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KR101823405B1 - 신규한 실로스타졸 염 화합물 및 이의 용도 - Google Patents

신규한 실로스타졸 염 화합물 및 이의 용도 Download PDF

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KR101823405B1
KR101823405B1 KR1020160056472A KR20160056472A KR101823405B1 KR 101823405 B1 KR101823405 B1 KR 101823405B1 KR 1020160056472 A KR1020160056472 A KR 1020160056472A KR 20160056472 A KR20160056472 A KR 20160056472A KR 101823405 B1 KR101823405 B1 KR 101823405B1
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cilostazol
mesylate
cilostazolyl
free base
acetate
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배수경
오의철
서재홍
박정배
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가톨릭대학교 산학협력단
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Abstract

본 발명은 경구 흡수율이 증가된 신규한 실로스타졸 화합물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 약 염기성 약물인 실로스타졸에 메실레이트(pKa, -1.2) 및 베실레이트(pKa, 0.7)와 같은 산을 첨가하여 합성한 실로스타졸 메실레이트 및 실로스타졸 베실레이트는 습도 및 광 노출에도 안정성하였으며, 경구 투여 후 생체 내 용해율 및 생체이용율의 향상이 확인됨에 따라, 상기 실로스타졸 메실레이트 및 실로스타졸 베실레이트 화합물은 종래의 실로스타졸의 낮은 용해율 및 용출 속도 문제를 개선하여 경구 흡수율이 향상된 경구용 제제로 사용될 수 있다.

Description

신규한 실로스타졸 염 화합물 및 이의 용도{Novel cilostazol salt compound and use thereof}
본 발명은 경구 흡수율이 증가된 신규한 실로스타졸 염 화합물에 관한 것이다.
퀴놀리논(quinolinone)계열 물질인 실로스타졸(6-[4-(Cyclohexyl-1H-tetrazol-5-yl)butoxy]-3,4-dihydro-2(1H)-quinolinone]은 포스포디에스테라제 타입(phosphodiesterase type) Ⅲ을 저해함으로써 혈소판 응집을 억제하고 혈관을 확장시킴으로써 혈액 응고 억제, 중추혈액순환 개선, 항염, 항궤양, 혈압강하, 천식 및 뇌경색을 예방 또는 치료하며, 뇌 순환 개선 등의 작용을 하는 것으로 알려져있다.
이러한 실로스타졸은 약염기 분자(pKa, 11.8)로, 메탄올 및 에탄올에서 낮은 용해율을 나타내지만 물에서는 용해되지 않는 난용성 약물로서 위장관 내 흡수율이 매우 낮고, 가변적이며, 안정성이 매우 낮아 약리적 효과가 제한적이다.
또한, 주로 위장관 상부에서 흡수되며 장관 하부로 갈수록 흡수가 감소하는 특징이 있으며, 이로 인하여 서방성 제제로 제형화될 경우 흡수시간의 제약이 있으므로 현재 시판되는 실로스타졸 제제는 모두 속방성 정제 형태임에 따라, 시판되는 실로스타졸 제제는 경구투여시 혈중 약물 농도의 빠른 상승을 유발하여 두통 등의 부작용을 일으키며, 지속적인 약리활성을 유지하기 위해서는 50~100mg 제제를 1일 2회씩 복용해야 하는 불편함이 있다.
따라서, 상기 실로스타졸의 부작용을 해결하고, 경구 흡수율 및 생체 이용율을 개선하기 위해 낮은 용해도 또는 용출 속도를 해결할 수 있는 다양한 연구가 진행되고 있다.
한국공개특허 제2006-0116422호(2006.11.15 공개)
본 발명은 실로스타졸의 낮은 용해율 및 용출 속도를 개선하여 경구 흡수율을 향상시킨 신규한 실로스타졸 염 화합물을 제공하고자 한다.
본 발명은 하기 화학식 1로 표시된 실로스타졸 메실레이트(cilostazol mesylate) 화합물을 제공한다.
[화학식 1]
Figure 112016043993784-pat00001
본 발명은 상기 실로스타졸 메실레이트 화합물을 유효성분으로 함유하는 경구투여용 제제를 제공한다.
본 발명은 하기 화학식 2로 표시된 실로스타졸 베실레이트(cilostazol besylate) 화합물을 제공한다.
[화학식 2]
Figure 112016043993784-pat00002
또한, 본 발명은 상기 실로스타졸 베실레이트 화합물을 유효성분으로 함유하는 경구투여용 제제를 제공한다.
본 발명에 따르면, 실로스타졸 메실레이트 및 실로스타졸 베실레이트는 습도 및 광 노출에도 안정성하였으며, 경구 투여 후 생체 내에서 향상된 용해율 및 생체이용율을 나타냄에 따라, 종래의 실로스타졸의 낮은 용해율 및 용출 속도 문제 개선을 위한 대체 화합물로 실로스타졸 메실레이트 및 실로스타졸 베실레이트 화합물을 사용할 경우, 경구 흡수율이 향상된 경구용 제제를 제공할 수 있다.
도 1은 각 실로스타졸 염의 화학 구조로, 도 1A는 실로스타졸이며, 도 1B는 실로스타졸 메실레이트이며, 도 1C는 실로스타졸 베실레이트이다.
도 2는 각 실로스타졸 염의 1H NMR 결과로, 도 1A는 실로스타졸의 1H NMR 스펙트럼이며, 도 1B는 실로스타졸 메실레이트의 1H NMR 스펙트럼, 도 1C는 실로스타졸 베실레이트의 1H NMR 스펙트럼이다.
도 3은 각 pH 조건에서 각 실로스타졸 염의 용해율을 확인한 결과로, 도 1A는 pH 1.2 조건에서 확인한 실로스타졸 유리 염기(cilostazol-free base), 실로스타졸 메실레이트(cilostazol mesylate) 및 실로스타졸 베실레이트(cilostazol besylate) 용해율 프로파일 결과이며, 도 1B는 pH 4.5 조건에서 확인한 로스타졸 유리 염기(cilostazol-free base), 실로스타졸 메실레이트(cilostazol mesylate) 및 실로스타졸 베실레이트(cilostazol besylate) 용해율 프로파일 결과이며, 도 1C는 pH 6.8 조건에서 실로스타졸 유리 염기(cilostazol-free base), 실로스타졸 메실레이트(cilostazol mesylate) 및 실로스타졸 베실레이트(cilostazol besylate) 용해율 프로파일 결과이다.
도 4는 실로스타졸 유리 염기(cilostazol-free base), 실로스타졸 메실레이트(cilostazol mesylate) 및 실로스타졸 베실레이트(cilostazol besylate)를 20 mg/kg 용량으로 랫에 경구 투여 후 혈장 내 각 실로스타졸 농도를 확인한 결과이다.
본 발명은 하기 화학식 1로 표시된 실로스타졸 메실레이트 화합물을 제공한다.
[화학식 1]
Figure 112016043993784-pat00003
상기 실로스타졸 메실레이트는 실로스타졸 유리 염기와 메실레이트의 산 첨가 반응을 통하여 합성될 수 있다.
상기 실로스타졸 메실레이트는 pH 1.2, pH 4.5 및 pH 6.8 조건에서 각각 85 내지 100%, 20 내지 35% 및 11 내지 20% 용출률을 나타낼 수 있다.
본 발명은 상기 화학식 1의 화합물을 유효성분으로 함유하는 경구투여용 제제를 제공할 수 있다.
또한, 본 발명은 하기 화학식 2로 표시된 실로스타졸 베실레이트 화합물을 제공할 수 있다.
[화학식 2]
Figure 112016043993784-pat00004
상기 실로스타졸 베실레이트는 실로스타졸 유리 염기와 베실레이트의 산 첨가 반응을 통하여 합성될 수 있다.
상기 실로스타졸 베실레이트는 pH 1.2, pH 4.5 및 pH 6.8 조건에서 각각 93 내지 100%, 20 내지 32% 및 10 내지 15% 용출률을 나타낼 수 있다.
본 발명은 상기 화학식 2의 화합물을 유효성분으로 함유하는 경구투여용 제제를 제공할 수 있다.
본 발명의 일실시예에 따르면, HCl 버퍼(pH 1.2), 아세테이트 버퍼(pH 4.5) 및 인산 완충액(pH 6.8)으로 위장관 조건을 모방하여 실로스타졸 유리 염기, 실로스타졸 메실레이트 및 실로스타졸 베실레이트를 생체 외(In vitro) 용출효과를 확인한 결과, 도 3과 같이 실로스타졸 유리 염기의 경우, pH 1.2, 4.5, 및 6.8의 조건에서 6시간 누적된 약물 용출 백분율이 각각 25.4%±3.56%, 8.54%±1.89%, 및 2.74%±0.341%인 것으로 나타났다.
반면, 상기 동일한 시간 조건으로 pH 4.5 버퍼에서 실로스타졸 메실레이트 및 실로스타졸 베실레이트의 용해율은 각각 25.6%±4.57% 및 26.6%±4.54%로 나타났으며, pH 6.8 버퍼에서는 각각 13.0%±2.07% 및 12.1%±1.65%의 용출률을 나타내었다.
상기 결과로부터 실로스타졸 메실레이트 및 실로스타졸 베실레이트 모두 1.2-6.8 pH 범위에서 용출 속도 및 약물 방출 정도가 매우 증가되었으며, 실로스타졸 염의 용해 후 각 테스트 버퍼의 pH 값이 변화되지 않은 것을 확인할 수 있었다.
따라서, 상기 두 실로스타졸의 용출 속도 및 약물 방출 수준은 실로스타졸 유리 염기보다 유의하게 개선된 것이 확인됨에 따라, 상기 두 실로스타졸 염은 위뿐만 아니라 장에서도 향상된 생체이용률을 나타낼 수 있다.
또한, 두 실로스타졸 염의 상대적인 생물학적 이용 가능성(bioavailabilities; F)을 확인하기 위해, 랫에 실로스타졸 유리 염기, 실로스타졸 메실레이트 및 실로스타졸 베실레이트를 경구 투여 후 실로스타졸의 혈장 내 농도-시간 프로파일을 확인하였다.
그 결과 도 4와 같이 실로스타졸 메실레이트 및 실로스타졸 베실레이트가 처리된 실험군의 혈장 내 실로스타졸 농도는 모든 관찰 시간에서 실로스타졸 유리 염기가 처리된 실험군보다 매우 높게 나타났다(P < 0.05).
또한, 표 2와 같이 실로스타졸 메실레이트 및 실로스타졸 베실레이트가 처리된 실험군에서는 실로스타졸 유리 염기가 처리된 실험군보다 매우 빠른 경구 흡수율 및 짧은 Tmax 값이 나타났으며, 모든 실험 결과에서 실로스타졸 메실레이트 및 실로스타졸 베실레이트가 처리된 실험군에서는 사이에서는 유의한 차이가 나타나지 않았다.
한편, 세 종류의 염이 각각 처리된 모든 실험군에서는 실로스타졸의 최종반감기(terminal half-life)가 모두 유사하게 나타나는 것이 확인됨에 따라, 생물학적 반감기 변화없이 상기 두 염 형태에 의해 실로스타졸 유리 염기의 생체 내 경구 흡수율 및 생체이용율(bioavailability)이 매우 향상된 것이 확인되었다.
본 발명에 따른 제제는 약학적으로 허용가능한 통상의 부형제, 붕해제, 활택제, 감미제 등을 혼합하여 경구투여용 제제를 제조할 수 있다. 이때, 부형제로는 미결정셀룰로오스, 유당, 옥수수전분, 만니톨, 저치환도히드록시프로필셀룰로오스, 메타규산알루민산마그네슘, 콜로이드성 이산화규소 등이 바람직하고, 붕해제는 크로스카르멜로오스나트륨, 전분글리콘산나트륨, 카르복시메칠셀룰로오스칼슘, 크로스포비돈 등이 바람직하며, 활택제는 스테아린산 마그네슘, 탈크, 스테아릴푸마르산나트륨 등이 바람직하다. 또한, 경구투여용 제제로는 정제, 캡슐제, 과립제, 고체분산체 등이 가능하다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
< 참조예 1> 물질
실로스타졸 염(Cilostazol-free base), 벤조 설포닉산(benzene sulfonic acid; besylate), 메탄 설포닉산(methane sulfonic acid; mesylate), 클로르프로파마이드(chlorpropamide), 다이메틸설폭사이드(dimethylsulfoxide), 포름산(formic acid), 폴리에틸렌 글리콜 400(polyethylene glycol 400) 및 트윈 80(Tween 80)을 Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)에서 구입하여 사용하였다. 모든 용매는 HPLC(high-performance liquid chromatography) 등급으로 Burdick 및 Jackson Company (Morristown, NJ, USA)에서 구입하였으며, 다른 화합물은 최상 등급으로 사용하였다.
< 실험예 1> 실로스타졸 염에 포함된 수분 확인
Karl Fischer Moisture Titrator MKA-520 (Kyoto Electronics Manufacturing Co., Ltd., Kyoto, Japan)를 이용하여 실로스타졸 메실레이트 및 실로스타졸 베실레이트에 포함된 수분을 확인하였다.
< 실험예 2> 화합물 내 실로스타졸 확인
자와선 검출기(G1314B), 네 개의 펌프(G1311B), 오토샘플러(G1367E) 및 컬럼 구획(G1316A)으로 구성된 HPLC 시스템(Agilent 1260; Agilent Technologies)을 이용하여 실로스타졸을 확인하였다.
이동상은 증류수 및 아세토나이트릴 (45:55, v/v)로 구성되었으며, 유속은 1.0 mL/min 이었다. 자외선 검출기의 파장은 257nm였으며, reversed-phase 컬럼(Gemini C18 150 mm ×4.6 mm, 5 μm particle size; Phenomenex, Torrence, CA, USA)을 사용하였으며, 컬럼의 온도는 30℃를 유지시켰다.
< 실시예 1> 실로스타졸 메실레이트 또는 베실레이트 화합물 제조
도 1A의 실로스타졸은 pK a 가 11.8인 약 염기성 약물로, 본 발명은 실로스타졸 염의 안정성을 증가시키기 위해, 경구 투여가 가능하고 바이오의약품적인 장점을 가지며, 의약적으로 사용 가능한 메실레이트(pKa, -1.2) 및 베실레이트(pKa, 0.7)와 같은 산성을 나타내는 반대이온들을 선택하여 새로운 형태의 실로스타졸 염을 제조하였다.
먼저, 메탄 설포익산 또는 벤조 설포익산 1.2 mmol을 실로스타졸(370 mg, 1.0 mmol)이 용해되어 있는 클로로포름 용액 10 mL에 첨가하여 25℃에서 교반하여 혼합하고, 동일한 온도 조건에서 상기 혼합물을 12시간 동안 교반하였다.
그 후 감압조건에서 용매를 제거하고 남은 잔사에 다이에틸에테르 10 mL을 첨가하여 25℃에서 1시간 동안 교반하여 여과한 후 40℃ 감압조건으로 건조시켜 분말 형태의 실로스타졸 염을 얻었다.
상기 과정의 산 첨가 반응으로 도 1B 및 1C와 같은 두 형태의 실로스타졸 염인 실로스타졸 메실레이트 및 실로스타졸 베실레이트 화합물을 얻었다.
중수소화 되지 않은 용매 또는 테트라메틸실란을 내부 대조군으로 사용하고 AVANCE III(500 MHz; Bruker, Billerica, MA, USA)를 이용하여 수득된 실로스타졸 염의 1H NMR(nuclear magnetic resonance) 스펙트라를 얻어 화합물을 확인하였다.
그 결과, 도 2B와 같이 실로스타졸 메실레이트의 1H NMR에서는 메실레이트의 세 개의 수소가 포함된 메틸 피크가 2.99 ppm에서 확인되었다.
상기 결과로부터 실로스타졸 메실레이트 염은 실로스타졸과 메탄 설포닉산의 1:1 비율로 발생된 것임을 확인할 수 있었다.
또한, 도 2C와 같이 실로스타졸 베실레이트의 1H NMR 결과에서도 동일한 비율이 확인되었다.
실로스타졸 메실레이트 및 실로스타졸 베실레이트는 흰색 분말로 각각 69% 및 98% 수득율을 나타내었으며, Karl Fischer 수분 측정법을 이용하여 수분 함량을 확인한 결과, 실로스타졸 메실레이트 및 실로스타졸 베실레이트는 각각 0.17% 및 0.14%의 매우 낮은 수분함량을 나타내었다.
상기 결과로부터 두 실로스타졸 염은 수분을 함유하지 않은 무수 형태인 것으로 확인되었다.
< 실시예 2> 흡습성( Hygroscopicity ) 확인
실제로 약제학적 제품의 제조 및 저장에 있어 화합물의 낮은 흡습성은 약제학적 제품의 소재에 요구되는 매우 중요한 특성이므로, 상기 제조된 실로스타졸 메실레이트 및 실로스타졸 베실레이트에 포함된 수분 함량을 확인하기 위해, 공개된 방법(Callahan et al.)에 따라 흡습성을 확인하였다.
두 실로스타졸 염을 페트리 디쉬 내에 얇은 층이 되도록 균일하게 분사하고 데이케이터로 밀봉하여 25℃ 온도에서 22% 상대 습도(RH; silica gel) 및 92.5% RH(질산 칼륨 포화 용액)의 습도 조건으로 유지시켰다.
상기 RH 조건의 시료를 세 개씩 준비하고, 일주일 후 시료의 무게를 측정하고, 건조된 고체 100g당 흡착된 수분의 무게(g)를 측정하여 흡습성을 확인하였다(g/100 g).
그 결과, 실로스타졸 메실레이트의 흡습성은 22% RH 및 92.5% RH에서 각각 0.32% 및 4.82%로 나타났으며, 실로스타졸 베실레이트의 흡습성은 0.26% 및 1.37% 로 확인되었다.
1주일 동안 90% RH 이상의 조건에서 수분량의 증가가 a < 20% (w/w)일 경우 비흡습성으로 판단되므로, 상기 결과로부터 두 실로스타졸 염은 비흡습성 화합물임이 확인되었다.
< 실시예 3> 안정성 확인
두 실로스타졸 염의 스트레스 안정성을 확인하기 위해, 6주간 40℃±2℃/75%±5% RH 및 60℃±2℃와 같은 온도 증가 조건하에서 염 형태에 미치는 영향을 확인하여 화합물의 안정성을 확인하였다.
상기 제조된 각 실로스타졸 염 ~2 mg를 갈색 유리병에 넣고 40℃±2℃/75%±5% RH 및 60℃±2℃ 조건으로 6주간 안정성 챔버(Labcare Pvt. Ltd., Mumbai, India)에서 보관하고, 6주 후 시료 순도를“Cilostazol determination in salts”와 같은 방법으로 확인하였다.
또한, 두 실로스타졸 염들을 빛에 노출시킨 후 광조사에 따른 안정성을 24시간 동안 확인하였다.
상기 제조된 각 실로스타졸 염 ~2 mg을 투명 유리병 안에 분사하고 광 조사 챔버 안(SUNTEST CPS+, Atlas Material Testing Technology, LLC, Chicago, IL, USA)에 위치시켰으며, 챔버의 온도는 25℃를 유지시켰다.
광원은 실내 일광을 모방하기 위해, 창문 유리를 통하여 여과된 xenon arc 램프의 빛을 이용하여, 300.800 nm 파장을 200 W/m2 로 24시간 동안 조사하였다.
대조군은 알루미늄 포일로 보호하고, 상기 실험군과 동시에 광 조사 챔버에 넣고 동일한 조건으로 빛을 조사한 후 모든 시료들을 “Cilostazol determination in salts”와 같은 방법으로 분석하였다.
그 결과, 표 1과 같이 모든 테스트 샘플은 색 손실 없는 고체 형태를 유지하였으며, 실로스타졸 메실레이트 및 실로스타졸 베실레이트 모두 저장 후에도 좋은 열 안정성을 나타내었으며, 각 실험군은 최초 양의 98.6% 이상 회복하였다.
상기 결과로부터 두 실로스타졸 염은 빛 노출 후에도 어떠한 광분해 없이 안정성을 나타내는 것으로 확인되었다.
Figure 112016043993784-pat00005
< 실시예 4> 생체 외(In vitro) 용출률 확인
HCl 버퍼(pH 1.2), 아세테이트 버퍼(pH 4.5) 및 인산 완충액(pH 6.8)으로 위장관 조건을 모방하여 실로스타졸 유리 염기, 실로스타졸 메실레이트 및 실로스타졸 베실레이트를 생체 외(In vitro) 용출효과를 확인하였다.
먼저, 실로스타졸 염 실로스타졸 메실레이트 및 실로스타졸 베실레이트의 용출률을 확인하기 위해, 용출 테스트기(708-DS; Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA)의 basket method를 이용하여 37℃±0.5℃ 온도 조건으로 세 번 반복하여 용출률을 확인하였다.
“5” 사이즈(Capsugel, Morristown, NJ, USA)의 단단한 젤라틴 캡슐에 각 시료에서 실로스타졸 20.0mg이 되도록 정확하게 무게가 측정된 각 시료를 채워 넣고, pH 1.2, 4.5, 및 6.8 용해 버퍼 900mL로 구성된 용해 매개물과 baskets을 100 rpm으로 회전시켰다.
0.25, 0.5, 1, 2, 4, 및 6시간 간격으로 각 용해 매개물 1mL의 시료를 채취하고 동일한 양으로 신선한 매개물을 추가하였다.
상기 채취된 시료를 폴리테트라플루오로에틸렌(polytetrafluoroethylene) 주사기 필터(0.45 μm)로 여과한 후, 여과된 메탄올로 적절하게 희석하고 HPLC를 이용하여 용출된 실로스타졸의 양을 분석하였다.
상기 용출 실험을 세 번 반복하여 수행하였으며, 결과는 평균 값으로 나타내었다.
그 결과, 도 3과 같이 실로스타졸 유리 염기의 경우, pH 1.2, 4.5, 및 6.8의 조건에서 6시간 누적된 약물 용출률 백분율이 각각 25.4%±3.56%, 8.54%±1.89%, 및 2.74%±0.341%인 것으로 나타났다.
상기 결과에서 실로스타졸은 낮은 pH 조건에서 높은 용해가 나타난 반면, 높은 pH 조건에서 매우 낮은 약물 용출률이 확인되었는데, 이는 실로스타졸의 염기 성질 때문으로, 상기 결과로부터 실로스타졸은 pH 의존적으로 용출되는 것을 확인할 수 있었다.
한편, 모든 테스트 용해 버퍼에서 6시간 동안 두 실로스타졸 염의 용출 속도 및 약물 방출 정도를 실로스타졸 유리 염기와 비교하였다.
그 결과, 도 3A와 같이 HCl 버퍼(pH 1.2)에서 실로스타졸 유리 염기는 6시간 동안 25.4%±3.56% 약물 방출이 나타난 반면, 실로스타졸 메실레이트 및 실로스타졸 베실레이트는 각각 93.5%±6.54% 및 98.6%±5.65%의 매우 높은 수준의 용출률을 나타내었으며, 실로스타졸 메실레이트와 실로스타졸 베실레이트 사이에서는 유의한 용출률 차이가 나타나지 않았다(P > 0.05).
또한, 도 3B 및 3C를 참고하면 pH 4.5 및 6.8 용해 버퍼에서, 6시간 동안 실로스타졸 유리 염기로부터 방출된 약물은 각각 8.54%±1.89% 및 2.74%±0.341%로 나타났으며, 상기 낮은 용출률은 높은 pH 용액 때문인 것으로 확인되었다.
반면, 상기 동일한 시간 조건으로 pH 4.5 버퍼에서 실로스타졸 메실레이트 및 실로스타졸 베실레이트는 각각 25.6%±4.57% 및 26.6%±4.54%의 용출률을 나타내었으며, pH 6.8 버퍼에서는 각각 13.0%±2.07% 및 12.1%±1.65%의 용출률을 나타내었다.
상기 결과로부터 실로스타졸 메실레이트 및 실로스타졸 베실레이트 모두 1.2-6.8 pH 범위에서 용출속도 및 약물 방출 정도가 매우 증가된 것이 확인됨에 따라, 상기 두 실로스타졸 염은 위뿐만 아니라 장에서도 효과적으로 사용될 수 있음리 확인되었다.
또한, 실로스타졸 염의 용출 후 각 테스트 버퍼의 pH 값이 변화되지 않은 것을 확인할 수 있었으며, 상기 결과로부터 두 실로스타졸 염의 용출 속도 및 약물 방출 수준이 유의하게 개선된 것으로 확인되었다.
< 실시예 5> 약물동태학 ( Pharmacokinetic ) 확인
1. 동물 실험
수컷 Sprague Dawley 랫 (8 주령, 250-270 g)을 Orient Bio (Sungnam, Gyeonggi-do, South Korea)에서 구입하고, 가톨릭대학교 성심 캠퍼스의 동물 실험윤리 및 사용 위원회로부터 승인받은 동물 실험을 위한 프로토콜(Approval No 2014-027; Bucheon, Gyeonggi-do, South Korea)로 동물 실험을 수행하였다.
약 투여 전 12시간 동안 모든 랫들은 물과 음식을 자유롭게 섭취하였으며, 혈액 채취를 위해 랫의 경동맥에 폴리에틸렌 관(Clay Adams, Franklin Lakes, NJ, USA)을 삽입하였다.
상기 랫을 한 그룹당 8마리씩 3그룹으로 분리하고 실로스타졸 유리염(20 mg/kg; cilostazol-free base), 실로스타졸 메실레이트 또는 실로스타졸 베실레이트(equivalent to 20 mg/kg of cilostazol-free base)를 경구 투여하였다.
약물을 경구투여하기 위해, 유리 염과 두 실로스타졸 염을 각각 5% 트윈 80: 폴리에틸렌 글리콜 200: 증류수 = 50:10:40 (v/v/v) 용액에 분산시키고, 각 염이 분산된 현탁액 5 mL/kg을 위관영양법(oral gavage)으로 랫에 주입하였다.
약물 투입 후 0(대조군), 5, 15, 30, 45, 60, 90, 120, 240, 360, 480, 600 및 720분마다 랫의 경동맥으로부터 ~0.12 mL의 혈액을 채취하고, 혈액의 응고를 예방하기 위해, 혈액 시료를 채취한 후 즉시, 헤파린 처리된 0.9% NaCl 주입 용액(20 units/mL, 0.3 mL)으로 캐뉼라(cannula)를 세척하였다.
상기 혈액 시료는 채취 즉시 4℃, 13,000 rpm으로 10분간 원심분리한 후, 혈장 시료 50 μL를 액체 크로마토크래피와 연결된 이중질량분석(LC-MS/MS) 전까지 -80℃에서 저장하였다.
2. 혈장 내 실로스타졸의 확인
상기 방법으로 각각의 실로스타졸이 주입된 동물의 혈액시료를 변형된 LC-MS/MS 분석방법(23)으로 분석하고, 혈장 내 실로스타졸 농도를 동시에 확인하였다.
LC-MS/MS 시스템은 Shimadzu LCMS-8050 triple quadrupole mass spectrometer (Shimadzu Corporation, Kyoto, Japan)가 연결된 Shimadzu Nexera HPLC로 구성되었다.
간략하게, 테트라-부틸 메틸 에테르 1 mL를 이용하여 랫의 혈장으로부터 실로스타졸 및 내부 대조군(chlorpropamide, 500 ng/mL)을 추출하고, ACE 3 C8 컬럼 (50 mm ×4.6 mm, 3 μm particle size; Hichrom, Reading, Berkshire, UK)과 증류수 및 0.1% 포름산이 포함된 아세토나이트릴이 25:75(v/v)로 구성된 등용매 이동상을 이용하여 0.7 mL/min 유속으로 크로마토그래피 분리를 수행하였다. 각 시료당 전체 실행시간은 5.0분이었다.
실로스타졸은 m/z 370.45→288.1로, 클로르프로파마이드(chlorpropamide)는 m/z 277.05→111.05로 선택된 반응-모니터링 모드의 질량 분석기로 검출 및 정량을 수행하였다.
하기 조건으로 최적화된 매스 스펙트럼 데이터를 얻었다.
질소는 흡입식 가스 형태와 건성 가스 형태로 각각 3.0 L/min 및 10.0 L/min 유속 조건이었으며, 각각 접속기 전압은 4.5 kV; 탈용매화 선 온도는 250℃; heat block 온도는 400℃였다.
충돌에너지는 실로스타졸은 18V였으며, 클로르프로파마이드는 20V였다.
아르곤 가스를 270kPa 압력으로 collision-induced dissociation 가스로 사용하였으며, 검출기 전압은 1.72 kV 조건으로 수행되었다.
실로스타졸을 5-2,000 ng/mL농도의 선형 범위와 5ng/mL의 양을 최소 수치로 하여 측정하였다.
모든 분석의 정밀도(precision)와 정확성(accuracy)에 대한 변동 계수는 활성분석(bioanalysis)에 대한 허용 기준을 충족하였으며, 분석의 내부 및 일간 정밀도(n=5)는 5.91%에서 10.1%였으며, 내부 및 일간 정확도(n=5)는 88.9%에서 105.4%였다.
실로스타졸은 관련된 간섭 또는 기질 영향 없이 다양한 저장 조건 및 조절 조건에서 안정하였다.
3. 약리학적 분석 및 통계적 분석
WinNonlin software (version 5.2; Pharsight Corporation, Mountain View, CA, USA)와 비처리 모델을 이용하여 약물 동력학 파라미터를 계산하고, 상기 계산된 값으로부터 최고 혈장 농도(Cmax) 및 최고 혈장 농도에 도달한 시간(Tmax)을 얻었다.
0시간부터 마지막 관찰 시간 포인트까지의 농도-시간 곡선의 면적(AUCt)을 선형 사다리꼴 공식으로 계산하였다.
두 실로스타졸 염의 상대적인 생물학적 이용 가능성(bioavailabilities; F)을 하기식으로 계산하였다.
Figure 112016043993784-pat00006
통계적 분석은 독립적인 자료를 얻기 위해, Duncan’s multiple range test (Version 22; SPSS Inc., Chicago, IL, USA)의 세 가지 방법 중 분산의 경험적 분석를 이용하여 수행하였다.
모든 결과들은 Tmax 중간 값을 제외하고, 평균 ± 표준편차(SD) 값으로 나타내었으며, 모든 분석에 있어서, P < 0.05 을 유의한 값으로 보았다.
상기 과정으로 랫에 실로스타졸 유리 염기, 실로스타졸 메실레이트 및 실로스타졸 베실레이트를 경구 투여 후 실로스타졸의 혈장 내 농도-시간 프로파일을 확인하였다.
그 결과 도 4와 같이 실로스타졸 메실레이트 및 실로스타졸 베실레이트가 처리된 실험군의 혈장 내 실로스타졸 농도는 모든 관찰 시간에서 실로스타졸 유리 염기가 처리된 실험군보다 매우 높게 나타났다(P < 0.05).
또한, 표 2와 같이 실로스타졸 유리염기와 비교하여 실로스타졸 메실레이트 및 실로스타졸 베실레이트의 AUCt 값은 각각 2.87 배 및 3.65배 증가하였으며, Cmax 값은 각각 2.94배 및 3.88배 증가한 것으로 나타난 반면, 실로스타졸 메실레이트의 혈장 농도 프로파일과 실로스타졸 베실레이트의 혈장 농도 프로파일을 비교한 결과, 두 염이 처리된 실험군 사이에 AUCt 및 Cmax 의 유의한 차이는 나타나지 않았다.
또한, 실로스타졸 메실레이트 및 실로스타졸 베실레이트가 처리된 실험군에서는 실로스타졸 유리 염기가 처리된 실험군보다 매우 빠른 경구 흡수율 및 짧은 Tmax 값이 나타났으며, 모든 실험 결과에서 실로스타졸 메실레이트 및 실로스타졸 베실레이트가 처리된 실험군에서는 사이에서는 유의한 차이가 나타나지 않았다.
한편, 세 종류의 염이 각각 처리된 모든 실험군에서는 실로스타졸의 최종반감기(terminal half-life)가 모두 유사하게 나타나는 것이 확인됨에 따라, 생물학적 반감기 변화없이 상기 두 염 형태에 의해 실로스타졸 유리 염기의 생체 내 경구 흡수율 및 생체이용율(bioavailability)이 매우 향상된 것을 확인할 수 있었으며, 상기 결과는 생체 외 용해 결과와 유사하게 나타났다.
상기 결과로부터 실로스타졸 유리 염기의 향상된 경구 흡수율은 설포닉 산 염 형태에 따른 용해력 증가 때문인 것을 확인할 수 있었다.
Figure 112016043993784-pat00007
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (8)

  1. 하기 화학식 1로 표시되며, 실로스타졸 유리 염기와 메실레이트의 산 첨가 반응을 통하여 합성된 실로스타졸 메실레이트(cilostazol mesylate) 화합물.
    [화학식 1]
    Figure 112017093990743-pat00008
  2. 삭제
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 실로스타졸 메실레이트는 pH 1.2, pH 4.5 및 pH 6.8 조건에서 각각 85 내지 100%, 20 내지 35% 및 11 내지 20% 용출률을 나타내는 것을 특징으로 하는 화합물.
  4. 청구항 1에 따른 화합물을 유효성분으로 함유하는 경구투여용 제제.
  5. 하기 화학식 2로 표시되며, 실로스타졸 유리 염기와 베실레이트의 산 첨가 반응을 통하여 합성된 실로스타졸 베실레이트(cilostazol besylate) 화합물.
    [화학식 2]
    Figure 112017093990743-pat00009
  6. 삭제
  7. 청구항 5에 있어서, 상기 실로스타졸 베실레이트는 pH 1.2, pH 4.5 및 pH 6.8 조건에서 각각 93 내지 100%, 20 내지 32% 및 10 내지 15% 용출률을 나타내는 것을 특징으로 하는 화합물.
  8. 청구항 5에 따른 화합물을 유효성분으로 함유하는 경구투여용 제제.
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