KR101712076B1 - 조산 위험성을 예측하기 위한 CpG 메틸화 마커 ITGA11 및/또는 THBS2, 및 이의 이용 - Google Patents
조산 위험성을 예측하기 위한 CpG 메틸화 마커 ITGA11 및/또는 THBS2, 및 이의 이용 Download PDFInfo
- Publication number
- KR101712076B1 KR101712076B1 KR1020160163427A KR20160163427A KR101712076B1 KR 101712076 B1 KR101712076 B1 KR 101712076B1 KR 1020160163427 A KR1020160163427 A KR 1020160163427A KR 20160163427 A KR20160163427 A KR 20160163427A KR 101712076 B1 KR101712076 B1 KR 101712076B1
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- methylation
- cpg
- gene
- itga11
- thbs2
- Prior art date
Links
- 230000011987 methylation Effects 0.000 title claims abstract description 106
- 238000007069 methylation reaction Methods 0.000 title claims abstract description 105
- 102100025320 Integrin alpha-11 Human genes 0.000 title claims abstract description 43
- 102100029529 Thrombospondin-2 Human genes 0.000 title claims abstract description 28
- 101001078151 Homo sapiens Integrin alpha-11 Proteins 0.000 title claims description 30
- 101000633605 Homo sapiens Thrombospondin-2 Proteins 0.000 title claims description 30
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 62
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 25
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 16
- 101710123196 Integrin alpha-11 Proteins 0.000 claims abstract description 4
- 108010060887 thrombospondin 2 Proteins 0.000 claims abstract description 4
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 45
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical class NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 39
- 230000008774 maternal effect Effects 0.000 claims description 27
- 108091029430 CpG site Proteins 0.000 claims description 23
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 claims description 22
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 claims description 22
- 206010036590 Premature baby Diseases 0.000 claims description 21
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 claims description 21
- LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-M Bisulfite Chemical group OS([O-])=O LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 19
- 101100287367 Homo sapiens ITGA11 gene Proteins 0.000 claims description 13
- 101150033395 THBS2 gene Proteins 0.000 claims description 13
- 230000002028 premature Effects 0.000 claims description 11
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 9
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 9
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 9
- 238000012175 pyrosequencing Methods 0.000 claims description 7
- 208000006399 Premature Obstetric Labor Diseases 0.000 claims description 6
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 claims description 6
- 206010036600 Premature labour Diseases 0.000 claims description 5
- 208000026440 premature labor Diseases 0.000 claims description 5
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 4
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 4
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 claims description 4
- 102000023732 binding proteins Human genes 0.000 claims description 3
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 claims description 3
- 238000001369 bisulfite sequencing Methods 0.000 claims description 3
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims description 3
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 claims description 3
- 238000009007 Diagnostic Kit Methods 0.000 claims description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 abstract description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 abstract description 3
- CTMZLDSMFCVUNX-VMIOUTBZSA-N cytidylyl-(3'->5')-guanosine Chemical group O=C1N=C(N)C=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](OP(O)(=O)OC[C@@H]2[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O2)N2C3=C(C(N=C(N)N3)=O)N=C2)O)[C@@H](CO)O1 CTMZLDSMFCVUNX-VMIOUTBZSA-N 0.000 description 39
- 208000005107 Premature Birth Diseases 0.000 description 30
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 22
- 210000001691 amnion Anatomy 0.000 description 18
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 16
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 12
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 12
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 12
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 11
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 10
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 9
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 8
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 7
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 7
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 7
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 6
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 4
- 230000007067 DNA methylation Effects 0.000 description 4
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 4
- RJKFOVLPORLFTN-LEKSSAKUSA-N Progesterone Chemical compound C1CC2=CC(=O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H](C(=O)C)[C@@]1(C)CC2 RJKFOVLPORLFTN-LEKSSAKUSA-N 0.000 description 4
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 4
- 239000000090 biomarker Substances 0.000 description 4
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 4
- 208000034423 Delivery Diseases 0.000 description 3
- 238000003491 array Methods 0.000 description 3
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 3
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 3
- 239000013068 control sample Substances 0.000 description 3
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 238000010199 gene set enrichment analysis Methods 0.000 description 3
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 3
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 description 3
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 3
- 230000035935 pregnancy Effects 0.000 description 3
- 238000012049 whole transcriptome sequencing Methods 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- LRSASMSXMSNRBT-UHFFFAOYSA-N 5-methylcytosine Chemical compound CC1=CNC(=O)N=C1N LRSASMSXMSNRBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010008267 Cervical incompetence Diseases 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 2
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010036790 Productive cough Diseases 0.000 description 2
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 2
- DWAQJAXMDSEUJJ-UHFFFAOYSA-M Sodium bisulfite Chemical compound [Na+].OS([O-])=O DWAQJAXMDSEUJJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N Uracil Chemical compound O=C1C=CNC(=O)N1 ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000004381 amniotic fluid Anatomy 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 2
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 2
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 2
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 2
- 210000003756 cervix mucus Anatomy 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- 210000004700 fetal blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 2
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 2
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 210000002826 placenta Anatomy 0.000 description 2
- 229960003387 progesterone Drugs 0.000 description 2
- 239000000186 progesterone Substances 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- 235000010267 sodium hydrogen sulphite Nutrition 0.000 description 2
- 210000003802 sputum Anatomy 0.000 description 2
- 208000024794 sputum Diseases 0.000 description 2
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical compound CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 2
- HWPZZUQOWRWFDB-UHFFFAOYSA-N 1-methylcytosine Chemical compound CN1C=CC(N)=NC1=O HWPZZUQOWRWFDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VOXZDWNPVJITMN-ZBRFXRBCSA-N 17β-estradiol Chemical compound OC1=CC=C2[C@H]3CC[C@](C)([C@H](CC4)O)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 VOXZDWNPVJITMN-ZBRFXRBCSA-N 0.000 description 1
- 206010000234 Abortion spontaneous Diseases 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 206010060937 Amniotic cavity infection Diseases 0.000 description 1
- 108010074051 C-Reactive Protein Proteins 0.000 description 1
- 102100032752 C-reactive protein Human genes 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LZZYPRNAOMGNLH-UHFFFAOYSA-M Cetrimonium bromide Chemical compound [Br-].CCCCCCCCCCCCCCCC[N+](C)(C)C LZZYPRNAOMGNLH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 208000008158 Chorioamnionitis Diseases 0.000 description 1
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 208000012239 Developmental disease Diseases 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 208000010201 Exanthema Diseases 0.000 description 1
- 108700007698 Genetic Terminator Regions Proteins 0.000 description 1
- 206010053759 Growth retardation Diseases 0.000 description 1
- 208000032754 Infant Death Diseases 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 1
- 206010056254 Intrauterine infection Diseases 0.000 description 1
- 208000034702 Multiple pregnancies Diseases 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 206010036595 Premature delivery Diseases 0.000 description 1
- 206010073024 Preterm premature rupture of membranes Diseases 0.000 description 1
- 239000012162 RNA isolation reagent Substances 0.000 description 1
- 239000013614 RNA sample Substances 0.000 description 1
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 108091081062 Repeated sequence (DNA) Proteins 0.000 description 1
- 208000007313 Reproductive Tract Infections Diseases 0.000 description 1
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 1
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 1
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 238000002669 amniocentesis Methods 0.000 description 1
- 239000012491 analyte Substances 0.000 description 1
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 1
- 208000006673 asthma Diseases 0.000 description 1
- 239000012148 binding buffer Substances 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 230000000740 bleeding effect Effects 0.000 description 1
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 1
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 206010008129 cerebral palsy Diseases 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 1
- 230000008602 contraction Effects 0.000 description 1
- 238000010219 correlation analysis Methods 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 231100000517 death Toxicity 0.000 description 1
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 1
- 238000013399 early diagnosis Methods 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000008995 epigenetic change Effects 0.000 description 1
- 201000005884 exanthem Diseases 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 231100000001 growth retardation Toxicity 0.000 description 1
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 238000007726 management method Methods 0.000 description 1
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 238000012164 methylation sequencing Methods 0.000 description 1
- 238000007855 methylation-specific PCR Methods 0.000 description 1
- 238000002493 microarray Methods 0.000 description 1
- 208000015994 miscarriage Diseases 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 description 1
- -1 nucleoside triphosphates Chemical class 0.000 description 1
- 230000032696 parturition Effects 0.000 description 1
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 230000009596 postnatal growth Effects 0.000 description 1
- 206010036596 premature ejaculation Diseases 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 description 1
- 206010037844 rash Diseases 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000000241 respiratory effect Effects 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 208000000995 spontaneous abortion Diseases 0.000 description 1
- 150000003431 steroids Chemical class 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 1
- 229940113082 thymine Drugs 0.000 description 1
- 238000011269 treatment regimen Methods 0.000 description 1
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 1
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 description 1
- 230000003827 upregulation Effects 0.000 description 1
- 229940035893 uracil Drugs 0.000 description 1
- 206010046901 vaginal discharge Diseases 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 230000036266 weeks of gestation Effects 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/5308—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for analytes not provided for elsewhere, e.g. nucleic acids, uric acid, worms, mites
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6854—Immunoglobulins
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
- G01N2800/36—Gynecology or obstetrics
- G01N2800/368—Pregnancy complicated by disease or abnormalities of pregnancy, e.g. preeclampsia, preterm labour
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
- G01N2800/50—Determining the risk of developing a disease
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
본 발명은 산모의 시료로부터 ITGA11 및/또는 THBS2 유전자의 CpG 부위의 메틸화 수준을 검출함으로써, 조산 위험성을 진단하기 위한 조성물, 진단 키트 및 진단 방법에 관한 것이다.
Description
본 발명은 산모의 시료로부터 ITGA11 및/또는 THBS2 유전자의 CpG 부위의 메틸화 수준을 검출함으로써, 조산 위험성을 진단하기 위한 조성물, 진단 키트 및 진단 방법에 관한 것이다.
조산(preterm birth)은 일반적으로 20주를 지나 37주 이전에 분만하는 것을 의미한다. 조산으로 태어난 신생아는 전체 영아 사망자의 약 60%를 차지할 정도로 사망의 위험이 높고, 생존아의 경우에도 신경계 발달장애, 호흡기계 합병증, 출생 후 성장지연 등으로 신생아 집중치료가 필요하며, 더 나아가 심각한 장기적 또는 단기적 질환에 이환율이 높다. 또한, 조산의 약 75%는 조기진통과 양막파수, 그리고 이와 관련된 자궁경관 무력증과 융모막염 등을 수반하여 발생하게 된다. 하지만 조산과 관련된 기전은 아직 명확히 밝혀져 있지 않으며, 자연적 진통과 흔히 연관된 위험인자는 생식기계 감염, 다태 임신, 2,3 삼분기 출혈, 이전의 조산기왕력 등이 있다.
조산아의 생존율을 향상시키기 위한 최소한의 임신주수는 27주, 출생체중은 0.9 kg이고, 출생 신생아의 이환과 사망은 출생체중보다는 일차적으로 임신주수, 즉 성숙도에 영향을 받는 것으로 알려져 있다. 따라서 이른 주수에 조산의 징후가 왔을 때, 적절한 치료를 통하여 분만 주수를 지연시켜 신생아를 성숙도를 높이는 것은 산모와 신생아의 건강과 삶의 질과 비용에 중대한 관건이 된다.
현재까지 조산의 치료를 위하여 조기진통의 산모에게 자궁수축 억제제 투여, 항생제 치료, 스테로이드제 및 프로게스테론 투여를 통해 진통을 억제하고 분만을 지연시켜왔다. 그러나, 이미 조기진통 및 조기 양막 파수가 발생한 경우에는 자궁 내 감염 및 염증에 대한 항생제의 치료 효과는 매우 제한적이며 조산을 막을 수는 없는 것으로 알려져 있다. 또한 자궁경관 무력증의 산모인 경우 감염과 유산에 대한 상당한 위험이 있기 때문에 조기분만의 치료와 예방으로서 자궁경부봉축술을 시행하여 왔으나, 이것이 근본적인 치료는 될 수 없으며 단기간의 임신 연장에 도움이 되는 정도로 알려져 있다.
따라서, 조산의 위험성을 미리 예측함으로써 조산위험 산모군을 선별하고, 이들에 대한 적절한 관리를 통하여 조산을 방지하거나 효과적인 치료방법을 개발하는 것이 필요하다. 또한, 조산의 시기가 빠를수록 신생아에게 후유증을 남길 가능성이 높고 후유증의 정도도 심하기 때문에 조산을 예측할 수 있다면 미숙아와 그로 인한 장애아의 발생률을 현저하게 줄일 수 있을 것으로 기대된다.
조산을 예측하기 위한 일반적인 접근 방법은, 산부인과학적으로, 인구통계학적으로 및 여러 가지 증후군에 따라 특별한 주의를 기울여야 하는 여성군을 확인하는 것이었으나(Main et al., Am. J. Obste. Gynecol., 151:892-898, 1985), 이러한 접근 방법은 그 방식이 민감하거나 특이적이지 않다는 문제가 있다. 이러한 문제점을 극복하기 위하여, 갑작스런 조산이나 양막 파수를 예견하기 위한 생화학적인 표지자를 발견하기 위하여 많은 연구가 시행되어 왔고, 플라즈마 에스트라디올-17 베타(plasma estradiol-17 beta), 프로게스테론(progesterone), C-반응성 단백질(C-reactive protein)과 같은 물질들이 후보로 지명되었으나, 이 역시 그 정확도가 떨어지는 것으로 나타났다. 따라서, 보다 검출이 용이하고 민감도와 특이도가 높은 표지자의 개발이 필요하다.
Main et al., Am. J. Obste. Gynecol., 151:892-898 (1985)
이에, 본 발명에서는 산모에게서 조산 위험성을 시사하는 조산의 예측 표지자를 발굴하여 조산의 예방에 기여하고자 한다.
이를 위하여, 일예로, 본 발명의 목적은 ITGA11 (Integrin alpha-11) 및 THBS2 (Thrombospondin-2)로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 유전자의 CpG 부위의 메틸화 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 산모의 조산 위험성의 진단용 조성물을 제공하는 것이다.
다른 예로, 본 발명의 또 하나의 목적은, 상기 조성물을 포함하는, 산모의 조산 위험성 진단용 키트를 제공하는 것이다.
다른 예로, 본 발명의 또 하나의 목적은, 산모의 시료로부터 ITGA11 및 THBS2 로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 유전자의 CpG 부위의 메틸화 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 조산 위험성 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공하는 것이다.
다른 예로, 본 발명의 또 하나의 목적은, 산모의 시료로부터 ITGA11 및 THBS2 로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 유전자의 CpG 부위의 메틸화 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 산모의 조산 위험성을 진단하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명은 조산 분만 산모와 정상 분만 산모의 혈액 내 유전자에서 유의적인 CpG 메틸화 수준의 차이를 나타내는 유전자들을 선별한 결과를 기초로 하여, 상기 유전자들의 CpG 부위의 메틸화 정도를 바이오 마커로서 이용하여 조산 위험성을 예측하는 기술을 제공한다
본 발명의 일 실시예에서는 임신 중 조기 진통으로 입원한 산모를 대상으로 분만 주수를 확인하여 37주 미만의 조산군과 37주 이후에 분만한 정상군으로 구별한 후, 이들 산모의 양막 시료를 채취하여 메틸화 어레이와 전장 전사체 시퀀싱(whole transcriptome sequencing)을 실시하여 유의적인 메틸화 및 발현량 변화를 나타내는 유전자들을 확인하고, 이들 중 메틸화와 발현량의 관계가 음의 상관관계가 있는 유전자들을 스크리닝하였다. 또한, 정상과 조산 양막 시료를 추가로 채취하여 파이로시퀀싱으로 상기 스크리닝된 유전자의 메틸화 수준 차이를 검증하고 qRT-PCR 을 통해 유전자 발현량을 조사하여 음의 상관관계가 있는지 검증하였다. 또한, 정상과 조산한 산모의 혈액 시료에서 메틸화 어레이 및 qRT-PCR 를 실시하여, 선별된 유전자의 메틸화 변화 양상이 양막 시료에서와 같은 양상으로 나타나는지 확인하였다.
나아가, 이와 같이 유전자의 발현에 영향을 준 특정 CpG 부위를 확인하였으며, 해당 유전자의 특정 CpG 위치에서 일어나는 메틸화 정도를 측정함으로써 산모의 조산 위험도를 예측할 수 있다는 것을 확인하였다.
따라서, 본 발명에서는 ITGA11 및/또는 THBS2 유전자의 CpG 위치에서 일어나는 저메틸화(hypomethylation)를 조산을 진단하거나 조산 위험도를 예측할 수 있는 바이오 마커로 제공한다.
보다 상세하게, ITGA11 및 THBS2 유전자의 CpG 부위가 조산 위험군 산모에서 특이적으로 저메틸화되므로, 이들 중 각각을 조산 위험성을 예측하기 위한 단독의 바이오 마커로 사용하거나, 이들 중 2종 이상을 복합 바이오 마커로 사용할 수도 있다.
따라서, 하나의 양태로서, 본 발명은 ITGA11 및 THBS2로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 유전자의 CpG 부위의 메틸화 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 조산 위험성의 진단용 조성물 및 이를 포함하는 키트에 관한 것이다.
본 발명에서 용어, "진단" 또는 "예측"이란, 산모에 대하여 임신주수 37주 미만에서 조산을 할 가능성이 있는지, 37주 미만에서 조산의 가능성이 상대적으로 높은지, 또는 37주 미만에서 조산의 징후를 나타낼 가능성이 있는지 여부를 판별하는 것을 말한다. 본 발명은 산모들에 대하여 37주 미만의 조산 위험성이 높은 산모들을 특별하고 적절한 관리를 통하여 조산을 지연시키거나 방지하는 데 사용될 수 있다. 또한, 본 발명은 37주 미만의 조산을 조기에 진단하여 가장 적절한 치료 방식을 선택함으로써 치료 결정을 하기 위해 임상적으로 사용될 수 있다.
본 발명에서 용어, "진단용 마커, 진단하기 위한 마커 또는 진단 마커(diagnosis marker)" 또는 "표지자"란 조산 산모(예를 들어, 37주 미만의 조산 산모)와 정상 분만 산모(예를 들어, 37주 이상에서 분만하는 산모)를 미리 예측하여 구분할 수 있는 물질로, 정상 분만 산모의 시료에 비하여 조산으로 예측되는 산모의 시료에서 유의적인 차이를 나타내는 생체 유기 분자들을 의미한다. 본 발명의 목적상, 조산으로 예측되는 산모의 시료에서 특이적으로 DNA 메틸화 변화를 나타내는 유전자들을 의미할 수 있다.
본 발명에서 용어, "메틸화"는 DNA를 구성하는 염기에 메틸기가 부착되는 것을 말한다. 바람직하게, 본 발명에서 메틸화 여부는 특정 유전자의 특정 CpG 부위의 사이토신에서 일어나는 메틸화 여부를 의미한다. 메틸화가 일어난 경우 그로 인하여 전사인자의 결합이 방해를 받게 되어 특정 유전자의 발현이 억제되며, 반대로, 비메틸화 또는 저메틸화가 일어나는 경우 특정 유전자의 발현이 증가하게 된다.
포유동물 세포의 게놈 DNA 에는 A, C, G 및 T 에 더하여, 사이토신 링의 다섯번째 탄소에 메틸 그룹이 부착된 5-메틸사이토신(5-methylcytosine, 5-mC)이라는 5번째 염기가 존재한다. 5-메틸사이토신의 메틸화는 CpG라고 불리는 CG 디뉴클레오티드(5'-mCG-3')의 C에서만 일어나고, CpG의 메틸화는 alu 또는 트랜스포존과 게놈의 반복서열이 발현되는 것을 억제한다. 또한, 상기 CpG의 5-mC가 자연적으로 탈아미노화하여 티민(T)이 되기 쉽기 때문에, CpG는 포유동물 세포에서 대부분의 후성유전학적 변화가 자주 일어나는 부위이다.
본 발명에서 용어, "메틸화 수준의 측정"은 ITGA11 및/또는 THBS2 유전자의 CpG 부위의 메틸화 수준을 측정하는 것으로서, 메틸화 특이적인 PCR, 예를 들어 메틸화 특이적 PCR(methylation-specific polymerase chain reaction, MSP), 실시간 메틸화 특이적 PCR(real time methylation-specific polymerase chain reaction), 메틸화 DNA 특이적 결합 단백질을 이용한 PCR, 또는 정량 PCR 등을 통해 측정할 수 있다. 또는, 파이로시퀀싱 및 바이설파이트 시퀀싱과 같은 자동염기분석 등의 방법으로 측정할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
바람직하게, 상기 유전자의 CpG 부위란, 상기 유전자의 DNA 상에 존재하는 CpG 부위를 말한다. 상기 유전자의 DNA 는, 상기 유전자가 발현하는데 필요하며 서로 작동가능하게 연결되어 있는 일련의 구성 단위를 모두 포함하는 개념으로, 예를 들어, 프로모터 영역, 단백질 코딩 영역(open reading frame, ORF) 및 터미네이터 영역을 포함한다. 따라서, ITGA11 및/또는 THBS2 유전자의 CpG 부위는 해당 유전자의 프로모터 영역, 단백질 코딩 영역(open reading frame, ORF) 또는 터미네이터 영역 등에 존재할 수 있다. 바람직하게, 상기 유전자의 CpG 는 ORF 에 존재할 수 있다.
일 구체예로, 본 발명에서 ITGA11 의 CpG 부위의 메틸화 수준을 측정하는 것은, 15번 염색체의 68667617 내지 68668338 번째 염기 중에 나타나는 CpG 부위의 사이토신의 메틸화 수준을 측정하는 것을 의미할 수 있다. 본 발명에서는, 상기 15번 염색체의 68667617 내지 68668338 번째 염기를 서열번호 1로 나타내었다.
다른 구체예로, 본 발명에서 ITGA11 유전자의 CpG 부위의 메틸화 수준을 측정하는 것은, 15 번 염색체의 68667977 번째 (서열번호 1의 361번째) 위치하는 사이토신의 메틸화 수준을 측정하는 것을 의미할 수 있다.
다른 구체예로, 본 발명에서 THBS2 유전자의 CpG 부위의 메틸화 수준을 측정하는 것은, 6 번 염색체의 169625244 내지 169625965 번째 염기 중에 나타나는 CpG 부위의 사이토신의 메틸화 수준을 측정하는 것을 의미할 수 있다. 본 발명에서는, 상기 6 번 염색체의 169625244 내지 169625965 번째 염기를 서열번호 2로 나타내었다.
다른 구체예로, 본 발명에서 THBS2 유전자의 CpG 부위의 메틸화 수준을 측정하는 것은, 6 번 염색체의 169625596 번째 (서열번호 2의 353번째), 169625604 번째 (서열번호 2의 361번째) 및/또는 169625613 번째 (서열번호 2의 370번째)위치하는 사이토신의 메틸화 수준을 측정하는 것을 의미할 수 있다.
상기 CpG 부위가 위치한 염색체 6의 염기서열은, 예컨대 Genbank 등록번호 NC_000006.11, 염색체 15의 염기서열은 NC_000015.9 에서 확인할 수 있다. 본 발명에서는 상기 인간 게놈 염색체 부위의 염기서열은 최신 버전인 The December 2013 Human reference sequence(GRCh37) 에 따라 표현하였지만, 상기 인간 게놈 염색체 부위의 구체적 서열은 게놈 서열 연구 결과가 업데이트됨에 따라서 그 표현이 다소 변경될 수 있으며, 이러한 변경에 따라 본 발명의 상기 인간 게놈 염색체 부위의 표현이 상이해질 수 있다. 따라서, 본 발명의 The December 2013 Human reference sequence(GRCh37)에 따라 표현된 인간 게놈 염색체 부위는 본 발명의 출원일 이후 인간 표준 염기서열(human reference sequence)이 업데이트되어 상기 인간 게놈 염색체 부위의 표현이 지금과 다르게 변경된다고 하여도, 본 발명의 범위가 상기 변경된 인간 게놈 염색체 부위에 미치게 됨은 자명하다고 할 것이다. 이러한 변경 내용은 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자라면 누구라도 용이하게 알 수 있는 사항이다.
또한, 산모 유전자의 비정상적인 메틸화의 변화는 양막, 양수, 제대혈, 태반, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 질액, 질 분비물, 조직, 타액, 객담 또는 뇨와 같은 생물학적 시료에서 얻은 게놈 DNA의 메틸화 변화와 상당한 유사성을 보이므로, 본 발명의 마커를 이용할 경우 조산의 진단 또는 조산 위험성 예측에 대하여, 혈액이나 체액 등을 통한 손쉬운 진단이 가능하다는 장점이 있다.
본 발명에서, CpG 부위의 메틸화 수준을 측정하는 제제는 비메틸화 사이토신 염기를 변형시키는 화합물 또는 메틸화 민감성 제한효소, 유전자의 메틸화된 대립형질 서열에 특이적인 프라이머, 및 비메틸화된 대립형질 서열에 특이적인 프라이머를 포함할 수 있다.
상기 비메틸화 사이토신 염기를 변형시키는 화합물은 바이설파이트(bisulfite) 또는 이의 염일 수 있으나 이에 제한되지 않으며, 바람직하게는 소듐 바이설파이트일 수 있다. 이러한 바이설파이트를 이용하여 비메틸화 사이토신 잔기를 변형시켜 CpG 부위의 메틸화 여부를 검출하는 방법은 당 업계에 널리 공지되어 있다(예, WO01/26536; US2003/0148326A1).
또한, 상기 메틸화 민감성 제한효소는 CpG 부위의 메틸화를 특이적으로 검출할 수 있는 제한효소로서 제한효소의 인식부위로 CG를 함유하는 제한효소일 수 있다. 예를 들면, SmaI, SacII, EagI, HpaII, MspI, BssHII, BstUI, NotI 등이 있으며 이에 제한되지 않는다. 상기 제한효소 인식부위의 C에서의 메틸화 또는 비메틸화에 따라 제한효소에 의한 절단 여부가 달라지고 이를 PCR 또는 서던블롯(Southern Blot) 분석을 통해 검출할 수 있게 된다. 상기 제한효소 이외의 다른 메틸화 민감성 제한효소는 당 업계에 잘 알려져 있다.
산모의 ITGA11 및/또는 THBS2 유전자의 CpG 부위에서의 메틸화 수준을 측정하는 대표적인 방법으로, 환자의 생물학적 시료에서 게놈 DNA를 수득하고, 수득한 DNA에 메틸화되지 않은 사이토신 염기를 변형시키는 화합물 또는 메틸화 민감성 제한효소를 처리한 후, 상기 처리된 DNA를 프라이머를 이용하여 PCR에 의해 증폭시키고 그 증폭된 결과물의 존부를 확인하는 것을 통해 측정할 수 있다.
따라서, 본 발명의 제제는 ITGA11 및/또는 THBS2 유전자의 메틸화된 대립형질 서열에 특이적인 프라이머 및 비메틸화된 대립형질 서열에 특이적인 프라이머를 포함할 수 있다. 본 발명에서, 용어 "프라이머"는 짧은 자유 3 말단 수산화기를 가지는 핵산 서열로 상보적인 템플레이트(template)와 염기쌍을 형성할 수 있고 템플레이트 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 중합효소 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다. 또한, 프라이머는, 7개 내지 50개의 뉴클레오타이드 서열을 가진 센스 및 안티센스 핵산으로서, DNA 합성의 개시점으로 작용하는 프라이머의 기본 성질을 변화시키지 않는 추가의 특징을 혼입할 수 있다.
본 발명의 프라이머는 메틸화 여부를 분석하는 대상이 되는 특정 CpG 부위의 서열에 따라 바람직하게 디자인될 수 있으며, 각각 메틸화되어 바이설파이트에 의해 변형되지 않았던 사이토신을 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머쌍, 및 메틸화되지 않아 바이설파이트에 의해 변형된 사이토신을 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머쌍일 수 있다.
상기 조성물 및 키트에는 상기 제제 이외에도, 중합효소 아가로스, 전기영동에 필요한 완충용액 등이 추가로 포함될 수 있다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 ITGA11 및 THBS2 로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 유전자의 CpG 부위에서의 메틸화 수준을 측정하여 조산 위험성을 진단하는 방법에 관한 것이다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 ITGA11 및 THBS2 로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 유전자의 CpG 부위에서의 메틸화 수준을 측정하여 조산 위험성 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법에 관한 것이다.
일예로, 본 발명은 산모의 시료로부터 ITGA11 및 THBS2 로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 유전자의 CpG 부위의 메틸화 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 조산 위험성 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법에 관한 것이다.
구체예로, 본 발명은 산모의 시료로부터 ITGA11 및 THBS2 로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 유전자의 CpG 부위의 메틸화 수준을 측정하는 단계; 및 상기 메틸화 수준을 대조군 시료의 유전자의 CpG 부위의 메틸화 수준과 비교하는 단계를 포함하는, 조산 위험성 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법에 관한 것이다.
바람직하게, 상기 대조군 시료는 정상 분만 산모의 시료일 수 있다.
또한, 상기 방법은, 산모의 시료에서 측정된 ITGA11 및/또는 THBS2 유전자의 CpG 부위 메틸화 수준이 대조군 시료에서 측정된 메틸화 수준보다 낮은 경우, 해당 산모가 조산의 위험성이 있는 것으로 결정하는 단계를 더욱 포함할 수 있다.
본 발명에서 용어 "시료" 또는 "생물학적 시료"란 조산 위험군 산모와 정상 산모 간에 ITGA11 및/또는 THBS2 유전자의 메틸화 수준이 차이 나는 어떠한 시료라도 포함하며, 예를 들어, 양막, 양수, 제대혈, 태반, 혈액(예를 들어, 전혈, 혈청, 혈장 등), 질 분비물, 질액, 조직, 세포, 타액, 객담 또는 뇨와 같은 시료 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
먼저, 산모로부터 게놈 DNA를 수득하여 메틸화 수준을 측정하기 위하여, 게놈 DNA의 수득은 당 업계에서 통상적으로 사용되는 페놀/클로로포름 추출법, SDS 추출법(Tai et al., Plant Mol. Biol. Reporter, 8: 297-303, 1990), CTAB 분리법(Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide; Murray et al., Nuc. Res., 4321-4325, 1980) 또는 상업적으로 판매되는 DNA 추출 키트를 이용하여 수행할 수 있다.
상기 유전자의 CpG 부위의 메틸화 수준을 측정하는 단계는, 비메틸화 사이토신 염기를 변형시키는 화합물 또는 메틸화 민감성 제한효소, 유전자 CpG 부위의 메틸화된 서열에 특이적인 프라이머, 및 비메틸화된 서열에 특이적인 프라이머를 이용하여 수행될 수 있다.
보다 상세하게는, 수득된 시료 내 게놈 DNA를 비메틸화 사이토신 염기를 변형시키는 화합물 또는 메틸화 민감성 제한효소로 처리하는 단계; 및
상기 처리된 DNA를 유전자 CpG 부위의 메틸화 부위를 증폭할 수 있는 프라이머를 이용하여 PCR에 의해 증폭하는 단계를 포함할 수 있다. 예를 들어, 메틸화 특이적 중합효소반응(methylation-specific polymerase chain reaction), 실시간 메틸화 특이적 중합효소반응(real time methylation-specific polymerase chain reaction), 메틸화 DNA 특이적 결합 단백질을 이용한 PCR, 정량 PCR, 파이로시퀀싱 및 바이설파이트 시퀀싱으로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상을 선택하여 메틸화 수준을 측정하는 단계에 의해 수행될 수 있다.
상기에서, 비메틸화 사이토신 염기를 변형시키는 화합물은 바이설파이트일 수 있으며, 바람직하게는 소듐 바이설파이트일 수 있다. 이러한 바이설파이트를 이용하여 비메틸화 사이토신 잔기를 변형시켜 유전자 메틸화 여부를 검출하는 방법은 당 업계에 널리 공지되어 있다.
또한, 상기 메틸화 민감성 제한효소는 위에서 설명한 바와 같이, 특정 CpG 부위의 메틸화를 특이적으로 검출할 수 있는 제한효소로서 제한효소의 인식부위로 CG를 함유하는 제한효소일 수 있으며, 예를 들면, SmaI, SacII, EagI, HpaII, MspI, BssHII, BstUI, NotI 등이 있으며, 이에 제한되지 않는다.
상기 프라이머는 위에서 설명한 바와 같이, 메틸화 여부를 분석하는 대상이 되는 특정 CpG 부위의 서열에 따라 바람직하게 디자인될 수 있으며, 각각 메틸화되어 바이설파이트에 의해 변형되지 않았던 사이토신을 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머쌍 및 메틸화되지 않아 바이설파이트에 의해 변형된 사이토신을 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머 쌍일 수 있다.
메틸화 수준의 측정은, 당 업계에 공지된 방법, 예를 들면 전기영동을 수행하여 원하는 위치의 밴드의 검출 여부에 따라서 수행될 수 있다. 예를 들면, 비메틸화 사이토신 잔기를 변형시키는 화합물을 사용한 경우 두 종류의 프라이머쌍, 즉 메틸화되어 바이설파이트에 의해 변형되지 않았던 사이토신을 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머쌍 및 메틸화되지 않아 바이설파이트에 의해 변형된 사이토신을 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머쌍에 의해 각각 증폭된 PCR 결과물의 존부에 따라 메틸화 정도를 판단할 수 있다. 바람직하게, 샘플 게놈 DNA를 바이설파이트로 처리하고, 해당 유전자의 CpG 부위를 PCR로 증폭하고, 증폭된 부위의 염기서열을 분석하는 바이설파이트 게놈 시퀀싱 방법을 사용하여 메틸화 여부를 판단할 수 있다.
또한, 제한효소를 이용한 경우에도 당 업계에 공지된 방법, 예를 들어 mock DNA에서 PCR 결과물이 나타난 상태에서, 제한효소로 처리된 DNA에서 PCR 결과물이 있는 경우는 유전자가 메틸화된 것으로 판단하고, 제한효소로 처리된 DNA에서 PCR 결과물이 없는 경우는 유전자가 비메틸화 한 것으로 판단하는 것에 따라 그 메틸화 여부를 판단할 수 있으며, 이는 당업자에게 자명하다. 상기에서 mock DNA란 시료에서 분리되고 아무런 처리를 하지 않은 상태의 시료 DNA를 의미한다.
이와 같은 방법에 따라, 산모의 시료 내 ITGA11 및 THBS2 유전자의 CpG 부위가 특이적으로 저메틸화 상태로 측정되는 경우, 조산의 위험성이 있다고 예측할 수 있는 것이다.
따라서, 상기 본 발명에 따를 경우, ITGA11 및/또는 THBS2 유전자의 CpG의 메틸화 여부를 효과적으로 확인하여 조산 위험도를 용이하게 판단할 수 있다.
본 발명을 이용하여 조산의 위험성을 조기에 진단하고 조산을 방지하여 신생아의 이환, 뇌성마비와 같은 신생아의 심각한 합병증과 후유증을 예방하는데 사용할 수 있다.
도 1은 정상과 조산 산모의 양막 시료에서 THBS2 의 CpG 메틸화 값과 상대적 mRNA 발현량을 측정하여 비교한 그래프이다 (Position 1은 6번 염색체의 169625596번째, Position 2는 6번 염색체의 169625604번째, Position 3은 6번 염색체의 169625613번째 위치를 나타냄)(* P < 0.05).
도 2는 정상과 조산 산모의 양막 시료에서 ITGA11의 CpG 메틸화 값과 상대적 mRNA 발현량을 측정하여 비교한 그래프이다(* P < 0.05).
도 3은 정상과 조산 산모의 혈액 시료 내 ITGA11의 CpG 메틸화 값과 상대적 mRNA 발현량을 확인한 그래프이다.
도 2는 정상과 조산 산모의 양막 시료에서 ITGA11의 CpG 메틸화 값과 상대적 mRNA 발현량을 측정하여 비교한 그래프이다(* P < 0.05).
도 3은 정상과 조산 산모의 혈액 시료 내 ITGA11의 CpG 메틸화 값과 상대적 mRNA 발현량을 확인한 그래프이다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예
1. 연구대상
2014년 6월부터 2015년 9월까지 이화여자대학교 목동병원(대한민국)에 임신 중 조기 진통으로 입원한 산모를 대상으로 분만주수를 확인하여 37주 미만의 조산군(n=5)과 37주 이후에 분만한 정상군(n=5)으로 구별하였고, 산모의 양막을 채취하여 메틸화 어레이를 실시하였다. 또한, 전장 전사체 시퀀싱(whole transcriptome sequencing)을 통해 조산군과 정상군 산모의 양막에서 유의한 발현 차이가 있는 유전자를 스크리닝 하였다. 메틸화와 발현량의 관계가 음의 상관관계가 있는 유전자를 찾아내어 정상군(n=16)과 조산군(n=19)에서 양막 샘플을 추가로 채취하여 파이로시퀀싱(pyrosequencing)을 이용하여 메틸화 수준 차이를 검증하고 qRT-PCR 방법으로 유전자 발현량을 조사하여 음의 상관관계가 있는지 검증하였다. 또한 정상군(n=13)과 조산군(n=17) 산모의 혈액에서 메틸화 어레이 및 qRT-PCR을 실시하여 이들 유전자의 메틸화 양상이 양막에서와 같은 양상인지 조사하였다.
실시예 2. genomic DNA 의 추출
채취한 산모 양막에서 Qiagen mini kit(Qiagen)를 이용하여 genomic DNA를 추출하였다. 추출방법은 제조사의 매뉴얼을 따라 실시하였다. 추출된 genomic DNA는 spectrophotometer를 이용하여 정량하였으며, DNA 상태는 1% 아가로즈 젤에서 전기영동하여 degradation여부를 확인하였다.
실시예 3. 바이설파이트(Bisulfite) 처리
게놈성(Genomic) DNA 에 바이설파이트(Bisulfite)를 처리하면 DNA 염기서열 중 5'-CpG-3' 부위의 사이토신이 메틸화된 경우에는 그대로 유지되지만, 비메틸화된 경우에는 우라실로 바뀌어서 메틸화 정도를 측정할 수 있다. 따라서, 메틸화된 시토신과 비메틸화된 시토신을 구별하기 위하여 게놈성 DNA를 바이설파이트로 처리하였다. 우선, ~700ng 의 게놈성 DNA를 Zymo EZ DNA Methylation Kit(Zymoresearch Inc.)을 이용하여 제조사의 매뉴얼에 따라 처리하였고, 이렇게 만들어진 바이설파이트 처리된 DNA를 H2O로 녹여서 사용 시까지 -20℃에서 보관하였다.
실시예 4. 메틸화 어레이
Infinium(®) Human Methylation 450K BeadChip을 사용하여, DNA 메틸화 마이크로어레이를 수행하였다. 제조사의 매뉴얼을 따라, 바이설파이트 처리된 DNA를 증폭하고, 절단(fragmentation), 침전(precipitation) 및 재현탁(resuspension)한 후 BeadChip에 혼성화(hybridization)하였다. 세척한 후, BeadChip을 HiScan SQ system(Illumina)을 이용하여 스캔하고, Genome Studio software(Illumina)를 이용하여 β 값을 계산하였다. DNA 메틸화 정도는 0~1 값을 갖는 β 값으로 표시되며 β값 0은 해당 CpG 부위가 완전히 비메틸화 된 것을 의미하며, 1은 완전히 메틸화된 것을 의미한다.
실시예 5. 전장 전사체 시퀀싱(Whole transcriptome sequencing)
전장 전사체 시퀀싱을 위해 양막으로부터 total RNA를 TRIzol® RNA Isolation Reagents(Life technologies, Carlsbad, CA)를 이용하여 분리하였고, RNA integrity는 Agilent RNA 6000 Nano Kit(Agilent, Santa Clara, CA)를 이용하여 확인하였다. 총 RNA는 TruSeq stranded total RNA sample preparation kit(illumina, San Diego, CA)을 이용하여 RNA 시퀀싱 라이브러리를 준비하였다. 1ug의 총 RNA에서 rRNAs를 제거하여 cDNA를 합성하여 적절한 프라이머로 ligation하여 트래킹하고 real time PCR로 정량하였다. 각 라이브러리의 시퀀싱은 illumina NextSeq500로 수행하였고 cDNA 라이브러리들의 클러스터는 TruSeq flow cell에 의해 생성되고, TruSeq 200 cycle SBS kit로 시퀀싱되었다. raw image data는 sequence data로 전환되었고, FASTQ format에 저장되었다.
실시예 6. 상관 관계 분석
정상군과 조산군의 양막에서 β 값을 이용하여 유의하게 메틸화 차이를 보였던 CpG 부위들(differential methylated region, DMR)과 두 군에서 발현량이 유의하게 차이(differential expressed gene, DEG)를 보였던 유전자를 선택하여 상관 관계를 분석하였다. 또한 GSEA(Gene set enrichment analysis)를 이용하여 GOterm 분석을 하였다.
실시예 7. 파이로시퀀싱
후보 유전자의 메틸화 유전자 증폭을 위해 각각의 디자인된 프라이머를 이용하여 바이설파이트 전처리된 DNA를 증폭시켰다.
THBS2 Forward primer: GGAGGTGGAGAGGAATTAGTAGGA (서열번호 3)
THBS2 Reverse primer: AAACCTAACCCCAATACTTATCCTAAC (서열번호 4)
ITGA11 Forward primer: GTATTTGTAGGTTTTTTTGGATTGATTGT (서열번호 5)
ITGA11 Reverse primer: ATCCCTATTTAAAATACACACAAAAATTTC (서열번호 6)
PCR 조건은 95℃에서 10분, 45 cycles(95℃에서 30초, 48℃에서 30초, 72℃에서 30초), 및 72℃에서 5분으로 Surecycler-8800 (Agilent)을 이용하여 증폭하였다. 파이로시퀀싱(Pyrosequencing) 분석을 위하여 바이오틴(biotin)이 결합된 증폭 산물을 스트렙타비딘-세파로즈 비드가 있는 결합 완충액으로 비드에 결합시켰다. 증폭 산물이 결합된 스트렙타비딘-세파로즈 비드는 96 magnetic ejectable microcylinder를 포함한 PSQ 96 샘플 프렙툴에 흡착시키고, 변성 및 수세하였다. 이후, 염기분석용 프라이머[THBS2: GTTTTGTAGTATAAGTTTTAGGG (서열번호 7), ITGA11: TTGGTTTATATATTTGGTGA (서열번호 8)] 를 이용하여 어닐링 완충액에 비드를 넣고, 80℃에서 2분간 변성시켰다. 실온에서 염기분석 시동체와 증폭산물을 상보적으로 결합시켜 PyroMark ID(Qiagen)을 이용하여 정상 대비 조산 관련 후성 유전자의 정량적 메틸화를 검증하였다.
실시예 8. 정량적 실시간 (Quantitative real-time) PCR (qRT-PCR)
정상군 및 조산군에서 메틸화와 mRNA 프로파일링에서 유의하게 차이를 보인 후보 유전자들의 mRNA의 발현량을 분석하고자 하였다. 양막과 혈액에서 각각 전체 RNA를 분리하고 RNA QC를 진행하여 cDNA로 합성하고, 특정 부위의 증폭에 합당하게 합성된 올리고뉴클레오타이드를 이용하여 qRT-PCR을 통한 후보 유전자의 RNA 발현 분석을 수행하였다. qRT-PCR 조건은 95℃에서 10분 반응한 후 40 사이클 (95℃에서 15초, 어닐링 온도 62℃에서 60초, dissociation stage (한 사이클당 95℃에서 15초, 62℃ 에서 20초, 및 95℃ 에서 15초)) 반복하여 증폭하였다. 사용된 프라이머 서열은 표 1에 정리하였다.
| 프라이머 종류 | 프라이머 서열(5' → 3') | PCR 산물 크기(bp) |
| ITGA 11 Forward | GGC GCT CAG CCT GTG G (서열번호 9) | 144 |
| ITGA 11 Reverse | CCC ACG ACC AGC CAC TTA TT (서열번호 10) | |
| THBS2 Forward | CCT YGC AAA TGG GTG TGA CG (서열번호 11) | 152 |
| THBS2 Reverse | AAA GCT GGG GAA GGA AGC TC (서열번호 12) |
실험결과
메틸화 어레이를 통하여 조산군(n=5)과 정상군(n=5) 산모의 양막에서 통계적으로 유의한 메틸화 차이를 보이는 CpG 부위는 총 1,255 CpG 부위였고, 전장 전사체 시퀀싱을 이용하여 조산군과 정상군의 양막에서 유의한 mRNA 발현량을 보였던 유전자는 1,500개였다. 이들 유전자 중에서 음의 상관관계를 갖는 유전자는 90개였다. 또한, 상기 90개의 유전자를 GSEA 분석한 결과 ITGA11 및 THBS2 유전자가 조산과 관련된 것으로 분석되었다. 표 2는 정산 산모와 조산 산모에서 유의적인 메틸화 발현 변화를 나타낸 CpG 부위의 위치를 나타낸 것이다.
| 유전자 | Genebank 등록번호 | Target ID | 염색체 | CpG 부위 |
| ITGA11 | NM_001004439 | cg09430158 | 15 | chr15:68667977 |
| THBS2 |
NM_003247.2 |
cg00438284 |
6 |
chr6:169625596 (Position 1) chr6:169625604 (Position 2) chr6:169625613 (Position 3) |
이에, 조산 산모군 및 정상 산모군에서 유의한 메틸화 변화를 나타낸 ITGA11 및 THBS2 유전자에 대하여, 정상군(n=16)과 조산군(n=19) 산모에서 추가로 양막 샘플을 채취하여 파이로시퀀싱을 이용하여 메틸화 수준 차이를 검증하고 qRT-PCR 방법으로 유전자 발현량을 조사하여 음의 상관관계가 있는지 검증하였다. 그 결과, ITGA11과 THBS2 유전자가 조산군에서 유의적으로 저메틸화(hypomethylation)되고 유전자의 발현이 유의적으로 증가(up regulation)한 것이 확인되었다 (도 1 및 도 2 참조).
또한, 양막 샘플에서의 메틸화 양상이 혈액 샘플에서도 동일하게 나타나는지를 조사하기 위하여, 정상군(n=13)과 조산군(n=17) 산모에서 혈액을 채취하여 메틸화 어레이를 통해 상기 유전자의 메틸화가 조산과 관련성이 있는지 여부를 분석하였다. 그 결과, 양막 샘플에서와 마찬가지로, 정상군에 대하여 조산군 산모의 혈액에서 ITGA11 유전자가 유의적으로 저메틸화(hypomethylation)되고 mRNA 발현량이 유의적으로 증가(up regulation)한 것이 확인되었다 (도 3 참조).
따라서 ITGA11과 THBS2 유전자의 유의적인 메틸화 변화는 산모의 조산과 관련이 있으므로, 조산의 예측에 사용 가능하다는 것이 확인되었다.
<110> Ewha University - Industry Collaboration Foundation
<120> ITGA11 and/or THBS2 as CpG methylation markers for predicting a
risk of preterm delivery and use thereo
<130> DPP20165225KR
<150> KR10-2016-0090182
<151> 2016-07-15
<160> 12
<170> KopatentIn 1.71
<210> 1
<211> 722
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<221> gene
<222> (1)..(722)
<223> chr15: 68667617-68668338
<400> 1
taggggcatc agggaggggt ttcactggag gagccgagag ctcgagggaa caaaggagag 60
attattcctt tagtgaggcc tttctctccc tctctctcca tggaaaatgg aatctcctcc 120
agcccctgtg agtttggtgg ctaatgggtt caagatgggt ctggggaagc gctgagagca 180
gcaagtccaa atgcctgccc agtggggacc ccggggctgc cctggctggg ggttgggtgt 240
agatggagaa tctggcccag gacctgccca aggggagaag ttggcacctg caggtcttcc 300
tggactgact gcaggggctt gtggttcacc ttggctcaca catctggtga ggcctggcct 360
cgtgggggct agggaaacga gagcccctct gtttgcacat cccttactct ccctccataa 420
agtcctatca gacactggaa acctttgtgt gcattttaaa cagggacata tacatgatga 480
ttaattttat gtgtcaactt gactgggcca cggggtgcct agatatatgg ccaaacgtca 540
ttctgggtgt ttctgtgagg gtgttttttg catgagatta acacttagat ctgtaggcta 600
aggaaagcaa atcacccttc ctaatgtggg tgggcctcat ccaatcagtc gaagggcaga 660
acagaacaaa atgactgacc ctcccttgag aaagagaatt ctccctggac cctaccccag 720
ac 722
<210> 2
<211> 722
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<221> gene
<222> (1)..(722)
<223> chr6:169625244-169625965
<400> 2
caagtcctcc tggtctgggt tgaacacaag ccggcagttg tccctgtcat cggggacgcc 60
atcgttgtca tcatcagggt cacaggcgtc gccctggccg tctctgtcat ggtcagcctg 120
gttggcgttg gagatgtagg ggcagttgtc ctggttgttc tggtggccgt cgtcatctat 180
gtcctcgttg ttgtcacact ggtccccaac aaggtcattg tccacgtcgg tctaggggat 240
ggggcgtgag agaaacagca gaggactgcc agtttgagga ggtggagagg aaccagcagg 300
acgcaagcct gagagccggc ctcctcgtcc tgcagcacaa gccccagggc cacgcagggg 360
cggctggccc gaggtcacac tgaccctgac gtcaggacaa gcactggggc caggcctctc 420
ggtccaggaa tctctccacc ctctgccacc tctccacagt aattcacttc actaaaggaa 480
gatgtgcttc ttcgctggaa aagcatgaac taccaggtaa ttatgtctct tttttacacc 540
atttgcgcca tttacaccat ttacatcata ggataatata tcctatgagc tgcatcaaga 600
taactgtcct cccttgtctc tttcaaacgc aaacctggaa atgaagccaa ttcctatgtt 660
ggcatcagga aaatggggag agaattctgt gaagacacaa cctcgctcca gctgatgagg 720
tg 722
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> THBS2 Forward primer
<400> 3
ggaggtggag aggaattagt agga 24
<210> 4
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> THBS2 Reverse primer
<400> 4
aaacctaacc ccaatactta tcctaac 27
<210> 5
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ITGA11 Forward primer
<400> 5
gtatttgtag gtttttttgg attgattgt 29
<210> 6
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ITGA11 Reverse primer
<400> 6
atccctattt aaaatacaca caaaaatttc 30
<210> 7
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> THBS2 primer
<400> 7
gttttgtagt ataagtttta ggg 23
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ITGA11 primer
<400> 8
ttggtttata tatttggtga 20
<210> 9
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ITGA11 Forward primer
<400> 9
ggcgctcagc ctgtgg 16
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ITGA11 Reverse primer
<400> 10
cccacgacca gccacttatt 20
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> THBS2 Forward primer
<400> 11
cctygcaaat gggtgtgacg 20
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> THBS2 Reverse primer
<400> 12
aaagctgggg aaggaagctc 20
Claims (13)
- ITGA11 (Integrin alpha-11) 및 THBS2 (Thrombospondin-2)로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 유전자의 CpG 부위의 메틸화 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 조산 위험성의 진단용 조성물로서,
상기 유전자의 CpG 부위의 메틸화 수준을 측정하는 제제는,
비메틸화 사이토신 염기를 변형시키는 화합물 또는 메틸화 민감성 제한효소;
상기 유전자의 CpG 부위의 메틸화된 서열에 특이적인 프라이머; 및
비메틸화된 서열에 특이적인 프라이머를 포함하는 것인,
조산 위험성의 진단용 조성물. - 삭제
- 제1항에 있어서, 상기 비메틸화 사이토신 염기를 변형시키는 화합물은 바이설파이트(bisulfite) 또는 이의 염인 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 메틸화 민감성 제한효소는 SmaI, SacII, EagI, HpaII, MspI, BssHII, BstUI 또는 NotI인 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 ITGA11 유전자의 CpG 부위는 서열번호 1 (15번 염색체의 68667617 내지 68668338 번째)의 염기서열 중에 나타나는 CpG 를 포함하는 것인 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 THBS2 유전자의 CpG 부위는 서열번호 2 (6 번 염색체의 169625244 내지 169625965 번째)의 염기서열 중에 나타나는 CpG 를 포함하는 것인 조성물.
- 제1항 및 제3항 내지 제6항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는,
조산 위험성의 진단용 키트. - 산모의 시료로부터 ITGA11 및 THBS2 로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 유전자의 CpG 부위의 메틸화 수준을 측정하는 단계를 포함하는,
조산 위험성 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법. - 제8항에 있어서, 상기 유전자의 CpG 부위의 메틸화 수준의 측정 단계는,
수득된 시료 내 게놈 DNA를 비메틸화 사이토신 염기를 변형시키는 화합물 또는 메틸화 민감성 제한효소로 처리하는 단계; 및
상기 처리된 DNA를 유전자 CpG 부위의 메틸화 부위를 증폭할 수 있는 프라이머를 이용하여 메틸화 특이적 중합효소반응(methylation-specific polymerase chain reaction), 실시간 메틸화 특이적 중합효소반응(real time methylation-specific polymerase chain reaction), 메틸화 DNA 특이적 결합 단백질을 이용한 PCR, 정량 PCR, 파이로시퀀싱 및 바이설파이트 시퀀싱으로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상을 선택하여 메틸화 수준을 측정하는 단계를 포함하는 방법. - 제9항에 있어서, 상기 비메틸화 사이토신 염기를 변형시키는 화합물은 바이설파이트(bisulfite) 또는 이의 염인 방법.
- 제9항에 있어서, 상기 메틸화 민감성 제한효소는 SmaI, SacII, EagI, HpaII, MspI, BssHII, BstUI 또는 NotI인 방법.
- 제8항에 있어서, 상기 ITGA11 유전자의 CpG 부위는 서열번호 1 (15번 염색체의 68667617 내지 68668338 번째)의 염기서열 중에 나타나는 CpG 를 포함하는 것인 방법.
- 제8항에 있어서, 상기 THBS2 유전자의 CpG 부위는 서열번호 2 (6 번 염색체의 169625244 내지 169625965 번째)의 염기서열 중에 나타나는 CpG 를 포함하는 것인 방법.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020160090182 | 2016-07-15 | ||
| KR20160090182 | 2016-07-15 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR101712076B1 true KR101712076B1 (ko) | 2017-03-03 |
Family
ID=58410725
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020160163427A KR101712076B1 (ko) | 2016-07-15 | 2016-12-02 | 조산 위험성을 예측하기 위한 CpG 메틸화 마커 ITGA11 및/또는 THBS2, 및 이의 이용 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR101712076B1 (ko) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2023106548A1 (ko) * | 2021-12-10 | 2023-06-15 | 한양대학교 에리카산학협력단 | 산모의 카드뮴 노출에 의한 조산 발생 가능성 예측을 위한 cg21010642 메틸화 바이오마커 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2012024543A1 (en) * | 2010-08-18 | 2012-02-23 | Caris Life Sciences Luxembourg Holdings | Circulating biomarkers for disease |
| KR101559975B1 (ko) * | 2015-04-17 | 2015-10-14 | 이화여자대학교 산학협력단 | 32주 미만의 조산 위험성을 예측하기 위한 마커 il-7 및 이의 이용 |
-
2016
- 2016-12-02 KR KR1020160163427A patent/KR101712076B1/ko active IP Right Grant
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2012024543A1 (en) * | 2010-08-18 | 2012-02-23 | Caris Life Sciences Luxembourg Holdings | Circulating biomarkers for disease |
| KR101559975B1 (ko) * | 2015-04-17 | 2015-10-14 | 이화여자대학교 산학협력단 | 32주 미만의 조산 위험성을 예측하기 위한 마커 il-7 및 이의 이용 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Main et al., Am. J. Obste. Gynecol., 151:892-898 (1985) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2023106548A1 (ko) * | 2021-12-10 | 2023-06-15 | 한양대학교 에리카산학협력단 | 산모의 카드뮴 노출에 의한 조산 발생 가능성 예측을 위한 cg21010642 메틸화 바이오마커 |
| KR20230087853A (ko) * | 2021-12-10 | 2023-06-19 | 한양대학교 에리카산학협력단 | 산모의 카드뮴 노출에 의한 조산 발생 가능성 예측을 위한 cg21010642 메틸화 바이오마커 |
| KR102738536B1 (ko) | 2021-12-10 | 2024-12-05 | 한양대학교 에리카산학협력단 | 산모의 카드뮴 노출에 의한 조산 발생 가능성 예측을 위한 cg21010642 메틸화 바이오마커 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP1668154B1 (en) | Methods useful for detecting an alteration in a locus copy number | |
| EP2885427B1 (en) | Colorectal cancer methylation marker | |
| US20140193817A1 (en) | Methods and kits useful for detecting an alteration in a locus copy number | |
| TWI804857B (zh) | 大腸直腸癌的早期檢測、預測治療反應和預後之方法 | |
| JP2024156700A (ja) | ダウン症候群診断用後成的バイオマーカー組成物及びその用途 | |
| KR101712076B1 (ko) | 조산 위험성을 예측하기 위한 CpG 메틸화 마커 ITGA11 및/또는 THBS2, 및 이의 이용 | |
| JP7535140B2 (ja) | ダウン症候群特異的な後成的マーカーを利用したダウン症候群診断方法 | |
| KR101695347B1 (ko) | 유전자의 CpG 메틸화 변화를 이용한 조산 위험성 예측용 조성물 및 이의 이용 | |
| KR101596359B1 (ko) | SORT1 유전자 프로모터의 CpG 메틸화 변화를 이용한 모야모야병 진단용 조성물 및 이의 이용 | |
| KR101275266B1 (ko) | ＡＧＲ２ 유전자 프로모터의 ＣｐＧ 메틸화 변화를 이용한 전이성 난소암 진단용 조성물 및 이의 이용 | |
| KR102738536B1 (ko) | 산모의 카드뮴 노출에 의한 조산 발생 가능성 예측을 위한 cg21010642 메틸화 바이오마커 | |
| KR102281644B1 (ko) | 지연성 허혈 진단을 위한 insr 유전자 과메틸화 마커 | |
| KR102268666B1 (ko) | 다운증후군 진단용 바이오마커 조성물 및 이의 용도 | |
| KR102281657B1 (ko) | 지연성 허혈 진단을 위한 cdhr5 유전자 과메틸화 마커 | |
| KR102252036B1 (ko) | Cmip 유전자의 메틸화 수준을 이용한 비만의 예측 또는 진단을 위한 정보제공방법 및 이를 위한 조성물 | |
| KR101275269B1 (ko) | ＩＦＩＴＭ１ 유전자 프로모터의 ＣｐＧ 메틸화 변화를 이용한 전이성 난소암 진단용 조성물 및 이의 이용 | |
| KR101384326B1 (ko) | ＮＴＮ4 유전자의 ＣｐＧ 메틸화 변화를 이용한 난소암 전이 진단용 조성물 및 이의 이용 | |
| KR102158726B1 (ko) | Itpr3 유전자 업스트림의 유전자간 영역을 포함하는 지연성 허혈 진단용 dna 메틸화 마커 조성물 | |
| KR101596357B1 (ko) | SNAR-G2 유전자 프로모터의 CpG 메틸화 변화를 이용한 모야모야병 진단용 조성물 및 이의 이용 | |
| KR101275267B1 (ko) | ＣＡ９ 유전자 프로모터의 ＣｐＧ 메틸화 변화를 이용한 전이성 난소암 진단용 조성물 및 이의 이용 | |
| KR101493044B1 (ko) | NUPR1 유전자 프로모터의 CpG 메틸화 변화를 이용한 모야모야병 진단용 조성물 및 이의 이용 | |
| WO2014133262A1 (ko) | 유전자 프로모터의 CpG 메틸화 변화를 이용한 난소암 전이 진단용 조성물 및 이의 이용 | |
| WO2015034289A1 (ko) | 유전자의 CpG 메틸화 변화를 이용한 난소암 전이 진단용 조성물 및 이의 이용 | |
| TW202208857A (zh) | 評估glp-1類似物療法之反應的方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PA0109 | Patent application |
Patent event code: PA01091R01D Comment text: Patent Application Patent event date: 20161202 |
|
| PA0201 | Request for examination | ||
| PA0302 | Request for accelerated examination |
Patent event date: 20161202 Patent event code: PA03022R01D Comment text: Request for Accelerated Examination |
|
| E902 | Notification of reason for refusal | ||
| PE0902 | Notice of grounds for rejection |
Comment text: Notification of reason for refusal Patent event date: 20170120 Patent event code: PE09021S01D |
|
| E701 | Decision to grant or registration of patent right | ||
| PE0701 | Decision of registration |
Patent event code: PE07011S01D Comment text: Decision to Grant Registration Patent event date: 20170220 |
|
| GRNT | Written decision to grant | ||
| PR0701 | Registration of establishment |
Comment text: Registration of Establishment Patent event date: 20170224 Patent event code: PR07011E01D |
|
| PR1002 | Payment of registration fee |
Payment date: 20170224 End annual number: 3 Start annual number: 1 |
|
| PG1601 | Publication of registration | ||
| FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20200102 Year of fee payment: 4 |
|
| PR1001 | Payment of annual fee |
Payment date: 20200102 Start annual number: 4 End annual number: 4 |
|
| PR1001 | Payment of annual fee |
Payment date: 20201228 Start annual number: 5 End annual number: 5 |
|
| PR1001 | Payment of annual fee |
Payment date: 20211228 Start annual number: 6 End annual number: 6 |
|
| PC1903 | Unpaid annual fee |
Termination category: Default of registration fee Termination date: 20241207 |