KR101784319B1 - 구아두아 앵거스티폴리아 추출물을 포함하는 망막 질환의 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents
구아두아 앵거스티폴리아 추출물을 포함하는 망막 질환의 예방 또는 치료용 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 명세서에는 구아두아 대나무의 추출물, 이의 분획물 또는 이로부터 분리된 화합물의 신규한 용도로서, 세포의 허혈성 손상을 억제 또는 개선하고, 활성산소로부터 세포를 보호하며 세포자살을 억제하는 용도가 개시된다. 특히 안세포에 대해 작용하여, 녹내장, 노인성 황반변성 등의 망막 질환 예방 및 치료 에 이용될 수 있다. 이러한 용도에 사용하기 위한 약제학적 조성물 또는 기능성 식품 조성물 또한 제공된다.
Description
본 명세서에는 허혈성 손상을 억제 또는 개선하고, 산화적 스트레스로부터 세포를 보호하며, 세포자살을 억제하는 구아두아 대나무의 신규한 용도가 개시된다.
세포자살(apoptosis)이란, 세포괴사(necrosis)와는 구별되는 세포 내의 자발적이고 계획된 세포사(programmed cell death)이고, 세포자살을 유발하는 다양한 기전들이 제시되어 왔다. 대표적인 유발인자로는 산화 스트레스(oxidative stress), 질소산화물 합성효소(nitric oxide synthase), 미토콘드리아(mitochondria)를 매개로 하는 케스페이즈 의존적(caspase-dependent) 또는 비의존적(caspase-independent) 기전 등이 있다. 특히 많은 안질환들이 특정 세포의 세포자살로 인해 발생하는 것으로 알려져 있으며, 그 대표적인 안질환으로는 연령 관련 황반 변성(age related macular degeneration) 및 녹내장(glaucoma)이 있다. 이러한 안질환의 억제 및 치료를 위하여 세포자살을 억제하거나 그 진행을 늦출 수 있는 약제에 대한 연구가 지속적으로 진행되고 있는 실정이다.
녹내장의 주원인은 안압의 상승, 즉 허혈성 손상이며 결국 신경 세포의 사멸로 인해 시야에 이상이 생긴다. 녹내장은 망막 신경 세포의 세포자살로 인한 시신경의 손상을 통해서 일어나게 되는데, 이러한 시신경의 손상은 특징적인 녹내장성 시야 손상을 동반한다. 녹내장에서 나타나는 망막 신경 세포의 세포사멸은 세포자살(apoptosis)로 알려져 있으며, 안압을 상승시킨 동물 모델뿐만 아니라 녹내장 환자의 사후 부검을 통해서도 녹내장 환자에서 망막 신경 세포의 세포자살이 관찰되었다(Quigley HA et al., Invest Ophthalmol Vis Sci., 36, 774-786, 1995; Garcia-Valenzuela E et al., Exp Eye Res., 61, 33-44, 1995). 세포 내에 세포사멸을 유도하는 기전과 억제하는 기전의 균형에 의하여 세포의 운명이 결정되는데, 녹내장에 있어서는 글루타메이트(glutamate), 사이토크롬 C(cytochrome c), 종양 괴사 인자-알파(TNF-α) 및 Bad(BCL2-antagonist of cell death) 단백질의 증가 또는 발현이 망막 신경 세포를 세포자살에 이르게 하는 것으로 알려져 있으며, 세포 내의 산화 스트레스(oxidative stress)도 녹내장의 중요한 원인으로 알려져 있다. 녹내장에서는 망막 신경 세포가 산화 스트레스를 받아 직접적으로 시신경을 손상에 이르게 할 뿐만 아니라, 방수 유출로를 구성하고 있는 섬유주 세포(trabecular meshwork cell)가 산화 스트레스를 받음으로써, 그 결과 섬유주 세포의 기능저하가 일어나게 되고, 궁극에는 세포자살이 일어나게 되어 안압이 상승하게 된다(Sacca' SC et al, Arch Ophthalmol., 123, 458-463, 2005; Zhou L et al., J Cell Physiol., 180, 182-189, 1999). 섬유주 세포의 기능저하는 세포가 고유하게 가지고 있는 방수를 흡수하는 음세포작용(pinocytosis)에 영향을 주게 되어 안압의 상승을 유발하는데 특히 섬유주 세포의 기능저하가 안압상승의 주원인으로 알려져 있는 원발성 폐쇄 각 녹내장(primary open angle glaucoma) 환자들의 섬유주 세포가 산화 스트레스에 더 취약한 것으로 알려져 있다(Izzotti A et al., Am J Med., 114, 638-646, 2003). 상기 환자의 방수를 분석한 결과, 총항산화역량(total antioxidant potential)이 유의하게 정상인에 비하여 낮은 것으로 나타났고(Ferreira SM at al., Am J Ophthalmol. 137, 62-69, 2004), 혈장에 산화 스트레스를 조절하는 글루타치온-S- 전이효소(Glutachione-S-Transferase)가 증가되어 있음이 관찰되었다(Yang J et al., Invest Ophthalmol Vis Sci., 42, 1273-1276, 2001). 또한 최근에는 원발성 개방 각 녹내장 환자들에 있어서 나타나는 섬유주 세포의 손상이 항산화제에 의하여 억제됨이 알려져 있다(Yuan He et al., Invest Ophthalmol Vis Sci., 49, 1447-1458, 2008). 이처럼 망막 신경 세포와 섬유주 세포의 세포 자살을 억제하고 상기 세포의 산화 스트레스를 억제하는 것이 새로운 접근방법으로 대두되고 있다.
Quigley HA et al., Invest Ophthalmol Vis Sci., 36, 774-786, 1995; Garcia-Valenzuela E et al., Exp Eye Res., 61, 33-44, 1995
Sacca' SC et al, Arch Ophthalmol., 123, 458-463, 2005; Zhou L et al., J Cell Physiol., 180, 182-189, 1999
Izzotti A et al., Am J Med., 114, 638-646, 2003
Ferreira SM at al., Am J Ophthalmol. 137, 62-69, 2004)
Yang J et al., Invest Ophthalmol Vis Sci., 42, 1273-1276, 2001
Yuan He et al., Invest Ophthalmol Vis Sci., 49, 1447-1458, 2008
일 측면에서 본 발명은, 세포의 허혈성 손상을 억제 또는 개선하는 것을 목적으로 한다.
다른 측면에서 본 발명은, 산화적 스트레스로부터 세포를 보호하는 것을 목적으로 한다.
다른 측면에서 본 발명은 세포자살(apoptosis)을 억제하는 것을 목적으로 한다.
다른 측면에서 본 발명은 망막 신경 세포 또는 섬유주 세포(trabecular meshwork cell)와 같은 안세포를 보호하는 것을 목적으로 한다.
다른 측면에서, 본 발명은 황반 변성 또는 녹내장과 같은 망막 질환의 예방, 개선 또는 치료를 목적으로 한다.
일 측면에서 본 발명은 구아두아 대나무 추출물을 유효성분으로 포함하는 세포의 허혈성 손상의 억제 또는 개선용 조성물일 수 있다.
다른 측면에서 본 발명은 구아두아 대나무 추출물을 유효성분으로 포함하는 산화적 스트레스로부터 세포를 보호하기 위한 항산화용 조성물일 수 있다.
다른 측면에서 본 발명은 구아두아 대나무 추출물을 유효성분으로 포함하는 세포자살(apoptosis) 억제용 조성물일 수 있다.
일 실시예에서 상기 세포는 안세포일 수 있다.
일 실시예에서, 상기 안세포는 망막 신경 세포 또는 섬유주 세포(trabecular meshwork cell)일 수 있다.
일 실시예에서, 상기 조성물은 망막 질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물일 수 있다.
일 실시예에서, 상기 망막 질환은 연령 관련 황반 변성 또는 녹내장일 수 있다.
일 측면에서, 상기 조성물은 망막 질환의 예방 또는 개선용 건강식품 조성물, 또는 망막 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물일 수 있다.
일 측면에서, 상기 구아두아 대나무는 구아두아 앵거스티폴리아(Guada angustifolia)일 수 있다.
일 실시예에서, 상기 구아두아 대나무 추출물은 구아두아 대나무의 지상부의 추출물일 수 있다.
일 실시예에서, 상기 구아두아 대나무 추출물은 구아두아 대나무의 잎의 추출물일 수 있다.
일 실시예에서, 상기 구아두아 대나무 추출물은 물, C1-6 저급 알코올, 아세톤 또는 이들의 혼합 용매로 추출한 추출물일 수 있다.
일 실시예에서, 상기 구아두아 대나무 추출물은 메탄올 또는 에탄올 추출물일 수 있다.
일 실시예에서, 상기 구아두아 대나무 추출물은 메탄올 또는 에탄올로 추출하여 얻어진 추출물을 물에 현탁시킨 후, n-헥산, 염화 메틸렌, 에틸아세테이트, n-부탄올 및 물로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 분획용매로 분획한 분획물일 수 있다.
일 실시예에서, 상기 구아두아 대나무 추출물은 0.004 내지 40mg/kg/일의 투여량으로 투여되는 조성물일 수 있다.
일 실시예에서, 상기 조성물은 국소 투여용 제형일 수 있다.
일 실시예에서 상기 조성물은 안약 제형일 수 있다.
일 실시예에서, 상기 조성물은 구아두아 대나무 추출물의 동결건조물을 용매에 용해시킨 용액일 수 있다.
일 실시예에서, 상기 동결건조물 용해용 용매는 디메틸설폭사이드(Dimethyl sulfoxide; DMSO)일 수 있다
일 실시예에서, 구아두아 대나무 추출물은 조성물 전체 중량을 기준으로 5 내지 500μg/ml의 농도일 수 있다.
일 실시예에서, 구아두아 대나무 추출물은 조성물 전체 중량을 기준으로 10 내지 250μg/ml의 농도일 수 있다.
본 명세서에 개시된 조성물은 세포의 허혈성 손상을 억제 또는 개선할 수 있다. 또한, 산화적 스트레스로부터 세포를 보호할 수 있다. 또한, 세포자살을 억제할 수 있다. 구체적으로 망막 신경 세포와 같은 안세포에 작용하여, 노인성 황반변성, 녹내장 등의 망막질환을 예방 및 치료하는 조성물 또는 기능성 식·의약품 소재로 유용하게 활용될 수 있다.
도 1a 및 도 1b는 구아두아 대나무 추출물, 분획물, 화합물이 세포사멸이 유도된 망막절세포의 생존에 미치는 영향을 MTT 어세이로 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 2는 세포염색법을 이용한 세포생존율의 측정한 결과이다.
도 3a 내지 도 3f는 구아두아 대나무 추출물, 분획물, 화합물의 활성산소(Reactive Oxygen Species) 억제 효과를 나타내는 그래프이다.
도 4는 세포사멸의 정도를 나타내는 잘려진 형태의 PARP양을 웨스턴 블롯 분석으로 측정한 사진이다.
도 5는 흰쥐 시신경 부분 압착 손상 모델에 구아두아 앵거스티폴리아( Guadua angustifolia) 메탄올 추출물을 처리한 후 형광 염색된 망막을 촬영한 사진이다.
도 2는 세포염색법을 이용한 세포생존율의 측정한 결과이다.
도 3a 내지 도 3f는 구아두아 대나무 추출물, 분획물, 화합물의 활성산소(Reactive Oxygen Species) 억제 효과를 나타내는 그래프이다.
도 4는 세포사멸의 정도를 나타내는 잘려진 형태의 PARP양을 웨스턴 블롯 분석으로 측정한 사진이다.
도 5는 흰쥐 시신경 부분 압착 손상 모델에 구아두아 앵거스티폴리아( Guadua angustifolia) 메탄올 추출물을 처리한 후 형광 염색된 망막을 촬영한 사진이다.
구아두아 대나무는 외떡잎식물 벼목 화본과 대나무아과에 속하는 신열대구 대나무종(neotropical genus)으로, 구아두아속(Guada sp .) 식물을 의미한다. 구아두아속(Guada sp.) 식물로는 구아두아 앰플렉시폴리아(Guadua amplexifolia), 구아두아 앵거스티폴리아(Guadua angustifolia), 구아두아 칼더로니아나(Guadua calderoniana), 구아두아 챠코엔시스(Guadua chacoensis), 구아두아 챠패런시스(Guadua chaparensis), 구아두아 글로머라타(Guadua glomerata), 구아두아 인카나(Guadua incana), 구아두아 라티폴리아(Guadua latifolia), 구아두아 롱기폴리아(Guadua longifolia), 구아두아 마클루레이(Guadua macclurei), 구아두아 마크로스피큘라타(Guadua macrospiculata), 구아두아 마크로스타키야(Guadua macrostachya), 구아두아 마큘로사(Guadua maculosa), 구아두아 마그나(Guadua magna), 구아두아 패니큘라타(Guadua paniculata), 구아두아 파라과이야나(Guadua paraguayana), 구아두아 레프락타(Guadua refracta), 구아두아 사르코카르파(Guadua sarcocarpa), 구아두아 수퍼바(Guadua superba), 구아두아 타고아라(Guadua tagoara), 구아두아 트리니이(Guadua trinii), 구아두아 언시나타(Guadua uncinata), 구아두아 벨루티나(Guadua velutina), 구아두아 베네주엘래(Guadua venezuelae), 구아두아 비르가타(Guadua virgata), 및 구아두아 웨버파우어리(Guadua weberbaueri)를 들 수 있다. 예컨대, 구아두아 대나무는 구아두아 앵거스티폴리아(Guadua angustifolia)일 수 있다.
구아두아 앵거스티폴리아(Guadua angustifolia)의 원산지는 아마존강 오리노코강 유역의 열대 우림지역이며 해발 1500미터 이하의 저산지대에 분포하지만 해발 2500까지 발견 된바 있다.
본 명세서에서 "추출물"은 용매 등을 이용하여 식물로부터 일부 성분들을 뽑아낸 물질을 의미하며, 1차적으로 물 또는 유기용매 등에 식물을 가하여 얻어진 추출물, 상기 1차적으로 얻어진 추출물에 2차적으로 용매를 가하여 분획하여 얻어진 분획물, 또는 상기 추출물 또는 분획물로부터 뽑아낸, 기능을 나타내는 유효성분인 화합물 자체를 모두 포함하는 개념이다. 또한, 상기 추출 또는 분획 후 발효, 동결건조 등의 가공을 거친 물질도 포함한다. 또한, 추출용매로 추출한 것이 아니라 식물을 그대로 착즙 또는 분쇄한 것을 포함한다.
본 발명의 구아두아 대나무 추출물은 하기와 같은 단계로 제조되는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다;
1) 건조한 구아두아 대나무을 추출용매를 가하여 추출하는 단계;
2) 단계 1)의 추출물을 여과하는 단계; 및
선택적으로(optionally), 3) 단계 2)의 여과한 추출물을 감압농축하여 추출물을 제조하는 단계; 및
선택적으로(optionally), 4) 단계 3)의 추출물을 추가적으로 유기용매로 추출하여 분획물을 제조하는 단계.
상기 방법에 있어서, 구아두아 대나무는 재배한 것, 채취한 것 또는 시판되는 것 등이 제한 없이 사용될 수 있다. 상기 구아두아 대나무 추출물은 식물 전체를 이용할 수 있고, 잎, 줄기, 지상부, 뿌리 또는 전체를 이용할 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 예컨대, 잎을 사용할 수 있다.
상기 추출 용매는 물, 알코올 또는 이들의 혼합물, 바람직하게는 C1 내지 C6의 저급 알코올, 아세톤 또는 이들의 혼합 용매로부터 선택된 용매를 사용할 수 있다. 예컨대, 100% 메탄올 또는 에탄올로 추출할 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 메탄올 또는 에탄올 수용액을 사용할 수도 있다. 상기 추출 용매의 양은 구아두아 대나무 건조 중량의 1 내지 30 배, 또는 10 내지 20배일 수 있다. 추출 방법은 가열 추출, 침지 추출, 냉침 추출, 환류 냉각 추출 및 초음파 추출 등의 추출 방법을 사용할 수 있으며, 예컨대, 냉침 추출로 추출될 수 있다. 예컨대, 냉침 추출은 2회 이상 반복될 수 있다. 예컨대, 2회 냉침 추출을 반복할 수 있다. 추출시 온도는 -114℃ 내지 100℃일 수 있지만, 이에 한정되지 않는다. 추출 시간은 30분 내지 7일일 수 있다. 예컨대, 1시간 내지 24시간, 또는 8 내지 16시간일 수 있지만, 이에 한정되지 않는다.
상기 추출물을 제조하는 방법은 냉침추출, 초임계추출, 아임계추출, 고온추출, 고압추출 또는 초음파추출법 등의 추출장치를 이용한 방법 또는 XAD 및 HP-20을 포함한 흡착 수지를 이용하는 방법 등 당업계의 통상적인 추출방법을 사용할 수 있다. 상기 추출 회수는 1 내지 5회일 수 있다. 2회 이상 반복 추출할 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 방법에 있어서, 단계 3)의 감압농축은 진공회전증발기를 이용할 수 있지만, 이에 한정하지 않는다. 또한, 건조는 감압건조, 진공건조, 비등건조, 분무건조, 상온건조 또는 동결건조할 수 있으나 이에 한정하지 않는다.
상기 방법에 있어서, 분획 단계 4)의 유기용매는 노르말-헥산, 염화 메틸렌, 에틸아세테이트 또는 노르말-부탄올인 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다. 상기 분획물은 구아두아 대나무 추출물을 물에 현탁시킨 후 노르말-헥산, 염화 메틸렌, 에틸아세테이트, 노르말-부탄올 및 물로 순차적으로 계통 분획하여 수득한 노르말-헥산 분획물, 염화 메틸렌 분획물, 에틸아세테이트 분획물, 노르말-부탄올 분획물 또는 물 분획물 중 어느 하나일 수 있다. 예컨대, 에틸아세테이트 분획물 또는 헥산 분획물일 수 있지만, 이에 한정하지 않는다. 상기 분획물은 상기 구아두아 대나무 추출물로부터 분획 과정을 1 내지 5회 반복할 수 있다. 예컨대, 2회 이상 반복하여 수득할 수 있다. 분획 후 감압 농축할 수 있지만, 이에 한정하지 않는다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 건조된 Guadua angustifolia을 적당한 크기로 분쇄하여 추출용기에 넣고 메탄올(100%)을 가하여 실온에서 방치한 후, 거름종이로 여과한 후, 여과액을 농축 및 동결건조하여 추출물을 얻었고, 상기 Guadua angustifolia 추출물을 분별깔때기를 이용하여, 노르말-헥산, 염화 메틸렌, 에틸아세테이트, 노르말-부탄올 및 물 분획물로 순차적으로 계통분획하여 Guadua angustifolia 에탄올 추출물 및 이의 분획물, 노르말-헥산 분획물, 염화 메틸렌 분획물, 에틸아세테이트 분획물, 노르말-부탄올 분획물 및 물 분획물을 각각 제조하였다.
상기 본 발명의 구아두아 대나무 추출물, 이의 분획물 또는 이로부터 분리한 화합물을 포함하는 조성물은, 조성물 총 중량에 대하여 상기 구아두아 대나무 추출물, 이의 분획물 또는 이로부터 분리한 화합물을 0.1 내지 100 중량%로 포함할 수 있지만, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 조성물은 약제의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 본 발명의 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 본 발명의 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구 투여(예를 들어, 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)할 수 있으며, 투여량은 환자의 상태, 체중, 연령, 성별, 식이, 배설율, 질환의 중증도, 약물형태, 투여시간, 투여방법, 투여경로 및 투여기간 등에 따라 그 범위가 다양하다. 1일 투여량은 본 발명에 따른 추출물, 분획물 또는 화합물을 동결건조하였을 때의 양으로 0.0001㎎/㎏ 내지 500㎎/㎏, 바람직하게는 0.001㎎/㎏ 내지 100㎎/㎏, 또는 0.004 내지 40mg/kg/일이며, 필요에 따라 일일 1회 내지 수회로 나누어 투여할 수 있다. 투여량은 예컨대, 0.001 mg/kg/일 이상, 0.004 mg/kg/일 이상, 0.01 mg/kg/일 이상, 0.02 mg/kg/일 이상, 0.03 mg/kg/일 이상, 0.04 mg/kg/일 이상, 0.05 mg/kg/일 이상, 0.06 mg/kg/일 이상, 0.07 mg/kg/일 이상, 0.08 mg/kg/일 이상, 0.09 mg/kg/일 이상, 0.1 mg/kg/일 이상, 0.2 mg/kg/일 이상, 0.3 mg/kg/일 이상, 0.4 mg/kg/일 이상일 수 있다. 또한, 투여량은 예컨대, 40 mg/kg/일 이하, 35 mg/kg/일 이하, 30 mg/kg/일 이하, 25 mg/kg/일 이하, 20 mg/kg/일 이하, 15 mg/kg/일 이하, 10 mg/kg/일 이하, 5 mg/kg/일 이하, 4 mg/kg/일 이하, 3 mg/kg/일 이하, 2 mg/kg/일 이하, 1 mg/kg/일 이하, 0.8 mg/kg/일 이하, 0.6 mg/kg/일 이하, 0.4 mg/kg/일 이하일 수 있다. 예컨대, 상기 투여량은 0.4mg/kg/일 일 수 있다.
일 측면에서 본 발명에 따른 조성물은 조성물 전체 중량을 기준으로 5 내지 500μg/ml의 농도로 구아두아 대나무 추출물을 함유할 수 있다. 예컨대, 5μg/ml 이상, 10μg/ml 이상, 15μg/ml 이상, 20μg/ml 이상, 25μg/ml 이상, 30μg/ml 이상, 35μg/ml 이상, 40μg/ml 이상, 43μg/ml 이상, 45μg/ml 이상, 또는 48μg/ml 이상일 수 있다. 또는, 500μg/ml 이하, 450μg/ml 이하, 400μg/ml 이하, 350μg/ml 이하, 300μg/ml 이하, 250μg/ml 이하, 200μg/ml 이하, 150μg/ml 이하, 100μg/ml 이하, 90μg/ml 이하, 80μg/ml 이하, 70μg/ml 이하, 60μg/ml 이하 또는 55μg/ml 이하일 수 있다. 예컨대, 구아두아 대나무 추출물은 조성물 전체 중량을 기준으로 10 내지 250μg/ml의 농도로 조성물에 포함될 수 있다. 예컨대, 약 50μg/ml의 농도일 수 있다.
또한, 본 발명은 구아두아 대나무 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 함유하는 망막질환 예방 및 치료용 식의약품을 소재로 제공한다.
상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 드링크제, 육류, 소세지, 빵, 비스켓, 떡, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강 식품을 모두 포함한다.
본 발명의 구아두아 대나무 추출물, 이의 분획물 또는 이로부터 분리한 화합물은 식품에 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합양은 그의 사용 목적(예방 또는 개선용)에 따라 적합하게 결정될 수 있다.
일반적으로, 건강기능식품 중의 상기 추출물의 양은 전체 식품 중량의 0.1 내지 90 중량%로 가할 수 있다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.
본 발명의 건강 기능성 음료 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 추출물을 함유하는 외에는 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 ㎖당 일반적으로 약 1 내지 400mg일 수 있다. 예컨대, 10 내지 40mg일 수 있다. 이러한 함량은 구아두아 대나무 추출물의 적정 투여량 범위에 맞게 정해진다. 1일 투여량은 본 발명에 따른 추출물, 분획물 또는 화합물을 동결건조하였을 때의 양으로 0.0001㎎/㎏ 내지 500㎎/㎏, 바람직하게는 0.001㎎/㎏ 내지 100㎎/㎏, 또는 0.004 내지 40mg/kg/일이며, 필요에 따라 일일 1회 내지 수회로 나누어 투여할 수 있다. 투여량은 예컨대, 0.001 mg/kg/일 이상, 0.004 mg/kg/일 이상, 0.01 mg/kg/일 이상, 0.02 mg/kg/일 이상, 0.03 mg/kg/일 이상, 0.04 mg/kg/일 이상, 0.05 mg/kg/일 이상, 0.06 mg/kg/일 이상, 0.07 mg/kg/일 이상, 0.08 mg/kg/일 이상, 0.09 mg/kg/일 이상, 0.1 mg/kg/일 이상, 0.2 mg/kg/일 이상, 0.3 mg/kg/일 이상, 0.4 mg/kg/일 이상일 수 있다. 또한, 투여량은 예컨대, 40 mg/kg/일 이하, 35 mg/kg/일 이하, 30 mg/kg/일 이하, 25 mg/kg/일 이하, 20 mg/kg/일 이하, 15 mg/kg/일 이하, 10 mg/kg/일 이하, 5 mg/kg/일 이하, 4 mg/kg/일 이하, 3 mg/kg/일 이하, 2 mg/kg/일 이하, 1 mg/kg/일 이하, 0.8 mg/kg/일 이하, 0.6 mg/kg/일 이하, 0.4 mg/kg/일 이하일 수 있다. 예컨대, 상기 투여량은 0.4mg/kg/일 일 수 있다.
상기 외에 본 발명의 구아두아 대나무 추출물, 이의 분획물 또는 이로부터 분리한 화합물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 구아두아 대나무 추출물, 이의 분획물 또는 이로부터 분리한 화합물은 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 구아두아 대나무 추출물 또는 이의 분획물 100 중량부 당 0.1 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
이하, 본 발명을 실시예, 실험예 및 제조예에 의해 상세히 설명한다. 단 하기 실시예, 실험예 및 제조예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예, 실험예 및 제조예에 의해 한정되지 않는다.
<실시예 1> 구아두아 앵거스티폴리아(
Guadua angustifolia
)추출물의 제조
콜롬비아, 발레 델 카우카, 칼세도니아(Calcedonia, Valle del Cauca, Colombia) 에서 채취한 구아두아 앵거스티폴리아(Guadua angustifolia)의 잎을 건조시키고, 건조된 잎을 세절한 후 100 g에 2.5 L의 메탄올(100%)을 가하고 12시간동안 냉침 추출한 후 추출액을 여과하였다. 추출액을 여과한 후 남은 잔사에 다시 2 L의 메탄올을 가하고 12시간동안 냉침추출하는 방법을 추가로 1회 반복하여 총 추출액 5.5 L를 수득하였다. 상기 추출액 5.5 L를 35 ℃에서 감압 농축하여 메탄올 추출물 8 g을 수득하였다. 상기 Guadua Angustifolia 추출물을 물에 현탁시킨 후 분별깔때기를 이용하여 n-헥산, 염화 메틸렌, 에틸아세테이트, n-부탄올 및 물로 순차적으로 분획하였으며, 그 결과 n-헥산 분획물(0.94g), 에틸아세테이트 분획물(1.74g), n-부탄올 분획물(1.86g) 및 물 분획물(2.2g)을 얻을 수 있었다. 상기 추출물은 디메틸설폭사이드(Dimethyl sulfoxide; DMSO)에 녹인 후, 하기 실험에 이용되었다.
<실시예 2> 구아두아 앵거스티폴리아(
Guadua angustifolia
)추출물로부터 화합물의 분리
상기 실시예1과 같은 방법으로 추출 및 분획된 염화 메틸렌 분획물에서 두 화합물들 (Compound A 및 Compound B)이 분리되었다. 이와 동일 또는 유사한 화합물들은 다른 구아두아속 식물에서도 발견되는 것을 확인할 수 있었다.
상기 실시예 1 또는 실시예 2의 추출물, 분획물 또는 화합물을 사용하여 하기와 같이 실험을 수행하였다.
실험방법
RGC
-
5세포
배양
망막절세포(Retinal Ganglion Cells, RGC, Alcone, USA)인 RGC-5 세포는 10% 우태아혈청(FBS)과 100 U/ml penicillin/streptomycin이 포함 된 Dulbecco's modified Eagle's medium 배지(DMEM, Hyclone, USA)를 사용하여 T-75 tissue culture flask에 37℃에서 5% CO2, 95% 공기 및 포화 습도하의 항온기에서 배양하였다. 2일 내지 3일 후 포화 상태로 자란 세포는 trypsin-EDTA 용액으로 flask로 부터 떼어낸 후 계대 배양하였다.
약물처리
세포를 96 well 배양접시에 분주한 후 24시간 동안 배양기에 넣어 세포를 부착시킨 후 배지를 제거하고 나서 혈청 단백질에 의한 항산화효과를 배제하기 위하여 1%의 저농도 우태아혈청이 포함된 DMEM 배지로 교환하였다. 추출물, 분획물 또는 화합물의 최종농도가 50, 10, 1, 0.1 ug/mL 되게 1시간 동안 전처리 한 후 0.5mM 1-buthionine-(S,R)-sulfoximine (BSO)과 10mM L-glutamatmic acid (glutamate)를 37℃에서 24시간동안 처리 후 각 측정을 수행하였다.
<실험예 1>
Guadua Angustifolia
추출물의 망막 신경 세포(RGC-5) 보호 효과 측정
망막절세포(Retinal Ganglion Cells, RGC)인 RGC-5 세포에 BSO (1-buthionine(S,R)-sulfoximine) plus glutamate로 세포사멸을 유도하였을 때, 실시예 1의 구아두아 앵거스티폴리아(Guadua angustifolia) 추출물이 세포사멸을 억제하는 지 MTT 방법으로 측정하였다. 구체적으로, RGC-5 세포에 0.5mM BSO와 10mM 글루타메이트를 처리하여 세포사멸을 유도한 후 실시예1의 구아두아 앵거스티폴리아(Guadua angustifolia) 헥산 분획물, 염화 메틸렌 분획물, 에틸 아세테이트 분획물 및 부탄올 분획물을 각각 50, 10, 1, 0.1μg/ml의 농도로 투여하였다. 또한, 실시예2의 화합물 50 μg/ml의 농도에 대해서도 동일하게 투여하였다. 그 후 MTT 어세이를 통해 세포의 생존율을 측정하였다.
사용된 MTT 어세이는 세포생존과 세포독성의 선별 검사로 흔히 이용되고 있는 발색검사의 일종인 세포의 mitochondrial dehydrogenase에 의하여 tetrazolium salt인 MTT가 formazan crystal로 변화하는 것을 이용한 MTT (3-[4, 5??imethylthiazol-2-yl]-2, 5-diphenyltetrazolium bromide, Sigma) 어세이이다. 배지를 제거하고 최종농도가 0.5mg/ml인 MTT를 각 well당 첨가 후 1시간 동안 반응시켰다. dimethylsulfoxide를 각 well당 100 μl씩 넣어 15분간 흔든 후 Synergy HT Multi-microplate reader(Bio-Tek instruments, Winooski, VT, U.S.A)로 570 nm에서 흡광도를 측정하였다.
그 결과를 도 1a 및 도 1b에 나타내었다. 도 1a 및 도 1b의 그래프에서 두번째 막대는 BSO plus glutamate 처리를 한 세포의 결과이다. 도 1에 나타난 바와 같이, 여러 유기용매를 가하여 분획한 분획물들 중 헥산, 염화 메틸렌, 에틸아세테이트를 처리한 분획물이 세포사멸을 보호하는 효과가 있음을 확인하였다.
<실험예 2> 세포염색법을 이용한 세포생존율의 측정
망막절세포(Retinal Ganglion Cells, RGC)인 RGC-5 세포에 BSO (1-buthionine(S,R)-sulfoximine) plus glutamate로 세포사멸을 유도하였을 때, 실시예 1의 구아두아 앵거스티폴리아(Guadua angustifolia) 추출물이 세포사멸을 억제하는 지 세포염색법을 이용하여 세포생존율을 확인하였다. Hoechst 33342는 막투과성이 있는 dye로 모든 세포를 염색 할 수 있고, PI (propidium Iodide, PI)는 막투과성이 없기 때문에, 살아있는 세포를 염색 시킬 수 없으나 죽어 있는 세포를 염색 할 수 있는 특징이 있다. 이러한 특징을 가지는 dye를 이용하여 세포생존율을 정성적으로 확인하였다.
분리한 화합물이 세포사멸을 보호하는지 알아보기 위하여 Hoechst 33342/propidium iodide (PI) 이중염색을 한 후 세포분석을 시행하였다. 세포를 96-well 배양 접시에 분주하여 부착시킨 후 배지를 1% 우태아혈청(FBS)로 교환하고 화합물을 1시간 동안 전처리를 하였다. 0.5mM 1-buthionine-(S,R)-sulfoximine (BSO)과 10mM L-glutamatmic acid (glutamate)를 24시간 동안 노출 시켰다.
세포를 차가운 D-PBS로 세척하고, 최종농도가 8 μM의 Hoechst 33342와 1.5 μM의 PI를 세포에 첨가하여 15분간 37℃에서 염색을 시킨 후 fluorescence microscope를 사용하여 가시화 하였다.
그 결과는 도 2에 나타나 있다. 세포사멸을 일으키는 BSO+Glu (0.5mM BSO와 10mM 글루타메이트) 군에서 PI positive 한 세포들이 많이 관찰 되었다. 반면, 상기 실시예1에 따른 구아두아 대나무의 헥산 또는 에틸아세테이트 분획물들을 처리한 결과 PI positive 세포들이 농도 의존적으로 감소되는 것을 확인 할 수 있었다.
따라서, 구아두아 대나무 추출물이 세포사멸을 억제하는 효능이 있음을 확인 할 수 있었다.
<실험예 3> 활성산소(Reactive Oxygen Species) 억제 효과 측정
망막절세포(Retinal Ganglion Cells, RGC)인 RGC-5 세포에 활성산소를 증가시켰을 때, 실시예 1의 구아두아 앵거스티폴리아(Guadua angustifolia) 분획물 실시예 2의 화합물들이 활성산소를 억제하는지 DCFH-DA 방법으로 측정하였다.
활성산소종의 생성은 2',7'-dichlorofluorescin diacetate (DCFH-DA, Sigma, USA) 가 세포 내로 들어가 활성산소종에 의하여 형광물질인 dichlorofluorescin(DCF)로 산화되는 것을 이용한 dichlorofluorescin diacetate(DCFH-DA) assay로 조사하였다. 96 well 배양접시에서 5.0X103cells/well의 농도로 세포를 37℃에서 24시간 동안 배양하였다. 1% 우태아혈청(FBS)이 포함된 DMEM 배지로 교환하여 1시간동안 약물을 처리한 후 10 μM의 DCFH-DA를 15분간 처리하였다. 배지를 제거하고 각각의 활성 산소종인 hydrogen peroxide (H2O2), hydroxyl radical (OH.), superoxide (O2 -.)를 유도하기 위하여 1mM H2O2 (H2O2 radical), 1mM H2O2 와 100μM iron(∥) perchlorate hexahydrate(OH. radical), 1mM KO2 (O2 -. radical)를 세포에 30분 간 노출시켜 산화된 dichlorofluorescin (DCF)을 excitation 485 nm, emission 535 nm의 파장에서 형광도를 측정하였다.
실시예 1의 분획물로는 에틸아세테이트 분획물을 50μg/ml의 농도로 사용하였다. 상기 에틸아세테이트 분획물을 RGC-5 세포에 먼저 처리한 후 BSO+Glu (0.5mM BSO와 10mM 글루타메이트) 처리하였다. 그 후 활성산소, H2O2, O2 -., .OH량을 측정하였다. 양성대조군으로서 항산화 활성이 알려진 EGCG를 50mM 사용하였다. 그 결과는 도 3a 내지 3f에 나타내었다. 첫번째 막대는 아무런 처리를 하지 않은 음성 대조군이고, 두번째 막대는 BSO+Glu (0.5mM BSO와 10mM 글루타메이트) 처리군이고, 세번째 막대는 실시예1의 에틸아세테이트 분획을 미리 처리한 후 BSO+Glu (0.5mM BSO와 10mM 글루타메이트)을 처리한 군이다. 도 3a 내지 3f에 나타난 바와 같이, 대나무 분획물 및 대나무 화합물들이 활성산소 소거 효과가 있음을 알 수 있었다.
<실험예 4> 세포사멸관련 단백질인 PARP의 활성 측정
망막절세포(Retinal Ganglion Cells, RGC)인 RGC-5 세포에 BSO (1-buthionine(S,R)-sulfoximine) plus glutamate로 세포사멸을 유도하였을 때, 실시예 1의 구아두아 앵거스티폴리아(Guadua angustifolia) 추출물이 세포사멸관련 단백질인 PARP의 활성에 어떠한 영향을 미치는지를 확인하기 위하여, 웨스턴 블롯 분석 방법을 이용하였다.
DMEM/10% FBS 용액을 망막신경절세포 배양액과 혼합하여 세포의 수를 1X105 cells/ml로 조제한 후에 60 mm dish에 5 ml씩 처리하여 5% CO2/37℃의 조건에서 배양하였다. 세포가 안정화 된 후에 세포가 안정화 된 후를 분리된 화합물을 1시간 동안 전처리 한 후 0.5mM 1-buthionine-(S,R)-sulfoximine (BSO)과 10mM L-glutamatmic acid (glutamate)를 18시간 동안 처리하였다. 차가운 D-PBS (1x, pH 7.4)로 3회 세척 한 후 세포를 수득을 하였다. 수득한 세포를 cell lysis buffer [1M Tris pH 7.4, 2M NaCl, 1M EDTA, 10% NP40, protease inhibitor cocktail (Sigma, St. Louis, MO, U.S.A.)]를 가하여 10분 동안 얼음에 박아놓은 다음 소니케이션을 하고, 4℃, 10,000g 에서 30분 동안 원심분리하여 단백질을 추출하였다. 단백질의 농도를 Bio-Rad Protein 분석방법을 사용하여 정량하고 4x sample buffer [200mM Tris-HCl (pH 6.8), 40% glycerol, 8% SDS, 400mM DTT, 0.4% bromophenol blue]와 1:4의 비율로 섞은 후, 5분 동안 끓여 10% 또는 12% polyacrylamid gel을 사용하여 SDS-PAGE를 실행하였다. 전기영동 후, PAGE gel의 단백질을 polyvinylidene difluoride (PVDF) 멤브레인 (Hybond-P; Amersham Biosciences, GE Healthcare, U.K)에 이동시키고 Ponseau S (Sigma, St. Louis, USA)로 염색하여 동량의 단백질들이 전기영동 되었는지, transfer가 잘 되었는지 확인하였다. 멤브레인을 PBST buffer (8g/L NaCl, 0.2g/L KCl, 1.44g/L NaH2PO4, 0.1% Tween-20)로 세척하고, PBST buffer에 녹인 5% skim milk로 1시간 30분 동안 실온에서 blocking한 뒤, 1:500 희석 배수의 rabbit anti-PARP (catalog no. 9542; Cell Signaling)로 1시간 동안 실온에서 반응시킨 후 4℃에서 밤새 반응시켰다. 일차항체 처리 후, 멤브레인을 15분씩 3회 세척 후 1:3,000 희석 배수의 이차항체(Santa Cruz Biotechnology, CA)로 2시간 동안 반응시켰다. 발현되는 단백질의 양은 Las-4000 image reader와 Multi Gauge 3.1 software(Fuji Photo Film, Japan)을 사용하여 측정하였다.
세포사멸이 일어나게 되면 PARP의 형태가 잘려져 cleaved PARP 형태로 나타나게 되는데, BSO+Glu(0.5mM BSO와 10mM 글루타메이트)를 처리한 결과 cleaved PARP의 활성이 증가한 것이 관찰 되었다. 실시예1의 구아두아 대나무의 헥산 분획물 10 μg/mL에서 cleaved PARP의 활성이 억제되는 것이 확인되었다. 결과는 도 4에 나타나 있다.
<실험예 5>
Guadua Angustifolia
추출물의 시신경 압박손상모델에서 흰쥐의 망막퇴화 보호효과
상기 <실시예 1>에서 추출한 메탄올 추출물의 시신경 압박손상모델에서 흰쥐의 망막퇴화 보호효과를 확인하였다. 먼저 흰쥐인 ICR 마우스 (수컷, 15-18g, 6주령)를 준비하였다. 2% 럼푼 주사액과 졸레틸을 혼합하여 상기 흰쥐에 1ml/kg 근육 주사 하여 마취시킨 후 상이측 결막을 열고, 결막조직을 박리하여 안구후부 직근들 사이의 시신경을 노출시켰다. Forceps를 이용하여 쥐 안구 후부로부터 2 mm 떨어진 위치의 시신경에 5초 동안 압박 손상을 주었다. 실시예 1의 Guadua angustifolia 추출물은 4 μg/eye 용량으로 안구내 유리체 투여를 1회 시행하였고 대조군에서는 같은 용량의 0.01 M PBS를 주입하였다. 시신경 손상 6일 후, 다시 쥐를 마취시킨 후 두피를 절개하였다. 시신경 세포 염색을 위해 시신경과 연결되어 있는 뇌의 상구부위에 수술용 드릴을 이용하여 타공하고 3% FluoroGold를 주입하였다. 절개부위를 봉합하고, 항생연고를 발라주어 감염을 예방하였다. 시신경 손상 12일 후 안구를 적출하여 4% parafromaldehyde 에 4시간 동안 고정하였다. 고정한 안구는 맥락막으로 부터 망막을 분리하여 4개의 방사상 절개를 하고, 슬라이드 위에 클로버 잎 모양으로 마운트하였다. 각 실험군 슬라이드는 형광현미경을 이용하여 형광을 띄는 시신경 세포를 확인하고 40배, 200배 촬영 하였다.
그 결과, 시신경압박은 세포사멸을 유도하여 세포생존율이 감소하였으며, Guadua angustifolia 추출물을 투여하였을 때, 유의적으로 망막세포의 사멸을 보호하여 세포생존율을 증가시킴을 확인하였다 (도 5).
Claims (21)
- 구아두아 앵거스티폴리아(Guada angustifolia) 추출물을 유효성분으로 포함하는, 산화적 스트레스로부터 망막 신경 세포를 보호하기 위한 망막 신경 세포 보호용 식품 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 구아두아 앵거스티폴리아(Guada angustifolia) 추출물은 망막 신경 세포의 허혈성 손상을 억제 또는 개선하는, 식품 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 구아두아 앵거스티폴리아(Guada angustifolia) 추출물은 망막 신경 세포의 세포자살(apoptosis)을 억제하는, 식품 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 식품 조성물은 산화적 스트레스에 의한 망막 신경 세포 손상 질환을 예방 또는 개선하는 식품 조성물.
- 제4항에 있어서, 상기 질환은 연령 관련 황반 변성 또는 녹내장인 식품 조성물.
- 구아두아 앵거스티폴리아(Guada angustifolia) 추출물을 유효성분으로 포함하는 산화적 스트레스에 의한 망막 신경 세포 손상 질환을 예방, 개선 또는 치료하기 위한 약학 조성물.
- 제6항에 있어서, 상기 구아두아 앵거스티폴리아(Guada angustifolia) 추출물은 망막 신경 세포의 허혈성 손상을 억제 또는 개선하는, 약학 조성물.
- 제6항에 있어서, 상기 구아두아 앵거스티폴리아(Guada angustifolia) 추출물은 망막 신경 세포의 세포자살(apoptosis)을 억제하는, 약학 조성물.
- 제6항에 있어서, 상기 질환은 연령 관련 황반 변성 또는 녹내장인 약학 조성물.
- 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 구아두아 앵거스티폴리아(Guada angustifolia) 추출물은 구아두아 앵거스티폴리아(Guada angustifolia)의 지상부의 추출물인 조성물.
- 제10항에 있어서, 상기 구아두아 앵거스티폴리아(Guada angustifolia) 추출물은 구아두아 앵거스티폴리아(Guada angustifolia)의 잎의 추출물인 조성물.
- 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 구아두아 앵거스티폴리아(Guada angustifolia) 추출물은 물, C1-6 저급 알코올, 아세톤 또는 이들의 혼합 용매로 추출한 추출물인 조성물.
- 제12항에 있어서, 상기 구아두아 앵거스티폴리아(Guada angustifolia) 추출물은 메탄올 또는 에탄올 추출물인 조성물.
- 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 구아두아 앵거스티폴리아(Guada angustifolia) 추출물은 메탄올 또는 에탄올로 추출하여 얻어진 추출물을 물에 현탁시킨 후, n-헥산, 염화 메틸렌, 에틸아세테이트, n-부탄올 및 물로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 분획용매로 분획한 분획물인 조성물.
- 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 구아두아 앵거스티폴리아(Guada angustifolia) 추출물은 0.004 내지 40mg/kg/일의 투여량으로 투여되는 조성물.
- 제6항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 국소 투여용 제형인 조성물.
- 제16항에 있어서, 상기 조성물은 안약 제형인 조성물.
- 제16항에 있어서, 상기 조성물은 구아두아 앵거스티폴리아(Guada angustifolia) 추출물의 동결건조물을 용매에 용해시킨 용액인 조성물.
- 제18항에 있어서, 상기 용매는 디메틸설폭사이드(Dimethyl sulfoxide; DMSO)인 조성물.
- 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 구아두아 앵거스티폴리아(Guada angustifolia) 추출물은 조성물 전체 중량을 기준으로 5 내지 500μg/ml의 농도로 조성물에 포함된 조성물.
- 제20항에 있어서, 구아두아 앵거스티폴리아(Guada angustifolia) 추출물은 조성물 전체 중량을 기준으로 10 내지 250μg/ml의 농도로 조성물에 포함된 조성물.
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