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KR101766064B1 - 내부 전반사 형광 현미경 - Google Patents

내부 전반사 형광 현미경 Download PDF

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KR101766064B1
KR101766064B1 KR1020150168314A KR20150168314A KR101766064B1 KR 101766064 B1 KR101766064 B1 KR 101766064B1 KR 1020150168314 A KR1020150168314 A KR 1020150168314A KR 20150168314 A KR20150168314 A KR 20150168314A KR 101766064 B1 KR101766064 B1 KR 101766064B1
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excitation light
excitation
solid immersion
immersion lens
light emitted
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KR1020150168314A
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박노철
문형배
이원섭
임건
최국종
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연세대학교 산학협력단
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Abstract

본 발명은 형광 현미경을 개시한다. 본 발명의 일 실시예에 의한 형광 현미경은, 형광체를 포함하는 시료를 촬영하는 형광 현미경에 있어서, 상기 형광체가 형광을 방출하도록 여기하는 여기 광을 방출하는 여기광원; 상기 여기광원에서 방출되는 여기 광에 의하여 여기된 형광체를 탈여기시키는 여기감소 광을 방출하는 여기감소광원; 상기 여기광원에서 방출된 빛과 상기 여기감소광원에서 방출되는 빛을 서로 중첩시키고, 중첩된 빛을 시료를 향하게 하는 광학바디부; 및 상기 광학바디부에서 배출된 빛이 입사되고, 상기 광학바디부에서 배출된 빛을 시료를 향하도록 굴절시키는 고체 침지렌즈; 를 포함하고, 상기 고체 침지렌즈에 입사된 빛은 상기 고체 침지렌즈의 저면에서 전반사할 수 있다.

Description

내부 전반사 형광 현미경{TOTAL INTERNAL REFLECTION FLUORESCENCE MICROSCOPY}
본 발명은 내부 전반사 형광 현미경에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 고굴절 고체 침지렌즈(Solid Immersion Lens, SIL)를 이용하며, 형광체를 여기시키는 여기광원과 형광체를 탈여기시키는 여기감소광원을 대물렌즈에 중첩되게 입사시키고, 여기광원에 의해 고체 침지렌즈에서 발생하는 전반사 각도를 조절하는 애퍼처(aperture)를 포함하는 내부 전반사 형광 현미경(Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy, TIRF)을 구성하며, 여기감소광원을 통하여 유도방출억제(Stimulated Emission Depletion, STED) 현상을 일으켜서 수평 및 수직 방향에서 회절 한계를 능가하는 해상도를 획득할 수 있는 내부 전반사 형광 현미경에 관한 것이다.
종래에는 바이오 샘플과 같은 시료를 이미징하기 위하여 광학 현미경이 이용되었다. 그러나, 종래의 광학 현미경(도 1(a) 참조)은 수직 방향의 해상도가 낮은 문제점이 있었다.
내부 전반사 형광 현미경(Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy, TIRF)은 전반사에 의해 발생하는 감쇄파(Evanescent)를 이용하는 현미경이다(도 1(b) 참조). 상기 내부 전반사 형광 현미경은 고굴절률 매체와 저굴절률 매체가 접하는 계면에 임계각 이상인 입사각에서 빛을 입사시켜서 전반사시킬 때 발생하는 감쇄파(evanescent wave)에 의한 형광 이미징 방식이다.
일반적으로, 내부 전반사 형광 현미경은 오일 침지렌즈(Oil Immersion Lens)를 이용하며, 이 경우 상기 감쇄파의 투과 깊이는 100nm이하로서, 일반적인 광학계의 투과 깊이보다 훨씬 작은 영역이므로 보다 높은 수직방향의 해상도를 획득할 수 있다.
특히, 내부 전반사 형광 현미경은 감쇄파에 의한 형광 이미지 방식이므로 시료의 표면을 이미징하는 데 용이한 장점이 있다. 따라서, 높은 수직방향의 해상도와 표면 이미징 특성을 이용하여 막역학(membrane dynmmics), 단분자 이미징(single molecule imaging) 등 많은 연구에 활용될 수 있다.
그러나, 이러한 전반사 형광 현미경은 수직방향의 해상도를 증가시킬 수 있었으나, 수평방향의 해상도는 회절 한계에 의해 제한되는 문제점이 있었다. 특히, 침지 물질의 굴절률이 제한되는 오일 침지렌즈의 특성상 렌즈의 개구수(NA, Numerical Aperture)가 1.49로 제한되므로, 수직방향의 해상도에 비해 수평방향의 해상도는 다소 낮은 문제점이 있었다.
종래의 초고분해능 기술 중 하나인 유도방출억제(Stimulated emission depletion, STED) 현미경(도 2 및 도 3 참조)은 관측하려는 시료에 서로 모드가 다른 두 빛을 중첩하여 조사하는 방식이다. 첫 번째 빛을 조사하면 시료에서 에너지를 흡수하여 형광이 발하는데, 중심부에 나노미터 크기로 빈 도넛 모양의 두 번째 빛을 조사하여 첫번째 빛과 중첩시키면 중심부의 공간을 제외한 다른 곳의 형광은 억제되어 중심부 공간의 형광만 관측된다. 이러한 방식으로 빛을 미세하게 이동하여 시료 전반에 조사하여 나노미터 단위의 영상을 얻을 수 있고, 이렇게 만들어진 수많은 관측 영상을 하나로 합하면 최종적으로 0.2μm보다 더 작은 해상도를 구현할 수 있다.
본 발명은 고체 침지렌즈(SIL)과 유도방출억제(STED) 기술을 내부 전반사 형광 현미경에 적용하여 수평 방향 및 수직 방향으로 광학 회절 한계를 훨씬 능가하는 해상도를 갖는 내부 전반사 형광 현미경을 제공하고자 한다.
본 발명의 일 실시예에 의한 형광 현미경은, 형광체를 포함하는 시료를 촬영하는 형광 현미경에 있어서, 상기 형광체가 형광을 방출하도록 여기하는 여기 광을 방출하는 여기광원; 상기 여기광원에서 방출되는 여기 광에 의하여 여기된 형광체를 탈여기시키는 여기감소 광을 방출하는 여기감소광원; 상기 여기광원에서 방출된 빛과 상기 여기감소광원에서 방출되는 빛을 서로 중첩시키고, 중첩된 빛을 시료를 향하게 하는 광학바디부; 및 상기 광학바디부에서 배출된 빛이 입사되고, 상기 광학바디부에서 배출된 빛을 시료를 향하도록 굴절시키는 고체 침지렌즈;를 포함하고, 상기 고체 침지렌즈에 입사된 빛은 상기 고체 침지렌즈의 저면에서 전반사될 수 있다.
또한, 상기 여기광원에서 방출되는 여기 광의 일부분을 가리는 애퍼처를 더 포함할 수 있다.
또한, 상기 애퍼처는 상기 여기광원에서 방출되는 여기 광의 일부분을 차단하여, 상기 고체 침지렌즈에 입사되는 여기 광 가운데 상기 고체 침지렌즈의 저면에서 전반사되지 않는 영역의 빛을 차단할 수 있다.
또한, 상기 애퍼처는 상기 여기광원에서 방출되는 여기 광의 일부분을 차단하여, 상기 고체 침지렌즈에 입사되는 여기 광 가운데 임계각 이하의 영역을 차단할 수 있다.
또한, 상기 애퍼처는 투명한 재질로 형성되어 상기 여기광원에서 배출되는 여기 광을 통과시키는 투과부와, 불투명한 재질로 형성되어 상기 여기광원에서 배출되는 여기 광을 차단하는 차단부를 포함하며, 상기 고체 침지렌즈로 입사되는 상기 여기 광의 입사 각도가 임계각보다 크도록 상기 투과부 및 상기 차단부가 배치될 수 있다.
또한, 상기 차단부는 상기 여기광원에서 배출되는 여기 광의 중앙을 차단하는 원형으로 형성되고, 상기 투과부는 상기 차단부 주변에 링 형상으로 형성될 수 있다.
또한, 상기 시료의 형광체의 형광 빛을 감지하는 검출부를 더 포함할 수 있다.
또한, 상기 광학바디부는, 상기 여기광원에서 방출되는 여기 광을 시료를 향하여 전달시키는 여기광 전달부; 및 상기 여기감소광원에서 방출된 여기감소 광을 시료를 향하여 전달시키는 여기감소광 전달부;를 포함할 수 있다.
또한, 상기 여기광 전달부 및 상기 여기감소광 전달부는 여기 광 또는 여기감소 광은 반사하고, 시료의 형광물질에서 방출되는 형광 빛은 통과시키는 것을 이색성 거울 또는 빔 스플리터일 수 있다.
또한, 상기 광학바디부의 하부에는 상기 광학바디부에서 배출된 빛을 상기 고체 침지렌즈를 향하여 입사시키는 대물렌즈가 구비될 수 있다.
또한, 상기 고체 침지렌즈를 향하여 입사되는 상기 여기 광이 임계각보다 큰 각도로 입사되면 상기 고체 침지렌즈의 저면에서 내부 전반사가 발생되고, 상기 고체 침지렌즈에서 시료를 향하여 감쇄파가 발생하며, 상기 감쇄파에 의하여 발생되는 형광체의 형광 빛을 감지할 수 있다.
또한, 상기 여기감소 광은, 상기 여기 광의 중심부 영역을 제외한 주변 영역에서 상기 여기 광과 중첩되도록 도넛 형상으로 파면이 형성되고, 상기 형광체를 여기하는 상기 여기 광을 탈여기시키는 유도방출억제(STED) 현상을 일으켜 수평 분해능을 증가시킬 수 있다.
또한, 상기 고체 침지렌즈는 반구 형상으로 형성되고, 상기 대물렌즈에서 배출되는 빛은 상기 고체 침지렌즈의 표면에서 수직 방향으로 입사되어 집광 효율이 증가될 수 있다.
또한, 상기 고체 침지렌즈 또는 상기 대물렌즈의 표면에는 상기 광학바디부에서 배출되는 빛을 굴절시키는 복제렌즈가 더 구비될 수 있다.
또한, 상기 고체 침지렌즈의 저면은 중심부에서 가장자리로 갈수록 상향 경사지게 형성되는 콘 형상으로 형성될 수 있다.
본 발명의 다른 실시예에 의하여, 형광체를 포함하는 시료를 촬영하는 형광 현미경에 있어서, 상기 형광체를 여기하는 제1 파장으로 여기 광을 방출하는 여기광원; 상기 여기광원에서 방출되는 여기 광에 의하여 여기된 상기 형광체를 탈여기시키는 제2 파장의 여기감소 광을 방출하는 여기감소광원; 상기 여기광원에서 방출된 빛과 상기 여기감소광원에서 방출되는 빛을 서로 중첩시키고, 중첩된 빛을 시료로 향하게 하는 광학바디부; 상기 광학바디부에서 배출된 빛이 유입되고, 상기 광학바디부에서 배출된 빛을 시료를 향하도록 굴절시키는 고체 침지렌즈; 상기 여기광원의 적어도 일부를 가려서 상기 여기광원에서 방출되는 빛의 양을 조절하고, 상기 광학바디부에서 배출된 빛이 상기 고체 침지렌즈의 저면에서 내부 전반사가 일어나도록 하는 애퍼처; 및 상기 광학바디부에서 배출된 빛을 받은 상기 형광체의 형광반응을 수광하는 검출기;를 포함할 수 있다.
또한, 상기 애퍼처는 상기 여기광원에서 방출되는 여기 광의 일부분을 차단하여, 상기 고체 침지렌즈에 입사되는 여기 광 가운데 상기 고체 침지렌즈의 저면에서 전반사되지 않는 영역의 빛을 차단할 수 있다.
또한, 상기 애퍼처는 상기 여기광원에서 방출되는 여기 광의 일부분을 차단하여, 상기 고체 침지렌즈에 입사되는 여기 광 가운데 임계각 이하의 영역을 차단할 수 있다.
또한, 상기 애퍼처는 투명한 재질로 형성되어 상기 여기광원에서 배출되는 여기 광을 통과시키는 투과부와, 불투명한 재질로 형성되어 상기 여기광원에서 배출되는 여기 광을 차단하는 차단부를 포함하며, 상기 고체 침지렌즈로 입사되는 상기 여기 광의 입사 각도가 임계각보다 크도록 상기 투과부 및 상기 차단부가 배치될 수 있다.
또한, 상기 차단부는 상기 여기광원에서 배출되는 여기 광의 중앙을 차단하는 원형으로 형성되고, 상기 투과부는 상기 차단부 주변에 링 형상으로 형성될 수 있다.
본 발명에 의하면, 종래의 광학 현미경의 회절 한계를 넘는 수평 및 수직 방향의 해상도를 획득할 수 있다.
또한, 내부 전반사에 의한 감쇄파가 매우 얇은 영역에서 발생하고, 그 세기가 진행거리에 따라 급격하게 감소하므로, 형광체가 염색된 시료를 국소적으로 관찰이 가능하며, 특히 세포의 표면과 같이 매우 얇은 부분을 형광반응을 통해 관찰할 수 있다.
또한, 일반적인 TIRF 현미경에 비하여 감쇄파의 두께가 매우 작기 때문에 이미지의 대비(image contrast) 효과를 높일 수 있다.
또한, 고체 침지렌즈(SIL)를 이용하여 종래의 광학 현미경에 비하여 NA가 높아 자체적으로 높은 해상도를 획득할 수 있다.
도 1(a)는 종래의 광학 현미경을 이용하여 시료의 이미지를 획득하는 원리를 개략적으로 나타내는 도면이다.
도 1(b)는 종래의 전반사 형광 현미경을 이용하여 시료의 이미지를 획득하는 원리를 개략적으로 나타내는 도면이다.
도 2는 종래의 유도방출억제(STED) 현상을 이용한 초고분해능 현미경을 이용하여 시료의 이미지를 획득하는 원리를 개략적으로 나타내는 도면이다.
도 3은 종래의 유도방출억제(STED) 현상을 이용한 초고분해능 현미경을 이용하여 서로 다른 파장을 갖는 두 빛을 중첩시키는 원리를 개략적으로 나타내는 도면이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 의한 형광 현미경을 도시하는 도면이다.
도 5(a)는 본 발명의 일 실시예에 의한 형광 현미경의 대물렌즈에서 고체 침지렌즈로 입사되는 여기 광의 경로를 도시하는 도면이다.
도 5(b)는 본 발명의 일 실시예에 의한 형광 현미경의 고체 침지렌즈로 입사되는 여기 광의 임계각을 도시하는 도면이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 의한 형광 현미경의 고체 침지렌즈 저면에서 전반사가 발생되는 형태를 도시하는 도면이다.
도 7(a)는 본 발명의 일 실시예에 의한 형광 현미경의 고체 침지렌즈의 구형 수차를 도시하는 도면이다.
도 7(b)는 본 발명의 일 실시예에 의한 형광 현미경의 고체 침지렌즈가 반구 형상인 것을 도시하는 도면이다.
도 7(c)는 본 발명의 일 실시예에 의한 형광 현미경의 고체 침지렌즈가 슈퍼-반구(super-hemisphere) 형상인 것을 도시하는 도면이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 의한 형광 현미경의 고체 침지렌즈의 저면 형상을 도시하는 도면이다.
도 9(a)는 본 발명의 일 실시예에 의한 형광 현미경의 고체 침지렌즈의 저면을 평면으로 가공한 형상을 도시하는 도면이다.
도 9(b)는 본 발명의 일 실시예에 의한 형광 현미경의 고체 침지렌즈의 저면 중앙부에 돌출부를 가공한 형상을 도시하는 도면이다.
도 9(c)는 본 발명의 일 실시예에 의한 형광 현미경의 고체 침지렌즈의 저면을 타원 형상으로 가공한 형상을 도시하는 도면이다.
도 10(a)는 본 발명의 일 실시예에 의한 형광 현미경의 애퍼처를 도시하는 단면도이다.
도 10(b) 및 10(c)는 본 발명의 일 실시예에 의한 형광 현미경의 애퍼처의 다른 형상을 도시하는 단면도이다.
도 11(a)는 본 발명의 일 실시예에 의한 형광 현미경의 여기광원이 애퍼처를 통과하는 형상을 도시하는 측면도이다.
도 11(b)는 본 발명의 일 실시예에 의한 형광 현미경의 여기광원이 대물렌즈로 입사되는 형태를 도시하는 단면도이다.
도 12는 본 발명의 일 실시예에 의한 형광 현미경의 NA 증가에 따른 임계각의 감소 및 여기 광의 광량 증가를 도시하는 도면이다.
도 13(a)는 본 발명의 다른 실시예에 의한 형광 현미경의 고체 침지렌즈 표면에 복제 침지렌즈가 구비되는 형태를 도시하는 단면도이다.
도 13(b)는 본 발명의 다른 실시예에 의한 형광 현미경의 구형 대물렌즈 및 고체 침지렌즈에 각각 복제 침지렌즈가 구비되는 형태를 도시하는 도면이다.
도 14(a)는 본 발명의 다른 실시예에 의한 형광 현미경의 고체 침지렌즈가 타원 형상인 것을 도시하는 도면이다.
도 14(b)는 본 발명의 다른 실시예에 의한 형광 현미경의 고체 침지렌즈의 표면에 복제 침지렌즈가 구비되어 고체 침지렌즈 저면에 빛이 포커싱되는 것을 도시하는 도면이다.
도 15는 본 발명의 또 다른 실시예에 의한 형광 현미경의 고체 침지렌즈 대신에 고체 침지 거울이 구비되는 것을 도시하는 도면이다.
도 16(a)는 본 발명의 일 실시예에 의한 형광 현미경의 NA가 1.4일 때 유도방출억제(STED) 현상에 의한 여기 광의 점상 강도 분포(PSF)를 도시하는 도면이다.
도 16(b)는 본 발명의 일 실시예에 의한 형광 현미경의 NA가 1.6일 때 유도방출억제(STED) 현상에 의한 여기 광의 점상 강도 분포(PSF)를 도시하는 도면이다.
도 16(c)는 본 발명의 일 실시예에 의한 형광 현미경의 NA가 1.84일 때 유도방출억제(STED) 현상에 의한 여기 광의 점상 강도 분포(PSF)를 도시하는 도면이다.
도 16(d)는 본 발명의 일 실시예에 의한 형광 현미경의 NA가 2.0일 때 유도방출억제(STED) 현상에 의한 여기 광의 점상 강도 분포(PSF)를 도시하는 도면이다.
도 17은 본 발명의 일 실시예에 의한 형광 현미경의 검출부가 고체 침지렌즈의 반대편에 구비되는 형태를 도시하는 도면이다.
이하에서는 도면을 참조하여 본 발명의 구체적인 실시예를 상세하게 설명한다. 다만, 본 발명의 사상이 그와 같은 실시예에 제한되지 않고, 본 발명의 사상은 실시예를 이루는 구성요소의 부가, 변경 및 삭제 등에 의해서 다르게 제안될 수 있을 것이나, 이 또한 발명의 사상에 포함되는 것이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 의한 형광 현미경을 도시하는 도면이고, 도 5(a)는 본 발명의 일 실시예에 의한 형광 현미경의 대물렌즈에서 고체 침지렌즈로 입사되는 여기 광의 경로를 도시하는 도면이며, 도 5(b)는 본 발명의 일 실시예에 의한 형광 현미경의 고체 침지렌즈로 입사되는 여기 광의 임계각을 도시하는 도면이고, 도 6은 본 발명의 일 실시예에 의한 형광 현미경의 고체 침지렌즈 저면에서 전반사가 발생되는 형태를 도시하는 도면이다.
도 4 내지 도 6을 참조하면, 본 발명의 일 실시예에 의한 형광 현미경(1)은 여기광원(10)과, 여기감소광원(20), 광학바디부(30), 고체 침지렌즈(40) 및 애퍼처(aperture, 50)를 포함할 수 있다.
여기광원(Excitation Source, 10)은 시료(S)에 포함된 형광체를 여기시키는 여기 광(Excitation light)을 방출할 수 있다.
여기감소광원(Deplaetion Source, 20)은 여기광원(10)에서 방출되는 여기 광에 의하여 여기된 상기 형광체를 탈여기시키는 여기감소 광(Deplaetion light)을 방출할 수 있다.
여기광원(10)에 방출되는 여기 광이 제1 파장이라면, 여기감소광원(20)은 제2 파장일 수 있고, 제1 파장은 제2 파장에 비하여 짧은 파장일 수 있다.
여기감소 광이 지나는 경로 상에는 위상판(21)이 구비될 수 있다. 위상판(21)은 여기감소 광을 도넛 형상으로 만드는 역할을 할 수 있다.
여기광원(10)과 여기감소광원(20)이 펄스 레이저인 경우에는, 두 빔의 시간 지연(time-delay), 펄스 폭(pulse-width) 조건을 맞추기 위한 장치가 추가될 수 있으며, CW 레이저를 이용할 경우에는 빔을 평행하게 만드는 콜리메이션(collimation) 장치와 빔 확대(beam expansion)장치가 추가될 수 있다.
또한, 도 4에서는 여기광원(10)이 대물렌즈(60)와 가까운 구조로 되어 있으나, 이에 한정되지 않으며 여기광원(10)과 여기감소광원(20)의 위치는 서로 바뀔 수 있다.
광학바디부(30)는 여기광원(10)에서 방출된 여기 광과 여기감소광원(20)에서 방출되는 여기감소 광을 서로 중첩시킬 수 있고, 중첩된 빛을 시료로 향하도록 하는 역할을 할 수 있다.
광학바디부(30)와 고체 침지렌즈(40) 사이에는 광학바디부(30)에서 배출된 빛을 굴절시켜서 고체 침지렌즈(40)를 향하여 입사시키는 대물렌즈(60)가 구비될 수 있다.
광학바디부(30)에는 여기광원(10)에서 방출된 여기 광을 시료를 향하여 전달시키는 여기광 전달부(31)와, 여기감소광원(20)에서 방출된 여기감소 광을 시료를 향하여 전달시키는 여기감소광 전달부(32)를 포함할 수 있다.
여기광 전달부(31) 및 여기감소광 전달부(32)는 여기 광 또는 여기감소 광은 반사하고, 시료의 형광물질에서 방출되는 형광 빛은 통과시키는 이색 거울성 거울 또는 빔 스플리터로 구비될 수 있다.
보다 상세히, 여기광 전달부(31) 및 여기감소광 전달부(32)는 기 설정된 각도로 기울어져 배치될 수 있고, 여기 광 및 여기감소 광을 반사시켜서 대물렌즈(60)로 향하게 하는 역할을 할 수 있고, 시료에서 발생하는 형광 빛은 통과하여 시료에서 발생하는 형광 빛이 검출부(70)로 유입되도록 할 수 있다.
고체 침지렌즈(40)는 광학바디부(30)에서 배출되는 빛이 유입될 수 있고, 광학바디부(30)에서 배출된 빛을 시료를 향하도록 굴절시키는 역할을 할 수 있다. 광학바디부(30)에서 배출되는 빛은 여기 광과 여기감소 광이 중첩된 형태일 수 있다.
광학바디부(30)에서 배출되어 대물렌즈(60)로 입사되는 빛이 굴절되어 고체 침지렌즈(40)로 입사될 수 있고, 빛의 최대 입사 각도는 θm으로 나타낼 수 있다(도 5(a) 참조). 이 때, θm(m: Marginal ray)은 대물렌즈(60)로 입사되는 빛의 가장자리로부터 굴절되는 빛의 입사 각도를 의미한다.
대물렌즈(60)에서 고체 침지렌즈(40)로 입사되는 빛은 임계각(θc) 이하의 영역과, 임계각(θc)보다 큰 각도로 입사되는 영역으로 구분될 수 있다(도 5(b) 참조). 빛이 임계각(θc) 이하의 영역으로 입사되는 경우에는, 원거리장(far-field) 영역에서의 빛의 투과가 발생할 수 있다. 상기 원거리장 영역에서는 감쇄파(evanescent) 없이 정투과가 발생할 수 있다.
또한, 빛이 임계각(θc) 이상의 영역으로 입사되는 경우에는, 근접장(near-field) 영역에서의 빛의 투과가 발생할 수 있다. 상기 근접장 영역에서는 감쇄파 형성에 의한 결합 투과(coupled transmission)가 발생할 수 있다.
다시 말해, 대물렌즈(60)에서 굴절되어 고체 침지렌즈(40)로 입사되는 빛의 입사각(θi)이 임계각(θc) 이상의 영역으로 입사되면, 고체 침지렌즈(40)의 저면에서 전반사가 발생되며, 전반사에 의해 생성되는 상기 근접장 영역에서의 감쇄파(WE) 형성에 의하여 이에 반응하는 형광체의 형광 반응을 획득할 수 있다(도 6 참조). 형광체의 형광반응을 수광하는 검출부(70)가 더 구비될 수 있다.
도 7(a)는 본 발명의 일 실시예에 의한 형광 현미경의 고체 침지렌즈의 구형 수차를 도시하는 도면이고, 도 7(b)는 본 발명의 일 실시예에 의한 형광 현미경의 고체 침지렌즈가 반구 형상인 것을 도시하는 도면이며, 도 7(c)는 본 발명의 일 실시예에 의한 형광 현미경의 고체 침지렌즈가 슈퍼-반구(super-hemisphere) 형상인 것을 도시하는 도면이고, 도 8은 본 발명의 일 실시예에 의한 형광 현미경의 고체 침지렌즈의 저면 형상을 도시하는 도면이며, 도 9(a)는 본 발명의 일 실시예에 의한 형광 현미경의 고체 침지렌즈의 저면을 평면으로 가공한 형상을 도시하는 도면이고, 도 9(b)는 본 발명의 일 실시예에 의한 형광 현미경의 고체 침지렌즈의 저면 중앙부에 돌출부를 가공한 형상을 도시하는 도면이며, 도 9(c)는 본 발명의 일 실시예에 의한 형광 현미경의 고체 침지렌즈의 저면을 타원 형상으로 가공한 형상을 도시하는 도면이다.
도 7 내지 도 9를 참조하면, 본 발명의 일 실시예에 의한 형광 현미경(1)의 고체 침지렌즈(40)는 반구 형상 또는 반구와 구 사이의 형상인 슈퍼-반구(super-hemisphere) 형상으로 형성될 수 있다. 다만, 고체 침지렌즈(40)의 형상은 구형을 기반으로 제작될 때 최적의 디자인임을 확인한 것이며, 고체 침지렌즈(40)의 형상은 도면에 도시된 바와 같이 한정되지 않고 두께에 대한 민감도가 낮은 다양한 형태로 제작될 수 있다.
고체 침지렌즈(40)가 반구 형상으로 형성되는 경우(도 7(b) 참조)에는, 반경(R)과 초점(F0)으로부터의 높이(L)가 같고(L=R) 이 경우의 구면수차(L/R)가 가장 작은 것을 확인할 수 있다(도 7(a) 참조). 또한, 고체 침지렌즈(40)가 슈퍼-반구 형상으로 형성되는 경우(도 7(c) 참조), 반경(R)과 초점(F0)으로부터의 높이(L)은 L=R+R/ns일 때 구면수차(L/R)가 가장 작은 것을 확인할 수 있다(도 7(a) 참조).
구형을 기반으로 제작되는 고체 침지렌즈(40)는, 고체 침지렌즈(40)의 저면에 빛이 포커싱 될 때, 구면수차(L/R)가 발생할 수 있으므로 고체 침지렌즈(40)의 두께를 정확하게 설정해야 한다. 본 발명에 의한 고체 침지렌즈(40)는 반구 형상 및 슈퍼-반구 형상 모두 구면수차가 가장 작아 적합한 형태일 수 있으나, 슈퍼-반구 형상의 경우에는 고체 침지렌즈(40)의 두께(W)에 대한 민감도가 높아 반구 형상이 보다 더 적합한 형태일 수 있다.
고체 침지렌즈(40)가 반구 형상으로 형성되는 경우에는, 대물렌즈(60)에서 굴절되어 고체 침지렌즈(40)로 빛이 입사되면, 고체 침지렌즈(40)의 표면에서 수직 방향으로 입사되어 NA가 증가될 수 있다. 이 때, NA는 빛의 회절의 고유 성질로서 굴절률과 빛의 최대 입사 각도를 이용하여 표시될 수 있다(식 (1) 참조).
NA = nsinθ (1)
고체 침지렌즈(40)와 시료(S) 사이에는 미세 간극이 형성될 수 있고, 고체 침지렌즈(40)의 저면의 중앙부는 시료(S)와 평행한 면이 형성될 수 있다. 또한, 상기 중앙부를 제외한 주변부는, 주변부 내측에서 주변부 외측으로 갈수록 시료(S)와 멀어지도록 기울어진 면이 형성될 수 있다(도 8 참조). 일례로, 상기 중앙부의 직경은 40μm일 수 있고, 미세 간극은 약 5~20nm일 수 있다.
보다 상세히, 고체 침지렌즈(40)의 저면은 상기 중앙부를 제외한 나머지 주변부가 시료(S)로부터 소정 각도(θ)만큼 틸팅된 형태로 가공될 수 있다. 일례로, 상기 고체 침지렌즈(40)와 시료(S)가 20nm 이하의 미세 간극을 유지하기 위한 최대 각도는 0.06 deg. 이하의 범위일 수 있다(식 (2) 참조).
θ=tan-1[d/DSIL. tip/2]]
=tan-1(0.02/20)
≤±0.06 deg. (2)
고체 침지렌즈(40)는 기본적으로 근접장 영역에서 작동되기 때문에 시료(S)와의 거리를 수십 nm 이하로 접근 또는 접촉시켜야 한다. 따라서, 고체 침지렌즈(40)의 최적의 형태인 반구 형상의 저면의 중앙부를 제외하고 주변부를 콘(cone) 형상으로 가공하여 사용할 수 있다.
다만, 고체 침지렌즈(40)의 형상은 이에 한정되지 않으며, 도 9(a)~9(c)에 도시된 바와 같이 다양한 형상으로 가공될 수 있다.
도 10(a)는 본 발명의 일 실시예에 의한 형광 현미경의 애퍼처를 도시하는 단면도이고, 도 10(b) 및 도 10(c)는 본 발명의 일 실시예에 의한 형광 현미경의 애퍼처의 다른 형상을 도시하는 단면도이며, 도 11(a)는 본 발명의 일 실시예에 의한 형광 현미경의 여기광원이 애퍼처를 통과하는 형상을 도시하는 측면도이고, 도 11(b)는 본 발명의 일 실시예에 의한 형광 현미경의 여기광원이 대물렌즈로 입사되는 형태를 도시하는 단면도이며, 도 12는 본 발명의 일 실시예에 의한 형광 현미경의 NA 증가에 따른 임계각의 감소 및 여기 광의 광량 증가를 도시하는 도면이다.
도 10 내지 도 12를 참조하면, 본 발명의 일 실시예에 의한 형광 현미경(1)은 애퍼처(50)를 포함할 수 있다.
애퍼처(50)는 여기광원(10)의 일부를 가려서 여기광원(10)에서 방출되는 빛의 분포와, 양을 조절할 수 있고, 광학바디부(30)에서 배출된 빛이 고체 침지렌즈(40)의 저면에서 전반사가 일어나도록 하는 역할을 할 수 있다.
바람직하게는, 애퍼처(50)는 여기광원(10)의 중심부를 차단하기 위하여 사용될 수 있다. 또한, 애퍼처(50)의 위치는 여기광원(10)을 반사시키는 여기광 전달부(31)의 앞부분에 배치될 수 있다. 다시 말해, 애퍼처(50)는 여기광원(10)과, 여기광 전달부(31)의 사이에 배치될 수 있다.
애퍼처(50)가 대물렌즈(60) 전방에 배치되는 경우에는, 여기감소광원(20)이 함께 차단되어 유도방출억제(STED)를 위한 여기감소 광의 광량이 약해질 수 있다. 따라서, 애퍼처(50)는 여기광 전달부 (31)의 앞부분에 배치되는 것이 바람직할 수 있다.
애퍼처(50)는 투명한 재질로 형성되어 여기광원(10)에서 방출되는 여기 광을 통과시키는 투과부(51)와, 불투명한 재질로 형성되어 여기 광원(10)에서 배출되는 여기 광을 차단하는 차단부(52)를 포함할 수 있다. 보다 상세히, 투과부(51) 및 차단부(52, 52')의 배치와, 면적에 따라 고체 침지렌즈(40)로 입사되는 여기 광의 입사 각도가 여기 광의 임계각보다 크도록 설정함으로써, 고체 침지렌즈(40)의 저면에서 전반사가 발생하도록 할 수 있다.
투과부(51)는 여기 광을 통과시킬 수 있도록 투명 기판으로 구비될 수 있고, 차단부(52, 52')는 여기 광을 차단시킬 수 있도록 검은색 기판으로 구비될 수 있다. 일례로, 투과부(51)와 차단부(52, 52')는 별개의 기판으로 구비되어 분리 가능하게 결합된 형태일 수 있다. 또한, 차단부(52, 52')는 검은색 테이프 또는 검은색 페인트 등으로 투과부(51)에 부착 또는 칠해지는 형태일 수 있다.
차단부(52, 52')에는 링 형상의 통과홀(53)이 형성될 수 있다(도 10(a) 참조). 통과홀(53)을 제외한 나머지 영역은 여기 광을 차단하는 역할을 할 수 있고, 여기 광은 투과부(51) 및 통과홀(53)을 지나 링 형상으로 입사될 수 있다. 또한, 통과홀(53)의 형상은 링 형상뿐만 아니라 적어도 일 부분이 절단된 링 형상으로 구비(도 10(b) 참조)될 수 있고, 이에 한정되지 않으며 여기 광의 입사 각도가 여기 광의 임계각보다 크도록 설정하는 범위 내에서 다양한 형상으로 제작될 수 있다.
다시 말해, 애퍼처(50)는 광학바디부(30)에서 배출되어 고체 침지렌즈(40)로 입사되는 빛 가운데 여기 광의 임계각 이하의 영역의 빛을 차단하는 역할을 할 수 있다.
여기광원(10)이 투과부(51) 및 차단부(52, 52')를 통과하면 여기 광의 중앙부가 차단되고 링 형상의 통과홀(53)을 통과한 여기 광만이 대물렌즈(60)로 입사될 수 있다(도 11 참조).
대물렌즈(60)에서 굴절되어 고체 침지렌즈(40)로 입사된 빛은 임계각보다 큰 각도로 입사될 수 있고, 고체 침지렌즈(40)의 저면에서 전반사가 발생될 수 있다. 일례로, 고체 침지렌즈(40)의 굴절률을 n1이라 하고, 시료(S)의 굴절률을 n2라 하면, 전반사가 발생하기 위해서는 고체 침지렌즈(40)의 굴절률 n1이 시료(S)의 굴절률 n2보다 크며, 고체 침지렌즈(40)로 입사되는 빛의 입사각이 임계각보다 큰 각도일 수 있다.
고체 침지렌즈(40)와 시료(S)의 경계에서 전반사가 발생하면, 굴절률이 낮은 방향으로 감쇄파가 발생할 수 있다. 상기 감쇄파는 근접장 영역에서만 존재하는 빛의 진행방향으로서, 매우 짧은 영역이고 그 세기는 진행거리에 따라 지수함수(Exp)에 따라 감소할 수 있다. 따라서, 상기 감쇄파 영역에서의 형광체가 염색된 시료(S)를 국소적으로 관찰할 수 있기 때문에 세포의 표면(cell membrane)과 같이 매우 얇은 부분을 관찰할 수 있는 장점이 있고, 상기 감쇄파의 투과 깊이가 매우 작기 때문에 일반 광학 현미경에 비하여 이미지의 대조(image contrast)를 향상시킬 수 있다.
또한, 고체 침지렌즈(40)와 시료(S) 간에 전반사가 발생하기 위해서는 집광 효율을 나타내는 NA가 시료의 굴절율, 즉 n시료보다 클 수 있다.
전체 NA 영역 가운데 n시료 이하의 영역은 임계각보다 작은 영역이므로 전반사가 발생하지 않고 투과될 수 있다(도 12 참조). 일례로, 공기에 있는 임의의 렌즈의 NA, 즉 NAair =0.8이고(NA가 0.8인 렌즈를 사용하여 공기를 통하여 시료를 본 경우임), 시료의 굴절률 n시료=1.3일 경우에는 NAair<n시료이므로 전반사가 일어나지 않고 투과가 발생할 수 있다.
또한, 오일의 경우 NAoil= ~1.42이고 n시료=1.3일 경우에는 NAoil>n시료이므로 임계각보다 큰 입사각으로 빛이 입사되어 전반사가 발생할 수 있다.
반면, 고체 침지렌즈(40)를 이용하는 경우에는 오일을 이용한 침지렌즈에 비하여 높은 여기 강도를 확보할 수 있으므로 해상도를 증가시킬 수 있는 효과가 있다. 일례로, n렌즈= ~2.3이고 n시료=1.3일 경우에 오일을 이용한 침지렌즈에 비하여 임계각도가 작아지므로 입사되는 여기 광의 광량이 증가될 수 있다.
도 13(a)는 본 발명의 다른 실시예에 의한 형광 현미경의 고체 침지렌즈 표면에 복제 침지렌즈가 구비되는 형태를 도시하는 단면도이고, 도 13(b)는 본 발명의 다른 실시예에 의한 형광 현미경의 구형 대물렌즈 및 고체 침지렌즈에 각각 복제 침지렌즈가 구비되는 형태를 도시하는 도면이다.
도 13을 참조하면, 본 발명의 다른 실시예에 의한 형광 현미경의 고체 침지렌즈(40)의 표면에는 복제 침지렌즈(41)가 구비될 수 있다.
복제 침지렌즈(41)는 고체 침지렌즈(40)의 표면에 위치될 수 있고, NA를 증가시키는 역할을 할 수 있다.
복제 침지렌즈(41)가 구비되는 경우에는, 대물렌즈(60)에서 일차적으로 굴절되어 입사되는 빛이 복제 침지렌즈(41)에 의해 한번 더 굴절되므로 고체 침지렌즈(40)로 입사되는 빛의 입사각이 증가될 수 있다. 일례로, 대물렌즈(60)에서 굴절되어 복제 침지렌즈(41)로 입사되는 빛의 입사각을 θ라 하고, 복제 침지렌즈(41)에서 한번 더 굴절되어 고체 침지렌즈(40)로 입사되는 빛의 입사각을 θ'라고 하면(도 13(a) 참조), θ<θ'가 성립될 수 있다.
복제 침지렌즈(41)는 상술한 슈퍼-반구 형상의 고체 침지렌즈(40)의 두께에 대한 민감도를 감소시킬 수 있는 효과가 있다.
보다 상세히, 고체 침지렌즈(40)의 표면에는 제1 복제 침지렌즈(41)가 구비될 수 있고, 뿐만 아니라 대물렌즈(60)의 표면에는 제2 복제 침지렌즈(61)가 구비될 수 있다(도 13(b) 참조). 광학바디부(30)에서 배출되는 빛은 일차적으로 제2 복제 침지렌즈(61)로 입사되어 굴절되어 대물렌즈(60)로 입사되며, 입사된 빛은 대물렌즈(60)에서 이차적으로 굴절될 수 있다. 대물렌즈(60)에서 배출되는 빛은 제1 복제 침지렌즈(41)에 의해 삼차적으로 굴절되어 고체 침지렌즈(40)로 입사될 수 있고, 마지막으로 고체 침지렌즈(40)에서 굴절되어 고체 침지렌즈(40)의 저면 중앙부에서 전반사를 발생시킬 수 있다.
도 14(a)는 본 발명의 다른 실시예에 의한 형광 현미경의 고체 침지렌즈가 타원 형상인 것을 도시하는 도면이고, 도 14(b)는 본 발명의 다른 실시예에 의한 형광 현미경의 고체 침지렌즈의 표면에 복제 침지렌즈가 구비되어 고체 침지렌즈 저면에 빛이 포커싱되는 것을 도시하는 도면이다.
도 14를 참조하면, 본 발명의 다른 실시예에 의한 형광 현미경(1)의 고체 침지렌즈(40)는 타원 형상으로 형성될 수 있다.
고체 침지렌즈(40)가 타원 형상으로 형성되는 경우에는, 광학바디부(30)에서 배출되는 빛은 대물렌즈(60)가 별도로 구비되지 않더라도 고체 침지렌즈(40)로 바로 입사될 수 있다. 이 때, 고체 침지렌즈(40)의 표면에는 광학바디부(30)에서 배출되는 빛을 굴절시키는 복제 침지렌즈(41)가 구비될 수 있다.
복제 침지렌즈(41)는 고체 침지렌즈(40)의 표면에 추가로 결합되는 구조로서, 광학바디부(30)에서 배출되는 빛은 복제 침지렌즈(41)에서 일차적으로 굴절된 후 고체 침지렌즈(40)로 입사되고, 고체 침지렌즈(40)의 저면에서 빛이 포커싱될 수 있도록 할 수 있다.
고체 침지렌즈(40)의 저면에서는 입사된 빛이 전반사될 수 있고, 이에 따라 고체 침지렌즈(40)와 시료(S) 사이에 형성된 간극에서 감쇄파(WE)가 발생되어 수직 방향의 분해능을 향상시킬 수 있다.
일례로, 고체 침지렌즈(40)는 LaSF35(n=2.086) 재질로 형성될 수 있고, 복제 침지렌즈(41)는 자외선을 차단할 수 있는 아크릴레이트(n=1.55) 재질로 형성될 수 있다.
도 15는 본 발명의 또 다른 실시예에 의한 형광 현미경의 고체 침지렌즈 대신에 고체 침지 거울이 구비되는 것을 도시하는 도면이다.
도 15를 참조하면, 본 발명의 또 다른 실시예에 의한 형광 현미경은 고체 침지렌즈(40) 대신에 고체 침지 거울이 구비될 수 있다.
고체 침지 거울(Solid Immersion Mirror)은 고체 침지렌즈(40)와 달리 렌즈의 구조는 아니지만, 고체 침지렌즈(40)와 유사한 효과를 얻을 수 있다.
상기 고체 침지거울은 고체 침지렌즈(40)와 동일하게 고체를 통해 침지(Immersion)하는 방식으로, 감쇄파가 형성될 수 있어 전반사에 의한 형광체의 형광반응을 획득할 수 있도록 하는 역할을 할 수 있다.
다시 말해, 광학바디부(30)에서 배출되는 빛은 분광 렌즈(Collimator Lens)를 통해 적어도 하나 이상으로 분리될 수 있고, 분리된 빛은 상기 고체 침지 거울로 입사될 수 있다. 상기 고체 침지 거울로 입사된 빛은 다각도에서 반사될 수 있고, 상기 고체 침지 거울의 저면 일 측에 포커싱될 수 있다.
상기 고체 침지 거울의 저면 일 측에는 상기 고체 침지 거울로 입사된 빛이 포커싱되는 돌출부가 구비될 수 있다. 일례로, 상기 돌출부는 5μm일 수 있다. 또한, 상기 돌출부와 시료(S) 사이는 소정 간격 이격되어 배치될 수 있다. 바람직하게는, 상기 고체 침지 거울은 고체 침지렌즈(40)와 마찬가지로 근접장 영역에서 작동되기 때문에 시료(S)와 상기 고체 침지 거울의 저면과의 거리를 수십 nm 이하로 접근 또는 접촉시킬 수 있다.
도 16(a)는 본 발명의 일 실시예에 의한 형광 현미경의 NA가 1.4일 때 유도방출억제(STED) 현상에 의한 여기 광의 점상 강도 분포(PSF)를 도시하는 도면이고, 도 16(b)는 본 발명의 일 실시예에 의한 형광 현미경의 NA가 1.6일 때 유도방출억제(STED) 현상에 의한 여기 광의 점상 강도 분포(PSF)를 도시하는 도면이며, 도 16(c)는 본 발명의 일 실시예에 의한 형광 현미경의 NA가 1.84일 때 유도방출억제(STED) 현상에 의한 여기 광의 점상 강도 분포(PSF)를 도시하는 도면이고, 도 16(d)는 본 발명의 일 실시예에 의한 형광 현미경의 NA가 2.0일 때 유도방출억제(STED) 현상에 의한 여기 광의 점상 강도 분포(PSF)를 도시하는 도면이다.
도 16을 참조하면, 본 발명의 일 실시예에 의한 형광 현미경은 NA 값에 따라 여기 광의 점상 강도 분포(PSF)가 달라질 수 있다.
고체 침지렌즈(40)를 향하여 입사되는 여기감소 광은 여기 광과 중첩되는 중심부 영역을 제외한 주변 영역에서 형광체를 여기하는 제1 파장의 상기 여기 광을 차단하여 탈여기시키는 유도방출억제(STED) 현상을 일으켜 수평 방향의 분해능을 증가시킬 수 있다.
보다 상세히, 유도방출은 에너지를 흡수하여 여기 상태로 전이된 전자에 특정 파장의 빛이 입사되고, 입사된 빛의 특성을 복제하며 방사를 일으키는 현상을 말한다. 상기 유도방출억제 현상은 상기 유도방출 현상을 응용하여 여기 상태에 있는 형광물질의 외곽부에 여기감소 광을 입사시켜서 유도방출을 일으키고, 그 파장을 차단함으로써 분해능을 증가시킬 수 있다.
상기 유도방출억제 현상에 의하여 빛의 포커싱 위치에서의 여기 광의 발광 면적을 최소화할 수 있어 보다 향상된 수평 분해능을 갖는 영상을 획득할 수 있는 효과가 있다. 상기 유도방출억제 현상에 의한 분해능 및 효율을 나타내는 식은 다음과 같다(식 (3) 참조).
Figure 112015116543415-pat00001
(3)
본 발명에 의한 형광 현미경(1)은 고체 침지렌즈(40)를 이용하여 종래 오일 침지렌즈에 비해 높은 NA를 확보할 수 있다. 이하에서는 NA에 따른 해상도 증가 해석 결과를 설명하도록 한다. 다만, 해석 조건은 NA만을 변경시켰으며, 이외의 여기 파장, 여기감소 파장, 각 파장의 초점에서의 강도는 모두 동일하게 설정한다(여기 파장= 635nm, 여기감소 파장= 780nm, 초점에서의 여기 강도= 1MW/mm2, 초점에서의 여기감소 강도= 10MW/mm2).
일례로, NA=1.4, 1.6, 1.84, 2.0으로 변경할 수 있고(도 16 참조), NA 값이 1.4일 때 보다 2.0일 때 유도방출억제에 의한 실질적인 점성 강도 분포(PSF)가 더 우수한 것을 확인할 수 있다.
다시 말해, 여기광원(10)에 의한 여기 점상 강도 분포(PSF)와 여기감소광원(20)에 의한 여기감소 점상 강도 분포(PSF)를 중첩하였을 때 나타나는 실질적인 점상 강도 분포(PSF)는 NA 값이 증가함에 따라 분해능이 향상되는 것을 확인할 수 있다.
도 17은 본 발명의 일 실시예에 의한 형광 현미경의 검출부가 고체 침지렌즈의 반대편에 구비되는 형태를 도시하는 도면이다.
도 17을 참조하면, 본 발명의 일 실시예에 의한 형광 현미경의 검출부(70)는 고체 침지렌즈(40)의 반대편에 구비될 수 있다.
검출부(70)는 대물렌즈(60)의 상부, 대물렌즈(60)의 하부, 여기광 전달부 및 여기감소광 전달부(31, 32)과 대물렌즈(60) 사이의 공간 또는 여기광 전달부 및 여기감소광 전달부(31, 32) 사이의 공간 가운데 어디에나 위치될 수 있다.
일례로, 도 17과 같이 검출부(60)가 대물렌즈(60)의 반대편, 즉 대물렌즈(60)의 하부에 구비되는 경우에는, 고체 침지렌즈(40)의 반대 방향에서 형광체의 형광반응을 수광하기 위한 광학 장치가 더 구비될 수 있다.
이하에서는 본 발명에 의한 형광 현미경(1)의 작용을 설명하도록 한다.
본 발명에 의한 형광 현미경(1)은 NA(Numerical Aperture)를 증가시키기 위하여 고체 침지렌즈(40)를 적용한 구조를 이용할 수 있다.
여기광원(10)에서 배출된 여기 광과, 여기감소광원(20)에서 배출된 빛은 광학바디부(30)를 통해 반사되어 대물렌즈(60)로 입사될 수 있다. 대물렌즈(60)에서 굴절된 빛은 반구 형상의 고체 침지렌즈(40)로 입사될 수 있고, 고체 침지렌즈(40)의 표면에서 수직하게 입사되어 NA가 증가되는 효과를 얻을 수 있다.
이 때, 고체 침지렌즈(40)에 입사되는 빛의 외곽 부분은 입사각이 임계각을 넘어서기 때문에 전반사가 발생될 수 있고, 고체 침지렌즈(40)의 저면에서 감쇄파(WE)가 형성될 수 있다. 고체 침지렌즈(40)에 입사되는 빛의 저 NA영역(임계각 이내의 영역)을 애퍼처(50)를 이용하여 차단함으로써 감쇄파(WE)에 의하여 내부 전반사 형광 현미경(TIRF) 구조를 구성할 수 있다.
특히, 애퍼처(50)는 대물렌즈(60)로 입사되는 여기 광의 투과 영역을 조절함으로써 여기 광이 고체 침지렌즈(40)에 입사될 때 임계각 이상의 각도로 입사되도록 조절하는 역할을 할 수 있다.
고체 침지렌즈(40)를 이용하여 NA를 증가시키는 경우에는 획득한 이미지의 수평 및 수직방향의 해상도를 모두 증가시킬 수 있다. 또한, 여기에 유도방출억제(STED) 기술을 더하여 수평방향의 해상도를 더욱 증가시킬 수 있는 효과가 있다.
따라서, 형광체를 포함하는 시료(S)의 수평 및 수직방향의 해상도 모두 빛의 회절 한계를 극복한 광학 이미지를 획득할 수 있는 장점이 있다.
1: 형광 현미경 10: 여기광원
20: 여기감소광원 21: 위상판
30: 광학바디부 31: 여기광 전달부
32: 여기감소광 전달부 40: 고체 침지렌즈
41: 복제 침지렌즈 50: 애퍼처
51: 투과부 52, 52': 차단부
53: 통과홀 60: 대물렌즈
61: 제2 복제 침지렌즈 70: 검출부

Claims (20)

  1. 형광체를 포함하는 시료를 촬영하는 형광 현미경에 있어서,
    상기 형광체가 형광을 방출하도록 여기하는 여기 광을 방출하는 여기광원;
    상기 여기광원에서 방출되는 여기 광에 의하여 여기된 형광체를 탈여기시키는 여기감소 광을 방출하는 여기감소광원;
    상기 여기광원에서 방출된 빛과 상기 여기감소광원에서 방출되는 빛을 서로 중첩시키고, 중첩된 빛을 시료를 향하게 하는 광학바디부; 및
    상기 광학바디부에서 배출된 빛이 입사되고, 상기 광학바디부에서 배출된 빛을 시료를 향하도록 굴절시키는 고체 침지렌즈;
    를 포함하고,
    상기 고체 침지렌즈에 입사된 빛은 상기 고체 침지렌즈의 저면에서 전반사되고,
    상기 고체 침지렌즈의 저면은 중심부에서 가장자리로 갈수록 상향 경사지게 형성되고, 상기 저면의 중앙부를 제외한 나머지 주변부가 시료로부터 소정 각도 θ만큼 틸팅되어 형성되며,
    상기 θ는 상기 고체 침지렌즈와 상기 시료가 20nm 이하의 미세 간극을 유지하기 위한 범위인 θ≤±0.06 deg. 로 조절되는 것을 특징으로 하는 내부 전반사 형광 현미경.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 여기광원에서 방출되는 여기 광의 일부분을 가리는 애퍼처를 더 포함하는 내부 전반사 형광 현미경.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 애퍼처는 상기 여기광원에서 방출되는 여기 광의 일부분을 차단하여, 상기 고체 침지렌즈에 입사되는 여기 광 가운데 상기 고체 침지렌즈의 저면에서 전반사되지 않는 영역의 빛을 차단하는 내부 전반사 형광 현미경.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 애퍼처는 상기 여기광원에서 방출되는 여기 광의 일부분을 차단하여, 상기 고체 침지렌즈에 입사되는 여기 광 가운데 임계각 이하의 영역을 차단하는 내부 전반사 형광 현미경.
  5. 제2항에 있어서,
    상기 애퍼처는 투명한 재질로 형성되어 상기 여기광원에서 배출되는 여기 광을 통과시키는 투과부; 및
    불투명한 재질로 형성되어 상기 여기광원에서 배출되는 여기 광을 차단하는 차단부;
    를 포함하며,
    상기 고체 침지렌즈로 입사되는 상기 여기 광의 입사 각도가 임계각보다 크도록 상기 투과부 및 상기 차단부가 배치되는 내부 전반사 형광 현미경.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 차단부는 상기 여기광원에서 배출되는 여기 광의 중앙을 차단하는 원형으로 형성되고, 상기 투과부는 상기 차단부 주변에 링 형상으로 형성되는 내부 전반사 형광 현미경.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 시료의 형광체의 형광 빛을 감지하는 검출부를 더 포함하는 내부 전반사 형광 현미경.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 광학바디부는,
    상기 여기광원에서 방출되는 여기 광을 시료를 향하여 전달시키는 여기광 전달부; 및
    상기 여기감소광원에서 방출된 여기감소 광을 시료를 향하여 전달시키는 여기감소광 전달부;
    를 포함하는 내부 전반사 형광 현미경.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 여기광 전달부 및 상기 여기감소광 전달부는 여기 광 또는 여기감소 광은 반사하고, 시료의 형광물질에서 방출되는 형광 빛은 통과시키는 것을 이색성 거울 또는 빔 스플리터인 내부 전반사 형광 현미경.
  10. 제1항에 있어서,
    상기 광학바디부의 하부에는 상기 광학바디부에서 배출된 빛을 상기 고체 침지렌즈를 향하여 입사시키는 대물렌즈가 구비되는 내부 전반사 형광 현미경.
  11. 제1항에 있어서,
    상기 고체 침지렌즈를 향하여 입사되는 상기 여기 광이 임계각보다 큰 각도로 입사되면 상기 고체 침지렌즈의 저면에서 내부 전반사가 발생되고, 상기 고체 침지렌즈에서 시료를 향하여 감쇄파가 발생하며, 상기 감쇄파에 의하여 발생되는 형광체의 형광 빛을 감지하는 내부 전반사 형광 현미경.
  12. 제1항에 있어서,
    상기 여기감소 광은, 상기 여기 광의 중심부 영역을 제외한 주변 영역에서 상기 여기 광과 중첩되도록 도넛 형상으로 파면이 형성되고,
    상기 형광체를 여기하는 상기 여기 광을 탈여기시키는 유도방출억제(STED) 현상을 일으켜 수평 분해능을 증가시키는 내부 전반사 형광 현미경.
  13. 제10항에 있어서,
    상기 대물렌즈에서 배출되는 빛은 상기 고체 침지렌즈의 표면에서 수직 방향으로 입사되어 집광 효율이 증가되는 것을 특징으로 하는 내부 전반사 형광 현미경.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 고체 침지렌즈 또는 상기 대물렌즈의 표면에는 상기 광학바디부에서 배출되는 빛을 굴절시키는 복제렌즈가 더 구비되는 것을 특징으로 하는 내부 전반사 형광 현미경.
  15. 삭제
  16. 형광체를 포함하는 시료를 촬영하는 형광 현미경에 있어서,
    상기 형광체를 여기하는 제1 파장으로 여기 광을 방출하는 여기광원;
    상기 여기광원에서 방출되는 여기 광에 의하여 여기된 상기 형광체를 탈여기시키는 제2 파장의 여기감소 광을 방출하는 여기감소광원;
    상기 여기광원에서 방출된 빛과 상기 여기감소광원에서 방출되는 빛을 서로 중첩시키고, 중첩된 빛을 시료로 향하게 하는 광학바디부;
    상기 광학바디부에서 배출된 빛이 유입되고, 상기 광학바디부에서 배출된 빛을 시료를 향하도록 굴절시키는 고체 침지렌즈;
    상기 여기광원의 적어도 일부를 가려서 상기 여기광원에서 방출되는 빛의 양을 조절하고, 상기 광학바디부에서 배출된 빛이 상기 고체 침지렌즈의 저면에서 내부 전반사가 일어나도록 하는 애퍼처; 및
    상기 광학바디부에서 배출된 빛을 받은 상기 형광체의 형광반응을 수광하는 검출기;
    를 포함하고,
    상기 광학바디부의 하부에는 상기 광학바디부에서 배출된 빛을 상기 고체 침지렌즈를 향하여 입사시키는 대물렌즈가 구비되며,
    상기 고체 침지렌즈 또는 상기 대물렌즈의 표면에는 각각 상기 광학바디부에서 배출되는 빛을 굴절시키는 복제렌즈가 더 구비되며,
    상기 고체 침지렌즈의 저면은 중심부에서 가장자리로 갈수록 상향 경사지게 형성되고, 상기 저면의 중앙부를 제외한 나머지 주변부가 시료로부터 소정 각도 θ만큼 틸팅되어 형성되며,
    상기 θ는 상기 고체 침지렌즈와 상기 시료가 20nm 이하의 미세 간극을 유지하기 위한 범위인 θ≤±0.06 deg. 로 조절되는 것을 특징으로 하고,
    상기 애퍼처는 상기 여기광원에서 배출되는 여기 광의 적어도 일부를 투과시키도록 링 형상으로 형성되는 전반사 형광 현미경.
  17. 제16항에 있어서,
    상기 애퍼처는 상기 여기광원에서 방출되는 여기 광의 일부분을 차단하여, 상기 고체 침지렌즈에 입사되는 여기 광 가운데 상기 고체 침지렌즈의 저면에서 전반사되지 않는 영역의 빛을 차단하는 내부 전반사 형광 현미경.
  18. 제17항에 있어서,
    상기 애퍼처는 상기 여기광원에서 방출되는 여기 광의 일부분을 차단하여, 상기 고체 침지렌즈에 입사되는 여기 광 가운데 임계각 이하의 영역을 차단하는 내부 전반사 형광 현미경.
  19. 제16항에 있어서,
    상기 애퍼처는 투명한 재질로 형성되어 상기 여기광원에서 배출되는 여기 광을 통과시키는 투과부; 및
    불투명한 재질로 형성되어 상기 여기광원에서 배출되는 여기 광을 차단하는 차단부;
    를 포함하며,
    상기 고체 침지렌즈로 입사되는 상기 여기 광의 입사 각도가 임계각보다 크도록 상기 투과부 및 상기 차단부가 배치되는 내부 전반사 형광 현미경.
  20. 제19항에 있어서,
    상기 차단부는 상기 여기광원에서 배출되는 여기 광의 중앙을 차단하는 원형으로 형성되고, 상기 투과부는 상기 차단부 주변에 링 형상으로 형성되는 내부 전반사 형광 현미경.
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