KR101551899B1

KR101551899B1 - 미생물 변이체를 이용한 나린제닌으로부터 아스트라갈린의 제조방법

Info

Publication number: KR101551899B1
Application number: KR1020130043101A
Authority: KR
Inventors: 송재경; 김병기; 프라사드 판데이 라메스; 말라 사이리쉬
Original assignee: 선문대학교 산학협력단
Priority date: 2013-04-18
Filing date: 2013-04-18
Publication date: 2015-09-18
Also published as: KR20140125209A

Abstract

본 발명은 아스트라갈린의 제조방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 미생물 변이체를 이용하여 나린제린으로부터 아스트라갈린을 제조하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법을 이용하면 항산화, 항염증 등 주요한 생리 활성 물질인 아스트라갈린을 대량으로 제조할 수 있다.

Description

미생물 변이체를 이용한 나린제닌으로부터 아스트라갈린의 제조방법{Method for Preparing Astragalin from Naringenin Using Microorganism Mutants}

본 발명은 아스트라갈린의 제조방법에 관한 것으로, 더 구체적으로는 나린제닌으로부터 미생물 변이체를 이용하여 아스트라갈린을 제조하는 방법에 관한 것이다.

아스트라갈린(astragalin, AST)은 플라보노이드 물질의 하나인 캄페롤(kaempferol, KMF)에 포도당(glucose)이 결합되어 있는 형태로서, 플라보놀(flavonol)로 구분된다. 캄페롤-3-O-글루코시드(kaempferol-3-O-glucoside) 또는 캄페롤 3-O-β-D-글루코피라노시드(kaempferol 3-O-β-D-glucopyranoside)로 알려진(도 1), 아스트라갈린은 다양한 건강상 이익과 항산화(Parejo I et al., J Agric Food Chem, 52:1890-1897, 2004), 항알레르기(Matsumoto M et al., Br J Dermatol, 146:221-227, 2002), 항염증(Kovganko NV et al., Chemistry of Natural Compounds, 40:71-74, 2004), 진통(Parveen Z et al., Yakugaku Zasshi, 27:1275-1279, 2007), 항-HIV(Lin YM et al., J Nat Prod, 60:884-888, 1997) 성질과 같은 생물학적 활성을 가진 식물 기반의 글리코시딕 플라보노이드이다. 그것은 또한 자연 식용 색소 시약으로써 이용되는 다른 콩들의 색의 원인이 된다. 식품 및 제약 산업 분야에서의 높은 수요 때문에 아스트라갈린의 효율적인 제조를 위한 다양한 시도가 있어왔다.

아스트라갈린은 가래고사리(Phegopteris connectilis)(Adam KP, Phytochemistry, 52:929-934, 1999), Thesium chinense Turez(Parveen Z et al., J Appl Sci, 6:2829-2832, 2006), 용아초(Agrimonia eupatoria L.)(Correia H et al, Biomed Chromatogr, 20:88-94, 2006), Orostachys japonicas(Park HJ et al., Arch Pharmacal Res, 14:167-171, 1991), 시아데아 종(Cyathea species)(Hiraoka A et al, Bot Mag, 88:127-130, 975), 미국자리공(Phytolacca americana), 금루매 종(Hamamelis species), 포도필룸(Podophyllum), 및 많은 다른 식물로부터 분리되어 왔다.

플라보노이드의 다양한 구조는 시토크롬 P450, 이산소화효소(dioxygenase), 메틸전달효소(methyltransferase), 글리코실전달효소(glycosyltransferase), 프레닐전달효소(prenyltransferase) 등에 의해 촉진되는 다양한 변형 반응에 의해 나린제닌과 같은 통상의 구조로부터 생합성된다. 이산소화효소는 놀랍게도 다양한 복잡한 산화반응을 촉진시킬 수 있는 효소를 포함한 비헴성 철이다(Bugg TDH, Tetrahedron, 59:7075-7101, 2003).

식물 이산소화효소는 두 개의 종류로 구분된다: 리폭시게나아제(lipoxygenases)와 2-옥소산 의존성 이산소화효소(2-oxoacid-dependent dioxygenases). 2-옥소산 의존성 이산소화효소는 하이드록시화, 에폭시화, 및/또는 비포화 반응을 촉진할 수 있다. 애기장대풀(Arabiodopsis thaliana)의 플라보놀 생성효소(flavonol synthase) (FLS1)와 같은 몇몇 이산소화효소는 생합성 경로의 연속적인 단계에서 한 가지 유형 이상의 반응을 촉진한다(Prescott AG et al., Phytochemistry, 60:589-593, 2002).

마찬가지로, 집중적인 연구들은 생물학적 활성, 안정성, 및 용해도를 향상시키기 위하여 상응하는 글리코실전달효소(GT)의 존재 하에서 넓은 범위의 NDP-당 공여체로부터 당 일부(moiety)를 이전시킴으로써 아글리콘(aglycones)(당 수용체)을 글리코실화하기 위하여 수행되었다. 기질 특이성과 시퀀스 유사성을 바탕으로 하여, GT는 94개 족으로 분류된다. 이러한 족들 중, 그들의 당 공여체로써 uridine 5´-diphosphosugars에 대한 의존성 때문에 UGT라고 불리는 GT 1 족은 주로 페놀 화합물과 같은 낮은 중량부 화합물/ 작은 분자들을 인식하고 높은 위치선택성을 가지고 플라보놀의 3-OH와 7-OH로 당 일부(moiety)를 이동시킨다. 식물들은 많은 수의 UGT를 포함하고 이러한 UGT는 그들의 상응하는 글리코시드로 플라보노이드 아글리콘을 글리코실화하는데 사용될 수 있다(Ren G et al., Glycoconj J, 29:425-432, 2012; Kim BG et al., Appl Microbiol Biotechnol, 93:2447-453, 2012; Kovinich N et al., Phytochemistry, 71:1253-1263, 2010).

플라보노이드의 화학합성은 종종 복잡하고 독성 화학물질과 극도의 반응 조건이 요구된다(Tang LJ et al., Chinese J Organ Chem, 24:882-889, 2004). 활성의 플라보노이드 분자와 뒤이은 글리코실화와 같은 변형을 일으키기 위한 키랄합성은 화학합성에 있어서 중대한 도전이다. 게다가, 핵산당인 UDP-당은 발효 목적을 위한 이론 공연비(stoichiometric ratio)로 사용되기에는 지나치게 비싸다. 그러므로, 화학합성 방법을 이용한 글리코실화된 플라보노이드의 대량 생산은 경제적으로 실현 불가능하다. 반면에, UDP-glucose를 포함한 몇몇 핵산당은 E. coli의 세포질에 특정 범위로 자연적으로 존재한다(Keseler IM et al., Nucleic Acids Res, 37:D464-D470, 2009). 결과적으로, E. coli를 이용하여 효소적 변경으로 플라보노이드를 수득하려는 시도와 아글리콘 분자의 공급에 의한 유전자재조합 E. coli 균주(strain)의 발효는 글리코실화된 플라보노이드의 저렴한 대규모 제조를 위한 최적의 대안이다. 게다가, 숙주 균주(strain)는 목표 화합물의 높은 역가를 이끄는 세포내 선구체 집단의 안정성과 증가에 신진대사적으로 운용될 수 있다.

그러나 아스트라갈린의 실제적인 생성량은 극소량에 불과하여, 산업적인 용도로 대용량을 얻는 데에는 어려움이 많다.

이에, 본 발명자들은 상기 문제점을 해결하기 위하여 예의 노력한 결과, 특정효소를 코딩하는 유전자가 도입된 대장균을 이용하여 나린제린을 위치특이적 변형시킬 경우 아스트라갈린을 높은 수율로 제조할 수 있다는 것을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 목적은 나린제닌을 기질로 하여 아스트라갈린 생성능을 가지는 재조합 미생물 및 이를 이용하여 나린제닌으로부터 아스트라갈린을 제조하는 방법을 제공하는데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 당으로부터 UDP-글루코오스를 생합성하는 경로를 가지고 있는 미생물에 플라본-3-수산화효소(flavanone-3-hydroxylase)를 코딩하는 유전자, 플라본 생성효소(flavonone synthase)를 코딩하는 유전자, 포스포글루코무타아제(phosphoglucomutase)를 코딩하는 유전자, 포도당-1-인산 우리딜일전달효소(glucose-1-phosphate uridylyltransferase)를 코딩하는 유전자 및 UDP-글리코실전달효소(UDP-glycosyltransferase, UGT)를 코딩하는 유전자가 도입되어 있고, 나린제린을 기질로 하여 하기 화학식 1로 표현되는 아스트라갈린 생성능을 가지는 재조합 미생물 및 이를 이용한 아스트라갈린의 제조방법을 제공한다.

본 발명은 또한 당으로부터 UDP-글루코오스를 생합성하는 경로를 가지고 있는 미생물에서 글루코오스 인산 이성질화효소(glucose phosphate isomerase), D-글루코오스-6-인산 탈수소효소(D-glucose-6-phosphate dehydrogenase), 및 UDP-글루코오스 가수분해효소(UDP-glucose hydrolase)를 코딩하는 유전자 중 하나 이상이 결실되어 있고, 플라본-3-수산화효소(flavanone-3-hydroxylase)를 코딩하는 유전자, 플라본 생성효소(flavonone synthase)를 코딩하는 유전자, 포스포글루코무타아제(phosphoglucomutase)를 코딩하는 유전자, 포도당-1-인산 우리딜일전달효소(glucose-1-phosphate uridylyltransferase)를 코딩하는 유전자 및 UDP-글리코실전달효소(UDP-glycosyltransferase, UGT)를 코딩하는 유전자가 도입되어 있고, 나린제린을 기질로 하여 아스트라갈린 생성능을 가지는 미생물 변이체 및 이를 이용한 아스트라갈린의 제조방법을 제공한다.

본 발명에 따르면 고수율의 아스트라갈린을 저렴한 비용으로 제조할 수 있어, 의약품, 화장품 등의 성분으로써 아스트라갈린 및 이와 유사한 파생물들의 산업적 이용을 촉진할 수 있다.

도 1은 나린제닌과 D-글루코오스로부터 시작되는 아스트라갈린의 생성단계를 나타낸 모식도이다. 도 1의 (A)는 전체 세포의 생체 내 변화를 나타낸 것이고, 도 1의 (B)는 나린제닌과 UDP-글루코오소로부터의 캄페롤의 형성 및 아스트라갈린을 제조하기 위한 캄페롤의 글루코실화에 대한 생합성 경로를 나타낸 것이다.
도 2는 LB 또는 M9 배지에서 24시간 배양한 후 측정한 E. coli FLS1 및/또는 E. coli F3H-FLS1에 의한 나린제닌의 캄페롤로의 생물 변환(bioconversion)량을 나타낸 것이다.
도 3은 HPLC 분석 데이터로, (a)는 E. coli F3H-FLS1에 의한 NRN으로부터 제조된 DHK 및 KMF를 나타낸 것이고, (b)는 성장 유도 배양액(growing induced culture)에 NRN을 보충하고 E. coli KG3를 48시간 배양한 후 14.3 min에 나타난 새로운 피크이다. 대조군(control)은 동등한 조건에서 E. coli KG3의 성장 유도 배양액에 의한 결과를 나타낸다.
도 4는 음성 모드에서 정제된 화합물들의 LC-QTOF-ESI/MS 분석을 나타낸 것으로, A)는 DHK를, B)는 KMF를, C)는 AST의 정확한 질량을 각각 나타낸다.
도 5는 LB, M9 최소, 및 TB 배지에서 나린제닌과 함께 48시간 배양된 후 E. coli KG3와 E. coli KG4에 의한 AST 생산량을 비교하여 나타낸 것이다.
도 6의 (A)는 LB, M9 최소, 및 TB 배지에서 E. coli 돌연변이 균주의 성장률을 비교한 것이고, 도 6의 (B)는 일정한 시간 간격으로 1%의 만노스(mannose)가 포함된 TB 배지에서 NRN을 보충한 경우, E. coli KG3, KG5, KG6, KG7 및 KG8에 의하여 제조된 AST에 대한 분석표를 나타낸 것이다. 도 6의 (C)는 다양한 탄소원이 보충된 TB 배지에서 E. coli KG8에 의하여 48시간 안에 제조된 AST의 양을 비교한 결과이다(Man: 1% 만노스가 첨가된 TB 배지; Man-Fru: 1% 만노스와 1% 과당(fructose)이 첨가된 TB 배지; Man-Fru-Gly: 1% 만노스, 1% 과당, 및 1% 글리세롤이 첨가된 TB 배지; Man-Fru-Gly-Glc: 1% 만노스, 1% 과당, 1% 글리세롤 및 1% 글루코오스가 첨가된 TB 배지; 및 Man-Fru-Gly-Glc(additional Gly): 1% 만노스, 1% 과당, 1% 글리세롤 및 1% 글루코오스 및 추가적인 1% 글리세롤 및 1% 글루코오스가 첨가된 TB 배지).
도 7은 발효기를 이용한 대규모의 생물변환을 나타낸 것으로, 탄소원이 최적화된 TB 배지에서 NRN의 DHK, KMF, 및 AST로의 시간에 따른 변화량을 나타낸 것이다.
도 8은 KMF가 제조됨에 따라 노르스름하게 변하는 배양액의 색을 나타낸 것이다. KMF가 노란색을 띄기 때문에, 배양액이 더 강한 노란색을 나타낼수록 더 많은 캄페롤이 형성된다.
도 9는 NRN이 첨가된 KG1 및 KG2의 전체 세포 생체 내 변화의 HPLC 분석을 나타낸 것이다. (A)는 UGT78K1, (B)는 UGT78D2에 대한 것이다. 여기에서 ⅰ)은 100 표준 나린제닌, ⅱ)는 재조합 KG1 또는 KG2로부터의 생산물, ⅲ)은 음성 대조군을 나타낸다(★:NRN, ●:DHK).
도 10은 NRN의 ¹H-NMR 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 11은 DHK의 ¹H-NMR 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 12는 KMF의 ¹H-NMR 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 13은 아스트라갈린의 ¹H-NMR 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 14는 아스트라갈린의 ¹³C-NMR 스펙트럼을 나타낸 것이다.

다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.

본 발명에서는 플라본-3-수산화효소(flavanone-3-hydroxylase), 플라본 생성효소(flavonone synthase), 포스포글루코무타아제(phosphoglucomutase), 포도당-1-인산 우리딜일전달효소(glucose-1-phosphate uridylyltransferase), 및 UDP-글리코실전달효소(UDP-glycosyltransferase, UGT)를 코딩하는 유전자가 도입된 재조합 미생물을 이용하여 나린제린(naringenin, NRN)으로부터 아스트라갈린(astragalin, AST)의 제조를 시도하였다. 그 결과, 식물체에 극소량 함유되어 있는 아스트라갈린을 대량으로 생산할 수 있다는 것을 확인할 수 있었다.

본 발명의 일 실시예에서는, 플라본-3-수산화효소를 코딩하는 유전자와 플라본 생성효소를 코딩하는 유전자를 함유하는 재조합 플라스미드(pC-Atf3h - Atfls1), 포스포글루코무타아제를 코딩하는 유전자와 포도당-1-인산 우리딜일전달효소를 코딩하는 유전자를 함유하는 재조합 플라스미드(pET-nfa44530-galU), 및 UDP-글리코실전달효소를 코딩하는 유전자를 함유하는 재조합 플라스미드(pET28-UGT78K1 또는 pET28-At5g17050)를 제작하고, 이를 E. coli BL21(DE3)에 도입하여 재조합 대장균 KG3 및 KG4를 제작하였다. 상기 제작된 재조합 대장균 KG3 및 KG4를 이용하여 NRN함유 LB, M9 최소, 및 TB 배지에서 배양한 결과, 재조합 대장균 KG3 및 KG4에 의해 AST가 제조된다는 것을 확인할 수 있었다.

따라서, 본 발명은 일 관점에서, 당으로부터 UDP-글루코오스를 생합성하는 경로를 가지고 있는 미생물에 플라본-3-수산화효소(flavanone-3-hydroxylase)를 코딩하는 유전자, 플라본 생성효소(flavonone synthase)를 코딩하는 유전자, 포스포글루코무타아제(phosphoglucomutase)를 코딩하는 유전자, 포도당-1-인산 우리딜일전달효소(glucose-1-phosphate uridylyltransferase)를 코딩하는 유전자 및 UDP-글리코실전달효소(UDP-glycosyltransferase, UGT)를 코딩하는 유전자가 도입되어 있고, 나린제린을 기질로 하여 아스트라갈린 생성능을 가지는 재조합 미생물에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 플라본-3-수산화효소를 코딩하는 유전자, 플라본 생성효소를 코딩하는 유전자, 포스포글루코무타아제를 코딩하는 유전자, 및 포도당-1-인산 우리딜일전달효소를 코딩하는 유전자는 각각 Atf3h, Atfls1, nfa44530, 및galU인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 UDP-글리코실전달효소를 코딩하는 유전자는 UGT78K1 또는 At5g17050인 것을 특징으로 할 수 있다. 많은 수의 식물 UGT는 이미 UDP-glucose로부터 당 일부(moiety)를 받아들이는 것에 의하여 효과적으로 플라보노이드를 글리코실화하기 위하여 보고되어 있다. 플라보놀 뼈대의 C-3 위치에서 당 일부(moiety)를 포함하는 AST를 합성하기 위하여, 식물 UGT, 다시 말해 A. thaliana의 At5g17050및 Glycine max 의 UGT78K1을 비교하였다. 상기 UDP-글리코실전달효소(UDP-glycosyltransferase)는 애기장대풀(Arabidopsis thaliana) 유래인 것을 특징으로 할 수 있다.

용어 “벡터 (vector)”는 적합한 숙주 내에서 DNA를 발현시킬 수 있는 적합한 조절 서열에 작동가능하게 연결된 DNA 서열을 함유하는 DNA 생산물을 의미한다. 벡터는 플라스미드, 파지 입자, 또는 간단하게 잠재적 게놈 삽입물일 수 있다. 적당한 숙주로 형질전환되면, 벡터는 숙주 게놈과 무관하게 복제하고 기능할 수 있거나, 또는 일부 경우에 게놈 그 자체에 통합될 수 있다. 플라스미드가 현재 벡터의 가장 통상적으로 사용되는 형태이므로, 본 발명의 명세서에서 “플라스미드 (plasmid)” 및 “벡터 (vector)”는 때로 상호 교환적으로 사용된다. 그러나, 본 발명은 당업계에 알려진 또는 알려지게 되는 바와 동등한 기능을 갖는 벡터의 다른 형태를 포함한다.

“발현 조절 서열 (expression control sequence)”이라는 표현은 특정한 숙주 생물에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열의 발현에 필수적인 DNA 서열을 의미한다. 그러한 조절 서열은 전사를 실시하기 위한 프로모터, 그러한 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함한다. 예를 들면, 원핵생물에 적합한 조절 서열은 프로모터, 임의로 오퍼레이터 서열 및 리보좀 결합 부위를 포함한다. 진핵세포는 프로모터, 폴리아데닐화 시그날 및 인핸서가 이에 포함된다. 플라스미드에서 유전자의 발현 양에 가장 영향을 미치는 인자는 프로모터이다. 고 발현용의 프로모터로서 SRα 프로모터와 사이토메가로바이러스 (cytomegalovirus) 유래 프로모터 등이 바람직하게 사용된다.

본 발명의 DNA 서열을 발현시키기 위하여, 매우 다양한 발현 조절 서열 중 어느 것이라도 벡터에 사용될 수 있다. 유용한 발현 조절서열의 예에는, SV40 또는 아데노바이러스의 초기 및 후기 프로모터들, lac 시스템, trp 시스템, TAC 또는 TRC 시스템, T3 및 T7 프로모터들, 파지 람다의 주요 오퍼레이터 및 프로모터 영역, fd 코드 단백질의 조절 영역, 3-포스포글리세레이트 키나제 또는 다른 글리콜분해 효소에 대한 프로모터, 상기 포스파타제의 프로모터들, 예를 들어 Pho5, 효모 알파-교배 시스템의 프로모터 및 원핵세포 또는 진핵 세포 또는 이들의 바이러스의 유전자의 발현을 조절하는 것으로 알려진 구성과 유도의 기타 다른 서열 및 이들의 여러 조합이 포함된다. T7 RNA 폴리메라아제 프로모터 Φ10은 E. coli에서 단백질 NSP를 발현시키는데 유용하게 사용될 수 있다.

핵산은 다른 핵산 서열과 기능적 관계로 배치될 때 “작동가능하게 연결 (operably linked)”된다. 이것은 적절한 분자 (예를 들면, 전사 활성화 단백질) 조절 서열(들)에 결합될 때 유전자 발현을 가능하게 하는 방식으로 연결된 유전자 및 조절 서열(들)일 수 있다. 예를 들면, 전서열(pre-sequence) 또는 분비 리더 (leader)에 대한 DNA는 폴리펩타이드의 분비에 참여하는 전단백질로서 발현되는 경우 폴리펩타이드에 대한 DNA에 작동가능하게 연결되고; 프로모터 또는 인핸서(enhancer)는 서열의 전사에 영향을 끼치는 경우 코딩서열에 작동가능하게 연결되거나; 또는 리보좀 결합 부위는 서열의 전사에 영향을 끼치는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결되거나; 또는 리보좀 결합 부위는 번역을 용이하게 하도록 배치되는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다. 일반적으로, “작동가능하게 연결된”은 연결된 DNA 서열이 접촉하고, 또한 분비 리더의 경우 접촉하고 리딩 프레임 내에 존재하는 것을 의미한다. 그러나, 인핸서는 접촉할 필요가 없다. 이들 서열의 연결은 편리한 제한 효소 부위에서 라이게이션(연결)에 의해 수행된다. 그러한 부위가 존재하지 않는 경우, 통상의 방법에 따른 합성 올리고뉴클레오티드 어댑터 (oligonucleotide adaptor) 또는 링커(linker)를 사용한다.

본원 명세서에 사용된 용어 “발현 벡터”는 통상 이종의 DNA의 단편이 삽입된 재조합 운반체(recombinant carrier)로서 일반적으로 이중 가닥의 DNA의 단편을 의미한다. 여기서, 이종 DNA는 숙주 세포에서 천연적으로 발견되지 않는 DNA인 이형 DNA를 의미한다. 발현 벡터는 일단 숙주 세포 내에 있으면 숙주 염색체 DNA와 무관하게 복제할 수 있으며 벡터의 수 개의 카피 및 그의 삽입된 (이종) DNA가 생성될 수 있다.

당업계에 주지된 바와 같이, 숙주세포에서 형질감염 유전자의 발현 수준을 높이기 위해서는, 해당 유전자가, 선택된 발현 숙주 내에서 기능을 발휘하는 전사 및 해독 발현 조절 서열에 작동가능하도록 연결되어야만 한다. 바람직하게는 발현 조절서열 및 해당 유전자는 세균 선택 마커 및 복제 개시점(replication origin)을 같이 포함하고 있는 하나의 발현 벡터 내에 포함되게 된다. 발현 숙주가 진핵세포인 경우에는, 발현 벡터는 진핵 발현 숙주 내에서 유용한 발현 마커를 더 포함하여야만 한다.

유전자를 발현시키기 위해 매우 다양한 발현 숙주/벡터 조합이 이용될 수 있다. 진핵 숙주에 적합한 발현 벡터에는, 예를 들어 SV40, 소 유두종바이러스, 아네노바이러스, 아데노-연관 바이러스(adeno-associated virus), 시토메갈로바이러스 및 레트로바이러스로부터 유래된 발현 조절 서열을 포함한다. 세균 숙주에 사용할 수 있는 발현 벡터에는 pBluescript, pGEX2T, pUC벡터, col E1, pCR1, pBR322, pMB9 및 이들의 유도체와 같이 E. coli에서 얻는 것을 예시할 수 있는 세균성 플라스미드, RP4와 같이 보다 넓은 숙주 범위를 갖는 플라스미드, λgt10과 λgt11, NM989와 같은 매우 다양한 파지 람다(phage lambda) 유도체로 예시될 수 있는 파지 DNA, 및 M13과 필라멘트성 단일가닥의 DNA 파지와 같은 기타 다른 DNA 파지가 포함된다.

상술한 발현 벡터에 의해 형질전환 또는 형질감염된 재조합 미생물은 본 발명의 또 다른 측면을 구성한다. 본원 명세서에 사용된 용어 "형질전환"은 DNA를 숙주로 도입하여 DNA가 염색체 외 인자로서 또는 염색체 통합완성에 의해 복제가능하게 되는 것을 의미한다. 본원 명세서에 사용된 용어“형질감염”은 임의의 코딩 서열이 실제로 발현되든 아니든 발현 벡터가 숙주 세포에 의해 수용되는 것을 의미한다.

발명의 숙주 세포는 원핵 또는 진핵생물 세포일 수 있다. 또한, DNA의 도입효율이 높고, 도입된 DNA의 발현효율이 높은 숙주가 통상 사용된다. E. coli, 슈도모나스, 바실러스, 스트렙토마이세스, 진균, 효모와 같은 주지의 진핵 및 원핵 숙주들, 스포도프테라 프루기페르다(SF9)와 같은 곤충 세포, CHO 및 생쥐 세포같은 동물 세포, COS 1, COS 7, BSC 1, BSC 40 및 BMT 10과 같은 아프리카 그린 원숭이 세포, 및 조직배양된 인간 세포는 사용될 수 있는 숙주 세포의 예이다.

도입된 DNA 서열은 숙주 세포와 동일한 종으로부터 얻을 수 있거나, 숙주 세포와 다른 종의 것일 수 있거나, 또는 그것은 어떠한 이종 또는 상동성 DNA를 포함하는 하이브리드 DNA 서열일 수 있다. 물론 모든 벡터와 발현 조절 서열이 본 발명의 DNA 서열을 발현하는데 모두 동등하게 기능을 발휘하지는 않는다는 것을 이해하여야만 한다. 마찬가지로 모든 숙주가 동일한 발현 시스템에 대해 동일하게 기능을 발휘하지는 않는다. 그러나, 당업자라면 과도한 실험적 부담없이 본 발명의 범위를 벗어나지 않는 채로 여러 벡터, 발현 조절 서열 및 숙주 중에서 적절한 선택을 할 수 있다. 예를 들어, 벡터를 선택함에 있어서는 숙주를 고려하여야 하는데, 이는 벡터가 그 안에서 복제되어야만 하기 때문이다. 벡터의 복제 수, 복제 수를 조절할 수 있는 능력 및 당해 벡터에 의해 코딩되는 다른 단백질, 예를 들어 항생제 마커의 발현도 또한 고려되어야만 한다. 발현 조절 서열을 선정함에 있어서도, 여러 가지 인자들을 고려하여야만 한다. 예를 들어, 서열의 상대적 강도, 조절가능성 및 본 발명의 DNA 서열과의 상용성 등, 특히 가능성있는 이차 구조와 관련하여 고려하여야 한다. 단세포 숙주는 선정된 벡터, 본 발명의 DNA 서열에 의해 코딩되는 산물의 독성, 분비 특성, 단백질을 정확하게 폴딩시킬 수 있는 능력, 배양 및 발효 요건들, 본 발명 DNA 서열에 의해 코딩되는 산물을 숙주로부터 정제하는 것의 용이성 등의 인자를 고려하여 선정되어야만 한다. 이들 변수의 범위내에서, 당업자는 본 발명의 DNA 서열을 발효 또는 대규모 동물 배양에서 발현시킬 수 있는 각종 벡터/발현 조절 서열/숙주 조합을 선정할 수 있다. 발현 클로닝에 의해 NSP 단백질의 cDNA를 클로닝 하려고 할 때의 스크리닝법으로서 바인딩법(binding법), 페닝법(panning법), 필름에멀션법(film emulsion 법)등이 적용될 수 있다.

재조합 단백질을 발현하기 위한 숙주세포는 짧은 시간 내 고농도 균체 배양이 가능하고 유전자 조작이 용이하고 유전학적, 생리적 특징이 잘 밝혀져 있는 대장균(Escherichia coli), 고초균(Bacillus subtillis) 등과 같은 원핵세포가 널리 이용되어 왔다.그러나, 단백질의 번역 후 수식(post-translational modification), 분비과정 및 활성형의 3차원 구조, 단백질의 활성상태의 문제점들을 해결하기 위해 최근 단세포 진핵세포인 효모 계열(Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisiae, Hansenula polymorpha 등), 사상성 진균류(filamentous fungi), 곤충세포(insect cells), 식물세포, 포유동물세포 mammalian cells) 등 고등생물에 이르기까지 재조합 단백질 생산의 숙주세포로 활용하고 있으므로, 실시예에서 예시된 대장균 뿐만 아니라 다른 숙주세포를 이용하는 것은 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 용이하게 적용가능하다.

본 발명의 다른 실시예에서는 상기 재조합 미생물에서 UDP-글루코오스 생성에 방해가 되는 유전자를 결실시켜 아스트라갈린의 생산 증대를 시도하였다. 상기 UDP-글루코오스 생성에 방해가 되는 유전자에는 글루코오스 인산 이성질화효소를 코딩하는 유전자(pgi), D-글루코오스-6-인산 탈수소효소를 코딩하는 유전자(zwf), 및 UDP-글루코오스 가수분해효소를 코딩하는 유전자(ushA) 등이 있다. 보다 구체적으로는 E. coli BL21(DE3)에서 UDP-글루코오스 생성에 방해가 되는 3종류 유전자(pgi, zwf, ushA)의 결실을 유도하였다. 상기 3종류 유전자 중 하나 이상이 결실된 대장균(△pgi; △zwf; △zwf △ pgi; △zwf △ pgi△ushA)에 본 발명에서 제작된 재조합 플라스미드를 도입하여 표 1에 기재된 바와 같이, 대장균 변이체 KG5, KG6, KG7, 및 KG8을 제작하였다. 상기 KG5, KG6, KG7, 및 KG8을 1%의 만노스(mannose)가 포함된 TB 배지에서 NRN을 보충하여 배양한 결과, KG5 KG6, KG7 및 KG8 균주에 의해 AST이 생성된다는 것을 확인하였고, 특히 KG8의 경우 KG3 균주보다 2.3배 높은 AST 생성능을 나타냈다.

따라서 본 발명은 다른 관점에서, 당으로부터 UDP-글루코오스를 생합성하는 경로를 가지고 있는 미생물에서 글루코오스 인산 이성질화효소(glucose phosphate isomerase), D-글루코오스-6-인산 탈수소효소(D-glucose-6-phosphate dehydrogenase), 및 UDP-글루코오스 가수분해효소(UDP-glucose hydrolase)를 코딩하는 유전자 중 하나 이상이 결실되어 있고, 플라본-3-수산화효소(flavanone-3-hydroxylase)를 코딩하는 유전자, 플라본 생성효소(flavonone synthase)를 코딩하는 유전자, 포스포글루코무타아제(phosphoglucomutase)를 코딩하는 유전자, 포도당-1-인산 우리딜일전달효소(glucose-1-phosphate uridylyltransferase)를 코딩하는 유전자 및 UDP-글리코실전달효소(UDP-glycosyltransferase, UGT)를 코딩하는 유전자가 도입되어 있으며, 나린제린을 기질로 하여 아스트라갈린 생성능을 가지는 미생물 변이체에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 유전자의 결실이란 상기 유전자가 염색체상 또는 플라스미드 상에서 삭제되어 상기 유전자가 코딩하는 단백질을 생산할 수 없게 된 상태를 의미한다.

본 발명의 다른 실시예에서는, 상기 미생물 변이체를 만노스(mannose), 과당ructose), 글리세롤(glycerol), 및 글루코오스(glucose) 중 하나 이상이 탄소원으로 포함된 TB배지에서 배양한 결과, 1%의 만노스(mannose), 1%의 과당(fructose), 1%의 글리세롤(glycerol), 및 1%의 글루코오스(glucose)가 포함된 TB 배지에서 가장 높은 성장률을 나타내는 것을 확인하였다.

본 발명에 따른 재조합 미생물 또는 미생물 변이체에 의한 아스트라갈린의 합성과정은 나린제린으로부터 플라본-3-수산화효소(flavanone-3-hydroxylase) 및 플라본 생성효소(flavonone synthase)에 의해 캄페롤이 생성되고, 상기 생성된 캄페롤을 UDP-글리코실전달효소(UDP-glycosyltransferase, UGT)에 의해 글루코실화하여 아스트라갈린으로 전환하는 단계를 거친다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

실시예 1 : 플라스미드 제작

본 발명의 일 실시예에서 사용된 균주, 벡터 및 플라스미드를 하기 표1에 나타내었다.

균주/ 플라스미드	설명	출처
종류
Escherichia coli
DH5α	일반적인 클로닝 숙주	Invitrogen
BL21(DE3)	ompT hsdT hsdS (r_B ^- m_B ^-) gal (DE3)	Novagen
F3H	pC-Atf3h를 함유 BL21(DE3)	본 발명
FLS1	pR-Atfls1를 함유 BL21(DE3)	본 발명
F3H-FLS1	pC-Atf3h-Atfls1를 함유 BL21(DE3)	본 발명
KG1	pC-Atf3h , pET- nfa44530 - galU 및 pET28-UGT78K1를 함유 BL21(DE3)	본 발명
KG2	pC-Atf3h , pET- nfa44530 - galU 및 pET28-At5g17050를 함유 BL21(DE3)	본 발명
KG3	pC-Atf3h-Atfls1 , pET- nfa44530 - galU 및 pET28-UGT78K1를 함유 BL21(DE3)	본 발명
KG4	pC-Atf3h-Atfls1 , pET- nfa44530 - galU 및 pET28-At5g17050를 함유 BL21(DE3)	본 발명
△zwf	zwf 결실된 E. coli BL21(DE3)	본 발명
△pgi	pgi 결실된 E. coli BL21(DE3)	본 발명
△zwf△pgi	zwf 및 pgi가 결실된 이중 결실 돌연변이	본 발명
△zwf△pgi△ushA	zwf, pgi, 및 ushA이 결실된 삼중 결실 돌연변이	본 발명
KG5	pC-Atf3h-Atfls1 , pET- nfa44530 - galU 및 pET28-UGT78K1를 함유 △zwf	본 발명
KG6	pC-Atf3h-Atfls1 , pET- nfa44530 - galU 및 pET28-UGT78K1를 함유 △pgi	본 발명
KG7	pC-Atf3h-Atfls1, pET-nfa44530-galU 및 pET28-UGT78K1를 함유 △zwf△pgi	본 발명
KG8	pC-Atf3h-Atfls1, pET-nfa44530-galU 및 pET28-UGT78K1를 함유 △zwf△pgi△ushA	본 발명

플라스미드 벡터
pETDuet-1	Double T7 promoters, ColE1 ori, Amp^r	Novagen
pCDFDuet-1	Double T7 promoters, CloDF13 ori, Sm^r	Novagen
pRSFDuet-1	Double T7 promoters, RSF ori, Km^r	Novagen
pET28a(+)	Expression vector with T7 promoter, p15A ori, Km^r	Novagen
pC-Atf3h	Arabidopsis thaliana 유래 AT3G51240 함유 CDF-Duet-1	본 발명
pC-Atf3h - Atfls1	Arabidopsis thaliana 유래 AT3G51240 및 AT5G08640함유 CDF-Duet-1	본 발명
pET-nfa44530 - galU	Nocardia farcinica 유래 nfa44530 및 E. coliK12 유래 d galU 함유 pETDuet -1	본 발명
pET28-At5gl7050	A. thaliana 유래 At5g17050 함유 pET28a(+)	본 발명
pET14b-UGT78K1	Glycine max (L.) Merr 유래 UGT78K1 함유 pET14b	Kovinich et al., 2010
pET28-UGT78K1	Glycine max (L.) Merr 유래 UGT78K1 함유 pET28(+)	본 발명

E. coli BL21(DE3)를 플라보노이드(flavonoid) 제조/변형(production/modification)에 사용하였고, 대장균(Escherichia coli) DH5α (Invitrogen, Seoul, Korea)를 플라스미드 클로닝과 균주 증식에 사용하였다. pET-28a(+), CDF-Duet-1, RSF-Duet-1, 및 pET-Duet-1 벡터(Novagen)를 클로닝과 서브클로닝(subcloning)에 사용하였다. pGEM®-T system(Promega, USA)은 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR) 단편을 클로닝과 염기서열분석(sequencing)에 벡터로서 사용하였다. Red helper plasmid pKD46(GenBank #AY048746), 클로람페니콜(chloramphenicol) 내성 마커의 PCR 증폭을 위한 플라스미드 pKD3, 항생제 마커를 제거하기 위한 플라스미드 pCP20을 E. coli BL21(DE3)에서 FLP-FRT 관련된 유전자를 녹아웃(knockout)하기 위해 사용하였다(Datsenko KA et al., Proc Natl Acad Sci USA, 97(12), 6640-5, 2000; B. Doublet et al., Journal of Microbiological Methods, 75, 359-361, 2008). 모든 DNA 조작은 표준 프로토콜에 따라 수행하였다.

E. coli 균주는 플라스미드의 선택과 유지에 필요할 때 일상적으로 항생제의 (앰피실린 100 μg/mL, 클로람페니콜 25 μg/mL, 스트렙토마이신/스펙티노마이신 50 μg/mL and kanamycin 35 μg/mL) 적절한 양을 추가한 LB 배지 또는 고형 배지에서 배양하였다. 플라보노이드 제조에 대해, LB 배지, 약간 변형된 M9 최소 배지(minimal medium) 또는 변형된 TB 배지를 실험 내내 사용하였다. NRN과 KMF는 시그마-알드리치에서 구입하였다. 제한효소와 T4 DNA 리가에제(ligase)는 New England Biolabs와 Promega로부터 구입하였다. 표준 프라이머(standard primer)는 DNA 사슬종결방법 (dideoxynucleotide chain termination method)에 따라 DNA 염기서열분석에 사용하였다. DNA 염기서열은 자동 DNA 염기서열 분석기로 하였다.

1-1 : pC - Atf3h 및 pC - Atfls1 제작

나린제닌-3-이산소화효소를 코딩하는 유전자(AT3G51240; GenBank accession no. NP 190692)를 증폭하기 위하여, A. thaliana(TAIR)의 cDNA를 주형으로 하고, AT3G51240 F(서열번호 1)와 AT3G51240 R(서열번호 2)의 프라이머 쌍을 이용하여 PCR을 수행하였다. 증폭된 PCR 생성물을 Nc0I/EcoRI 제한효소로 잘려진 pCDFDuet-1(Novagen)에 클로닝하여 pC- Atf3h를 제작하였다(Malla S et al., Appl Environ Microbiol, 78:684-694, 2012).

다음으로, 플라본 생성효소를 코딩하는 유전자를 증폭하기 위하여, A. thaliana의 cDNA를 주형으로 하고, FLS1 F(서열번호 3: 5´-CAT ATG GAG GTC GAA AGA GTC CAA GAC ATT-3´, 밑줄은 NdeI 제한효소 위치)와 FLS1 R(서열번호 4: 5´- A GGT ACC TCA ATC CAG AGG AAG TTT ATT GAG-3´, 밑줄은 KpnI 제한효소 위치)의 프라이머 쌍을 이용하여 PCR을 수행하였다. 증폭된 PCR 생성물을 증폭된 PCR 생성물을 Nc0I/EcoRI 제한효소로 잘려진 pCDFDuet-1(Novagen)에 클로닝하여 pC- Atfls1을 제작하였다.

1-2 : pC - Atf3h - Atfls1 제작

fls1 (AT5G08640, 1011 bp, Genbank accession no. NP_001190266)을 증폭하기 위하여, A. thaliana의 cDNA를 주형으로 하고, 올리고뉴클레오티드 FLS1 F (서열번호 3: 5´-CAT ATG GAG GTC GAA AGA GTC CAA GAC ATT-3´, 밑줄은 NdeI 제한효소 위치)와 FLS1 R(서열번호 4: 5´- A GGT ACC TCA ATC CAG AGG AAG TTT ATT GAG-3´, 밑줄은 KpnI 제한효소 위치)의 프라이머 쌍을 이용하여 PCR을 수행하였다. 증폭된 PCR 생성물을 NdeI/KpnI 제한효소로 잘려진 pC-Atf3h에 클로닝하여 pC-Atf3h-Atfls1을 제작하였다.

1-3 : pET - nfa44530 - galU 제작

nfa44530과 galU 유전자를 증폭하기 위하여, nfa44530 F(서열번호 5)과 nfa44530 R(서열번호 6), 및 galU F(서열번호 7)과 galU R(서열번호 8)의 프라이머 쌍을 이용하여 PCR을 수행하였다. nfa44530은 Nocardia farcinica IFM10152에서 PCR을 수행하였고, galU는 E.coli K12에서 PCR을 수행하였다. 증폭된 PCR 생성물을 각각 EcoRI/HindⅢ 제한효소 및 EcoRV/KpnI 제한효소로 잘려진 pETDuet-1(Novagen)의 MCS1 및 MCS2에 클로닝하여 pET-nfa44530-galU를 제작하였다(Pandey RP et al., Appl Microbiol Biotechnol . Oct 5. [ Epub ahead of print ], 2012).

1-4 : pET28 - UGT78K1 제작

Kovinich에 의하여 제공된 pET14b-UGT78K1 재조합 벡터는 NdeI/BamHI로 제거하였고 pET28-UGT78K1를 만들기 위해 pET28a(+)의 각각의 위치에 복제하였다(Kovivich N et al., Phytochemistry, 71:1253-1263, 2010).

1-5 : pET28 - At5g17050 제작

A. thaliana 유래 당화효소(glycosyltransferase) AT5G17050 (UGT78D2) (Genbank accession no. NP_197207)를 코딩하는 유전자를 증폭하기 위해, U15892(Source TAIR)를 주형으로 At5g17050 F(서열번호 9: 5´- CAT ATG ATG ACC AAA CCC TCC GAC CCA A -3´, 밑줄은 NdeI 제한효소 위치)와 At5g17050 R (서열번호 10: 5´- AAG CTT TCA AAT AAT GTT TAC AAC TGC A-3´, 밑줄은 HindIII 제한효소 위치)의 프라이머 쌍을 이용하여 PCR을 수행하였다. 증폭된 PCR 생성물을 pET-28a(+)(Novagen)의 NdeI/KpnI 위치로 복제하여 pET28-At5g17050을 제작하였다.

실시예 2 : 재조합 미생물 제작

2-1 : F3H, FLS1 , F3H- FLS1

실시예 1-1에서 제작된 pC-Atf3h 플라스미드를 E. coli BL21(DE3)에 도입하여 재조합 미생물 F3H를 제작하였고, 실시예 1-1에서 제작된 pC-Atfls1 플라스미드를 E. coli BL21(DE3)에 도입하여 재조합 미생물 FLS1을 제작하였다. 또한 실시예 1-2에서 제작된 pC-Atf3h-Atfls1 플라스미드를 E. coli BL21(DE3)에 도입하여 재조합 미생물 F3H-FLS1을 제작하였다.

2-2 : KG1 , KG2 , KG3 및 KG4

실시예 1-1, 1-3, 및 1-4에서 제작된 pC-Atf3h , pET- nfa44530 - galU및 pET28-UGT78K1을 E. coli BL21(DE3)에 도입하여 재조합 E. coli KG1을 제작하였다.

실시예 1-1, 1-3, 및 1-5에서 제작된 pC-Atf3h , pET- nfa44530 - galU및 pET28-At5g17050을 E. coli BL21(DE3)에 도입하여 재조합 E. coli KG2를 제작하였다.

실시예 1-2, 1-3, 및 1-4에서 제작된 pC-Atf3h - Atfls1 , pET- nfa44530 - galU및 pET28-UGT78K1을 E. coli BL21(DE3)에 도입하여 재조합 E. coli KG3을 제작하였다.

실시예 1-2, 1-3, 및 1-5에서 제작된 pC-Atf3h - Atfls1 , pET- nfa44530 - galU및 pET28-At5g17050을 E. coli BL21(DE3)에 도입하여 재조합 E. coli KG4를 제작하였다.

실시예 3 : E. coli 녹아웃 변이체 제작

녹아웃(Knock-out) 변이체는 어느 특정 유전자의 발현을 막는 것으로써, 보통은 목적 유전자가 결실되게 하거나 변이한 유전자로 바꾸어 놓음으로써 유전자가 작용하지 않도록 한다. UDP-sugar 풀(pool)을 증가시키기 위해 E. coli BL21(DE3)의 염색체(chromosomal)에서 UDP-글루코오스 생성에 방해가 되는 3종류 유전자 pgi, zwf 및 ushA 중 하나 이상이 결실된 대장균 변이체를 제작하였다(Datsenko KA et al., Proc Natl Acad Sci USA, 97:6640-6645, 2000).

AST 생산의 증가를 위하여, E. coli BL21(DE3)이 세포내부 UDP-glucose 집단을 향상시키기 위하여 사용되었다. UDP-글루코오스가 합성되는 동안, 글루코오스는 과당-6-인산(fructose-6-phosphate, F6P) 및 6-포스포글루콘산(6-phosphogluconate, 6PG) 형성을 위한 일반적인 선구체인 글루코오스-6-인산(glucose-6-phosphate, G6P)로 전환된다. 염색체 zwf 및 pgi의 단일 결실 (E. coli BL21(DE3) △pgi, E. coli BL21(DE3) △zwf) 및 이중 결실(E. coli BL21(DE3) △zwf△pgi) 돌연변이는 G6P로부터 UDP-글루코오스로의 생합성 경로를 이끌기 위하여 생성하였다. 게다가, 염색체 ushA는 내부적으로 생산된 UDP-글루코오스의 UDP와 글루코오스로의 분리를 막기 위한 E. coli 삼중 결실 돌연변이 BL21(DE3) △pgi△zwf△ushA를 생성하기 위하여 이중 결실 돌연변이로부터 결실되었다.

E. coli BL21(DE3)에서 pgi, zwf 및 ushA 유전자를 FLP/FRT 시스템과 DelpgiF(서열번호 11)/DelpgiR(서열번호 12), DelzwfF(서열번호 13)/DelzwfR(서열번호 14), DelushAF(서열번호 15)/DelushAR(서열번호 16) 프라이머를 이용하여 최종적으로 pgi, zwf , ushA 유전자가 결실된 미생물 녹아웃 변이체를 확보하였다. FLP/FRT 시스템은 유기물의 DNA를 생체 내에서(in vivo) 증폭시키기 위한 위치특이적(site-directed) 재조합 기술이다. 효모 사카로마이세스 세레비지아(Saccahromyces cerevisiae)에서 유래된 플립파아제(flippase, FLP) 재조합효소를 사용하는데, FLP가 FLP 재조합효소 대상(FLP recombinase target) 시퀀스를 인식하는 것에 의하여 수행된다(Golic K. G., Cell, 59:499-509, 1989).

△zwf는 zwf, △pgi는 pgi , △zwf △ pgi는 zwf 및 pgi , △zwf △ pgi△ushA는 zwf, pgi , 및 ushA가 결실된 E. coli BL21(DE3)이다(표 1).

실시예 4 : 미생물 변이체 제작

E. coli KG5는 실시예 3에서 제작된 대장균 △zwf에 실시예 1-2, 1-3, 및 1-4에서 제작된 pC-Atf3h - Atfls1 , pET- nfa44530 - galU및 pET28-UGT78K1을 E. coli BL21(DE3)에 도입하여 제작하였다.

E. coli KG6는 실시예 3에서 제작된 대장균 △pgi에 실시예 1-2, 1-3, 및 1-4에서 제작된 pC-Atf3h - Atfls1 , pET- nfa44530 - galU및 pET28-UGT78K1을 E. coli BL21(DE3)에 도입하여 제작하였다.

E. coli KG7은 실시예 3에서 제작된 대장균 △zwf △ pgi에 실시예 1-2, 1-3, 및 1-4에서 제작된 pC-Atf3h - Atfls1 , pET- nfa44530 - galU및 pET28-UGT78K1을 E. coli BL21(DE3)에 도입하여 제작하였다.

마지막으로, E. coli KG8은 실시예 3에서 제작된 대장균 △zwf △ pgi△ushA에 실시예 1-2, 1-3, 및 1-4에서 제작된 pC-Atf3h - Atfls1 , pET- nfa44530 - galU및 pET28-UGT78K1을 E. coli BL21(DE3)에 도입하여 제작하였다(표 1).

실시예 5 : KMF 의 생산 및 분석

NRN은 두 효소적 단계를 통하여 KMF로 전환되고 두 반응 단계 모두 A. thaliana 유래 두 기능을 가진 동일효소(FLS1)에 의하여 촉진될 수 있다. 실시예 2-1에서 제작된 E. coli FLS1 균주와 E. coli F3H-FLS1 균주에 의한 NRN으로부터 KMF의 생산은 LB와 M9 배지 모두에서 24시간 배양 후 분석하였다.

E. coli FLS1 균주는 LB 배지에서 20.3 mg/L (70 μM) DHK, 6.7 mg/L (23.4 μM) KMF를 생산한 반면, 500 μM NRN 함유 M9 배지에서는 48.2 mg/L (167 μM) DHK, 25.1 mg/L (87.7 μM) KMF를 생산하였다(도 2). 잔여 NRN의 정량화는 추가된 NRN의 60% 이상이 LB 및 M9 배지 모두에서 FLS1 효소에 의해 사용되지 않았음을 나타낸다.

E. coli F3H-FLS1는 LB 배지에서 20.9 mg/L (72.5 μM) DHK, 56.5 mg/L (197.4 μM) KMF를 생산한 반면, 잔여 NRN이 10% 미만인 M9 최소 배지에서는 10.7 mg/L (37.1 μM) DHK, 58.9 mg/L (205.8 μM) KMF를 생산하였다(도 2). KMF의 생산 후, 배지액(culture broth)의 색은 눈에 띄게 노란색으로 변하였다(도 8).

DHK 및 KMF의 생산은 각각 잔류시간 15.8분과 21.1분에 피크를 보이는 HPLC에 의해 감지되었다(도 3). 후에 그것을 LC-QTOF-ESI/MS와 ¹H-NMR spectroscopy에 의해서 확인하였다(표 2). ESI-MS는 DHK에 대해 m/z 287.0569에서 준분자 이온 피크 [M-H]^-를 나타내는 반면(도 4), KMF에 대해서는 m/z 285.0392에서 나타내었다.

수소의 위치	나린제닌	DHK	캄페롤	아스트라갈린
2	5.44, dd (J=2.88, 12.84 Hz)	5.04, d (J= 11.4 Hz)
3 수평	2.68. cis, dd (J=3, 17.1 Hz)	4.58, d (J= 11.4 Hz)
3 수직	3.26, trans, q (J=12.84, 17.1 Hz)
4
5
6	5.87, s	5.85, s (J= 1.8 Hz)	6.18, s (J= 1.92 Hz)	6.20, s (J= 2.04 Hz)
7
8	5.87, s	5.91, s (J= 1.86 Hz)	6.43, s (J= 1.92 Hz)	6.43, s (J= 1.98 Hz)
9
10
1
2	7.31, d, (J=8.52 Hz)	7.30, d (J= 8.4 Hz)	8.03, d (J= 8.82 Hz)	8.04, d (J= 8.82 Hz)
3	6.79, d, (J=8.52 Hz)	6.78, d (J=8.4 Hz)	6.92, d (J= 8.82 Hz)	6.88, d (J= 8.82 Hz)
4
5	6.79, d, (J=8.52 Hz)	6.78, d (J=8.4 Hz)	6.92, d (J= 8.82 Hz)	6.88, d (J= 8.82 Hz)
6	7.31, d, (J=8.52 Hz)	7.30, d (J= 8.4 Hz)	8.03, d (J= 8.82 Hz)	8.04, d (J= 8.82 Hz)
5-OH	12.14, s	11.90, s	12.47, s	12.61, s
7-OH	10.77, s	10.81, s	10.77, s	10.85, s
4-OH	9.57, s	9.54, s	9.59, s	10.17, s
3-OH			9.38, s

글루코오스
1				5.46, d ( J= 7.5 Hz)
2				3.56, d (J= 11.4 Hz)
3				3.32, b
4				3.21, b
5				3.17, b
6				3.08, b
6				3.07, b

실시예 6 : AST 의 생산 및 분석

6-1 : KG1 , KG2 , KG3 , 및 KG4 에 의한 AST 의 생산 및 분석

실시예 2-2에 따라 제작된 KG1과 KG2를 이용한 전체 세포 생체 내 변화는 UGT가 100 μM NRN 함유 LB 배지에서 글리코실화된 NRN 또는 DHK 물질을 생산할 수 있는지를 분석하기 위하여 수행하였다. 48시간 후 반응 생성물의 HPLC 분석은 FLS1 효소가 플라보놀 화합물을 생성하기 위한 3-O-글리코실화에 필수적이라는 것을 나타내며, UGT78K1(도 9의 A)와 UGT78D2(도 9의 B) 모두 어떠한 글리코실화된 NRN 또는 DHK의 생성 없이 오로지 DHK(잔류 시간의 피크: 15.8 분)의 형성만을 나타냈다. UGT78D2는 At5g17050과 같은 유전자이다.

재조합 플라스미드가 도입된 대장균 균주를 적당한 항생제를 가지는 3ml LB 액상배지에서 37℃ 220 rpm으로 밤새도록 전-배양하였다(precultured). 다음날, 전배양액(preinoculum) 500 ㎕는 20 ml LB 액상배지로 옮겼고, 600 nm 흡광도(OD600nm)가 대략 0.6에 이르기까지 37℃에서 배양하였다. 그리고 나서, IPTG(isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside)는 마지막 농도가 1 mM이 되도록 넣고, 바이오매스(biomass)를 증가시키기 위해 30℃에서 5시간 배양하였다. 세포 펠렛(cell pellet)은 원심분리에 의해 모았고 NRN 첨가 후 1 mM IPTG를 포함하는 LB 또는 TB 또는 M9 최소 배지 (원심분리 전 배양 배지와 동일 용량)에서 재부유시켰다(resuspend). 그리고 나서 플라스크는 24-60 시간 동안 30℃에서 220 rpm으로 배양하였다(실험에 의존적으로). 배양 배지는 동일 용량의 에틸 아세트산(ethyl acetate)으로 추출하였다. 유기층을 모았고, 유기용매를 없애기 위하여 증발(evaporation)에 의해 건조하여 농축시켰다. 남아있는 생산물은 HPLC와 LC-QTOF-ESI/MS 분석을 위해 메탄올에 녹였다.

상기 추출한 플라보노이드는 종래의 방법을 이용하여 HPLC 분석하였다. HPLC 크로마토그램에서 DHK, NRN 및 KMF는 각각 15.8분, 19.7분 및 21.1분의 잔류 시간(retention time)에서 피크가 나타났다(도 3). 플라보노이드 정량에 대해, KMF와 DHK의 정량곡선 (calibration curve)은 10, 20, 30, 40 및 50 ㎍/ml 농도를 사용하여 그렸다. 화합물의 정확한 질량(mass)은 LC-QTOF-ESI/MS를 이용하여 분석하였다. MS 스펙트럼은 음성 이온 모드(negative ion mode)에서 획득하였다.

실시예 2-2에 따라 제작된 E. coli KG3(fls1, f3h, nfa44530, galU 및 ugt78K1 유전자들을 포함하는 E. coli)는 M9 최소 배지 1L에서 배양하였다. 1 mM IPTG로 유도(induction)되는 동안 500 μM NRN을 첨가하였고, 24시간 유도 후에, 분리 과정은 동일한 방법으로 수행하였다. 추출된 정제되지 않은 화합물은 PREP-HPLC에서 분리하였다. 분획을 모아, 정제된 분획은 동결건조기(lyophilizer)에서 완벽히 건조하였다. 정제된 화합물의 구조 설명은 ¹H-NMR과 ¹³C-NMR 분광기 (spectroscopy)에 의해 결정하였다.

NMR 스펙트럼은 Bruker Advance 600 instrument (600 MHz)을 이용하여 DMSO-d ₆로 샘플을 녹여서 얻었다. ¹H-NMR 실험에 대해, 32 transients spectra (신호 스펙트럼)은 8000 Hz의 spectral width로 얻었다. 모든 NMR 데이터는 XWINNMR을 이용하여 처리하였다. DHK, KMF 및 AST의 구조는 NMR 데이터의 해석(interpretation)을 기초로 결정하였다(도 4).

E. coli 유전자 재조합 균주 KG3 및 KG4에 의한 글리코실화된 캄페롤의 생산은 48시간의 반응 시간에 M9 최소 배지에 NRN을 보충하여 분석하였다. 두 균주(strain)의 HPLC 크로마토그램에서 잔류 시간 14.3분에 새로운 피크가 나타났고(도 3) LC-QTOF-ESI/MS는 m/z 447.0915에서 준분자 이온 피크 [M-H]^-를 나타냈는데(도 4), 이는 NMR 분석에 의하여 AST로 후에 확인되었다(표2 및 표3). 48시간 배양 후, 균주 KG3는 500 μM NRN 함유 LB, M9, TB 배지에서 각각 7.5 mg/L (16.7 μM), 13.3 mg/L (29.6 μM), 및 22.7 mg/l (49.3 μM) AST를 생산하였다. 반면에, 균주 KG4는 500 μM NRN 함유 LB, M9, TB 배지에서 각각 4.9 mg/L (10.9 μM), 11.5 mg/L (25.6 μM), 및 17.2 mg/L (38.3 μM) AST를 생산하였다(도 5).

탄소의 위치	ppm
C-2	156.2
C-3	133.1
C-4	177.4
C-5	161.2
C-6	98.6
C-7	164.1
C-8	93.6
C-9	156.3
C-10	104
C-1	120.9
C-2, C-6	130.8
C-3 ,C-5	115.1
C-4	159.9
C-1	100.8
C-2	74.2
C-3	77.5
C-4	69.8
C-5	76.4
C-6	60.8

DHK와 KMF의 구조는 ¹H-NMR 분석에 의하여 확인한 반면에 AST의 구조는 ¹³C NMR 뿐만 아니라 ¹H-NMR 분석에 의해서 확인하였다(표 2 및 표3; 도 10 내지 도 14).δ5.04 (1H, d, J= 11.4 Hz, H-2)및 δ4.58 (1H, d, J= 11.4 Hz, H-3)에서의 DHK의 ¹H-NMR 신호는 이 탄소에 OH기가 붙어 있다는 것을 확인하며, C-3 위치에 오로지 하나의 수소가 있다는 것을 나타낸다. 반면에, 이러한 신호들은 C-2와 C-3 탄소 사이에 이중결합의 존재를 확인하는 KMF의 ¹H-NMR 신호에서는 존재하지 않았다.

AST의 ¹H-NMR에서, 스펙트럼의 다운필드 부분은 KMF와 같은 패턴이었다. 게다가, 아노머 당 양성자가 δ5.46 (1H, d, J= 7.5 Hz)에서 이중항으로 발견되었고 δ3.56-3.07(m, 육탄당의 남아있는 양성자)에서의 다른 특징적 추가 신호는 글루코오스 부분의 존재를 나타낸다. 아노머 양성자의 결합 상수는 KMF의 당 가지의 β-결합을 확인하며, 7 Hz 이상이다. ¹³C NMR 데이터는 12 탄소 신호를 보이는데, 15개는 플라본 골격에 전형적이고 6개는 클루코오스 부분(moiety)에 할당된 것이다. 육탄당은 인쇄 자료에 양성자와 탄소의 업필드 이동 값의 비교에 의하여 아글리콘의 C-3 위치에 결합된 글루코피라노실(glucopyranosyl) 단위가 되는 것으로 결정되었다. 그러므로, 화합물 3은 캄페롤-3-O-β-D-글루코피라노시드(AST)로 인식된다.

6-2 : KG5 , KG6 , KG7 , 및 KG8 에 의한 AST 의 생산 및 분석

실시예 4에 따라 제작된 KG5, KG6, KG7 및 KG8로부터의 AST 생산량을 KG3와 비교하였다. 다른 시간 간격을 두고 500 μM NRN 함유 1% 만노스의 TB 배지에서 분석하였다(도 6의 B). 60시간 배양 후, 24.3 mg/L (54.2 μM), 24.5 mg/L (54.6 μM), 30.1 mg/L (67.1 μM), 51.9 mg/L (115.8 μM), 및 55.6 mg/L (124.0 μM)의 AST가 E. coli KG3, KG5, KG6, KG7, 및 KG8 균주에 의해 각각 생산되었다. KG8은 모든 돌연변이 균주 중에서 최대의 AST를 생성하는데, 이는 KG3 균주(strain)의 생산보다 2.3 배 높은 것이다.

실시예 7 : AST 생산을 위한 배지 최적화

실시예 4에서 제작된 E. coli KG5, KG6, KG7 및 KG8을 이용하여, 1%의 만노스 함유 LB, M9, TB 배지에서 모든 E. coli 돌연변이의 성장 곡선 분석은 E. coli 균주의 가장 높은 성장이 1% 만노스 함유 TB에서 나타난다는 것을 보이는 반면, 1% 만노스 함유 M9에서 가장 낮은 성장을 나타냈다(도 6의 A).

아울러 E. coli KG8을 이용하여, 500 μM NRN과 1% 만노스를 비롯한 다양한 탄소원을 보충하면서, AST의 생산을 반응 시간 60시간 배양 후 분석하였다(도 6의 C). 1% 만노스와 1% 과당 함유 TB 배지에서는 AST 생산에서 눈에 띄는 증가가 없었다. 반면에, 만노스와 과당을 비롯한 1% 글리세롤의 추가는 생산 단계를 74.7 mg/L (166.7 μM)까지 증가시켰다. 게다가, TB 배지에 1%의 만노스, 과당, 글리세롤, 및 글루코오스(총 4% 탄소 소스)의 추가는 101.2 mg/L (225.8 μM)의 AST를 생산하는데, 이는 AST의 최대 생산량(약 30% 증가된 수준)이다. 비록 글리세롤과 글루코오스의 추가가 눈에 띄게 AST 생산을 증가시킨다고 하더라도, TB 배지에 글리세롤과 글루코오스의 추가는 생산 수준을 더 이상 증가시키지 않았다.

실시예 8 : 발효에 의한 규모 확대

3L의 수용용량을 가지는 멸균할 수 있는 유리 발효기 시스템(glass autoclavable self controlled fermentor system)을 AST의 대용량 생산에 사용하였다. 가장 높은 생물전환 수용용량(highest bioconversion capacity)을 가지는 E. coli KG8을 필요한 항생제를 함유한 5 ml LB 배지에서 37℃, 220 rpm 동안 밤새 배양하였다. 밤새 배양된 배지는 발효기에 대해 접종물(inoculum)로 준비되기 위해 항생제를 함유한 300 ml LB 배지로 옮겼다. 37℃, 220 rpm에서 16시간 배양 후에, 접종물을 무균상태로 발효기에 옮겼다. 발효기에서 최적의 변형된 TB 배지(1% 만노스 + 1% 과당 + 1% 글리세롤 및 1% 글루코오스가 추가)를 AST 생산에 사용하였다. pH 미터와 용존산소량 (dissolved oxygen, DO) 프로브(probe)는 제조사 프로토콜에 따라 교정하였다(calibrate). pH는 상업적으로 사용할 수 있는 수산화 암모늄 (ammonium hydroxide) 28%를 이용하여 배양 동안 7.0을 유지하였다. DO 레벨은 시작할 때 95%를 유지하였고 실험 동안 20% 이하로 내려가지 않았다. 600 nm에서 흡광도가 5보다 위에 있을 때, 배양하는 곳에 1 mM IPTG로 유도하였고 온도는 30℃로 낮췄다. 배양유도 5시간 후에, NRN의 마지막 농도가 500 μM이 되도록 첨가하였고 60시간까지 배양하였다. 유가배양(fed-batch culture)은 실험기간 동안 NRN의 첨가 시작 후 30시간까지 매시간 멸균된 글루코오스 용액 (600 g/L) 20 ml를 추가하였다. 샘플들은 36시간까지 6시간 간격으로 수집하였고 그리고 나서 생산물 생산의 정량을 위해 60시간까지 12시간 간격으로 수집하였다. 배양물은 동일용량의 에틸 아세트산(ethyl acetate)으로 2번 추출하였고 생산물은 HPLC로 분석하였다. 그리고 정제와 정량에 사용하였다. 추가된 NRN은 주로 발효 말기에 AST로 완전히 전환되는 KMF로 전환되었다(도 7). 보충된 거의 모든(99.8%) NRN은 60시간 안에 AST 328 mg(즉, 109.3 mg/L, 244 μM)을 생산하는 발효 과정 동안 소비되었다. 그러므로, 균주의 대사 공학과 배지 구성 다양화에 의한 발효 조건의 최적화에 의해 500 μM NRN 첨가 하에서 48.8%의 AST가 생성되는 것을 확인하였다.

<110> SUNMOON UNIVERSITY INDUSTRY- UNIVERSITY COOPERATION FOUNDATION <120> Method for Preparing Astragalin from Naringenin Using Microorganism Mutants <130> P13-B023 <160> 16 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AT3G51240 F <400> 1 ccatggcaat ggctccagga actttga 27 <210> 2 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AT3G51240 R <400> 2 gaattcctaa gcgaagattt ggtcgaca 28 <210> 3 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FLS1F <400> 3 catatggagg tcgaaagagt ccaagacatt 30 <210> 4 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FLS1R <400> 4 aggtacctca atccagagga agtttattga g 31 <210> 5 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nfa-44530F <400> 5 gaattcgatg atcctgatga cgagccggg 29 <210> 6 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nfa-44530R <400> 6 aagctttcac ggctggagcg ccttgcc 27 <210> 7 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> galUF <400> 7 gatatcgatg gctgccatta atacgaaagt 30 <210> 8 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> galUR <400> 8 ggtaccttac ttcttaatgc ccatctcttc 30 <210> 9 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> At5g17050F <400> 9 catatgatga ccaaaccctc cgacccaa 28 <210> 10 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> At5g17050R <400> 10 aagctttcaa ataatgttta caactgca 28 <210> 11 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DelpgiF <400> 11 ttccaaagtc acaattctca aaatcagaag agtattgcta gtgtaggctg gagctgcttc 60 60 <210> 12 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DelpgiR <400> 12 gcggcgtgaa cgccttatcc ggcctacata tcgacgatga catatgaata tcctccttag 60 60 <210> 13 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DelzwfF <400> 13 ctggcttaag taccgggtta gttaacttaa ggagaatgac gtgtaggctg gagctgcttc 60 60 <210> 14 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DelzwfR <400> 14 atgttaccgg taaaataacc ataaaggata agcgcagata catatgaata tcctccttag 60 60 <210> 15 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DelushAF <400> 15 ctatttttca acacgttgaa atcaggtcag ggagagaagt gtgtaggctg gagctgcttc 60 60 <210> 16 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DelushAR <400> 16 ttaagcattg tgccggatgc aaacatccgg cactttcgga catatgaata tcctccttag 60 60

Claims

당으로부터 UDP-글루코오스를 생합성하는 경로를 가지고 있는 대장균에 플라본-3-수산화효소(flavanone-3-hydroxylase)를 코딩하는 유전자, 플라본 생성효소(flavonone synthase)를 코딩하는 유전자, 포스포글루코무타아제(phosphoglucomutase)를 코딩하는 유전자, 포도당-1-인산 우리딜일전달효소(glucose-1-phosphate uridylyltransferase)를 코딩하는 유전자 및 UDP-글리코실전달효소(UDP-glycosyltransferase, UGT)를 코딩하는 유전자가 도입되어 있고 나린제린을 기질로 하여 하기 화학식 1로 표현되는 아스트라갈린 생성능을 가지는 재조합 대장균.
[화학식 1]
제1항에 있어서, 플라본-3-수산화효소(flavanone-3-hydroxylase)를 코딩하는 유전자, 플라본 생성효소(flavonone synthase)를 코딩하는 유전자, 포스포글루코무타아제(phosphoglucomutase)를 코딩하는 유전자, 및 포도당-1-인산 우리딜일전달효소(glucose-1-phosphate uridylyltransferase)를 코딩하는 유전자는 각각 Atf3h, Atfls1, nfa44530, 및 galU인 것을 특징으로 하는 재조합 대장균.
제1항에 있어서, UDP-글리코실전달효소(UDP-glycosyltransferase, UGT)를 코딩하는 유전자는 UGT78K1 또는 At5g17050인 것을 특징으로 하는 재조합 대장균.
삭제
제1항에 있어서, 상기 UDP-글리코실전달효소(UDP-glycosyltransferase, UGT)는 애기장대풀(Arabidopsis thaliana) 유래인 것을 특징으로 하는 재조합 대장균.
제1항 내지 제3항 및 제5항 중 어느 한 항의 재조합 대장균을 이용하여, 나린제닌으로부터 아스트라갈린을 제조하는 방법.
제6항에 있어서, 다음 단계를 거치는 것을 특징으로 하는 아스트라갈린의 제조방법:
(a) 나린제닌을 플라본-3-수산화효소(flavanon-3-hydroxylase) 및 플라본 생성효소(flavonone synthase)에 의해, 캄페롤으로 전환시키는 단계: 및
(b) 상기 전환된 캄페롤을 UDP-글루코실전달효소(UDP-glycosyltransferase, UGT)로 글루코실화하여 아스트라갈린으로 전환시키는 단계.
당으로부터 UDP-글루코오스를 생합성하는 경로를 가지고 있는 대장균에서 글루코오스 인산 이성질화효소(glucose phosphate isomerase), D-글루코오스-6-인산 탈수소효소(D-glucose-6-phosphate dehydrogenase), 및 UDP-글루코오스 가수분해효소(UDP-glucose hydrolase)를 코딩하는 유전자 중 하나 이상이 결실되어 있고, 플라본-3-수산화효소(flavanone-3-hydroxylase)를 코딩하는 유전자, 플라본 생성효소(flavonone synthase)를 코딩하는 유전자, 포스포글루코무타아제(phosphoglucomutase)를 코딩하는 유전자, 포도당-1-인산 우리딜일전달효소(glucose-1-phosphate uridylyltransferase)를 코딩하는 유전자 및 UDP-글리코실전달효소(UDP-glycosyltransferase, UGT)를 코딩하는 유전자가 도입되어 있으며, 나린제린을 기질로 하여 아스트라갈린 생성능을 가지는 대장균 변이체.
제8항에 있어서, 글루코오스 인산 이성질화효소(glucose phosphate isomerase), D-글루코오스-6-인산 탈수소효소(D-glucose-6-phosphate dehydrogenase), 및 UDP-글루코오스 가수분해효소(UDP-glucose hydrolase)를 코딩하는 유전자는 각각 pgi, zwf, 및 ushA인 것을 특징으로 하는 대장균 변이체.
제8항에 있어서, 플라본-3-수산화효소(flavanone-3-hydroxylase)를 코딩하는 유전자, 플라본 생성효소(flavonone synthase)를 코딩하는 유전자, 포스포글루코무타아제(phosphoglucomutase)를 코딩하는 유전자, 및 포도당-1-인산 우리딜일전달효소(glucose-1-phosphate uridylyltransferase)를 코딩하는 유전자는 각각 Atf3h, Atfls1, nfa44530, 및 galU인 것을 특징으로 하는 대장균 변이체.
제8항에 있어서, UDP-글리코실전달효소(UDP-glycosyltransferase, UGT)를 코딩하는 유전자는 UGT78K1 또는 At5g17050인 것을 특징으로 하는 대장균 변이체.
삭제
제8항에 있어서, 상기 UDP-글리코실전달효소(UDP-glycosyltransferase)는 애기장대풀(Arabidopsis thaliana) 유래인 것을 특징으로 하는 대장균 변이체.
제8항 내지 제11항 및 제13항 중 어느 한 항의 대장균 변이체를 이용하여, 나린제닌으로부터 아스트라갈린의 제조방법.
제14항에 있어서, 다음 단계를 거치는 것을 특징으로 하는 아스트라갈린의 제조방법:
(a) 나린제닌을 플라본-3-수산화효소(flavanon-3-hydroxylase) 및 플라본 생성효소(flavonone synthase)에 의해, 캄페롤으로 전환시키는 단계: 및
(b) 상기 전환된 캄페롤을 UDP-글루코실전달효소(UDP-glycosyltransferase, UGT)로 글루코실화하여 아스트라갈린으로 전환시키는 단계.
제14항에 있어서, 상기 대장균 변이체를 1%의 만노스(mannose), 1%의 과당(fructose), 1%의 글리세롤(glycerol), 및 1%의 글루코오스(glucose)가 포함된 TB 배지에서 배양하는 것을 특징으로 하는 아스트라갈린의 제조방법.