 새 튜브에 모으고, 스탠다드용 제형의 농도는 4 μM에서 0.00256 μM까지 총 11개의 농도로 PBS에 희석하여 준비한다. PCR용 96웰 플레이트에 스탠다드용으로 희석한 제형을 1 ㎕ 넣고 9 ㎕의 Balb/c 마우스 혈청과 90 ㎕의 0.25% triton X-100을 넣어준다. 실험군 혈액 샘플 10 ㎕에 90 ㎕의 0.25% Triton X-100 를 넣어준 후 전달체를 풀어주는 전처리 단계를 거친다. 제형이 풀어짐으로써 노출된 siRNA를 역전사 (RT) 단계를 거쳐 cDNA로 합성하고 합성된 cDNA를 이용하여 qRT-PCR (Bio-Rad CFX96 Real-Time System) 을 수행하였다. 분석은 Bio-Rad CFX Manager 프로그램을 이용하여 분석하였다.

	혈중 농도 (ng/mL)
	0.5 시간	6 시간
비교예 1	11650	5563
실시예 3	14362	7701
실시예 7	17410	8042
실시예 14	12033	6462
실시예 16	13250	8634

Claims

(a) 음이온성 약물과 양이온성 지질을 각각 수성 용매에 용해시켜 혼합하는 단계: 및,
(b) 양친성 블록 공중합체를 수성 용매 또는 유기 용매에 용해시켜 단계 (a)에서 얻어진 혼합물과 혼합하는 단계;
를 포함하고,
상기 음이온성 약물은 DNA 또는 RNA이며,
상기 양이온성 지질은 하기 화학식 1의 양이온성 지질이고
상기 양친성 블록 공중합체는 친수성 블록(A) 및 소수성 블록(B)를 포함하는 A-B형 블록 공중합체이며, 상기 친수성 A 블록은 폴리에틸렌글리콜 또는 모노메톡시폴리에틸렌글리콜이며, 상기 소수성 B 블록은 폴리락타이드, 폴리글리콜라이드 또는 이들의 공중합체인, 음이온성 약물 전달용 조성물의 제조방법:
[화학식 1]

상기 식에서,
n과 m 및 l은 각각 0 내지 12이되, 1 ≤ n + m + l ≤ 12이며, a와 b 및 c는 각각 1 내지 6이며, R1, R2 및 R3는 각각 독립적으로 수소 또는 탄소수 11 내지 25개의 포화 또는 불포화 탄화수소로서, R1, R2 및 R3 중 적어도 하나는 탄소수 11 내지 25개의 포화 또는 불포화 탄화수소이다.
제1항에 있어서, 단계 (b)에서 추가로 화학식 2의 폴리락트산염을 수성 용매 또는 유기용매에 용해시켜 단계 (a) 에서 얻어진 혼합물과 혼합하는, 제조방법:
[화학식 2]

상기 식 2에서, A는 -COO-CHZ-이고; B는 -COO-CHY-, -COO-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂- 또는 -COO-CH₂CH₂OCH₂-이며; R은 수소원자, 또는 아세틸, 벤조일, 데카노일, 팔미토일, 메틸, 또는 에틸기이고; Z와 Y는 각각 수소원자, 또는 메틸 또는 페닐기이며; M은 Na, K, 또는 Li이고; n은 1 내지 30의 정수이며; m은 0 내지 20의 정수이다.
제1항에 있어서,
(c) 단계 (b)에서 얻어진 혼합물을 0 ~ 50 ℃의 온도에서 5 ~ 60 분간 안정화하는 단계;
를 추가로 포함하는, 제조방법.
제1항에 있어서,
(a') 음이온성 약물과 양이온성 지질을 각각 수성 용매에 용해시켜 혼합한 후, 동결건조하는 단계;
(b-1) 단계 (a')에서 얻어진 동결건조물을 유기 용매에 용해시키는 단계;
(b-2) 단계 (b-1)에서 얻어진 용액을 수성 용매와 혼합하는 단계; 및,
(b-3) 단계 (b-2)에서 얻어진 혼합물로부터 유기용매를 제거하는 단계:
를 포함하고,
양친성 블록 공중합체를 단계 (b-1)의 유기 용매 또는 단계 (b-2)의 수성 용매에 용해시키는 것인, 제조방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 단계 (a)에서 음이온성 약물이 용해된 수용액에 대한 양이온성 화합물이 용해된 수용액의 부피비(양이온성 화합물 수용액/음이온성 약물 수용액)가 1 내지 20인, 제조방법.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 RNA는 siRNA(short interfering RNA)인 것을 특징으로 하는, 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 음이온성 약물은 하나 이상의 말단이 콜레스테롤, 토코페롤, 및 탄소수 10 내지 24개의 지방산으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상으로 수식된 것을 특징으로 하는, 제조방법.
삭제
삭제
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단계 (b)의 유기 용매는 아세톤, 에탄올, 메탄올, 메틸렌 클로라이드, 클로로포름, 다이옥산, 디메틸설폭사이드, 아세토니트릴, 에틸아세테이트 및 아세트산으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 제조방법.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 친수성 A 블록은 모노메톡시폴리에틸렌글리콜이며, 상기 소수성 B 블록은 폴리락타이드인 것을 특징으로 하는, 제조방법.
삭제
제1항에 있어서,
상기 소수성 B 블록의 말단 히드록시기는 콜레스테롤, 토코페롤, 및 탄소수
10 내지 24개의 지방산으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상으로 수식된 것인, 제조방법.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 유기용매가 포스파티딜에탄올아민 또는 하나 또는 2 개의 C10-24 지방산과 결합된 포스파티딜에탄올아민인 융합성 지질(fusogenic lipid)을 포함하는 것인, 제조방법.
제14항에 있어서, 상기 융합성 지질은 디라우로일 포스파티딜에탄올아민(dilauroyl phosphatidylethanolamine), 디미리스토일 포스파티딜에탄올아민(dimyristoyl phosphatidylethanolamine), 디팔미토일 포스파티딜에탄올아민(dipalmitoyl phosphatidylethanolamine), 디스테아로일 포스파티딜에탄올아민(distearoyl phosphatidylethanolamine), 디올레오일 포스파티딜에탄올아민(dioleoyl phosphatidylethanolamine), 디리놀레오일 포스파티딜에탄올아민(dilinoleoyl phosphatidylethanolamine), 1-팔미토일-2-올레오일 포스파티딜에탄올아민(1-palmitoyl-2-oleoyl phosphatidylethanolamine), 및 1,2-디피타노일-3-sn-포스파티딜에탄올아민(1,2-diphytanoyl-3-sn-phosphatidylethanolamine)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인, 제조방법.