KR101663567B1 - Itgb4 억제제를 포함하는 종양세포 노화 억제용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 ITGB4(integrin beta 4) 억제제를 포함하는 종양세포 노화 억제용 조성물 및 상기 억제제를 이용한 종양세포의 노화 조절 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 조성물은 종양세포에서 ITGB4의 발현 또는 활성을 억제하여 방사선에 의해 유도된 종양 세포의 노화를 억제할 수 있다. 따라서 특정 물질이 ITGB4의 발현 또는 활성에 미치는 영향을 분석함으로써 방사선에 대한 종양세포의 민감성 증진과 관련된 항암 기작의 연구가 가능하다.

Description

ITGB4 억제제를 포함하는 종양세포 노화 억제용 조성물 {Composition for inhibiting tumor cell senescence comprising ITGB4 inhibitor}

본 발명은 ITGB4(integrin beta 4) 억제제를 포함하는 종양세포 노화 억제용 조성물 및 상기 억제제를 이용한 종양세포의 노화 조절 방법에 관한 것이다.

종양세포 조기 노화는 스트레스-유도 조기 노화라고도 하며, 다양한 자극에 의해 종양세포에서 발생하는 노화를 의미한다. 종양세포는 일정한 횟수만큼만 분열하고 노화되는 정상세포와 달리, 암화 과정에서 복제성 노화의 특성이 변화되어 무한정 분열하는 세포들이므로, 종양세포는 세포 노화과정이 진행되지 않을 것이라는 개념이 일반적이었다. 그러나 최근 종양세포도 다양한 자극에 의해 세포 노화가 급격히 유도됨이 알려지게 되었고 이를 스트레스-유도 조기 노화 (stress-induced premature senescence)라 한다(Sugrue et al., Proc. Natl. Acad.Sci.USA, 94:9648-9653, 1997; Mason et al., Oncogene, 23;9238-9246, 2004). 종양세포의 노화를 유도할 수 있는 스트레스원으로는 유전적 독성 화학물질 (예, etoposide, cyclophophamide), 방사선, 자외선 등이 보고되었다(Hemann and Narita, Genes & Dev., 21:1-5, 2007; Chang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99:389-394,2002).

최근 스트레스 유도 조기 노화를 이용한 종양세포의 노화 및 이의 증식 억제가 암 환자 치료를 위한 효율적인 기전으로 제시되었으며 (Roninson et al., Drug Resist Updates, 4:303-313, 2001; Campisi, Science, 309:886-887, 2005), 세포 노화 유도 기전 연구를 통한 암 치료의 효율성 증대가 필수적임이 제안되었다(Narita 및 Lowe, Nature Medicine, 11:920-922, 2005).

또한, 종양의 악성화가 저지된 암 환자의 조직 분석 결과, 종양세포 노화가 효율적으로 유도되었음이 보고되었고(Collado et al., Nature, 436:642, 2005), 종양 억제 단백질 p53이 작용해 세포 노화를 통해 종양 조직이 효율적으로 제거됨이 종양 모델 동물 실험에서 입증되었다(Wue et al., Nature, 445:656-660, 2007). 이는 종양 치료에 세포 노화가 유용하게 활용될 수 있음을 제시하는 것이다. 실질적으로 종양세포의 노화기전 활성화는 세포사멸 기전 활성화보다 낮은 용량의 항암제나 방사선 투여를 가능하게 함으로써 암 치료 부작용을 개선할 수 있고, 세포사멸에 대한 저항성을 획득한 종양 세포의 암 치료 저항성 극복에 이용될 수 있다(Rebbaa, Cencer Lett, 219:1-13, 2005).

이에 본 발명자들은 종양세포 조기 노화와 관련된 연구를 계속하던 중, 방사선 유도 종양세포 노화 반응에서 ITGB4의 인산화가 필수적이며, ITGB4를 억제할 경우 종양세포 노화 반응이 현저하게 저해됨을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 ITGB4(integrin beta 4) 억제제를 포함하는 종양세포 노화 억제용 조성물 및 상기 억제제를 이용한 종양세포의 노화 조절 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 ITGB4 인산화 정도를 이용한 항암제 또는 항암보조제 후보물질의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 ITGB4(integrin beta 4) 유전자 또는 상기 유전자가 암호화하는 단백질에 대한 억제제를 포함하는 종양세포 노화 억제용 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 종양세포에 ITGB4(integrin beta 4) 유전자 또는 상기 유전자가 암호화하는 단백질에 대한 억제제를 처리하는 단계를 포함하는, 종양세포의 노화 조절 방법을 제공한다.

또한 본 발명은 (a) 종양세포에 시료를 처리한 후, ITGB4(integrin beta 4) 인산화 정도를 측정하는 단계; 및 (b) 상기 (a) 단계의 종양세포에서 시료를 처리하지 않은 대조군에 비해 ITGB4 인산화 정도가 증가한 시료를 선별하는 단계를 포함하는 항암 또는 항암보조제 후보물질의 스크리닝 방법을 제공한다.

본 발명에 따른 조성물은 종양세포에서 ITGB4의 발현 또는 활성을 억제하여 방사선에 의해 유도된 종양 세포의 노화를 억제할 수 있다. 따라서 특정 물질이 ITGB4의 발현 또는 활성에 미치는 영향을 분석함으로써 방사선에 대한 종양세포의 민감성 증진과 관련된 항암 기작의 연구가 가능하다.

도 1은 폐암 세포에 방사선을 조사하고 3일 후, 세포 형태(A) 및 베타갈락토시다아제 활성(B)을 관찰한 결과를 나타낸 도이다.
도 2는 유방암 세포에 방사선을 조사한 후, 시간에 따른 ITGB4 의 인산화 정도를 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 3은 폐암 세포에 ITGB4 siRNA를 주입하고 방사선을 조사한 후, 세포 형태를 관찰한 결과를 나타낸 도이다.
도 4는 폐암 세포에 ITGB4 siRNA를 주입하고 방사선을 조사한 후, 시간에 따른 ITGB4 의 인산화 정도를 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 5는 폐암 세포에 ITGB4 항체인 Asc-8을 처리하고 방사선을 조사한 후, 세포 형태 및 베타갈락토시다아제 활성을 관찰한 결과를 나타낸 도이다.

본 발명은 ITGB4(integrin beta 4) 유전자 또는 상기 유전자가 암호화하는 단백질에 대한 억제제를 포함하는 종양세포 노화 억제용 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 종양세포에 ITGB4(integrin beta 4) 유전자 또는 상기 유전자가 암호화하는 단백질에 대한 억제제를 처리하는 단계를 포함하는, 종양세포의 노화 조절 방법을 제공한다.

본 발명에서 “ITGB4(integrin beta 4)”는 약 200 kDa 크기의 단백질이다. 인테그린은 알파와 베타의 서브유닛이 헤테로다이머를 형성하는 막 수용체 단백질로 integrin beta 4는 integrin alpha 6 와 헤테로다이머를 형성하여 세포-매트릭스나 세포-세포 간 결합을 촉진하고 세포 내 단백질들의 신호를 전달하여 세포 골격 유지, 세포 성장, 세포 증식, 유전자 발현 등 다양한 세포 내 반응을 매개한다.

본 발명에서 ITGB4 유전자는 바람직하게는 인간 유래의 것으로, NCBI등록번호 NM_000213(서열번호 1), NM_001005619(서열번호 2), NM_001005731(서열번호3)의 염기서열로 이루어진 뉴클레오티드 및 상기 뉴클레오티드와 기능적으로 동일한 작용을 할 수 있는 변이체(염기의 결실, 치환 또는 삽입)를 포함한다. 상기 염기서열은 예시일 뿐 이에 한정되는 것이 아님은 당업자에게 자명하며, 상기 서열에 대해 실질적인 서열 동일성 또는 실질적인 서열 상동성을 지닌 서열 또한 본 발명의 범주에 포함된다.

본 발명에서 ITGB4 유전자가 암호화하는 단백질은 NCBI등록번호 NP_000204(서열번호 4), NP_001005619(서열번호 5), NP_001005731(서열번호6)의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드 및 상기 단백질의 기능적 동등물을 포함한다. 상기 "기능적 동등물"이란 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과, 상기 아미노산 서열과 적어도 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 상기 아미노산 서열로 이루어진 단백질과 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 단백질을 말한다.

본 발명에서 ITGB4 유전자의 억제제는 상기 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 안티센스 뉴클레오티드, siRNA(short interfering RNA), shRNA(short hairpin RNA) 또는 리보자임 등일 수 있으며, 이에 제한되지 않는다. 상기 siRNA는 상기 유전자의 mRNA의 염기서열 내에서 선택되는 15 내지 30머(mer)의 센스 서열 및 상기 센스 서열에 상보적으로 결합하는 안티센스 서열로 구성되며, 예를 들어, 서열번호 7의 센스서열 및 이에 상보적인 서열번호 8의 안티센스 서열로 이루어진 이중가닥siRNA 일 수 있다. 상기 siRNA는 센스서열 및/또는 안티센스 서열의 3' 말단에 티민2 염기(dTdT)가 결합된 것일 수 있다.

본 발명에서 ITGB4 유전자가 암호화하는 단백질의 억제제는 상기 단백질에 상보적으로 결합하는 화합물, 펩티드, 펩티드 모방체 (mimetics), 기질유사체, 앱타머 또는 항체 등일 수 있으며, 이에 제한되지 않는다. 상기 항체는 상기 단백질에 특이적으로 결합할 수 있는 단일클론 항체, 다클론항체, 또는 재조합 항체 등일 수 있으며, 예를 들어, Asc-8(Anti-Integrin beta 4 antibody)일 수 있다. 상기 항체는 당업자에게 알려진 공지의 방법으로 제작할 수 있으며, 시판되는 것을 구입하여 사용할 수 있다.

본 발명에서 종양세포는 암세포일 수 있다. 상기 암은 간암, 위암, 유방암, 결장암, 골암, 췌장암, 두부 또는 경부 암, 자궁암, 대장암, 폐암, 난소암, 직장암, 식도암, 소장암, 항문부근암, 나팔관암종, 자궁내막암종, 자궁경부암종, 질암종, 음문암종, 호지킨병, 전립선암, 방광암, 신장암, 수뇨관암, 신장세포암종, 신장골반암종, 골육종 또는 중추신경계 종양 등을 포함하며, 바람직하게는 상기 암세포는 유방암 또는 폐암세포일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에서 노화는 바람직하게는 방사선에 의해 유도된 것이며, 이에 제한되지 않는다.

상기 방사선은 바람직하게는 감마선이며, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 종양세포 노화 억제용 조성물은 생물학적 제제에 통상적으로 사용되는 약제학적으로 허용 가능한 담체, 희석제, 부형제 또는 둘 이상의 이들의 조합을 포함할 수 있다. 또한 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사 용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 당해 기술 분야에 알려진 적합한 제제는 문헌 (Remington's Pharmaceutical Science, 최근, Mack Publishing Company, Easton PA)에 개시되어 있는 것을 사용하는 것이 바람직하다. 상기 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시 벤조에이트, 프로필히드록시 벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 등이 있다. 상기 조성물을 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다.

또한 본 발명은 (a) 종양세포에 시료를 처리한 후, ITGB4(integrin beta 4) 인산화 정도를 측정하는 단계; 및 (b) 상기 (a) 단계의 종양세포에서 시료를 처리하지 않은 대조군에 비해 ITGB4 인산화 정도가 증가한 시료를 선별하는 단계를 포함하는 항암 또는 항암보조제 후보물질의 스크리닝 방법을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 의하면, 방사선 유도 종양세포 노화 반응에서 ITGB4의 인산화가 필수적임을 확인하였다. 따라서 특정 시료가 ITGB4의 인산화를 증가시킬 경우 종양세포의 노화 반응이 촉진되는바, 상기 시료는 방사선에 대한 종양세포의 민감성을 증진시키고, 항암제의 치료 효과를 증진시킬 수 있는 항암 또는 항암보조제의 후보물질로 판별될 수 있다.

이하 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 방사선에 의한 종양세포 노화 유도

방사선에 의해 종양세포의 노화 유도가 가능한지 확인하기 위하여, 인간 폐암세포주 A549에 방사선(감마선) 6 Gy를 조사하고, 세포 형태 및 베타-갈락토시다아제 활성도를 분석하였다.

보다 구체적으로, 폐암세포에 ¹³⁷Cs 감마선 방출기 (Atomic Energy of Canada Ltd., Mississauga, Ontario, Canada)로부터 방출되는 6 Gy의 감마-방사선을 3.81 Gy/분의 용량으로 노출한 후, 5% CO₂ 농도의 37℃ 항온 배양기에서 3일간 배양한 후, 현미경(ECLIPSE TE300, Nikon)으로 세포 형태를 관찰하였다.

또한, 상기 세포를 PBS로 2번 세척하고 3% 포름알데히드로 실온에서 3-5분간 고정한 후, 고정된 세포를 PBS로 다시 한 번 세척하였다. 상기 세포에 β-갈락토시다아제 활성 염색 용액(1 mg/ml의 X-Gal, 40 mM 시트르산 /소듐 포스페이트(pH 6.0), 5 mM 포타슘 페로시아니드, 5 mM 포타슘 페리시아니드, 150 mM 염화클로라이드, 2 mM 마그네슘 클로라이드) 5 ml를 첨가하고, 37℃ 항온 배양기에서 12-16시간 반응시켰다. 반응을 진행하는 동안 빛이 들어가지 않도록 은박 호일로 배양접시를 싸서 배양하였다. 베타-갈락토시다아제 활성 정도는 위상차 현미경 (ECLIPSE TE300, Nikon)을 사용하여 관찰하였으며, 염색된 세포의 개수를 측정하여 베타-갈락토시다아제 양성을 보이는 세포의 비율을 정량화하였다.

그 결과를 도 1에 나타내었다.

도 1A에 나타낸 바와 같이, 방사선에 노출되지 않은 대조군과 달리 방사선을 조사한 폐암세포는 세포의 크기가 커지며 편평해지는 등 노화세포의 특징이 나타남을 확인하였다.

또한, 도 1B에 나타낸 바와 같이, 방사선에 노출되지 않은 대조군에 비해 방사선을 조사한 폐암세포는 노화-관련 베타-갈락토시다아제의 양성을 보이는 세포의 비율이 현저하게 증가함을 확인하였다.

실시예 2. 방사선에 의한 종양세포 노화 과정에서 ITGB4 의 인산화 정도 분석

2-1. 인간 유방암 세포주에서 ITGB4 의 인산화 정도 분석

인간 유방암 세포주 MCF 7 에 선량 6 Gy 감마-방사선을 조사한 후 1시간, 6시간, 24시간 동안 5% CO₂ 농도의 37℃ 항온 배양기에서 배양하였다. 상기 세포를 PBS (phosphate buffered saline)로 2번 세척한 후 세포 용해 완충액(50mM Tri-HCl, 1% NP-40, 0.25% sodium deoxycholate, 150 mM NaCl, 1mM PMSF, 50 mM NaF, 0.2 mM Na3VO4, 10 μg/ml 아프로티닌, 2 μg/ml 루펩틴)을 사용하여 세포를 녹였다. 상기 세포를 11,000 rpm에서 10분간 원심분리한 후 상등액만 취하여 세포에서 추출된 단백질을 분리하였으며, Fullmoon BioSystems (USA)의 막 및 막 하위 신호전달 인산화 단백질의 항체마이크로어레이 (Phospho Explorer Antibody Microarray)를 이용하여 1,318 종의 인산화 단백질에 대한 방사선 반응성을 분석하였다. 그 중 ITGB4의 인산화 정도를 표 1에 나타내었다.

인산화 잔기	방사선 유도 세포노화 과정에서의 인산화 정도 (방사선 조사군/대조군)
	1 시간	6 시간	24 시간
ITGB4 (Tyr1510)	2.509	1.49	1.33

표 1에 나타낸 바와 같이, 유방암 세포를 방사선에 노출시켜 노화를 유도한 결과, 1시간 후부터 ITGB4의 인간화가 나타남을 확인하였다.

2-1. 인간 폐암 세포주에서 ITGB4 의 인산화 정도 분석

인간 폐암 세포주 A549에 선량 6 Gy 감마-방사선을 조사한 후 0.5시간, 1시간, 6시간 동안 5% CO₂ 농도의 37℃ 항온 배양기에서 배양하였다. 상기 세포를 PBS로 세척한 후 세포 용해 완충액(50mM Tri-HCl, 1% NP-40, 0.25% sodium deoxycholate, 150 mM NaCl, 1mM PMSF, 50 mM NaF, 0.2 mM Na3VO4, 10 μg/ml 아프로티닌, 2 μg/ml 루펩틴)을 사용하여 세포를 녹였다. 상기 세포를 11,000rpm에서 10분간 원심분리한 후 상등액만 취하여 세포에서 추출된 단백질을 분리하였으며, 브래드포드법(bradford, M., Anal. Biochem. 72:248-254(1976))을 이용하여 정량하였다. 20 ug의 단백질에 2X SDS 로딩 버퍼(60 mM Tris-Cl (pH6.8), 25% 글리세롤, 2% SDS, 14.4 mM 머캅토에탄올, 0.1% 브로모페놀 블루)를 가한 후, 95℃에서 5분간 가열하고 8% 내지 10% SDS 폴리아크릴 아마이드 젤에서 80V 로 2시간 동안 전기영동하였다. 전기영동 후 분리된 단백질을 나이트로셀룰로오즈 멤브레인(Whatman 사)으로 전이시켰다. 단백질이 전이되어 있는 멤브레인을 5% 탈지분유가 함유된 PBS 용액에 넣고 실온에서 1시간 동안 방치하여 블록킹(blocking)하고, 1:500 ~ 1:1000으로 희석한 일차 항체들을 넣고 4℃에서 16시간 동안 반응시켰다. 1차 항체는 다클론 항-p21 항체(polyclonal anti-p21 Ab, Santa Cruz 사), 다클론 항-actin 항체 (polyclonal anti-actin Ab, Santa Cruz 사), ITGB4의 타이로신 잔기 중 인산화된 아미노산 1510 만을 특이적으로 인지하는 항 p-ITGB4 항체 (monoclonal anti-phosphoITGB4, Abcam사)를 사용하였고 2차 항체는 호스 래디쉬 퍼옥시다아제 복합 항-토끼 또는 항-쥐 항체 (HRP conjugated goat anti-rabbit IgG, HRP conjugated goat anti-mouse IgG, Santa Cruz 사)를 이용하였다. 최종 단백질 발현은 ECL (enhanced chemiluminescence) 시약 (Amersham 사)으로 확인하였다. 이 때 세포노화 특이적 발현 단백질인 p21은 노화 유도가 정상적으로 이루어졌는지를 확인하기 위하여 이용되었으며, 모든 세포에서 동일한 수준으로 발현되는 유전자(housekeeping gene)인 액틴(actin)은 동량의 단백질에 대한 결과임을 확인하기 위해 이용되었다. 그 결과를 도 2에 나타내었다.

도 2에 나타낸 바와 같이, 폐암세포를 방사선에 노출시켜 노화를 유도한 결과, ITGB4의 인산화가 나타남을 확인하였다.

실시예 3. siRNA 를 이용하여 종양세포의 노화 과정에서 ITGB4 의 발현 분석

인간 폐암 세포주 A549 을 10% 우태아 혈청(fetal bovine serum: FBS,㈜ 웰진)과 항생제 (Gibco BRL 사)가 포함된 RPMI 배양 배지 안에서 배양하고 작은간섭 RNA(siRNA)의 주입 하루 전, 60 mm 배양접시에서 계대배양한 후 2 μl의 RNAiMAX (invitrogen, Cat#13778-075)와 OptiMEM®I 배양배지 (Invitrogen, Cat#31985)를 섞고 ITGB4 유전자에 대한 siRNA {ITGB4 si ; 5'-CUG GUA AAC AUC ACC AUC AdTdT-3', 서열번호 7-dTdT) 및 5'=UGA UGG UGA UGU UUA CCA GdTdT-3', 서열번호 8-dTdT), 각각의 서열 3' 말단에 티민 2 염기(dTdT)가 결합된 상태임}를 100 nM의 농도로 세포에 처리하였다. 6시간 후 배양배지를 10% 우태아 혈청(fetal bovine serum: FBS, ㈜ 웰진)과 항생제인 스트렙토마이신 100 ug/ml과 페니실린 100 U/ml (Gibco BRL 사)이 포함된 RPMI 배양 배지로 교환한 후, 5% CO₂ 농도의 37℃ 항온 배양기에서 1 일간 배양하였다. 상기 세포에 137Cs 감마선 방출기 (Atomic Energy of Canada Ltd., Mississauga, Ontario, Canada)로부터 방출되는 6 Gy의 감마-방사선을 3.81 Gy/분의 용량으로 노출한 후, 5% CO₂ 농도의 37℃ 항온 배양기에서 3일간 배양하고, 현미경(ECLIPSE TE300, Nikon)으로 세포 형태를 관찰하였다(도 3).

또한, 상기 방법과 동일하게 세포에 siRNA 를 100nM 처리한 후, 5% CO₂ 농도의 37℃ 항온 배양기에서 1 일간 배양하였다. 상기 세포에 137Cs 감마선 방출기로 방사선 6Gy 를 조사하고 0.5시간, 1시간, 6시간 동안 5% CO₂ 농도의 37℃ 항온 배양기에서 배양하였다. 방사선 노출 시간 대별로 세포를 수득한 후, 이를 PBS로 세척하고, 세포 용해 완충액(50mM Tri-HCl, 1% NP-40, 0.25% sodium deoxycholate, 150mM NaCl, 1mM PMSF, 50 mM NaF, 0.2 mM Na3VO4, 10 μg/ml 아프로티닌, 2 μg/ml 루펩틴)을 사용하여 세포를 녹였다. 상기 세포를 11,000rpm에서 10분간 원심분리한 후 상등액만 취하여 세포에서 추출된 단백질을 분리하였으며, 브래드포드법 (bradford, M., Anal. Biochem. 72:248-254(1976))을 이용하여 정량하였다. 20ug의 단백질에 2X SDS 로딩 버퍼(60 mM Tris-Cl (pH 6.8), 25% 글리세롤, 2% SDS, 14.4 mM 머캅토에탄올, 0.1% 브로모페놀 블루)를 가한 후, 95℃에서 5분간 가열하고 8% 내지 10% SDS 폴리아크릴 아마이드 젤에서 80V 로 2시간 동안 전기영동하였다. 전기영동 후 분리된 단백질을 나이트로셀룰로오즈 멤브레인(Whatman 사)으로 전이시켰다. 단백질이 전이되어 있는 멤브레인을 5% 탈지분유가 함유된 PBS 용액에 넣고 실온에서 1시간 동안 방치하여 블록킹(blocking)하고 1:500 ~ 1:1000으로 희석한 일차 항체들을 넣고 4℃에서 16시간동안 반응시켰다. 1차 항체는 다클론 항-p21 항체(polyclonal anti-p21 Ab, Santa Cruz 사), 다클론 항-actin 항체 (polyclonal anti-actin Ab, Santa Cruz 사), 단클론 항-ITGB4 항체 (monoclonal anti-ITGB4, Abcam사), ITGB4의 타이로신 잔기 중 인산화된 아미노산 1510 만을 특이적으로 인지하는 항 p-ITGB4 항체 (monoclonal anti-phosphoITGB4, Abcam사)를 사용하였고 2차 항체는 호스 래디쉬 퍼옥시다아제 복합 항-토끼 또는 항-쥐 항체 (HRP conjugated goat anti-rabbit IgG, HRP conjugated goat anti-mouse IgG, Santa Cruz 사)를 이용하였다. 최종 단백질 발현은 ECL (enhanced chemiluminescence) 시약 (Amersham 사)으로 확인하였다 (도 4).

한편, 상기 실험에서는 인간 폐암 세포주 A549에 비특이적 작은 간섭 RNA{Control si; 5'-CCU ACG CCA CCA AUU UCG UdTdT-3'(서열번호 9-dTdT)과 5'-ACG AAA UUG GUG GCG UAG GdTdT-3'(서열번호 10-dTdT)의 염기서열로 이루어진 이중가닥 siRNA로, 각각의 서열 3' 말단에 티민 2염기(dTdT)가 결합된 상태임}를 주입한 세포주를 대조군으로 이용하였다.

상기 siRNA는 모두 바이오니아(대한민국)에 의뢰하여 제작한 것을 사용하였다. 보다 구체적으로, β-시아노에틸 포스포라미다이트(β-cyanoethyl phosphoramidite)를 이용하여 DNA 구조의 골격을 이루는 포스포디에스터 결합을 연결해가는 방법을 사용하여 siRNA를 합성하였다(참조: Sinha et al., Nucleic Acids Research, 12:4539-4557, 1984). 즉, RNA 합성기(Perseptive Biosystems 8909, PE Biosystems, USA)를 사용하여, 뉴클레오티드가 부착된 고형지지체 상에서, 차단제거(deblocking), 결합(coupling), 산화(oxidation) 및 캐핑(capping)으로 이루어지는 일련의 과정을 반복하여 원하는 길이의 RNA를 포함하는 반응물을 수득하였다. 이어, 전기 반응물을 Daisogel C18(Daiso, Japan)을 사용한 HPLC LC918(Japan Analytical Industry, Japan)에 적용하여, RNA를 분리하고 이를 MALDI-TOF 질량 흡광분석기(Shimadzu, Japan)에 적용하여, 합성하고자 하는 염기서열과 부합하는지 확인하였다. 그런 다음, 센스와 안티센스 RNA가닥을 결합시켜서, 목적하는 이중가닥 siRNA를 각각 제조하였다.

이상의 실험 결과를 도 3 및 도 4에 나타내었다.

도 3에 나타낸 바와 같이, 폐암 세포에 ITGB4 siRNA를 주입하고 방사선에 노출시킬 경우, 노화 특이적 세포 형태의 변화가 나타나지 않음을 확인하였다.

또한, 도 4에 나타낸 바와 같이, 폐암 세포에 ITGB4 siRNA를 주입하고 방사선에 노출시킬 경우, ITGB4 발현이 효과적으로 억제되며, 세포 노화 특이적 발현 단백질인 p21의 발현량이 현저하게 감소함을 확인하였다.

실시예 4. 항체를 이용하여 종양세포의 노화 과정에서 ITGB4 의 발현 분석

인간 폐암 세포주 A549 을 10% 우태아 혈청(fetal bovine serum: FBS, ㈜ 웰진)과 항생제 (Gibco BRL 사)가 포함된 RPMI 배양 배지 및 5% CO₂ 농도의 37℃ 항온 배양기에서 1일 동안 배양하였다. 상기 세포에 하고 ITGB4 활성화 저해제인 항체 Asc-8 (Abcam사) 1ug/Ml 을 처리한 후 다시 5% CO₂ 농도의 37℃ 항온 배양기에서 1시간 동안 배양하였다. 상기 세포에 ¹³⁷Cs 감마선 방출기로 방사선 6Gy 를 조사한 후 5% CO₂ 농도의 37℃ 항온 배양기에서 다시 3일 동안 배양한 후, 현미경(ECLIPSE TE300, Nikon)으로 세포 형태를 관찰하였다.

또한, 상기 세포를 PBS로 2번 세척하고 3% 포름알데히드로 실온에서 3-5분간 고정한 후, 고정된 세포를 PBS로 다시 한 번 세척하였다. 상기 세포에 β-갈락토시다아제 활성 염색 용액(1 mg/ml의 X-Gal, 40 mM 시트르산/소듐 포스페이트(pH 6.0), 5 mM 포타슘 페로시아니드, 5 mM 포타슘 페리시아니드, 150 mM 염화클로라이드, 2 mM 마그네슘 클로라이드) 5 ml를 첨가하고, 37℃ 항온 배양기에서 12-16시간 반응시켰다. 반응을 진행하는 동안 빛이 들어가지 않도록 은박 호일로 배양접시를 싸서 배양하였다. 베타-갈락토시다아제 활성 정도는 위상차 현미경 (ECLIPSE TE300, Nikon)을 사용하여 관찰하였으며, 염색된 세포의 개수를 측정하여 베타-갈락토시다아제 양성을 보이는 세포의 비율을 정량화하였다.

그 결과를 도 5에 나타내었다.

도 5에 나타낸 바와 같이, 폐암 세포에 Asc-8를 처리하고 방사선에 노출시킬 경우, 노화 특이적 세포 형태의 변화가 나타나지 않으며, 대조군에 비해 노화-관련 베타-갈락토시다아제의 양성을 보이는 세포의 비율이 현저하게 감소하는 등 종양세포 노화 반응이 현저하게 저해됨을 확인하였다.

이상의 실험 결과를 통하여, 방사선에 의해 유도된 종양세포 노화 과정에서 ITGB4의 인산화가 필수적이며, ITGB4의 발현 또는 활성을 억제할 경우 종양세포 노화 반응이 현저하게 저해됨을 확인하였다.

<110> INHA-INDUSTRY PARTNERSHIP INSTITUTE <120> Composition for inhibiting tumor cell senescence comprising ITGB4 inhibitor <130> 1.154P <160> 10 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 5925 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 gcgctgcccg cctcgtcccc acccccccaa cccccgcgcc cgccctcgga cagtccctgc 60 tcgcccgcgc gctgcagccc catctcctag cggcagccca ggcgcggagg gagcgagtcc 120 gccccgaggt aggtccagga cgggcgcaca gcagcagccg aggctggccg ggagagggag 180 gaagaggatg gcagggccac gccccagccc atgggccagg ctgctcctgg cagccttgat 240 cagcgtcagc ctctctggga ccttggcaaa ccgctgcaag aaggccccag tgaagagctg 300 cacggagtgt gtccgtgtgg ataaggactg cgcctactgc acagacgaga tgttcaggga 360 ccggcgctgc aacacccagg cggagctgct ggccgcgggc tgccagcggg agagcatcgt 420 ggtcatggag agcagcttcc aaatcacaga ggagacccag attgacacca ccctgcggcg 480 cagccagatg tccccccaag gcctgcgggt ccgtctgcgg cccggtgagg agcggcattt 540 tgagctggag gtgtttgagc cactggagag ccccgtggac ctgtacatcc tcatggactt 600 ctccaactcc atgtccgatg atctggacaa cctcaagaag atggggcaga acctggctcg 660 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Leu Lys Met Asp Ala 435 440 445 Gly Ile Ile Cys Asp Val Cys Thr Cys Glu Leu Gln Lys Glu Val Arg 450 455 460 Ser Ala Arg Cys Ser Phe Asn Gly Asp Phe Val Cys Gly Gln Cys Val 465 470 475 480 Cys Ser Glu Gly Trp Ser Gly Gln Thr Cys Asn Cys Ser Thr Gly Ser 485 490 495 Leu Ser Asp Ile Gln Pro Cys Leu Arg Glu Gly Glu Asp Lys Pro Cys 500 505 510 Ser Gly Arg Gly Glu Cys Gln Cys Gly His Cys Val Cys Tyr Gly Glu 515 520 525 Gly Arg Tyr Glu Gly Gln Phe Cys Glu Tyr Asp Asn Phe Gln Cys Pro 530 535 540 Arg Thr Ser Gly Phe Leu Cys Asn Asp Arg Gly Arg Cys Ser Met Gly 545 550 555 560 Gln Cys Val Cys Glu Pro Gly Trp Thr Gly Pro Ser Cys Asp Cys Pro 565 570 575 Leu Ser Asn Ala Thr Cys Ile Asp Ser Asn Gly Gly Ile Cys Asn Gly 580 585 590 Arg Gly His Cys Glu Cys Gly Arg Cys His Cys His Gln Gln Ser Leu 595 600 605 Tyr Thr Asp Thr Ile Cys Glu Ile Asn Tyr Ser Ala Ile His Pro Gly 610 615 620 Leu Cys Glu Asp Leu Arg Ser Cys Val Gln Cys Gln Ala Trp Gly Thr 625 630 635 640 Gly Glu Lys Lys Gly Arg Thr Cys Glu Glu Cys Asn Phe Lys Val Lys 645 650 655 Met Val Asp Glu Leu Lys Arg Ala Glu Glu Val Val Val Arg Cys Ser 660 665 670 Phe Arg Asp Glu Asp Asp Asp Cys Thr Tyr Ser Tyr Thr Met Glu Gly 675 680 685 Asp Gly Ala Pro Gly Pro Asn Ser Thr Val Leu Val His Lys Lys Lys 690 695 700 Asp Cys Pro Pro Gly Ser Phe Trp Trp Leu Ile Pro Leu Leu Leu Leu 705 710 715 720 Leu Leu Pro Leu Leu Ala Leu Leu Leu Leu Leu Cys Trp Lys Tyr Cys 725 730 735 Ala Cys Cys Lys Ala Cys Leu Ala Leu Leu Pro Cys Cys Asn Arg Gly 740 745 750 His Met Val Gly Phe Lys Glu Asp His Tyr Met Leu Arg Glu Asn Leu 755 760 765 Met Ala Ser Asp His Leu Asp Thr Pro Met Leu Arg Ser Gly Asn Leu 770 775 780 Lys Gly Arg Asp Val Val Arg Trp Lys Val Thr Asn Asn Met Gln Arg 785 790 795 800 Pro Gly Phe Ala Thr His Ala Ala Ser Ile Asn Pro Thr Glu Leu Val 805 810 815 Pro Tyr Gly Leu Ser Leu Arg Leu Ala Arg Leu Cys Thr Glu Asn Leu 820 825 830 Leu Lys Pro Asp Thr Arg Glu Cys Ala Gln Leu Arg Gln Glu Val Glu 835 840 845 Glu Asn Leu Asn Glu Val Tyr Arg Gln Ile Ser Gly 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Glu Val Asp Ser Leu Leu Arg 1060 1065 1070 Gly Arg Gln Val Arg Arg Phe His Val Gln Leu Ser Asn Pro Lys Phe 1075 1080 1085 Gly Ala His Leu Gly Gln Pro His Ser Thr Thr Ile Ile Ile Arg Asp 1090 1095 1100 Pro Asp Glu Leu Asp Arg Ser Phe Thr Ser Gln Met Leu Ser Ser Gln 1105 1110 1115 1120 Pro Pro Pro His Gly Asp Leu Gly Ala Pro Gln Asn Pro Asn Ala Lys 1125 1130 1135 Ala Ala Gly Ser Arg Lys Ile His Phe Asn Trp Leu Pro Pro Ser Gly 1140 1145 1150 Lys Pro Met Gly Tyr Arg Val Lys Tyr Trp Ile Gln Gly Asp Ser Glu 1155 1160 1165 Ser Glu Ala His Leu Leu Asp Ser Lys Val Pro Ser Val Glu Leu Thr 1170 1175 1180 Asn Leu Tyr Pro Tyr Cys Asp Tyr Glu Met Lys Val Cys Ala Tyr Gly 1185 1190 1195 1200 Ala Gln Gly Glu Gly Pro Tyr Ser Ser Leu Val Ser Cys Arg Thr His 1205 1210 1215 Gln Glu Val Pro Ser Glu Pro Gly Arg Leu Ala Phe Asn Val Val Ser 1220 1225 1230 Ser Thr Val Thr Gln Leu Ser Trp Ala Glu Pro Ala Glu Thr Asn Gly 1235 1240 1245 Glu Ile Thr Ala Tyr Glu Val Cys Tyr Gly Leu Val Asn Asp Asp Asn 1250 1255 1260 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Asp Glu Met Phe Arg Asp Arg Arg Cys Asn Thr Gln 50 55 60 Ala Glu Leu Leu Ala Ala Gly Cys Gln Arg Glu Ser Ile Val Val Met 65 70 75 80 Glu Ser Ser Phe Gln Ile Thr Glu Glu Thr Gln Ile Asp Thr Thr Leu 85 90 95 Arg Arg Ser Gln Met Ser Pro Gln Gly Leu Arg Val Arg Leu Arg Pro 100 105 110 Gly Glu Glu Arg His Phe Glu Leu Glu Val Phe Glu Pro Leu Glu Ser 115 120 125 Pro Val Asp Leu Tyr Ile Leu Met Asp Phe Ser Asn Ser Met Ser Asp 130 135 140 Asp Leu Asp Asn Leu Lys Lys Met Gly Gln Asn Leu Ala Arg Val Leu 145 150 155 160 Ser Gln Leu Thr Ser Asp Tyr Thr Ile Gly Phe Gly Lys Phe Val Asp 165 170 175 Lys Val Ser Val Pro Gln Thr Asp Met Arg Pro Glu Lys Leu Lys Glu 180 185 190 Pro Trp Pro Asn Ser Asp Pro Pro Phe Ser Phe Lys Asn Val Ile Ser 195 200 205 Leu Thr Glu Asp Val Asp Glu Phe Arg Asn Lys Leu Gln Gly Glu Arg 210 215 220 Ile Ser Gly Asn Leu Asp Ala Pro Glu Gly Gly Phe Asp Ala Ile Leu 225 230 235 240 Gln Thr Ala Val Cys Thr Arg Asp Ile Gly Trp Arg Pro Asp Ser Thr 245 250 255 His Leu Leu Val Phe Ser 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Leu Met Ala Pro Arg Ser Ala Lys Pro 885 890 895 Ala Leu Leu Lys Leu Thr Glu Lys Gln Val Glu Gln Arg Ala Phe His 900 905 910 Asp Leu Lys Val Ala Pro Gly Tyr Tyr Thr Leu Thr Ala Asp Gln Asp 915 920 925 Ala Arg Gly Met Val Glu Phe Gln Glu Gly Val Glu Leu Val Asp Val 930 935 940 Arg Val Pro Leu Phe Ile Arg Pro Glu Asp Asp Asp Glu Lys Gln Leu 945 950 955 960 Leu Val Glu Ala Ile Asp Val Pro Ala Gly Thr Ala Thr Leu Gly Arg 965 970 975 Arg Leu Val Asn Ile Thr Ile Ile Lys Glu Gln Ala Arg Asp Val Val 980 985 990 Ser Phe Glu Gln Pro Glu Phe Ser Val Ser Arg Gly Asp Gln Val Ala 995 1000 1005 Arg Ile Pro Val Ile Arg Arg Val Leu Asp Gly Gly Lys Ser Gln Val 1010 1015 1020 Ser Tyr Arg Thr Gln Asp Gly Thr Ala Gln Gly Asn Arg Asp Tyr Ile 1025 1030 1035 1040 Pro Val Glu Gly Glu Leu Leu Phe Gln Pro Gly Glu Ala Trp Lys Glu 1045 1050 1055 Leu Gln Val Lys Leu Leu Glu Leu Gln Glu Val Asp Ser Leu Leu Arg 1060 1065 1070 Gly Arg Gln Val Arg Arg Phe His Val Gln Leu Ser Asn Pro Lys Phe 1075 1080 1085 Gly Ala His 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Claims (9)

1. ITGB4(integrin beta 4) 유전자의 발현을 억제하는 siRNA(short interfering RNA)를 유효성분으로 포함하는 폐암 세포의 노화 억제용 배지 조성물로서, 상기 siRNA는 서열번호 7의 염기서열로 표시되는 센스서열 및 이에 상보적인 서열번호 8의 염기서열로 표시되는 안티센스 서열로 이루어진 이중가닥 siRNA이고; 상기 노화는 방사선에 의해 유도된 것임을 특징으로 하는 조성물.
   
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7. 제1항에 있어서, 상기 방사선은 감마선인 것을 특징으로 하는, 조성물.
   
   
   
   
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