KR101520931B1 - 패혈증 진단용 조성물 및 그 방법 및 키트 - Google Patents

Abstract

본 발명은 패혈증 진단용 조성물 및 그 방법과 키트에 관한 발명이다.

Description

패혈증 진단용 조성물 및 그 방법 및 키트{Composition for diagnosing sepsis and method thereof}

본 발명은 패혈증 진단용 조성물 및 그 방법과 키트에 관한 발명이다.

패혈증은 발견되는 시기에 따라서 그 사망률이 23%에서 46%까지 보고되는 심각한 질환이며 많은 경제적 부담을 증가시키는 질환으로 보건정책의 난제로 알려져 있다(Dellinger RP:Cardiovascular management of septic shock. Crit Care Med 2003; 31: 946-55; Osborn TM, Tracy JK, Dunne JR, Pasquale \M, Napolitano LM: Crit Care Med 2004; 32: 2234-40; Angus DC, Linde-Zwirble WT. Lidicker J, Clermont G, Carcillo J, Pinsky MR: Crit Care Med 2001; 29: 1303-10)

패혈증은 비 심혈관계 중환자실 사망의 가장 흔한 원인으로 미국에서는 최소한 연평균 75만 명의 새로운 환자가 발생하며, 그 중 50%가 패혈성 쇼크로 진행하고 그 절반 정도인 20만명이 사망한다(Martin GS, Mannino DM, Eaton S, Moss M: N Engl J Med 2003; 348: 1546-54.)

최근 수십년 동안 패혈성 쇼크의 발생빈도는 꾸준히 증가해온 반면 그에 대한 사망률은 거의 변함이 없거나 약간 감소한 상태이다(Friedman G, Silva E, Vincent JL: Crit Care Med 1998; 26: 2078-86.)

패혈증의 임상증상은 병원성 미생물의 감염이 숙주의 면역계통, 응고계통, 신경호르몬계통 등 신체의 다양한 기능계통에 영향을 주어 이와 관련된 전신반응으로 나타나기 때문에 복잡하고 다양한 임상 양상을 보인다. 따라서 숙주의 반응 정도와 감염 원인균의 특성 모두 패혈증의 예후에 중대한 영향을 미친다.

1980년대 중반 이후부터는 그람 양성균이 전통적인 그람 음성균에 비하여 패혈증의 원인균으로 더 많은 부분을 차지하였고 1990년대 이후 진균에 의한 패혈증의 발생 빈도 역시 증가하고 있다(Martin GS, Mannino DM, Eaton S, Moss M: TN Engl J Med 2003; 348: 1546-54) 이러한 패혈증의 원인이 되는 균주의 변화는 동반질환이 있는 고령환자의 증가와 함께 과거에 비하여 향상되고 적극적인 내과적, 외과적 치료와 더불어 사람면역결핍바이러스(human immunodeficiency virus)에 의한 질환 증가와 기존 항생제에 대해 내성을 보이는 내성균주의 발현에 기인한 것으로 생각된다.

비병원성으로 알려져 왔던 많은 효모양 진균들이 최근에 와서 면역 저하 환자들에게서 중요한 기회 감염균으로 부각되고 있다. 이런 기회 감염 진균증은 악성종양, 후천성 면역 결핍증, 주요 수술, 심한 화상, 골수나 장기의 이식, 혈관내 도관 삽입, 장기간의 항생제 투여 및 화학요법을 받는 환자 등 많은 내과 및 외과 입원 환자들의 흔한 합병증으로 발생된다(Kiehn TE, Edwards FF, Armstrong D. Am J Clin Pathol. 1980;73:518-21; Komshian SV, Uwaydah AK, Sobel JD, Crane LR. Rev Infect Dis. 1989; 11:379-90) 흔한 원인균으로 알려져 왔던 Candidal albicans외에 Candida spp. 중에서 최근 들어 Candida tropicalis와 Candida parapsilosis가 증가하는 추세에 있으며(Goldani LZ and Mario PS. J Infect. 2003;46:155-60.; Fraser VJ, Jones M, Dunkel J, Storfer S, Medoff G, Dunagan WC. Clin Infect Dis. 1992;15:414-21.) 골수이식 환자 등에서 fluconazole을 예방적으로 투여한 결과 이에 내성을 지닌 Candida krusei 및 Candida glabrata에 의한 기회감염 진균증의 보고가 증가되고 있다(Baran J Jr, Muckatira B, Khatib R. Scand J Infect Dis. 2001;33:137-9.; Diekema DJ, Messer SA, Brueggemann AB, Coffman SL, Doern GV, Herwaldt LA, et al. J clin Microbiol. 2002;40:1298-302; Collin B, Clancy CJ, Nguyen MH. Drug Resist Updat. 1999;2:9-14)

1940년에 페니실린이 임상의학에 처음 도입된 이후 지난 70년간 많은 항생제가 개발되고 임상에서 사용되어 감염질환으로부터 수많은 환자의 생명을 구하는데 결정적인 기여를 하였다 그러나 항생제의 사용과 더불어 급속하게 발현하기 시작한 세균의 항생제 내성은 항생제 개발보다 훨씬 빠른 속도로 진화하여 불과 70년만에 대부분의 항생제가 치료효과가 감소하는 현상이 범세계적으로 나타나고 있다. 세균감염질환의 빈도 및 임상적 중요성을 감안할 때 항생제 내성은 세계적인 보건상의 위기라고 할 수 있다.

항생제 내성이 문제가 되는 주요 세균은 Enterococcus faecium, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa, Enterobacter spp. 라고 할 수 있는데(Boucher HW, Talbot GH, Bradley JS, Edwards JE, Gilbert D, Rice LB, Scheld M, Spellberg B, Bartlett J. Badbugs, Clin Infect Dis 2009;48:1-12.)

이중 그람 양성균으로 대표적인 내성의 예는 포도알균(Staphylococcus aureus)의 methicillin(지역사회 MRSA 포함) 및 Vancomycin 내성, 장알균(Enterococcus faecium)의 vancomycin 내성 그리고 지역사회의 주요세균인 폐렴알균(Streptococcus pneumoniae)의 macrolide 및 다제 내성을 들 수 있다.

MRSA는 전세계 각 병원에서 가장 중요한 병원감염균으로 자리잡고 있다. 특히 한국, 일본, 대만, 홍콩, 싱가포르, 스리랑카 및 일부 미국 병원에서는 병원에서 분리되는 포도알균의 50% 이상이 MRSA인 것으로 보고되고 있다(Grundmann H, Aires-de-sousa M, Boyce J, Tiemersma E. Lancet 2006;368;874-85)

국내병원의 MRSA 발생률은 1996년에 국내 15개 병원에서 전향적으로 시행한 연구의 결과 83.7%인 것으로 나타났으며(Kim JM, Park ES, Jeong JS, et al. Am J Infect control 2000;28:454-8.) 1997년부터 2006년까지 다기관 연구를 통하여 보고된 MRSA의 빈도는 64-72%로서 국내 병원에서 가장 흔한 병원 감염의 원인균으로 확인되었다(Chong Y, Lee K, Park YJ, Jeon DS, et al. Yonsei Med J 1998;39:569-77.)

장알균(Enterococcus)은 심내막염의 주요 감염균으로 알려져 있었으나 1970년대 중반부다 3세대 세팔로스포린계항생제의 사용이 증가하면서 병원내 감염의 중요한 원인균으로 인식되기 시작하였다. 장알균은 대부분의 항생제에 고유내성을 보유한 데다 plasmid 및 transposon의 전달에 의해 쉽게 항생제 내성을 획득할 수 있다. Vancomycin 내성 장내알균(VRE)은 1988년에 영국과 프랑스에서 처음으로 보고되었다(Uttley AH, Collins CH, Naidoo J, George RC. Vancomycin-resistant Enterococci. Jancet 1988;1:57-8.; Keclercq R, Duval J, Courvalin P. N Engl J Med 1988;319:157-61)

이후 VRE는 미국에서 급속히 증가하는 경향을 보였으며 이는 transposon에 의한 VanA gene의 전달이 주요기전임이 밝혀졌다(Frieden TR, munsiff SS, Low DE et al. Lancet 1993;342:76-9).

국내에서는 1992년에 처음으로 VRE 감염이 보고된 바 있으며 국내에서 분리되는 E.faecium 중 VRE 비율은 1997년 4%이었으나 지속적으로 증가하여 2009년에는 29%에 증가하였고 전국적인 다기간 연구의 결과에서는 2009-2010년에 병원 감염을 일으킨 E. faecium 중 VRE의 비율이 38.9%이었다(Park JW, Kim YR, Shin WS, Kang MW, et al. Korean J Infect Dis 1992;24:133-7.; Lee K, Kim MN, Kim JS et al, Yonsei Med J 2011;52:793-802.)

혈액배양은 균혈증 검사의 아주 중요한 방법으로 질병의 진단, 치료의 지침 및 예후를 결정하는데 필수적인 검사법이다(Aronson MD and Bor DH. Blood culture. Ann Intern Med 1987;106:246-53.)

패혈증은 여러 가지 감염증에 동반될 수 있고 다양한 균종에 의해 야기되기 때문에 그 원인균을 규명하기 위해 혈액배양이 주로 이용되며, 혈액배양 결과를 분석하여 그 변화 추이를 조사하고 분리되는 균종과 항균제 감수성 양상을 파악하는 일은 환자의 치료에 중요한 정보를 제고해 왔다. 균혈증 환자는 매우 위중한 상태이므로 신속한 결과가 환자의 생명을 구하는데 큰 역할을 하게 된다. 하지만 혈액배양은 5일 이상의 시간이 소요되며 배양양성 신호가 나오면 계대배양하여 그람염색과 균종동정 및 항생제 감수성 검사를 시행하게 되는데 10일 이상의 시간이 소요하게 된다

[선행 특허문헌]

대한민국특허공개번호 제1020050016987호

대한민국특허공개번호 제1020080006617호

본 발명은 상기의 문제점을 해결하고, 상기의 필요성에 의하여 안출된 것으로서 본 발명의 목적은 패혈증 진단을 위한 정보제공방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 패혈증 진단용 프라이머를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 패혈증 진단용 프로브를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 패혈증 진단용 키트를 제공하는 것이다.

상기의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 a)검체 시료로부터 DNA를 분리하는 단계;b)상기 DNA로부터 각각의 프라이머를 이용하여 16s rRNA 유전자, ITS(internal transcribed sequence) 유전자, Nuc(heat-stable DNA nuclease) 유전자, Cps (캠슐 다당류 생합성을 코딩하는 S.pneumoniae) 유전자, Mec(gene encoding methicillin resistance in saphylococci)A 유전자, salmonella를 검출하기 위한 invA(invasion A) 유전자, Shigella를 검출하기 위한 ipaH(invasion 플라즈미드 항원) 및 Van(Vancomycin resistance protein) A와 Van(Vancomycin resistance protein) B 유전자 단편을 PCR 증폭하는 단계;및 c)그람 양성균과 그람음성균을 구분하기 위한 16s rRNA 유전자 검출용 올리고머 프로브, 진균을 구분하기 위한 ITS(internal transcribed sequence) 유전자 검출용 올리고머 프로브, MRSA의 항생제 내성여부를 확인하기 위한 MecA 유전자 검출용 올리고머 프로브, S. aureus 에만 특이적인 nuc 유전자 검출용 프로브, S. pneumoniae에만 특이적인 Cps 유전자 검출용 프로브, 및 salmonella를 검출하기 위한 invA 검출용 프로브, ,Shigella를 검출하기 위한 ipaH 검출용 프로브 및 VRE의 항생제 내성여부를 확인하기 위한 VanA와 VanB 유전자 검출용 올리고머 프로브가 부착되어 있는 고체 서포트와 상기 단계 b)에서 얻어진 PCR 증폭산물을 하이브리드 형성시키는 PCR-리버스 블랏 하이브리드형성 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 패혈증 진단을 위한 정보제공방법을 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 16s rRNA 유전자 단편을 증폭하기 위한 프라이머는 서열번호 1 내지 4의 프라이머, ITS(internal transcribed sequence) 유전자 단편을 증폭하기 위한 프라이머는 서열번호 5 내지 6의 프라이머, Nuc(heat-stable DNA nuclease) 유전자 단편을 증폭하기 위한 프라이머는 서열번호 7 내지 8의 프라이머, MecA 유전자 단편을 증폭하기 위한 프라이머는 서열번호 9 내지 10의 프라이머이고, VanA와 VanB 유전자 단편을 증폭하기 위한 프라이머는 각각 서열번호 11 내지 12 및 서열번호 13 내지 14의 프라이머이고, invA 유전자 단편을 증폭하기 위한 프라이머는 각각 서열번호 15 내지 16, ipaH 유전자 단편을 증폭하기 위한 프라이머는 각각 서열번호 17 내지 18, Cps 유전자 단편을 증폭하기 위한 프라이머는 서열번호 19 내지 20의 프라이머인 것이 바람직하고,

본 발명의 다른 구현예에 있어서, 상기 그람 음성균 유전자 검출용 프로브는 서열번호 22 내지 30의 프로브, 그람 양성균 유전자 검출용 프로브는 서열번호 31 내지 37의 프로브, Nuc(heat-stable DNA nuclease) 유전자 검출용 프로브는 서열번호 38, MRSA의 항생제 내성여부를 확인하기 위한 MecA 유전자 검출용 프로브는 서열번호 39의 프로브이고, VRE의 항생제 내성여부를 확인하기 위한 VanA와 VanB 유전자 검출용 프로브는 각각 서열번호 40 및 서열번호 41의 프로브, 진균을 구분하기 위한 유전자 검출용 프로브는 서열번호 42 내지 47의 프로브인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

또 본 발명은 검체 시료로부터 DNA를 분리하고, 서열번호 48 내지 49의 프라이머쌍과 서열번호 50 내지 53의 프로브를 이용하여 실시간(Real-time) PCR법을 수행하는 단계를 포함하는 그람 양성균 및 그람음성균을 검출하기 위한 정보제공 방법을 제공한다.

또 본 발명은 검체 시료로부터 DNA를 분리하고, 서열번호 54 내지 55의 프라이머쌍과 서열번호 56의 프로브를 이용하여 실시간(Real-time) PCR법을 수행하는 단계를 포함하는 진균을 검출하기 위한 정보제공방법을 제공한다.

또 본 발명은 서열번호 1 내지 4의 프라이머, ITS(internal transcribed sequence) 유전자 단편을 증폭하기 위한 서열번호 5 내지 6의 프라이머, Nuc(heat-stable DNA nuclease) 유전자 단편을 증폭하기 위한 서열번호 7 내지 8의 프라이머, MecA 유전자 단편을 증폭하기 위한 서열번호 9 내지 10의 프라이머, VanA와 VanB 유전자 단편을 증폭하기 위한 각각 서열번호 11 내지 12 및 서열번호 13 내지 14의 프라이머, invA 유전자 단편을 증폭하기 위한 서열번호 15 내지 16의 프라이머, ipaH 유전자 단편을 증폭하기 위한 서열번호 17 내지 18의 프라이머, 및 Cps 유전자 단편을 증폭하기 위한 서열번호 19 내지 20의 프라이머로 구성된 프라이머 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 그람 음성균 유전자 검출용 서열번호 22 내지 30의 프로브, 그람 양성균 유전자 검출용 서열번호 31 내지 37의 프로브, Nuc(heat-stable DNA nuclease) 유전자 검출용 서열번호 38의 프로브, MRSA의 항생제 내성여부를 확인하기 위한 MecA 유전자 검출용 서열번호 39 프로브, VRE의 항생제 내성여부를 확인하기 위한 VanA와 VanB 유전자 검출용 서열번호 40 및 서열번호 41의 프로브, 진균을 구분하기 위한 유전자 검출용 서열번호 42 내지 47의 프로브로 구성된 프로브 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 상기 본 발명의 프라이머 조성물, 및 올리고머 프로브 조성물을 유효성분으로 포함하는 패혈증 진단용 키트를 제공한다.

또 본 발명은 서열번호 48 내지 49의 프라이머쌍과 서열번호 50 내지 53의 프로브를 유효성분으로 포함하는 그람 양성균 및 그람음성균 검출용 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 서열번호 54 내지 55의 프라이머쌍과 서열번호 56의 프로브를 유효성분으로 포함하는 진균 검출용 조성물을 제공한다.

본 발명의 프라이머는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 핵산 서열은 또한 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 비제한적인 예로는 메틸화, "캡화", 천연 뉴클레오타이드 하나 이상의 동족체로의 치환, 및 뉴클레오타이드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체(예: 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 있다. 핵산은 하나 이상의 부가적인 공유 결합된 잔기, 예를 들면, 단백질(예: 뉴클레아제, 독소, 항체, 시그날 펩타이드, 폴리-L-리신 등), 삽입제(예: 아크리딘, 프소랄렌 등), 킬레이트화제(예: 금속, 방사성 금속,철, 산화성 금속 등), 및 알킬화제를 함유할 수 있다. 본 발명의 핵산 서열은 또한 검출 가능한 시그널을 직접 또는 간접적으로 제공할 수 있는 표지를 이용하여 변형시킬 수 있다. 표지의 예로는 방사성 동위원소, 형광성 분자, 바이오틴 등이 있다.

본 발명의 용어 "실시간 중합효소 반응(realtime PCR)"이라 함은 DNA를 주형(template)으로 하여 타겟 프라이머와 표지를 포함하는 타겟 프로브를 이용해 타겟을 증폭함과 동시에 증폭된 타겟에 타겟 프로프의 표지에서 발생하는 신호를 정량적으로 검출해 내는 분자생물학적 중합방법이다.

본 발명은 상기의 혈액배양법을 대체할 수 있는 Gram positive-Gram negative bacteria-Candida species를 신속하게 구분할 수 있는 Real-time PCR기법을 이용한 Real GP-GN/Real Can과 신속하고 정확한 동정법인 Gram positive-Gram negative bacteria의 구분과 Candida spp. 를 포함하는 Fungus의 동정 뿐만 아니라 MRSA와 VRE에 대한 항생제 내성여부를 동시에 동정할 수 있는 REBA(Reverse blot hybridization assay) Sepsis-ID를 개발하여 그 유용성을 확인하였다.

도 1은 REBA sepsis-ID를 위한 PCR 증폭산물의 결과
도 2는 표준균주에서 REBA sepsis-ID의 특이도 결과
도 3은 표준균주를 이용한 REBA Sepsis-ID의 발색결과
도 4는 임상 혈액배양균주에서 REBA Sepsis-ID의 결과의 예
도 5는 Real-time PCR을 이용한 그람양성균과 그람음성균, 그리고 진균에서의 민감도 확인
도 6은 혈액배양음성에서 양성으로 나온 21검체에 대한 REBA Sepsis-ID의 결과로, Lane 1-21 배양 음성/Real GP-GN PCR 양성 검체

이하 비한정적인 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 단 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 의도로 기재된 것으로 본 발명의 범위는 하기 실시예에 의하여 제한되는 것으로 해석되지 아니한다.

실시예 1: 재료

원주 기독병원 진단검사의학과에 의뢰된 혈액배양 검체를 대상으로 혈액배양에서 양성으로 나온 균종들과 항생제 감수성 결과가 있는 검체를 대상으로 실시하였다.

혈액배양은 균혈증이 의심되는 환자에서 BACTEC Standard 10 Aerobic/F병과 BACTEC PLUS Anaerobic/ F병에 한 쌍으로 이루어진 혈액배양 병에 각각 5~10ml의 혈액을 접종하였다. 모든 혈액배양 병은 24시간 내내 접수되었으며 3시간이내 BACTEC 9240 시스템(BD, Franklin Lakes, NJ, USA)과 BacT/Alert 3D system (BioMerieux, Durham, NC, *SA)의 두가지 혈액배양 자동화 장비를 이용하여 37℃에서 5일 동안 배양되었다. 배양양성 신호가 나오면 계대배양하여 그람염색과 균종 동정 및 항생제 감수성 검사를 시행하였다. 세균의 동정은 Vitek II system을 (BioMerieux, Marcy, 1'Eltoile, France) 이용한 생화학적인 방법을 이용하였다. 칸디다 균종의 동정은 발아관 시험을 시행한 후 양성이면 Candida albicans로 동정하였고 발아관 음성인 균은 ATB ID 32C (bioMerieux SA, Marcy-1'Etoile, France)를 이용하여 동정하였다.

실시예 2: 표준균주와 임상분리균주에서의 genomic DNA 추출

BACTEC 9240 system (Becton Dickinson Microbiology System, Sparks, Md, USA)를 통해 배양된 배양액의 일부를 취하여 DNA extraction solution 100 ㎕를 넣은 후 1분간 vortex하고, 100℃에서 10분간 가열한 후, 실온에서 13,000 rpm으로 3분간 원심분리하여 얻은 상층액을 취하는 방법을 이용하여 핵산을 분리하였다. 분리된 핵산은 Real GP-GN/Real Can과 REBA sepsis-ID를 수행하기 위한 PCR의 주형으로 사용되었다.

실시예 3: Real GP - GN / Real Can 과 REBA Sepsis - ID 의 유전자 수집 및 분석

미국 국립생물정보센터 (National center for biotechnology information, NCBI, http://www.ncbi.nlm.nih.gov) Genbank에서 표적으로 하는 PCR 프라이머와 올리고뉴클레오타이드 프로브는 Sepsis를 정확한 균 동정을 위해 Gram positive bacteria와 Gram negative bacteria를 위한 16s rRNA 유전자를, 진균(Fungus)를 위한 18S rRNA와 5.8S rRNA의 사이에 존재하는 internal transcribed sequence (ITS) 유전자를, MRSA의 항생제 내성여부를 알수 있는 MecA 유전자를, VRE의 항생제 내성여부를 알 수있는 VanA와 VanB 유전자를 검색하여 염기서열을 수집하였다. 멀티얼라인 (http://multalin.toulouse.inra.fr/multalin)을 수행한 후 표적으로 하는 각각의 유전자들이 공통으로 가지는 염기서열 부위에서 2쌍의 primer를 디자인하였고, 그 중 reverse primer에는 PCR-REBA법을 위해 biotin을 5‘말단에 붙였다. 그리고 2쌍의 primer 내부에 존재하는 균특이 부위에서 각각의 표적 균종을 검출할 수 있는 올리고뉴클레오타이드 프로브를 디자인하였고 각 올리고뉴클레오타이드 프로브에는 얇은 막과 펩타이드 결합을 할 수 있도록 하기 위해 5’말단에 amine기를 붙였다. 디자인한 primer와 올리고뉴클레오타이드 프로브는 바이오니아(대전, 한국)에 합성을 의뢰하였다.

실시예 4: one - tube nested PCR

추출한 각 균주의 genomic DNA를 주형으로 상용화된 Prime Taq Premix (2X) (Genet Bio, 논산, 한국)를 이용하여 PCR을 수행하였다. Prime Taq Premix (2X)의 조성은 primer Taq polymerase 1unit/10㎕, 2X reaction buffer, 4mM MgCl2, enzyme stabilizer, sedment, loading dye, pH 9.0, 0.5mM of each dATP, dCTP, dGTP, dTTP이다. PCR을 위한 각 조성은 Prime Taq premix (2X) 10㎕, 한 쌍의 10 pmole primer를 각각 1㎕, ultrapure water 3㎕, 각 균주의 genomic DNA 5㎕로 총량을 20㎕로 하였다. PCR 반응은 초기 변성과정을 위해 95℃ 5분, 일차 증폭을 위해 95℃ 30초, 60℃ 30초 반응을 15번 반복, 2차 증폭을 위해 95℃ 30초, 54℃ 30초 반응을 35번 반복 후 완전한 신장반응을 위해 72℃ 10분간 반응시켰다. PCR 반응이 완료된 PCR 산물은 2% TBE (Tris-borate-ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate) agarose gene (W/V ratio)에서 290 bolt로 20분간 전기영동하여 ethidium bromide에 10분간 염색 후 자외선 투과조명기로 GN-GP를 동정할 수 있는 16s rRNA는 280 bp, Fungus를 동정할 수 있는 18S-5.8S rRNA의 ITS gene의 250bp, S. aureus 에만 특이적인 nuc gene의 135bp, S. pneumoniae에만 특이적인 Spn gene의 120bp, Methicilin의 내성여부를 알 수 있는 MecA gene의 140bp, Vancomycin의 내성여부를 알 수 있는 VanA와 VanB gene는 각각 170bp와 100bp의 PCR 산물의 증폭여부를 확인하였다.

실시예 5: REBA Sepsis - ID 의 수행

증폭한 PCR 산물을 이용한 REBA Sepsis-ID는 제조자가 제시한 실험조건을 이용하여 시행하였으면 실험방법은 다음과 같다. PCR 산물에 동량의 Denaturation solution (0.2N NaOH, 0.2mM EDTA)을 섞어 실온에 5분간 반응시켜 이중가닥의 PCR 반응산물을 단일가닥으로 변성하였다. 반응하는 동안 균특이 올리고뉴클레오타이드 프로브가 부착된 얇은막 REBA Sepsis-ID membrane (M&D, Korea)에 2X SSPE/0.1% SDS으로 희석시켜 Membrane minitray (Bio-rad, USA)에 넣은 후 55℃ 에서 30분간 반응시키고, WS (Washing solution)을 이용하여 55℃에서 10분간 두 번 씻어준 후 1:2000 (v/v)으로 희석한 alkaline phosphatase-labeled Streptavidin conjugate (Roche, Mannheim, Germany)을 처리하여 실온에서 30분간 반응시켰다. 반응이 끝난 membrane을 SS (Staining solution, TBS pH7.5)로 실온에 1분간 2회 세척하고, alkaline phosphatase에 반응하는 발색용 기질 용액인 NBT/BCIP (Nitro blue tetrazolium chloride and 5-Bromo-4-chloro-3-indolylphosphate, toluidine salt in 67% DMSO(v/v), Roche, Germany)에 10분간 감광시킨후 DW로 닦아낸 후 건조시켜 검출 여부를 판단하였다.

실시예 6: Real GP - GN / Real Can 의 수행

Real GP-GN/Real Can은 추출한 각 균주의 genomic DNA를 주형을 사용하여 총 20㎕내에 2X PCR premix (TOYOBO, Japan) 10㎕, GP-GN primer/probe의 혼합물 5㎕와 추출한 검체 DNA 5㎕를 첨가하여 사용하였다. PCR 반응조건은 predenaturation을 94℃ 3분간 1회 수행한 후에 94℃ 20초 denaturation, 60℃ 40초 annealing 및 extension 후, 총 40회의 반응을 CFX 96 (Bio-Rad, USA)을 사용하였다. Real GP-GN은 Gram positive bacteria를 검출하는 GP 프로브(HEX)와 Gram negative bacteria를 검출하는 GN 프로브(FAM), 그리고 internal control (IC) 프로브(Cy5)를 포함하고 있으며 측정된 threshold cycle (Ct)값을 분석하여 35이하를 양성, 35을 초과하는 값에 대하여 음성으로 판정하였다. 또한 Real Can은 Candida species를 검출하는 Can 프로브(FAM)을 사용하고 있으며 마찬가지로 threshold cycle (Ct)값을 분석하여 35이하를 양성, 35을 초과하는 값에 대하여 음성으로 찬정하였다. 또한 IC프로브와 GP프로브가 동시에 검출되거나 GP 프로브가 단독으로 검출되면 그람 양성균으로 판정하고, IC프로브와 GN프로브가 동시에 검출되거나 GN 프로브가 단독으로 검출되면 그람 음성균으로 판정하고 IC프로브와 GN-GP프로브가 동시에 검출되거나 GN-GP프로브가 동시에 검출되면 그람양성균-그람음성균이 섞여 있는 것으로 판정한다. 그러나 IC프로브를 포함한 모든 프로브의 시그날이 검출되지 않는 경우에 검사 실패로 판정한다.

상기 실시예의 결과는 하기와 같다.

1. PCR 증폭결과

16s rRNA 유전자를 이용한 E. facalis , E. solitarius , E. faecium , E. malodoratus , E. saccharolytivus, E. casseliflavus , S. pneumoniae , S. agalactiae 등의 Gram positive (도1A-B)와 E. coli, K. pneumoniae , K. oxytoca , S. liquifaciens , P. alcalifaciens , P. vulgaris , P. mirabilis , S. typhi 등의 Gram negative bacteria(도1C)로부터 280bp의 PCR 증폭산물을 확인할 수 있었다. 또한 18S-5.8S rRNA의 ITS 유전자를 이용한 C. albicans , C. tropicalis , C. glabrata , C. parapsilosis 등의 Candida관련 DNA로부터 250bp 의 PCR 증폭산물을 확인 할 수 있었다. (도1D)

2. 표준균주를 이용한 GN - GP bacteria 의 균특이도 검사

표준균주를 통해 증폭된 PCR 산물을 이용하여 제작된 균특이적인 올리고 뉴클레오타이드 프로브의 특이도를 확인하기 위하여 PCR-REBA를 수행하였다. 그 결과 38개의 Gram positive 균주에서 모두 Gram positive 프로브 및 Enterococcus spp.프로브(도2A)와 Streptococcus 프로브 (도2B)및 Stapyhlococcus 프로브(도2C)에 양성반응을 보였으며, 21개의 Gram negative 균주에서 모두 Gram negative 프로브 및 각 균종의 특이 프로브에 양성반응을 나타난 것을 확인할 수 있었다(도2D). 또한 Membrane strip을 이용한 발색결과는 도3을 통해 확인할 수 있다.

3. 임상고체배양균주를 이용한 PCR - REBA 의 유용성 평가

임상에서 분리된 41개의 그람 양성균주와 64개의 그람 음성균주와 13개의 진균의 총 118개의 고체배양균주를 대상으로 PCR-REBA법을 실시하였다(표 1). 그 결과 118개 모두에서 그람 양성균과 그람음성균, 그리고 진균의 각각 프로브에 동정이 된 것을 확인할 수 있었다.

4. 임상 혈액배양 양성균주를 이용한 PCR - REBA 의 유용성 평가

임상 혈액양성 배양균주를 통해 70개의 그람 양성균주와 32개의 그람음성 균주, 그리고 진균 13개를 이용한 REBA sepsis-ID의 유용성 평가를 해 본 결과(도4), 70개의 그람 양성 균주 중 Staphylococcus aureus에서 13검체, S. epidermidis 23검체, S. capitis 5검체, S. haemolyticus 5검체, S. hominis 5검체와 S. warneri 1검체에서 모두 Staphylococcus spp. 프로브에서 확인되었으며, Streptococcus parasanguinis, S. salivarius각각 1검체에서 모두 Streptococcus spp. 프로브에서 확인되었고, 6검체의 Enterococcus faecium은 모두 Enterococcus spp. 프로브에서 검출됨을 확인할 수 있었고, E. facalis 1검체에서도 Enterococcus spp. 프로브에서 검출되었으며 그 외에 Corynebacterium spp. 1검체와 Micrococcus spp.에서 2검체, Propionibacterium acnes 1검체와 Gram-positive rods 5검체에서는 GP 프로브에서 검출되는 것을 확인할 수 있었다. 32검체의 그람 음성균에서는 Escherichia coli 에서 14검체, Klebsiella pneumoniae에서 7검체, Salmonella group , Haemophilus influenzae, Pseudomonas aeruginosa에서 각각 1검체가 모두 해당 프로브에서 검출됨을 확인하였으며, K. oxytoca 2검체, Acinetobacter lwoffii, Aeromonas spp., Citrobacter koseri, Neisseria sicca, Proteus mirabilis, Sphingomonas paucimobilis 에서 각각 1검체들은 모두 GN 프로브에서 검출되는 것을 확인하였다. 또한 13검체의 진균에서는 C. albicans 8검체, C. parapsilosis 2검체, C. glabrata 1검체에서 모두 해당 프로브에서 검출되는 것을 확인하였으며 Cryptococcus neoformans 와 Saccharomyces cerevisiae 1검체에서는 Pan-fungus에서 나오는 것을 확인하였다(표 2).

5. 항생제 내성검사균주를 통한 MRSA 와 VRE 의 유용성 평가

고체배양 그람 양성균주를 이용하여 Methicillin의 내성여부를 확인하기 위하여 MecA 유전자의 검출을 확인한 결과 12검체의S. aureus에서 9검체에서 MRSA로 확인되었으며 8검체의 Staphylococcus spp. 에서 7검체에서 MRCoNS로 MecA유전자가 확인되었다(표 1). 또한 혈액배양 양성검체 중 13검체의 S. aureus에서 10검체에서 MRSA로 확인되었으며 39검체의 Staphylococcus spp. 에서 32검체에서 MRCoNS로 나타나 MecA유전자가 있음을 확인 할 수 있었다. Enterococcus spp. 와 관련하여 Vancomycin 내성여부를 확인하기 위한 검사에서 16검체의 고체배양균주에서 7검체에서 VanA유전자에 내성이 확인되었으며, 7검체의 혈액 양성 배양 검체에서 2검체에서 VanA유전자의 내성을 확인할 수 있었다(표 2).

6. Real GP - GN / Real Can 의 민감도 확인

혈액배양에서 일차적으로 그람양성균-그람음성균 또는 진균의 확인을 신속하게 하기 위하여 Real-time PCR법을 이용하여 확인하였다. 이를 위하여 그람 양성균-그람음성균과 진균에서의 민감도를 확인하기 위하여 그람 양성균 S. aureus와 그람 음성균 E. coli, 그리고 진균 C. glabrata의 DNA를 10배씩 희석하여 민감도를 확인한 결과 그람양성균과 그람음성균은 100fg~ 10fg에서, 진균에서는 1pg의 민감도를 나타냄을 확인 할 수 있었다(도 5).

7. 표준균주를 이용한 Real GP - GN PCR 의 결과

63검체의 표준균주를 이용하여 Real GP-GN의 특이도를 확인한 결과 39검체의 그람양성균에서 모두 GP (HEX) 프로브에서 검출되었으며, 24검체의 그람음성균에서는 모두 GN (FAM) 프로브에서 검출되었고 5검체의 Candida균주로부터 모두 Can (FAM) 프로브에서 검출됨을 확인 할 수 있었다(표 3).

8. 고체배양균을 이용한 Real GP - GN PCR 의 유용성 확인

105검체의 고체배양균을 이용하여 Real GP-GN/Real Can의 유용성을 확인한 결과 12검체의 S. aureus를 포함한 그람양성균 41검체에 모두 GP (HEX) 프로브에서 17.35에서 30.46으로 Ct값이 확인되었다. 또한 16검체의 E. coli를 포함한 그람음성균 64검체에서 모두 GN (FAM) 프로브에서 12.68에서 33.54의 Ct 값을 확인할 수 있었으며 5검체의 C. albicans를 포함한 Candida 균 10검체에서 모두 Can (FAM) 프로브에서 17.61에서 30.95의 Ct값을 확인할 수 있었다(표 4).

9. 혈액배양 양성균을 이용한 Real GP - GN PCR 의 유용성 확인

혈액배양병에서 양성으로 나온 176검체를 이용하여 Real GP-GN의 유용성을 확인한 결과 175검체의 그람 양성균이 모두 GP (HEX) 프로브에서 검출되었으며 이때 Ct값은 12.43에서 34로 나타났으며 70검체의 그람음성균도 모두 GN (FAM)프로브에서 검출되었으며 이때 Ct값은 6.56에서 24.08로 나타났다. 그리고 배양결과 S. agalactiae와 C. koseri가 섞여있는 것으로 나타난 1검체에서의 Real GP-GN PCR결과 GP-GN 프로브에서 각각 14.61과 10.61의 Ct값이 나와 정확하게 섞여있는 검체도 검출함을 확인하여 혈액배양병에서 양성균의 Real GP-GN PCR 의 양성률의 민감도는 99.6%로 나타남을 확인할 수 있었다. 또한 24검체의 진균을 이용하여 Real Can의 유용성을 확인한 결과 2검체의 C. albicans와 C. parapsilosis, C. tropicalis에서 각각 1검체가 Can (FAM)에서 검출되었으며 22.81에서 31.98의 Ct값이 확인되었다(표 5).

10. 혈액배양 음성균을 이용한 Real GP - GN PCR 의 유용성 확인

혈액배양병에서 음성으로 확인된 200검체의 혈액배양 음성균에서의 Real GP-GN PCR의 유용성 확인 한 결과 GP (HEX) 프로브에서 7검체의 그람양성균과 GN (FAM) 프로브에서 14검체의 그람음성균을 포함한 총 21검체가 양성으로 확인되어 특이도는 89.5%로 확인되었다(표 6). Real GP-GN PCR에서 양성으로 나온 검체에 대해 PCR-REBA와 Sequencing을 통하여 비교하였으며(도6), PCR-REBA에서는 Real GP 로 나온 7검체는 GP 프로브에서, Real GN으로 나온 14검체 중 12검체에서 GN프로브에, 하나는 Pan-bacteria에, 나머지 하나에서는 검출되지 않았고, Sequencing결과에서는 그람 양성으로 나온 7검체 모두에서 Uncultured bacterium으로 나왔으며, 그람음성으로 나온 14검체 중 한 검체에서는 Uncultured bacterium으로, 나머지 13검체에서 Proteobacterium과 Pseudomonas spp.,로 각각 2검체로 나왔으며 그 외에 Janthinoba cterium sp., Polynucleobacter sp., Hyalangium sp., Duganella sp., Ochrobacterum sp., Burkholderiales bacterium., Methylophilus sp., Nitrosomonadaceae., Enterobacter sp., 로 각각 나온 것을 확인할 수 있었다(표 7).

현재까지 전통적인 방법인 배양법을 통하여 그람양성균과 그람음성균을 확인하였으나 Real GP-GN을 통하여 1시간 내지 1시간 30분이면 그람양성균과 그람음성균을 신속하고 정확하게 확인할 수 있으며 이후 다시 1시간 내지 1시간 30분이면 REBA Sepsis-ID를 통하여 그람음성균의 균종과 그람양성균의 균 종 및 Methicilin내성과 Vancomycin내성여부를 총 4시간을 거치면 확인할 수 있어서 3~5일을 통하여 배양을 하고 이 후에 항생제내성여부를 또다시 확인하여 5~7일의 실험결과가 소요되는 배양법을 대체할 수 있는 유용한 방법임을 확인 할 수 있었으며, 또한 3~5일을 통하여 배양하더라도 배양음성으로 나오는 경우와 본 실험에서 보여준 배양음성균에서도 약 10%정도의 양성률을 보이는 결과를 볼 때 Real GP-GN PCR은 배양법에 대체할 수 있는 유용한 방법임을 다시 한번 확인할 수 있었다.

표 1은 118고체배양균주에서 배양법과 PCR-REBA법의 비교

표 2는 115 혈액 배양 양성검체에서 배양법과 PCR-REBA법의 비교

표 3은 68검체의 표준균주를 이용하여 Real GP-GN /Real Can PCR의 특이도 검출

표 4는115검체의 고체배양균을 이용하여 Real GP-GN /Rea. Can PCR의 특이도 검출

표 5는 혈액배양에서 Real GP-GN PCR 검출과 BACTEC 9240 의 배양결과와의 비교

표 6은 혈액배양병에서 Real GP-GN PCR의 민감도와 특이도

표 7은 혈액배양병에서 21검체의 Real GP-GN PCR-양성과 배양음성균에 대한 PCR-REBA와 Sequencing의 비교

표 8은 REBA Sepsis-ID를 위한 Primer

표 9는 REBA Sepsis-ID를 위한 Probe

표 10은 Real GP-GN을 위한 Primer & Probe

표 11은 Real Can을 위한 Primer & Probe

<110> Molecules and Diagnostics Inc. Yonsei University Wonju Industry-Academic Cooperation Foundation <120> Composition for diagnosing sepsis and method thereof <160> 56 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 taayacatgc aagtcgarcg 20 <210> 2 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 tggcacgdag ttrgccgkkg ctt 23 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 taayacatgc aagtcgarcg 20 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 tgtggcygrt crycctctca g 21 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 aacgcanmtt gcrcychhtg 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 cagcgggtad yccyacctga 20 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 agcgattgat ggtgatacgg t 21 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 atgcacttgc ttcaggacca 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Claims (10)

1. a)검체 시료로부터 DNA를 분리하는 단계;
   b)상기 DNA로부터 각각의 프라이머를 이용하여 16s rRNA 유전자, ITS(internal transcribed sequence) 유전자, Nuc(heat-stable DNA nuclease) 유전자, Cps (캠슐 다당류 생합성을 코딩하는 S.pneumoniae ) 유전자, Mec(gene encoding methicillin resistance in saphylococci)A 유전자, salmonella를 검출하기 위한 invA(invasion A) 유전자, ,Shigella를 검출하기 위한 ipaH(invasion 플라즈미드 항원) 및 Van(Vancomycin resistance protein) A와 Van(Vancomycin resistance protein) B 유전자 단편을 PCR 증폭하는 단계;및
   c)그람 양성균과 그람음성균을 구분하기 위한 16s rRNA 유전자 검출용 올리고머 프로브, 진균을 구분하기 위한 ITS(internal transcribed sequence) 유전자 검출용 올리고머 프로브, MRSA의 항생제 내성여부를 확인하기 위한 MecA 유전자 검출용 올리고머 프로브, S.aureus 에만 특이적인 nuc 유전자 검출용 프로브, S.pneumoniae에만 특이적인 Cps 유전자 검출용 프로브, salmonella를 검출하기 위한 invA 검출용 프로브, Shigella를 검출하기 위한 ipaH 검출용 프로브 및 VRE의 항생제 내성여부를 확인하기 위한 VanA와 VanB 유전자 검출용 올리고머 프로브가 부착되어 있는 고체 서포트와 상기 단계 b)에서 얻어진 PCR 증폭산물을 하이브리드 형성시키는 PCR-리버스 블랏 하이브리드형성 단계;
   를 포함하고,
   상기 16s rRNA 유전자 단편을 증폭하기 위한 프라이머는 서열번호 1 내지 4의 프라이머, ITS(internal transcribed sequence) 유전자 단편을 증폭하기 위한 프라이머는 서열번호 5 내지 6의 프라이머, Nuc(heat-stable DNA nuclease) 유전자 단편을 증폭하기 위한 프라이머는 서열번호 7 내지 8의 프라이머, MecA 유전자 단편을 증폭하기 위한 프라이머는 서열번호 9 내지 10의 프라이머이고, VanA와 VanB 유전자 단편을 증폭하기 위한 프라이머는 각각 서열번호 11 내지 12 및 서열번호 13 내지 14의 프라이머이고, invA 유전자 단편을 증폭하기 위한 프라이머는 서열번호 15 내지 16, ipaH 유전자 단편을 증폭하기 위한 프라이머는 서열번호 17 내지 18, Cps 유전자 단편을 증폭하기 위한 프라이머는 서열번호 19 내지 20의 프라이머이며,
   상기 그람 음성균 유전자 검출용 프로브는 서열번호 22 내지 30의 프로브, 그람 양성균 유전자 검출용 프로브는 서열번호 31 내지 37의 프로브, Nuc(heat-stable DNA nuclease) 유전자 검출용 프로브는 서열번호 38, MRSA의 항생제 내성여부를 확인하기 위한 MecA 유전자 검출용 프로브는 서열번호 39의 프로브이고, VRE의 항생제 내성여부를 확인하기 위한 VanA와 VanB 유전자 검출용 프로브는 각각 서열번호 40 및 서열번호 41의 프로브, 진균을 구분하기 위한 유전자 검출용 프로브는 서열번호 42 내지 47의 프로브인 것을 특징으로 하는 패혈증 진단을 위한 정보제공방법.
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6. 16s rRNA 유전자 단편을 증폭하기 위한 서열번호 1 내지 4의 프라이머, ITS(internal transcribed sequence) 유전자 단편을 증폭하기 위한 서열번호 5 내지 6의 프라이머, Nuc(heat-stable DNA nuclease) 유전자 단편을 증폭하기 위한 서열번호 7 내지 8의 프라이머, MecA 유전자 단편을 증폭하기 위한 서열번호 9 내지 10의 프라이머, VanA와 VanB 유전자 단편을 증폭하기 위한 각각 서열번호 11 내지 12 및 서열번호 13 내지 14의 프라이머, invA 유전자 단편을 증폭하기 위한 서열번호 15 내지 16의 프라이머, ipaH 유전자 단편을 증폭하기 위한 서열번호 17 내지 18의 프라이머, 및 Cps 유전자 단편을 증폭하기 위한 서열번호 19 내지 20의 프라이머로 구성된 프라이머 조성물 및 그람 음성균 유전자 검출용 서열번호 22 내지 30의 프로브, 그람 양성균 유전자 검출용 서열번호 31 내지 37의 프로브, Nuc(heat-stable DNA nuclease) 유전자 검출용 서열번호 38의 프로브, MRSA의 항생제 내성여부를 확인하기 위한 MecA 유전자 검출용 서열번호 39 프로브, VRE의 항생제 내성여부를 확인하기 위한 VanA와 VanB 유전자 검출용 서열번호 40 및 서열번호 41의 프로브, 진균을 구분하기 위한 유전자 검출용 서열번호 42 내지 47의 프로브로 구성된 프로브 조성물을 유효성분으로 포함하는 패혈증 진단용 키트.
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