KR101623992B1

KR101623992B1 - 개선된 ｆｒｅｔ-프로브 및 이의 용도

Info

Publication number: KR101623992B1
Application number: KR1020107013331A
Authority: KR
Inventors: 돈겐 야코부스 요하네스 마리아 반; 드 마토스 코레이아 이 발르 요세 알베르토 오르파오
Original assignee: 에라스무스 유니버시티 메디컬 센터 로테르담
Priority date: 2007-11-21
Filing date: 2008-11-21
Publication date: 2016-05-24
Also published as: EP2210100B1; CA2706477C; WO2009067009A1; CA2706477A1; ZA201003394B; US20120003632A1; EP2210100A1; BRPI0819739A2; AU2008326922A1; CN101868728A; ATE511649T1; EA201000836A1; KR20100105605A; ES2367232T3; AU2008326922B2; JP2011505549A; DK2210100T3

Abstract

본 발명은 특히 종양-특이적 융합 단백질과 단백질 상호작용의 검출에 관한 것이다. 적어도 제 1 분자 프로브 및 제 2 분자 프로브의 세트가 제공되고, 여기서 각각의 프로브에는 염료가 제공되고, 상기 염료는 함께 에너지 전달을 허용하며, 각각의 프로브에는 적어도 제 1 분자 프로브와 제 2 분자 프로브가 병치되게 허용하는 반응기가 추가로 제공되어 있고, 여기서 반응기는 올리고뉴클레오타이드이고, 제 1 분자 프로브의 반응기는 제 2 분자 프로브의 반응기와 직접 반응하지 않는다.

Description

개선된 ＦＲＥＴ-프로브 및 이의 용도{IMPROVED FRET-PROBES AND USE THEREOF}

본 발명은 특히 종양-특이적 융합 단백질 및 단백질 상호작용의 검출에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 융합 단백질 및/또는 상호작용 단백질의 존재를 단일 세포 수준에서 나타내는 기법에 관한 것이다.

악성 종양의 진단 및 분류는 종종 주로 DNA 수준 또는 RNA 수준에서의 발암성 변이의 검출뿐만 아니라 특정한 단백질 분자 또는 단백질 분자의 세트의 검출에 근거한다[1]. 정상 및 악성 세포에서의 현재의 게놈 및 프로테옴 연구는 유전자 발현 및 유전 변이에 대한 정보를 극적으로 확장시키고 있다. 이는 세포-세포 상호작용, 세포 활성화, 신호전달 경로, 증식, 분화, 세포사멸 및 많은 다른 정상 및 비정상 세포 작용을 조절하는 여러 새로운 단백질 네트워크의 발견을 야기한다. 이들 단백질 네트워크를 밝혀내는 것은 개별적인 단백질 분자의 진정한 동시위치를 특이적으로 검출할 것을 요구한다.

악성 종양의 분류는 특히 세포 계통 및 분화 특성 및 특정한 염색체 변이의 존재에 근거한다. 이들 염색체 변이중 많은 것은 융합 유전자, 즉, 하나의 유전자의 업스트림 일부가 다른 유전자의 다운스트림 일부와 이상 커플링되거나 또는 하나의 유전자의 다운스트림 일부가 다른 유전자의 업스트림 일부와 이상 커플링된 유전자를 생성한다[2 내지 5]. 이들 유합 유전자는 융합 유전자 전사물로 전사되고 융합 단백질로 번역되며(도 1), 이는 발암 과정에서 중요한 역할을 할 것으로 추정된다. 이제까지, 수백 개 이상의 서로 다른 유형의 융합 유전자가 백혈병, 임파종 및 고형 종양에서 개시되어 왔다. 예시적인 융합 단백질이 표 1에 열거되어 있다.

결론적으로, 단일 세포 수준에서의 이들 종양-특이적 융합 단백질의 믿을 수 있는 검출은 암 환자의 진단 및 분류뿐만 아니라, 적용된 치료 프로토콜의 효과의 측정치로서 치료 동안 악성 세포의 소실을 모니터링하는 데 있어 중요한 진전이 될 것이다.

서로 다르게 라벨링된 항체의 밀접하고 안정한 병치를 위해 뉴클레오타이드 연결기 시스템을 이용한 FRET-기법을 통해 검출될 수 있는 악성 종양에서의 융합 단백질의 예³

악성 종양	염색체 변이	융합 단백질
만성 골수성 백혈병	t(9;22)(q34;q11)	BCR-ABL
임파종	t(2;5)(p23;q35)	NPM-ALK
전립선 암	t(21;21)(q22.3;q22.2)	TMPRSS2-ERG
유잉 육종	t(11;22)(q24;q12)	EWSR1-FLI1
유두상 신장 세포 암종	t(X;1)(p11;q23)	PRCC-TFE3
여포상 갑상선암	t(2;3)(q13;p25)	PAX8-PPARG
섬유점액성 연조직 육종	t(7;16)(q33;p11)	FUS-CREB3L2
자궁내막 기질 암종	t(7;17)(p15;q11)	JAZF1-SUZ12
연조직 연골육종	t(9;22)(q31;q12)	EWSR1-NR4A3
결합조직 형성 소원형 세포 종양	t(11;22)(p13;q12)	EWSR1-WT1
중심선 구조에 영향을 미치는 열악하게 분화된 암종	t(15;19)(q14;p13)	BRD4-NUT

먼저, 과학자들은 융합 단백질의 융합 에피토프에 대한 항체를 제조함으로써 융합-단백질 특이적 항체를 모집하고자 하였다. 이 접근법은 거의 성공하지 못하였으며, 특이적 항체가 수득된 경우, 이들은 일반적으로 형광 현미경 또는 유동 세포측정기에 적용될 수 없었다[6 내지 8]. 예를 들면 BCR-ABL p190 융합 단백질에 대한 ER-FP1 항체는 웨스턴 블럿팅에서는 잘 작용하지만, 인간 BCR-ABL 양성 백혈병에 대한 현미경 연구에서는 성공하지 못하였다[6,7].

이들 초기의 문제점에도 불구하고, 융합 단백질의 일부에 대한 포착 항체 및 단백질의 다른 부분에 대한 라벨링된 검출 항체를 이용함으로써 융합 단백질의 특이적 검출이 가능해졌다. 이런 시스템에서 포착 항체는 고형 층, 예를 들면 계량봉, ELISA 플레이트 또는 유동 세포측정기에 의해 분석될 수 있는 비드에 결합되어 있다[9]. 비록 우아하고 수행하기 쉽지만, 이들 시스템은 세포 용균물을 이용하고, 결론적으로 단일 세포 수준에서 세포내 융합 단백질의 검출을 허용하지 않는다.

2개의 상이한 막-결합된 단백질 및/또는 세포간 단백질 사이의 밀접한 상호작용, 또는 융합 단백질의 존재는 형광 공명 에너지 전달(FRET)에 적합한 형광색소와 컨쥬게이트를 형성하거나 이에 연결된 항체를 이용함으로써 조사될 수 있다. FRET 기법은 하나의 형광색소가 발광을 생성하고, 이것이 다른 형광색소를 여기시키는 2개의 서로 다른 형광색소(서로 다른 여기 파장을 가짐)를 병치하는 것에 근거한다(도 2). 제 2 형광색소의 발광이 유동 세포측정기에 의해 검출될 수 있으면, 이는 단일 세포 수준에서 단백질 네트워크를 쉽게 고속 분석하고 융합 단백질을 검출하는 것을 허용한다. 예를 들면 공초점 주사 현미경을 이용하여, 상호작용 단백질과 융합 단백질의 정확한 세포내 위치를 평가하는 것이 가능해졌다.

2개의 FRET 형광색소-컨쥬게이트된 항체가 대략적으로 동시위치하는 것으로는 요구되는 광-에너지 전달에 충분하지 않다. 효율적인 광-에너지 전달에 필수적인 2개의 상이한 항체에 연결된 형광색소의 밀접한 병치(일반적으로 80Å 미만, 바람직하게는 50Å 미만, 가장 바람직하게는 10Å 미만)가 일어나도록 검출된 단백질의 진정한 동시위치가 요구된다.

본 출원인은 이전에 FRET 기법이 한 세트의 특이적으로 디자인된 프로브를 이용하여 세포 내에서 융합 단백질의 존재를 검출하거나(제WO2004/042398호) 또는 단백질 상호작용을 검출(제WO2004/042404호)하는데 이용될 수 있다는 것을 개시하였다. 제WO2004/042398호 및 제WO2004/042404호에 따르면, 각각의 프로브에는 염료가 제공되어 있고, 여기서, 상기 염료들이 함께 FRET을 가능하게 하며, 적어도 하나의 프로브에는 반응기가 제공되어 있다. 반응기에 결합할 수 있는 "가교" 시약을 첨가하면 FRET 염료들 사이에 증가된 에너지 전달 가능성이 있도록 제 1 분자 프로브와 제 2 분자 프로브를 병치시키는 것을 허용한다. 제WO2004/042398호는 예를 들면 A-B 융합 단백질의 절편 A 및 B에 대한 항체 프로브 A 및 B의 세트를 개시하고 있고, 여기서 A 및 B는 서로 다른 FRET 염료로 라벨링되고, A 및 B에 (스트렙트)아비딘 가교 물질을 결합할 수 있는 바이오틴 반응기가 구비되어 있다. 가교 물질을 반응기에 첨가하면, 항체 프로브의 공간적인 조직이 반응기를 통해 조절된다. 이는 프로브에 부착되어 있는 개별적인 FRET 염료가 FRET이 일어나는 것을 허용하는 서로의 거리, 즉, 서로의 약 80 내지 100Å 이내에 있도록 한다. 제WO2004/042398호 및 제WO2004/042404호의 프로브와 방법이 일반적으로 만족할 수 있는 결과를 생성할 수 있지만, 본 발명자는 이를 추가로 개선시키고자 한다. 특히, 융합 단백질과 상호작용 단백질을 검출하기 위한 FRET계 방법의 민감성을 증가시키는 것이 본 발명의 목적이다.

[선행기술문헌]

[비특허문헌]

1. Jaffe ES, Harris NL, Stein H, Vardiman JW (eds), World Health Organization classification of tumours. Pathology and genetics of tumours of haematopoietic and lymphoid tissues. Lyon: IARC Press, 2001.

2. Van Dongen JJM, Macintyre EA, Gabert JA, et al, Standardized RT-PCR analysis of fusion gene transcripts from chromosome aberrations in acute leukemia for detection of minimal residual disease. Report of the BIOMED-1 Concerted Action: investigation of minimal residual disease in acute leukemia. Leukemia 1999; 13: 1901-28.

3. Mitelman F, Johansson B, Mertens F, The impact of translocations and gene fusions on cancer causation. Nat Rev Cancer 2007; 7: 233-45

4. Look AT, Oncogenic transcription factors in the human acute leukemias. Science 1997; 278: 1059-64.

5. Crans HN, Sakamoto KM, Transcription factors and translocations in lymphoid and myeloid leukemia. Leukemia 2001; 15: 313-31.

6. Van Denderen J, Hermans A, Meeuwsen T, et al, Antibody recognition of the tumor-specific bcr-abl joining region in chronic myeloid leukemia. J Exp Med 1989; 169: 87-98.

7. Van Denderen J, ten Hacken P, Berendes P, et al, Antibody recognition of the tumor-specific b3-a2 junction of bcr-abl chimeric proteins in Philadelphia-chromosome-positive leukemias. Leukemia 1992; 6: 1107-12.

8. Sang BC, Shi L, Dias P, et al, Monoclonal antibodies specific to the acute lymphoblastic leukemia t(1;19)-associated E2A/PBX1 chimeric protein: characterization and diagnostic utility. Blood 1997; 89: 2909-14.

9. Berendes P, Recognition of tumor-specific proteins in human cancer, Ph.D. Thesis, Chapter 8. Rotterdam: Erasmus University Rotterdam, 1997: 111-27.

상기 본 발명의 목적은 FRET가 큰 효율로 일어날 수 있도록 FRET 형광물질이 밀접하고 안정하게 병치되도록 하기에 올리고뉴클레오타이드 잔기가 특히 적합하다는 것을 깨달음으로서 만족되었다. 올리고뉴클레오타이드의 작은 크기는 병치된 염료 사이에 단지 최소한의 간격만을 허용한다. 또한, 상보적인 올리고뉴클레오타이드 서열은 매우 특이적이고 강한 분자간 상호작용을 달성하도록 디자인될 수 있다. 따라서, 본 발명자들은 탁월한 반응기로서 올리고뉴클레오타이드(예를 들면 DNA 또는 PNA 또는 LNA 분자)를 확인하고, 물질이 염료-라벨링된 프로브의 밀접한 병치를 매개하고/하거나 개선시키도록 하였다.

따라서, 본 발명은 적어도 제 1 분자 프로브 및 제 2 분자 프로브의 세트를 제공하고, 각각의 프로브에는 염료가 제공되어 있고, 여기서, 상기 염료들은 함께 에너지 전달을 허용하고, 각각의 프로브에는 상기 적어도 제 1 분자 프로브와 제 2 분자 프로브의 병치를 허용하는 반응기가 추가로 제공되어 있고, 여기서, 반응기는 올리고뉴클레오타이드이고, 제 1 분자 프로브의 올리고뉴클레오타이드 반응기는 제 2 분자 프로브의 올리고뉴클레오타이드 반응기와 직접적으로 반응하지 않는다. 마지막 부분은 프로브 사이의 원하지 않는 자가-연결에 의해 발생되는 위양성 신호를 피하기 위해 필요한 것이다.

도 1은 유전자 A의 업스트림(5') 부분 및 유전자 B의 다운스트림(3') 부분으로 구성된 융합 유전자의 도식도이다. 이 A-B 융합 유전자는 A-B mRNA로 전사되고, A-B 융합 단백질로 번역된다.
도 2는 공여자 염료로서 형광 색소 X를 이용하고 수용체 염료로서 Y를 이용하는 형광 공명 에너지 전달(FRET)의 원리에 대한 도식도이다. A: X와 Y사이의 거리가 너무 멀면, 수용체 염료 Y는 공여자 염료 X의 발광에 의해 여기되지 않는다. B: 공여자와 수용체 염료 사이의 거리가 충분히 작으면(80Å 미만, 바람직하게는 50Å 미만), 공여자 염료 X의 발광은 수용체 염료 Y를 여기시킬 것이다.
도 3은 2개의 항체를 밀접하고 안정하게 연결시키는 올리고뉴클레오타이드(예를 들면 DNA/PNA) 분자의 이용을 나타내는 도식도이다. 2개의 항체가 모두 서로에 대해 밀접하게 위치한 경우, 이들이 융합 단백질 A-B의 양쪽 파트너 둘 모두에 결합되기 때문에, 가교 물질 올리고뉴클레오타이드 C(이는 올리고뉴클레오타이드 A 및 B 둘 모두에 대해 부분적으로 상보적이다)는 2개의 형광색소 X와 Y사이의 간격을 감소시키고 안정화시킬 것이고, FRET 신호가 검출될 수 있다. A: 공여자 및 수용체 형광색소가 항체 프로브에 직접 컨쥬게이트되어 있다. B: 공여자 및 수용체 형광 색소가 올리고뉴클레오타이드 반응기에 컨쥬게이트되어 있다. 올리고뉴클레오타이드 반응기는 연결기 잔기를 통해 항체 프로브에 부착된다.
도 4는 반응기 올리고뉴클레오타이드 A, 반응기 올리고뉴클레오타이드 B, 반응기 올리고뉴클레오타이드 A와 B의 조합, 또는 A 및 B와 가교 올리고뉴클레오타이드 C의 조합 중 하나의 경우에서 검출되는 형광의 결과를 나타낸다. 화살표는 상보적 가교 올리고뉴클레오타이드 C의 첨가에 의해 야기된 FRET 신호를 나타낸다. 상세한 내용에 대해서는 하기 실시예를 참조할 수 있다.

본 발명의 기초를 이루는 원칙은 도 3에 도식적으로 예시되어 있다. 제 1 분자 프로브(항체 A)에는 FRET 염료 X 및 하나 이상의 반응기가 제공되어 있고, 상기 반응기는 올리고뉴클레오타이드(뉴클레오타이드 A)를 포함하거나 이로 구성된다. 반응기는 그 일부가 뉴클레오타이드 A의 적어도 한 절편의 서열에 대해 상보적인 핵산 서열을 포함하거나 이로 구성되는 가교 물질(뉴클레오타이드 C)에 특이적으로 결합할 수 있다. 뉴클레오타이드 C는 또한 FRET 염료 Y가 제공된 제 2 분자 프로브(항체 B)의 반응기(뉴클레오타이드 B)의 서열의 적어도 일부에 상보적이다. 염료 X와 Y는 함께 FRET 쌍을 형성한다. 제 1 분자 프로브와 제 2 분자 프로브가 서로 밀접하게 되면(예를 들면 도면에 도시된 바와 같이 이들이 융합 단백질 A-B 상의 인접한 에피토프에 결합하거나, 또는 상호작용 분자 상의 에피토프에 결합하기 때문에), 올리고뉴클레오타이드 반응기(뉴클레오타이드 A 및 B)는 가교 물질(뉴클레오타이드 C)에 대해 충분히 밀접하여 제 1 분자 프로브와 제 2 분자 프로브 둘 모두의 반응기에 결합한다. 이 상호작용은 FRET 신호가 검출될 수 있도록 2개의 프로브-결합된 염료 사이의 거리를 감소시키고 안정화시킬 것이다.

FRET 에너지 전달 효율은 공여체 염료와 수용체 염료 사이의 거리의 육제곱값에 반비례한다. 본원에 개시된 바와 같은 올리고뉴클레오타이드 연결기 시스템의 가교 물질 및 올리고뉴클레오타이드 반응기의 매우 작은 크기로 인해 염료의 매우 밀접한 접근이 가능해져서(예를 들면 10Å 이내), 제WO2004/042398호 또는 제WO2004/042404호에 개시된 바와 같은 단백질성 반응기 및 가교 물질을 이용하는 것과 비교하였을 때 훨씬 더 강한 형광 신호를 생성한다. 또한, 반응기 그들 자체 사이가 아니라 반응기와 가교 물질의 상보적인 서열 사이의 염기쌍 인식이 높은 정도의 특이성을 제공한다.

안정화 연결기 시스템으로서 3개의 올리고뉴클레오타이드 분자를 이용하는 이 FRET 접근법에서, 세포는 전형적으로 각각 올리고뉴클레오타이드 반응기를 갖는 2개 이상의 프로브로 세포내 라벨링된 후, (엄격하게) 세척되고, 후속적으로 특이적으로 고안된 가교 올리고뉴클레오타이드와 함께 항온처리되어 2개의 반응성 항체의 밀접하고 안정한 연결을 수득한다. 바람직한 양태에서, 각각의 프로브에는 2 내지 6개의 올리고뉴클레오타이드와 같은 여러 반응기가 제공되고, 이들 각각은 가교 올리고뉴클레오타이드와 반응성이다. 단일 프로브에 존재하는 상기 반응기는 서로에 대해 동일하거나 상이하다.

달리 언급되지 않는 한, 본원에서 이용되는 표현 "반응기 올리고뉴클레오타이드" 및 "올리고뉴클레오타이드 반응기"는 서로 교환되어 사용될 수 있다. 또한, "가교 올리고뉴클레오타이드" 및 "올리고뉴클레오타이드 가교 물질"은 동일한 대상을 의미한다.

본원에서 이용되는 용어 "올리고뉴클레오타이드"는 장쇄에서 연결된 핵산 또는 핵산 유사체의 스트레치를 의미한다. 올리고뉴클레오타이드의 총 길이는 특히 핵산 또는 핵산 유사체의 성질에 따라 다양할 수 있다. 한 양태에서, 올리고뉴클레오타이드는 장쇄에 연결된 5 내지 50개, 바람직하게는 10 내지 30개의 핵산 또는 핵산 유사체의 스트레치로 구성된다. 핵산은 예를 들면 질소성 염기(DNA에서는 A, G, T 또는 C; RNA에서는 A, G, U 또는 C), 전하를 띠는 포스페이트 잔기, 및 당 잔기(DNA에서는 데옥시리보스, RNA에서는 리보스)를 포함하는 뉴클레오타이드이다.

프로브-결합된 올리고뉴클레오타이드(즉, 반응기)에 적합한 길이는 8개 이상의 핵산 잔기, 바람직하게는 10 내지 18개의 핵산 또는 유사체로 구성된 것들을 포함한다. 각각의 프로브 상의 올리고뉴클레오타이드 반응기의 길이는 상이하거나 동일할 수 있다. 한 양태에서, 이들은 동일한 길이, 예를 들면 10 내지 15개, 바람직하게는 10 내지 12개의 핵산 또는 유사체이다. 가교 올리고뉴클레오타이드는 일반적으로 반응기 올리고뉴클레오타이드보다 더 길 것이다. 한 양태에서, 가교 또는 연결기 올리고뉴클레오타이드는 15 내지 40개의 핵산 또는 이의 유사체, 예를 들면 약 20 내지 약 25개와 같은 18 내지 30개의 핵산으로 구성된다.

바람직한 양태에서, 올리고뉴클레오타이드는 펩타이드 핵산(PNA) 다량체이다. PNA는 DNA 또는 RNA와 유사하지만, 이의 "주쇄"의 조성이 상이하다. DNA와 RNA는 각각 데옥시리보스 및 리보스 당 주쇄를 갖는 반면, PNA의 주쇄는 펩타이드 결합에 의해 연결된 반복 N-(2-아미노에틸)-글리신 단위로 구성된다. 다양한 퓨린 및 피리미딘 염기는 메틸렌 카보닐 결합에 의해 주쇄에 연결된다. PNA는 전형적으로 펩타이드로서 묘사되고, N-말단이 첫번째(좌측) 위치이고, C-말단이 우측에 위치한다.

핵산 유사체인 PNA는 지구상에 존재하는 생명체에는 천연적으로 존재하지 않는 것으로 알려져 있지만, 이는 인공적으로 합성될 수 있다. 생물학적 연구 및 의학적 치료의 일부 영역에서 사용되어왔다. 합성 펩타이드 핵산 다량체는 분자 생물학 과정, 진단 분석 및 안티센스 치료에서 최근 몇 년 동안 이용되어 왔다. PNA의 주쇄가 하전된 포스페이트 기를 함유하지 않기 때문에, PNA/DNA 가닥 사이의 결합은 정전기적 반발력이 없으므로 DNA/DNA 가닥 사이에서 보다 더 강하다. 호모피리미딘 가닥(단지 하나의 반복된 피리미딘 염기로 구성된 가닥)을 이용한 초기의 실험은, 등가의 6-염기 DNA/DNA 이중체가 10℃ 미만의 온도에서 변성되는 데 비해, 6-염기 티민 PNA/아데닌 DNA 이중 나선의 Tm("용융 온도")이 31℃임을 보여주었다. 혼합 염기 PNA 분자는 염기-쌍 인식의 측면에서 DNA 분자의 진정한 모사체이다.

PNA 다량체는 또한 상보적 DNA에 대한 결합에서 더 큰 특이성을 나타내고, PNA/DNA 염기 미스매치가 DNA/DNA 이중체에서의 유사한 미스매치에 비해 보다 더 탈안정화된다. 이 결합 강도 및 특이성은 또한 PNA/RNA 이중체에 적용된다. PNA는 뉴클레아제 또는 프로테아제에 의해 쉽게 인식되지 않아서, 이들이 효소 분해에 보다 저항성이 되도록 한다. PNA는 또한 넓은 pH 범위에 걸쳐 안정하다. 최종적으로, 이들의 하전되지 않은 성질로 인해 세포 막을 가로지르는 교차가 더 쉬워지게 만들고, 이는 온전한 세포에서 융합 단백질의 검출을 포함하는 본 발명에 대한 그들의 가치를 추가로 개선시킬 수 있다. 한 양태에서, 약 10 내지 16개, 예를 들면 12 내지 15개의 PNA 유니트로 구성된 PNA 올리고뉴클레오타이드가, 선택적으로 20 내지 30개의 PNA 유니트로 구성된 가교 올리고뉴클레오타이드와 조합되어, 반응기 올리고뉴클레오타이드로서 이용된다. 특정한 양태에서, 프로브-결합된 PNA 서열은 각각 20 내지 25개, 예를 들면 21개 PNA 유니트로 구성된 가교 올리고뉴클레오타이드에 상보적인 10 내지 12개 PNA 유니트로 구성된다.

또다른 양태에서, 올리고뉴클레오타이드는 록킹된 핵산(LNA: 상표명)을 포함한다. LNA는 2'-O, 4'-C 메틸렌 가교를 함유하는 신규한 유형의 핵산 유사체이다. 3'-엔도 배열에서 잠긴 이 가교는 리보푸라노스 고리의 가요성을 제한하고, 구조를 경직된 이환상 형태로 잠그고, 개선된 혼성화 성능 및 탁월한 생물학적 안정성을 부여한다.

당 분야의 숙련자에 의해 이해되는 바와 같이, 반응기 및 가교 물질로서, 다양한 서로 다른 조합의 핵산 다량체 유형(예를 들면 DNA, RNA, LNA 및 PNA)가 이용될 수 있다. 반응기와 가교 물질 사이의 특이적인 높은 친화성 상호작용은 동종이중체(예, DNA/DNA, PNA/PNA) 또는 이종이중체(예를 들면 DNA/PNA) 형성중 하나를 통해 수행될 수 있다. 한 양태에서, 본 발명의 프로브 세트는 적어도 제 1 분자 프로브와 제 2 분자 프로브를 포함하고, 각각의 프로브에는 반응기로서 별개의 올리고뉴클레오타이드가 제공되어 있고, 여기서 상기 핵산 다량체는 데옥시리보뉴클레오타이드 다량체(DNA)이다. 이들 DNA 반응기는 서로 다른 유형의 가교 물질, 예를 들면 DNA(동종이중체) 또는 PNA(이종이중체) 가교 물질에 의해 클러스터를 형성할 수 있다. 다르게는, 반응기는 RNA(동종이중체) 또는 PNA(이종이중체)에 의해 인식되고 결합될 수 있는 옥시리보뉴클레오타이드 서열(RNA)을 포함한다. 적어도 제 1 분자 프로브의 반응기와 가교 물질 사이의 동종이중체 및 적어도 제 2 분자 프로브와 가교 물질 사이의 이종이중체를 이용하는 것 또한 가능하다. 예를 들면 프로브 A에는 PNA 반응기가 제공되어 있고, 프로브 B에는 DNA 또는 RNA 반응기가 제공되어 있고, 두가지 기 모두 RNA 가교 물질에 의해 클러스터를 형성할 수 있다.

가교 올리고뉴클레오타이드와 올리고뉴클레오타이드 반응기중 어느 하나 사이의 상보성 정도는 이들이 특이적이고 안정한 결합을 허용하는 한 다양할 수 있다. 한 양태에서, 5개 이상, 바람직하게는 7개 이상의 연속적인 핵산 또는 유사체의 스트레치에 걸쳐 반응기와 가교 물질 사이에 상보성(즉, 염기-쌍)이 있다. 이해되는 바와 같이, 프로브의 자가 연결 및 부착된 염료 사이의 조기 에너지 전달이 발생하는 것을 피하기 위해서, 제 1 분자 프로브의 올리고뉴클레오타이드 반응기는 제 2 분자 프로브의 올리고뉴클레오타이드 반응기와 직접적으로 반응하지 않는다. 이는 FRET 신호가 진정으로 병치된 프로브를 반영하는 것을 보증하기 위해 중요하다.

한 양태에서, 가교 물질은 제 1 올리고뉴클레오타이드 반응기의 적어도 일부에 상보적인 제 1 서열, 및 제 2 올리고뉴클레오타이드 반응기의 적어도 일부에 상보적인 제 2 서열을 포함하고, 여기서 제 1 및 제 2 서열은 하나 이상의 핵산 또는 유사체에 의해 분리된다. 예를 들면, 이들은 몇몇, 예를 들면 2, 3, 4 또는 5개 와 같은 1 내지 10개의 핵산에 의해 이격된다. 1 내지 3개에 의한 이격이 바람직하다. 다른 양태에서, 상보적 서열은 하나 이상의 아미노산 잔기, 바람직하게는 1 또는 2개의 글리신 잔기와 같은 작은 아미노 잔기에 의해 이격된다.

그러나, 제 1 분자 프로브의 올리고뉴클레오타이드 반응기의 적어도 일부에 상보적인 서열이 이격되지 않고 제 2 분자 프로브의 올리고뉴클레오타이드 반응기의 적어도 일부에 상보적인 서열의 바로 측면에 배치되어 있는 것 또한 가능하다. 단일 가닥 "유리 단부"가 존재하지 않도록, 가교 올리고뉴클레오타이드의 양 말단이 올리고뉴클레오타이드 반응기에 대한 결합에 참여하도록 고안되는 것이 바람직하다.

또한, 올리고뉴클레오타이드 서열은 융합 단백질이 검출되는 세포의 내인성 뉴클레오타이드 서열과 교차 반응하지 않도록 선택되어야만 한다. 따라서, 본 발명을 실시하는데 이용되는 임의의 서열을 고안할 때, 올리고뉴클레오타이드의 원하지 않는 차단 또는 소거를 방지하기 위해서, 내인성 (예를 들면 인간) DNA 및/또는 RNA 서열과의 상보성이 최소화되거나 심지어는 완전히 회피되어야만 한다.

한 양태에서, 제 1 분자 프로브에는 예를 들면 연결기를 통해 5'-CGA TTC TAT G-3'의 서열로 구성된 반응기 올리고뉴클레오타이드가 제공되고, 제 2 분자 프로브에는 또한 연결기를 통해 5'-TGT ACC TTG A-3'의 서열을 포함하는 반응기 올리고뉴클레오타이드가 제공되어 있다. 이 세트의 프로브는 5'-TCA DGG TAC A Gly Gly CAT AGA ATC G-3'의 서열을 포함하거나 이로 구성된 가교 올리고뉴클레오타이드와 조합되어 사용되는 것이 유리하다. 그러나, 당 분야의 숙련자들은 본 발명이 가교 물질과 각각의 프로브 사이에 충분한 결합 강도 및 결합 특이성을 허용하는 DNA, RNA, PNA 또는 이의 임의의 조합인 임의의 세트의 서열을 이용하여 실시될 수 있다는 점을 이해할 것이다.

분자 프로브는 이의 소위 결합 도메인을 통해 흥미로운 생물학적 분자에 특이적으로 결합할 수 있다. 결합 도메인을 통해 흥미로운 분자에 적어도 제 1 분자 프로브 및 제 2 분자 프로브가 결합된 후, 반응기를 이용하여 병치를 조절한다. 올리고뉴클레오타이드 반응기는 프로브가 흥미로운 분자에 결합된 후 병치된 프로브의 공간적 조직화를 조절하는데 이용가능하도록 남아있다. 한 양태에서, 흥미로운 분자는 단백질, 바람직하게는 융합 단백질, 보다 바람직하게는 발암성 융합 단백질이다. 각각의 프로브가 융합 단백질의 융합 영역의 반대 측면에 위치한 결합 부위(에피토프)를 인식하고 이에 결합할 수 있는 제 1 분자 프로브와 제 2 분자 프로브의 세트가 특히 바람직하다. 물론, 각각의 프로브가 흥미로운 분자의 서로 다른 에피토프(예를 들면 융합 단백질의 융합 영역의 C-말단과 N-말단 측면에서의 에피토프)에 결합하는 한 세트의 프로브를 이용할 경우, 상기 서로 다른 에피토프들은 분자간 또는 분자내 방식으로 서로와 상호작용하지 않아야한다(이러한 상호작용은 명확하게 프로브 결합을 방해하기 때문이다). 따라서, 한 세트의 프로브 이내에서의 서로 다른 프로브는 서로 다른, 본질적으로 비-상호작용성 에피토프에 결합할 수 있다. 프로브가 서로의 작은 거리 이내에서 결합 부위(에피토프)를 인식하는 한, 프로브의 융합 단백질 또는 상호작용 분자로의 단순한 결합은 이론적으로는 염료 사이의 에너지 전달를 야기할 수 있다. 그러나, 가교 물질에 의한 병치된 반응기의 "클러스터 형성"에 의해, 에너지 전달 경향이 극적으로 개선되도록 염료의 공간적 조직화가 조절될 수 있다.

본 발명은 또한 본 발명에 따른 한 세트의 프로브를 포함하는 진단 키트를 제공한다. 바람직한 양태에서, 키트는 제 1 분자 프로브의 올리고뉴클레오타이드 반응기의 적어도 일부에 상보적인 서열을 갖고 제 2 분자 프로브의 올리고뉴클레오타이드의 적어도 일부에 상보적인 올리고뉴클레오타이드 가교 물질을 부가적으로 포함한다. 예를 들면, 이런 키트는 종양-특이적 융합 단백질-양성 세포의 검출을 통해 악성 종양 세포, 예를 들면 백혈병 세포의 모니터링 및 정량에 이용될 수 있다. 본원에서 제공되는 진단 시험 키트는 적용된 암 치료 프로토콜의 효과를 평가하기 위해 치료 동안 및 치료후 뿐 아니라 진단 기간에 유용하다.

추가의 양태는 상기 치료의 효과를 평가하기 위해 질병의 치료 전, 치료 동안, 치료 후 뿐만 아니라, 질병의 진단 및/또는 분류시 융합 단백질 또는 상호작용(단백질) 분자의 존재를 검출하기 위해 프로브 세트를 이용하는 방법에 관한 것이다.

또한 각각의 프로브를 올리고뉴클레오타이드 반응기와 접촉시켜 프로브와 반응기 사이에 컨쥬게이트를 형성하는 단계, 및 상기 컨쥬게이트를 정제하는 단계를 포함하는 본 발명에 따른 프로브 세트를 생산하는 방법을 제공한다. 반응기 올리고뉴클레오타이드는 직접적으로 또는 예를 들면 스페이서 또는 연결기 잔기를 통해 간접적으로 프로브에 부착될 수 있다. 또한, FRET 염료는 직접적으로 또는 예를 들면 반응기를 통해 간접적으로 프로브에 부착될 수 있다. 바람직한 양태에서, 프로브는 하나 이상의 올리고뉴클레오타이드 반응기를 포함하고, 상기 반응기에는 FRET 염료가 제공되어 있다(도 3B 참조). 올리고뉴클레오타이드 반응기는 프로브에 직접적으로 또는 간접적으로 커플링될 수 있다. 반응기가 프로브와 컨쥬게이트를 형성하기 전 또는 후에 FRET 염료가 제공될 수 있다.

본 발명의 바람직한 양태에서, 프로브 세트는 각각이 융합 단백질의 융합 영역의 반대쪽 측면에 위치하거나 또는 별개의 상호작용 분자, 예를 들면 단백질 복합체의 단백질에 위치한 결합 부위를 인식할 수 있는 2개 이상의 염료-올리고뉴클레오타이드-컨쥬게이트 항체의 세트를 포함한다. 적합한 항체는 종래의 (폴리클론 또는 모노클론) 항체 또는 합성 항체, 또는 이와 기능적으로 등가인 결합 절편, 예를 들면 Fab', Fab, 단일 쇄 Fv 절편, 다이어바디(diabody)(단일 쇄 Fv 이량체) 등을 포함한다. 예를 들면, 키메릭 융합 단백질 A-B는 염료-컨쥬게이트된 프로브의 세트, 예를 들면 항-A 항체 및 항-B 항체를 이용하여 FRET을 통해 검출될 수 있다. 바람직한 양태에서, 시료를 2개의 항체(하나는 융합 단백질의 도메인 A에 대한 것이고, 다른 것은 도메인 B에 대한 것이다)와 접촉시켜 세포 시료 중의 A-B 융합 단백질의 존재를 검출한다. 하나의 항체는 FRET 공여자 염료로 라벨링(바람직하게는 이의 반응기를 통해)되어 있고, 다른 항체는 FRET 수용체 염료로 라벨링되어 있다. 도메인 A가 도메인 B에 매우 근접한 경우에만, 예를 들면 둘 모두가 동일한 단백질 분자의 일부일 때, 2개의 항체가 함께 충분히 가까워서('병치되어') 공여자/수용체 쌍이 검출가능한 FRET 형광 신호를 야기하도록 허용한다.

본원에서 용어 "반응기"는 에너지 전달이 일어날 확률이 증가되고/되거나 에너지 전달 효율이 증가하도록 FRET 염료의 공간적 조직화가 조절되게 허용하는 잔기를 의미한다. 공간적 조직화란 염료의 상대적 배향 뿐 아니라 염료간의 거리 둘 모두를 의미한다. 공간적 조직화를 조절한다는 것은 염료의 공간적 조직화를 조절하고 안정화시키는 것을 포함한다. 에너지 전달이 일어나는 주된 조건중 하나는 공여자와 수용체 분자가 전형적으로 10 내지 100Å로 매우 밀접해야만 한다는 것이다. 바람직한 양태에서, 반응기는 서로에 대해 50Å의 간격 이내, 보다 바람직하게는 서로에 대해 20Å의 간격 이내, 가장 바람직하게는 10Å의 간격 이내에 상기 염료들을 병치하는 것을 허용한다.

본원에서 용어 "염료"는 다른 염료와 함께 FRET 분석과 같은 에너지 전달 분석에 이용될 수 있는 치환체를 의미한다. 상기 언급된 바와 같이, FRET은 일반적으로 둘 모두 형광인 공여자 염료와 수용체 염료 사이의 상호작용에 근거한다. 한 양태에서, 본 발명은 염료중 적어도 하나가 형광색소인 프로브 세트를 이용한다. 그러나, 비형광 수용체가 또한 사용될 수 있고, FRET는 공여자 형광의 급냉에 의해 검출된다. 상기한 바와 같이, 병치된 프로브의 결과로서 공여자 형광의 감소를 모니터링함으로써 FRET를 검출하는 것은 종종 수용체 형광의 증가를 검출하는 것만큼 민감하지는 않다. 따라서, 바람직한 양태에서는, 상세한 설명에 예시된 바와 같이, 2개 이상의 형광 라벨링된 프로브를 이용하여 융합 단백질을 검출한다. 바람직한 형광색소의 예는 종래의 유동 세포측정기에 의한 분석에 적합한 것들이고, 플루오레세인 라벨, 예를 들면 5-(및 6)-카복시플루오레세인, 5- 또는 6-카복시플루오레세인, 6-(플루오레세인)-5-(및 6)-카복사미드 헥산산 및 플루오레세인 아이소티오시아네이트, 알렉사플루오르(AlexaFluor: 상표명) 염료, 예를 들면 알렉사플루오르 488(상표명) 또는 알렉사플루오르 594(상표명), 시안 염료, 예를 들면 Cy2, Cy3, Cy5, Cy7, 선택적으로 치환된 쿠마린, R-피코에리트린, 알로피코에리트린, 텍사스 레드(Texas Red) 및 프린스톤 레드(Princeton Red), 뿐만 아니라 R-피코에리트린의 컨쥬게이트, 및 예를 들면 Cy5 또는 텍사스 레드 및 피코빌리프로테인의 일종을 포함한다. 흥미있는 다른 염료는 양자 도트 염료이고, 이는 거의 무제한의 색의 팔레트를 생성한다. 유동 세포측정기에 의한 에너지 전달 검출에 적합한 공여자/수용체 쌍에 대한 광범위한 정보가 문헌[Szollosi et al.¹⁸]에서 발견될 수 있다. 형광색소의 바람직한 조합은 듀오크롬으로도 언급되는 전통적인 탠덤 컨쥬게이트에서 사용되는 염료를 포함한다¹⁹. 바람직한 양태에서는, 프로브에 LCRed640(상표명) 또는 LCRed705(상표명)와 조합된 플루오레세인과 같은 라이트사이클러(LightCycler) 기법에서 이용되는 염료 세트가 구비되어 있다.

또한 본원에서는 각각의 프로브가 상기 융합 단백질의 융합 영역의 반대쪽 측면에 위치한 결합 부위를 (이의 결합 도메인을 통해) 인식할 수 있고, 각각의 프로브에 염료가 구비되어 있고, 여기서 상기 염료가 함께 에너지 전달를 허용하며, 염료 사이의 에너지 전달 가능성을 증가시키도록 적어도 제 1 분자 프로브 및 제 2 분자 프로브의 병치를 조절하는 것을 허용하는 올리고뉴클레오타이드 반응기가 적어도 하나의 프로브에 구비되어 있는, 적어도 제 1 분자 프로브 및 제 2 분자 프로브 세트를 이용하여 세포에서 융합 단백질의 존재를 검출하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 프로브 세트를 제공하는 단계, 세포를 포함하는 시료를 제공하는 단계, 융합 단백질 상에서 프로브가 병치되는 것을 허용하는 조건 하에서 시료를 프로브와 접촉시키는 단계, 임의의 결합되지 않은 프로브와 임의의 비-특이적으로 결합된 프로브를 제거하는 단계, 및 FRET를 통해 상기 프로브의 병치를 검출하여 상기 융합 단백질의 존재를 측정하는 단계를 포함한다.

한 양태에서, 프로브에는 상기 프로브가 하나 이상의 가교 물질과 상호작용할 수 있게 하는 하나 이상의 올리고뉴클레오타이드 반응기가 구비되어 있다. 하나 이상의 반응기를 갖는 프로브를 제공하는 것은 상기 프로브와 가교 물질 사이의 상호작용 가능성을 이론적으로 증가시킬 것이다.

그런 다음, 본 발명은 각각의 프로브가 프로브의 결합 도메인을 통해 상기 융합 단백질의 융합 영역의 반대쪽에 위치한 결합 부위에 결합할 수 있는, 즉, 하나의 프로브는 융합 단백질의 N-말단 절편을 포함하는 단백질 분획에 대한 것이고, 다른 프로브는 동일한 융합 단백질의 C-말단 절편을 포함하는 단백질 분획에 대한 것인 본 발명에 따른 프로브 세트를 이용하여 단일 세포 수준에서 융합 단백질을 검출하는 방법을 제공한다. 융합 단백질은 융합 유전자의 전사 및 번역 후에 형성되는 임의의 종류의 단백질 물질을 포함한다. 융합 유전자는 다른 유전자 또는 이로부터 유래된 일부와 조합된 하나 이상의 유전자의 한 부분을 포함한다. 융합 단백질은 염색체 전위, 역전 또는 결실의 결과일 수 있다. 바람직한 양태에서는, 종양-특이적 융합 단백질을 검출하는데 이용되는 방법이 제공된다. 융합 단백질은 내인성 발현된 단백질일 수 있거나, 또는 이는 유전자 조작의 결과일 수 있다. 본 발명에 따른 방법을 이용하여 쉽게 검출될 수 있는 악성 종양에서의 융합 단백질은 표 1에 열거된 것들을 포함하지만 이로 한정되지는 않는다.

많은 상이한 용도가 본원에 개시된 제안된 올리고뉴클레오타이드계 FRET 방법을 이용하여 예상될 수 있고, 예를 들면 다음과 같다:

- 천연 및 발암성 융합 단백질의 검출: 여러 임파종 및 고형 종양에서 발생하는 발암성 융합 단백질, 유전자 단편의 융합에 의해 형성된 T-세포 수용체 또는 B-세포 수용체 단백질;

- 특이적 T-세포 수용체 쇄의 회합의 검출(예를 들면 Vδ9⁺ 쇄를 갖는 Vδ2⁺);

- 단백질 복합체의 조사: 단백질 복합체의 모든 성분이 존재하는가? 성분들이 얼마나 밀접하게 회합되어 있는가?

- 전사 복합체에 의한 유전자 조절의 조사(예를 들면 정상적인 조혈의 결정적인 조절자인 AML1/CBFβ 코어 결합 인자 전사 복합체);

- 단백질 복합체에 의한 전사 활성화의 조사(예를 들면 β-카테닌의 Tcf-1으로의 결합이 Wnt-표적 유전자의 전사를 유도한다);

- 단백질-DNA 또는 단백질-RNA 상호작용의 검출, 예를 들면 전사 또는 번역에 관련된 단백질의 조사;

- 동일한 상호작용 과정에 관련된 상이한 세포 유형에 대한 항체를 통한 세포-세포 상호작용의 평가.

본원에 개시된 방법은 조직 절편 및 도말 표본에서의 용도를 위한 여러 이점을 갖는다:

- 다른 면역조직화학적 염색과 평행한 적용

- 스플릿-신호 FISH와의 조합: DNA 수준(융합 유전자) 및 단백질 수준(융합 단백질)에서의 발암 사건의 검출.

본 발명의 방법이 세포내 융합 단백질 또는 분자 복합체의 존재를 검출하는데 세포 일체성의 혼란, 예를 들면 세포 용균물의 제조를 요구하지 않는다는 점이 매우 중요하다. 세포의 형태 일체성의 보존은 예를 들면 유동 세포측정기 또는 형광 현미경에 의한 단일 세포 수준에서의 분석을 허용한다. 유동 세포측정기에 의한 FRET 신호의 검출은 이종 모집단에서 특정한 개별적인 세포의 신속한 다변수 분석을 수행하는 능력을 제공한다. 유동 세포측정기의 주된 이점은 이것이 정량적인 자료를 직접 제공하고, 매우 빠르다(결과가 몇시간 내에 수득될 수 있다)는 점이다.

본 발명에서 제공된 방법은 단일 세포 수준에서 융합 단백질 또는 상호작용 분자의 검출을 허용한다. 물질의 삼투성 및 형태의 보존성을 수득하도록 세포를 포함하는 시료가 처리될 수 있다. 바람직한 처리는 항체와 같은 프로브가 가장 효율적인 정도로 투과할 수 있게 할 뿐 아니라 세포 내부의 세포 매트릭스와 단백질의 형태 일체성을 고정시키고 보존시키는 것이다.

예를 들면 세포 표면에서 또는 세포 용균물에서 융합 단백질 또는 상호작용 단백질의 존재를 검출하는 데에만 본질적으로 적용될 수 있는 "포획/검출" 항체 방법과는 다르게, 본 발명의 방법은 면역표현형 특징을 통해 세포의 혼합물에 존재하는 세포의 부분 집합의 통문(gating)을 허용한다. 결론적으로, 정상 세포의 큰 바탕값 중에서 드문 악성 세포 모집단의 검출을 허용하는 방법이 본원에 제공된다. 이는 치료 효율성의 평가를 위해 치료 동안 또는 치료 후에 미세 잔존 질환(MRD)을 검출하는 경우에서와 같은 낮은 빈도의 융합-양성 세포를 검출하는데 특히 유리하다. 바람직한 양태에서, 제공된 방법은 단일 세포 수준에서 융합 단백질의 존재를 검출하기 위해 단일 세포를 확인하고/하거나 단리하기 위한 다변수 유동 세포측정을 포함한다. 제공된 방법을 실시하는데 필요한 모든 것은 유동 세포측정 장치이다. 중요한 점은, 방법이 당업자에 의해 일상적인 실험실에서 수행될 수 있다는 것이다.

다양한 유형의 암에서 수백 개 이상의 상이한 융합 유전자 및 융합 단백질이 개시되었다. 말한 바와 같이, 제공된 방법은 단일 세포 수준에서 정상 단백질과 비정상적인 융합 단백질의 존재를 구별하는 것을 허용한다. 이론적으로, 융합 단백질의 2개의 다른 도메인을 인식하는 2개의 항체는 융합 유전자 대신에 정상 유전자에서 유래된 정상 단백질 상의 도메인에 결합함으로써 바탕값 염색을 야기할 수 있다. 그러나, 일부 경우, 2개의 정상 단백질중 하나만이 세포 표면 및/또는 세포간 마커에 의해 한정된 바와 같은 표적 세포 모집단에서 검출가능한 발현 수준에 도달한다.

또한, 정상 단백질 및 융합 단백질은 종종 이들의 세포내 발현 패턴이 상이하고, 종종 결과적으로 서로 다르게 세포 이하 국소화된다. 이는 2개의 상이한 정상 단백질이 동시에 동일한 세포내에 위치하는 경우가 좀처럼 유의한 수준으로 발생하지 않는다는 것을 의미한다. 특히, FRET 신호에 충분한 프로브의 동시적 병치는 정상 세포에서는 설령 발생한다고 하더라도 매우 드물 것이다.

제공된 방법은 세포를 포함하는 시료를 제공하고, 이에 의해 시료가 선택적으로 고정되고 투과되는 단계를 포함한다. 시료는 생물학적 시료에서 수득된 1차 세포를 포함할 수 있다. 생물학적 시료는 혈액, 혈청, 뇨, 골수, 뇌척수액(CSF), 침을 포함하는 체액 시료일 수 있다. 이는 또한 조직 시료, 조직 균질화물일 수 있다. 시료는 배양된 세포를 포함하고, 이는 배양된 1차 세포, 예를 들면 림프절 생검에서 수득된 종양 세포일 수 있다. 또한, 시료는 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(American Type Culture Collection: ATCC; 온라인 카탈로그의 경우 www.atcc.org) 또는 저먼 콜렉션 오브 마이크로오가니즘즈 앤드 셀 컬쳐스(German Collection of Microorganisms and Cell Cultures: DSMZ; 온라인 카탈로그의 경우 www.dsmz.de)와 같은 다수의 공급원에서 수득될 수 있는 확립된 실험실 세포주, 예를 들면 K562, KASUMI-1, REH 또는 CEM 세포주로부터 나온 배양된 세포를 포함할 수 있다. 제공된 방법은 세포 내에서 재조합 융합 단백질 뿐 아니라 내인성 융합 단백질의 존재를 검출하는데 적합하다. 제공된 방법은 또한 세포에서 재조합 단백질 및/또는 내인성 분자 사이의 상호작용을 검출하는데 적합하다.

세포의 현탁액을 포함하는 시료를 분석하는 경우, 흥미있는 분자가 프로브에 충분히 접근가능한지를 보증하기 위해서, 물질의 형태 및 투과성을 보존할 수 있도록 시료를 처리하는 것이 바람직하다. 처리 유형은 사용된 고정제, 고정 정도 및 흥미있는 분자의 유형과 성질과 같은 여러 인자에 의존할 것이다. 고정은 포름알데하이드와 같은 고정제를 이용하여 수행될 수 있다.

1차 세포의 검출을 위해서, 흥미있는 표적 세포 모집단을 한정하는 추가의 마커를 이용하는 것이 특히 유리하다. 감염성 질환에서의 다수의 중요한 생물학적 용도, MRD 검출 및 모니터링, 및 유전자 치료는 전형적으로 다른 세포의 큰 "바탕값"으로부터 희귀 세포(예를 들면 조혈 줄기/전구 세포)의 분석 및 단리를 요구한다. 본 발명의 한 양태에서, 방법은 하나 이상의 세포 마커, 예를 들면 세포 표면 마커 또는 세포내 마커를 위해 시료를 염색하여 세포의 혼합물 내에서 표적 세포 모집단을 한정하는 단계를 포함하며, 이는 상기 시료를 상기 마커에 선택적으로 결합할 수 있는 화합물과 접촉시키는 단계를 포함한다. 바람직한 양태에서, 이런 화합물에는 형광 염료가 직접 태깅(tagged)되어 있다. 적합한 화합물은 형광 라벨링된 항체 또는 이와 기능적으로 등가인 결합 절편을 포함한다. 또한, 염료-컨쥬게이트된 2차 시약(형광 라벨링된 2차 항체)을 이용하여 검출될 수 있는 세포 마커에 선택적으로 결합할 수 있는 화합물을 이용할 수 있다. 세포 마커는 세포의 혼합물에서 세포의 아집단을 구별하는데 이용될 수 있는 임의의 종류의 세포내 또는 막-결합된 마커를 포함한다. 세포의 혼합물은 살아있는 세포를 포함한다. 이는 또한 투과성 및/또는 고정된 세포를 포함한다. 세포 마커는 분화 클러스터(cluster of differentiation: CD) 항원일 수 있다. CD 마커는 모노클론 항체와 구별될 수 있는, 특히 조혈 세포의 세포 표면 분자이다. 조혈 세포는 흉선 세포, 수지상 세포, 랑게르한스 세포, 호중구, 호산구, 배 중심 B 세포, 여포성 수지상 세포, 혈장 세포 및 골수 세포를 포함한다. 예를 들면 적합한 세포 마커는 CD1, CD3, CD4, CD8, CD10, CD19, CD20, CD33, CD34 및 CD117을 포함한다. 다수의 인간 CD 마커에 대한 모노클론 항체는 다양한 공급원, 예를 들면 미국 베이포트 소재의 안셀 이뮤놀로지 리서치 프로덕츠(Ancell Immunology Research Products) 또는 BD 바이오사이언시즈(BD Biosciences)로부터 수득될 수 있다. 종종, CD10-PE 또는 CD19-FITC와 같이 선택된 형광색소와 직접 컨쥬게이트를 형성한 항체가 이용가능하고, 이는 본 발명에 따른 방법을 실시하는데 있어 명확하게 바람직한 선택이다.

바람직한 양태에서, 다변수 유동 세포측정/세포 분류 기법을 이용하여 희귀한 단일 세포를 확인 및/또는 단리하고, 흥미있는 융합 단백질의 존재 또는 부재에 의해 또는 상호작용 분자의 확인에 의해 이들 세포를 추가로 특징화하는 방법이 제공된다. 이런 방법은 면역계 발전, 감염성 질환, 암 및 유전자 치료에서의 다수의 중요한 문제점들에 적용하기에 특히 적합하다. 전형적으로, 세포 시료를 프로브 세트로 염색하기 전에, 표적 세포 모집단을 한정하기 위해 표준 공정에 따라 하나 이상의 관련된 염료-컨쥬게이트된 항체를 이용하여 세포를 라벨링한다. 염료의 선택은 FRET 염료에 추가하여 면역표현형을 위한 2 또는 3개 염료의 이용을 목표로 해야만 하지만, 이로만 한정되어서는 안된다. 예를 들면 본 발명에 따른 FRET 프로브는 다른 염료와 조합되어 면역표현형 특성을 통한 백혈구 부분집합 통문을 매개할 수 있고, 예를 들면, CD10, CD19 및 CD20은 골수에서 전구체-B-세포의 부분 집단을 정확하게 한정하거나, CD1, CD4 및 CD8은 흉선세포의 부분 집단을 한정하거나, CD34 및/또는 CD117은 줄기/전구 세포 모집단을 확인한다. 본원의 상세한 설명에 도시된 바와 같이, 본 발명은 세포의 매우 작은 부분집합에서 세포내 융합 단백질의 검출, 즉, 암 치료의 효과를 평가하는데 필수적인 MRD의 검출을 허용하는 방법을 제공한다.

실시예

하기 올리고뉴클레오타이드를 표준 방법에 따라 합성하였다.

반응기 올리고뉴클레오타이드 A: 연결기 CGA TTC TAT G 플루오레세인

반응기 올리고뉴클레오타이드 B: 알렉사(Alexa)-TGT ACC TTG A-연결기

가교 올리고뉴클레오타이드 C: TCA DGG TAC A Gly Gly CAT AGA ATC G

서로 다른 올리고뉴클레오타이드의 10pmol PNA를 200㎕의 포스페이트 완충액(pH 7.2)과 혼합하고, 이들의 형광을 측정하였다. PNA 올리고뉴클레오타이드 C가 첨가되면, 혼성화는 5분이내에 종결되었다. 결과는 도 4에 나타나 있다.

장치: 퍼킨 엘머(Perkin Elmer) LS 55

여기 파장: 플루오레세인: 485nm, 알렉사 546: 546nm

여기 슬릿: 5nm, 방출 슬릿: 10nm.

SEQUENCE LISTING <110> Erasmus University Medical Center Rotterdam <120> Improved FRET-probes and use thereof <130> P77170PC00 <140> PCT/NL2008/050737 <141> 2008-11-21 <150> US 61/004,112 <151> 2007-11-21 <160> 2 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> reactive group oligonucleotide A <400> 1 cgattctatg 10 <210> 2 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> reactive group oligonucleotide B <400> 2 tgtaccttga 10

Claims

적어도 제 1 분자 프로브 및 제 2 분자 프로브의 세트로서, 각각의 프로브가 이의 결합 도메인을 통해 흥미있는 분자에 특이적으로 결합할 수 있고, 각각의 프로브에 상기 적어도 제 1 분자 프로브와 제 2 분자 프로브의 병치를 허용하는 반응기가 추가로 제공되어 있고, 상기 반응기에 컨쥬게이트된 염료가 각각의 프로브에 제공되어 상기 염료가 함께 에너지 전달을 허용하며, 상기 반응기는 프로브가 흥미있는 분자에 결합된 후에 병치된 프로브의 공간적 조직화를 조절하는데 이용될 수 있게 남아있고, 상기 반응기가 올리고뉴클레오타이드를 포함하고, 상기 제 1 분자 프로브의 반응기가 제 2 분자 프로브의 반응기와 직접적으로 반응하지 않고, 상기 세트가 상기 프로브의 밀접한 병치를 매개하고/하거나 개선하기 위해 2개 이상의 반응기를 가교할 수 있는 가교 물질을 포함하고, 제 1 분자 프로브와 제 2 분자 프로브 양쪽의 반응기들, 상기 가교 물질, 또는 이들 모두가 펩타이드 핵산(PNA) 다량체(oligomer)를 포함하는, 세트.
제 1 항에 있어서,
제 1 분자 프로브 및 제 2 분자 프로브의 올리고뉴클레오타이드 반응기가 독립적으로 데옥시라이보뉴클레오타이드(DNA) 다량체, 옥시라이보뉴클레오타이드(RNA) 다량체, 록킹된 핵산(LNA), 및 펩타이드 핵산(PNA) 다량체로 구성된 군에서 선택되는 세트.
삭제
제 1 항에 있어서,
각각의 프로브에 다수의 반응기가 제공되어 있는 세트.
제 1 항에 있어서,
프로브가 항체 또는 이와 기능적으로 등가인 결합 절편인 세트.
제 1 항에 있어서,
염료중 하나 이상이 형광색소인 세트.
제 6 항에 있어서,
형광색소가 플루오레세인 아이소티오시아네이트(FITC), 테트라메틸로다민 아이소티오시아네이트(TRITC), 텍사스 레드(Texas Red: TR), R-피코에리트린(R-PE), 알로피코시아닌(APC), 피코빌리프로테인의 부류, 시아닌 염료, 알렉사 플루오르(Alexa Fluor) 염료, 플루오레세인, 라이트사이클러(LightCycler) 염료, 이들 형광색소의 탠덤 컨쥬게이트, 및 양자 도트 염료로 구성된 군에서 선택되는 세트.
각각의 프로브를 적합한 염료 및 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 반응기와 접촉시켜, 상기 프로브, 상기 염료 및 상기 반응기 사이에 컨쥬게이트를 형성하는 단계를 포함하되, 상기 염료가 반응기에 컨쥬게이트되는, 제 1 항, 제 2 항 및 제 4 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 따른 프로브 세트를 제공하는 방법.
삭제
- 제 1 항, 제 2 항 및 제 4 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 따른 프로브 세트를 제공하는 단계;
- 세포를 포함하는 시료를 제공하는 단계;
- 상기 시료를 프로브 세트와 접촉시키는 단계;
- 융합 단백질 상에서 상기 프로브들이 병치되는 것을 허용하는 조건 하에서
- 상기 프로브를 제 1 분자 프로브의 반응기의 적어도 일부 및 제 2 분자 프로브의 반응기의 적어도 일부에 특이적으로 결합할 수 있는 핵산 서열을 포함하는 가교 물질과 접촉시키는 단계; 및
- 형광 공명 에너지 전달(FRET)을 통해 상기 프로브의 병치를 검출하여 융합 단백질의 존재를 측정하는 단계를 포함하는,
각각의 프로브가 융합 단백질의 융합 영역의 반대쪽 측면에 위치한 결합 부위를 인식할 수 있는 적어도 제 1 분자 프로브 및 제 2 분자 프로브의 세트를 이용하여, 세포 내에서 융합 단백질의 존재를 검출하는 방법.
제 10 항에 있어서,
융합 단백질이 종양-특이적 융합 단백질인 방법.
- 제 1 항, 제 2 항 및 제 4 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 따른 프로브 세트를 제공하는 단계;
- 세포를 포함하는 시료를 제공하는 단계;
- 상호작용 분자 상에 상기 프로브들이 병치되는 것을 허용하는 조건 하에서 상기 시료를 프로브 세트와 접촉시키는 단계;
- 상기 프로브를 제 1 분자 프로브의 반응기의 적어도 일부 및 제 2 분자 프로브의 반응기의 적어도 일부에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오타이드 서열을 포함하는 가교 물질과 접촉시키는 단계; 및
- 형광 공명 에너지 전달(FRET)을 통해 상기 프로브의 병치를 검출하여 상호작용 분자를 검출하는 단계를 포함하는,
각각의 프로브가 흥미있는 서로 다른 상호작용 분자에 특이적으로 결합할 수 있는 결합 도메인을 포함하는 적어도 제 1 분자 프로브 및 제 2 분자 프로브의 세트를 이용하여, 세포 내에서 2개 이상의 상호작용 분자를 검출하는 방법.
제 12 항에 있어서,
상호작용 분자중 하나 이상이 단백질 물질, 핵산, 지질 분자 또는 탄수화물인 방법.
제 10 항에 있어서,
반응기 및 가교 물질이 DNA, RNA, LNA 또는 PNA 서열을 포함하는 방법.
제 10 항에 있어서,
시료를 세포 마커에 선택적으로 결합할 수 있는 화합물과 접촉시키는 단계를 포함하며, 여기서 세포 마커가 분화 클러스터(CD) 항원인, 하나 이상의 세포 마커에 대해 시료를 염색시켜 표적 세포 모집단을 한정함을 포함하는, 방법.
제 10 항에 있어서,
유동 세포측정기를 이용한 단일 세포 수준에서의 FRET 검출을 포함하는 방법.
제 1 분자 프로브의 반응기의 적어도 일부 및 제 2 분자 프로브의 반응기의 적어도 일부에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오타이드 서열을 포함하는 가교 물질을 추가로 포함하는, 제 1 항, 제 2 항 및 제 4 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항의 프로브 세트를 포함하는 진단 키트.
제 17 항에 있어서,
가교 물질이 DNA, RNA, LNA 또는 PNA 서열인 진단 키트.
제 1 항, 제 2 항 및 제 4 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서,
질병의 치료 전, 치료 동안 및 치료 후에 치료의 유효성을 평가하거나, 질병을 진단, 분류, 또는 진단 및 분류하기 위해 사용되는 세트.
제 12 항에 있어서,
상기 반응기 및 가교 물질이 DNA, RNA, LNA 또는 PNA 서열을 포함하는 방법.
제 12 항에 있어서,
시료를 세포 마커에 선택적으로 결합할 수 있는 화합물과 접촉시키는 단계를 포함하며, 여기서 세포 마커가 분화 클러스터(CD) 항원인, 하나 이상의 세포 마커에 대해 시료를 염색시켜 표적 세포 모집단을 한정함을 포함하는, 방법.
제 12 항에 있어서,
유동 세포측정기를 이용한 단일 세포 수준에서의 FRET 검출을 포함하는 방법.