KR101660496B1 - 마이크로어레이 기반 프로브 증폭 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 마이크로어레이에 기반하여 프로브를 효율적으로 증폭하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 마이크로어레이 기반 프로브 증폭 방법은 마이크로어레이 및 유액 PCR을 기반으로 하여 프로브를 증폭함으로써 기존의 프로브 합성 방법에 비하여 다량, 다종의 이중가닥(double strand) 프로브를 반복적으로 합성하여 프로브 합성 단가를 낮출 수 있다.

Description

마이크로어레이 기반 프로브 증폭 방법{Amplification method of probes based on programmable microarray}

본 발명은 마이크로어레이에 기반하여 프로브를 저비용으로 효율적으로 증폭하는 방법에 관한 것이다.

20세기에 들어 DNA(deoxyribonucleic acid)가 유전물질이라는 것이 밝혀진 이래로, 서로 크기가 다른 DNA를 빠른 시간에 분리할 수 있는 모세관 전기영동(capillary electrophoresis)의 개발, DNA를 증폭하는 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)의 개발, 여러 종류의 DNA를 동시에 분석하는 DNA microarray의 개발 등 DNA를 연구하는 기술들이 계속적으로 개발되고 있고 이로 인해 다량의 DNA를 고속으로 분석할 수 있게 되었다. 최근에는 이러한 기술들을 이용하여 전장 유전체 염기서열 분석(whole genome sequencing), 유전형 분석(genotyping), 핵산 검사(nucleic acid testing), 핵산 진단(nucleic acid diagnostics) 등 DNA를 이용한 다양한 연구가 활발히 진행되고 있다.

일반적으로 DNA를 이용한 연구를 실시하기 위해서는 가장 먼저 소량의 시료로부터 분석을 원하는 목적 유전자(target gene)를 증폭하는 단계가 필요하고, 이를 위하여 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction)을 많이 사용하고 있다. 과거에는 하나의 목적 유전자를 분석하기 위하여 목적 유전자에 결합하는 전방향프라이머(forward primer)와 역방향 프라이머(reverse primer)로 구성된 하나의 프라이머 세트를 이용하였지만, 최근에는 서로 다른 종류의 DNA를 동시에 분석하기 위하여 다중 중합효소연쇄반응(multiplex polymerase chain reaction)에 대한 관심이 높아졌다. 이에 따라 분자 도치 프로브를 이용한 유전형 분석(molecular inversion probe genotyping), 전장 유전체 시료 분석(whole genome sampling analysis) 등의 방법이 개발되고 있고, 이러한 기술들은 약물유전체학(pharmacogenomics)에서 높은 평가를 받고 있다.

그러나 이러한 기술들을 사용하기 위해서는 여러 종류의 프라이머(primer) 또는 프로브(probe)를 다량으로 필요로 하는데, 핵산의 합성 단가가 매우 높기 때문에 이러한 기술들의 이용이 제한되고 있는 실정이다. 이에 따라 프로브를 저비용으로 합성하는 다양한 방법들이 연구되고 있는데 이 중 하나가 컬럼 기반 합성(column-based synthesis) 방법(Science (2012) 338(6114): 1619-1622)이다. 컬럼 기반 합성 방법을 이용하면, 다양한 종류의 프로브를 용이하게 합성할 수 있지만, 길이가 100mer 이상의 질 좋은 프로브를 합성하기 위해서는 단가가 매우 높고 2,000여개의 단일가닥 프로브(single-strand probe) 만을 합성할 수 있다.

따라서 본 발명자들은 저렴한 비용으로 10,000 종류 이상의 이중 가닥 프로브(double-strand probe)를 동시에 효율적으로 합성할 수 있는 방법에 대해 연구한 결과, 마이크로어레이 기반 프로브 증폭 방법을 개발하였다.

본 발명은 상기와 같은 종래 기술상의 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로, 저렴한 비용으로 다종 다량의 프로브를 효율적으로 증폭할 수 있는 마이크로어레이 기반 프로브 증폭 방법을 제공하는 것을 그 목적으로 한다.

그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

이하, 본원에 기재된 다양한 구체예가 도면을 참조로 기재된다. 하기 설명에서, 본 발명의 완전한 이해를 위해서, 다양한 특이적 상세사항, 예컨대, 특이적 형태, 조성물, 및 공정 등이 기재되어 있다. 그러나, 특정의 구체예는 이들 특이적 상세 사항 중 하나 이상 없이, 또는 다른 공지된 방법 및 형태와 함께 실행될 수 있다. 다른 예에서, 공지된 공정 및 제조 기술은 본 발명을 불필요하게 모호하게 하지 않게 하기 위해서, 특정의 상세사항으로 기재되지 않는다. "한 가지 구체예" 또는 "구체예"에 대한 본 명세서 전체를 통한 참조는 구체예와 결부되어 기재된 특별한 특징, 형태, 조성 또는 특성이 본 발명의 하나 이상의 구체예에 포함됨을 의미한다. 따라서, 본 명세서 전체에 걸친 다양한 위치에서 표현된 "한 가지 구체예에서" 또는 "구체예"의 상황은 반드시 본 발명의 동일한 구체예를 나타내지는 않는다. 추가로, 특별한 특징, 형태, 조성, 또는 특성은 하나 이상의 구체예에서 어떠한 적합한 방법으로 조합될 수 있다.

본 명세서에 있어서, "마이크로어레이(microarray)"란 금속 또는 유리 표면에 핵산(nucleic acid)이 부착되어 있는 칩(chip)을 의미하며, 상기 핵산은 cDNA, 올리고뉴클레오타이드(oligonucleotide), BAC clone 등일 수 있으나, 핵산이라면 이에 제한되지 않는다.

본 명세서에 있어서, "프로브(probe)"란 목적 유전자(target gene)의 특정 서열과 결합할 수 있도록 상보적인 서열로 디자인된 올리고뉴클레오타이드(oligonucleotide) 탐침자를 의미한다. 바람직하게는 분자 도치 프로브(molecular inversion probe), 패드락프로브(padlock probe), 피시 프로브(FISH probe), 연결 도치 프로브(connector inversion probe) 등일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 칩 측면 부위(chip flanking site), 제한효소 부위(enzyme cut site), 연장 암 부위(extension arm site), 중앙 기반 부위(middle backbone site), 임의 N 부위(random N site), 증폭용 서열(amplification F/R sequence), 말단 기반 부위(last backbone site), 연결 암 서열(ligation arm sequence) 등으로 이루어진 이중 가닥의 분자 도치 프로브(molecular inversion probe)이다. 그러나 본 명세서의 마이크로어레이 기반 프로브 증폭 방법에 의하여 증폭될 수 있는 올리고뉴클레오타이드라면 이에 제한되지 않는다.

본 명세서에 있어서, "유액 중합효소연쇄반응(emulsion polymerase chain reaction)"이란 오일(oil)을 이용한 중합효소연쇄반응을 의미하는 광의의 개념을 말한다. 구체적으로는 중합효소연쇄반응을 위한 혼합물(PCR mixture)에 오일 계면활성제 혼합물(oil surfactant mixture)을 혼합하고 중합효소연쇄반응을 수행하는 방법을 의미한다. 상기 오일 계면활성제 혼합물은 스팬 80(Span 80), 트윈 80(Tween 80), 트리톤 X-100(Triton X-100), 미네랄 오일(mineral oil) 등을 혼합하여 제조할 수 있으나, 중합효소연쇄반응 시 미셀(micelle)을 형성할 수 있는 물질이라면 이에 제한되지 않는다.

본 발명은 a) 프로브를 디자인하는 단계; b) 상기 디자인된 프로브를 이용하여 마이크로어레이를 제작하는 단계; c) 상기 마이크로어레이로부터 프로브를 분리하는 단계; 및 d) 상기 분리된 프로브를 주형(template)으로 1차 유액 중합효소연쇄반응(emulsion polymerase chain reaction)을 실시하는 단계를 포함하는 마이크로어레이 기반 프로브 증폭 방법을 제공한다. 그러나 마이크로어레이 상에서 프로브를 분리하지 않고, 바로 마이크로어레이 상의 프로브를 중합효소연쇄반응 또는 유액 중합효소연쇄반응 등의 방법으로 증폭할 수도 있다. 디자인된 프로브를 이용하여 제작된 마이크로어레이를 이용하여 프로브를 증폭시킬 수 있는 방법이라면 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 방법은 증폭된 프로브를 주형(template)으로 이용하여 2차 유액 중합효소연쇄반응을 수행하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 한다. 본 발명의 다른 구체예에서, 상기 방법은 증폭된 프로브를 제한효소를 처리하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 한다. 또한, 제한효소 처리 외에도 프로브를 사용 가능한 형태로 변이(modification)시키는 단계를 더 포함할 수 있다. 바람직하게는 형광물질 결합, 어댑터(adaptor) 결합 등일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 또 다른 구체예에서, 상기 유액 중합효소연쇄반응은 유화제(emulsion)을 포함하지 않은 오일 계면활성제 혼합물(oil surfactant mixture)을 사용하는 것을 특징으로 한다. 본 발명의 또 다른 구체예에서, 상기 마이크로어레이로부터 프로브를 분리하는 단계는 pH를 조절하여 프로브를 분리하는 것을 특징으로 한다.

또한 본 발명은 본 명세서의 마이크로어레이 기반 프로브 증폭 방법에 의하여 증폭된 프로브를 제공한다.

본 발명의 일 구체예에서, a) 목적하는 유전자 부위에 대한 프로브를 디자인하는 단계; b) 상기 디자인된 프로브를 이용하여 마이크로어레이를 제작하는 단계; c) 상기 마이크로어레이로부터 프로브를 분리하는 단계; 및 d) 상기 분리된 프로브를 주형(template)으로 유액 중합효소연쇄반응(emulsion polymerase chain reaction)을 실시하는 단계를 포함하고, 상기 프로브는 칩 측면 부위(chip flanking site), 제한효소부위(enzyme cut site), 연장 암 부위(extension arm site), 중앙 기반 부위(middle backbone site), 임의 N 부위(random N site), 증폭용 서열(amplification F/R sequence), 말단 기반 부위(last backbone site), 및 연결 암 서열(ligation arm sequence)로 이루어진 분자 도치 프로브(molecular inversion probe)인 마이크로어레이 기반 프로브 증폭 방법을 제공한다. 상기 구체예에서, 분자 도치 프로브(Molecular inversion probe)의 연장 암 서열(extension arm sequence) 또는 연결 암 서열(ligation arm sequence)의 용융 온도(melting point)를 측정하여 증폭된 프로브의 효율을 확인하는 단계를 추가로 포함하는 마이크로어레이 기반 프로브 증폭 방법을 제공하고, 상기 용융 온도가 55 내지 62.5 °C의 범위 이내인지 여부를 측정하는 마이크로어레이 기반 프로브 증폭 방법을 제공하며, 상기 증폭된 프로브는 이중 가닥인 것을 특징으로 하는, 방법을 제공하며, 상기 마이크로어레이로부터 프로브를 분리하는 단계는 pH를 조절하여 프로브를 분리하는 것을 특징으로 하는 방법을 제공한다.

본 발명의 일 구체예에서, a) 목적하는 유전자 부위에 대한 프로브를 디자인하는 단계; b) 상기 디자인된 프로브를 이용하여 마이크로어레이를 제작하는 단계; c) 상기 마이크로어레이로부터 프로브를 분리하는 단계; d) 상기 분리된 프로브를 주형(template)으로 1차 유액 중합효소연쇄반응(emulsion polymerase chain reaction)을 실시하는 단계; 및 e) 상기 증폭된 프로브를 주형(template)으로 이용하여 2차 유액 중합효소연쇄반응을 수행하는 단계를 포함하고, 상기 프로브는 칩 측면 부위(chip flanking site), 제한효소부위(enzyme cut site), 연장 암 부위(extension arm site), 중앙 기반 부위(middle backbone site), 임의 N 부위(random N site), 증폭용 서열(amplification F/R sequence), 말단 기반 부위(last backbone site), 및 연결 암 서열(ligation arm sequence)로 이루어진 분자 도치 프로브(molecular inversion probe)인 마이크로어레이 기반 프로브 증폭 방법을 제공한다. 상기 구체예에서, 분자 도치 프로브(Molecular inversion probe)의 연장 암 서열(extension arm sequence) 또는 연결 암 서열(ligation arm sequence)의 용융 온도(melting point)를 측정하여 증폭된 프로브의 효율을 확인하는 단계를 추가로 포함하는 마이크로어레이 기반 프로브 증폭 방법을 제공하고, 상기 용융 온도가 55 내지 62.5 °C의 범위 이내인지 여부를 측정하는 마이크로어레이 기반 프로브 증폭 방법을 제공하며, 상기 증폭된 프로브는 이중 가닥인 것을 특징으로 하는, 방법을 제공하며, 상기 마이크로어레이로부터 프로브를 분리하는 단계는 pH를 조절하여 프로브를 분리하는 것을 특징으로 하는, 방법을 제공하며, 상기 프로브 증폭 방법은 2차 유액 중합효소연쇄반응 후에 제한효소를 처리하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법을 제공한다.

본 발명은 마이크로어레이에 기반하여 프로브를 효율적으로 증폭하는 방법에 관한 것으로, 마이크로어레이를 기반으로 하기 때문에 반복적으로 저렴한 비용으로 이중 가닥의 프로브를 증폭시킬 수 있으며, 유액 중합효소연쇄반응을 이용함으로써 다양한 종류의 프로브를 한번에 다량으로 하성 가능하기 때문에 염기서열 분석, 핵산 진단 등 프로브를 이용하는 다양한 연구 분야에 폭넓게 이용될 수 있을 것으로 기대된다. 또한, 마이크로어레이를 기반으로 하기 때문에 용도에 맞추어 프로브를 증폭하고, 수백 개의 유전자를 동시에 진단 및 분석할 수 있는 하나의 패널(panel)을 개발할 수 있을 것으로 기대된다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 MIP 형태를 나타낸 도면이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 마이크로어레이 상에서 PCR을 통해 증폭된 프로브를 나타낸 도면이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른마이크로어레이 상에서 유액 PCR을 통해 증폭된 프로브를 나타낸 도면이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 분자 도치 프로브의 용융 온도를 측정한 결과를 나타낸 도면이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예

실시예 1: 마이크로어레이 기반 프로브 증폭

1.1. 마이크로어레이 제작

마이크로어레이(Microarray)를 기반으로 하여 프로브(probe)를 증폭시키기 위하여, 166bp의 분자 도치 프로브(molecular inversion probe, MIP)를 임의로 11,724개를 디자인하였다. 디자인된 MIP 형태는 도 1에 나타내었다.

도 1에 나타난 바와 같이, 166bp의 MIP는 (1) 칩 측면 부위(chip flanking site: 마이크로어레이 상에서 증폭을 위한 프라이머(primer) 서열이 포함된 부위), (2) 제한효소 부위(enzyme cut site: EarI 인식서열을 포함한 부위), (3) 연장 암 서열(extension arm sequence: 목적 유전자에 결합하는 서열), (4) 중앙 기반 부위(middle backbone site: 프로브의 길이 유지를 위한 부위), (5) 임의 N 부위(random N site: 증폭 편향(amplification bias)을 방지하기 위한 프로브 특이적인 tag), (6) 증폭용 서열(amplification F/R sequence: MIP 증폭용 공통 서열), (7) 말단 기반 부위(last backbone site: 프로브의 길이 유지를 위한 부위), 및 (8) 연결 암 서열(ligation arm sequence: 목적 유전자에 결합하는 서열)의 형태로 디자인하였으며, 칩 측면 부위를 제외한 MIP의 크기는 126bp가 되도록 디자인하였다. 디자인된 각각의 MIP는 CustomArray B3™ Synthesizer를 이용하여 마이크로어레이를 제작하였다. 상기 마이크로어레이 제작에 사용된 MIP는 80uL에 총 2.93ug이 되도록 합성하였고, 마이크로어레이 상에 고정되어 있는 프로브들은 필요시에 pH를 낮추어 마이크로어레이로부터 분리하여 TE(Tris-EDTA) buffer에 보관된 형태로 제조하여 이 후 반응에 주형(template)으로 사용하였다.

1.2. 중합효소연쇄반응을 이용한 프로브 증폭

프로브 증폭을 위하여, 실시예 1.1의 방법으로 준비한 마이크로어레이 상에서 분리한 프로브들을 주형(template)으로 2번의 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)을 실시하였다. PCR을 실시하기 위하여, template 1μL ,10μL의 2X KAPA HiFi polymerase(KAPA BIOSYSTEMS), 7μL의 3차 증류수, 및 각 1μL의 프라이머 세트(서열번호 1(Forward primer): 5'-AAG ACG TGG TTG ATC TGT CC-3', 서열번호 2(Reverse primer): 5'-TCA ACA CTT CCA CGA GAT GG-3'를 섞어 PCR 혼합물을 만들었다. 그리고 이를95°C에서 3분간 변성(denaturation) 단계 후, 95°C에서 30초, 58°C에서 30초, 72°C에서 30초를 45회 반복하고, 최종적으로 72°C에서 10분간 반응시켜 1차 PCR을 실시하였다. 증폭된 프로브는아가로스겔(agarose gel)을 이용하여 전기영동(electrophoresis)하였다. 그 결과는 도 2a에 나타내었다.

도 2a에 나타난 바와 같이, 166bp의 프로브가 정상적으로 증폭된 것을 확인하였다. 상기 증폭된 프로브는 QIAGEN gel-extraction kit를 이용하여 아가로스겔로부터 정제하고, 정제된 프로브를 주형(template)으로 이용하여 2차 PCR을 실시하였다. 2차 PCR은 95°C에서 3분간 변성(denaturation) 단계 후, 95°C에서 20초, 58°C에서 30초, 72°C에서 30초를 25회 반복하고, 최종적으로 72°C에서 10분간 반응시키는 순서로 실시하였다. 2차로 증폭된 프로브는 다시 아가로스겔을 이용하여 전기영동하였다. 그 결과는 도 2b에 나타내었다.

도 2b에 나타난 바와 같이, 166bp의 프로브가 고농도로 증폭된 것을 확인할 수 있었다. 그리고 증폭된 프로브는 다시 아가로스겔로부터 정제하고, EarI 제한효소를 이용하여 37℃에서 16시간 동안 자른 후, 아가로스겔을 이용하여 전기영동하였다. 그 결과는 도 2c에 나타내었다.

도 2c에 나타난 바와 같이, 제한효소에 의하여 칩 측면 부위가 제거되고 126bp의 MIP를 다량 획득한 것을 확인하였으며, 이를 통하여 PCR을 통해 프로브가 증폭되었음을 확인할 수 있었다.

1.3. 유액 중합효소연쇄반응을 이용한 프로브 증폭

프로브 증폭을 위하여, 실시예 1.1의 방법으로 준비한 마이크로어레이 상에서 분리한 프로브들을 주형(template)으로 2번의 유액 중합효소연쇄반응(emμLsion polymerase chain reaction)을 실시하였다. 유액 PCR을 위하여, 우선 오일 계면활성제 혼합물(oil surfactant mixture) 50mL을 준비하였다. 오일 계면활성제 혼합물은 2.25mL의 Span 80(최종 농도: 4.5% (vol/vol)), 200μL의 Tween 80(최종 농도: 0.4% (vol/vol)), 및 25μL의 Triton X-100(최종 농도: 0.05% (vol/vol))을 혼합하고, 미네랄 오일(mineral oil)을 첨가하여 총 50mL이 되도록 제조하였다. 1차 유액 PCR을 위하여, template 1μL, 1,300μL의2X KAPA HiFi polymerase(KAPA BIOSYSTEMS), 1,253μL의 3차 증류수, 및 13μL의 프라이머 세트(Forward primer(서열번호 1) 및 Reverse primer(서열번호 2))를 각각 첨가하여 수상(aqueous phase)을 구성할 PCR 혼합물(mixture)를 준비하였다.유상(oil phase)로서 상기 오일 계면활성제 혼합물 5.2mL을 준비하고, 수상과 유상이 균일한 emulsion을 형성하면서 혼합되도록 하기 위하여, ULTRA-TURRAX® Tube Drive Control(IKA®)을 사용하여, 6,000rpm에서 6분간 혼합하였다. 이 후 100μL씩 PCR tube에 나누어 담고 95°C에서 3분간 변성(denaturation) 단계 후, 95°C에서 20초, 58°C에서 30초, 72°C에서 30초를 35회 반복하고, 최종적으로 72°C에서 10분간 반응시켜 1차 유액 PCR을 실시하였다. 증폭된 프로브는아가로스겔(agarose gel)을 이용하여 전기영동(electrophoresis)하였다. 그 결과는 도 3a에 나타내었다.

도 3a에 나타난 바와 같이, 166bp의 프로브가 정상적으로 증폭된 것을 확인하였다. 상기 증폭된 프로브는 QIAGEN gel-extraction kit를 이용하여 아가로스겔로부터 정제하고, 정제된 프로브를 주형(template)으로 이용하여 2차 유액 PCR을 실시하였다. 2차 유액 PCR은 95°C에서 3분간 변성(denaturation) 단계 후, 95°C에서 20초, 58°C에서 30초, 72°C에서 30초를 25회 반복하고, 최종적으로 72°C에서 10분간 반응시키는 순서로 실시하였다. 2차로 증폭된 프로브는 다시 아가로스겔을 이용하여 전기영동하였다. 그 결과는 도 3b에 나타내었다.

도 3b에 나타난 바와 같이, 166bp의 프로브가 고농도로 증폭된 것을 확인할 수 있었다. 그리고 증폭된 프로브는 다시 아가로스겔로부터 정제하고, EarI 제한효소를 이용하여 37℃에서 16시간 동안 자른 후, 아가로스겔을 이용하여 전기영동하였다. 그 결과는 도 3c에 나타내었다.

도 3c에 나타난 바와 같이, 제한효소에 의하여 칩 측면 부위가 제거되고 126bp의 MIP를 다량 획득한 것을 확인하였으며, 이를 통하여 유액 PCR을 통해 프로브가 증폭되었음을 확인할 수 있었다.

실시예 2: 증폭된 프로브 확인

2.1. 중합효소연쇄반응을 이용하여 증폭된 프로브의 확인

PCR을 이용하여 증폭된 프로브를 MIP 실험에 사용가능한지 확인하기 위하여, 증폭된 프로브의커버리지 범위(Breadth-of-coverage)를 측정하였다. 프로브의 커버리지 범위(Breadth-of-coverage)란, 프로브가 포획하도록 목표했던 영역이 차세대 염기서열 분석 장비(Next generation sequencing)을 이용하여 어느 정도의 염기서열 분석 횟수(sequencing depth)로 분석되었는지를 확인한 값이다. 이는 fastq 파일 형태의 분석된 염기서열을 생명정보학적인 분석 방법을 이용하여 reference genome에 assembly하여 획득한 값으로, 높은 염기서열 분석 횟수로 목표 영역의 상당 부분의 서열 정보를 얻을수록 생성한 프로브 패널의 효율이 크다. 그 결과는 표 1에 나타내었다.

func	Fold-coverage (X)	Breadth-of-coverage
		1X (%)	5X (%)	10X (%)	15X (%)	20X (%)	50X (%)	100X (%)
average	132.20	80.25	66.78	58.76	53.40	49.38	35.52	24.95

표 1에 나타난 바와 같이, 일반 PCR을 이용하여 증폭된 프로브의 커버리지 범위는 10배수에서 평균 58.76%으로, 커버리지 범위가 낮을 것을 확인하였다. 이를 통하여, 마이크로어레이 상에서 일반 PCR을 이용하여 프로브를 증폭하는 경우에 증폭 편향(amplification bias)에 의하여, 각각의 프로브가 균일하게 증폭되는 것이 아니라 불균형하게 증폭되어 일부 종류의 프로브만 과다하게 증폭되어 프로브의 커버리지 범위가 낮으며, 낮은 커버리지 범위로 인하여 MIP 실험에 이용하기 용이하지 않다는 것을 확인할 수 있었다.

2.2. 유액 중합효소연쇄반응을 이용하여 증폭된 프로브의 확인

유액 PCR을 이용하여 증폭된 프로브를 MIP 실험에 사용가능한지 확인하기 위하여, 증폭된 프로브의 커버리지 범위(Breadth-of-coverage)를 측정하였다. 커버리지 범위 측정은 실시예 2.1과 동일한 방법으로 실시하였다. 그 결과는 표 2에 나타내었다.

func	Fold-coverage(X)	Breadth-of-coverage
		1X(%)	4X(%)	8X(%)	10X(%)	20X(%)	50X(%)	100X(%)	200X(%)
average	143.54	92.93	89.10	85.43	83.96	77.98	64.29	47.06	25.70

표 2에 나타난 바와 같이, 유액 PCR을 이용하여 증폭된 프로브의 커버리지 범위는 [표1]의 결과와 근사한 정도의 Fold-coverage(X)에서의 10배수에서 평균 83.96%로, 일반 PCR을 이용하여 증폭된 프로브의 커버리지 범위의 약 1.4배인 것을 확인하였으며, 이를 통하여 마이크로어레이 상에서 프로브를 증폭하는 경우 유액 PCR을 이용하면 다양한 종류의 프로브가 균일하게 증폭되며, MIP 사이의 결합에 의한 이량체(dimer) 형성을 억제하여 증폭 효율 감소 문제 또한 해결할 수 있다는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 증폭된 프로브가이중 가닥(double strand)일 때도 MIP 실험에 이용 가능하다는 것을 확인할 수 있었다.

상기 결과들을 통하여, 마이크로어레이를 기반으로 하여 프로브를 합성함으로써 저렴한 비용으로 다양한 종류의 프로브를 한번에 합성할 수 있었으며, 이를 추가 증폭함으로써 이중가닥(double strand)의 프로브를 다량으로 반복적으로 합성하여 프로브 합성 단가를 100배 이상 낮출 수 있으며, 유액 PCR을 사용함으로써 다양한 종류의 프로브를 효율적으로 합성 가능하다는 것을 확인할 수 있었다.

실시예 3: 증폭된 분자 도치 프로브의 적용

3.1 염기서열 분석 횟수( sequencing depth ) 정보 획득

실시예 1 및 2의 방법으로 제조한 분자 도치 프로브들은 Hybridizaiton, gap filling, exonuclease 처리, barcode 및 adaptor를 위한 분자 도치 프로브를 위한 일반적인 PCR의 과정을 거쳐, 차세대 염기서열 분석 기술로 염기서열을 분석할 수 있는 라이브러리(library)로 제작하였다. Hybridization 과정에서 분자 도치 프로브들과 게놈 DNA(genomic DNA)를 함께 95°C에서 5분간 변성(denaturation)시킨 후에, 0.1°C/sec의 속도로 60°C까지 온도를 낮추고, 48시간 동안 같은 온도를 유지하였다. 목표 영역의 양 끝에 hybiridization된 분자 도치 프로브의 빈 영역을 원래 염기서열과 같게 채워넣기 위하여 AmpliTaq® DNA polymerase(Stoffel Fragment, 10U/I), Ampligase DNA Ligase(100U/I), 10X Ampligase Reaction Buffer와 dNTP(10mM)를 섞고 24시간 동안 60℃를 유지하였다. 작동하지 않은 single strand 형태의 프로브 및 게놈 DNA를 제거하기 위하여 exonucleaseI(20U/ul), exonuclease III (100U/ul)를 섞고 37℃에서 2시간, 이후 94℃에서 4분간 유지하였다. 차세대 염기서열 분석 장비가 인식할 수 있는 일반적인 바코드와 인덱스 서열을 중합효소연쇄반응을 이용하여 포획이 끝난 분자 도치 프로브의 양 끝에 붙여 염기서열 분석이 가능한 형태의 library를 제작하였다. 이 후 차세대 염기서열 분석 장비를 이용하여 fastq 파일 형태의 분석된 염기서열을 생명정보학적인 분석 방법을 이용하여 reference genome에 assembly하여, 목표했던 영역이 어느 정도의 염기서열 분석 횟수(sequencing depth)로 분석되었는지를 확인하였다.

3.2 분자 도치 프로브의 용융 온도 측정

분자 도치 프로브의 연장 암 서열과 연결 암 서열의 용융 온도는 인접한 2mer의 염기서열의 enthalpyenthalpy(ΔG°), entropy(ΔH°)를 고려하여 용융 온도를 계산하는 방법인 nearest-neighbor method(NN method)를 이용하여 계산하였다. 이는 널리 알려진 방법으로, enthalpy(ΔG°), entropy(ΔH°)의 실험값에 따라 계산치가 달라질 수 있어 여러 연구그룹에서 관련한 실험값을 발표한 바 있다. 본 연구에서는 “John SantaLucia Jr. (1998). Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95(4): 1460-5”에 기재된 측정치를 최근린 방법(nearest-neighbor method, NN method)에 적용하였다. 각 분자 도치 프로브의 연장 암 서열과 연결 암 서열의 용융 온도와 그에 따른 염기서열 분석 횟수(sequencing depth)를 수행하여, 30,335개의 분자 도치 프로브 중 게놈 DNA를 잘 포획하여 높은 염기서열 분석 횟수를 얻은 분자 도치 프로브의 용융 온도는 55 내지 75°C에 분포하는 것을 확인할 수 있었다.

3.3 높은 포획 효율을 가지는 분자 도치 프로브의 제작

상기에서 획득한 분자 도치 프로브의 용융 온도를 이용하여, 포획 효율이 증가된 분자 도치 프로브를 디자인하기 위하여, 잘 알려져 있는 약리 유전자 89개에 결합할 수 있는 분자 도치 프로브를 11,724개 디자인하였다. 상기 11,724개의 분자 도치 프로브는 연장 암 서열과 연결 암 서열의 길이를 조절하여 둘 중 적어도 하나는 용융 온도가 55 내지 75°C에 분포하도록 제작하였다. 그리고 용융 온도 측정 시 정확성을 증가시키기 위하여, 분자 태깅(molecular tagging) 방식을 이용하여 반복된 염기서열 분석 결과를 제거하고, 상기에서 새롭게 제작한 분자 도치 프로브의 용융 온도를 측정하였다. 분자 태깅 방식은 “Hiatt JB, et. al., Genome Res. 2013 23(5): 843-54”에 기재된 방식을 기반으로 하여 실시하였다. 그 결과는 도 4에 나타내었다.

도 4에 나타난 바와 같이, 11,724개의 분자 도치 프로브 중 게놈 DNA와 높은 효율로 결합하는 분자 도치 프로브의 용융 온도는 55 내지 62.5 °C인 것을 확인할 수 있었다. 또한, 연장 암 서열과 연결 암 서열 중 어느 하나의 서열만이 적정 용융 온도 내에 분포하여도, 높은 효율로 게놈 DNA와 결합하는 것을 확인하였다. 상기 결과를 통하여, 게놈 DNA와 결합하는 연장 암 서열과 연결 암 서열 중 어느 하나가 효율적으로 게놈 DNA를 포획한다면, 다른 서열의 결합도 용이하게 이루어진다는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 본 발명의 프로브 증폭 방법을 이용하여 제조된 프로브를 이용하여 분자 도치 프로브를 이용한 실험에 사용 가능하다는 것을 확인할 수 있었다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> Industry-Academic Cooperation Foundation, Yonsei University <120> Amplification method of probes based on programmable microarray <130> DPB140010 <160> 2 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 1 aagacgtggt tgatctgtcc 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 2 tcaacacttc cacgagatgg 20

Claims (12)

1. a) 목적하는 유전자 부위에 대한 프로브를 디자인하는 단계;
   b) 상기 디자인된 프로브를 이용하여 마이크로어레이를 제작하는 단계;
   c) 상기 마이크로어레이로부터 프로브를 분리하는 단계; 및
   d) 상기 분리된 프로브를 주형(template)으로 유액 중합효소연쇄반응(emulsion polymerase chain reaction)을 실시하는 단계를 포함하고,
   상기 프로브는 유액 중합효소연쇄반응을 위한 프라이머 결합 서열인 칩 측면 부위(chip flanking site), 제한효소부위(enzyme cut site), 연장 암 부위(extension arm site), 중앙 기반 부위(middle backbone site), 프로브 특정 태그 서열(probe specific tag sequence), 전방 증폭용 서열(amplification F sequence), 말단 기반 부위(last backbone site), 후방 증폭용 서열(amplification R sequence), 프로브 특정 태그 서열, 중앙 기반 부위(middle backbone site), 연결 암 서열(ligation arm sequence), 제한효소부위(enzyme cut site), 및 칩 측면 부위(chip flanking site) 순서로 이루어진 분자 도치 프로브(molecular inversion probe)인, 마이크로어레이 기반 프로브 증폭 방법에 있어서,
   프로브 특정 태그 서열은 증폭 편향을 방지하기 위한 프로브 특이적인 서열이며, 중앙 기반 부위 및 말단 기반 부위는 프로브의 길이를 유지하기 위한 서열인 것을 특징으로 하는, 방법.
2. 제 1 항에 있어서,
   분자 도치 프로브(Molecular inversion probe)의 연장 암 서열(extension arm sequence) 또는 연결 암 서열(ligation arm sequence)의 용융 온도(melting point)를 측정하여 증폭된 프로브의 효율을 확인하는 단계를 추가로 포함하는, 마이크로어레이 기반 프로브 증폭 방법.
3. 제 2 항에 있어서,
   상기 용융 온도가 55 내지 62.5 °C의 범위 이내인지 여부를 측정하는, 마이크로어레이 기반 프로브 증폭 방법.
4. 제 1 항에 있어서,
   상기 (d) 단계에서 증폭된 프로브는 이중 가닥인 것을 특징으로 하는, 마이크로어레이 기반 프로브 증폭 방법.
5. 제 1 항에 있어서,
   상기 마이크로어레이로부터 프로브를 분리하는 단계는 pH를 조절하여 프로브를 분리하는 것을 특징으로 하는, 마이크로어레이 기반 프로브 증폭 방법.
6. a) 목적하는 유전자 부위에 대한 프로브를 디자인하는 단계;
   b) 상기 디자인된 프로브를 이용하여 마이크로어레이를 제작하는 단계;
   c) 상기 마이크로어레이로부터 프로브를 분리하는 단계;
   d) 상기 분리된 프로브를 주형(template)으로 1차 유액 중합효소연쇄반응(emulsion polymerase chain reaction)을 실시하는 단계; 및
   e) 상기 (d) 단계에서 증폭된 프로브를 주형(template)으로 이용하여 2차 유액 중합효소연쇄반응을 수행하는 단계를 포함하고,
   상기 프로브는 유액 중합효소연쇄반응을 위한 프라이머 결합 서열인 칩 측면 부위(chip flanking site), 제한효소부위(enzyme cut site), 연장 암 부위(extension arm site), 중앙 기반 부위(middle backbone site), 프로브 특정 태그 서열(probe specific tag sequence), 전방 증폭용 서열(amplification F sequence), 말단 기반 부위(last backbone site), 후방 증폭용 서열(amplification R sequence), 프로브 특정 태그 서열, 중앙 기반 부위(middle backbone site), 연결 암 서열(ligation arm sequence), 제한효소부위(enzyme cut site), 및 칩 측면 부위(chip flanking site) 순서로 이루어진 분자 도치 프로브(molecular inversion probe)인, 마이크로어레이 기반 프로브 증폭 방법에 있어서,
   프로브 특정 태그 서열은 증폭 편향을 방지하기 위한 프로브 특이적인 서열이며, 중앙 기반 부위 및 말단 기반 부위는 프로브의 길이를 유지하기 위한 서열인 것을 특징으로 하는, 방법.
7. 제 6 항에 있어서,
   분자 도치 프로브(Molecular inversion probe)의 연장 암 서열(extension arm sequence) 또는 연결 암 서열(ligation arm sequence)의 용융 온도(melting point)를 측정하여 증폭된 프로브의 효율을 확인하는 단계를 추가로 포함하는, 마이크로어레이 기반 프로브 증폭 방법.
8. 제 7 항에 있어서,
   상기 용융 온도가 55 내지 62.5 °C의 범위 이내인지 여부를 측정하는, 마이크로어레이 기반 프로브 증폭 방법.
9. 제 6 항에 있어서,
   상기 증폭된 프로브는 이중 가닥인 것을 특징으로 하는, 마이크로어레이 기반 프로브 증폭 방법.
10. 제 6 항에 있어서,
    상기 마이크로어레이로부터 프로브를 분리하는 단계는 pH를 조절하여 프로브를 분리하는 것을 특징으로 하는, 마이크로어레이 기반 프로브 증폭 방법.
11. 제 6 항에 있어서,
    상기 프로브 증폭 방법은 2차 유액 중합효소연쇄반응 후에 제한효소를 처리하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 마이크로어레이 기반 프로브 증폭 방법.
12. 제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 하나의 프로브 증폭 방법에 의하여 증폭된 프로브.

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