KR101606634B1

KR101606634B1 - Ｍａａ 대량 생산 방법

Info

Publication number: KR101606634B1
Application number: KR1020140064759A
Authority: KR
Inventors: 모상현; 전진영; 정유철; 이정훈; 김형식; 서효현; 조문진; 송미영; 모지홍; 최수용
Original assignee: 주식회사 바이오에프디엔씨
Priority date: 2014-05-28
Filing date: 2014-05-28
Publication date: 2016-03-28
Also published as: KR20150137244A

Abstract

본 발명은 Glut-1 유전자로 형질전환된 형질전환체 및 그 배양방법에 관한 것으로, 특히, Glut-1 유전자로 형질전환된 클라미도모나스 해들레이이 및 상기 형질전환체의 바이오매스를 획기적으로 증가시켜, MAA 대량 생산에 활용할 수 있는 배양방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 클라미도모나스 헤드레이이 형질전환체는 Glut-1 유전자로 형질전환된 미세조류로써, 이러한 형질전환체의 바이오매스를 증가시키는 배양 방법을 통하여, 시노린, 포르피라와 같은 MAA 대량 생산에도 유용하게 활용할 수 있다.

Description

ＭＡＡ 대량 생산 방법{Mass Production Method of Mycosporine-like amino acid}

본 발명은 미세조류 클라미도모나스 (Chlamydomonas)에 Glut-1 유전자를 형질전환한 형질전환체로부터 MAAs(Mycosporine-like amino acids) 종류인 Shinorine과 Porphyra를 대량생산하는 방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 Chlamydomonas hedleyi 배양조건을 확립하여 Shinorine과 Porpyra와 같은 MAAs를 산업적으로 이용가능하도록 대량으로 생산할 수 있는 방법에 관한 것이다.

일반인들에게 잘 알려진 미역, 다시마, 김등의 해조류뿐만 아니라 클로렐라와 같은 단일 세포로 구성된 미세조류를 포괄적으로 연구하는 학문을 조류학(藻類學; Phycology)이라한다. 조류학은 미역, 다시마, 파래 등의 해조류(seaweed)를 포함하는 모든 조류(藻類, algae)에 관한 학문이나 미세조류는 선태식물, 양치식물이나 관속식물 이외의 광합성 식물을 대상으로 하는 생물 중에 해조류를 제외하고 현미경적 크기의 생물만을 의미한다.

미세조류는 미생물계에 속하나 분해자의 역할이 아니라 대기 중에 이산화탄소를 흡수하여 광에너지의 도움으로 식물처럼 광합성을 하여 유기물질을 합성하는 독립영양을 하는 생산자 역할을 한다. 반면에 약 35억년 전에 처음으로 지구상에 출현한 남세균은 광합성을 하면서 세균처럼 질소고정을 하는 원핵세포 생물로서 미생물 중에 세균에 포함된다.

미세조류는 진핵세포로 구성되어 식물의 생리적 기작과 유사하나 고등식물보다 생물주기가 짧고, 세포분열 능력이 띄어나 식물의 광합성 원리 연구를 위한 실험시료로 널리 이용되고 있다.

미세조류는 엽록소를 가지고 있는 광합성 생물로서 식물과 더불어 지구 생태계의 유기물 합성자로서의 역할을 담당하고 있으며, 다른 미생물들과 같이 식량과 대체에너지 및 고부가 가치의 의료용 물질 등 산업적으로 유용한 물질을 생산하고, 환경문제 해결에도 기여하는 등 긍정적인 면과 함께 부영양화현상처럼 수계 수질을 악화시키는 부정적인 측면에서 인류 사회 및 경제 발전에 많은 영향을 주고 있다.

오늘날은 생명공학기술의 급속한 발전으로 미세조류의 산업적 이용가치가 높아지고 있다. 각자 고유한 유전적 형질을 지니고 있으며, 인간에게 유용한 식량자원으로서 뿐만 아니라 다양한 기능성 생리활성물질 (항산화제, 항암제, 면역조절제, 항피부노화제 등), 기능성 식품 및 향장 소재, 친환경소재 등을 제공하고 있다.

미세조류의 생명공학적 연구는 대체에너지원, 건강기능성식품, 건강보조식품, 피부 화장료, 피부 외용제, 보습제, 방향성 식물 활성제, 수산양식용 사료, 의약품 개발을 위한 천연화합물 분석, 그외 고부가가치를 지니는 특정 색소, 탄수화물, 아미노산, 불포화지방 생산과 오폐수처리, 비료, 에너지를 생산하기 위한 미세조류의 대량생산을 위한 광생물반응기와 발효조 배양법에 의한 연구개발을 위한 생물공학적 연구가 광범위하게 진행되고 있다. 특히 미세조류의 세포밀도가 다른 미생물에 비해 상대적으로 낮아 배양 공정의 경제적 효율성의 확보를 위해 환경산업과 연계되어 폐자원(축산폐수, 산업폐기물 등)을 이용하여 대량 배양에 소요되는 경비 절감을 유도하여 생산성을 높이는 연구개발도 진행 중이다.

미세조류의 단백질, 비타민, 미네랄, 불포화지방산, 다당류 등 다양한 영양성분과 각종 유용물질인 생리활성물질을 이용한 면역증강(항균, 항암 예방효과), 세포부활, 혈압강화, 간의 지방질 감소 및 간기능 회복 등의 효과에 대한 연구와 뇌졸증과 백내장 개선, 예방 및 치료제, 리파아제 활성 촉진제 등의 연구와 광합성 색소를 이용한 항산화제, 여드름 예방 치료제, 항염효과, 항세균, 항진균, 항바이러스, 신경활성, 림프성 백혈병, 혈장 콜레스테롤 저하를 유도하여 고혈압과 심장병을 예방하는 기능성 탐색을 위한 활성 연구가 활발히 진행되고 있다.

미세조류 바이오소재 기술을 활용한 산업분야는 1. 미세조류를 이용해서 수질오염원이 되는 질소와 인(최근에는 물속의 방사선 물질까지 흡수하는 생물로서 확인됨)을 제거하여 수질을 정화하고, 수질 생태계를 복원하면서 이때 대량생산된 바이오매스를 바이오에너지, 비료 등으로 재활용하는 사업 분야, 2. 미세조류의 생리활성 물질을 고농도로 유도하여 수율이 높은 바이오소재로 개발하여 건강식품, 화장품, 약품소재를 활용하여 제품화 할 수 있는 사업분야, 3. 미세조류를 지표생물로 활용하여 수질의 오염 정도와 민물과 바다의 환경의 건강성을 분석하고 예측할 수 있는 환경영향평가 등에 활용되는 지표생물로 활용 된다(김과 김 1999).

특히, 클로렐라(Chlorella)를 비롯한 스피루리나(Spirulina), 두나리엘라 (Dunaliella), 헤마토코크스(Haematococcus)와 같은 미세조류를 이용한 건강 식품과 미세조류에서 유래되는 항산화제인 lutein, astaxanthin, cantaxanthin 등은 이미 선진 외국에서 개발 연구되어 항산화 효과가 기존의 vit E (토코페롤), beta-carotene 보다 월등하다는 임상보고가 잇따라 발표되고 있으며 astaxanthin의 경우는 2500 $/㎏의 고부가가치의 상품으로서 미국에서만도 매출 규모가 수십억 $ 이상을 기록하고 있다.

미세조류는 첫째) 산업화가 용이하고, 둘째) 기능성 생리활성물질의 체내 부존도가 상대적으로 풍부하고, 셋째) 상대적 부가가치가 높은 광합성 미생물이다. 또한 유전자 재조합 기술이 없이도 배양조건에 따라 부가가치 산물을 최적화하여 대량생산을 유도할 수 있는 특징을 가지고 있다

미세조류로부터 바이오디젤 생산의 주요 공정은 ①미세조류 탐색 및 기능강화(균주 개량), ② 미세조류의 고밀도 대량배양, ③ 미세조류의 효율적 수확, ④미세조류 바이오매스로부터 유용물질 및 바이오연료생산으로 구분해 볼 수 있다. 특히, 미세조류를 고밀도 대량배양하는 과정은 산업적으로 중요하며, 이러한 미세조류의 대량배양을 통하여 바이오매스로부터 의약용 물질, 기능성 식품, 수산양식용 사료, 동물사료 등의 고부가 유용물질을 생산하여 경제적 가치를 창출할 수 있다. 즉, 미세조류 생명공학은 생물산업의 활성화와 함께 이산화탄소의 저감 등 환경산업의 발전을 도모할 수 있는 유망한 미래 산업으로서 앞으로 큰 발전이 기대된다.

이러한 미세조류를 이용한 종래의 기술로는 형질전환된 미세조류를 생산하는 방법(특허문헌 1) 에 관한 기술, 형질전환된 미세조류를 이용하여 외래 단백질을 생산하는 방법 (특허문헌 2) 에 관한 기술들이 존재하나, 본 발명에서와 같이 바이오매스 증가를 통한 MAA 대량 생산을 목적으로 특정 유전자가 삽입된 미세조류를 제작하는 경우는 거의 전무한 실정이다.

특허문헌 1: 제10-2000-41692호 특허문헌 2: 제10-2000-75076호

본 발명자들은 미세조류, 클라미도모나스 해들레이이(Chlamydomonas hedleyi)에 Glucose transporter 1(Glut-1) 유전자를 유전학적으로 도입하여 형질전환체를 이용하여 글루코스와 NH₄Cl이 함유된 배지에서의 배양을 통해 바이오매스 증가와 함께 MAA를 획기적으로 대량 생산할 수 있는 배양 조건을 확립하고, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은, 총 배양배지에 대하여, K₂HPO₄, KH₂PO₄, MgSO₄·7H₂O, CaCl₂·2H₂O, C₄H₁₁NO₃, C₁₀H₁₆N₂O₈, BO₃H₃, ZnSO₄·7H₂O, MnCl₂·4H₂O, FeSO₄·7H₂O, CoCl₂·6H₂O, CuSO₄·5H₂O, MO₇O₂₄(NH₄)₆·4H₂O, Glucose, NH₄Cl 을 함유하는 MAA(myscoporine-like amino acids) 생산용 미세조류 배양 배지 조성물을 제공하는데 있다.

일 양태로, 본 발명의 목적은, 1L 총 배양배지에 대하여,

K₂HPO₄, 0.0972~0.1188; KH₂PO₄, 0.0504~0.0616; MgSO₄·7H₂O, 0.09~0.11; CaCl₂·2H₂O, 0.045~0.055; C₄H₁₁NO₃, 2.1798~2.6642; C₁₀H₁₆N₂O₈, 0.045~0.055; BO₃H₃, 0.01026~0.01254; ZnSO₄·7H₂O, 0.0198~0.0242; MnCl₂·4H₂O, 0.004554~0.005566; FeSO₄·7H₂O, 0.004491~0.005489; CoCl₂·6H₂O, 0.001449~0.001771; CuSO₄·5H₂O, 0.001503~0.001837; MO₇O₂₄(NH₄)₆·4H₂O, 0.00099~0.00121; Glucose 2~25g, 바람직하게는, 5~15, 5~10, 2~10g NH₄Cl 50~600 μΜ 바람직하게는, 100~500, 100~400 μΜ를 포함하는 것을 특징으로 하는 MAA(myscoporine-like amino acids) 생산용 미세 조류 배양 배지 조성물을 제공하는데 있다.

본 발명에 있어서, 상기 미세조류 배양 배지는 클라미도모나스(Chlamydomonas) 배양용인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 클라미도모나스는 클라미도모나스 해들레이이(Chlamydomonas hedleyi)이고, 이러한 클라미도모나스 해들레이이는 glut-1(Glucose transporter 1) 유전자로 형질전환된 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 MAA는 시노린(shinorine) 또는 포르피린(porphyrin, 포르피라 porphyra)인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명의 목적은 또한, 총 배양배지에 대하여, K₂HPO₄, KH₂PO₄, MgSO₄·7H₂O, CaCl₂·2H₂O, C₄H₁₁NO₃, C₁₀H₁₆N₂O₈, BO₃H₃, ZnSO₄·7H₂O, MnCl₂·4H₂O, FeSO₄·7H₂O, CoCl₂·6H₂O, CuSO₄·5H₂O, MO₇O₂₄(NH₄)₆·4H₂O, Glucose, NH₄Cl 을 함유하는 배지 조성물에서 glut-1 유전자로 형질전환된 클라미도모나스 해들레이이를 암조건에서 배양하는 것을 특징으로 하는 MAA 생산 방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 또한, 1g 총 배양배지에 대하여,

K₂HPO₄, 0.108; KH₂PO₄, 0.056; MgSO₄·7H₂O, 0.1; CaCl₂?2H₂O, 0.05; C₄H₁₁NO₃, 2.422; C₁₀H₁₆N₂O₈, 0.05; BO₃H₃, 0.0114; ZnSO₄·7H₂O, 0.022; MnCl₂·4H₂O, 0.00506; FeSO₄·7H₂O, 0.00499; CoCl₂·6H₂O, 0.00161; CuSO₄·5H₂O, 0.00167;MO₇O₂₄(NH₄)₆·4H₂O, 0.0011; Glucose 2~25g, 50~600 μΜ NH₄Cl 를 포함하는 배양 배지에 glut-1 유전자로 형질전환된 클라미도모나스 해들레이이를 암조건에서 배양하는 것을 특징으로 하는 MAA의 제조 방법을 제공하는데 있다.

본 발명에 있어서, 상기 미세조류 배양 배지는 클라미도모나스 해들레이이(Chlamydomonas hedleyi) 배양용인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 클라미도모나스 해들레이이는 glut-1 유전자로 형질전환된 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 MAA는 시노린(shinorine) 또는 포르피린(porphyrin)인 것을 특징으로 할수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 방법에 있어서, Rf(Radiofrequency)를 처리하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 Glut-1 유전자는 서열번호 1의 염기서열을 가지는 것을 특징으로 하는 클라미도모나스 해들레이이일 수 있다.

본 발명은, 총 배양배지에 대하여, K₂HPO₄, KH₂PO₄, MgSO₄·7H₂O, CaCl₂·2H₂O, C₄H₁₁NO₃, C₁₀H₁₆N₂O₈, BO₃H₃, ZnSO₄·7H₂O, MnCl₂·4H₂O, FeSO₄·7H₂O, CoCl₂·6H₂O, CuSO₄·5H₂O, MO₇O₂₄(NH₄)₆·4H₂O, Glucose, NH₄Cl 을 함유하는 MAA(myscoporine-like amino acids) 생산용 미세조류 배양 배지 조성물을 제공한다.

본 발명은, 1L 총 배양배지에 대하여,

K₂HPO₄, 0.0972~0.1188; KH₂PO₄, 0.0504~0.0616; MgSO₄·7H₂O, 0.09~0.11; CaCl₂·2H₂O, 0.045~0.055; C₄H₁₁NO₃, 2.1798~2.6642; C₁₀H₁₆N₂O₈, 0.045~0.055; BO₃H₃, 0.01026~0.01254; ZnSO₄·7H₂O, 0.0198~0.0242; MnCl₂·4H₂O, 0.004554~0.005566; FeSO₄·7H₂O, 0.004491~0.005489; CoCl₂·6H₂O, 0.001449~0.001771; CuSO₄·5H₂O, 0.001503~0.001837; MO₇O₂₄(NH₄)₆·4H₂O, 0.00099~0.00121; Glucose 2~25, 바람직하게는, 5~15, 2~10, NH₄Cl 50~600 μΜ 바람직하게는, 100~500 μΜ를 포함하는 것을 특징으로 하는 MAA(myscoporine-like amino acids) 생산용 미세 조류 배양 배지 조성물을 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 미세조류 배양 배지는 클라미도모나스 배양용인 것을 특징으로 하며, 일 예시로써, 클라미도모나스 해들레이이(Chlamydomonas hedleyi) 배양용인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 클라미도모나스 해들레이이는 glut-1(Glucose transporter 1) 유전자로 형질전환된 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 MAA는 시노린(shinorine) 또는 포르피린(porphyrin)인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명은 또한, 총 배양배지에 대하여, K₂HPO₄, KH₂PO₄, MgSO₄·7H₂O, CaCl₂·2H₂O, C₄H₁₁NO₃, C₁₀H₁₆N₂O₈, BO₃H₃, ZnSO₄·7H₂O, MnCl₂·4H₂O, FeSO₄·7H₂O, CoCl₂·6H₂O, CuSO₄·5H₂O, MO₇O₂₄(NH₄)₆·4H₂O, Glucose, NH₄Cl 을 함유하는 배지 조성물에서 glut-1 유전자로 형질전환된 클라미도모나스 해들레이이를 암조건에서 배양하는 것을 특징으로 하는 MAA 생산 방법을 제공한다.

본 발명은 또한, 1g 총 배양배지에 대하여,

K₂HPO₄, 0.108; KH₂PO₄, 0.056; MgSO₄·7H₂O, 0.1; CaCl₂·2H₂O, 0.05; C₄H₁₁NO₃, 2.422; C₁₀H₁₆N₂O₈, 0.05; BO₃H₃, 0.0114; ZnSO₄·7H₂O, 0.022; MnCl₂·4H₂O, 0.00506; FeSO₄·7H₂O, 0.00499; CoCl₂·6H₂O, 0.00161; CuSO₄·5H₂O, 0.00167;MO₇O₂₄(NH₄)₆·4H₂O, 0.0011; Glucose 2~25g, 100~400 μΜ NH₄Cl 를 포함하는 배양 배지에 glut-1 유전자로 형질전환된 클라미도모나스 해들레이이를 암조건에서 배양하는 것을 특징으로 하는 MAA의 제조 방법을 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 배양방법에 있어서, Rf(Radiofrequency)를 처리하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 따른 클라미도모나스 해들레이이 형질전환체는 Glut-1 유전자로 형질전환된 미세조류로써, 이러한 형질전환체의 바이오매스를 증가시키는 배양 방법을 통하여, 시노린, 포르피라와 같은 MAA 대량 생산에도 유용하게 활용할 수 있다.

도 1은 본 발명에서 이용된 pCAMBIA 1302의 개열지도(A), 본 발명에서 이용된 프라이머 서열들 (B), 실시예에 따른 Glut-1 클로닝 결과 (C), 헤그로마이신(hegromycin)을 이용한 형질전환체 선택적 발굴 결과(D)를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명에 따른 Glut-1 형질전환된 형질전환체의 형광 현미경 사진 (A 및 B)과 웨스턴 블랏 결과(C)이다.
도 3은 본 발명의 Glut-1 형질전환된 형질전환체의 5L bioreactor 배양 결과, Glucose 농도에 따른 생장곡선을 나타낸 그래프이다.
도 4는 본 발명의 Glut-1 형질전환된 형질전환체의 5L, 20L bioreactor 배양 결과, Glucose 농도에 따른 Biomass를 확인한 그래프이다.
도 5는 본 발명에 따른 Glut-1 형질전환된 형질전환체의 5L bioreactor 배양 결과, NH4Cl 농도에 따른 생장곡선을 나타낸 그래프이다.
도 6은 본 발명에 따른 Glut-1 형질전환된 형질전환체의 5L bioreactor 배양 결과, NH4Cl 농도에 따른 Biomass/MAA를 확인한 그래프이다.
도 7은 본 발명에 따른 Glut-1 형질전환된 형질전환체의 RF 처리에 따른 5L, 20L bioreactor 배양 결과, Biomass/MAA를 확인한 그래프이다.
도 8은 본 발명에 따른 Glut-1 형질전환된 형질전환체의 배양에 의해 생산된 MAA의 성분 분석 결과, 시노린, 포르피라를 HPLC 분석을 통해 확인한 그래프이다.

본 발명은, MAA 대량 생산, 특히, MAA 중에서도 시노린 및 포르피린의 대량 생산을 위한 배양배지 조성물 및 MAA 생산 방법에 관한 것이다.

일 관점에서, 본 발명은, 전체 배양 배지에 대하여, K₂HPO₄, KH₂PO₄, MgSO₄·7H₂O, CaCl₂·2H₂O, C₄H₁₁NO₃, C₁₀H₁₆N₂O₈, BO₃H₃, ZnSO₄·7H₂O, MnCl₂·4H₂O, FeSO₄·7H₂O, CoCl₂·6H₂O, CuSO₄·5H₂O, MO₇O₂₄(NH₄)₆·4H₂O, Glucose, NH₄Cl 을 함유하는 배지 조성물에 관한 것이다.

일 양태로, 본 발명은, 1L 총 배양배지에 대하여,

K₂HPO₄, 0.0972~0.1188; KH₂PO₄, 0.0504~0.0616; MgSO₄·7H₂O, 0.09~0.11; CaCl₂·2H₂O, 0.045~0.055; C₄H₁₁NO₃, 2.1798~2.6642; C₁₀H₁₆N₂O₈, 0.045~0.055; BO₃H₃, 0.01026~0.01254; ZnSO₄·7H₂O, 0.0198~0.0242; MnCl₂·4H₂O, 0.004554~0.005566; FeSO₄·7H₂O, 0.004491~0.005489; CoCl₂·6H₂O, 0.001449~0.001771; CuSO₄·5H₂O, 0.001503~0.001837; MO₇O₂₄(NH₄)₆·4H₂O, 0.00099~0.00121; Glucose 2~25, 바람직하게는, 5~15, 2~10, NH₄Cl 50~600 μΜ 바람직하게는, 100~500 μΜ를 포함하는 것을 특징으로 하는 MAA(myscoporine-like amino acids) 생산용 미세 조류 배양 배지 조성물에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 배양 배지는 macrounitrients(Nitrogen, Phosphorus, Silicon)로써, K₂HPO₄, KH₂PO₄ _,MgSO₄·7H₂O, CaCl₂·2H₂O, CuSO₄·5H₂O를 포함하며, 트레이스 금속(tract metals)인 ZnSO₄·7H₂O, MnCl₂·4H₂O, pH 버퍼로써 FeSO₄·7H₂O (Acidified Iron Solution)를 포함한다.

본 발명에 있어서, 상기 미세조류 배양 배지 조성물은, 특히, 클라미도모나스 (Chlamydomonas) 배양을 위한 배지 조성물로써, 이러한 클라미도모나스는 클라미도모나스과에 속하는 클라미도모나스속(Chlamydomonas) 녹조류의 총칭이다. 단세포로 크기는 10 ~ 30마이크로미터(㎛)이고, 공 모양 또는 계란 모양·유선형을 하고 있으며, 끝 부분에 모두 두 개가 있다. 세포막은 엷고 색소입자는 모양의 변화가 많다. 클라미도모나스는 광합성을 하기도 하고 세포 표면을 통해 영양소를 흡수하기도 한다.

이러한 클라미도모나스에는, 특히 바람직하게는, 클라미도모나스 해들레이이(Chlamydomonas hedleyi) 일 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 클라미도모나스 해들레이이는 glut-1 유전자로 형질전환된 것을 특징으로 할 수 있으며, 이에 대해서는 종래 알려진 유전학적 방법에 따라 형질전환하는 것을 특징으로 할 수 있으며, 구체적으로 상기 유전자는 서열번호 1의 염기서열을 가지며, glut-1 단백질 서열은 서열번호 2와 같다. 이러한 유전자는 실시예에 개시된 방법에 따라 형질전환된 미생물 제조과정을 거칠 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 MAA는 시노린(shinorine) 또는 포르피린(porphyrin)인 것을 특징으로 하는 조성물이다.

본 발명은 또 다른 관점에서, 본 발명은 또한, 총 배양배지에 대하여, K₂HPO₄, KH₂PO₄, MgSO₄·7H₂O, CaCl₂·2H₂O, C₄H₁₁NO₃, C₁₀H₁₆N₂O₈, BO₃H₃, ZnSO₄·7H₂O, MnCl₂·4H₂O, FeSO₄·7H₂O, CoCl₂·6H₂O, CuSO₄·5H₂O, MO₇O₂₄(NH₄)₆·4H₂O, Glucose, NH₄Cl 을 함유하는 배지 조성물에서 glut-1 유전자로 형질전환된 클라미도모나스 해들레이이를 암조건에서 배양하는 것을 특징으로 하는 MAA 생산 방법에 관한 것이다.

본 발명은 또한, 1g 총 배양배지에 대하여,

K₂HPO₄, 0.108; KH₂PO₄, 0.056; MgSO₄·7H₂O, 0.1; CaCl₂?2H₂O, 0.05; C₄H₁₁NO₃, 2.422; C₁₀H₁₆N₂O₈, 0.05; BO₃H₃, 0.0114; ZnSO₄·7H₂O, 0.022; MnCl₂·4H₂O, 0.00506; FeSO₄·7H₂O, 0.00499; CoCl₂·6H₂O, 0.00161; CuSO₄·5H₂O, 0.00167;MO₇O₂₄(NH₄)₆·4H₂O, 0.0011; Glucose 2~10g, 100~400 μΜ NH₄Cl 를 포함하는 배양 배지에 glut-1 유전자로 형질전환된 클라미도모나스 해들레이이를 암조건에서 배양하는 것을 특징으로 하는 MAA의 생산(제조) 방법에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 형질전환된 클라미도모나스 (클라미노모나스 해들레이이)의 배양 과정은 아래와 같다:

(1) 초기 접종

본 발명에 따른 상기 조성의 배양 배지에, 클로미도모나스 속 미세조류를 23℃, pH7.0에서 30일간 배양한다. 구체적으로, 배양에 사용되는 배지와 500ml 플라스크는 121℃에서 20분간 멸균하였고 Glut-1 유전자가 형질전환된 클라미도모나스 해들레이이 초기 접종농도는 5×10⁴ cells/ml로 500 ml 삼각플라스크(100ml 배지함유)에 접종하여 30일간 배양한다.

(2) Bioreactor 배양

5L 또는 20L 크기의 Bioreactor를 준비하여, 멸균된 공기가 공급되도록 하면서, 30일간 배양한다. 구체적으로, 풍선형 생물반응기(삼성과학)를 이용하여 동일한 조성의 액체 배지에서 온도 23℃, 공기공급량을 0.1vvm으로 일정하게 조절하며 30일 간격으로 배양하였다.

(3) Scale-up 배양

산업적 이용을 위해, 12kL 배지를 배양할 수 있는 25kL stirred-tank bioreactor에서 대량 배양한다. 배양 조건은 상기에서와 같은 배지 조성을 사용하고, aeration rate 200m³/min, 교반속도는 110 rpm을 유지한다.

(4) 유인제 처리

상기 (2) 또는 (2) 및 (3)의 배양 후, 상기 배양 조건을 이용하여, RF 발생장치가 연결된 생물반응기에서 Glut-1 유전자가 형질전환된 Chlamydomonas hedleyi를 배양한다. 5~15일째에 RF 발생장치를 이용하여 강도 (Intensity) 15~25 J/cm², 바람직하게는, 20 J/cm², 전류 (Current) 0.01~0.03 A, 바람직하게는, 0.02 A, 270 kHz ~ 300 kHz 에 노출시킬 수 있다. 바람직하게는, 배양 10일째, RF 발생장치를 이용하여 Intensity 20J/cm², Current 0.02 A, 270 kHz ~ 300 kHz 에 노출시킨다. 처리는 20~40분간격(가장 적합하게는, 약 30분 간격)으로 RF 처리와 휴식을 번갈아가며 2~5회, 바람직하게는, 3~4회/1일 수행을 할 수 있고, 이러한 방법으로 4일정도 처리할 수 있다.

따라서, 본 발명은 상기 배양방법에 있어서, 상기 클라미도모나스 해들레이이를 상기 배지 조성물에서 Rf(Radiofrequency)를 처리하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법을 특징으로 할 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

본 발명에 따른 클라미도모나스 해들레이이 형질전환체의 구축

1) pCAMBIA 1302내 Glut-1 유전자 클로닝

인간 유래 glucose transporter 1(Glut-1) 유전자(서열번호 1)를 프라이머들

서열번호 3: Bal = AGATCTGATGGAGCCCAGCAGCAAG

서열번호 4: BSTE = GGTNACCTCACACTTGGGAAT CAGCCCC

을 가지고 인간 cDNA를 이용하여 RT-PCR을 이용하여 분리했다. cDNA 및 RT-PCR 조건은 아래와 같은 조건하에서 시행되었다

- cDNA 합성 -

Primery Solution (100mMdNTP,Oligo dt or Random primer, RT buffer, Sample RNA)을 준비해준 다음 65℃에서 5min 동안 denaturation시켜주었다. 여기에 Seconday solution (100mM DTT)를 넣은 후 잘 혼합해준 후 25℃ 10 min 반응시켰다.42℃ 에서 1h 30min 동안 cDNA를 합성시킨 후 실온에서 cooling해주었다. 이후로는 만들어진 cDNA를 이용하여 real-time PCR을 진행하였다.

- RT-PCR -

아래의 반응액을 PCR tube에 넣고 모든 조작은 얼음 위에서 수행하였다.

시약 조성은 다음과 같다:

PCR 반응 조건은 다음과 같다:

PCR 반응이 끝나면 약 5~10의 반응액을 100V에서 30~40분 전기영동(Buffer: 0.5 X TBE)하여 DNA의 band를 확인하였다.

제한효소 Bal II 와 BSTE II를 이용하여, 상기 얻어진 Glut-1 PCR product를 binary vector인 pCAMBIA 1302(성균관 대학교 세포공학 연구실, Tubu-bio Inc. Cat# M1593)에 클로닝한 다음, 서열 분석(sequencing analysis)를 통해 Glut-1 서열임을 도 1의 C에서와 같이 확인하였다. 구체적으로, Glut-1 유전자를 포함하는 plasmid DNA를 Bal , BSTE primer를 사용해 PCR를 수행하고, pCAMBIA vector에 형질전환 후, Bal II, BST II enzyme을 사용해 Glut-1유전자의 클로닝 여부를 도 1의 C에서와 같이 확인하였다.

2) Agrobacterium을 이용한 Glut-1 형질전환

클라미도모나스 해들레이이(Chlamydomonas hedleyi) KMMCC 118 종은 한국 해양 미세조류 배양센터에서 분주 받았으며 18S rRNA 유전자를 통해 종 구분이 되어 GenBank accession number, JQ315503을 부여 받았다. 아그로박테리움 형질전환체기법을 통한 클라미도모나스 해들레이이 Glut-1형질전환을 시도했다.

아그로박테리움에의한 형질질전환법의 원리는 20 세기 초반에 식물에 발생된 근두암종병 (crown gall disease)에 대한 연구를 통해 이루어졌다. 즉 질병의 원인은 세균자체가 아니라 아그로박테리움에 존재하는 플라스밋드가 원인이라는 것이 밝혀졌는데 이것이 Ti (tumor-inducing)플라스미드의 발견이다. 아그로박테리움에 의해 식물세로의 genomic DNA중에는 Ti플라스미드의 일부 DNA영역 (T-DNA, Transferred DNA)가 들어가는 있다는 놀라운 사실이 밝혀졌다 (Thomashow et al., 1980). 따라서 세균에 의한 자연계에 존재하는 유전자도입의 원리를 이용하여 식물, 미세조류 등을 포한함 여러 가지 생물체의 형질전환기술을 개발했다. 클라미도모나스 해들레이 형질전환체를 만들기 위해 사용된 pCAMBIA 1302의 Glut-1이 삽입된 부분이 T-DNA로 작용하여 클라미도모나스 해들레이 genomic DNA에 Glut-1 유전자가 들어가게 된다. 그 방식은 아래 그림과 같다.

다음으로 형질전환체 제작 과정을 살펴보면, acetosyringone(100uM)이 포함된 f/2 고체 배지에 클라미도모나스 해들레이이 (OD=1.24) 200ul을 도말한 후 3일 정도 20 incubator에서 키웠다. 3일 후 고체 배지에서 자란 클라미도모나스 해들레이이를 scrapper를 사용하여 15ml tube에 모은 후 1500rpm, 5분 동안 centrifugation한 후 상층액을 조심스럽게 제거하여 클라미도모나스 해들레이이를 얻었다. 멸균 증류수 (200ul)로 클라미도모나스 해들레이이 pellets을 resuspension한 후에 200ul agrobacterium (OD=0.5)와 잘 혼합하여 20℃, 48시간동안 배양시켰다. 그 후 1500 rpm, 5분 동안 centrifugation을 통해 agrobacterium 과 클라미도모나스 해들레이이를 얻은 후, cefotaxime이 포함된 액체 f/2 배지로 2회 씻겨주었다. 마지막으로 200 ul 액체 f/2배지로 pellets을 resuspension해준 후 10 mg/L hygromycin 과 500 mg/L cefotaxime이 포함된 고체 f/2배지에 도말한 다음, 일주일 동안 20℃ incubator에서 배양하였다. 배양배지조성(g/L): K₂HPO₄, 0.108; KH₂PO₄, 0.056; MgSO₄7H₂O, 0.1; CaCl₂2H₂O, 0.05; C₄H₁₁NO₃, 2.422; C₁₀H₁₆N₂O₈, 0.05; BO₃H₃, 0.0114; ZnSO₄7H₂O, 0.022; MnCl₂4H₂O, 0.00506; FeSO₄7H₂O, 0.00499; CoCl₂6H₂O, 0.00161; CuSO₄5H₂O, 0.00167; MO₇O₂₄(NH₄)₆4H₂O, 0.0011; Glucose 0~10g, 400 M NH₄Cl 이다.

* pH의 범위: 7.0~7.4 (1 M의 초산 용액을 fed-batch 방식으로 주입

* 배양온도: 23/ * 교반속도: 130 rpm/ * 공기공급량: 1.0

3) Glut-1유전자를 지닌 클라미도모나스 해들레이이 형질전환체 선발

pCAMBIA 1302 벡터에 있는 selection marker인 hygromycin (10mg/ml)을 통해 Glut-1 유전자 형질전환체를 선택적으로 발굴했다. Glut-1 유전자 형질전환체는 hygromycin에 대한 저항성을 가지고 있으며 형질전환이 제대로 이루어지지 않은 세포는 사멸에 이른다. 따라서 고체배지에 hygromycin(10mg/ml) 농도로 제조하고 생존하는 세포를 선택해서 발굴했다. 또한 형질전환체를 만들기위해 사용된 pCAMBIA 1302 벡터에는 GFP 유전자가 들어있어 Glut-1유전자가 발현을 하게되면 Glut-1/ GFP fusion 단백질이 만들어진다. 따라서 Glut-1 유전자가 들어간 형질전환체는 형광현미경아래에서 GFP 단백질에 의한 green 형광을 관찰 할 수 있다. 도 2에서와 같이 현광현미경을 통해 형질전환체의 확인과정을 수행하였다.

그 다음으로 순수 Glut-1형질전환체를 얻기 위해 하나의 클라미도모나스 해들레이이 클론 12개를 분리해서 24wells plate의 각 well에 분주한 후 2주간 배양했다. 이들을 가지고 형질전환체 내에 도입된 Glut-1유전자의 발현이 성공적으로 이루어졌는지를 알아보기 위해 Glut-1 및 GFP 항체를 이용한 단백질 발현을 Western blot 분석을 통해 측정해 보았다. Western blot 분석은 10⁸ ~ 10⁹ cells의 형질전환된 클라미도모나스 헤들레이를 함유하는 배양액 3ml를 5분 동안 1,700 x g에서 원심분리하여 형질전환된 클라미도모나스 헤들레이를 분리하였다. 분리된 형질전환체를 sample loading buffer [ 1mM EDTA, 250 mM Tris-Cl (pH 6.8), 4% SDS, 2% - 머캄도에탄올, 0.2% 브모로페닐블루, 50% 글리세롤] 20ul에 현탁시키고 10분 동안 끓였다. 그 다음, 10분 동안 12,000 x g에서원심분리하여 상등액을 취하고, 15% SDS-PAGE겔에서 전기영동하여 분리하였다. 분리된 단백질은 니트로셀룰로오스막으로 옮겼다. fGH에 대한 다클론 항체 (anti-GFP 혹은 anti-Glut-1)의 최종 농도는 1:5,000이고, 2차항체로 알카리성 인산화효소가 결합된 항체를 사용하였다. 형질전환되지 않은 클라미도모나스헤들레이 또한 동일한 방법으로 웨스턴 블럿 분석을 실행했다. 그 결과 Glut-1/GFP 합성 단백질이 형질전환체 내에서 정상적으로 발현되는 것을 클라미도모나스 해들레이 클론 G1-3에서 확인하였다 (도 2).

실시예 1의 Glut-1 유전자가 형질전환된 Chlamydomonas hedleyi 을 5L Bioreactor을 이용하여 Shinorine, Porpyra와 같은 지표물질이 함유된 대량생산공정 시스템을 구축하였다. Shinorine, Porpyra와 같은 지표물질의 추출효율을 높이기 위하여 NH₄Cl농도, 배지조성, pH, 온도 및 고주파처리(Radiofrequecy,RF)등을 최적의 조건으로 산출하였다.

(1) 초기접종

배양에 사용되는 배지 (배양배지 조성(g/L)은 다음과 같다: K₂HPO₄, 0.108; KH₂PO₄, 0.056; MgSO₄·7H₂O, 0.1; CaCl₂·2H₂O, 0.05; C₄H₁₁NO₃, 2.422; C₁₀H₁₆N₂O₈, 0.05; BO₃H₃, 0.0114; ZnSO₄·7H₂O, 0.022; MnCl₂·4H₂O, 0.00506; FeSO₄·7H₂O, 0.00499; CoCl₂·6H₂O, 0.00161; CuSO₄·5H₂O, 0.00167;MO₇O₂₄(NH₄)₆·4H₂O, 0.0011; Glucose 2~10g, NH₄Cl 100~400 μΜ)와 500ml 플라스크는 121℃에서 20분간 멸균하였고, 상기 실시예 1에서 얻어진 Glut-1 유전자가 형질전환된 Chlamydomonas hedleyi 배양은 23℃에서, pH 7.0~7.4범위로 30일간 배양하였다.

(2) 5L, 20L 생물반응기( Bioreactor ) 배양

풍선형 생물반응기(삼성과학)를 이용하여 동일한 조성의 액체 배지에서 온도 23℃, 공기공급량을 0.1vvm으로 일정하게 조절하며 30일 간격으로 배양하였다.

(3) 25 kL Scale - up 배양

산업적인 이용을 위하여, 12kL배지를 배양할 수 있는 25kL stirred-tank bioreactor에서 대량배양하였다. 배양조건은 상기에서와 같은 배지조성을 사용하였고, 배양초기에 aeration rate 200m³/min, 교반속도는 110 rpm을 유지하였다.

(4) 유인제 처리 조건

상기 (2)의 배양 조건을 이용하여, RF 발생장치가 연결된 생물반응기에서 Glut-1 유전자가 형질전환된 Chlamydomonas hedleyi를 배양하였다. 배양 10일째, RF 발생장치를 이용하여 Intensity 20J/cm², Current 0.02 A, 270 kHz ~ 300 kHz 에 노출시켰다. 처리는 약 30분 간격으로 RF 처리와 휴식을 번갈아가며 3~4회/1일 수행을 하였고, 이러한 방법으로 4일정도 처리하였다.

Glut-1 유전자가 형질전환된 Chlamydomonas hedleyi로부터 MAA 추출 및 분석

상기 실시예 2에서 대량 배양한 이후 건조된 Glut-1 유전자가 형질전환된 C.hedleyi 10 mg을 45℃ water bath에서 1ml의 20% 메탄올을 넣고 2시간동안 반응시킨 후, 원심분리하여 상층액만을 취하여 동결건조한 뒤, 다시 100% 메탄올로 녹인뒤 HPLC system (Waters 600)으로 330nm에서 분석하였다. 표준품을 HPLC로 분석한뒤 정량곡선을 그리고, 피크면적에 따른 넓이로 값을 환산하여 각각 Shinorine과 Porphyra 발현양을 환산하였다.

3.1 Glut-1 유전자가 형질전환된 C. hedleyi 의 5L, 20L Bioreactor 시스템을 활용한 대량생산

3.1.1.Glucose 농도에 따른 Glut-1(+)의 생장곡선 및 Biomass

: 5L Bioreactor ((주)삼성과학)시스템을 활용하여 Glucose 농도에 따른 Glut-1(+)의 생장곡선을 확인하고, 5L, 20L 각각에서 Biomass를 측정하였다. 바이오메스 측정은 UV fluorescence (520 nm)과 소수점 3자리 전자저울을 사용해 측정했다.

(1) 5L Bioreactor 배양에서, Glucose 농도에 따른 Glut-1(+)의 생장곡선을 통하여, 바이오매스가 증가에 따라 필요한 최적의 글루코스 농도를 확인하였다. 상기 실시예 2에서 5L Bioreactor 배양 후 OD값을 측정하였다. (Thermo Scientific사, Multiskan Go 기기로 파장 520nm에서 OD값을 측정) 그 결과 15g/L 글루코스 농도가 최적 농도로 확인되었다.

(2) Glucose 농도에 따른 Glut-1(+)의 biomass

: Glucose 농도에 따라 Glut-1(+)의 5L, 20L Bioreactor 시스템을 활용하여 Biomass를 측정하였다. 5L Bioreactor을 이용하여 배양할 경우, 최적의 Biomass함량을 15g/L Glucose 조건에서 확인하였고, 20L Bioreactor을 이용하여 배양할 경우, 최적의 Biomass함량을 10g/L Glucose 조건에서 확인하였다.

5L Bioreactor을 이용하여 Glucose 농도별에 따른 Biomass 결과에서 알 수 있듯이, 1% Glucose가 포함된 배지조성에 가장 높은 Biomass를 얻을 수 있어서, 1% Glucose 함유한 배지에서 NH₄Cl의 농도를 달리하여 Biomass 및 DCW를 측정하였다.

아울러, 5L, 20L Bioreactor 배양에서 각각 13.5~16.5g/L, 9.0~11.0g/L이 최적의 글루코스 농도 범위인 것으로 확인되었다.

3.1.2. NH₄Cl 농도에 따른 Glut-1(+)의 성장곡선 및 Biomass 측정

(1) NH₄Cl 농도에 따른 Glut-1(+)의 성장곡선

: 일차적으로 5L Bioreactor 시스템을 활용하여 NH₄Cl농도에 따른 Glut-1(+) 클라미도모나스 해들레이이의 생장곡선을 확인하였다.

(2) NH₄Cl 농도에 따른 Glut-1(+)의 Biomass 및 MAAs 함량 측정

: NH₄Cl농도에 따른 Glut-1(+)의 MAAs/DCW(mg/g) 함량을 5L 및 20L 배양하여 측정하였다. 1% Glucose함량으로 고정하였을 경우, 100 ~ 400 μM NH₄Cl 농도에 따른 DCW 및 MAAs 함량을 확인한 결과, 400 μM NH₄Cl에서 가장 높은 MAAs/DCW(mg/g)을 확인할 수 있었다.

3.1.3. RF처리에 따른 Glu-1(+)의 생장곡선 및 MAAs함량 변화 측정

그밖의 물리적 유인제인 Radiofrequency(RF, 고주파)처리에 의한 Glut-1(+)의 Biomass 변화량을 확인하고자 다음과 같은 실험을 수행하였다.

(1) RF처리시, Glut-1(+)의 생장곡선

: 5L, 20L Bioreactor 시스템에서 1% Glucose 농도, 400 μM NH₄Cl를 처리한 후, 물리적 유인제인 RF를 배양 10일째 처리하였을 때, Glut-1(+)의 생장곡선의 변화를 확인하였다. RF를 처리한 후 Biomass가 줄어드는 것을 확인할 수 있었다.

(2) RF처리시, Glut-1(+)의 5L 및 20L에서의 MAAs 함량변화

: 5L, 20L Bioreactor 시스템에서 물리적 유인제인 RF를 처리하였을 때, Glut-1(+)의 MAAs 함량/DCW(mg/g)을 측정하였다.

RF(-) 처리하지 않으면 RF(+)하였을 경우보다 바이오매스는 증가하지만, 결론적으로 수율(YIELD)를 비교할 시 사용되는 DCW(g)당 maa는 RF(+)처리하였을 경우가 높다.

3.2 RF처리시, 1% Glucose, 400 μM NH₄Cl가 포함된 배지에서 배양된 Glut-1(-), Glut-1(+)의 HPLC 분석 결과

HPLC 분석조건은 다음과 같다.

구 분	분 석 조 건
HPLC 기기 종류	Waters 1525μ Binary HPLC Pump
Column 종류	Gemini 5μ C18 110 A (Phenomenex 사)
Column 규격	250 * 4.60 mm, 5 micron
용매 조건	- 용매 A : Water (0.1 % TFA (Trifluoro acetic acid) 함유) - 용매 B : Acetonitrile (0.1 % TFA (Trifluoro acetic acid) 함유)
파장	234 nm (UV 램프)
유속	1 ml/min

Rt 4.1분 Shinorine, Rt 5.6분 Porphyra 피크가 증가함을 확인함으로써, 본 발명에 따른 Glut-1 유전자로 형질전환된 클라미도모나스 해들레이이 배양 결과 시노린, 포르피라를 함유한 MAA 생산됨을 확인하였다.

3.3. Glut-1 유전자를 형질전환한 형질전환체 C. hedleyi 로부터 배양단계에 따른 수득율 비교

	5L		20L		25kL
RF 처리	-	+	-	+	-	+
DCW(g/L)	2.3	1.95	2.56	2.23	1.88	-
MAAs(mg/g)	3.2	4.1	3.0	3.9	2.9	-
Shinorine(μg/g)	310	400	290	395	300	-
Porphyra(μg/g)	405	510	385	490	400	-
Total MAAs yield (mg/g)	7.36	7.99	7.5	8.69	5.4	-

- 상기 표 2에서 MAAs(mg/g)는 5L, 20L 및 25kL 배양할 경우 얻어지는 대략적으로 알려진 20가지 MAA를 mg/g으로 측정한것이고, Total MAAs yield (mg/g)는

DCW(g/L) x MAAs(mg/g)로 수율을 의미한다. 즉, 5L, 20L 및 25kL 배양할 경우 Dried Cell Weight과 MAA를 고려한 수율을 mg/g으로 나타낸것이다.

상기 표의 결과로부터 (i) 5L, 20L, 25kL배양시, 20L 배양시 가장 높은 DCW를 확인할 수 있었고, (ii) RF처리시, 무처리하여 배양하였을 경우보다 DCW는 줄어듬을 확인하였으나, MAAs함량은 증가함을 확인하였고, (iii) 특히, Shinorine과 Porphyra의 함량도 증가함을 확인하였으며, (iv) 따라서, DCW와 MAA함량을 고려하여 20L 생물반응기에서 RF처리하였을 경우 가장 높은 수율을 확인하였다.

<110> BIOFDNC DAESANG <120> Mass Production Method of Mycosporine-like amino acid <130> P-140528-2 <160> 4 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 1476 <212> DNA <213> Glut-1 gene <400> 1 atggagccca gcagcaagaa gctgacgggt cgcctcatgc tggccgtggg aggagcagtg 60 cttggctccc tgcagtttgg ctacaacact ggagtcatca atgcccccca gaaggtgatc 120 gaggagttct acaaccagac atgggtccac cgctatgggg agagcatcct gcccaccacg 180 ctcaccacgc tctggtccct ctcagtggcc atcttttctg ttgggggcat gattggctcc 240 ttctctgtgg gccttttcgt taaccgcttt ggccggcgga attcaatgct gatgatgaac 300 ctgctggcct tcgtgtccgc cgtgctcatg ggcttctcga aactgggcaa gtcctttgag 360 atgctgatcc tgggccgctt catcatcggt gtgtactgcg gcctgaccac aggcttcgtg 420 cccatgtatg tgggtgaagt gtcacccaca gcccttcgtg gggccctggg caccctgcac 480 cagctgggca tcgtcgtcgg catcctcatc gcccaggtgt tcggcctgga ctccatcatg 540 ggcaacaagg acctgtggcc cctgctgctg agcatcatct tcatcccggc cctgctgcag 600 tgcatcgtgc tgcccttctg ccccgagagt ccccgcttcc tgctcatcaa ccgcaacgag 660 gagaaccggg ccaagagtgt gctaaagaag ctgcgcggga cagctgacgt gacccatgac 720 ctgcaggaga tgaaggaaga gagtcggcag atgatgcggg agaagaaggt caccatcctg 780 gagctgttcc gctcccccgc ctaccgccag cccatcctca tcgctgtggt gctgcagctg 840 tcccagcagc tgtctggcat caacgctgtc ttctattact ccacgagcat cttcgagaag 900 gcgggggtgc agcagcctgt gtatgccacc attggctccg gtatcgtcaa cacggccttc 960 actgtcgtgt cgctgtttgt ggtggagcga gcaggccggc ggaccctgca cctcataggc 1020 ctcgctggca tggcgggttg tgccatactc atgaccatcg cgctagcact gctggagcag 1080 ctaccctgga tgtcctatct gagcatcgtg gccatctttg gctttgtggc cttctttgaa 1140 gtgggtcctg gccccatccc atggttcatc gtggctgaac tcttcagcca gggtccacgt 1200 ccagctgcca ttgccgttgc aggcttctcc aactggacct caaatttcat tgtgggcatg 1260 tgcttccagt atgtggagca actgtgtggt ccctacgtct tcatcatctt cactgtgctc 1320 ctggttctgt tcttcatctt cacctacttc aaagttcctg agactaaagg ccggaccttc 1380 gatgagatcg cttccggctt ccggcagggg ggagccagcc aaagtgacaa gacacccgag 1440 gagctgttcc atcccctggg ggctgattcc caagtg 1476 <210> 2 <211> 492 <212> PRT <213> Glut-1 protein <400> 2 Met Glu Pro Ser Ser Lys Lys Leu Thr Gly Arg Leu Met Leu Ala Val 1 5 10 15 Gly Gly Ala Val Leu Gly Ser Leu Gln Phe Gly Tyr Asn Thr Gly Val 20 25 30 Ile Asn Ala Pro Gln Lys Val Ile Glu Glu Phe Tyr Asn Gln Thr Trp 35 40 45 Val His Arg Tyr Gly Glu Ser Ile Leu Pro Thr Thr Leu Thr Thr Leu 50 55 60 Trp Ser Leu Ser Val Ala Ile Phe Ser Val Gly Gly Met Ile Gly Ser 65 70 75 80 Phe Ser Val Gly Leu Phe Val Asn Arg Phe Gly Arg Arg Asn Ser Met 85 90 95 Leu Met Met Asn Leu Leu Ala Phe Val Ser Ala Val Leu Met Gly Phe 100 105 110 Ser Lys Leu Gly Lys Ser Phe Glu Met Leu Ile Leu Gly Arg Phe Ile 115 120 125 Ile Gly Val Tyr Cys Gly Leu Thr Thr Gly Phe Val Pro Met Tyr Val 130 135 140 Gly Glu Val Ser Pro Thr Ala Leu Arg Gly Ala Leu Gly Thr Leu His 145 150 155 160 Gln Leu Gly Ile Val Val Gly Ile Leu Ile Ala Gln Val Phe Gly Leu 165 170 175 Asp Ser Ile Met Gly Asn Lys Asp Leu Trp Pro Leu Leu Leu Ser Ile 180 185 190 Ile Phe Ile Pro Ala Leu Leu Gln Cys Ile Val Leu Pro Phe Cys Pro 195 200 205 Glu Ser Pro Arg Phe Leu Leu Ile Asn Arg Asn Glu Glu Asn Arg Ala 210 215 220 Lys Ser Val Leu Lys Lys Leu Arg Gly Thr Ala Asp Val Thr His Asp 225 230 235 240 Leu Gln Glu Met Lys Glu Glu Ser Arg Gln Met Met Arg Glu Lys Lys 245 250 255 Val Thr Ile Leu Glu Leu Phe Arg Ser Pro Ala Tyr Arg Gln Pro Ile 260 265 270 Leu Ile Ala Val Val Leu Gln Leu Ser Gln Gln Leu Ser Gly Ile Asn 275 280 285 Ala Val Phe Tyr Tyr Ser Thr Ser Ile Phe Glu Lys Ala Gly Val Gln 290 295 300 Gln Pro Val Tyr Ala Thr Ile Gly Ser Gly Ile Val Asn Thr Ala Phe 305 310 315 320 Thr Val Val Ser Leu Phe Val Val Glu Arg Ala Gly Arg Arg Thr Leu 325 330 335 His Leu Ile Gly Leu Ala Gly Met Ala Gly Cys Ala Ile Leu Met Thr 340 345 350 Ile Ala Leu Ala Leu Leu Glu Gln Leu Pro Trp Met Ser Tyr Leu Ser 355 360 365 Ile Val Ala Ile Phe Gly Phe Val Ala Phe Phe Glu Val Gly Pro Gly 370 375 380 Pro Ile Pro Trp Phe Ile Val Ala Glu Leu Phe Ser Gln Gly Pro Arg 385 390 395 400 Pro Ala Ala Ile Ala Val Ala Gly Phe Ser Asn Trp Thr Ser Asn Phe 405 410 415 Ile Val Gly Met Cys Phe Gln Tyr Val Glu Gln Leu Cys Gly Pro Tyr 420 425 430 Val Phe Ile Ile Phe Thr Val Leu Leu Val Leu Phe Phe Ile Phe Thr 435 440 445 Tyr Phe Lys Val Pro Glu Thr Lys Gly Arg Thr Phe Asp Glu Ile Ala 450 455 460 Ser Gly Phe Arg Gln Gly Gly Ala Ser Gln Ser Asp Lys Thr Pro Glu 465 470 475 480 Glu Leu Phe His Pro Leu Gly Ala Asp Ser Gln Val 485 490 <210> 3 <211> 25 <212> DNA <213> primer (Bal) <400> 3 agatctgatg gagcccagca gcaag 25 <210> 4 <211> 28 <212> DNA <213> primer(BSTE) <400> 4 ggtnacctca cacttgggaa tcagcccc 28

Claims

전체 배양배지에 대하여, K₂HPO₄, KH₂PO₄, MgSO₄·7H₂O, CaCl₂·2H₂O, C₄H₁₁NO₃, C₁₀H₁₆N₂O₈, BO₃H₃, ZnSO₄·7H₂O, MnCl₂·4H₂O, FeSO₄·7H₂O, CoCl₂·6H₂O, CuSO₄·5H₂O, MO₇O₂₄(NH₄)₆·4H₂O, 글루코스, 및 NH₄Cl 을 함유하는 MAA(myscoporine-like amino acids) 생산하기 위한, glut-1 유전자로 형질전환된 미세 조류 배양 배지 조성물.
제1항에 있어서, 1L 총 배양배지에 대하여,
K₂HPO₄, 0.0972~0.1188; KH₂PO₄, 0.0504~0.0616; MgSO₄·7H₂O, 0.09~0.11; CaCl₂·2H₂O, 0.045~0.055; C₄H₁₁NO₃, 2.1798~2.6642; C₁₀H₁₆N₂O₈, 0.045~0.055; BO₃H₃, 0.01026~0.01254; ZnSO₄·7H₂O, 0.0198~0.0242; MnCl₂·4H₂O, 0.004554~0.005566; FeSO₄·7H₂O, 0.004491~0.005489; CoCl₂·6H₂O, 0.001449~0.001771; CuSO₄·5H₂O, 0.001503~0.001837; MO₇O₂₄(NH₄)₆·4H₂O, 0.00099~0.00121; 글루코스 2~25g, 및 NH₄Cl 50~600 μΜ를 포함하는 것을 특징으로 하는 MAA(myscoporine-like amino acids) 생산용 미세 조류 배양 배지 조성물.
제1항에 있어서, 상기 미세조류 배양 배지는 클라미도모나스 해들레이이(Chlamydomonas hedleyi) 배양용인 것을 특징으로 하는 조성물.
삭제
제1항에 있어서, 상기 MAA는 시노린(shinorine) 또는 포르피린(porphyrin)인 것을 특징으로 하는 조성물.
1g 총 배양배지에 대하여,
K₂HPO₄, 0.108; KH₂PO₄, 0.056; MgSO₄·7H₂O, 0.1; CaCl_2·2H₂O, 0.05; C₄H₁₁NO₃, 2.422; C₁₀H₁₆N₂O₈, 0.05; BO₃H₃, 0.0114; ZnSO₄·7H₂O, 0.022; MnCl₂·4H₂O, 0.00506; FeSO₄·7H₂O, 0.00499; CoCl₂·6H₂O, 0.00161; CuSO₄·5H₂O, 0.00167;MO₇O₂₄(NH₄)₆·4H₂O, 0.0011; 글루코스 2~25g, 50~600 μΜ NH₄Cl 를 포함하는 배양 배지 조성물에 glut-1 유전자로 형질전환된 미세 조류를 배양하는 것을 특징으로 하는 MAA의 제조 방법.
제6항에 있어서, 상기 미세조류는 클라미도모나스 헤들레이이(Chlamydomonas hedleyi)인 것을 특징으로 하는 제조 방법.
삭제
제6항에 있어서, 상기 MAA는 시노린(shinorine) 또는 포르피린(porphyrin)인 것을 특징으로 하는 방법.