KR101721059B1

KR101721059B1 - 안구 표면 질환 예방 또는 치료용 약학조성물

Info

Publication number: KR101721059B1
Application number: KR1020140190726A
Authority: KR
Inventors: 양재욱; 이혜숙; 이지현; 이윤진; 이근무
Original assignee: 주식회사 아이바이오코리아
Priority date: 2014-12-26
Filing date: 2014-12-26
Publication date: 2017-03-30
Also published as: US20160215018A1; US9695218B2; KR20160079983A; WO2016104964A1

Abstract

본 발명은 연골세포 유래 세포외 기질에서 분리된 콜라겐 타입 II α1 기반의 펩타이드 GQDGLAGPK를 유효성분으로 함유하는 안구 표면 질환 예방 또는 치료용 약학조성물에 관한 것으로, 펩타이드 GQDGLAGPK를 처리한 알칼리 화상 동물 모델의 경우, 각막 혼탁이 감소하였으며, 혈관신생 인자인 CD31 및 VEGF 발현이 감소되었다. 또한, 염증 마커인 대식세포, TNFα, ICAM-1, VCAM-1 및 MMP-9이 감소하였으며, 염증 유발 인자인 NF-κB의 발현이 억제되었다. 따라서, 본 발명의 펩타이드 GQDGLAGPK는 안구 표면 질환인 각막 질환의 예방 또는 치료용 약학조성물로 사용될 수 있다.

Description

안구 표면 질환 예방 또는 치료용 약학조성물{Pharmaceutical composition for preventing or treating ocular surface disease}

본 발명은 신규한 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 안구 표면 질환 예방 또는 치료용 약학조성물에 관한 것이다.

안구 표면은 결막 상피세포와 각막 상피세포로 구성된 특수한 신체표면으로, 이들 세포들은 주눈물샘과 덧눈물샘으로부터 분비되는 눈물과 함께 건강한 안구 표면을 구성하고, 이러한 건강한 안구 표면은 안구의 최적 기능을 위해 필수적이다.

각막은 앞쪽 안구 표면의 1/6 부분을 차지하고 있는 투명하고 혈관이 없는 조직으로, 눈을 외부로부터 보호할 뿐만 아니라, 빛의 굴절과 전달에 주요한 기능을 하며 신경이 발달되어 있다. 각막은 각막상피, 보우만막, 각막실질, 데스메막, 각막내피와 같은 5개의 층으로 구성되어 있는데, 각막상피세포는 전체 각막의 두께의 약 10%를 차지하며 결막의 상피와 이어져 있으며, 5~7층의 세포로 이루어져 있는데, 가장 아래층의 바닥세포가 증식하여 바깥쪽으로 밀려와 7~14일 후 탈락한다.

각막 병변은 가장 많이 진단받는 질병 중 하나이자, 시력 손상의 주요 원인이다. 각막 병변의 원인은 다양할 수 있으며, 주로 알레르기, 감염, 안구건조증, 외과수술 또는 기타 트라우마 등에 기인한다. 이러한 각막은 손상 및 질환 시 그 본래의 상태가 파괴되는데, 각막의 상처는 윤부 줄기 세포에 의해 제공되는 것으로 여겨지는 각막 상피세포의 측면이동, 염증세포의 침윤, 및 상처 기질에서의 혈관신생을 자극하고, 각막 혈관신생, 염증 및 각막의 화학적 상해는 안구의 투명성을 저해하여 시력의 손실을 가져옴에 따라, 신속한 치료가 필요하나, 현재 시판되고 있는 안구 표면 질환 치료제는 스테로이드 또는 비스테로이드 염증 제제가 완화제로 사용될 뿐이다.

한국공개특허 제10-2010-0029672호

본 발명은 연골세포 유래 세포외 기질에서 분리된 콜라겐 타입 Ⅱ α1 기반의 펩타이드 및 이를 포함하는 조성물을 안구 표면 질환 예방 또는 치료용 약학조성물로 제공하고자 한다.

본 발명은 서열목록 2로 표시되는 아미노산 서열을 가지는 펩타이드를 제공한다.

또한, 본 발명은 서열목록 2로 표시되는 아미노산 서열을 가지는 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 안구 표면 질환 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공한다.

본 발명의 서열목록 2로 표시되는 펩타이드는 연골세포 유래 세포외 기질(chondrocyte-derived extracellular matrix; CDEM)에서 분리된 콜라겐 타입 Ⅱ α1 기반의 펩타이드일 수 있다.

본 발명의 안구 표면 질환은 각막 혼탁, 각막 혈관신생, 각막 염증 및 각막 섬유화로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 질환일 수 있다.

본 발명에 따르면, 연골세포 유래 세포외 기질에서 분리된 콜라겐 타입 Ⅱ α1 기반의 펩타이드 GQDGLAGPK를 알칼리 화상으로 안구 표면 질환이 유도된 동물모델에 투여한 결과, 생리식염수를 처리한 대조군 및 펩타이드 GDRGD이 처리된 비교군 보다 안구 혼탁이 감소하였으며, 혈관신생 인자인 CD31 및 VEGF 발현이 감소된 것을 확인할 수 있었다. 또한, 스트로마 부분에 섬유아세포 형성이 억제되었으며, 염증 마커인 대식세포, TNFα, ICAM-1, VCAM-1 및 MMP-9을 감소시키고, 염증 유발 인자인 NF-κB의 발현이 억제된 것을 확인할 수 있었다. 따라서, 본 발명의 펩타이드 GQDGLAGPK는 각막의 혈관신생, 염증, 혼탁 및 섬유화와 같은 안구 표면 질환을 예방하거나, 치료할 수 있는 약학조성물로 사용될 수 있다.

도 1은 알칼리 화상 토끼 각막에서 GQDGLAGPK의 효과를 확인한 결과로, 도 1A는 알칼리 화상 후 0, 7 및 17일째 토끼 각막을 현미경(SZX7, Olympus, Tokyo, Japan)으로 촬영한 사진이며(Scale bar=10 mm), 도 1B는 각막 혈관신생 정도를 나타낸 그래프이며, 도 1C는 각막 혼탁화 정도를 나타낸 그래프로, 그래프 값은 각 실험군(n=5)의 평균±표준편차를 나타낸 것이며, t-테스트를 통하여 *P<0.05 vs 알칼리 화상군 값을 유의한 값으로 보았다.
도 2는 알칼리 화상 토끼 각막의 두께 변화에 대한 GQDGLAGPK의 효과를 확인한 결과로, 도 2A는 가상 현미경(NanoZoomer 2.0 RS, Hamamatsu, Japan)으로 촬영한 조직 절편 사진이며(Scale bar=1 mm), 도 2B는 각막 두께를 나타내는 그래프이다.
도 3은 알칼리 화상 토끼에서 섬유화 변화에 대한 GQDGLAGPK의 효과를 확인하기 위하여, 안구 섬유아세포를 Masson's trichrome 염색법으로 면역염색하고 가상 현미경(NanoZoomer 2.0 RS, Hamamatsu, Japan)으로 촬영한 사진(Scale bar=100 μm)으로, 갈색으로 나타난 부분이 섬유아세포이다.
도 4는 알칼리 화상 토끼에서 혈관신생 마커에 대한 GQDGLAGPK의 효과를 확인한 결과로, 화살표(↓)로 표시된 부분이 H&E로 면역염색된 신생혈관이며, 특이적 항체인 CD31 및 VEGF로 면역염색된 조직 절편을 가상 현미경(NanoZoomer 2.0 RS, Hamamatsu, Japan)으로 촬영한 사진이다(Scale bar=300 μm).
도 5는 알칼리 화상 토끼에서 염증 마커에 대한 GQDGLAGPK의 효과를 확인한 결과로, 조직 절편을 대식세포, TNFα, ICAM-1, VCAM-1 및 MMP-9와 같은 특이적 항체로 면역염색 후 가상 현미경(NanoZoomer 2.0 RS, Hamamatsu, Japan)으로 활영한 사진이다(Scale bar=300 μm).
도 6은 알칼리 화상 토끼에서 핵 전사 인자 발현에 대한 GQDGLAGPK의 효과를 확인한 결과로, 특이적 항체인 NF-κB로 면역염색한 조직 절편을 가상 현미경(NanoZoomer 2.0 RS, Hamamatsu, Japan)으로 촬영한 사진이다(Scale bar=300 μm).

상기 서열목록 2로 표시되는 아미노산 서열을 가지는 펩타이드는 연골세포 유래 세포외 기질(chondrocyte-derived extracellular matrix; CDEM)에서 분리된 콜라겐 타입 II α1 기반의 펩타이드일 수 있다.

보다 상세하게는, 상기 연골세포 유래 세포외 기질은 동물의 연골조직 및/또는 연골유래 연골세포에서 분비되어 형성된 연골세포 유래 세포외 기질에서 분리된 것일 수 있으며, 상기 동물은 돼지, 말, 소, 양, 염소 및 원숭이로 이루어진 군에서 선택될 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.

본 발명의 안구 표면 질환은 각막 혼탁, 각막 혈관신생, 각막 염증 및 각막 섬유화로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 질환일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 서열목록 2로 표시되는 아미노산 서열을 가지는 펩타이드는 약학조성물 총 100 중량부에 대하여 0.1 내지 50 중량부로 함유될 수 있다.

상기 약학조성물은 점안제, 주사제, 과립제, 정제, 환제, 캡슐제, 겔, 시럽, 현탁제, 유제, 점적제 및 액제로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 제형일 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.

본 발명의 다른 구체예에서, 서열목록 2로 표시되는 아미노산 서열을 가지는 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 안구 표면 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물은 약학 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제, 붕해제, 감미제, 피복제, 팽창제, 윤활제, 활택제, 향미제, 항산화제, 완충액, 정균제, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 첨가제를 추가로 포함할 수 있다.

구체적으로 담체, 부형제 및 희석제는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 사용할 수 있으며, 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트, 수크로스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제할 수 있다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용할 수 있다. 경구를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 있으며 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제 등이 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기재로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 일실시예에 따르면 상기 약학 조성물은 정맥내, 동맥내, 복강내, 근육내, 동맥내, 복강내, 흉골내, 경피, 비측내, 흡입, 국소, 직장, 경구, 안구내 또는 피내 경로를 통해 통상적인 방식으로 대상체로 투여할 수 있다.

상기 서열목록 2로 표시되는 아미노산 서열을 가지는 펩타이드의 바람직한 투여량은 대상체의 상태 및 체중, 질환의 종류 및 정도, 약물 형태, 투여경로 및 기간에 따라 달라질 수 있으며 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 본 발명의 일실시예에 따르면 이에 제한되는 것은 아니지만 1일 투여량이 0.01 내지 200 mg/kg, 구체적으로는 0.1 내지 200 mg/kg, 보다 구체적으로는 0.1 내지 100 mg/kg 일 수 있다. 투여는 하루에 한 번 투여할 수도 있고 수회로 나누어 투여할 수도 있으며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 상기 '대상체'는 인간을 포함하는 포유동물일 수 있으나, 이들 예에 한정되는 것은 아니다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.

하기의 실험예는 본 발명에 따른 각각의 실시예에 적용되는 실험예를 제공하기 위한 것이다.

< 실험예 1> 면역 조직화학적 분석

하기 알칼리 화상 동물 모델의 안구 조직 절편을 6 μm 두께로 절단하여 면역 조직화학 분석에 사용하였다.

먼저, 조직 절편을 3.5% 파라포름알데하이드로 고정시키고, 0.1% 트리톤 X-100, 불활성화된 2% 소혈청알부민(BSA; all from Sigma, St. Louis, MO)을 투과시키고, 항-CD31(1:1,000; Abcam Inc., Cambridge, MA), 항-MMP-9, 항-ICMA-1, 항-VCAM-1 (1:1,000; from Bioss Antibodies, Woburn, MA), 항-TNFα, 항-NF-κB (1:1,000; all from biorbyt LLC, San Franciso, CA) 항-대식세포(macrophage)/ 단핵백혈구(monocyte)(Abnova Crop., Taipei, Taiwan) 및 항-VEGF-A (Abbiotec, San Diego, CA) 1차 항체로 하룻밤 동안 인큐베이션하였다.

그 후, 절편에 2차 항체를 45분간 인큐베이션하고 diaminobenzidine (DAB) chromogen으로 면역학적 반응을 시각화하고, 절편을 실온에서 30초간 Mayer's hematoxylin (Sigma)으로 대비염색하였다.

상기 방법으로 염색된 절편을 가상 현미경(virtual microscope; NanoZoomer 2.0 RS, Hamamatsu, Japan)으로 촬영하였다.

< 실시예 1> CDEM ( chondrocyte - derived extracellular matrix )에서 분리된 주요 펩타이드 확인

연골세포 유래 세포외 기질(CDEM) 혼합물로부터 단백질 분석을 수행하였다. CDEM(chondrocyte-derived extracellular matrix)의 주요 단백질 분석은 Baek's group of Center of Biomedical Mass Sepctrometry (Diatech Korea Co., Ltd., Seoul, Korea)에서 수행하였다.

그 결과, 표 1과 같은 3 개의 주요 단백질이 분리되었는데, 콜라겐 타입 II α1 기반의 펩타이드 서열 GQDGLAGPK(펩타이드 Ⅱ)가 전체 단백질 중 15.9%로 가장 높은 함량을 나타내었으며, 그 다음으로 콜라겐 타입 Ⅰ α1 기반의 펩타이드 서열 GPAGPR(펩타이드 Ⅲ)가 2.1% 함량을 나타내었으며, 같은 콜라겐 타입 I α1 기반의 펩타이드 서열 GDRGD(펩타이드 I)가 0.6% 함량으로 확인되었다.

상기 결과로부터 주요 펩타이드인 GQDGLAGPK의 효과를 알칼리 화상 토끼 모델에서 확인하였으며, 가장 낮은 함량의 GDRGD 펩타이드를 비교군으로 사용하였다.

상기 펩타이드들은 PEPTRon (Daejeon, Korea)에서 합성하여 모든 실험에 사용하였다.

	펩타이드 서열	단백질	분자 중량(kDa)	함량(%, w/w)
펩타이드 Ⅰ (서열목록 1)	GDRGD	Collagen type I, α1	15.250	0.6
펩타이드 Ⅱ (서열목록 2)	GQDGLAGPK	Collagen type Ⅱ, α1	130.084	15.9
펩타이드 Ⅲ (서열목록 3)	GPAGPR	Collagen type I, α1	129.160	2.1

< 실시예 2> 각막 알칼리 화상 동물 모델 제작

눈과 시력 연구를 위한 동물 실험은 인제대학교 의과대학교 및 ARVO Statement에서 승인받은 동물 실험 지침서에 따라 수행되었다(No.; 2014-028).

2.0 내지 2.5 kg의 뉴질랜드 흰색 토끼 26 마리를 Samtako (Osan, Korea)에서 구입하고, 케타민 하이드로클로라이드(30 mg/kg body weight, Huons, Jecheon, Korea) 및 자일라진 하이드로클로라이드(2.5 mg/kg, Bayer Korea Ltd., Seoul, Korea) 혼합물을 근육에 주사하여 전신 마취하였으며, 알카라인 프로프라카인(Alcaine propracaine) 점안액(Alcon Inc., Seoul, Korea)을 이용하여 국소 마취하였다.

그 후, 1 N NaOH를 적신 8 mm 필터 종이를 토끼의 오른쪽 각막 중심에 1분간 노출시켜 알칼리 화상 모델은 제작하고, 화상 7일 후 알칼리 화상에 따른 각막 혈관신생 및 각막 혼탁 증가를 확인하였다.

상기 토끼들을 무작위로 알칼리 화상군(n=5), 펩타이드 I 처리군(n=5) 및 펩타이드 Ⅱ 처리군(n=5)으로 나누었다. 알칼리 화상군은 생리식염수를 매일 4회 투여하였으며, 펩타이드 I 처리 실험군에는 GDRGD 펩타이드 10 mg/mL을 매일 4회 투여하였으며, 펩타이드 Ⅱ 처리 실험군에는 GQDGLAGPK 펩타이드 10 mg/mL을 매일 4회 투여하였으며, 왼쪽 눈을 대조군으로 사용하였다.

상기 방법으로 각각의 처리 물질들을 10일간 투여한 후, H&E 염색, Masson's trichrome 염색 및 면역조직화학 염색(immunohistochemistry)을 수행하여 섬유화, 혈관신생, 염증 및 각막 구조 변화 등을 확인하였다.

< 실시예 3> 각막 알칼리 화상 토끼 동물모델에서 각막 혈관신생 및 혼탁화 확인

각막 알칼리 화상 7일 후, 각막 혈관신생 및 혼탁화에 대한 임상 평가를 수행하였다.

먼저, 각막 혈관신생 정도를 0점에서 3점까지 평가하였다. 혈관신생이 나타나지 않은 경우 0점, 각막 주변부의 혈관신생이 확인될 경우 1점, 눈동자 가장자리까지 혈관신생이 확장된 경우 2점 및 눈동자 가장자리는 넘어 각막 중심까지 혈관신생이 확장된 경우 3점으로 평가하였으며, 각막 혈관신생 평가시 상당한 혼탁 및 광범위한 검구 유착이 형성되어 각막 혈관신생 정도를 평가하기 어려울 경우, 3점으로 평가하였다.

또한, 각막 혼탁 정도를 0점에서 3점까지 평가하였다. 홍채 부분이 선명하게 보이는 투명한 각막의 경우 0점, 홍채 부분에 부분적인 혼탁이 확인될 경우 1점, 눈동자 가장자리와 홍채 부분이 약하게 보일 때 2점, 홍채 및 눈동자 부분이 완전히 혼탁화된 경우 3점으로 평가하였다.

그 결과, 도 1A와 같이 알칼리 화상 후, 즉시 각막 혼탁이 나타났으며, 알칼리 화상 7일 후, 각막 혈관신생 및 혼탁이 증가한 것을 확인할 수 있었다.

또한, 각막 혈관신생 및 혼탁이 확인된 후 생리 식염수, 펩타이드 I 또는 펩타이드 II를 각각 10일간 처리한 알칼리 화상 17일 후, 도 1B 및 도 1C와 같이 대조군의 각막 혼탁 점수가 3.0±0.0으로 상당히 증가하였으며, 혈관신생점수는 2.7±0.5으로 신생혈관이 눈동자 가장자리를 넘어 각막 중심까지 확장된 것을 확인할 수 있었다.

반면, 도 1C와 같이 펩타이드 II를 처리한 실험군에서는 1.9±0.6(p<0.05), 펩타이드 I을 처리한 실험군에서는 2.1±0.3(p<0.05)로 혼탁화가 감소된 것을 확인할 수 있었으며, 도 1B와 같이 대조군보다 펩타이드 Ⅱ를 처리한 실험군에서 감소된 혈관신생 효과가 나타나는 것을 확인할 수 있었다.

상기 결과로부터 GQDGLAGPK 펩타이드가 각막 혼탁화를 저해하는데 효과적임이 확인되었다.

<실시예 4> 각막 알칼리 화상 토끼 동물모델에서 GQDGLAGPK에 따른 각막 두께 변화 확인

가상 현미경(virtual microscope; NanoZoomer 2.0 RS, Hamamatsu, Japan)으로 촬영한 H&E 염색 절편의 각막두께를 NDP view 프로그램 (Hamamatsu, USA)을 이용하여 분석하였다.

그 결과, 도 2와 같이 알칼리 화상 후, 정상범위인 628.0±13.2 μm에서 1078.0±30.8 μm로 증가한 것을 확인할 수 있었다. 그러나, 펩타이드 Ⅱ 처리 10일 후, 펩타이드 Ⅱ 처리 실험군의 각막 두께가 876.0±37.0 μm (p<0.05)로 대조군보다 감소한 것을 확인할 수 있었다. 이와 대조적으로 펩타이드 I 을 처리한 실험군은 1066.0±31.7 μm로 대조군과 비교하여 각막 두께 감소에 차이가 나타나지 않았다.

<실시예 5> 알칼리 화상에 따른 토끼 각막의 섬유화에 대한 GQDGLAGPK 효과 확인

알칼리 화상에 따른 각막의 섬유화를 확인하기 위해 Masson's trichrome 염색을 수행하였다.

안구들을 적출하고 3.5 % 파라포름알데하이드로 고정시킨 후 세척하고 파라핀이 박힌 조직 절편(6 μm)으로 제작할 때까지 70 % 알콜에 저장하였다. 콜라겐 섬유화 및 섬유화 등급 정도를 시각화하기 위해, 절편에 Massons trichrome stain kit (Polysciences, Inc. Germany)를 이용하여 Massons trichrome 염색을 수행하였다. 구체적으로, 자일렌(xylene)을 이용하여 조직 절편의 탈파라핀 과정을 거친 후 100% 에탄올 2회, 95% 에탄올 1회, 85% 에탄올 1회 순으로 함수 과정을 거친 후 증류수로 세척하였다. 이후 56℃에서 1시간 동안 bouin solusion에 인큐베이션한 후 10 분간 수세한 다음 weigert iorn hematoxylin working solution에 10 분간 반응시켰다. 그 다음 수세 후 5분간 biebrich scarlet-acid fuchsin solusion에 반응 후 증류수로 세척하고, phosphotungstic/phosphomolybdic acid에 10 분간 반응시켰다. 5분 동안 아닐린 블루(aniline blue) 용액에 염색시킨 후 수체하고, 1분 동안 1% 아세트산(acetic acid)에 담근 후 discard solution, 증류수 순으로 세척하였다. 마지막으로 탈수 과정을 거친 후, 투명 및 봉립한 조직을 가상 현미경(virtual microscope; NanoZoomer 2.0 RS, Hamamatsu, Japan)으로 촬영하였다.

그 결과, 도 3과 같이 대조군의 경우, 알칼리 화상에 의해 스트로마 부분에 갈색 섬유아세포 형성이 증가된 것이 확인되었으며, 펩타이드 I을 처리한 실험군에서는 알칼리 화상에 따른 섬유화 변화 억제효과가 매우 적게 나타났다. 그러나, 펩타이드 Ⅱ를 처리한 실험군에서는 섬유아세포의 증가가 억제된 것을 확인할 수 있었다.

상기 결과로부터 GQDGLAGPK 펩타이드가 섬유아세포의 증가를 저해함으로써, 각막 섬유화를 억제하는데 효과적임이 확인되었다.

<실시예 6> 알칼리 화상 토끼의 각막 혈관신생에 대한 GQDGLAGPK 효과 확인

H&E 염색을 수행하여 알칼리 화상에 따른 각막의 조직학적 변화를 확인하였다. 안구들을 3.5 % 파라포름알데하이드로 고정시킨 후, optimal cutting temperature compound(OCT; Tissue-Tek, Sakura Fine Technical Co., Ltd., Tokyo, Japan)에 박고 액체 질소에 냉동시켰다.

그 후, 4% 포름알데하이드에 24시간 동안 고정시키고, 건조시킨 후, 파라핀 왁스에 박았다. 그 후 8 μm 두께의 조직 절편으로 준비한 후 헤모톡실린/에오신(H&E)염색을 수행하였다.

먼저, 8 μm 두께의 조직 절편을 헤모톡실린(hematoxylin)에 3분간 염색한 후 수돗물로 수세한 다음 1% 염산 용액을 1-2방울 떨어뜨려 세포질에 염색된 헤모톡실린을 탈색한 후 수세한다. 조직 절편을 에오신(Eosin)에 1분간 염색한 후 수세하고 85% 에탄올 1회, 95% 에탄올 1회, 100% 에탄올 2회의 순으로 탈수과정을 거친 후, 1분간 카르복실렌(carboxylene)에 반응시킨 다음 자일렌(xylene) 용액에 3분씩 2회 투명 과정을 거친 후 봉입하고, 절편의 이미지를 가상 현미경(virtual microscope; NanoZoomer 2.0 RS, Hamamatsu, Japan)으로 촬영하였다.

그 결과, 도 4의 윗부분을 참고하면, 알칼리 화상은 각막에 상피 증식, 염증성 세포 침입, 간질 부종 및 신생혈관 형성을 유도한다. 그러나, 도 3을 참고하면, 상기 조직학적 변화에 대하여, 펩타이드 I 처리 실험군에서는 매우 적은 개선효과를 나타낸 반면, 펩타이드 Ⅱ 처리 실험군에서는 향상된 개선효과를 나타내었다.

상기 결과로부터, 펩타이드 Ⅱ가 신생혈관 형성에 영향을 미치는 것이 확인됨에 따라, 알칼리 화상을 입힌 각막에서 각각의 펩타이드 처리에 따른 혈관신생 특징을 확인하기 위해, 실험예 1과 같은 방법으로 각막 혈관신생의 특이적 마커인 CD31 및 VEGF를 이용하여 각막 절편을 면역염색하였다.

그 결과, 도 4와 같이 CD31 및 VEGF 혈관신생 마커가 알칼리 화상에 따른 섬유화 기질 세포에서 강하게 발현되는 것을 확인할 수 있었다. 그러나, 펩타이드 II가 처리된 실험군에서 펩타이드 I이 처리된 실험군보다 상피, 상피하 및 기질에서 CD31 및 VEGF의 유의한 감소를 확인할 수 있었다.

상기 결과로부터 GQDGLAGPK 펩타이드가 혈관신생 인자인 CD31 및 VEGF의 발현을 감소시킴으로써, 각막 혈관신생을 저해하는데 효과적임이 확인되었다.

<실시예 7> 알칼리 화상 토끼에서 GQDGLAGPK의 염증 억제 효과 확인

앞선 실험결과에서 언급했듯이 H&E 염색 결과, 알칼리 화상에 의해 염증 세포들이 각막으로 침투한 것을 확인할 수 있었다. 따라서, 염증 마커 발현에 대하여 각 펩타이드의 효과를 확인하기 위해, 실험예 1과 같은 방법으로 각막 절편에 대식세포, TNFα, ICAM-1, VCAM-1 및 MMP-9와 같은 염증 특이적 마커를 이용하여 면역염색을 수행하였다.

그 결과, 도 5와 같이 알칼리 화상은 상피와 상피하 및 증식성 기질에서 대식세포 발현을 증가시킨 반면, 펩타이드 II가 처리된 실험군에서는 대식세포의 발현을 효과적으로 억제한 것을 확인할 수 있었다. 또한, 알칼리 화상군에서는 염증성 사이토카인 TNFα, ICAM-1 및 VCAM-1와 같은 부착분자의 증가가 확인되었으나, 펩타이드 II가 처리된 실험군에서는 상기 염증성 인자들의 발현이 감소된 것을 확인할 수있었다. 추가적으로, 알칼리 화상군에서는 MMP-9의 발현이 강하게 나타난 반면, 펩타이드 I이 처리된 실험군보다 펩타이드 Ⅱ가 처리된 실험군에서 MMP-9의 발현이 억제된 것을 확인할 수 있었다.

또한, GQDGLAGPK 펩타이드가 알칼리 화상으로 인한 염증 유발 인자인 NF-κB 활성화를 감소시킬 수 있는지를 확인하기 위해, 조직 절편을 특이적 항체 NF-κB를 이용하여 실험예 1과 같은 방법으로 면역염색을 수행하였다.

그 결과 도 6과 같이, 알칼리 화상에 의해 기질에 NF-κB 발현이 유도되는 되는 것이 확인되었다. 반면, 펩타이드 Ⅱ가 처리된 실험군에서는 펩타이드 I이 처리된 실험군보다 NF-κB 발현이 감소된 것을 확인할 수 있었다.

상기 결과들로부터 GQDGLAGPK 펩타이드가 염증성 인자의 발현을 저해함으로써, 각막 염증 질환에 효과적임이 확인되었다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> INJE UNIVERSITY INDUSTRY-ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION <120> Pharmaceutical composition for preventing or treating ocular surface disease <130> ADP-2014-0590 <160> 3 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Collagen <400> 1 Gly Asp Arg Gly Asp 1 5 <210> 2 <211> 9 <212> PRT <213> Collagen <400> 2 Gly Gln Asp Gly Leu Ala Gly Pro Lys 1 5 <210> 3 <211> 6 <212> PRT <213> Collagen <400> 3 Gly Pro Ala Gly Pro Arg 1 5

Claims

서열목록 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드.
청구항 1에 있어서, 상기 서열목록 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드는 연골세포 유래 세포외 기질(chondrocyte-derived extracellular matrix; CDEM)에서 분리된 콜라겐 타입 Ⅱα1(collagen type Ⅱ α1) 기반인 것을 특징으로 하는 펩타이드.
서열목록 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드를 유효성분으로 함유하며, 각막 혼탁, 각막 혈관신생, 각막 염증 및 각막 섬유화로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 안구 표면 질환 예방 또는 치료용 약학조성물.
삭제
청구항 3에 있어서, 상기 서열목록 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드는 약학조성물 총 100 중량부에 대하여 0.1 내지 50 중량부로 함유되는 것을 특징으로 하는 안구 표면 질환 예방 또는 치료용 약학조성물.
청구항 3에 있어서, 상기 약학조성물은 점안제, 주사제, 과립제, 정제, 환제, 캡슐제, 겔, 시럽, 현탁제, 유제, 점적제 및 액제로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 제형인 것을 특징으로 하는 안구 표면 질환 예방 또는 치료용 약학조성물.