KR101752941B1 - 유전자 발현을 상승시키는 시스템 및 이 시스템을 유지한 벡터 - Google Patents

Abstract

본 발명은, 프로모터, 인핸서 등을 이용하여 특히 외래 유전자의 발현을 상승시키는 방법, 및 프로모터, 인핸서 등을 포함하는 유전자 발현을 상승시킬 수 있는 발현용 카세트의 제공을 목적으로 하며, 제1 프로모터의 하류에 발현시키고자 하는 유전자 및 폴리A 부가 서열을 포함하는 DNA 구축물을 포함하고, 또한 상기 DNA 구축물의 하류에 인핸서 또는 제2 프로모터를 포함하는 유전자 발현용 카세트에 의해 상기 목적을 달성한다.

Description

유전자 발현을 상승시키는 시스템 및 이 시스템을 유지한 벡터{SYSTEM FOR INCREASING GENE EXPRESSION AND VECTOR COMPRISING THE SYSTEM}

본 발명은 프로모터, 인핸서 등을 이용하여 유전자의 발현을 상승시키는 방법, 및 프로모터, 인핸서 등을 포함하는 유전자 발현을 상승시키는 발현용 카세트에 관한 것이다.

이전부터, 유전자 발현 효율을 상승시키기 위해서, CMV 프로모터나 CAG 프로모터 등 여러 가지 유전자 발현 프로모터가 개발되어 있다(특허문헌 1∼4). 그러나, 생물공학 분야에서는, 이들 종래 기술을 이용하더라도, 세포의 종류나 유전자의 종류에 따라, 유전자 발현이 거의 발생하지 않거나, 또는 발현 단백질량이 매우 적다고 하는 문제가 일상적으로 발생하고 있다. 또한, 이 문제는 유전자 발현을 진단이나 치료에 이용하는 의료의 발전에 있어서 큰 장벽으로 되고 있다.

특허문헌 1 : 일본 특허 공보 제2814433호 공보 특허문헌 2 : 일본 특허 공보 제2814434호 공보 특허문헌 3 : 미국 특허 제5168062호 명세서 특허문헌 4 : 미국 특허 제5385839호 명세서

프로모터, 인핸서 등을 이용하여 유전자의 발현을 상승시키는 방법 및 프로모터, 인핸서 등을 포함하는 유전자 발현을 상승시킬 수 있는 발현용 카세트의 제공을 목적으로 한다.

본 발명자는, 프로모터를 이용한 유전자 발현 시스템에 있어서, 보다 높은 효율로 유전자를 발현시킬 수 있는 새로운 시스템의 개발을 시도하여, 여러 가지 유전자의 프로모터나 인핸서의 조합에 의한 프로모터 활성을 비교, 검토했다. 그 결과, 제1 프로모터의 하류에 발현시키고자 하는 유전자 및 폴리A 부가 서열을 포함하는 DNA 구축물의 하류에 인핸서 또는 제2 프로모터가 연결된, 유전자의 발현용 카세트를 이용하여, 발현시키고자 하는 유전자를 2개의 프로모터 혹은 프로모터와 인핸서로 사이에 끼움으로써, 유전자를 고효율로 발현시킬 수 있음을 알아냈다. 본 발명자는 또한, 상기한 발현용 카세트에, 폴리A 부가 서열, RU5', UAS, SV40-ori 등의 엘리멘트를 추가로 포함하게 함으로써 더욱 고효율로 유전자를 발현시킬 수 있음을 알아냈다.

본 발명의 「유전자 발현을 상승시키는 시스템 및 이 시스템을 유지한 벡터」의 개발에 의해, 거의 모든 세포, 유전자에 대해서 단백질의 발현을 강력하게 상승시킬 수 있게 된다.

즉, 본 발명은 다음과 같다.

[1] 제1 프로모터의 하류에 발현시키고자 하는 유전자 및 폴리A 부가 서열을 포함하는 DNA 구축물을 포함하고, 또한 상기 DNA 구축물의 하류에 인핸서 또는 제2 프로모터를 포함하는 유전자의 발현용 카세트.

[2] 연결한 인핸서 또는 제2 프로모터의 하류에 다른 유전자 발현용의 기구를 갖지 않고, 발현시키고자 하는 유전자를 제1 프로모터 하나와 인핸서 하나로 사이에 끼우거나, 또는 제1 프로모터 하나와 제2 프로모터 하나로 사이에 끼운 구조를 갖는 [1]의 발현용 카세트.

[3] 프로모터가 CMV i 프로모터, SV40 프로모터, hTERT 프로모터, β 액틴 프로모터 및 CAG 프로모터로 이루어지는 군에서 선택되는 프로모터인 [1]의 발현용 카세트.

[4] 인핸서가 CMV 인핸서, SV40 인핸서 및 hTERT 인핸서로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 인핸서인 [1]∼[3] 중 어느 하나의 발현용 카세트.

[5] 또한, 프로모터의 하류에 발현시키고자 하는 단백질을 코드하는 DNA 및 폴리A 부가 서열을 포함하는 DNA 구축물의 상류에 1∼4개의 CMV 인핸서가 연결된 [1]∼[4] 중 어느 하나의 발현용 카세트.

[6] 또한 이하의 엘리멘트의 적어도 어느 하나를 포함하는 [1]∼[5] 중 어느 하나의 발현용 카세트:

(ⅰ) 외래 단백질을 코드하는 DNA의 바로 상류에 연결된 RU5';

(ⅱ) 인핸서 및/또는 프로모터의 바로 상류에 연결된 UAS; 및

(ⅲ) 발현용 카세트의 최상류에 연결된 SV40-ori.

[7] 발현시키고자 하는 유전자가 질환의 치료에 이용할 수 있는 치료용 유전자, 또는 의약, 진단약 혹은 시약에 이용할 수 있는 단백질의 유전자인 [1]∼[6] 중 어느 하나의 발현용 카세트.

[8] 치료용 유전자가 종양의 치료에 이용할 수 있는 암 억제 유전자인 [7]의 발현용 카세트.

[9] 암 억제 유전자가 REIC/Dkk-3 유전자인 [8]의 발현용 카세트.

[10] 발현시키고자 하는 유전자가 REIC/Dkk-3 유전자의 단편 DNA인 [9]의 발현용 카세트.

[11] REIC/Dkk-3 유전자의 단편 DNA가, 서열번호 18의 아미노산 서열의 1∼78번째의 아미노산을 코드하는 DNA인 [10]의 발현용 카세트.

[12] 컨스트럭트 2번(도 8), 4번(도 10), 6번(도 12), 8번(도 14), 10번(도 16), 12번(도 18) 및 14번(도 20)에 나타내는 구조를 갖는 [1]의 외래 유전자의 발현용 카세트.

[13] 컨스트럭트 15번(도 16), 16번(도 37), 17번(도 49), 20번(도 57) 및 21번(도 58)에 나타내는 구조를 갖는 [1]의 외래 유전자의 발현용 카세트.

[14] [1]∼[13] 중 어느 한 외래 유전자의 발현용 카세트를 포함하는 벡터.

[15] 아데노바이러스 또는 아데노 수반 바이러스 벡터인 [14]의 벡터.

[16] [14] 또는 [15]의 벡터를 포함하는 숙주 세포.

[17] [14] 또는 [15]의 벡터를 포함하는 질환 검출 또는 치료용 제제.

[18] [1]∼[13] 중 어느 하나의 발현용 카세트 또는 [14] 혹은 [15]의 벡터를 이용하여 발현시키고자 하는 유전자를 발현시키는 방법.

[19] 제1 프로모터의 하류에, 발현시키고자 하는 유전자 및 폴리A 부가 서열을 포함하는 DNA 구축물의 하류에 인핸서 또는 제2 프로모터가 연결된 것을 벡터에 도입하고, 그 벡터를 이용하여 상기 유전자를 발현시키는 방법.

[20] [1]∼[13] 중 어느 한 항에 기재한 발현용 카세트 또는 [14] 혹은 [15]에 기재한 벡터를 세포에 도입하여, 그 세포를 배양하는 것을 포함하는, 발현시키고자 하는 유전자가 코드하는 단백질을 제조하는 방법.

본 명세서는 본원의 우선권의 기초인 일본 특허출원 2009-264299호 명세서 및/또는 도면에 기재되는 내용을 포함한다.

도 1은 HEK293 세포주에 FuGENE(상표)-HD를 이용하여 36시간 트랜스펙트한 각종 외래 유전자의 발현을 도시하는 도면이다.
도 2는 여러 가지 세포주에 FuGENE(상표)-HD를 이용하여 36시간 트랜스펙트한 KLF 유전자의 발현을 도시하는 도면이다.
도 3은 HEK293 세포주에 각종 트랜스펙트 시약을 이용하여 36시간 트랜스펙트한 KLF 유전자의 발현을 도시하는 도면이다.
도 4는 HEK293 세포주에 전장 REIC 유전자 및 N78-REIC를 코드하는 유전자를 FuGENE(상표)-HD를 이용하여 36시간 트랜스펙트한 경우의 발현을 도시하는 도면이다.
도 5a는 N78-REIC를 코드하는 DNA를 삽입한 컨스트럭트 14번에 의한, 인간 전립선암 세포 PC3 세포주의 증식 억제와 세포사 유도를 도시하는 도면(그래프)이다.
도 5b는 N78-REIC를 코드하는 DNA를 삽입한 컨스트럭트 14번에 의한, 인간 전립선암 세포 PC3 세포주의 증식 억제와 세포사 유도를 도시하는 도면(사진)이다.
도 6은 전장 REIC 유전자를 삽입한 컨스트럭트 14번에 의한, 인간 전립선암 세포 PC3 세포주의 증식 억제를 도시하는 도면이다.
도 7은 컨스트럭트 1번의 구조를 도시하는 도면이다.
도 8은 컨스트럭트 2번의 구조를 도시하는 도면이다.
도 9는 컨스트럭트 3번의 구조를 도시하는 도면이다.
도 10은 컨스트럭트 4번의 구조를 도시하는 도면이다.
도 11은 컨스트럭트 5번의 구조를 도시하는 도면이다.
도 12는 컨스트럭트 6번의 구조를 도시하는 도면이다.
도 13은 컨스트럭트 7번의 구조를 도시하는 도면이다.
도 14는 컨스트럭트 8번의 구조를 도시하는 도면이다.
도 15는 컨스트럭트 9번의 구조를 도시하는 도면이다.
도 16은 컨스트럭트 10번의 구조를 도시하는 도면이다.
도 17은 컨스트럭트 11번의 구조를 도시하는 도면이다.
도 18은 컨스트럭트 12번의 구조를 도시하는 도면이다.
도 19는 컨스트럭트 13번의 구조를 도시하는 도면이다.
도 20은 컨스트럭트 14번의 구조를 도시하는 도면이다.
도 21은 전장 REIC/Dkk-3 유전자를 코드하는 아데노바이러스의 컨스트럭트 의 구조를 도시하는 도면이다.
도 22a는 pDNR-1r Donor vector의 전염기 서열을 도시하는 도면이다.
도 22b는 pDNR-1r Donor vector의 전염기 서열을 도시하는 도면이다(도 22a의 계속).
도 23은 pIDT-SMART 벡터의 전염기 서열을 도시하는 도면이다.
도 24는 CMV i 프로모터(hCMV+인트론 프로모터) 영역의 염기 서열을 도시하는 도면이다.
도 25는 BGH polyA(3 x stop+BGH polyA) 영역의 염기 서열을 도시하는 도면이다.
도 26은 CMV 인핸서 영역의 염기 서열을 도시하는 도면이다.
도 27은 인간 β 액틴 프로모터 영역의 염기 서열을 도시하는 도면이다.
도 28은 RU5' 정방향{HTLV Type 1 long terminal repeat의 R 세그멘트 및 U5 서열의 일부(R-U5')} 영역의 염기 서열을 도시하는 도면이다.
도 29는 RU5' 역방향{HTLV Type 1 long terminal repeat의 R 세그멘트 및 U5 서열의 일부(R-U5')} 영역의 염기 서열을 도시하는 도면이다.
도 30은 4 x CMV 인핸서 영역의 염기 서열을 도시하는 도면이다.
도 31은 CAG 프로모터 영역의 염기 서열을 도시하는 도면이다.
도 32는 2IRES 인서트 영역의 염기 서열을 도시하는 도면이다.
도 33은 SV40ori-UAS-CMVi-RU5' 영역의 염기 서열을 도시하는 도면이다.
도 34는 3 x stop-BGH-polyA-UAS-hTERT 인핸서+SV40 인핸서+CMV 인핸서 영역의 염기 서열을 도시하는 도면이다.
도 35a는 컨스트럭트 14번 벡터의 전염기 서열을 도시하는 도면이다.
도 35b는 컨스트럭트 14번 벡터의 전염기 서열을 도시하는 도면이다(도 35a의 계속).
도 36은 컨스트럭트 15번의 구조를 도시하는 도면이다.
도 37은 컨스트럭트 16번의 구조를 도시하는 도면이다.
도 38은 SV40ori-UAS-SV40 enh-intron A-RU5' 영역의 염기 서열을 도시하는 도면으로, 컨스트럭트 15번의 삽입 유전자(목적 유전자)보다 좌측(상류측)의 삽입 부분의 염기 서열을 도시하는 도면이다.
도 39는 SV40ori-UAS-hTERT enh-intron A-RU5' 영역의 염기 서열을 도시하는 도면으로, 컨스트럭트 16번의 삽입 유전자(목적 유전자)보다 좌측(상류측)의 삽입 부분의 염기 서열을 도시하는 도면이다.
도 40은 플라스미드 중의 GFP 영역의 염기 서열을 도시하는 도면이다.
도 41a는 컨스트럭트 14번의 삽입 유전자(목적 유전자) 영역에 GFP 유전자의 DNA를 삽입한 플라스미드의 염기 서열을 도시하는 도면이다.
도 41b는 컨스트럭트 14번의 삽입 유전자(목적 유전자) 영역에 GFP 유전자의 DNA를 삽입한 플라스미드의 염기 서열을 도시하는 도면이다(도 41a의 계속).
도 42a는 컨스트럭트 15번의 삽입 유전자(목적 유전자) 영역에 GFP 유전자의 DNA를 삽입한 플라스미드의 염기 서열을 도시하는 도면이다.
도 42b는 컨스트럭트 15번의 삽입 유전자(목적 유전자) 영역에 GFP 유전자의 DNA를 삽입한 플라스미드의 염기 서열을 도시하는 도면이다(도 42a의 계속).
도 43a는 컨스트럭트 16번의 삽입 유전자(목적 유전자) 영역에 GFP 유전자의 DNA를 삽입한 플라스미드의 염기 서열을 도시하는 도면이다.
도 43b는 컨스트럭트 16번의 삽입 유전자(목적 유전자) 영역에 GFP 유전자의 DNA를 삽입한 플라스미드의 염기 서열을 도시하는 도면이다(도 43a의 계속).
도 44는 SV40프로모터(컨스트럭트 15번) 및 hTERT 프로모터(컨스트럭트 16번)를 포함하는 플라스미드를 이용한 경우의 GFP 유전자 발현의 세기를 도시하는 도면이다.
도 45는 플라스미드 중의 인간 에리트로포이에틴 영역의 염기 서열을 도시하는 도면이다.
도 46은 컨스트럭트 14번의 플라스미드를 이용하여 인간 에리트로포이에틴을 발현시킨 경우의 결과를 도시하는 도면이다.
도 47a는 플라스미드 중의 인간 IgG 경쇄 영역(도 44A)의 염기 서열을 도시하는 도면이다.
도 47b는 플라스미드 중의 인간 IgG 중쇄 영역(도 44B)의 염기 서열을 도시하는 도면이다.
도 48은 컨스트럭트 14번의 플라스미드를 이용하여 인간 IgG 경쇄(도 48A) 및 인간 IgG 중쇄(도 48B)을 발현시킨 경우의 결과를 도시하는 도면이다.
도 49는 컨스트럭트 17번의 구조를 도시하는 도면이다.
도 50은 컨스트럭트 17번의 삽입 유전자(목적 유전자) 영역에 전장 인간 REIC의 DNA를 삽입한 플라스미드의 염기 서열을 도시하는 도면이다.
도 51은 컨스트럭트 17번의 플라스미드를 이용하여 전장 인간 REIC를 발현시킨 결과를 도시하는 도면이다.
도 52는 c-myc 유전자의 서열을 도시하는 도면이다.
도 53은 컨스트럭트 14번의 발현 플라스미드의 발현 유전자의 하류에 존재하는 BGH polyA 및 3개의 인핸서가 연결된 염기 서열을 도시하는 도면이다.
도 54는 시판되는 플라스미드에 컨스트럭트 14번의 발현 플라스미드의 발현 유전자의 하류에 존재하는 BGH polyA 및 3개의 인핸서가 연결된 염기 서열을 도입하여 c-myc 유전자를 발현시킨 경우의 결과를 도시하는 도면이다.
도 55는 컨스트럭트 18번의 구조를 도시하는 도면이다.
도 56은 컨스트럭트 19번의 구조를 도시하는 도면이다.
도 57은 컨스트럭트 20번의 구조를 도시하는 도면이다.
도 58은 컨스트럭트 21번의 구조를 도시하는 도면이다.
도 59a는 컨스트럭트 21번의 삽입 유전자(목적 유전자) 영역에 GFP 유전자의 DNA를 삽입한 플라스미드의 염기 서열을 도시하는 도면이다.
도 59b는 컨스트럭트 21번의 삽입 유전자(목적 유전자) 영역에 GFP 유전자의 DNA를 삽입한 플라스미드의 염기 서열을 도시하는 도면이다(도 59a의 계속).
도 60은 목적 유전자를 hTERT 프로모터를 포함하는 플라스미드에 삽입하여 발현시킨 경우의 결과를 도시하는 도면이다.
도 61은 다른 외래 유전자를 도입한 복수의 발현 벡터를 동시 트랜스펙트한 경우의 발현을 도시하는 도면이다.
도 62는 본 발명의 발현 벡터를 이용한 인간 에리트로포이에틴의 생성을 도시하는 도면이다.
도 63은 본 발명의 발현 벡터를 이용하여 생성한 인간 에리트로포이에틴의 순도를 도시하는 도면이다.
도 64는 본 발명의 발현 벡터를 이용한 인간 에리트로포이에틴의 생성량을 도시하는 도면으로, 도 64A는 배양 상청 25 mL 중의 생성량을 나타내고, 도 64B는 배양 상청 1 L 중의 환산 생성량을 나타낸다.
도 65는 본 발명의 발현 벡터를 이용한 인간 REIC 단백질의 생성을 도시하는 도면이다.
도 66은 본 발명의 발현 벡터를 이용하여 생성한 인간 REIC 단백질의 이온 교환 컬럼 크로마토그램을 도시하는 도면이다.
도 67은 본 발명의 발현 벡터를 이용한 인간 REIC 단백질의 생성량(배양 상청 520 mL 중의 생성량 및 배양 상청 1 L 중의 환산 생성량)을 도시하는 도면이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명에 있어서, 발현시키고자 하는 단백질의 발현용 카세트란, 발현시키고자 하는 단백질의 발현을 가능하게 하기 위한 DNA의 세트를 말한다.

상기 발현용 카세트는, 적어도 제1 프로모터의 하류에, 발현시키고자 하는 단백질의 유전자(발현시키고자 하는 유전자) 및 폴리A 부가 서열을 포함하는 DNA 구축물을 포함하고, 또한 그 구축물의 하류에 인핸서 또는 제2 프로모터가 연결되어 포함되는 구조를 갖는다. 또한, 발현시키고자 하는 유전자는, 어떠한 것이나 이용할 수 있으며, 본 발명의 발현용 카세트에 있어서는, 발현시키고자 하는 유전자를 삽입하는 부위는, 멀티클로닝 사이트로서 존재하더라도 좋다. 이 경우, 발현시키고자 하는 유전자를 멀티클로닝 부위(삽입 부위)에 제한 효소가 인식하는 서열을 이용하여 삽입하면 된다. 이와 같이 발현시키고자 하는 유전자 DNA 자체가 포함되어 있지 않고, 상기 DNA를 삽입하는 부분이 멀티클로닝 부위로서 포함되는 발현용 카세트도 본 발명의 발현용 카세트에 포함된다. 한편, 발현시키고자 하는 유전자를 표적 유전자나 목적 유전자라고 부르고, 단백질을 표적 단백질이나 목적 단백질이라고 부르는 경우도 있다. 또한, 발현 카세트 구축의 관점에서는, 이들 유전자를 발현 카세트의 표적 유전자 영역에 삽입하기 때문에, 삽입 유전자라고도 한다. 또한, 외래 유전자라고 하는 경우도 있다.

또한, 본 발명의 발현용 카세트의 최하류에는 상기한 인핸서 또는 제2 프로모터가 존재하고, 그 하류에는 다른 유전자 발현용 기구를 갖지 않는다. 즉, 본 발명의 발현용 카세트는, 적어도 발현시키고자 하는 유전자를 제1 프로모터 하나와 인핸서 적어도 하나로 사이에 끼우거나, 또는 제1 프로모터 하나와 제2 프로모터 하나로 사이에 끼운 구조를 갖는다. 여기서, 다른 유전자 발현용 기구란, 상기한 발현시키고자 하는 유전자 이외의 유전자를 발현시키기 위한 기구를 말하며, 발현시키고자 하는 유전자 이외의 유전자를 발현시키기 위한 프로모터나 인핸서 등이 포함된다. 본 발명의 발현용 카세트에 있어서는, 발현시키고자 하는 유전자의 상류와 하류에 프로모터가 존재할 수 있는데, 이 2개의 프로모터는 상기 발현시키고자 하는 유전자의 발현 효율 증강을 위해 이용된다.

본 발명의 발현용 카세트는 발현 벡터에 도입하여 이용된다. 본 발명은, 본 발명의 발현용 카세트를 포함하는 벡터도 포함한다. 상기한 바와 같이, 본 발명의 발현용 카세트의 최하류에는 상기한 인핸서 또는 제2 프로모터가 존재하고, 그 하류에는 다른 유전자 발현용 기구를 갖지 않는다. 본 발명의 발현용 카세트를 포함하는 벡터는, 발현용 카세트의 하류에 다른 유전자 발현용 기구를 갖지 않는다.

본 발명에 있어서, 발현시키고자 하는 유전자는, 인공적으로 삽입한 외래 단백질을 코드하는 유전자(DNA)를 포함하고, 호스트 세포와 유래가 다른 유전자도, 유래가 동일한 유전자도 포함한다. 이 경우, 본 발명에 있어서는, 외래 유전자를 삽입 유전자라고도 말한다. 발현시키고자 하는 유전자의 종류는 한정되지 않고, 재조합체를 제조하고자 하는 온갖 단백질을 코드하는 DNA나 특정한 질환의 치료에 이용하기 위해서 생체 내에서 발현시키고자 하는 단백질을 코드하는 DNA를 이용할 수 있다. 또한, 특정한 질환의 치료에 이용할 수 있는 치료용 유전자로서, REIC/Dkk-3 유전자(서열번호 17에 염기 서열을 나타냄), p53, Rb 등의 종양 억제 유전자, 인터류킨 1(IL-1), IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, α-인터페론, β-인터페론, γ-인터페론, 앤지오스타틴, 트롬보스폰딘, 엔도스타틴, METH-1, METH-2, GM-CSF, G-CSF, M-CSF, 종양 괴사 인자, 간세포 성장 인자, 에리트로포이에틴, 트롬보포이에틴, 인슐린, 성장 호르몬, 항체(IgG 경쇄나 IgG 중쇄), 프로테인 G, 프로테인 A 등의 생리 활성 물질 등의 의약으로서 이용할 수 있는 단백질, 질환 등의 검출에 이용하는 진단약이나 연구실에 있어서의 실험, 연구 등에 이용하는 시약으로서 유용한 단백질을 코드하는 유전자를 들 수 있다. 발현시키는 목적 단백질은 세포외 분비 단백질이 바람직하다. 또한, 생물이 본래 갖는 유전자의 하류에 인핸서 또는 프로모터를 인공적으로 연결시킴으로써, 생물이 본래 갖는 유전자의 발현을 증강할 수도 있다. 즉, 본 발명에 있어서 발현시키고자 하는 유전자는 생물이 본래 갖는 유전자도 포함한다. 본 발명은, 이와 같이 생물이 본래 갖는 유전자의 하류에 인핸서 또는 프로모터를 삽입하여, 그 유전자의 발현을 제어하는 것도 포함한다. 또한, 생물이 본래 갖는 유전자를 포함하는 세포의 그 유전자의 하류에 인핸서 또는 프로모터를 삽입한 세포도 포함한다. 더욱이, 발현시키고자 하는 유전자로서, RNA 간섭 작용을 갖는 siRNA, shRNA, miRNA 등을 코드하는 DNA 등을 들 수 있다. RNA 간섭 작용을 갖는 RNA를 이용하는 경우, 트랜스퍼 RNA 프로모터를 이용하여 이들의 RNA를 전사 제조시킴으로써 특정한 유전자의 발현 억제가 가능하게 된다.

예컨대, 이들 유전자 중, REIC/Dkk-3 유전자 등을 종양의 치료에 이용할 수 있고, 전장 유전자뿐만 아니라 그 단편도 이용할 수 있으며, 예컨대, 서열번호 18에 나타내는 REIC/Dkk-3 단백질의 아미노산 서열 중의 제1번째의 아미노산으로 시작되고 제39번째 아미노산∼제78번째 중 어느 한 아미노산으로 끝나는 아미노산 서열, 혹은 서열번호 18에 나타내는 REIC/Dkk-3 단백질의 아미노산 서열 중의 제1번째의 아미노산으로 시작되고 제39번째 아미노산∼제78번째 중 어느 한 아미노산으로 끝나는 아미노산 서열에 있어서 하나 혹은 수개의 아미노산을 치환, 결실 또는 부가하여 이루어지는 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 아포토시스 활성을 갖는 폴리펩티드를 코드하는 DNA를 들 수 있다. 이들 DNA 중에서도 서열번호 18에 나타내는 REIC/Dkk-3 단백질의 아미노산 서열의 1∼78번째의 아미노산으로 이루어지는 펩티드를 코드하는 DNA(N78-REIC DNA)가 적합하게 이용된다.

또한, 검출이나 질환의 진단을 위해 리포터 유전자가 포함되어 있더라도 좋다.

프로모터는 DNA를 주형으로 전사를 시작하는 DNA 상의 특정한 염기 서열이며, 일반적으로 공통의 서열을 갖는다. 예컨대, 대장균 등의 원핵생물에서는, 통상 전사 개시 부위의 -10 염기쌍 부위에 TATAATG 서열을, -35 염기쌍 부위에 TTGACA 서열을 갖는다. 또한, 진핵생물에서는, 통상 -20 염기쌍 부위에 TATA 박스를 갖는다. 본 발명의 발현용 카세트는, 발현시키고자 하는 유전자의 상류에 반드시 제1 프로모터를 지니고, 또한 발현시키고자 하는 유전자의 하류에 제2 프로모터를 갖더라도 좋다. 이들 제1 프로모터 및 제2 프로모터로서 이용하는 프로모터는 한정되지 않으며, 제1 프로모터와 제2 프로모터는 동일하더라도 다르더라도 좋다. 온갖 세포나 조직에서 외래 유전자를 발현을 촉진시킬 수 있는 비특이적 프로모터도 조직 혹은 기관 특이적 프로모터, 종양 특이적 프로모터, 발생 혹은 분화 특이적 프로모터 등의 특이적 혹은 선택적 프로모터도 이용할 수 있다. 예컨대, 제1 프로모터로서 특이적 프로모터를 이용하고, 제2 프로모터로서 비특이적인 프로모터를 이용할 수 있다. 본 발명에 있어서 이용하는 프로모터로서, 암·종양 특이적 프로모터로서는 hTERT(인간 텔로머라아제 역전사 효소), PSA(전립선 특이적 항원), c-myc, GLUT 프로모터 등을, ES 세포·암 줄기 세포 특이적 프로모터로서는 OCT3/4, NANOG 프로모터 등을, 신경줄기 세포 특이적 프로모터로서는 Nestin 프로모터 등을, 세포 스트레스 감지 프로모터로서는 HSP70, HSP90, p53 프로모터 등을, 간세포 특이적 프로모터로서는 알부민 프로모터 등을, 방사선 감수성 프로모터로서는 TNF-알파 프로모터 등을, 감염 플라스미드의 카피수를 증가시키는 프로모터로서는 SV40 프로모터 등을, 증식성 세포 특이적 프로모터로서 EF1-알파 프로모터 등을 들 수 있다. 더욱 구체적으로는, 예컨대, 제1 프로모터로서, CMV-i 프로모터(hCMV+인트론 프로모터)(서열번호 5), β 액틴 프로모터, CAG 프로모터(서열번호 12), CMV 프로모터 등이 이용되고, 제2 프로모터로서 CMV 프로모터 등이 이용된다. β 액틴 프로모터의 유래 동물종은 한정되지 않고, 포유류 β 액틴 프로모터, 예컨대, 인간 β 액틴 프로모터(서열번호 8)나 닭 액틴 프로모터가 이용된다. 또한, 상기한 CMV-i 프로모터 등의 인공적인 하이브리드 프로모터도 이용할 수도 있다. CMV-i 프로모터는 미국 특허 제5168062호 명세서나 미국 특허 제5385839호 명세서의 기재에 기초하여 합성할 수 있다. 프로모터는 프로모터 활성을 갖는 최소 서열로 이루어지는 코어 프로모터 부분을 이용하더라도 좋다. 코어 프로모터란, 정확한 전사 개시를 유도하는 기능을 갖는 프로모터 영역을 말하며, TATA 박스를 포함하는 경우가 있다. 상기한 프로모터 중, hTERT 프로모터 등의 암·종양 특이적 프로모터는, 암을 타겟으로 하여 유전자 발현에 의한 유전자 치료, 암 진단용에 적합하게 이용할 수 있으며, hTERT 프로모터를 포함하는 컨스트럭트 21번을 이러한 용도로 이용할 수 있다.

폴리A 부가 서열(폴리아데닐화 서열, 폴리A)의 유래는 한정되지 않고, 성장 호르몬 유전자 유래의 폴리A 부가 서열, 예컨대 소 성장 호르몬 유전자 유래의 폴리A 부가 서열(서열번호 6에 나타내는 염기 서열에 포함됨(13번째 염기 이후의 서열))이나 인간 성장 호르몬 유전자 유래 폴리A 부가 서열, SV40 바이러스 유래 폴리A 부가 서열, 인간이나 토끼의 β 글로빈 유전자 유래의 폴리A 부가 서열 등을 들 수 있다. 폴리A 부가 서열을 발현용 카세트에 포함하게 함으로써, 전사 효율이 증대된다.

인핸서는, 전사에 의해 생성되는 메신저 RNA(mRNA)의 양을 결과적으로 증가시키는 것이라면 한정되지 않는다. 인핸서는 프로모터의 작용을 촉진하는 효과를 갖는 염기 서열이며, 일반적으로는 100 bp 전후로 이루어지는 것이 많다. 인핸서는 서열의 방향에 관계없이 전사를 촉진할 수 있다. 본 발명에서 이용되는 인핸서는 1종류라도 좋지만, 2개 이상의 동일한 인핸서를 복수 이용하거나, 또는 다른 복수의 인핸서를 조합시켜 이용하더라도 좋다. 또한, 다른 복수의 인핸서를 이용하는 경우, 그 순번은 한정되지 않는다. 예컨대, CMV 인핸서(서열번호 7), SV40 인핸서, hTERT(Telomerase Reverse Transcriptase) 인핸서 등을 이용할 수 있다. 일례로서, hTERT 인핸서, SV40 인핸서 및 CMV 인핸서를 이 순서로 연결한 것을 들 수 있다.

또한 발현시키고자 하는 단백질을 코드하는 DNA 및 폴리A 부가 서열을 포함하는 DNA 구축물의 상류에 복수의 인핸서, 예컨대 1∼4개의 인핸서가 연결되어 있더라도 좋다. 이 상류에 연결하는 인핸서는 한정되지 않지만, CMV 인핸서가 바람직하다. 예컨대, CMV 인핸서를 4개 연결한 4×CMV 인핸서(서열번호 11) 등을 들 수 있다.

인핸서를 「프로모터-발현시키고자 하는 유전자-폴리A 부가 서열」로 이루어지는 DNA 구축물의 바로 하류에 삽입하면, 종래의 일반적인 유전자 발현 시스템과 비교하여, 강력한 발현시키고자 하는 유전자의 단백질 발현이 가능하게 된다.

특히, CMV i 프로모터와 CMV 인핸서의 조합에 의해서, 거의 모든 세포(숙주 세포)에 있어서, 온갖 유전자를 삽입한 경우에, 어떠한 트랜스펙션 시약을 이용한 경우에 있어서도, 발현시키고자 하는 유전자의 강력한 단백질 발현이 가능하게 된다.

CMV 인핸서를 프로모터의 상류에 1개 이상 삽입함으로써, 특정한 세포(예컨대, 후기하는 실시예의 HEK293 세포주나 MCF7 세포주)에 있어서, 특정한 유전자, 예컨대, 후기하는 실시예의 REIC/Dkk-3 유전자나 CD133 유전자에 있어서, 발현이 더욱 증강된다. 또한, CMV 인핸서를 프로모터 앞에 4개 삽입함으로써, 특정한 세포(예컨대, 후기하는 실시예의 HepG2 세포주나 HeLa 세포주)에 의해서는 더욱 발현이 증강된다.

한편, 상류에 CMV 인핸서를 삽입한 것만으로는, 유전자 발현은 조금밖에 상승하지 않거나, 혹은 조금밖에 변화되지 않는다(도 1 및 도 2). 본 발명의 발현용 카세트에 있어서는, 폴리A 부가 서열의 바로 하류에 CMV 인핸서가 삽입 연결되어 있는 것이 중요하다.

또한, RU5'(서열번호 9)가 발현시키고자 하는 단백질을 코드하는 DNA의 바로 상류에 연결되어 있더라도 좋다. 바로 상류란, 다른 특정한 기능을 갖는 엘리멘트를 통하지 않고 직접 연결되어 있는 것을 말하는데, 링커로서 짧은 서열이 사이에 포함되어 있더라도 좋다. RU5'는 HTLV 유래의 LTR로, 삽입함으로써, 단백질 발현을 상승시키는 엘리멘트이다(Mol. Cell. Biol., Vol. 8(1), p.466-472, 1988). RU5'를 보고되어 있는 것과 반대로 삽입함으로써, 프로모터의 인핸서 삽입에 의한 발현 증강 효과가 상쇄되는 경우가 있다.

더욱이, 인핸서 및/또는 프로모터의 바로 상류에 UAS가 연결되어 있더라도 좋다. UAS란, GAL4 유전자의 결합 영역이며, 뒤에 GAL4 유전자를 삽입함으로써, 단백질 발현이 상승되게 된다.

또한, 발현용 카세트의 최상류에 SV40-ori가 연결되어 있더라도 좋다. SV40-ori는 SV40 유전자의 결합 영역이며, 뒤에 SV40 유전자를 삽입함으로써, 단백질 발현이 상승한다.

상기한 각 엘리멘트는 기능적으로 연결되어 있을 필요가 있다. 여기서, 기능적으로 연결되어 있다는 것은, 각각의 엘리멘트가 그 기능을 발휘하여, 발현시키고자 하는 유전자의 발현이 증강되도록 연결되어 있는 것을 말한다.

도 7∼21, 36, 37, 49, 55∼58에 여러 가지 발현용 카세트의 컨스트럭트 구조를 도시한다. 본 발명에 있어서, 컨스트럭트를 플라스미드의 골격이라고도 한다. 본 발명의 발현시키고자 하는 유전자의 발현을 증강하는 컨스트럭트로서, 예컨대, 컨스트럭트 2번(도 8), 4번(도 10), 6번(도 12), 8번(도 14), 10번(도 16), 12번(도 18), 14번(도 20), 15번(도 36), 16번(도 37), 17번(도 49), 20번(도 57) 및 21번(도 58)에 도시하는 컨스트럭트를 들 수 있다. 또한, 도 21에 도시하는 컨스트럭트도 포함된다.

이들 컨스트럭트 중에서, 유전자 발현의 상승이라는 관점에서는, 목적 유전자의 하류에 3개의 인핸서가 연결되어 있는 컨스트럭트 14번, 컨스트럭트 15번 및 컨스트럭트 16번의 컨스트럭트가 가장 우수하다. 예컨대, 컨스트럭트 14번에 목적 유전자로서 REIC 전장 유전자를 이용함으로써, 그 단백질 발현량은, 100 MOI에서의 아데노바이러스 벡터(전장 REIC/Dkk-3 유전자를 코드)인 경우의 발현량에 필적한다. 또한, 컨스트럭트 14번의 플라스미드 골격은, N78-REIC를 코드하는 DNA와 같은 유전자 단편에 있어서도 유전자 발현 상승 효과를 보인다.

예컨대, 컨스트럭트 14번의 컨스트럭트에 N78-REIC를 코드하는 DNA 단편을 포함하는 제제를, 인간 전립선암 세포 PC3에 트랜스펙션함으로써, 현저한 암 세포 증식 억제 효과 및 암 세포사 유도 효과가 인정된다. 컨스트럭트 14번의 컨스트럭트에 전장 REIC 유전자를 코드한 제제를, 인간 전립선암 세포 PC3에 트랜스펙션함으로써, 암 세포 증식 억제 효과가 인정된다.

또한, 컨스트럭트 14번에 인간 에리트로포이에틴 등의 단백질을 코드하는 DNA를 삽입하여, 발현 벡터를 제작하고, 이 발현 벡터를 이용하여 세포를 트랜스펙트함으로써, 상기 세포를 이용하여 상기 단백질을 대량으로 제조할 수 있다.

본 발명에 있어서 상기 서열번호의 염기 서열로 나타내어지는 DNA는, 각각의 DNA가 갖는 활성 또는 각각의 DNA가 코드하는 단백질 혹은 폴리펩티드가 갖는 활성을 갖고 있는 한, 염기 서열에 변이를 갖고 있더라도 좋다. 예컨대, 각각의 서열번호로 나타내어지는 염기 서열에 상보적인 염기 서열을 갖는 DNA와 스트린젠트 조건 하에서 하이브리다이즈하는 DNA, 각각의 서열번호로 나타내어지는 염기 서열과, BLAST(Basic Local Alignment Search Tool at the National Center for Biological Information(미국국립생물학정보센터의 기본 로컬 얼라인먼트 검색 툴)) 등(예컨대, 디폴트 즉 초기 설정의 파라미터를 이용하여)을 이용하여 계산했을 때에, 적어도 85% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 더욱 바람직하게는 95% 이상, 특히 바람직하게는 97% 이상의 상동성을 갖고 있는 DNA, 또는 상기 DNA에 의해 코드되는 단백질 혹은 폴리펩티드의 아미노산 서열에 대하여 1 또는 복수 혹은 수개(1∼10개, 바람직하게는 1∼5개, 더욱 바람직하게는 1개 혹은 2개)의 아미노산이 치환, 결실 및/또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지는 단백질 혹은 폴리펩티드를 코드하는 DNA도 본 발명의 DNA 구축물의 구축에 이용할 수 있다. 여기서, 「스트린젠트 조건」이란, 예컨대, 「1XSSC, 0.1% SDS, 37℃」정도의 조건이며, 보다 엄한 조건은 「0.5XSSC, 0.1% SDS, 42℃」정도의 조건이고, 더욱 엄한 조건은 「0.2XSSC, 0.1% SDS, 65℃」정도의 조건이다. 이와 같이 하이브리다이제이션 조건이 엄격하게 될 수록 프로브 서열과 높은 상동성을 갖는 DNA의 단리를 기대할 수 있다. 다만, 상기한 SSC, SDS 및 온도 조건의 조합은 예시이며, DNA의 농도, DNA의 길이, 하이브리다이제이션의 반응 시간 등을 적절하게 조합함으로써, 필요한 스트린젠시를 실현하는 것이 가능하다.

본 발명의 발현용 카세트를 삽입하는 벡터로서는, 플라스미드, 아데노바이러스 벡터, 아데노 수반 바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 헤르페스바이러스 벡터, 센다이바이러스 벡터 등의 바이러스 벡터나 생분해성 폴리머 등의 비(非)바이러스 벡터를 들 수 있다. 상기 발현용 카세트를 도입한 벡터를, 감염, 일렉트로포레이션 등의 공지된 방법에 의해 세포에 도입하면 된다.

또한, 이 때, 공지된 트랜스펙션 시약을 이용하여 도입하더라도 좋다.

본 발명의 발현용 카세트를 삽입한 벡터를 세포에 도입하여, 그 세포를 트랜스펙트함으로써, 상기 세포에서 목적 유전자를 발현시켜, 목적 단백질을 생성할 수 있다. 본 발명의 발현 카세트를 도입하여 목적 단백질을 생성하게 하기 위해서는, 진핵 세포 또는 원핵 세포계를 사용할 수 있다. 진핵 세포로서는, 예컨대 수립된 포유류 세포계, 곤충 세포계, 진사상균 세포 및 효모 세포 등의 세포 등을 들 수 있고, 원핵 세포로서는, 예컨대 대장균, 고초균, 브레비바실러스(Brevibacillus)속 세균 등의 세균 세포를 들 수 있다. 바람직하게는, Hela 세포, HEK193 세포, CHO 세포, 예컨대 CHO, COS 세포, BHK 세포, Vero 세포 등의 포유류 세포가 이용된다. 형질전환된 상기한 숙주 세포를 시험관내 또는 생체내로 배양하여 목적으로 하는 단백질을 생성시킬 수 있다. 숙주 세포의 배양은 공지된 방법에 따라서 행한다. 예컨대, 배양액으로서, DMEM, MEM, RPMI1640, IMDM 등의 공지된 배양용 배지를 사용할 수 있다. 발현된 단백질은, 분비 단백질의 경우는 배양액 중에서, 비분비 단백질의 경우는 세포 추출물 중에서 공지된 방법으로 정제할 수 있다. 목적 단백질을 발현하여 생산하는 경우, 세포에 별개의 목적 유전자를 포함하는 복수의 벡터를 동시에 트랜스펙트시켜 생산하더라도 좋다. 이와 같이 함으로써, 한 번에 복수의 단백질을 생성할 수 있다.

또한, 시판되는 벡터를 개변하여, 본 발명의 발현용 카세트가 포함되도록 하더라도 좋다. 예컨대, pShuttle 벡터 등의 시판되는 벡터의 발현 유전자 카세트의 하류 영역에 인핸서를 도입하여 이용할 수 있다. 본 발명의 벡터는 시판되는 카세트를 개변한 것도 포함한다.

본 발명은, 또한, 상기한 발현시키고자 하는 유전자 발현용 카세트를 포함하는 아데노바이러스(Ad) 벡터 및 아데노 수반 바이러스(AAV) 벡터를 포함한다. 상기 벡터는 암 등의 질환의 특이적 진단 또는 치료를 가능하게 한다. 상기 벡터는 아데노바이러스 또는 아데노 수반 바이러스에 상기한 발현시키고자 하는 유전자 발현용 카세트를 삽입하여 제작할 수 있다.

아데노바이러스 벡터의 특징으로서, (1) 많은 종류의 세포에 유전자 도입을 할 수 있고, (2) 증식 정지기의 세포에 대하여도 효율적으로 유전자 도입을 할 수 있으며, (3) 원심에 의해 농축이 가능하고, 높은 타이터(10∼11 PFU/ml 이상)의 바이러스를 얻을 수 있고, (4) 생체내의 조직 세포에의 직접 유전자 도입에 적합하다고 하는 점을 들 수 있다.

유전자 치료용의 아데노바이러스로서는, E1/E3 영역을 결실시킨 제1 세대의 아데노바이러스 벡터(Miyake, S., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 93, 1320, 1996)로부터, E1/E3 영역에 더하여, E2 혹은 E4 영역을 결실시킨 제2 세대의 아데노바이러스 벡터(Lieber, A., et al., J. Virol., 70, 8944, 1996; Mizuguchi, H.& Kay, M.A., Hum. Gene Ther., 10, 2013, 1999), 아데노바이러스 게놈을 거의 완전히 결실시킨(GUTLESS) 제3 세대의 아데노바이러스 벡터(Steinwaerder, D.S., et al., J. Virol., 73, 9303, 1999)가 개발되어 있지만, 본 발명에 따른 유전자를 도입하기 위해서는, 특별히 한정되지 않고 어느 아데노바이러스 벡터라도 사용 가능하다.

아데노 수반 바이러스는, 파르보바이러스속 1본쇄 DNA 바이러스이며, (1) 유전자 장기 발현, (2) 저독성, (3) 분열 및 비분열 세포에 유전자 도입이 가능하다고 하는 특성을 갖는다. 연쇄체(concatamer; 1본쇄 DNA가 연결된 복합체)의 형성이 유전자 장기간 발현의 원인으로 되어 있다.

본 발명의 발현시키고자 하는 유전자의 발현용 카세트를 포함하여 표적이 되는 발현시키고자 하는 유전자를 발현할 수 있는 아데노바이러스(Ad) 벡터 및 아데노 수반 바이러스(AAV) 벡터는 질환 검출 또는 질환 치료에 이용할 수 있다. 질환으로서는, 암 등을 들 수 있고, 아데노바이러스 벡터 또는 아데노 수반 바이러스 벡터의 외피에 삽입된 특정한 세포에 발현하고 있는 단백질에 선택적으로 결합하는 RGD 등의 펩티드에 의해 상기 세포를 지향하고, 그 세포에 감염하여, 발현시키고자 하는 유전자가 발현한다. 발현시키고자 하는 유전자가 루시페라아제 유전자 등의 리포터 유전자인 경우, 특정한 세포를 발광 등에 의해 검출할 수 있다. 특정한 세포가 암 세포인 경우, 피험체에 투여함으로써, 피험체 내의 암 세포를 검출하여, 그 피험체가 암에 걸렸음을 진단할 수 있다. 본 발명의 아데노바이러스 벡터 및 아데노 수반 바이러스 벡터는 세포 1개를 검출할 수 있기 때문에, 예컨대 미소 암의 검출에 이용할 수 있다.

또한, 발현시키고자 하는 유전자가 치료용 유전자인 경우, 특정한 세포 중에서 표적이 되는 발현시키고자 하는 유전자가 발현하여, 치료 효과를 발휘할 수 있다. 예컨대, 특정한 세포가 암 세포이며, REIC/Dkk-3 유전자 등의 암 억제 유전자를 이용한 경우, 피험체에 투여함으로써, 피험체의 암 세포에 암 치료용 유전자가 딜리버리되고, 암 세포 중에서 유전자가 발현하여, 치료 효과를 발휘한다. 본 발명은, 이러한 아데노바이러스 벡터 또는 아데노 수반 바이러스 벡터를 포함하는 진단 또는 치료용 바이러스 제제를 포함한다. 치료용 유전자로서, 인간 REIC/Dkk-3 유전자 등의 암 억제 유전자를 이용한 경우의 치료 대상이 되는 암으로서는, 본 발명의 치료 대상이 되는 암은, 예컨대, 뇌·신경종양, 피부암, 위암, 폐암, 간암, 임파종·백혈병, 결장암, 췌장암, 항문·직장암, 식도암, 자궁암, 유방암, 부신암, 신장암, 신우뇨관암, 방광암, 전립선암, 요도암, 음경암, 정소암, 골·골육종, 평활근종, 횡문근종, 중피종 등을 들 수 있다. 본 발명의 아데노바이러스 벡터 및 아데노 수반 바이러스 벡터는 원발성 암의 치료에도 전이성 암의 치료에도 이용할 수 있다.

본 발명의 아데노바이러스 벡터 및 아데노 수반 바이러스 벡터는, 유전자 치료 분야에서 사용 가능한 방법, 예컨대, 정맥내 투여나 동맥내 투여 등의 혈관내 투여, 경구 투여, 복강내 투여, 기관내 투여, 기관지내 투여, 피하 투여, 경피 투여 등에 의해 투여할 수 있다. 특히, 본 발명의 아데노바이러스 벡터 및 아데노 수반 바이러스 벡터는 특정한 조직, 세포에의 지향성이 크고, 표적 유전자를 효율적으로 특정한 조직, 세포에 딜리버리할 수 있기 때문에, 혈관내 투여에 의해서도 효율적으로 진단, 치료를 할 수 있다.

아데노바이러스 벡터 및 아데노 수반 바이러스 벡터는 치료상 유효량을 투여하면 된다. 치료상의 유효량은 유전자 치료 분야의 당업자라면 용이하게 결정할 수 있다. 또한, 투여량은 피험자의 병태의 중독도, 성별, 연령, 체중, 습관 등에 의해서 적절하게 변경할 수 있다. 예컨대, 아데노바이러스 벡터 및 아데노 수반 바이러스 벡터를, 0.5×10¹¹∼2.0×10¹² viral genome/kg 체중, 바람직하게는 1.0×10¹¹∼1.0×10¹² viral genome/kg 체중, 더욱 바람직하게는 1.0×10¹¹∼5.0×10¹¹ viral genome/kg 체중의 양으로 투여하면 된다. viral genome은, 아데노바이러스 또는 아데노 수반 바이러스의 게놈의 분자수(바이러스 입자수)를 나타내고, particle라고 기재하는 경우도 있다. 제제 분야에서 통상 이용되는 담체, 희석제, 부형제를 포함한다. 예컨대, 정제용의 담체, 부형제로서는, 젖당, 스테아린산마그네슘 등이 사용된다. 주사용의 수성액으로서는, 생리식염수, 포도당이나 그 밖의 보조약을 포함하는 등장액 등이 사용되고, 적당한 용해보조제, 예컨대 알코올, 프로필렌글리콜 등의 폴리알코올, 비이온 계면활성제 등과 병용하더라도 좋다. 유성액으로서는, 참깨유, 대두유 등이 사용되고, 용해보조제로서는 안식향산벤질, 벤질알코올 등을 병용하더라도 좋다.

또한, 목적 유전자를 포함하는 본 발명의 발현 카세트를 포함하는 발현 벡터를 암 등에 대한 백신이나 DNA 백신으로서 이용할 수도 있다(Kaufman, H. L. et al., J. Clin. Oncol. 22, 2122-2132(2004); McNeel, D. G. et al., J. Clin. Oncol. 27, 425-430(2009)). 예컨대, 암 특이적 항원을 표적 단백질로 하여, 그 단백질을 코드하는 유전자를 도입한 본 발명의 발현 카세트를 포함하는 발현 벡터를 피하에의 주입 등에 의해 생체 내에 투여하고, 상기 항원을 생체 내에서 발현시켜, 그 항원에 대한 숙주의 세포성 면역이나 항체 면역의 활성화를 유도할 수 있다. 이와 같이 백신으로서 이용함으로써, 본 발명의 발현 카세트를 암 등의 질환의 예방이나 치료에 이용할 수 있다.

본 발명을 이하의 실시예에 의해 구체적으로 설명하지만, 본 발명은 이들 실시예에 의해서 한정되는 것은 아니다.

실시예 1 : CMV 프로모터를 포함하는 발현용 카세트

본 발명의 발현용 카세트를 작성하고, 트랜스펙트하여, 발현 단백질을 웨스턴 블롯에 의해 분석했다.

(1) 이용한 발현용 카세트의 컨스트럭트

컨스트럭트 1번(도 7)

발현시키고자 하는 유전자의 상류에 CMV i 프로모터를 탑재한 유전자 발현 플라스미드이다. 또한, 상기 유전자의 하류에 BGH 폴리A(소 성장 호르몬 폴리A 부가 서열)가 연결되어 있다. 즉, 일반적으로 사용되고 있는 CMV i 프로모터를 이용한 발현 플라스미드와, 단백질 발현력은 동등하다고 생각된다.

컨스트럭트 2(도 8)

컨스트럭트 1번의 BGH 폴리A의 바로 하류에 CMV 인핸서를 삽입한 것이다.

컨스트럭트 3번(도 9)

컨스트럭트 1번의 CMV i 프로모터를 인간 β 액틴 프로모터로 치환한 것이다.

컨스트럭트 4번(도 10)

컨스트럭트 3번의 BGH 폴리A의 바로 하류에 CMV 인핸서를 삽입한 것이다.

컨스트럭트 5번(도 11)

컨스트럭트 3번의 인간 β 액틴 프로모터의 바로 하류에 RU5' 영역을 삽입한 것이다.

컨스트럭트 6번(도 12)

컨스트럭트 5번의 BGH 폴리A의 바로 하류에 CMV 인핸서를 삽입한 것이다.

컨스트럭트 7번(도 13)

컨스트럭트 5번의 인간 β 액틴 프로모터의 바로 상류에 CMV 인핸서를 삽입한 것이다.

컨스트럭트 8번(도 14)

컨스트럭트 7번의 BGH 폴리A의 바로 하류에 CMV 인핸서를 삽입한 것이다.

컨스트럭트 9번(도 15)

컨스트럭트 7번의 RU5' 영역을 반대의 염기 서열로 한 것이다.

컨스트럭트 10번(도 16)

컨스트럭트 9번의 BGH 폴리A의 바로 하류에 CMV 인핸서를 삽입한 것이다.

컨스트럭트 11번(도 17)

컨스트럭트 5번의 인간 β 액틴 프로모터의 바로 상류에 4×CMV 인핸서(4개의 CMV 인핸서)를 삽입한 것이다.

컨스트럭트 12번(도 18)

컨스트럭트 11번의 BGH 폴리A의 바로 하류에 CMV 인핸서를 삽입한 것이다.

컨스트럭트 13번(도 19)

CAG 프로모터를 탑재한 유전자 발현 플라스미드이다. 즉, 일반적으로 사용되고 있는 CAG 프로모터를 이용한 발현 플라스미드와, 단백질 발현력은 동등하다고 생각된다.

컨스트럭트 14번(도 20)

지금까지의 여러 가지 상기한 컨스트럭트를 조사한 결과로부터, BGH 폴리A의 바로 하류에 CMV 인핸서를 삽입함으로써, 유전자 발현이 현저히 증강하는 것이 판명되었기 때문에, 컨스트럭트 14번에서는 또한, 다른 인핸서인 hTERT 인핸서와 SV40 인핸서를 연결했다. 그 결과로서, 컨스트럭트 2번보다도 우수한 컨스트럭트가 되었다고 생각된다.

전장 REIC/Dkk-3 유전자를 코드하는 아데노바이러스의 컨스트럭트(도 21)

REIC/Dkk-3(Ad-REIC)의 전장 cDNA를 코스미드 벡터 pAxCAwt에 도입하고, 이어서 COS-TPC 방법(TAKARA Bio)에 의해 아데노바이러스 벡터로 트랜스퍼했다. 이 때, LacZ 유전자를 유지하는 아데노바이러스 벡터(Ad-LacZ)를 컨트롤로서 이용했다. 이용한 아데노바이러스 벡터는 일본 특허 3813872호 공보에 기재되어 있는 것과 같다.

도 22∼도 35에 이하의 엘리멘트 또는 컨스트럭트의 염기 서열을 도시한다.

도 22a 및 도 22b(도 22a의 계속)는, pDNR-1r Donor vector(프로모터가 없는 클로닝용 플라스미드 벡터(Clontech사, 품번 PT3616-5))의 전염기 서열을 도시한다.

도 23은 pIDT-SMART 벡터(프로모터가 없는 클로닝용 플라스미드 벡터(IDT사))의 전염기 서열을 도시한다.

도 24는 CMV i 프로모터(hCMV+인트론 프로모터) 영역의 염기 서열을 도시한다. 상기 영역은, CMV i 프로모터 영역의 염기 서열의 이미 알려진 정보를 바탕으로, 인공 합성에 의해 작성했다.

도 25는 BGH polyA(3×stop+BGH polyA) 영역의 염기 서열을 도시한다.

상기 염기 서열 중의 「TAATAAA」 부분은 BGH polyA 서열 중에서도 보다 중요한 서열이다. 이 서열은, BGH polyA 영역의 염기 서열의 이미 알려진 정보를 바탕으로, 인공 합성에 의해 작성했다.

도 26은 CMV 인핸서 영역의 염기 서열을 도시한다. 이 서열은, CMV 인핸서 영역의 염기 서열의 이미 알려진 정보를 바탕으로, 인공 합성에 의해 작성했다.

도 27은 인간 β 액틴 프로모터 영역의 염기 서열을 도시한다. 이 서열은, InvivoGen사의 pDRIVE-hβActin-RU5'의 플라스미드를 입수하여, 그 해당 부분의 염기 서열을 PCR하여 증폭함으로써 작성했다.

도 28은 RU5' 정방향{HTLV Type 1 long terminal repeat의 R 세그멘트 및 U5 서열의 일부(R-U5')} 영역의 염기 서열을 도시한다. 이 서열은, {HTLV Type1 long terminal repeat의 R 세그멘트 및 U5 서열의 일부(R-U5')} 영역의 염기 서열의 이미 알려진 정보를 바탕으로, 인공 합성에 의해 작성했다.

도 29는 RU5' 역방향{HTLV Type1 long terminal repeat의 R 세그멘트 및 U5서열의 일부(R-U5')} 영역의 염기 서열을 도시한다. 이 서열은, {HTLV Type 1 long terminal repeat의 R 세그멘트 및 U5 서열의 일부(R-U5')} 영역의 염기 서열의 이미 알려진 정보를 바탕으로, 인공 합성에 의해 작성했다.

도 30은 4×CMV 인핸서 영역의 염기 서열을 도시한다. 도 30의 염기 서열 중에서, 하선이 그어져 있는 부분은, 소위 「짧은 CMV 인핸서」라고 불리는 것으로, 이것이 4개 있기 때문에, 4×CMV 인핸서가 된다. 한편, 전술한 CMV 인핸서는 「짧은 CMV 인핸서」를 포함하고 있고, 일반적으로는 CMV 인핸서라고 하는 경우, 긴 쪽을 가리킨다. 상기 서열은, CMV 인핸서 영역의 염기 서열의 이미 알려진 정보를 바탕으로, 인공 합성에 의해 작성했다.

도 31은 CAG 프로모터 영역의 염기 서열을 도시한다. 공지된 CAG 프로모터 영역의 염기 서열이다. 오리엔탈코보사로부터 제공받은 CAG 프로모터 탑재의 유전자 발현 벡터인 pCAGGS 플라스미드를 바탕으로, 그 해당 부분의 염기 서열을 PCR하여 증폭함으로써 작성했다.

도 32는 2IRES 인서트 영역의 염기 서열을 도시한다. 후기하는 도 5 및 도 6의 IRES 컨트롤 유전자의 염기 서열이다. BiP-IRES 영역(도 32의 염기 서열 중의 (1)의 프레임으로 둘러싼 소문자 부분)과 Myc-IRES 영역(도 32의 염기 서열 중의 (2)의 프레임으로 둘러싼 소문자 부분)의 2개의 정상 인간 DNA의 염기 서열을 이 순서로 이은 것으로, 삽입 유전자의 컨트롤 유전자로서 이용되는 유전자이다. 상기 서열은, BiP-IRES 영역과 Myc-IRES 영역의 염기 서열의 이미 알려진 정보를 바탕으로, 인공 합성에 의해 작성했다.

도 33은 SV40ori-UAS-CMVi-RU5' 영역의 염기 서열을 도시한다. 컨스트럭트 14번(가장 좋은 컨스트럭트)의 삽입 유전자(외래 유전자)보다 좌측의 삽입 부분의 염기 서열이다. 이 서열은, 그 부분에 포함되는 각각의 영역의 염기 서열의 이미 알려진 정보를 바탕으로, 인공 합성에 의해 작성했다. 도 33의 염기 서열 중의 (1)의 프레임으로 둘러싼 부분은 SV40 ori 영역을 나타내고, (2)의 프레임으로 둘러싼 부분은 CMV i 프로모터 영역을 나타내고, (3)의 프레임으로 둘러싼 부분은 RU5' 영역을 나타낸다.

도 34는 3×stop-BGH-polyA-UAS-hTERT 인핸서+SV40 인핸서+CMV 인핸서 영역의 염기 서열을 도시한다. 컨스트럭트 14번(가장 좋은 컨스트럭트)의, 삽입 유전자(외래 유전자)보다 우측(하류측)의 삽입 부분의 염기 서열이다. 이 서열은, 그 부분에 포함되는 각각의 영역의 염기 서열의 이미 알려진 정보를 바탕으로, 인공 합성에 의해 작성했다. 도 34 중의 염기 서열 중의 (1)의 프레임으로 둘러싼 대문자 부분은 BGH polyA 영역을, (2)의 프레임으로 둘러싼 소문자 부분은 hTERT 인핸서 영역을, (3)의 프레임으로 둘러싼 대문자 부분은 SV40 인핸서 영역을, (4)의 프레임으로 둘러싼 소문자 부분은 CMV 인핸서 영역을 나타낸다.

도 35a 및 35b는 컨스트럭트 14번 벡터의 전염기 서열을 도시한다. 도 20에 도시한 컨스트럭트 14번(가장 좋은 컨스트럭트)의 염기 서열을 나타내고, pIDT-SMART 벡터 부분(도 35a 중 염기 서열의 제10행째의 굵은 글씨 부분까지의 영역 및 도 35b 중 염기 서열의 아래에서부터 24행의 프레임으로 둘러싸인 GCGCGC 뒤의 영역)도 포함하는 모든 염기 서열이다. 이 서열은, 전술한 pIDT-SMART 벡터에, 직전의 2개로 나타낸(컨스트럭트 14번의) 삽입 유전자(외래 유전자) 좌우의 삽입 부분을 도입함으로써 작성했다. (1)은 SV-40 ori 영역, (2)는 CMV i 프로모터 영역을, (3)은 RU5' 영역을, (4)는 BiP IRES 영역을, (5)는 Myc IRES 영역을, (6)은 hTERT 인핸서 영역을, (7)은 SV40 인핸서 영역을 나타낸다.

(2) 이용한 외래 유전자(삽입 유전자)

6His-S100A11-HA

인간 정상 선유아세포의 상기 cDNA를 템플릿으로 하여, 그 5' 측에 6His의 링커를 붙인 프라이머와 3' 측에 HA의 링커를 붙인 프라이머로 PCR하여 작성했다.

GFP(Green fluorescent protein; 녹색형광단백질)

Clontech사 제품의 GFP 발현 벡터인, pEGFP-N2를 템플릿으로 하여 프라이머를 설정하고, PCR하여 작성했다.

REIC/Dkk-3(전장)

인간 정상 선유아세포의 상기 cDNA를 템플릿으로 하여 프라이머를 설정하고, PCR하여 작성했다.

N78­REIC-6His

상기에서 얻은 전장의 REIC/Dkk-3 유전자의 3' 측에 6His가 붙도록 프라이머를 설정하고, PCR하여 작성했다.

컨트롤 유전자(IRES)

여기서 말하는 이 IRES 컨트롤 유전자는, BiP-IRES 유전자와 Myc-IRES 유전자의 2개의 정상 인간 DNA의 이미 알려진 염기 서열을 이 순서로 이은 것으로, 인공 합성에 의해 작성했다. 이 유전자를 컨스트럭트 14번의 삽입 유전자(외래 유전자) 부분에 삽입함으로써, 후기하는 도 5 및 도 6에 있어서 REIC/Dkk-3(전장) 유전자 및 N78­REIC-6 His를 코드하는 DNA의 컨트롤 유전자로 했다.

CD133-6His

인간 정상 선유아세포의 상기 cDNA를 템플릿으로 하여 프라이머를 설정하고, PCR하여 작성했다.

LGR5-HA

인간 정상 선유아세포의 상기 cDNA를 템플릿으로 하여 프라이머를 설정하고, PCR하여 작성했다.

텔로머라제-6His

인간 정상 선유아세포의 상기 cDNA를 템플릿으로 하여 프라이머를 설정하고, PCR하여 작성했다.

KLF16

인간 정상 선유아세포의 상기 cDNA를 템플릿으로 하여 프라이머를 설정하고, PCR하여 작성했다.

(3) 트랜스펙션법과 웨스턴 블롯 분석(WB법)

각종 세포(6웰 플레이트로 70∼80% 컨플루언트로 배양한 것)에의 각종 유전자의 도입은, 각사의 트랜스펙션 시약: FuGENE(상표)-HD(Roche사), Lipofectamine(등록상표) 2000(Invitrogen사), Trans-IT-Keratinocyte(TAKARA Bio사)를 이용하여 행했다. 그 절차는 각각의 제품 매뉴얼에 기재된 대로 행했다.

발현된 외래 유전자(삽입 유전자) 웨스턴 블롯 분석은 다음의 방법으로 행했다.

세포를 PBS(phosphate buffered saline)를 이용하여 2회 세정하고, 용해 번퍼(lysis buffer)(50 mM HEPES, pH 7.4, 250 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% NP-40, 1 mM DTT, 1 mM PMSF, 5 ㎍/ml 류펩틴, 5 ㎍/ml 아프로티닌, 2 mM Na₃VO₄, 1 mM NaF, 10 mM β-GP)로 용해하여, 단백질을 추출했다. 원심 분리 후, 각 실험에 이용하는 각 상청의 단백질량을 동일 농도로 조정하고, 동량의 2×SDS 샘플 버퍼를 이용하여 희석했다. 이어서, 95℃에서 5분간 열처리했다. 샘플(10 ㎍ 단백질)을 7.5% 또는 그라디언트 SDS-PAGE 겔(Bio Rad사)로 분리하여 폴리불화피닐리덴(PVDF)막에 전사했다. 블롯을 10% 지방 불포함 밀크 파우더, 6% 글리신 및 0.1% Tween-20을 포함하는 TBS(Tris buffered saline)로 실온 1시간 블로킹했다. 이어서, 단백질을 이하의 일차 항체(1:1000 희석)를 이용하여 동정했다.

항HA 항체(Cell Signaling Technology사)

항GFP 항체(Clontech사)

항REIC 항체(토끼 항인간 REIC/Dkk-3 폴리클로날 항체)

항6His 항체(MBL사)

항KLF16 항체(Abcam사)

0.1% Tween-20 함유 TBS(T-TBS)로 충분히 세정하여, 블롯을 서양고추냉이 페록시다아제 컨쥬게이트 이차 항체와 반응시켰다. T-TBS로 충분히 세정한 후, 증강 화학발광(enhanced chemiluminescence) 검출법(ECL kit, Amersham Pharmacia Biotech사)에 의해 검출했다.

세포 배양은 다음의 방법으로 행했다.

HEK293(인간 정상 신장 유래), MCF7(인간 유방암 유래), PC3(인간 전립선암 유래), HeLa(인간 자궁암 유래), HepG2(인간 간암 유래)의 각 세포주는 ATCC(the American Type Culture Collection(Rockville, MD))로부터 입수했다. 이용한 배지는 이하와 같았다.

HEK293 : DMEM 고 글루코스 배지(Invitrogen사)

MCF7 : DMEM 고 글루코스 배지(Invitrogen사)

PC3 : F12 배지(Invitrogen사)

HeLa : DMEM 고 글루코스 배지(Invitrogen사)

HepG2 : DMEM 고 글루코스 배지(Invitrogen사)

상기 세포주를 10%(v/v) 태아 소 혈청, 페니실린(100 IU/ml) 및 스트렙토마이신(100 ㎍/ml)을 보충한 상기 배지에서 증식시켜 5% CO₂ 조건 하에서 인큐베이트했다.

결과를 도 1∼도 6에 도시한다.

도 1은 HEK293 세포주에 FuGENE(상표)-HD를 이용하여 36시간 트랜스펙트한 각종 외래 유전자의 발현을 도시한다. 컨스트럭트 1번의 단백질 발현력은, 일반적으로 사용(판매)되고 있는 CMV i 프로모터를 이용한 발현 플라스미드와 동등했다. 즉, 이들 발현 플라스미드의 단백질 발현력과 비교하여, 컨스트럭트 2번의 단백질 발현력은 현저하게 강하다고 말할 수 있다. 또한, 이하의 여러 가지 유전자에 있어서 같은 결과이며, 컨스트럭트 2번은, 모든 종류의 유전자의 발현에 있어서, 현재 널리 사용되고 있는 유전자 발현 시스템을 능가하고 있다고 말할 수 있다.

S100A11 : 암 증식에 관여한다고 생각됨; 세포질 내-핵 내 이행 단백질

GFP : 형광 단백질; 세포질 내 단백질

REIC/Dkk-3(전장) : 암 억제 단백질; 분비 단백질

N78­REIC : 상기한 유전자 단편을 바탕으로 만들어지는 단편 단백질(서열번호 2에 나타내는 REIC/Dkk-3 단백질의 아미노산 서열의 1∼78번째의 아미노산으로 이루어지는 단편 펩티드)

CD133 : 암 줄기 세포의 마커; 세포 표면에도 발현

LGR5 : 정상 세포 및 암 세포의 줄기 세포의 마커; 세포막 관통 단백질

텔로머라제 : 세포의 노화나 불사화에 관여; 세포질 내 단백질

KLF16 : 단백질의 전사에 관여; 핵 내 단백질

도 2는 여러 가지 세포주에 FuGENE(상표)-HD를 이용하여 36시간 트랜스펙트한 KLF 유전자의 발현을 도시한다. 도면에 도시한 모든 세포(HEK293 세포, MCF7 세포, PC3 세포, HeLa 세포, HepG2 세포)에 있어서, 컨스트럭트 2번의 단백질 발현력(KLF16의 유전자 발현)은, 컨스트럭트 1번과 비교하여 현저하게 강하다고 말할 수 있다. 즉, 컨스트럭트 2번은, 모든 종류의 세포에서의 유전자 발현에 있어서, 현재 널리 사용되고 있는 유전자 발현 시스템을 능가하고 있다고 말할 수 있다.

도 3은 HEK293 세포주에 각종 트랜스펙트 시약을 이용하여 36시간 트랜스펙트한 KLF 유전자의 발현을 도시한다. 어느 트랜스펙션 시약에 있어서도, 컨스트럭트 2번의 경우에, WB법에 의해 가장 많은 KLF16 단백질이 발현되고 있다. 컨스트럭트 1번은 일반적으로 입수 가능하며 일반적으로 자주 사용되고 있는 CMV i 프로모터를 포함하는 컨스트럭트이고, 컨스트럭트 13번은 마찬가지로 일반적으로 자주 사용되고 있는 CAG 프로모터를 포함하는 컨스트럭트이다. 즉, 현재 세계에서 유전자 발현용의 플라스미드 컨스트럭트로서 보급·사용되고 있는 컨스트럭트를 현저하게 능가하는 양의 단백질 발현(유전자 발현 과정 전체적인 효율의 향상)이 본 발명의 컨스트럭트 2번을 사용함으로써 가능하게 되었다.

도 4는 HEK293 세포주에 전장 REIC 유전자 및 N78-REIC를 코드하는 유전자 FuGENE(상표)-HD를 이용하여 36시간 트랜스펙트한 경우의 발현을 도시한다. 좌측 패널은, WB법에 의해, 컨스트럭트 14번에서는 컨스트럭트 2번의 경우보다 REIC/Dkk-3 단백질(전장)이 많이 발현되고 있음을 나타낸다. 즉, 도 1의 WB법의 결과(컨스트럭트 1번∼12번 중에서 2번이 가장 단백질을 많이 발현) 및 도 3의 WB법의 결과(컨스트럭트 1번, 2번, 11번, 12번, 13번 중에서 2번이 가장 단백질을 많이 발현)을 근거로 하면, 검토한 플라스미드 컨스트럭트 중에서 가장 많이 단백질을 발현할 수 있는 것(유용한 것)은 컨스트럭트 14번였다. 이 컨스트럭트 14번에 의한 단백질 발현의 능력은, 100 MOI에 있어서의 Ad-REIC(전장 REIC/Dkk-3 유전자를 코드하는 아데노바이러스)의 투여시와 동등한 정도로 강력했다. 우측 패널은, 단편 유전자인 N78-REIC-6His를 컨스트럭트 14번에 삽입했을 때도, 좌측 패널과 마찬가지라고 말할 수 있음을 나타낸다. 즉, 제시한 플라스미드 컨스트럭트 중에서 가장 많이 단백질을 발현할 수 있는 것(유용한 것)은, 컨스트럭트 14번였다.

도 5는 N78-REIC를 코드하는 DNA를 삽입한 컨스트럭트 14번에 의한, 인간 전립선암 세포 PC3 세포주의 증식 억제와 세포사 유도를 도시한다.

세포 생존율 어세이

PC3 세포주를 6웰 플레이트에 1웰당 50,000 세포의 밀도로 완전 배지 중에 파종했다. 24시간의 인큐베이션 후, 완전 배지 중에서 세포를 소정의 플라스미드에 FuGENE(상표)-HD 시약을 이용하여 트랜스펙트하여, 소정 일수 인큐베이트했다. 인큐베이션 후, 세포 생존율을 CellTiter 96(등록상표) Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay(Promega사)를 이용하여 측정했다.

통계 분석

2군 사이에서 Mann-Whitney U test를 행하여, p<0.05일 때 유의차가 있다고 판정했다.

도면에 도시하는 것과 같이 N78-REIC를 코드하는 DNA를 삽입한 컨스트럭트 14번의 투여 후 2일째와 5일째에 있어서, 컨트롤 유전자(IRES)를 삽입한 컨스트럭트 14번의 투여군과 비교하여, 유의적으로 PC3 세포주의 증식이 억제되었다(PC3 세포의 수가 N78-REIC를 코드하는 DNA-컨스트럭트 14번의 투여에 의해 감소하고 있으므로, 유의적으로 많이 세포사가 유도되었다고 말할 수 있다).

도 6은 전장 REIC 유전자를 삽입한 컨스트럭트 14번에 의한, 인간 전립선암 세포 PC3 세포주의 증식 억제를 도시한다.

세포 생존율 어세이

PC3 세포주를 6웰 플레이트에 1웰당 50,000 세포의 밀도로 완전 배지 중에 파종했다. 24시간의 인큐베이션 후, Hank's Balanced Salt Solutions 중에서 세포를 소정의 플라스미드에 FuGENE(상표)-HD 시약을 이용하여 트랜스펙트하여, 소정 일수 인큐베이트했다. 인큐베이션 후, 세포 생존율을 CellTiter 96(등록상표) Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay(Promega사)를 이용하여 측정했다.

통계 분석

2군 사이에서 Mann-Whitney U test를 행하여, p<0.05일 때 유의차가 있다고 판정했다.

도면에 도시하는 것과 같이 전장 REIC 유전자 삽입한 컨스트럭트 14번의 투여 후 2일째에 있어서, 컨트롤 유전자(IRES)를 삽입한 컨스트럭트 14번의 투여군과 비교하여, 유의적으로 PC3 세포의 증식이 억제되었다.

실시예 2 : SV40 프로모터 또는 hTERT 프로모터를 포함하는 발현용 카세트

GFP(Green fluorescent protein)를 목적 유전자(삽입 유전자)로서 포함하는 본 발명의 발현용 카세트를 작성하고, Hela 세포를 트랜스펙트하여, GFP 발현을 관찰함으로써 발현의 세기를 분석했다. 트랜스펙트는, 리포펙타민 2000을 이용하여 행하고, 48시간 후에 GFP 발현을 형광 현미경 하에서 관찰했다.

이용한 발현용 카세트의 컨스트럭트는 실시예 1에서 이용한 컨스트럭트 14번(도 20) 및 컨스트럭트 14번의 CMV i 프로모터를 SV40 프로모터로 치환한 컨스트럭트 15번(도 36)와 컨스트럭트 14번의 CMV i 프로모터를 hTERT 프로모터로 치환한 컨스트럭트 16번(도 37)이었다. GFP 유전자는 Clontech사 제품의 GFP 발현 벡터인, pEGFP-N2를 템플릿으로 하여 프라이머를 설정하고, PCR를 행하여 작성하여, 이것을 각 컨스트럭트의 목적 유전자 삽입부에 삽입하여 이용했다. 컨트롤로서 시판되는 GFP 발현 플라스미드 pEGFP-N1(Clontech사)을 이용했다.

컨스트럭트 15번의 발현 벡터의 SV40 ori+UAS+SV40 enh+intron A+RU5'의 영역을 포함하는 부분 단편의 염기 구조를 도 38에 도시하고, 그의 염기 서열을 서열번호 19에 나타낸다. 또한, 컨스트럭트 16번의 발현 벡터의 SV40 ori+UAS+hTERT enh+intron A+RU5'의 영역으로 이루어지는 부분 단편의 구조를 도 39에 도시하고, 염기 서열을 서열번호 20에 나타낸다. 더욱이, 도 40에 제한 효소 부위를 연결한 GFP를 코드하는 DNA의 염기 서열을 도시한다(서열번호 21). 도 38의 염기 서열 중의 (1), (2), (3) 및 (4)의 프레임으로 둘러싼 부분은, 각각 SV40 ori, SV40 프로모터, intron A 및 RU5'를 나타내고, 도 39의 염기 서열 중의 (1), (2), (3) 및 (4)의 프레임으로 둘러싼 부분은, 각각 SV40 ori, hTERT 프로모터, intron A 및 RU5'를 나타낸다. 컨스트럭트 14번의 발현 벡터에 GFP 유전자를 삽입한 벡터의 전장 염기 서열을 도 41a 및 도 41b(도 41a의 계속)에 도시한다(서열번호 22). 또한, 컨스트럭트 15번의 발현 벡터에 GFP 유전자를 삽입한 벡터의 전장 염기 서열을 도 42a 및 도 42b(도 41a의 계속)에 도시한다(서열번호 23). 더욱이, 컨스트럭트 16번의 발현 벡터에 GFP 유전자를 삽입한 벡터의 전장 염기 서열을 도 43a 및 도 43b(도 43a의 계속)에 도시한다(서열번호 24). 도 41a 및 도 41b의 염기 서열 중의 (1), (2), (3) 및 (4)의 프레임으로 둘러싼 부분은, 각각 CMV i 프로모터(P-CMViRU), GFP 유전자, Myc IRES, 3개의 인핸서(pA-3enh)를 나타내고, 도 42의 염기 서열 중의 (1), (2), (3) 및 (4)의 프레임으로 둘러싼 부분은, 각각 SV40 프로모터(P-SViRU), GFP 유전자, Myc IRES, 3개의 인핸서(pA-3enh)를 나타내고, 도 43의 염기 서열 중의 (1), (2), (3) 및 (4)의 프레임으로 둘러싼 부분은, 각각 hTERT 프로모터(P-TiRU), GFP 유전자, Myc IRES, 3개의 인핸서(pA-3enh)를 나타낸다.

컨스트럭트 15번는 SV40 단백질이 고발현되는 환경에서의 유전자의 강발현에 유리한 플라스미드 벡터이며, 컨스트럭트 16번은 암 세포 속 등의 hTERT 단백질이 고발현되는 환경에서의 유전자의 강발현에 유리한 플라스미드 벡터이다.

결과를 도 44에 도시한다. 도 44A, 44B, 44C 및 44D는, 각각 시판되는 GFP 발현 플라스미드(pEGFP-N1), 컨스트럭트 14번의 GFP 발현 플라스미드, 컨스트럭트 15번의 GFP 발현 플라스미드 및 컨스트럭트 16번의 GFP 발현 플라스미드의 결과를 도시한다. 도면 중 상단의 패널은 명시야를 나타낸다. 도면에 도시하는 것과 같이, CMV 프로모터, SV40 프로모터 및 hTERT 프로모터의 어느 것이나, 시판되는 플라스미드와 비교하여, 강한 GFP 유전자 발현이 인정되었다. 본 실시예는, 본 시스템(컨스트럭트 14번의 컨스트럭트 골격)은 이와 같이 프로모터를 변화시키더라도 유전자 증강을 위한 사용이 가능함을 나타낸다.

실시예 3 : 인간 에리트로포이에틴의 발현

인간 에리트로포이에틴을 외래 유전자(삽입 유전자)로서 포함하는 본 발명의 발현용 카세트를 작성하고, HEK293 세포를 트랜스펙트하여, 발현 단백질을 웨스턴 블롯에 의해 분석했다. 트랜스펙트는, FuGENE(상표)-HD를 이용하여 행하고, 24시간 후에 세포 배양액 중의 인간 에리트로포이에틴을 웨스턴 블롯팅에 의해 검출했다.

이용한 발현용 카세트의 컨스트럭트는 실시예 1에서 이용한 컨스트럭트 14번(도 20)이며, 목적 유전자(삽입 유전자)로서 인간 에리트로포이에틴을 코드하는 DNA를 삽입했다. 도 45에 제한 효소 부위를 연결한 인간 에리트로포이에틴을 코드하는 DNA의 염기 서열을 도시한다(서열번호 25). 컨트롤로서, 시판되는 발현 플라스미드인 pTracer(등록상표) -EF/V5-His-A(인비트로젠사) 및 pEF6/Myc-His-A(인비트로젠사)를 이용하여, 각각의 플라스미드의 제한 효소 사이트 EcoR1-Xba1 부위에 인간 에리트로포이에틴을 코드하는 DNA를 삽입했다.

웨스턴 블롯팅은, 항6His 항체(MBL사)를 이용하여 행하고, 트랜스펙트 24시간 후의 배양액 1 mL를 6His 아미노산으로 트랩하여 회수하고, 회수한 단백질 전량을 웨스턴 블롯팅에 이용했다.

결과를 도 46에 도시한다. 레인 1이 pTracer(등록상표) -EF/V5-His-A를 이용하여 발현시킨 것, 레인 2가 pEF6/Myc-His-A를 이용하여 발현시킨 것, 레인 3이 컨스트럭트 14번의 발현 플라스미드를 이용하여 발현시킨 것을 나타낸다. 도면에 도시하는 것과 같이, 컨스트럭트 14번의 발현 플라스미드를 이용한 경우에 가장 강한 발현이 인정되었다. 이 결과는, 본 시스템(컨스트럭트 14번의 컨스트럭트 골격)은, 에리트로포이에틴 등의 의약품, 진단약, 혹은 시약으로서 이용되는 단백질의 생산에, 유전자 증강에 기초한 양적 생산의 관점에서 유용함을 나타낸다.

실시예 4 : 인간 IgG의 발현

인간 IgG 경쇄 및 인간 IgG 중쇄를 목적 유전자(삽입 유전자)로서 포함하는 본 발명의 발현용 카세트를 작성하고, HEK293 세포를 트랜스펙트하여, 발현 단백질을 웨스턴 블롯에 의해 분석했다. 트랜스펙트는, FuGENE(상표)-HD를 이용하여 행하고, 24시간 후에 세포 추출액 및 세포 배양액 중의 인간 IgG 경쇄 및 인간 IgG 중쇄를 웨스턴 블롯팅에 의해 검출했다.

이용한 발현용 카세트의 컨스트럭트는 실시예 1에서 이용한 컨스트럭트 14번(도 20)이며, 목적 유전자(삽입 유전자)로서 인간 IgG 경쇄 또는 인간 IgG 중쇄를 코드하는 DNA를 삽입했다. 도 47에, 제한 효소 부위를 연결한 인간 IgG 경쇄(도 47a) 및 인간 IgG 중쇄(도 47b)를 코드하는 DNA의 염기 서열을 도시한다(각각, 서열번호 26 및 서열번호 27). 컨트롤로서, 시판되는 발현 플라스미드인 pTracer(등록상표) -EF/V5-His-A(인비트로젠사) 및 pEF6/Myc-His-A(인비트로젠사)를 이용하여, 각각의 플라스미드의 제한 효소 사이트 EcoR1-Xba1 부위에 인간 IgG 경쇄 또는 인간 IgG 중쇄를 코드하는 DNA를 삽입했다.

웨스턴 블롯팅은, 항6His 항체(MBL사)를 이용하여 행하고, 트랜스펙트 24시간 후의 세포 추출액(토탈 단백질량은 10 ㎍)과, 배양액 1 mL를 6His 아미노산으로 트랩하여 회수하여, 회수한 단백질 전량을 이용했다.

결과를 도 48에 도시한다. 도 48A가 인간 IgG 경쇄의 결과, 도 48B가 인간 IgG 중쇄의 결과를 도시한다. 도 48A, 48B 모두 레인 1이 pTracer(등록상표) -EF/V5-His-A를 이용하여 발현시킨 것, 레인 2가 pEF6/Myc-His-A를 이용하여 발현시킨 것, 레인 3이 컨스트럭트 14번를 이용하여 발현시킨 것을 나타낸다. 또한, 세포 추출액을 이용한 세포 내 발현의 결과와, 배양액을 이용한 결과를 나타낸다. 도면에 도시하는 것과 같이, 컨스트럭트 14번를 이용한 경우에 가장 강한 발현이 인정되었다. 이 결과는, 본 시스템(컨스트럭트 14번의 컨스트럭트 골격)은, 항체 등의 의약품, 진단약 혹은 시약으로서 이용되는 단백질의 생산에, 유전자 증강에 기초한 양적 생산의 관점에서 유용함을 나타낸다.

실시예 5 : 시판되는 플라스미드 벡터를 개변한 발현 벡터를 이용한 REIC 단백질의 발현

인간 REIC 유전자를 외래 유전자(삽입 유전자)로서 포함하는 본 발명의 발현용 카세트를 작성하고, HEK293 세포를 트랜스펙트하여, 발현 단백질을 웨스턴 블롯에 의해 분석했다. 트랜스펙트는, FuGENE(상표) HD를 이용하여 행하고, 24시간 후에 세포 추출액 중의 REIC 단백질을 웨스턴 블롯팅에 의해 검출했다.

이용한 발현용 카세트의 컨스트럭트는, 시판되는 pShuttle 플라스미드 벡터(Clontech)의 Xba1-Kpn1의 삽입부에 REIC를 코드하는 DNA를 삽입하고, 또한 그 REIC를 코드하는 DNA의 하류의 Kpn1-EcoR1의 삽입 부위에, 실시예 1에서 이용한 컨스트럭트 14번(도 20)의 발현 플라스미드의 발현 유전자의 하류에 존재하는 3개의 인핸서(hTERT 인핸서, SV40 인핸서 및 CMV 인핸서)를 BGH polyA+3개의 인핸서의 형태로 삽입하여 구축한 컨스트럭트 17번이었다(도 49). 컨트롤로서, 시판되는 pShuttle 플라스미드 벡터(Clontech)의 Xba1-Kpn1의 삽입부에 REIC를 코드하는 DNA를 삽입하여 구축한 벡터를 이용했다. 도 50에 REIC를 코드하는 DNA를 삽입한 컨스트럭트 17번의 발현 벡터의 전염기 서열을 도시한다(서열번호 28). 도 50의 염기 서열 중의 (1) 및 (2)의 프레임으로 둘러싼 부분은, 각각 REIC를 코드하는 DNA 및 3개의 인핸서(3xenh)를 나타낸다.

웨스턴 블롯팅은, 항REIC 항체를 이용하여 행하고, 트랜스펙트 24시간 후의 세포 추출액(토탈 단백질량은 10 ㎍)을 이용했다.

결과를 도 51에 도시한다. 레인 1이 외래 단백질을 발현시키지 않은 세포의 세포 추출액의 결과, 레인 2가 시판되는 pShuttle 벡터에 REIC를 코드하는 벡터로 트랜스펙트한 세포의 세포 추출액의 결과, 레인 3이 시판되는 pShuttle 벡터에 REIC를 코드하는 DNA를 삽입하고, 또한 3개의 인핸서를 REIC를 코드하는 DNA의 하류(BGH poly A의 하류)에 삽입한 발현 벡터로 트랜스펙트한 세포의 세포 추출액의 결과를 나타낸다. 도면에 도시하는 것과 같이, 컨스트럭트 17번을 이용한 경우에 가장 강한 발현이 인정되었다. 이 결과는, 본 시스템(컨스트럭트 14번의 컨스트럭트 골격)의 3개의 인핸서 부분을, pShuttle 벡터 등의 시판되는 플라스미드의 발현 유전자 카세트의 하류에 도입함으로써, 그 유전자 발현의 증강이 가능하게 됨을 나타낸다. 즉, 3개의 인핸서 영역을 여러 가지 유전자 컨스트럭트에 삽입하여 목적 유전자의 발현을 증강시키는 것이 가능함을 나타내고 있다.

실시예 6 : 시판 플라스미드 벡터를 개변한 발현 벡터를 이용한 c-myc 유전자의 발현

인간 c-mycC 유전자를 목적 유전자(삽입 유전자)로서 포함하는 본 발명의 발현용 카세트를 작성하고, HEK293 세포를 트랜스펙트하여, 발현 단백질을 웨스턴 블롯에 의해 분석했다. 트랜스펙트는, FuGENE(상표)-HD를 이용하여 행하고, 24시간 후에 세포 추출액 중의 REIC 단백질을 웨스턴 블롯팅에 의해 검출했다.

이용한 발현용 카세트의 컨스트럭트는, 시판되는 pShuttle 플라스미드 벡터(Clontech)의 Xba1-Kpn1의 삽입부에 REIC를 코드하는 DNA를 삽입하고, 또한 상기 REIC를 코드하는 DNA의 하류의 Kpn1-EcoR1의 삽입 부위에, 실시예 1에서 이용한 컨스트럭트 14번(도 20)의 발현 플라스미드의 발현 유전자의 하류에 존재하는 3개의 인핸서(hTERT 인핸서, SV40 인핸서 및 CMV 인핸서)를 BGH poly A+3개의 인핸서의 형태로 삽입하여 구축한 컨스트럭트였다. 컨트롤로서, 시판되는 pShuttle 플라스미드 벡터(Clontech)의 Xba1-Kpn1의 삽입부에 인간 c-myc을 코드하는 DNA를 삽입하여 구축한 벡터를 이용했다. 도 52에 삽입한 c-myc 유전자의 염기 서열을 도시하고(서열번호 29), 도 53에 컨스트럭트 14번에 포함되는 BGH poly A와 3개의 인핸서를 포함하는 영역의 염기 서열(서열번호 30)을 도시한다.

웨스턴 블롯팅은, 항c-mycC 항체(산타크루즈사, Cat 번호 : sc-70469)를 이용하여 행하고, 트랜스펙트 24시간 후의 세포 추출액(토탈 단백질량은 10 ㎍)을 이용했다.

결과를 도 54에 도시한다. 레인 1이 시판되는 pShuttle 벡터에 REIC를 코드하는 벡터로 트랜스펙트한 세포의 세포 추출액의 결과, 레인 2가 시판되는 pShuttle 벡터에 c-myc를 코드하는 DNA를 삽입하고, 또한 3개의 인핸서를 c-myc를 코드하는 DNA의 하류(BGH poly A의 하류)에 삽입한 발현 벡터로 트랜스펙트한 세포의 세포 추출액의 결과를 나타낸다. 도면에 도시하는 것과 같이, 시판되는 pShuttle 벡터에 c-myc를 코드하는 DNA를 삽입하고, 또한 3개의 인핸서를 c-myc를 코드하는 DNA의 하류(BGH poly A의 하류)에 삽입한 발현 벡터를 이용한 경우에 가장 강한 발현이 인정되었다. 이 결과는, 본 시스템(컨스트럭트 14번의 컨스트럭트 골격)의 3개의 인핸서 부분을, pShuttle 벡터 등의 시판되는 플라스미드의 발현 유전자 카세트의 하류에 도입함으로써, 그 유전자 발현의 증강이 가능하게 됨을 나타낸다. 즉, 3개의 인핸서 영역을 여러 가지 유전자 컨스트럭트에 삽입하여 목적 유전자의 발현을 증강시키는 것이 가능함을 나타내고 있다. 본 실시예의 결과는, 본 시스템(컨스트럭트 14번의 컨스트럭트 골격)의 3개의 인핸서 부분을, iPS 세포의 제작에 이용되는 c-myc 유전자의 발현용 플라스미드의 발현 유전자 카세트의 하류에 도입함으로써, c-myc의 유전자 발현이 증강됨을 나타내고 있다. iPS 세포는 여러 종류의 재생 의료에 유용하다고 생각되며, 즉, 상기 인핸서 부분은, c-myc 등의 소위 리프로그래밍 유전자의 보다 강한 유전자 발현을 가능하게 하는 수단으로서, 또한 발현 단백질 그 자체를 재생 인자로 하여 생체내 혹은 ex vivo에서 사용하는 수단으로서, 재생 의료 등에 유용함을 나타내고 있다.

실시예 7 : 프로모터로서 hTERT를 이용한 경우의 발현 증강

GFP(Green fluorescent protein)를 외래 유전자(삽입 유전자)로서 포함하는 본 발명의 발현용 카세트를 작성하고, HEK293 세포를 트랜스펙트하여, 발현 단백질을 웨스턴 블롯에 의해 분석했다. 트랜스펙트는, FuGENE(상표)-HD를 이용하여 행하고, 24시간 후에 세포 배양액 속의 GFP를 웨스턴 블롯팅에 의해 검출했다.

이용한 발현용 카세트의 컨스트럭트는 실시예 1에서 이용한 컨스트럭트 2번(도 8) 및 컨스트럭트 18번, 19번, 20번 및 21번이었다. 컨스트럭트 18번, 19번, 20번 및 21번의 구조를, 각각 도 55, 56, 57 및 58에 도시한다. 컨스트럭트 18번은 hTERT 프로모터를 포함하는 일반적인 유전자 발현 벡터이다. hTERT가 고발현되는 환경에서, 즉 암 세포에서의 유전자 강발현에 유리하며, 암 세포 특이적 유전자 발현을 기대하는 경우에 이용한다. 그러나, 그 유전자 발현이 매우 미약하다는 것이, 유전자 치료나, 특이한 세포에서의 단백질(의약) 생성 등에의 임상 응용의 방해가 되고 있었다. 컨스트럭트 19번은 hTERT 프로모터를 포함하는 일반적인 유전자 발현 벡터(컨스트럭트 18번)의 발현 유전자의 상류에, RU5 서열을 삽입한 플라스미드이다. 컨스트럭트 20번은 hTERT 프로모터를 포함하는 일반적인 유전자 발현 벡터(컨스트럭트 18번)의 BGH poly A 서열의 하류에, hTERT 인핸서 서열을 삽입한 플라스미드이다. 컨스트럭트 21번은 hTERT 프로모터를 포함하는 일반적인 유전자 발현 벡터(컨스트럭트 18번)의 발현 유전자의 상류에, RU5' 서열을 삽입하고, 또한 BGH poly A 서열의 하류에, hTERT 인핸서 서열을 삽입한 플라스미드이다. 도 59a 및 도 59b(도 59a의 계속)에 컨스트럭트 21번의 발현 벡터의 전염기 서열을 도시한다(서열번호 31). 도 59a 및 도 59b의 염기 서열 중의 (1), (2), (3), (4) 및 (5)의 프레임으로 둘러싼 부분은, 각각 hTERT 코어 프로모터, 최소 CMV 프로모터(minimal CMV promoter), RU5', GFP 유전자, BGH poly A, hTERT 코어 프로모터를 나타낸다.

발현 결과를 도 60에 도시한다. 레인 1이 외래 단백질을 발현시키지 않은 세포의 세포 추출액의 결과, 레인 2∼6은, 각각 컨스트럭트 2번, 18번, 19번, 20번 및 21번을 이용하여 발현시킨 결과를 나타낸다. 도면에 도시하는 바와 같이, 컨스트럭트 18번, 19번, 20번, 21번 및 2번의 순번으로 강한 발현이 인정되었다. 본 실시예의 결과는, 본 시스템(목적 발현 유전자를, 프로모터와 인핸서로 사이에 끼우는 상기 컨스트럭트의 형태)은, 암 특이적 유전자 발현을 가능하게 하는 hTERT 프로모터와 같은, 유전자 발현 능력이 매우 약한 프로모터의, 유전자 발현을 현저히 증강시키는 데 유용함을 나타내고 있다.

실시예 8 : 다른 외래 유전자를 도입한 복수의 발현 벡터를 동시 트랜스펙트한 경우의 발현

컨스트럭트 2번(도 20)에 DsRed(적색 형광 단백질)을 코드하는 DNA를 도입한 플라스미드, 컨스트럭트 21번(도 58)에 효모 GST(글루타치온 S 트랜스페라아제)를 코드하는 DNA를 도입한 플라스미드, 컨스트럭트 21번(도 58)에 GFP를 코드하는 DNA를 도입한 플라스미드를 세포에 동시에 트랜스펙트하여, 발현 단백질을 웨스턴 블롯에 의해 분석했다. 트랜스펙트는, FuGENE(상표)-HD를 이용하여 행했다. 세포는, HEK293 세포, Hela 세포, PC3 세포, HepG2 세포, HCT116 세포, MCF7 세포의 암 세포주를 이용하고, 또한 정상 세포주로서 인간 유래의 선유아세포인 OUMS-24 세포 및 인간 유래의 케라티노사이트 세포인 NHK 세포를 이용했다. 트랜스펙트 48시간 후에 세포 추출액 속의 각각의 단백질을 웨스턴 블롯팅에 의해 검출했다. DsRed를 코드하는 DNA 및 효모 GST를 코드하는 DNA는 공지된 cDNA 서열에 기초하여 인공 합성에 의해 cDNA를 제작했다.

웨스턴 블롯팅은, 항GFP 항체, 항6His 항체(MBL사, 6His를 부가한 텔로머라제의 검출에 사용), 항튜불린 항체(시그마사), 항DsRed 항체(Clontech사) 및 항효모 GST 항체를 이용하여 행하고, 트랜스펙트 24시간 후의 세포 추출액(토탈 단백질량은 10 ㎍)을 이용했다.

결과를 도 61에 도시한다. 도 61에 도시하는 것과 같이 hTERT 프로모터를 포함하는 플라스미드 컨스트럭트(컨스트럭트 21번)에서는, 여러 가지 암 세포, 정상 세포에 있어서, 암 세포에만 특이적인 유전자 발현을 행하는 데 유용하다. 즉 이 경우는, 암 세포에서만 강하게 유전자가 발현되고, 또한 정상 세포에서의 유전자 발현을 억제할 수 있다. 이 점, 예컨대, CMV 프로모터를 포함하는 플라스미드 컨스트럭트(컨스트럭트 2번)에서는, 인간 암 세포·정상 세포 중 어디에서나 유전자 발현이 보여, 암 세포에 특이적인 유전자 발현을 달성할 수 없다. hTERT 프로모터를 포함하는 플라스미드는, 이와 같이 암 세포 특이적으로 유전자 발현을 달성할 수 있다고 하는 점에서 유용하다.

실시예 9 : 본 발명의 유전자 발현 카세트를 포함하는 발현 벡터로 트랜스펙트한 HEK293 세포(Human embryonic kidney cell)에 의한 인간 에리트로포이에틴(Human EPO)의 생산량 검토

인간 에리트로포이에틴을 분비 발현시키기 위해서 C 말단측에 His tag를 부가한 EPO-His tag의 DNA 단편을, 컨스트럭트 14번의 컨스트럭트를 포함하는 벡터(SGE(Super Gene Expression) 벡터라고 함) 및 대조로서 pTracer(등록상표) -EF 벡터(EF-1α 프로모터, Invitrogen사)에 각각 도입하였다.

인간 에리트로포이에틴의 분비 발현의 숙주 세포로서, 대수 증식기에 있는 인간 신장 유래 세포 : FreeStyle 293-F 세포(Invitrogen사)를 5∼6×10⁵ 세포/mL의 농도로 125 mL 플라스크에 30 mL 파종하여, 37℃, 8% CO₂ 존재 하에서 Freestyle 293 Expression 1Media(Invitrogen사)를 이용하여 하룻밤 진탕 배양(125 rpm)했다. 다음날, 1×10⁶ 세포/mL의 농도로 조정하여, 125 mL 플라스크에 30 mL 파종한 293-F 세포에 대하여, 각 30 ㎍의 SGE-EPO-His tag 및 pTracer(등록상표) -EF­EPO-His tag의 플라스미드 DNA를 유전자 도입 시약 : 293 Fectin(Invitrogen사)와 혼합하여 유전자 도입을 행했다. 트랜스펙트 후 4일간, 37℃, 8% CO₂ 존재 하에서 진탕 배양하여, 배양 상청을 회수했다. 이 배양 상청 중 18 μL를 SDS-PAGE를 이용하여 분리하여, CBB 염색에 의해서 분자량 약 35 kDa의 당쇄 부가형의 EPO 단백질을 검출했다(도 62).

EPO 생산량을 어림하기 위해서 4일 후에 회수한 배양 상청 25 mL 중에 분비된 인간 에리트로포이에틴 단백질을 히스티딘 친화성 컬럼 크로마토그래피(TALON -Affinity Resin(Clontech사))를 이용하여 정제하고, 용출액을 SDS-PAGE를 이용하여 분리하여, CBB 염색에 의해서 EPO 단백질의 순도를 확인했다(도 63). 또한 이 정제 EPO 단백질의 단백질량을 Bradford법에 의해 정량하여, 25 mL 배양시의 정제 단백질량으로부터, 1 L 배양시에 얻어지는 단백질량을 산출했다(도 64A 및 64B). 이 결과, 인간 에리트로포이에틴은 SGE 벡터를 이용하면 pTracer(등록상표) -EF 벡터에서의 발현량과 비교하여 약 8배량의 단백질을 생산할 수 있고, 1 L의 배양액으로 환산하면 약 150 mg의 초고효율의 발현량을 달성했다.

실시예 10 : 본 발명의 유전자 발현 카세트를 포함하는 발현 벡터로 트랜스펙트한 HEK293 세포(Human embryonic kidney cell)에 의한 인간 REIC(Reduced Expression in Immortalized Cells) 단백질의 생산량 검토

실시예 1에 기재한 방법에 준하여, 293-F 세포를 1×10⁶ 세포/mL의 농도로 조정하여, 500 mL 플라스크에 180 mL 파종한 플라스크를 3개 분량 준비하고, 각 플라스크에 REIC 발현 SGE 벡터(컨스트럭트 14번의 컨스트럭트를 포함하는 벡터) 180 ㎍를 유전자 도입 시약 : 293 Fectin(Invitrogen사)를 이용하여 일과성으로 트랜스펙트했다. 트랜스펙트 후 4일간, 37℃, 8% CO₂ 존재 하에서 진탕 배양하여, 배양 상청을 회수했다. 이 배양 상청 18 μL를 SDS-PAGE를 이용하여 분리하고, CBB 염색에 의해서 분자량 약 55 kDa의 당쇄 부가 REIC 단백질을 검출했다(도 65).

회수한 배양 상청은 한외여과에 의해 520 mL에서 35 mL로 농축하고, Sephadex(상표) G25M 컬럼 크로마토그래피(GE헬스케어사)를 이용하여 용매를 20 mM Hepes Buffer(pH 7.2)로 치환하여, REIC 단백질 함유 분획을 회수했다. 그 후, 음이온 교환 컬럼 크로마토그래피(DEAE-Toyopearl(등록상표) 650 M, 도소사)를 이용하여, 단백질을 흡착시킨 후, 20 mM Hepes Buffer(pH 7.2) 중에서, 염화나트륨의 직선 농도 구배(0∼0.7 M)에 의해 용출을 행하여, 염화나트륨 농도가 0.35 M 정도인 조건에서, REIC 단백질의 피크 분획을 확인했다. 각 피크 분획을 SDS-PAGE로 해석하여, 고순도의 REIC 단백질만으로 구성되는 분획을 회수했다(도 66). 이 정제 REIC 단백질의 단백질량을 흡광도(280 nm)에 의해 산출하고, 또한 520 mL 배양시의 정제 단백질량으로부터 환산함으로써, 1 L 배양시에 얻어지는 단백질량을 산출했다(도 67). 이 결과, REIC 발현 SGE 벡터를 트랜스펙트한 배양 상청으로부터 고순도의 정제 단백질을 약 50 mg 얻을 수 있었다. 즉, 1 L의 배양액으로 환산하면 약 100 mg의 대용량의 정제 단백질이 실제로 회수 가능함을 증명했다.

산업상 이용 가능성

본 발명의, 제1 프로모터의 하류에, 발현시키고자 하는 유전자 및 폴리A 부가 서열을 포함하는 DNA 구축물을 포함하고, 또한 상기 DNA 구축물의 하류에 인핸서 또는 제2 프로모터가 연결된 유전자의 발현용 카세트는, 세포의 종류, 유전자의 종류, 트랜스펙션 시약의 종류를 막론하고, 유전자 발현에 의한 발현시키고자 하는 목적 단백질의 초고발현에 의한 대량 생산을 실현하는 것으로, 생물공학 분야에서의 시약으로서의 적용뿐만 아니라, 치료용의 단백질 의약으로서의 적용이나 임상에서의 유전자를 이용한 치료·검사·진단을 위해 폭넓은 응용이 가능하다. 예컨대, (1) 종래 해석을 할 수 없었던 미지 유전자의 특정 세포나 조직에서의 기능 해석, (2) 유전자 치료에 있어서 바이러스뿐만 아니라 비바이러스 벡터에의 탑재에 의한 치료 효과의 향상, (3) 항체 의약 등 최근의 바이오 의약품의 생산법으로서, 특정한 인간 기능성 단백질을 인간 세포로 대량으로 생산하는 수퍼셀의 제작, (4) 각종 어세이나 임상 진단에 이용하는 시약이나 진단약의 효율적이고 또한 저렴한 제조법 등에의 응용 등, 생물공학 영역에 혁명적 진화를 가져올 수 있다.

본 발명의 발현용 DNA 카세트는, 생물공학 분야에서의 시약으로서의 적용뿐만 아니라, 임상에서의 유전자를 이용한 치료·검사·진단을 위해서 폭넓은 응용이 가능하다.

서열표 프리텍스트

서열번호 1∼16, 19∼31 합성

SEQUENCE LISTING <110> National University Corporation Okayama University Momotaro-Gene Inc. <120> A system to enhance gene expression and a vector having the system <130> PH-4541-PCT <150> JP 2009-264297 <151> 2009-11-19 <160> 31 <170> PatentIn version 3.4 <210> 1 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 1 gcggccgcat aacttcgtat agcatacatt atacgaagtt atcagtcgac 50 <210> 2 <211> 4579 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 2 gcgcgcgggc ccagtaggta agtgaacatg gtcatagctg tttcctagga gatcctggtc 60 atgactagtg cttggattct caccaataaa aaacgcccgg cggcaaccga gcgttctgaa 120 caaatccaga tggagttctg aggtcattac tggatctatc aacaggagtc caagcgagct 180 cgatatcaaa ttacgccccg ccctgccact catcgcagta ctgttgtaat tcattaagca 240 ttctgccgac atggaagcca tcacaaacgg catgatgaac ctgaatcgcc agcggcatca 300 gcaccttgtc gccttgcgta taatatttgc ccatggtgaa aacgggggcg aagaagttgt 360 ccatattggc cacgtttaaa tcaaaactgg tgaaactcac ccagggattg gctgagacga 420 aaaacatatt ctcaataaac cctttaggga aataggccag gttttcaccg taacacgcca 480 catcttgcga atatatgtgt agaaactgcc ggaaatcgtc gtggtattca ctccagagcg 540 atgaaaacgt ttcagtttgc tcatggaaaa cggtgtaaca agggtgaaca ctatcccata 600 tcaccagctc accgtctttc attgccatac gaaattccgg atgagcattc atcaggcggg 660 caagaatgtg aataaaggcc ggataaaact tgtgcttatt tttctttacg gtctttaaaa 720 aggccgtaat atccagctga acggtctggt tataggtaca ttgtgtgatt aaaaaggcaa 780 ctttatgccc atgcaacaga aactataaaa aatacagaga atgaaaagaa acagatagat 840 tttttagttc tttaggcccg tagtctgcaa atccttttat gattttctat caaacaaaag 900 aggaaaatag accagttgca atccaaacga gagtctaata gaatgaggtc gaaaagtaaa 960 tcgcgcgggt ttgttactga taaagcaggc aagacctaaa atgtgtaaag ggcaaagtgt 1020 atactttggc gtcacccctt acatatttta ggtctttttt tattgtgcgt aactaacttg 1080 ccatcttcaa acaggagggc tggaagaagc agaccgctaa cacagtacat aaaaaaggag 1140 acatgaacga tgaacatcaa aaagtttgca aaacaagcaa cagtattaac ctttactacc 1200 gcactgctgg caggaggcgc aactcaagcg tttgcgaaag aaacgaacca aaagccatat 1260 aaggaaacat acggcatttc ccatattaca cgccatgata tgctgcaaat ccctgaacag 1320 caaaaaaatg aaaaatatca agttcctgag ttcgattcgt ccacaattaa aaatatctct 1380 tctgcaaaag gcctggacgt ttgggacagc tggccattac aaaacgctga cggcactgtc 1440 gcaaactatc acggctacca catcgtcttt gcattagccg gagatcctaa aaatgcggat 1500 gacacatcga tttacatgtt ctatcaaaaa gtcggcgaaa cttctattga cagctggaaa 1560 aacgctggcc gcgtctttaa agacagcgac aaattcgatg caaatgattc tatcctaaaa 1620 gaccaaacac aagaatggtc aggttcagcc acatttacat ctgacggaaa aatccgttta 1680 ttctacactg atttctccgg taaacattac ggcaaacaaa cactgacaac tgcacaagtt 1740 aacgtatcag catcagacag ctctttgaac atcaacggtg tagaggatta taaatcaatc 1800 tttgacggtg acggaaaaac gtatcaaaat gtacagcagt tcatcgatga aggcaactac 1860 agctcaggcg acaaccatac gctgagagat cctcactacg tagaagataa aggccacaaa 1920 tacttagtat ttgaagcaaa cactggaact gaagatggct accaaggcga agaatcttta 1980 tttaacaaag catactatgg caaaagcaca tcattcttcc gtcaagaaag tcaaaaactt 2040 ctgcaaagcg ataaaaaacg cacggctgag ttagcaaacg gcgctctcgg tatgattgag 2100 ctaaacgatg attacacact gaaaaaagtg atgaaaccgc tgattgcatc taacacagta 2160 acagatgaaa ttgaacgcgc gaacgtcttt aaaatgaacg gcaaatggta cctgttcact 2220 gactcccgcg gatcaaaaat gacgattgac ggcattacgt ctaacgatat ttacatgctt 2280 ggttatgttt ctaattcttt aactggccca tacaagccgc tgaacaaaac tggccttgtg 2340 ttaaaaatgg atcttgatcc taacgatgta acctttactt actcacactt cgctgtacct 2400 caagcgaaag gaaacaatgt cgtgattaca agctatatga caaacagagg attctacgca 2460 gacaaacaat caacgtttgc gcctagcttc ctgctgaaca tcaaaggcaa gaaaacatct 2520 gttgtcaaag acagcatcct tgaacaagga caattaacag ttaacaaata aaaacgcaaa 2580 agaaaatgcc gatatcctat tggcattgac gtcaggtggc acttttcggg gaaatgtgcg 2640 cggaacccct atttgtttat ttttctaaat acattcaaat atgtatccgc tcatgagaca 2700 ataaccctga taaatgcttc aataatattg aaaaaggaag agtatgagta ttcaacattt 2760 ccgtgtcgcc cttattccct tttttgcggc attttgcctt cctgtttttg ctcacccaga 2820 aacgctggtg aaagtaaaag atgctgaaga tcagttgggt gcacgagtgg gttacatcga 2880 actggatctc aacagcggta agatccttga gagttttcgc cccgaagaac gttttccaat 2940 gatgagcact tttaaagttc tgctatgtgg cgcggtatta tcccgtattg acgccgggca 3000 agagcaactc ggtcgccgca tacactattc tcagaatgac ttggttgagt actcaccagt 3060 cacagaaaag catcttacgg atggcatgac agtaagagaa ttatgcagtg ctgccataac 3120 catgagtgat aacactgcgg ccaacttact tctgacaacg atcggaggac cgaaggagct 3180 aaccgctttt ttgcacaaca tgggggatca tgtaactcgc cttgatcgtt gggaaccgga 3240 gctgaatgaa gccataccaa acgacgagcg tgacaccacg atgcctgtag caatggcaac 3300 aacgttgcgc aaactattaa ctggcgaact acttactcta gcttcccggc aacaattaat 3360 agactggatg gaggcggata aagttgcagg accacttctg cgctcggccc ttccggctgg 3420 ctggtttatt gctgataaat ctggagccgg tgagcgtggg tctcgcggta tcattgcagc 3480 actggggcca gatggtaagc cctcccgtat cgtagttatc tacacgacgg ggagtcaggc 3540 aactatggat gaacgaaata gacagatcgc tgagataggt gcctcactga ttaagcattg 3600 gtaactgtca gaccaagttt actcatatat actttagatt gatttaaaac ttcattttta 3660 atttaaaagg atctaggtga agatcctttt tgataatctc atgaccaaaa tcccttaacg 3720 tgagttttcg ttccactgag cgtcagaccc cgtagaaaag atcaaaggat cttcttgaga 3780 tccttttttt ctgcgcgtaa tctgctgctt gcaaacaaaa aaaccaccgc taccagcggt 3840 ggtttgtttg ccggatcaag agctaccaac tctttttccg aaggtaactg gcttcagcag 3900 agcgcagata ccaaatactg ttcttctagt gtagccgtag ttaggccacc acttcaagaa 3960 ctctgtagca ccgcctacat acctcgctct gctaatcctg ttaccagtgg ctgctgccag 4020 tggcgataag tcgtgtctta ccgggttgga ctcaagacga tagttaccgg ataaggcgca 4080 gcggtcgggc tgaacggggg gttcgtgcac acagcccagc ttggagcgaa cgacctacac 4140 cgaactgaga tacctacagc gtgagctatg agaaagcgcc acgcttcccg aagggagaaa 4200 ggcggacagg tatccggtaa gcggcagggt cggaacagga gagcgcacga gggagcttcc 4260 agggggaaac gcctggtatc tttatagtcc tgtcgggttt cgccacctct gacttgagcg 4320 tcgatttttg tgatgctcgt caggggggcg gagcctatgg aaaaacgcca gcaacgcggc 4380 ctttttacgg ttcctggcct tttgctggcc ttttgctcac atgttctttc ctgcgttatc 4440 ccctgattct gtggataacc gtattaccgc cttacgcgtg taaaacgacg gccagtagat 4500 ctgtaatacg actcactata gggcgctagc tgctcgccgc agccgaacga ccgagcgcag 4560 cgagtcagtg agcgaggaa 4579 <210> 3 <211> 604 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 3 gggctgtgtg cacgaacccc ccgttcagcc cgaccgctgc gccttatccg gtaactatcg 60 tcttgagtcc aacccggtaa gacacgactt atcgccactg gcagcagcca ctggtaacag 120 gattagcaga gcgaggtatg taggcggtgc tacagagttc ttgaagtggt ggcctaacta 180 cggctacact agaagaacag tatttggtat ctgcgctctg ctgaagccag ttacctcgga 240 aaaagagttg gtagctcttg atccggcaaa caaaccaccg ctggtagcgg tggttttttt 300 gtttgcaagc agcagattac gcgcagaaaa aaaggatctc aagaagatcc tttgattttc 360 taccgaagaa aggcccaccc gtgaaggtga gccagtgagt tgattgcagt ccagttacgc 420 tggagtctga ggctcgtcct gaatgtgtaa aacgacggcc agtttatcta gtcagcttga 480 ttctagctga tcgtggaccg gaaggtgagc cagtgagttg attgcagtcc agttacgctg 540 gagtctgagg ctcgtcctga atgatatacg cgtcggaggg ttgcgtttga gacgggcgac 600 agat 604 <210> 4 <211> 1423 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 4 atcagttctg gacgagcgag ctgtcgtccg gcggccgcga tcttacggca ttatacgtat 60 gatcggtcca cgatcagcta gattatctag tcagcttgat gtcatagctg tttcctgagg 120 ctcaatactg accatttaaa tcatacctga cctccatagc agaaagtcaa aagcctccga 180 ccggaggctt ttgacttgat cggcacgtaa gaggttccaa ctttcaccat aatgaaataa 240 gatcactacc gggcgtattt tttgagttat cgagattttc aggagctaag gaagctaaaa 300 tgagccatat tcaacgggaa acgtcttgct tgaagccgcg attaaattcc aacatggatg 360 ctgatttata tgggtataaa tgggctcgcg ataatgtcgg gcaatcaggt gcgacaatct 420 atcgattgta tgggaagccc gatgcgccag agttgtttct gaaacatggc aaaggtagcg 480 ttgccaatga tgttacagat gagatggtca ggctaaactg gctgacggaa tttatgcctc 540 ttccgaccat caagcatttt atccgtactc ctgatgatgc atggttactc accactgcga 600 tcccagggaa aacagcattc caggtattag aagaatatcc tgattcaggt gaaaatattg 660 ttgatgcgct ggcagtgttc ctgcgccggt tgcattcgat tcctgtttgt aattgtcctt 720 ttaacggcga tcgcgtattt cgtctcgctc aggcgcaatc acgaatgaat aacggtttgg 780 ttggtgcgag tgattttgat gacgagcgta atggctggcc tgttgaacaa gtctggaaag 840 aaatgcataa actcttgcca ttctcaccgg attcagtcgt cactcatggt gatttctcac 900 ttgataacct tatttttgac gaggggaaat taataggttg tattgatgtt ggacgagtcg 960 gaatcgcaga ccgataccag gatcttgcca tcctatggaa ctgcctcggt gagttttctc 1020 cttcattaca gaaacggctt tttcaaaaat atggtattga taatcctgat atgaataaat 1080 tgcagtttca cttgatgctc gatgagtttt tctaatgagg acctaaatgt aatcacctgg 1140 ctcaccttcg ggtgggcctt tctgcgttgc tggcgttttt ccataggctc cgcccccctg 1200 acgagcatca caaaaatcga tgctcaagtc agaggtggcg aaacccgaca ggactataaa 1260 gataccaggc gtttccccct ggaagctccc tcgtgcgctc tcctgttccg accctgccgc 1320 ttaccggata cctgtccgcc tttctccctt cgggaagcgt ggcgctttct catagctcac 1380 gctgtaggta tctcagttcg gtgtaggtcg ttcgctccaa gct 1423 <210> 5 <211> 754 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 5 tccgcgttac ataacttacg gtaaatggcc cgcctggctg accgcccaac gacccccgcc 60 cattgacgtc aataatgacg tatgttccca tagtaacgcc aatagggact ttccattgac 120 gtcaatgggt ggagtattta cggtaaactg cccacttggc agtacatcaa gtgtatcata 180 tgccaagtac gccccctatt gacgtcaatg acggtaaatg gcccgcctgg cattatgccc 240 agtacatgac cttatgggac tttcctactt ggcagtacat ctacgtatta gtcatcgcta 300 ttaccatggt gatgcggttt tggcagtaca tcaatgggcg tggatagcgg tttgactcac 360 ggggatttcc aagtctccac cccattgacg tcaatgggag tttgttttgg caccaaaatc 420 aacgggactt tccaaaatgt cgtaacaact ccgccccatt gacgcaaatg ggcggtaggc 480 gtgtacggtg ggaggtctat ataagcagag ctcgtttagt gaaccgtcag atcgcctgga 540 gacgccatcc acgctgtttt gacctccata gaagacaccg ggaccgatcc agcctccgcg 600 gccgggaacg gtgcattgga acgcggattc cccgtgccaa gagtgacgta agtaccgcct 660 atagactcta taggcacacc cctttggctc ttatgcatga attaatacga ctcactatag 720 ggagacagac tgttcctttc ctgggtcttt tctg 754 <210> 6 <211> 262 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 6 tgactgactg acgtttaaac ccgctgatca gcctcgactg tgccttctag ttgccagcca 60 tctgttgttt gcccctcccc cgtgccttcc ttgaccctgg aaggtgccac tcccactgtc 120 ctttcctaat aaaatgagga aattgcatcg cattgtctga gtaggtgtca ttctattctg 180 gggggtgggg tggggcagga cagcaagggg gaggattggg aagacaatag caggcatgct 240 ggggatgcgg tgggctctat gg 262 <210> 7 <211> 310 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 7 tccgcgttac ataacttacg gtaaatggcc cgcctggctg accgcccaac gacccccgcc 60 cattgacgtc aataatgacg tatgttccca tagtaacgcc aatagggact ttccattgac 120 gtcaatgggt ggagtattta cggtaaactg cccacttggc agtacatcaa gtgtatcata 180 tgccaagtac gccccctatt gacgtcaatg acggtaaatg gcccgcctgg cattatgccc 240 agtacatgac cttatgggac tttcctactt ggcagtacat ctacgtatta gtcatcgcta 300 ttaccatggt 310 <210> 8 <211> 1508 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 8 gttccatgtc cttatatgga ctcatctttg cctattgcga cacacactca gtgaacacct 60 actacgcgct gcaaagagcc ccgcaggcct gaggtgcccc cacctcacca ctcttcctat 120 ttttgtgtaa aaatccagct tcttgtcacc acctccaagg agggggagga ggaggaaggc 180 aggttcctct aggctgagcc gaatgcccct ctgtggtccc acgccactga tcgctgcatg 240 cccaccacct gggtacacac agtctgtgat tcccggagca gaacggaccc tgcccacccg 300 gtcttgtgtg ctactcagtg gacagaccca aggcaagaaa gggtgacaag gacagggtct 360 tcccaggctg gctttgagtt cctagcaccg ccccgccccc aatcctctgt ggcacatgga 420 gtcttggtcc ccagagtccc ccagcggcct ccagatggtc tgggagggca gttcagctgt 480 ggctgcgcat agcagacata caacggacgg tgggcccaga cccaggctgt gtagacccag 540 cccccccgcc ccgcagtgcc taggtcaccc actaacgccc caggccttgt cttggctggg 600 cgtgactgtt accctcaaaa gcaggcagct ccagggtaaa aggtgccctg ccctgtagag 660 cccaccttcc ttcccagggc tgcggctggg taggtttgta gccttcatca cgggccacct 720 ccagccactg gaccgctggc ccctgccctg tcctggggag tgtggtcctg cgacttctaa 780 gtggccgcaa gccacctgac tcccccaaca ccacactcta cctctcaagc ccaggtctct 840 ccctagtgac ccacccagca catttagcta gctgagcccc acagccagag gtcctcaggc 900 cctgctttca gggcagttgc tctgaagtcg gcaaggggga gtgactgcct ggccactcca 960 tgccctccaa gagctccttc tgcaggagcg tacagaaccc agggccctgg cacccgtgca 1020 gaccctggcc caccccacct gggcgctcag tgcccaagag atgtccacac ctaggatgtc 1080 ccgcggtggg tggggggccc gagagacggg caggccgggg gcaggcctgg ccatgcgggg 1140 ccgaaccggg cactgcccag cgtggggcgc gggggccacg gcgcgcgccc ccagcccccg 1200 ggcccagcac cccaaggcgg ccaacgccaa aactctccct cctcctcttc ctcaatctcg 1260 ctctcgctct tttttttttt cgcaaaagga ggggagaggg ggtaaaaaaa tgctgcactg 1320 tgcggcgaag ccggtgagtg agcggcgcgg ggccaatcag cgtgcgccgt tccgaaagtt 1380 gccttttatg gctcgagcgg ccgcggcggc gccctataaa acccagcggc gcgacgcgcc 1440 accaccgccg agaccgcgtc cgccccgcga gcacagagcc tcgcctttgc cgatccgccg 1500 cccgtcca 1508 <210> 9 <211> 286 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 9 agcttcgagg ggctcgcatc tctccttcac gcgcccgccg ccctacctga ggccgccatc 60 cacgccggtt gagtcgcgtt ctgccgcctc ccgcctgtgg tgcctcctga actgcgtccg 120 ccgtctaggt aagtttaaag ctcaggtcga gaccgggcct ttgtccggcg ctcccttgga 180 gcctacctag actcagccgg ctctccacgc tttgcctgac cctgcttgct caactctacg 240 tctttgtttc gttttctgtt ctgcgccgtt acagatccaa gccacc 286 <210> 10 <211> 286 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 10 ggtggcttgg atctgtaacg gcgcagaaca gaaaacgaaa caaagacgta gagttgagca 60 agcagggtca ggcaaagcgt ggagagccgg ctgagtctag gtaggctcca agggagcgcc 120 ggacaaaggc ccggtctcga cctgagcttt aaacttacct agacggcgga cgcagttcag 180 gaggcaccac aggcgggagg cggcagaacg cgactcaacc ggcgtggatg gcggcctcag 240 gtagggcggc gggcgcgtga aggagagatg cgagcccctc gaagct 286 <210> 11 <211> 1012 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 11 gtcgacgtcg ccccattgac gtcaatgggc gttacataac ttacggtaaa tggcccgcct 60 ggctgaccgc ccaacgaccc ccgcccattg acgtcaataa tgacgtatgt tcccatagta 120 acgccaatag ggactttcca ttgacgtcaa tgggtggagt atttacggta aactgcccac 180 ttggcagtac atcaagtgta tcatatgcca agtacgcccc ctattgacgt caatgacggt 240 aaatggcccg cctggcatta tgcccagtac atgaccttat gggactttcc tacttggcag 300 tacatctacg tattagtcat cgctattacc atggtcccca ttgacgtcaa tgggcgttac 360 ataacttacg gtaaatggcc cgcctggctg accgcccaac gacccccgcc cattgacgtc 420 aataatgacg tatgttccca tagtaacgcc aatagggact ttccattgac gtcaatgggt 480 ggagtattta cggtaaactg cccacttggc agtacatcaa gtgtatcata tgccaagtac 540 gccccctatt gacgtcaatg acggtaaatg gcccgcctgg cattatgccc agtacatgac 600 cttatgggac tttcctactt ggcagtacat ctacgtatta gtcatcgcta ttaccatggt 660 ccccattgac gtcaatgggc gttacataac ttacggtaaa tggcccgcct ggctgaccgc 720 ccaacgaccc ccgcccattg acgtcaataa tgacgtatgt tcccatagta acgccaatag 780 ggactttcca ttgacgtcaa tgggtggagt atttacggta aactgcccac ttggcagtac 840 atcaagtgta tcatatgcca agtacgcccc ctattgacgt caatgacggt aaatggcccg 900 cctggcatta tgcccagtac atgaccttat gggactttcc tacttggcag tacatctacg 960 tattagtcat cgctattacc atggtcccca ttgacgtcaa tgggggacta gt 1012 <210> 12 <211> 1621 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 12 attgattatt gactagttat taatagtaat caattacggg gtcattagtt catagcccat 60 atatggagtt ccgcgttaca taacttacgg taaatggccc gcctggctga ccgcccaacg 120 acccccgccc attgacgtca ataatgacgt atgttcccat agtaacgcca atagggactt 180 tccattgacg tcaatgggtg gagtatttac ggtaaactgc ccacttggca gtacatcaag 240 tgtatcatat gccaagtacg ccccctattg acgtcaatga cggtaaatgg cccgcctggc 300 attatgccca gtacatgacc ttatgggact ttcctacttg gcagtacatc tacgtattag 360 tcatcgctat taccatggtc gaggtgagcc ccacgttctg cttcactctc cccatctccc 420 ccccctcccc acccccaatt ttgtatttat ttatttttta attattttgt gcagcgatgg 480 gggcgggggg ggggggcgcg cgccaggcgg ggcggggcgg ggcgaggggc ggggcggggc 540 gaggcggaga ggtgcggcgg cagccaatca gagcggcgcg ctccgaaagt ttccttttat 600 ggcgaggcgg cggcggcggc ggccctataa aaagcgaagc 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agcctctgga ttcactttca gtcactatgg catgtcttgg 180 gttcgccaga ctccagacaa gaggctggag tgggtcgcaa ccattggtag tcgtggtact 240 tacacccact atccagacag tgtgaaggga cgattcacca tctccagaga caatgacaag 300 aacgccctgt acctgcaaat gaacagtctg aagtctgaag acacagccat gtattactgt 360 gcaagaagaa gtgaatttta ttactacggt aatacctact attactctgc tatggactac 420 tggggtcaag gagcctcagt caccgtctcc tcagccaaaa cgacaccccc atctgtctat 480 ccactggccc ctggatctgc tgcccaaact aactccatgg tgaccctggg atgcctggtc 540 aagggctatt tccctgagcc agtgacagtg acctggaact ctgggtccct gtccagcggt 600 gtgcacacct tcccagctgt cctgcagtct gacctctaca ctctgagcag ctcagtgact 660 gtcccctcca gcacctggcc cagcgagacc gtcacctgca acgttgccca cccggccagc 720 agcaccaagg tggacaagaa aattgtgccc agggattgtg gttgtaagcc ttgcatatgt 780 acagtcccag aagtatcatc tgtcttcatc ttccccccaa agcccaagga tgtgctcacc 840 attactctga ctcctaaggt cacgtgtgtt gtggtagaca tcagcaagga tgatcccgag 900 gtccagttca gctggtttgt agatgatgtg gaggtgcaca cagctcagac gcaaccccgg 960 gaggagcagt tcaacagcac tttccgctca gtcagtgaac ttcccatcat gcaccaggac 1020 tggcccaatg gcaaggagtt caaatgcagg gtcaacagtg cagctttccc tgcccccatc 1080 gagaaaacca tctccaaaac caaaggcaga ccgaaggctc cacaggtgta caccattcca 1140 cctcccaagg agcagatggc caaggataaa gtcagtctga cctgcatgat aacagacttc 1200 ttccctgaag acattactgt ggagtggcag tggaatgggc agccagcgga gaactacaag 1260 aacactcagc ccatcatgaa cacgaatggc tcttacttcg tctacagcaa gctcaatgtg 1320 cagaagagca actgggaggc aggaaatact ttcacctgct ctgtgttaca tgagggcctg 1380 cacaaccacc atactgagaa gagcctctcc cactctcctg gtaaaggacc gggccatcac 1440 caccatcacc attgacgcgg atccgcgagg actagtcctg ctctagagc 1489 <210> 28 <211> 2355 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 28 tctagagcac catgcagcgg cttggggcca ccctgctgtg cctgctgctg gcggcggcgg 60 tccccacggc ccccgcgccc gctccgacgg cgacctcggc tccagtcaag cccggcccgg 120 ctctcagcta cccgcaggag gaggccaccc tcaatgagat gttccgcgag gttgaggaac 180 tgatggagga cacgcagcac aaattgcgca gcgcggtgga agagatggag gcagaagaag 240 ctgctgctaa agcatcatca gaagtgaacc tggcaaactt acctcccagc tatcacaatg 300 agaccaacac agacacgaag gttggaaata ataccatcca tgtgcaccga gaaattcaca 360 agataaccaa caaccagact ggacaaatgg tcttttcaga gacagttatc acatctgtgg 420 gagacgaaga aggcagaagg agccacgagt gcatcatcga cgaggactgt gggcccagca 480 tgtactgcca gtttgccagc ttccagtaca cctgccagcc atgccggggc cagaggatgc 540 tctgcacccg ggacagtgag tgctgtggag accagctgtg tgtctggggt cactgcacca 600 aaatggccac caggggcagc aatgggacca tctgtgacaa ccagagggac tgccagccgg 660 ggctgtgctg tgccttccag agaggcctgc tgttccctgt gtgcacaccc ctgcccgtgg 720 agggcgagct ttgccatgac cccgccagcc ggcttctgga cctcatcacc tgggagctag 780 agcctgatgg agccttggac cgatgccctt gtgccagtgg cctcctctgc cagccccaca 840 gccacagcct ggtgtatgtg tgcaagccga ccttcgtggg gagccgtgac caagatgggg 900 agatcctgct gcccagagag gtccccgatg agtatgaagt tggcagcttc atggaggagg 960 tgcgccagga gctggaggac ctggagagga gcctgactga agagatggcg ctgggggagc 1020 ctgcggctgc cgccgctgca ctgctgggag gggaagagat ttagggggta ccccggctag 1080 atgactaacg tttaaacccg ctgatcagcc tcgactgtgc cttctagttg ccagccatct 1140 gttgtttgcc cctcccccgt gccttccttg accctggaag gtgccactcc cactgtcctt 1200 tcctaataaa atgaggaaat tgcatcgcat tgtctgagta ggtgtcattc tattctgggg 1260 ggtggggtgg ggcaggacag caagggggag gattgggaag acaatagcag gcatgctggg 1320 gatgcggtgg gctctatggc ggagtactgt cctccgcttc ccacgtggcg gagggactgg 1380 ggacccgggc acccgtcctg ccccttcacc ttccagctcc gcctcctccg cgcggacccc 1440 gccccgtccc gacccctccc gggtccccgg cccagccccc tccgggccct cccagcccct 1500 ccccttcctt tccgcggccc cgccctctcc tcgcggcgcg agttttggaa agtccccagg 1560 ctccccagca ggcagaagta tccaaagcat ccatctcaat tagtcagcaa ccaggtgtgg 1620 aaagtcccca ggctccccag caggcagaag tatccaaagc atccatctca attagtcagc 1680 aaccatagtc ccgcccctaa ctccgcccat cccgccccta actccgccca gttccgccca 1740 ttctccgccc catggctgac taattttttt tatttatgca gaggccgagg ccgcctctgc 1800 ctctgagcta ttccagaagt agtgaggagg cttttttgga ggccaaggct tttgcaaaaa 1860 gctccgttac ataacttacg gtaaatggcc cgcctggctg accgcccaac gacccccgcc 1920 cattgacgtc aataatgacg tatgttccca tagtaacgcc aatagggact ttccattgac 1980 gtcaatgggt ggagtattta cggtaaactg cccacttggc agtacatcaa gtgtatcata 2040 tgccaagtac gccccctatt gacgtcaatg acggtaaatg gcccgcctgg cattatgccc 2100 agtacatgac cttatgggac tttcctactt ggcagtacat ctacgtatta gtcatcgcta 2160 ttaccatggt gatgcggttt tggcagtaca tcaatgggcg tggatagcgg tttgactcac 2220 ggggatttcc aagtctccac cccattgacg tcaatgggag tttgttttgg caccaaaatc 2280 aacgggactt tccaaaatgt cgtaacaact ccgccccatt gacgcaaatg ggcggtaggc 2340 gtgttgccgg aattc 2355 <210> 29 <211> 1413 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 29 atgttcatgc cttcttcttt ttcctacagc tcctgggcaa cgtgctggtt attgtgctgt 60 ctcatcattt tggcaaagaa ttcgcccttc accatgcccc tcaacgtgaa cttcaccaac 120 aggaactatg acctcgacta cgactccgta cagccctatt tcatctgcga cgaggaagag 180 aatttctatc accagcaaca gcagagcgag ctgcagccgc ccgcgcccag tgaggatatc 240 tggaagaaat tcgagctgct tcccaccccg cccctgtccc cgagccgccg ctccgggctc 300 tgctctccat cctatgttgc ggtcgctacg tccttctccc caagggaaga cgatgacggc 360 ggcggtggca acttctccac cgccgatcag ctggagatga tgaccgagtt acttggagga 420 gacatggtga accagagctt catctgcgat cctgacgacg agaccttcat caagaacatc 480 atcatccagg actgtatgtg gagcggtttc tcagccgctg ccaagctggt ctcggagaag 540 ctggcctcct accaggctgc gcgcaaagac agcaccagcc tgagccccgc ccgcgggcac 600 agcgtctgct ccacctccag cctgtacctg caggacctca ccgccgccgc gtccgagtgc 660 attgacccct cagtggtctt tccctacccg ctcaacgaca gcagctcgcc caaatcctgt 720 acctcgtccg attccacggc cttctctcct tcctcggact cgctgctgtc ctccgagtcc 780 tccccacggg ccagccctga gcccctagtg ctgcatgagg agacaccgcc caccaccagc 840 agcgactctg aagaagagca agaagatgag gaagaaattg atgtggtgtc tgtggagaag 900 aggcaaaccc ctgccaagag gtcggagtcg ggctcatctc catcccgagg ccacagcaaa 960 cctccgcaca gcccactggt cctcaagagg tgccacgtct ccactcacca gcacaactac 1020 gccgcacccc cctccacaag gaaggactat ccagctgcca agagggccaa gttggacagt 1080 ggcagggtcc tgaagcagat cagcaacaac cgcaagtgct ccagccccag gtcctcagac 1140 acggaggaaa acgacaagag gcggacacac aacgtcttgg aacgtcagag gaggaacgag 1200 ctgaagcgca gcttttttgc cctgcgtgac cagatccctg aattggaaaa caacgaaaag 1260 gcccccaagg tagtgatcct caaaaaagcc accgcctaca tcctgtccat tcaagcagac 1320 gagcacaagc tcacctctga aaaggactta ttgaggaaac gacgagaaca gttgaaacac 1380 aaactcgaac agcttcgaaa ctctggtgca taa 1413 <210> 30 <211> 1285 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 30 gtttaaaccc gctgatcagc ctcgactgtg ccttctagtt gccagccatc tgttgtttgc 60 ccctcccccg tgccttcctt gaccctggaa ggtgccactc ccactgtcct ttcctaataa 120 aatgaggaaa ttgcatcgca ttgtctgagt aggtgtcatt ctattctggg gggtggggtg 180 gggcaggaca gcaaggggga ggattgggaa gacaatagca ggcatgctgg ggatgcggtg 240 ggctctatgg cggagtactg tcctccgctt cccacgtggc ggagggactg gtcctccgct 300 tcccacgtgg cggagggact ggggacccgg gcacccgtcc tgccccttca ccttccagct 360 ccgcctcctc cgcgcggacc ccgccccgtc ccgacccctc ccgggtcccc ggcccagccc 420 cctccgggcc ctcccagccc ctccccttcc tttccgcggc cccgccctct cctcgcggcg 480 cgagttttgg aaagtcccca ggctccccag caggcagaag tatccaaagc atccatctca 540 attagtcagc aaccaggtgt ggaaagtccc caggctcccc agcaggcaga agtatccaaa 600 gcatccatct caattagtca gcaaccatag tcccgcccct aactccgccc atcccgcccc 660 taactccgcc cagttccgcc cattctccgc cccatggctg actaattttt tttatttatg 720 cagaggccga ggccgcctct gcctctgagc tattccagaa gtagtgagga ggcttttttg 780 gaggccaagg cttttgcaaa aagctccgtt acataactta cggtaaatgg cccgcctggc 840 tgaccgccca acgacccccg cccattgacg tcaataatga cgtatgttcc catagtaacg 900 ccaataggga ctttccattg acgtcaatgg gtggagtatt tacggtaaac tgcccacttg 960 gcagtacatc aagtgtatca tatgccaagt acgcccccta ttgacgtcaa tgacggtaaa 1020 tggcccgcct ggcattatgc ccagtacatg accttatggg actttcctac ttggcagtac 1080 atctacgtat tagtcatcgc tattaccatg gtgatgcggt tttggcagta catcaatggg 1140 cgtggatagc ggtttgactc acggggattt ccaagtctcc accccattga cgtcaatggg 1200 agtttgtttt ggcaccaaaa tcaacgggac tttccaaaat gtcgtaacaa ctccgcccca 1260 ttgacgcaaa tgggcggtag gcgtg 1285 <210> 31 <211> 1968 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Synthetic <400> 31 gtcgacgtcg gccataccgg aattccggct tcccacgtgg cggagggact ggggacccgg 60 gcacccgtcc tgccccttca ccttccagct ccgcctcctc cgcgcggacc ccgccccgtc 120 ccgacccctc ccgggtcccc ggcccagccc cctccgggcc ctcccagccc ctccccttcc 180 tttccgcggc cccgccctct cctcgcggcg cgagtttcag gcagcgctgc gtcctgctgc 240 gcacgtgggg taggcgtgta cggtgggagg cctatataag cagagctcgt ttagtgaacc 300 gtcagatcgc ctggagacgc catccacgct gttttgacct ccatagaaga caccgggacc 360 gatccagcct ccgcggcccc gcattcgagc tcggtacccg gcccaagctt gggagcttcg 420 aggggctcgc atctctcctt cacgcgcccg ccgccctacc tgaggccgcc atccacgccg 480 gttgagtcgc gttctgccgc ctcccgcctg tggtgcctcc tgaactgcgt ccgccgtcta 540 ggtaagttta aagctcaggt cgagaccggg cctttgtccg gcgctccctt ggagcctacc 600 tagactcagc cggctctcca cgctttgcct gaccctgctt gctcaactct acgtctttgt 660 ttcgttttct gttctgcgcc gttacagatc caagccaccc ccaagcttgg gcgggatccc 720 gaccatggtg agcaagggcg aggagctgtt caccggggtg gtgcccatcc tggtcgagct 780 ggacggcgac gtaaacggcc acaagttcag cgtgtccggc gagggcgagg gcgatgccac 840 ctacggcaag ctgaccctga agttcatctg caccaccggc aagctgcccg tgccctggcc 900 caccctcgtg accaccctga cctacggcgt gcagtgcttc agccgctacc ccgaccacat 960 gaagcagcac gacttcttca agtccgccat gcccgaaggc tacgtccagg agcgcaccat 1020 cttcttcaag gacgacggca actacaagac ccgcgccgag gtgaagttcg agggcgacac 1080 cctggtgaac cgcatcgagc tgaagggcat cgacttcaag gaggacggca acatcctggg 1140 gcacaagctg gagtacaact acaacagcca caacgtctat atcatggccg acaagcagaa 1200 gaacggcatc aaggtgaact tcaagatccg ccacaacatc gaggacggca gcgtgcagct 1260 cgccgaccac taccagcaga acacccccat cggcgacggc cccgtgctgc tgcccgacaa 1320 ccactacctg agcacccagt ccgccctgag caaagacccc aacgagaagc gcgatcacat 1380 ggtcctgctg gagttcgtga ccgccgccgg gatcactctc ggcatggacg agctgtacaa 1440 gtgaccgctc gagcgggctc tagaggttta aacccgctga tcagcctcga ctgtgccttc 1500 tagttgccag ccatctgttg tttgcccctc ccccgtgcct tccttgaccc tggaaggtgc 1560 cactcccact gtcctttcct aataaaatga ggaaattgca tcgcattgtc tgagtaggtg 1620 tcattctatt ctggggggtg gggtggggca ggacagcaag ggggaggatt gggaagacaa 1680 tagcaggcat gctggggatg cggtgggctc tatggatgca tccaatgcat tggatgcatc 1740 ttcccacgtg gcggagggac tggggacccg ggcacccgtc ctgccccttc accttccagc 1800 tccgcctcct ccgcgcggac cccgccccgt cccgacccct cccgggtccc cggcccagcc 1860 ccctccgggc cctcccagcc cctccccttc ctttccgcgg ccccgccctc tcctcgcggc 1920 gcgagtttca ggcagcgctg cgtcctgctg cgcacgtggt tggcgcgc 1968

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17. (ⅰ) 제1 프로모터, 발현시키고자 하는 유전자 및 폴리A 부가 서열을 이 순서로 연결한 DNA 구축물, 및
    (ⅱ) 적어도 hTERT 인핸서를 포함하는, 인핸서(들) 또는 상류에 UAS가 연결된 인핸서(들)을, (ⅰ) 및 (ⅱ)의 순서로 포함하고,
    폴리A 부가 서열의 바로 하류에 상기 인핸서(들) 또는 상류에 UAS가 연결된 인핸서(들)이 연결되고, 인핸서(들)을 제1 프로모터의 상류에 삽입했을 때와 비교하여 유전자의 단백질 발현을 증강시킬 수 있는 유전자의 발현용 카세트.
18. 제17항에 있어서, 연결한 인핸서(들)의 하류에 다른 유전자 발현용의 기구를 갖지 않고, 발현시키고자 하는 유전자를 제1 프로모터와 인핸서(들)로 사이에 끼운 구조를 갖는 발현용 카세트.
19. 제17항에 있어서, 프로모터가 CMV 프로모터, CMV i 프로모터, SV40 프로모터, hTERT 프로모터, β 액틴 프로모터 및 CAG 프로모터로 이루어지는 군에서 선택되는 프로모터인 발현용 카세트.
20. 제17항에 있어서, 폴리A 부가 서열의 하류에 연결한 인핸서들이 CMV 인핸서 및 SV40 인핸서로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 인핸서를 추가로 포함하는 것인 발현용 카세트.
21. 제17항에 있어서, 폴리A 부가 서열의 하류에 연결한 인핸서들이, hTERT 인핸서, SV40 인핸서 및 CMV 인핸서를 이 순서로 연결한 인핸서인 발현용 카세트.
22. 제17항에 있어서, 프로모터가 hTERT 프로모터이고, 인핸서가 hTERT 인핸서인 발현용 카세트.
23. 제17항에 있어서, 이하의 엘리멘트 (ⅰ) 및 (ⅱ) 중 어느 하나 이상을 포함하는 발현용 카세트:
    (ⅰ) 발현시키고자 하는 유전자의 바로 상류에 연결된 RU5'; 및
    (ⅱ) 발현용 카세트의 최상류에 연결된 SV40-ori.
24. 제17항에 있어서, 발현시키고자 하는 단백질을 코드하는 DNA가 질환의 치료에 이용할 수 있는 치료용 유전자, 또는 의약, 진단약 혹은 시약에 이용할 수 있는 단백질을 코드하는 DNA인 발현용 카세트.
25. 제24항에 있어서, 치료용 유전자가 종양의 치료에 이용할 수 있는 암 억제 유전자인 REIC/Dkk-3 유전자인 발현용 카세트.
26. 제21항에 있어서, 이하에 나타내는 구조를 갖는 컨스트럭트 14번, 컨스트럭트 16번 및 컨스트럭트 17번으로 이루어지는 군에서 선택되는 컨스트럭트의 구조를 갖는 외래 유전자의 발현용 카세트:
    

    

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    ,
    

    

    ,
27. 제17항에 기재한 외래 유전자의 발현용 카세트를 포함하는 벡터.
28. 제27항에 있어서, 아데노바이러스 또는 아데노 수반 바이러스 벡터인 벡터.
29. 제27항에 기재한 벡터를 포함하는 숙주 세포.
30. 제27항에 기재한 벡터를 포함하는 질환 검출 또는 치료용 제제.
31. 제17항에 기재한 발현용 카세트 또는 제27항에 기재한 벡터를 이용하여 발현시키고자 하는 유전자를 발현시키는 방법.
32. 제17항에 기재한 발현용 카세트 또는 제27항에 기재한 벡터를 세포에 도입하여, 그 세포를 배양하는 것을 포함하는, 발현시키고자 하는 유전자가 코드하는 단백질을 제조하는 방법.
33. 제17항에 있어서, 프로모터가 CMV 프로모터 또는 CMVi 프로모터이고, 인핸서가 hTERT 인핸서인 발현용 카세트.
    
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