Nothing Special   »   [go: up one dir, main page]

KR101513308B1 - 안질환의 치료에 유용한 보체 결합 앱타머 및 항-ｃ5 제제 - Google Patents

안질환의 치료에 유용한 보체 결합 앱타머 및 항-ｃ5 제제 Download PDF

Info

Publication number
KR101513308B1
KR101513308B1 KR1020087024533A KR20087024533A KR101513308B1 KR 101513308 B1 KR101513308 B1 KR 101513308B1 KR 1020087024533 A KR1020087024533 A KR 1020087024533A KR 20087024533 A KR20087024533 A KR 20087024533A KR 101513308 B1 KR101513308 B1 KR 101513308B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
delete delete
aptamer
seq
complement
nucleotides
Prior art date
Application number
KR1020087024533A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20080100388A (ko
Inventor
데이비드 엡스타인
제프 씨 커즈
Original Assignee
아케믹스 엘엘씨
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 아케믹스 엘엘씨 filed Critical 아케믹스 엘엘씨
Publication of KR20080100388A publication Critical patent/KR20080100388A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101513308B1 publication Critical patent/KR101513308B1/ko

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/005—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'active' part of the composition delivered, i.e. the nucleic acid delivered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/115—Aptamers, i.e. nucleic acids binding a target molecule specifically and with high affinity without hybridising therewith ; Nucleic acids binding to non-nucleic acids, e.g. aptamers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/702—Oligosaccharides, i.e. having three to five saccharide radicals attached to each other by glycosidic linkages
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/3955—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against proteinaceous materials, e.g. enzymes, hormones, lymphokines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0048—Eye, e.g. artificial tears
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/22—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against growth factors ; against growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/16—Aptamers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2320/00—Applications; Uses
    • C12N2320/30—Special therapeutic applications
    • C12N2320/32—Special delivery means, e.g. tissue-specific

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Ophthalmology & Optometry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

본 발명은 안구 질환을 치료하는데 충분한 양으로 개체의 보체 성분을 억제하는 제제를 투여하여 보체 매개성 안구 질환을 치료하는 방법에 관한 것으로, 여기서 선택적인 구체예에서, 상기 제제는 항-보체 앱타머이고, 바람직한 구체에에서 제제는 항-C5 앱타머이다.

Description

안질환의 치료에 유용한 보체 결합 앱타머 및 항-Ｃ5 제제{COMPLEMENT BINDING APTAMERS AND ANTI-C5 AGENTS USEFUL IN THE TREATMENT OF OCULAR DISORDERS}
-관련 출원-
본 특허 출원은 2006년 3월 8일 가출원된 미국 가출원 제60/780,905호 및 2006년 9월 29일 가출원된 미국 가출원 제60/848,274호를 우선권으로 주장하며, 이들 각각을 전체로 본 발명에서 참조하여 포함시킨다.
-본 발명의 기술분야-
본 발명은 대체로 핵산 분야에 관한 것으로서, 보다 구체적으로 보체 관련 안구 질환, 심장 질환, 염증성 질환, 천식 및 자가 면역 질환, 허혈성 재관류 손상 및/또는 특히, C5 매개성 보체 활성화가 관여되는 기타 질환 또는 질병 등의 치료 및 진단에 유용한, 보체계의 단백질에 결합할 수 있는 앱타머에 관한 것이다. 바람직한 구체예에서, 본 발명은 보다 구체적으로, 이에 한정되는 것은 아니고, C5 매개성 질환 예컨대 C5 매개성 안구 질환의 치료 및 검출을 비롯한 안구 질환의 치료 및 검출을 위한 방법 및 물질에 관한 것이다. 본 발명은 또한 C5 단백질을 포함하는 보체계 단백질에 결합할 수 있는 앱타머의 투여를 위한 물질 및 방법에 관한 것이다.
앱타머란 왓슨 크릭 염기쌍 형성 이외의 상호 작용을 통해서 단백질 등과 같은 일부 표적에 높은 특이성 및 친화력으로 결합하는 단리된 핵산 분자를 일컫는다. 앱타머가 핵산 기반 분자이지만, 앱타머와 다른 핵산 분자 예컨대 유전자 및 mRNA 간에는 기본적으로 차이가 있다. 후자에 있어서, 핵산 구조는 그 선형 염기 서열을 통해서 정보를 암호화하고 있으며 그 결과 이 서열은 정보 저장의 기능으로서 중요하다. 이와는 전혀 대조적으로, 표적 분자와의 특이적 결합을 기반으로하는 앱타머의 기능은 보존된 선형 서열에 의존적인 것이라기 보다는 특정한 2차/3차 구조에 따른다. 즉, 앱타머는 비코딩 서열이다. 앱타머가 보유가능한 임의 코딩 가능성은 전적으로 우연에 의한 것이고 이의 동족 표적에 대한 앱타머의 결합에 대해 어떠한 역할도 하지 않는다. 따라서, 그러한 앱타머가 동일 표적에 결합하고, 심지어 표적 상의 동일 부위에 결합하더라도, 대부분 유사한 선형 염기 서열을 공유하는 것은 아니다.
앱타머는 또한, 일정 단백질에 결합하는 천연 발생 핵산 서열과는 구별되어야 한다. 후자의 서열은 천연 발생 핵산의 전사, 번역 및 수송에 관여하는 특정한 단백질의 하부군, 즉 핵산 결합 단백질에 결합하는 유기체의 게놈에 속하는 천연 발생 서열이다. 이에 반해 앱타머는 짧고, 단리된 비천연 발생적인 핵산 분자이다. 앱타머는 핵산 결합 단백질에 결합하는 것으로 동정할 수 있는 한편, 대부분의 경우에서 이러한 앱타머는 자연적으로 핵산 결합 단백질이 인지하는 서열에 대한 서열 동일성이 거의 없거나 없다. 보다 중요한 것은, 앱타머는 소분자, 탄수화물, 펩 티드 등을 비롯한 목적하는 임의 표적 대부분을 비롯하여 실질적으로 임의 단백질(단지 핵산 결합 단백질만이 아님)에도 결합할 수 있다. 대부분의 표적에 있어서, 심지어 단백질에 대해서도, 이에 결합하는 천연 발생 핵산은 존재하지 않으며, 이러한 서열을 갖는 표적에 있어서, 즉 핵산 결합 단백질에 있어서, 강하게 결합한 앱타머와 비교하여 천연적으로는 사용되는 결합 친화력이 비교적 낮기 때문에 이러한 서열은 앱타머와는 구별된다.
파지 디스플레이 또는 항체에 의해 생성된 펩티드와 같이, 앱타머는 선택된 표적에 특이적으로 결합할 수 있고, 표적의 활성 또는 결합 상호 작용을, 예를 들어 결합 앱타머의 이들 표적이 기능하는 능력을 차단하여서, 조정할 수 있다. 항체처럼, 표저에 대한 특이적 결합의 기능성은 고유한 특성이다. 또한, 항체와 같이, 당업자가 표적에 대한 앱타머의 정밀한 구조적 특징에 대해서는 알지 못하더라도, 당업자라면 정밀한 구조적 정의 없이 이러한 분자를 동정하고, 제조하고 사용하는 방법에 대해서는 알고 있다.
또한, 앱타머는, 외관상으로는 미미하지만 단일한 구조적 변화로 앱타머의 결합능 및/또는 다른 활성(또는 활성들)에 현저한 영향(수십배)을 줄 수 있다는 점에서 소분자 치료법과 유사하다. 반면, 일부 구조적 변화는 영향이 없거나 거의 없을 수 있다. 이는 앱타머의 2차/3차 구조의 중요도에 의한 것이다. 달리 말하면, 앱타머는 이의 소정의 표적과 특이적으로 결합하기 위한 화학적 접촉부를 제공하는 고정된 입체 형태를 유지하는 3차원 구조로 존재한다. 그 결과, (1) 일부 구역 또는 특정 서열이 (a) 표적과 접촉하는 특이적 접점, 및/또는 (b) 표적과 접촉하는 분자 위치의 서열로서 필수적이다. (2) 일부 구역 또는 특정 서열이 가변성 범위를 가지는데, 예를 들어, 뉴클레오티드 X는 피리미딘이어야 하고, 또는 뉴클레오티드 Y는 퓨린이어야하고, 또는 뉴클레오티드 X 및 Y는 상보적이어야 한다. 그리고 (3) 일부 구역 또는 특정 서열은 무엇이든지 될 수 있는데, 즉 이들은 본질적으로 공간화 성분(spacing element)이고, 예를 들어, 이들은 소정 길이의 임의 뉴클레오티드 가닥일 수 있고 또는 PEG 분자 등과 같이 비뉴클레오티드 스페이서일 수도 있다.
무작위적 서열의 올리고뉴클레오티드 풀에서 시험관내 선별 과정으로 발견한 바에 따르면, 앱타머는 성장 인자, 전사 인자, 효소, 면역글로불린 및 수용체를 포함하는 130 이상의 단백질에 대해서 생성된 것으로 확인되었다. 전형적으로 앱타머는 그 크기가 10∼15 kDa(20∼45 뉴클레오티드)이고, 표적에 대해서 나노몰 내지 나노몰 이하의 친화력으로 결합하며, 밀접하게 관련된 표적과 구별된다(예를 들어, 앱타머는 대체로 동일한 유전자 패밀리 유래의 다른 단백질에 결합하지 않는다). 일련의 구조 연구에 따르면 앱타머는 항체-항원 복합체의 친화성 및 특이성을 유도하는 것과 동일한 유형의 결합 상호 작용(예를 들어, 수소 결합, 정전기적 상보력, 소수성 접촉, 입체 배제 등)을 사용할 수 있다.
앱타머는 높은 특이성 및 친화성, 생물학적 효능 및 우수한 약물동력학적 특성을 포함하여 치료법 및 진단법으로서 사용할 수 있는 다수의 바람직한 특징을 보유한다. 또한, 이들은 항체 및 다른 단백질 생물학에 비해, 예를 들어 하기와 같은 특히 경쟁할만한 장점을 제공한다:
1) 속도 및 제어
앱타머는 전적으로 시험관 내 과정으로 제조되어서, 치료 선행물(lead)을 비롯하여, 초기 선행물의 빠른 생성을 가능하게 한다. 시험관 내 선별은 앱타머의 특이성 및 친화성을 강하게 제어할 수 있게 하고 독성이 있고 비면역원성인 표적에 대한 선행물을 포함하여 선행물의 생성을 가능하게 한다.
2) 독성 및 면역원성
클래스로서 앱타머는 치료적으로 허용가능한 독성 및 면역원성의 결여가 증명되었다. 수많은 단일클론 항체의 효능이 그 자체의 항체에 대한 면역 반응으로 인해 엄격하게 제한되는 한편, 앱타머는 MHC를 통해 T 세포에 의해서 제시될 수 없고 면역 반응은 일반적으로 핵산 단편을 인식하지 않도록 트레이닝되기 때문에 대부분 앱타머에 대해서 항체를 유도하는 것은 매우 어렵다.
3) 투여
대부분의 현재 승인된 항체 치료제는 정맥내 주입(통상 2 내지 4시간)으로 투여되는 반면, 앱타머는 피하 주입(피하 투여를 통한 앱타머의 생체 이용률은 원숭이 실험에서 > 80%이다(문헌 [Tucker 외, J. Chromatography B. 732: 203-212, 1999])으로 투여할 수 있다. 이러한 차이는 대체로 상당히 낮은 가용성과 이로 인해 대부분의 치료용 mAb에 대해 필요한 용적이 증가된다는 것이 주요한 이유이다. 양호한 가용성(>150 mg/mL) 및 상당히 낮은 분자량(앱타머: 10-50 kDa; 항체: 150 kDa)에 의해서, 앱타머의 1주 투여량은 0.5 mL 미만의 용적으로 주입되어 전달할 수 있다. 또한, 소형 크기의 앱타머는 이들이 항체 또는 항체 단편이 침투불가능한 입체형태적 협착면에 침투할 수 있게 하며, 이는 앱타머를 기반으로하는 치료법 또 는 예방법의 또다른 장점이라 할 수 있다.
4) 확장성 및 비용
치료적 앱타머는 화학적으로 합성할 수 있고 그 결과 생산 수요에 부합하도록 필요에 따라서 용이하게 확장할 수 있다. 현재 스케일링 생산의 어려움은 일부 생물학적 제제의 이용성이 제한되고 단백질의 대량 생산 플렌트의 자본이 방대하다는 것인데, 단일한 대량 올리고뉴클레오티드 합성기는 년간 100 kg/년 이상을 생산할 수 있고 비교적 적당한 초기 투자 비용을 필요로 한다. 킬로그램 수준으로 앱타머를 합성하기 위한 현행 제품 비용은 상당히 최적화된 항체에 대한 비용과 비교하여 $500/g으로 추정된다. 공정 개발의 지속적인 향상으로 5년간 <$100/g으로 제품 비용이 저감될 것으로 기대된다.
5) 안정성
치료용 앱타머는 화학적으로 강건하다. 이들은 본질적으로 열 및 변성제 등의 인자에 노출된 후 활성을 다시 회복하도록 조정되었고 동결건조된 분말로서 실온에서 장기간(>1년) 동안 보관할 수 있다. 이와 대조적으로, 항체는 냉동보관해야만 한다.
보체계
보체계는 세포외 병원체 형태(예를 들어, 박테리아)를 공격하기 위해 조절되는 캐스캐이드 시스템에서 함께 작용하는 적어도 20 내지 30의 혈장 및 막 단백질 세트를 포함한다. 보체계는 C5의 활성화로 집중되는, 막 공격 경로로 알려진 비효소적 경로를 일으키는 세개의 구별되는 효소 활성화 캐스캐이드인, 고전 경로, 렉 틴 경로 및 대체 경로를 포함한다(도 1 참조).
고전 경로로 알려진 제1 효소 활성화된 캐스캐이드는 몇몇 성분, Cl, C4, C2, C3 및 C5(경로 내 순서로 열거함)를 포함한다. 보체계의 고전 경로의 개시는 면역 및 비면역 활성 인자 양자에 의해서 제1 보체 성분(C1)의 결합 및 활성화 이후에 일어난다. C1은 성분 C1q, C1r 및 C1s의 칼슘 의존적 복합체를 포함하고, C1q 성분의 결합을 통해서 활성화된다. C1q는 6개의 동일한 서브유닛을 포함하고 각각의 서브유닛은 3개의 사슬(A, B 및 C 사슬)을 포함한다. 각각의 사슬은 콜라겐 유사 테일에 연결된 구형의 헤드 영역을 갖는다. 항원-항체 복합체에 의한 C1q의 결합 및 활성화는 C1q의 헤드 기 영역을 통해서 일어난다. 단백질, 지질 및 핵산을 포함하는 수많은 항체 이외의 C1q 활성 인자는 콜라겐 유사 스톡(stalk) 상의 개별적인 부위를 통해서 C1q에 결합하고 활성화시킨다. C1q에 의한 보체 활성 인자의 분자 인식은 입체 형태의 변화를 유도하고 전구효소인 C1r의 자가활성화를 촉진하여서, 이어 C1s의 단백질 가수분해 활성화를 촉매하게 된다. 이어 Cs는 보체 성분 C4 및 C2의 활성화를 촉매하여, C3 전환효소로서 기능하는 C4bC2a 복합체를 형성한다.
렉틴 경로로 알려진 제2 효소 활성화 캐스캐이드는 MBL/MASP-2 복합체가 C1을 대신하는 것을 제외하고는 제1 경로와 유사하다. 만난 결합 렉틴(MBL)이 박테리아 표면상의 만노스 함유 다당류를 직접적으로 인식하며 구조적으로 기능적으로 C1의 C1q 성분과 상동성을 갖는다. 활성인자에 MBL이 결합하여 MBL-연합된 프로테아제2(MASP-2)의 활성화를 유도한다. 이어서, MASP-2는 C1s의 기능과 유사한 방식으 로 C4 및 C2의 활성화를 촉매하여 C3 전환효소를 형성하도록 한다.
대체 경로로 알려진 제3 효소 활성화 캐스캐이드는 보체계 활성화 및 증폭을 위한 빠르며, 항체 비의존적인 경로이다. 대체 경로는 몇몇 성분, C3, 인자 B 및 인자 D(경로 내 순서로 열거함)를 포함한다. C3의 단백질 가수분해 절단 형태인 C3b가 박테리아 등의 활성화된 표면 제제에 결합하는 경우에 대체 경로의 활성화가 일어난다. 이어 인자 B는 C3b에 결합하고, 인자 D에 의해 절단되어서 C3 전환효소 C3bBb를 생성시킨다. C3 전환효소의 활성 증폭은 추가적인 C3b가 생산되고 축적되면서 일어난다. 이러한 증폭 반응은 또한 양성 조절인자 단백질 프로페르딘(P)의 결합으로 도움이 되는데, 이 인자는 활성화된 전환효소를 분해에 대해 안정화시켜서 반감기를 1 내지 2분에서 18분으로 연장시킨다.
따라서, 모든 3 경로는 인자 C3을 C3a 및 C3b로 나누는 C3 전환효소를 생성시킨다. 여기서, 두 C3 전환효소(고전/렉틴 및 대체)는 또한 C5 전환효소(C4b2a3b 및 C3b3bBb)로 회합된다. 이들 복합체는 이어서 보체 성분 C5를 두 성분: C5a 폴리펩티드(9 kDa) 및 C5b 폴리펩티드(170 kDa)로 절단된다. C5a 폴리펩티드는 7 트랜스막 G-단백질 커플링된 수용체에 결합하는데, 이는 원래 백혈구와 연합되어 있고 간세포 및 뉴론을 비롯한 다양한 조직에서 발현되는 것으로 현재 알려져 있다. C5a 분자는 인간 보체계의 주요한 주화성 성분으로서 백혈구 주화성, 평활근 수축, 세포내 신호 전달 경로, 뉴트로필-내피 부착, 사이토카인 및 지질 매개인자 방출 및 산화제 형성 등을 포함하는 다양한 생물학적 반응을 촉발시킬 수 있다.
보다 큰 C5b 단편은 연속적으로 이후의 보체 캐스캐이드의 성분, C6, C7, C8 및 C9에 순차적으로 결합하여 C5b-9 막 공격 복합체("MAC")를 형성한다. 이 C5b-9 MAC은 직접적으로 적혈구를 용해시킬 수 있고, 보다 큰 양으로는, 백혈구를 용해시키고 근육, 상피 세포 및 내피 세포 등의 조직에 손상을 줄 수 있다. 용해시키는 이하의 양에서, MAC는 부착 분자의 상향 조절, 세포내 칼슘 증가 및 사이토카인 방출을 촉진할 수 있다. 또한, C5b-9 MAC은 세포 용해를 야기하지 않으면서 내피 세포 및 혈소판 등의 세포를 자극할 수 있다. C5a 및 C5b-9 MAC의 비용해 효과는 때때로 상당히 유사하다.
보체계가 건강을 유지하는데 중요한 역할을 하고 있지만, 질환을 야기하거나 질환의 원인이 될 가능성을 가지고 있다. 예를 들어, 보체계는 관상 동맥 우회로("CABG") 수술, 다양한 신장, 류마티즘학적, 신경학적, 피부학적, 혈액학적, 혈관/폐, 알레르기, 감염성 및 생체적합성/쇼크 질환 및/또는 병태와 관련된 부작용에 관여되어 있다. 보체계가 필수적으로 유일한 질환 상태의 원인은 아니지만, 발명의 원인이 되는 몇몇 인자 중 하나일 수 있다.
최근, 데이타들에 의하면 보체는 또한 안구 질환에 관여하는 것으로 제안되었다. 따라서, 보체 관련 안구 질환의 치료에서 치료법 및 진단법으로 사용하기 위한 보체계의 신규 억제제를 보유하는 것이 이로울 수 있다.
도 1은 보체계의 고전 경로 및 대체 경로를 도시한 도면이다.
도 2는 무작위 서열의 올리고뉴클레오티드 풀로부터 시험관 내에서 앱타머를 선별하는 과정((SELEX™)을 개략적으로 나타낸 도면이다.
도 3A는 항-C5 앱타머(서열 번호 1)의 뉴클레오티드 서열 및 2차 구조를 도시한 도면으로서, 여기서 밑줄친 잔기는 2'-H 피리미딘 잔기이거나 2'-플루오로 피리미딘 잔기이고, 박스로 표시한 잔기는 2'-플루오로 피리미딘 잔기이거나 2'-OMe 피리미딘 잔기이며, 화살표(→)로 표시한 잔기는 2'-플루오로 변형을 함유해야하는 잔기를 나타낸다.
도 3B는 ARC330 항-C5 앱타머(서열 번호 2)의 뉴클레오티드 서열 및 2차 구조를 도시한 도면으로서, 여기서 원형으로 표시된 잔기는 2'-H 잔기이고, 피리미딘 잔기는 2'-플루오로 치환되었으며, 퓨린 잔기의 대다수는 2'-OMe 치환되었고, 그렇지 않은 3개의 2'-OH 퓨린 잔기는 밑줄로 표시하였다.
도 3C는 ARC 186 항-C5 앱타머(서열 번호 4)의 뉴클레오티드 서열 및 2차 구조를 도시한 도면이고, 모든 21 피리미딘 잔기는 2'-플루오로 변형을 가지며 퓨린의 대다수(14 잔기)는 2'-OMe 변형을 가지고, 그렇지 않은 3개의 2'-OH 퓨린 잔기는 밑줄로 표시하였다.
도 4는 앱타머의 5' 말단에 부착된40 kD의 분지형 PEG (l,3-비스(mPEG-[20 kDa])-프로필-2-(4'-부타미드)를 도시한 도면이다.
도 5는 앱타머의 5' 말단에 부착된 40 kD 분지형 PEG (l,3-비스(mPEG-[20 kDa])-프로필-2-(4'-부타미드)를 도시한 도면이다.
도 6은 고분자량의 PEG-핵산 접합체의 합성을 위한 다양한 전략을 도시한 도면이다.
도 7A는 비PEG화 항-C5 앱타머(ARC186(서열 번호 4))에 대하여, PEG화 항-C5 앱타머(ARC(서열 번호 61), ARC658(서열 번호 62) 및 ARC187(서열 번호 5))에 의한 용혈의 용량 의존적 억제율을 비교한 그래프이다. 도 7B는 도 7A에 도시한 용혈 분석법에서 사용한 앱타머의 IC50 값을 나타낸 표이다. 도 7C는 PEG화 항-C5 앱타머 ARCl 87(서열 번호 5), ARC1537(서열 번호 65), ARC1730(서열 번호 66) 및 ARC1905(서열 번호 67)에 의한 용혈의 용량 의존적 억제율을 비교한 그래프이다. 도 7D는 도 7C에서 도시한 용혈 분석법에서 사용한 앱타머의 IC50 값을 나타낸 표이다.
도 8은 사이노멀거스(Cynomolgus) 원숭이 혈청 보체 대 인간 혈청 보체의 항-C5 앱타머 ARC658(서열 번호 62)에 의한 용혈의 억제율을 나타내는 그래프이다.
도 9는 15분 항온 반응 후 37℃ 및 실온(23℃) 두 온도에서 정제 C5 단백질에 ARC186(서열 번호 4)의 결합을 도시한 그래프이다.
도 10은 4시간 항온 반응 후 37℃ 및 실온(23℃) 두 온도에서 정제된 C5 단백질에 ARC186(서열 번호 4)의 결합을 도시한 또 다른 그래프이다.
도 11은 23℃에서 C5·ARC186 복합체의 시간 경과에 따른 해리를 보여주는 그래프이다.
도 12는 23℃에서 C5·ARC186의 형성에서 시간 경과에 따른 평형 상태를 보여주는 그래프이다.
도 13은 ARC186(서열 번호 4)의 C5 단백질 대 보체 캐스캐이드 내 상류 및 하류 단백질 성분에 대한 결합능을 도시한 그래프이다.
도 14는 비표지화 경쟁인자 ARC186(서열 번호 4), ARC657(서열 번호 61), ARC658(서열 번호 62) 또는 ARCl 87(서열 번호 5)의 존재하에서 C5에 결합된 방사선 동위 원소 표지된 ARC186(서열 번호 4)의 비율을 도시한 그래프이다.
도 15는 다양한 농도의 ARC186(서열 번호 4) 앱타머의 존재하에 25℃ 및 37℃에서 5시간 동안 항온반응시킨 혈액 샘플 중에 생성된 C5b 보체 단백질의 양을 도시한 그래프이다.
도 16은 희석하지 않은 인간 혈청 중 자이모산, 시트레이트화된 인간 전체 혈액 또는 사이노멀거스 혈청의 존재하에서, ARC187(서열 번호 5)에 의한 보체 억제율을 도시한 그래프이다.
도 17은 실시예 1D에서 기술한 관루프 모델(tubing loop model)에서 ARC658(서열 번호 62)이 보체 활성화(C5a)를 완전하게 억제함을 보여주는 그래프이다.
도 18은 C5 선별 풀의 라운드 10에 대한 해리 상수를 도시한 그래프이다. 해리 상수(Kds)는 하기 식에 데이타를 대입하여 산출하였다: RNA 결합 분율 = 진폭*Kd/(Kd+[C5]). "ARC520(서열 번호 70)은 실험하지 않은(naive) 비선별된 dRmY 풀을 의미하고 "+"는 경쟁인자의 존재를 의미한다(0.1 mg/mL tRNA, 0.1 mg/mL 연어 정자 DNA).
도 19는 C5 클론 해리 상수 곡선을 나타내는 그래프이다. 해리 상수(Kds)는 하기 식에 데이타를 대입하여 산출하였다:RNA 결합 분율 = 진폭*Kd/(Kd+[C5]).
도 20은 ARC186(서열 번호 4)와 비교하여 다양한 농도의 항-C5 앱타머 클론 ARC913(서열 번호 75)의 용혈 활성에 대한 억제 효과를 나타내는 IC50 곡선을 도시한 그래프이다.
도 21은 ARC187(서열 번호 5)의 구조를 도시한 도면이다.
도 22는 ARC1905(서열 번호 67)의 구조를 도시한 도면이다.
도 23은 처음 단리한 관류된 심장 연구에 대한 실험 설계도를 개략적으로 나타낸 표이다.
도 24는 인간 혈장(A)에 노출된 단리한 심장의 좌심실(LV)의 심실내 압력에 대한 압력 추적도를 대조군 앱타머 용액(B)에 노출시킨 단리한 심장의 LVP 압력 추적도와 비교하여 나타낸 그래프이다.
도 25는 몰당량, 10X 및 50X 앱타머/C5 용액(여기서 대략 500 nM의 농도는 정상적인, 희석하지 않은 인간 혈장 내 C5에 대해서 추정한 것임)에 노출시킨 단리된 심장의 좌심실(LV)의 심실내 압력에 대한 압력 추적도를 비교한 그래프이다.
도 26은 인간 혈장 및 다양한 혈장/앱타머 용액에 노출시킨 후 단리한 마우스 심장에서 분당 심박 변화율(bpm)을 비교한 그래프이다.
도 27은 0-1X 몰비 ARC186(서열 번호 4)(약화된 심장), 또는 10-50X 몰비율(C5 앱타머로 보호한 심장)을 포함하는 인간 혈장에 노출되기 전 및 후의 단리한 마우스 심장의 심장 무게의 변화를 비교한 그래프이다.
도 28은 단리한 마우스 심장을 통해서 관류한 후, 다양한 농도의 앱타머 를 함유하는 인간 혈장 중 상대적인 C5a 생성 정도를 비교한 그래프이다. 상대적인 C5a 농도는 흡광 단위(Abs)로서 그래프화하였는데, 여기서 보다 높은 판독치는 C5a가 보다 높은 농도로 존재함을 의미하는 것이다.
도 29는 단리한 마우스 심장을 통한 관류 후, 다양한 농도의 앱타머를 함유하는 인간 혈장 중에서 상대적인 가용성 C5b-9의 생성 정도를 비교한 그래프이다.
도 30은 마우스 심장 유출물 중 C3 절단에 대한 ARC186(서열 번호 4)의 효과를 도시한 그래프이다.
도 31은 단리한 관류시킨 마우스 심장 실험에 대한 면역조직화학 염색 결과를 도시한 표이다.
도 32는 C5b 매개된 손상으로부터 심장을 보호하기 위해서 인간 또는 영장류 혈장 중에 필요한 ARC658(서열 번호 62)의 몰비를 도시한 표이다.
도 33은 래트 및 사이노멀거스 마카쿠(cynomolgus macaque) 혈장 중에서 항온반응 시간 함수에 따른 전체 길이 ARC186의 잔류 비율을 로그-선형 곡선으로 도시한 그래프이다.
도 34는 실시예 5에서 기술한 바와 같이 스프라그-다우리 래트에 대해 수행한 약물 동력학 실험의 실험 설계도를 도시한 표이다.
도 35는 스프라그 다우리 래트에서 시간에 따른 ARC657(서열 번호 61), ARC658(서열 번호 62) 또는 ARC187(서열 번호 5)의 평균 혈장 농도를 도시한 표이다.
도 36은 래트에서 앱타머의 정맥 내 투여 이후 시간 경과에 따른 ARC657(서 열 번호 61), ARC658(서열 번호 62) 또는 ARC187(서열 번호 5)의 평균 혈장 농도를 도시한 그래프이다.
도 37은 도 35 및 36에 도시한 시간에 따른 농도의 비구획 분석 결과를 도시한 표이다.
도 38A는 마우스에서 ARC187(서열 번호 5) 및 ARC1905(서열 번호 67)의 약물동력학 실험에 대한 계획도를 도시한 표이고, 도 38B는 단일 IV 볼러스 투여후 CD-1 마우스에서 ARC187(서열 번호 5) 및 ARC1905(서열 번호 67)의 약물 동력학 프로파일을 도시한 그래프이며, 도 38C는 도 38B에서 도시한 시간에 따른 농도의 비구획 분석 결과를 도시한 표이다.
도 39는 정맥 내 투여 후 마우스 심장 조직에서의 열거한 앱타머의 검출 결과를 도시하는 표이다.
도 40은 실시예 5E에서 기술한, 동물 실험 1의 실험 설계도를 도시한 표이다.
도 41은 사이노멀거스 마카쿠에 앱타머를 정맥 내 볼러스 투여한 후, 시간 경과에 따른 앱타머의 혈장 농도를 도시한 표이다.
도 42는 실험 1에서 사이노멀거스 마카쿠에게 정매 내 투여된 ARC657(서열 번호 61), ARC658(서열 번호 62) 및 ARCl 87(서열 번호 5)에 대한 약물 동력학 파라미터를 열거한 표이다.
도 43(a) 및 43(c)는 사이노멀거스 마카쿠에게 항-C5 앱타머 ARC657(서열 번호 61), ARC658(서열 번호 62) 또는 ARCl 87(서열 번호 5)를 정맥 내 투여한 후 시 간 경과에 따른 sC5b-9 및 C5a의 혈장 농도를 도시한 그래프이고, 도 43(b) 및 43(d)는 항-C5 앱타머 ARC657(서열 번호 61), ARC658(서열 번호 62) 또는 ARCl 87(서열 번호 5)에 대한 sC5b-9 및 C5a의 혈장 농도를 도시한 그래프이다.
도 44는 실시예 5F에 기술한, 실험 2의 실험 계획도를 도시한 도면이다.
도 45는 사이노멀거스 마카쿠에게 ARC658(서열 번호 62) 또는 ARC187(서열 번호 5)을 정맥 내 투여한 후, 다양한 시간 지점에서의 평균 앱타머 혈장 농도를 도시한 그래프이다.
도 46은 사이노멀거스 마카쿠에게 정맥 내 볼러스 앱타머 투여 후 시간에 따른 농도의 2구획 분석 결과를 도시한 표이다.
도 47은 사이노멀거스 혈장에 자이모산 존재하에서 ARC187(서열 번호 5) 또는ARC658(서열 번호 62) 농도에 대한 C5b-9의 농도를 도시한 그래프이다.
도 48은 사이노멀거스 혈장에 자이모산의 존재하에서 ARC187(서열 번호 5) 또는 ARC658(서열 번호 62) 농도에 대한 C5a의 농도를 도시한 그래프이다.
도 49는 사이노멀거스 마카쿠에게 IV 볼러스와 주입 투여하는 동안 및 그 후에 ARC187(서열 번호 5)에 대해 PK-PD 실험한 결과를 요약한 표이다.
도 50은 IV 볼러스 투여 후 사이노멀거스 마카쿠에서 ARC187(서열 번호 5)에 대한 약물 동력학의 파라미터를 요약한 표이다.
도 51은 사이노멀거스 마카쿠에게 IV 볼러스와 주입 투여하는 동안 및 그 후에 ARC187(서열 번호 5)에 대해 산출 및 실제 측정한 약물 동력학 프로파일을 도시한 그래프이다.
도 52는 사이노멀거스 마카쿠에게 IV 볼러스와 주입 투여 동안 및 그 후에 일정하게 남은 활성 ARC187(서열 번호 5)의 혈장 농도를 도시한 그래프이다.
도 53은 CABG 수술에서 항-C5 앱타머에 대해 예상되는 인간 투여 요구량을 도시한 표이다.
도 54는 프로트롬빈 시간(PT) 및 활성화된 부분 트롬보플라스틴 시간(APTT)을 통해 측정된 응집에 대해서 ARC187(서열 번호 5)가 비교적 시험관 내 영향이 없음을 도시한 그래프이다.
도 55는 헤파린의 항응집 활성, 및 프로타민의 프로응집 활성에 대한 ARC187(서열 번호 5)의 시험관 내 효과를 요약한 표이다.
도 56은 ARC187(서열 번호 5)가 생체 내에서 헤파린 항응집의 반전에 어떠한 영향도 없음을 보여주는 그래프이다.
도 57은 자이모산의 보체 활성화를 억제하여 측정한, ARC187(서열 번호 5)의 항-보체 기능에 대해 헤파린 및 프로타민 양자가 어떠한 영향도 없음을 보여주는 그래프이다.
도 58은 항-C5 앱타머 ARC1905(서열 번호 67) 또는 ARC672(서열 번호 63)의 농도 함수에 따른 인간 혈청에서 양의 적혈구 용혈 억제율을 도시한 그래프이다.
도 59A는 ARC1905(서열 번호 67)에 의한 인간, 사이노멀거스 원숭이 및 래트 혈청에서 용혈 억제율을 도시한 그래프이고, 도 59B는 ARC1905, 항-C5 앱타머 또는 ARC127로서, C5에 결합하지 않는 비관련 앱타머(음성 대조군)에 의한 인간, 사이노 멀거스 원숭이 및 래트 혈청에서 보체 활성화의 억제에 대한 평균 IC50 값을 요약한 표이다.
도 60은 경쟁적 결합 분석에서, 비표지화 경쟁 인자 ARC1905(서열 번호 67) 또는 ARC672(서열 번호 63)의 농도 함수(가로축)에 따른 방사선 동위 원소 표지된 ARC186(서열 번호 4)(세로축)의 억제에 대한 IC50 값을 도시한 그래프이다.
도 61은 경쟁적 결합 분석에서 37℃ 및 25℃에서 비표지화 경쟁 인자 ARC1905(서열 번호 67)의 농도 함수(가로축)에 따른 방사선 동위 원소 표지된 ARC186(서열 번호 4)(세로축)의 억제에 대한 IC50 값을 도시한 그래프이다.
도 62는 인간 C5a(hC5a) 및 사이노멀거스 원숭이 C5a(hC5a eq.)에 대한 표준 곡선을 도시한 그래프이다.
도 63은 자이모산 유도된 보체 활성화 분석법으로 측정된, ARC1905(서열 번호 67)에 의한 인간 및 사이노멀거스 원숭이 혈청에서 C5 활성화의 억제에 대한 IC50, IC90 및 IC99 값을 요약한 표이다.
도 64는 자이모산 유도된 보체 활성화 분석법으로 측정한 인간 및 사이노멀거스 원숭이 혈청에서 ARC1905(서열 번호 67) 농도 함수에 따른 C5a 생성의 억제율을 도시한 그래프이다.
도 65는 자이모산 유도된 보체 활성화 분석법으로 측정한 인간 또는 사이노멀거스 원숭이 혈청에서 C3a 생성에 대한 ARC1905(서열 번호 67)의 영향을 도시한 그래프이다.
도 66은 보체 활성화의 관 루프 모델에서 측정한 5 공여자 유래의 인간 혈청에서 보체 활성화에 대한 ARC1905(서열 번호 67)에 대한 평균 IC50, IC90 및 IC99 값을 요약한 표이다
도 67은 보체 활성화의 관 루프 모델에서 ARC1905, 항-C5 앱타머 또는 C5에 결합하지 않는 비관련 앱타머인 ARC127(음성 대조군)의 농도 함수에 따른 C5a 및 C3a 생성의 억제율을 도시한 그래프이다.
-본 발명의 요약-
본 발명은 보체 관련 안구 질환(또한 여기서 안구 질병이라고도 함)의 치료, 예방 및/또는 안정화를 위한 물질 및 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구체예에서, 항-보체 앱타머는 보체 성분 또는 이의 변이체의 기능을 조정한다. 특히 바람직한 구체예에서, 항-보체 앱타머는 바람직하게 생체 내에서, 바람직하게 척추 동물에서, 바람직하게 포유 동물에서, 보다 바람직하게는 인간 생체 내에서 보체 성분 또는 이의 변이체의 기능을 억제 또는 저하시킨다. 본 발명의 일 구체예에서, 예를 들어, C2, C3, C4, C5 및/또는 인자 B가 보체 표적인 경우, 앱타머에 의해 조정, 바람직하게는 억제되는 기능은 보체 단백질 절단이다. 본 발명의 일 구체예에서, 예를 들어, C2b, C5b, C6, C7, C8, C9, 인자 B 및/또는 프로페르딘이 보체 표적인 경우, 앱타머에 의해 조정, 바람직하게 억제되는 기능은 활성 보체 성분 응집체 예컨대 전환 효소 또는 막 공격 복합체의 회합이다. 본 발명의 일 구체예에서, 예를 들어 C3b, 인자 D, C1(C1r 및/또는 C1s) 및/또는 만노스 연합 세린 프로테아제("MASP")가 보체 표적인 경우, 앱타머에 의해 조정, 바람직하게 억제되는 기능은 효소 활성이다. 본 발명의 일 구체예에서, 예를 들어, C3a, C5a, C3a 수용체 또는 C5a 수용체가 보체 표적인 경우, 앱타머에 의해 조정, 바람직하게 억제되는 기능은 리간드/수용체 결합이다.
일 구체예에서, C5, C5a 및/또는 C5b-9 매개된 안구 질환의 안정화, 치료 및/또는 예방 방법을 제공하고, 이 방법은 이를 필요로 하는 개체에게 안구 질환을 안정화, 치료 및/또는 예방하기에 충분한 양으로 항-C5 제제를 투여하는 단계를 포함한다. 일 구체예에서, 안정화, 치료 및/또는 예방할 안구 질환은 안구 신혈관생성 질환이다. 일 구체예에서, 안정화, 치료 및/또는 예방할 안구 질환은 당뇨병성 망막병증 또는 황반 변성증, 구체적으로 나이 관련 황반 변성증("AMD")이다. 일 구체예에서, 안정화, 치료 및/또는 예방할 AMD는 삼출성 AMD이다. 일 구체예에서, 안정화, 치료 및/또는 예방할 AMD는 비삼출형이다.
일 구체예에서, 보체 매개성 안구 질환을 안정화, 치료 및/또는 예방하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 이러한 안정화, 치료 및/또는 예방이 필요한 개체에게 항-보체 앱타머의 치료적 유효량을 투여하는 단계를 포함한다. 일 구체예에서, 항-보체 앱타머의 치료적 유효량은 안구 질환을 안정화, 치료 및/또는 예방하기에 충분한 양이다. 본 발명의 일 구체예에서, 개체는 척추 동물이고, 일 구체예에서는 포유류, 일 구체예에서는 인간이다. 일 구체예에서, 안정화, 치료 및/또는 예방할 보체 매개성 안구 질환은 급성 또는 만성 염증성 및/또는 면역 매개성 안구 질환이다. 일 구체예에서, 치료, 예방 및/또는 안정화할 보체 매개성 안구 질환은 알레르기성 및 거대 유두성 결막염을 비롯한 염증성 결막염, 황반 부종, 포도막염, 안내염, 공막염, 각막 궤양, 건성안 증후군, 녹내장, 허혈성 망막 질환, 각막 이식 거부증, 안구내 수술 예컨대 안구내 렌즈 이식술과 관련된 합병증 및 백내장 수술과 관련된 염증, 베체트병, 스타르가르트병, 면역 복합 혈관염, 푸크스 질환, 보그트-고야나기-하라다병, 망막하 섬유증, 각막염, 초자체 망막 염증, 안구 기생충성 감염/이동증, 망막 색소 변성증, 거대세포바이러스 망막염 및 맥락막 염증으로 구성된 군으로부터 선택된다. 일 구체예에서, 안정화, 치료 및/또는 예방할 안구 질환은 황반 변성증, 구체적으로 나이 관련 황반 변성증("AMD")이다. 일 구체예에서, 안정화, 치료 및/또는 예방할 안구 질환은 비삼출성("건성" 및/또는 "위축성") AMD이다. 일 구체예에서, 안정화, 치료 및/또는 예방할 안구 질환은 안구 신혈관생성 질환, 예컨대 당뇨병성 망막병증 또는 삼출성("습성") AMD이다.
일 구체예에서, C5, C5a 및/또는 C5b-9 매개성 안구 신혈관생성 질환, 구체적으로 삼출성 AMD 또는 당뇨병성 망막병증을 안정화시키는 방법을 제공하며, 이 방법은 이러한 안정화가 필요한 개체에게 C5, C5a 및/또는 C5b-9 매개성 안구 신혈관생성 안구 질환을 안정화시키기에 충분한 양으로 항-C5 제제를 투여하는 단계를 포함한다. 일 구체예에서, 항-C5 제제는 이 항-C5 제제를 투여시 개체의 시력 수준과 비교하여 개체의 시력 수준을 적어도 동일하게 유지하기에 충분한 양으로 투여된다. 일 구체예에서, 항-C5 제제는 이 항-C5 제제 투여시 개체의 망막 혈관 밀도와 대략 동일하게 개체에서 망막 혈관 밀도를 유지하기에 충분한 양으로 투여된다.
일 구체예에서, 보체 매개 안구 신혈관생성 질환, 구체적으로 삼출성 AMD 또는 당뇨병성 망막병증을 안정화시키는 방법을 제공하며, 이 방법은 이러한 안정화가 필요한 개체에게 보체 매개성 안구 신혈관생성 질환을 안정화시키기에 충분한 양으로 항-보체 앱타머를 투여하는 단계를 포함한다. 일 구체예에서, 항-보체 앱타머는 이 항-보체 앱타머의 투여시 개체의 시력 수준과 비교하여 개체의 시력 수준을 적어도 동일하게 유지하기에 충분한 양으로 투여한다. 일 구체예에서, 항-보체 앱타머는 이 앱타머 투여시 개체의 망막 혈관 밀도와 대략 동일한 수준으로 개체의 망막 혈관 밀도를 유지시키기에 충분한 양으로 투여된다. 일 구체예에서, 항-보체 앱타머는 이 항-보체 앱타머의 투여시 개체의 신혈관생성 연관 출혈, 유체 축적, 망막 박리 및/또는 반흔화 수준에 대해서 개체의 신혈관생성 연관 출혈, 유체 축적, 망막 박리 및/또는 반흔화의 수준을 안정화 또는 유지시키기에 충분한 양으로 투여된다.
일 구체예에서, C5, C5a 및/또는 C5b-9 매개성 안구 신혈관생성 질환, 구체적으로 삼출성 AMD 또는 당뇨병성 망막병증을 치료하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 이러한 치료를 필요로하는 개체에게 C5, C5a 및/또는 C5b-9 매개성 안구 신혈관생성 질환의 징후를 경감시키기에 충분한 양으로 항-C5 제제를 투여하는 단계를 포함한다. 일 구체예예서, 항-C5 제제는 항-C5 제제 투여시 개체의 시력 수준에 대해서 개체에서 시력 수준을 개선시키기에 충분한 양으로 투여된다. 일 구체예에서, 항-C5 제제는 항-C5 제제 투여 시 개체의 망막 혈관 밀도에 대해서 개체에서 망막 혈관 밀도 수준을 저하시키기에 충분한 양으로 투여된다.
일 구체예에서, 보체 매개성 안구 신혈관생성 질환, 구체적으로 삼출성 AMD 또는 당뇨병성 망막병증을 치료하는 방법을 제공하고, 이 방법은 이러한 치료가 필요한 개체에게 보체 매개성 안구 신혈관생성 질환의 징후를 경감시키기에 충분한 양으로 항-보체 앱타머를 투여하는 단계를 포함한다. 일 구체예에서, 항-보체 앱타머는 이 항-보체 앱타머를 투여시 개체의 시력 수준에 대해서 개체의 시력 수준을 개선시키기에 충분한 양으로 투여된다. 일 구체예에서, 항-보체 앱타머는 이 항-보체 앱타머의 투여시 개체의 망막 혈관 밀도 수준에 대해서 개체에서 망막 혈관 밀도의 수준을 저하시키기에 충분한 양으로 투여된다. 일 구체예에서, 항-보체 앱타머는 이 항-보체 앱타머의 투여시 개체의 신혈관생성 연관 출혈, 유체 축적, 망막 박리 및/또는 반흔화의 수준에 대해서 개체에서 신혈관생성 연관 출혈, 유체 축적, 망막 박리 및/또는 반흔화의 수준을 저하시키기에 충분한 양으로 투여된다.
일 구체예에서, 개체에서 임상적 보체 매개성 안구 신혈관생성 질환, 구체적으로 삼출성 AMD 또는 당뇨병성 망막병증을 예방하는 방법을 제공하고, 이 방법은 보체 매개성 안구 신혈관생성 질환의 임상 징후를 예방하기에 충분한 양으로 개체에게 항-보체 앱타머를 투여하는 단계를 포함한다. 일 구체예에서, 항-보체 앱타머는 개체에서 임상적 시력 상실을 예방하기에 충분한 양으로 투여된다. 일 구체예에서, 항-보체 앱타머는 임상적 안구 신혈관생성 질환과 상관 관계가 있는 개체의 망막 혈관 밀도 수준을 예방하기에 충분한 양으로 투여된다. 일 구체예에서, 개체는 안구 신혈관생성 질환이 발병할 위험 상태이다. 일 구체예에서, 상기 방법은 항-보체 앱타머의 투여전에 보체 매개성 안구 신혈관생성 질환이 발병할 위험 상태인 개체를 확인하는 단계를 추가로 포함한다. 일 구체예에서, 확인 단계는 개체에서 드루센의 존재 및/또는 색소형성 변화 존재를 검출하고 임상적 시력 상실이 없음을 검출하는 것을 포함한다. 일 구체예에서, 확인 단계는 야생형 인자 H에 대해서 개체에서 보체 인자 H의 변이를 검출하는 단계를 포함한다. 야생형 인자 H의 아미노산 서열은 [Ripoche 등(1988) The complete amino acid sequence of human complement factor H.Biochem.J. 249, 593-602]에 보고되어 있다. 일 구체예에서, 개체에서 보체 매개성 신혈관생성 안구 질환, 구체적으로 당뇨병성 망막병증을 안정화, 치료 및/또는 예방하는 방법을 제공하는데, 이 항-보체 앱타머의 투여 경로는 안구 또는 안구 주변 투여 경로이다.
일 구체예에서, 개체에서 임상적인 C5, C5a 및/또는 C5b-9 매개성 안구 신혈관생성 질환, 구체적으로 삼출성 AMD 또는 당뇨병성 망막병증을 예방하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 개체에게 C5, C5a 및/또는 C5b-9 매개성 안구 신혈관생성 질환의 임상 징후를 예방하는데 충분한 양으로 항-C5 제제를 투여하는 단계를 포함한다. 일 구체예에서, 항-C5 제제는 개체에서 임상적 시력 상실을 예방하기에 충분한 양으로 투여된다. 일 구체예에서, 항-C5 제제는 임상적 안구 신혈관 질환과 상호관련된 개체의 망막 혈관 밀도의 수준을 예방하기에 충분한 양으로 투여된다. 일 구체예에서, 개체는 안구 신혈관생성 질환이 발병할 위험 상태이다. 일 구체예에서, 상기 방법은 항-C5 제제의 투여 전에 C5, C5a 및/또는 C5b-9 매개성 안구 신혈관생성 질환이 발병할 위험 상태인 개체를 확인하는 단계를 추가로 포함한다. 일 구체예에서, 확인 단계는 개체에서 드루센의 존재를 검출하고 시력의 임상적 상실이 없음을 검출하는 것을 포함한다. 일 구체예에서, 확인 단계는 개체의 보체 인자 H에서 변이를 검출하는 것을 포함한다.
상기 기술한 방법의 일 구체예에서, 상기 방법은 개체에게 항-VEGF 제제를 투여하는 단계를 추가로 포함하는데, 구체적으로 항-VEGF 제제는 핵산 분자, 앱타머, 안티센스 분자, RNAi 분자, 단백질, 펩티드, 환형 펩티드, 항체 또는 항체 단편, 당류, 중합체 및 소분자로 구성된 군으로부터 선택된다.
상기 기술한 방법의 일 구 체예에서, 개체에게 항-PDGF 제제를 투여하는 단계를 추가로 포함하고, 구체적으로 항-PDGF 제제는 핵산 분자, 앱타머, 안티센스 분자, RNAi 분자, 단백질, 펩티드, 환형 펩티드, 항체 또는 항체 단편, 당류, 중합체 및 소분자로 구성된 군에서 선택된다.
상기 기술한 방법의 일 구체예에서, 상기 방법은 개체에게 항혈관제를 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 일 구체예에서, 항혈관제는 포르피린 유도체이다. 일 구체예에서, 포르피린 유도체는 주입용 베르테포르핀(verteporfin)(Visudyne®, Novartis Pharmaceuticals Corporation, East Hanover, NJ)이다. 일 구체예에서, 상기 방법은 레이저광으로 포르피린 유도체를 활성화시키는 단계를 추가로 포함한다.
일 구체예에서, C5, C5a 및/또는 C5b-9 매개성 비삼출성 AMD를 안정화, 치료 및/또는 예방하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 이러한 안정화, 치료 및/또는 예방이 필요한 개체에게 비삼출성 AMD를 안정화, 치료 및/또는 예방하기에 충분한 양으로 항-C5 제제를 투여하는 단계를 포함한다. 일 구체예에서, 비삼출성 AMD를 안정화시키는데, 상기 항-C5 제제는 이 항-C5 제제의 투여시 개체의 드루센 수준과 비교하여 대략 동일하게 드루센 수준을 유지하기에 충분한 양으로 투여된다. 일 구체예에서, 비삼출성 AMD를 안정화시키는데, 항-C5 제제는 항-C5 제제의 투여시 개체의 시력과 비교하여 개체의 시력 수준을 대략 동일하게 유지하기에 충분한 양으로 투여된다. 일 구체예에서, 비삼출성 AMD를 치료하게 되고, 항-C5제제는 항-C5 제제의 투여시 개체의 드루센 수준과 비교하여 드루센 수준을 저하시키기에 충분한 양으로 투여된다. 일 구체예에서, 비삼출성 AMD를 치료하고, 항-C5 제제는 항-C5 제제의 투여시 개체의 시력과 비교하여 개체의 시력을 개선시키기에 충분한 양으로 투여된다. 일 구체예에서, 비삼출성 AMD를 예방하고, 상기 방법은 이러한 예방이 필요한 개체에게 C5, C5a 및/또는 C5b-9의 임상적 징후를 예방하기에 충분한 양으로 항-C5 제제를 투여하는 단계를 포함한다. 일 구체예에서, 항-C5 제제는 개체에서 임상적 시력 상실을 예방하기에 충분한 양으로 투여된다. 일 구체예에서, 항-C5 제제는 드루센의 임상적 수준의 축적을 예방하기에 충분한 양으로 투여된다. 일 구체예에서, 개체는 비삼출성 AMD로 발전할 위험 상태이다. 일 구체예에서, 상기 방법은 항-C5 제제의 투여 전에 C5, C5a 및/또는 C5b-9 매개성 비삼출성 AMD로 발전할 위험 상태인 개체를 확인하는 단계를 포함한다. 일 구체예에서, 확인 단계는 개체에서 드루센을 검출하고 임상적 시력 상실이 없음을 검출하는 것을 포함한다. 일 구체예에서, 확인 단계는 개체의 보체 인자 H의 변이를 검출하는 것을 포함한다.
상기 기술한 방법의 일 구체예에서, 항-C5 제제는 핵산 분자, 앱타머, 안티센스 분자, RNAi 분자, 단백질, 펩티드, 환형 펩티드, 항체 또는 항체 단편, 당류, 중합체 및 소분자로 구성된 군으로부터 선택된다. 구체예에서, 항-C5 제제는 C5 특이적 앱타머, 보다 구체적으로 C5 특이적 엡타머는 서열 번호 1 내지 67, 75 내지 81 및 88-98로 구성된 군에서 선택된다. 바람직한 구체예에서, 상기 기술한 방법에서 사용하기 위한 C5 특이적 앱타머는 ARC187(서열 번호 5) 및 ARC1905(서열 번호 67)로 구성된 군에서 선택된다.
상기 기술된 방법의 일 구체예에서, 항-C5 제제는 안구 투여, 구체적으로 유리체내 투여로 전달된다. 상기 기술한 방법의 일 구체예에서, 항-VEGF 제제, 항-PDGF 제제 및/또는 항혈관제는 안구 투여로 전달된다. 상기 기술한 방법의 일 구체예에서, 투여되는 항-C5 제제, 항-VEGF 제제, 항-PDGF 제제 및/또는 항혈관제는 프로드러그이다. 상기 기술한 방법의 일 구체예에서, 개체는 인간이다.
상기 기술한 방법에서 사용되는 용어 "항-C5 제제 투여시"는 항-C5 제제 투여 전에 의심되는 징후가 임상적으로 측정된 시기를 포함한다.
일 구체예에서, 보체 매개성 비삼출성 AMD를 안정화, 치료 및/또는 예방하는 방법을 제공하고, 이 방법은 이러한 안정화, 치료 및/또는 예방이 필요한 개체에게 항-보체 앱타머의 치료적 유효량을 투여하는 단계를 포함한다. 일 구체예에서, 비삼출성 AMD를 안정화시키고, 항-보체 앱타머는 항-보체 앱타머의 투여시 개체의 드루센 수준과 비교하여 드루센의 수준(예를 들어, 크기, 수, 면적 및/또는 형태)을 대략 동일하게 유지하기에 충분한 양으로 투여된다. 일 구체예에서, 비삼출성 AMD를 안정화시키고, 항-보체 앱타머는 항-보체 앱타머의 투여시 개체의 수준과 비교하여 지도형 위축증의 수준을 대략 동일하게 유지하여 망막 색소 상피층, 광수용체 및/또는 맥락막 모세혈관의 위축증을 비롯하여, 지도형 위축증으로 발전되는 것을 안정화시키기에 충분한 양으로 투여된다. 일 구체예에서, 비삼출성 AMD가 안정화되고, 항-보체 앱타머는 항-보체 앱타머의 투여시 개체의 시력과 비교하여 개체에서 시력 수준을 대략 동일하게 유지하기에 충분한 양으로 투여된다.
일 구체예에서, 비삼출성 AMD를 치료하고, 항-보체 앱타머는 항-보체 앱타머의 투여시 개체의 드루센 수준과 비교하여 드루센, 구체적으로 크고 연성인 드루센의 수준을 저하시키기에 충분한 양으로 투여된다. 일 구체예에서, 비삼출성 AMD를 치료하고, 항-보체 앱타머는 항-보체 앱타머의 투여시 개체의 시력과 비교하여 개체의 시력을 개선시키기에 충분한 양으로 투여된다.
일 구체예에서, 비삼출성 AMD를 예방하고, 상기 방법은 이러한 예방이 필요한 개체에게 보체 매개성 비삼출성 AMD의 임상적 징후를 예방하기에 충분한 양으로 항-보체 앱타머를 투여하는 단계를 포함한다. 일 구체예에서, 항-보체 앱타머는 개체에서 임상적 시력 상실을 예방하기에 충분한 양으로 투여된다. 일 구체예에서, 항-보체 앱타머는 드루센, 특히 크고, 연성인 드루센의 임상적 수준의 축적을 예방하기에 충분한 양으로 투여된다. 일 구체예에서, 항-보체 앱타머는 지도형 위축증의 임상적 수준을 예방하기에 충분한 양으로 투여된다. 일 구체예에서, 항-보체 앱타머는 개체에서 삼출성 AMD로의 발전을 예방하기에 충분한 양으로 비삼출성 AMD를 갖는 개체에게 투여된다. 일 구체예에서, 항-보체 앱타머는 개체에서 삼출성 AMD로 발전 또는 지도형 위축증의 임상적 수준을 예방하기에 충분한 양으로 나이 관련 황반 변성증(드루센, 망막 색소형성 변화 및/또는 위축증의 소영역 존재로 특징됨)을 갖는 개체에게 투여된다.
일 구체예에서, 개체는 비삼출성 AMD로 발전할 위험성이 있는 상태이다. 일 구체예에서, 상기 방법은 항-보체 앱타머의 투여전에 보체 매개성 비삼출성 AMD로 발전할 위험성이 있는 개체를 확인하는 단계를 추가로 포함한다. 일 구체예에서, 확인 단계는 개체에서 드루센, 구체적으로 크고, 연성인 드루센의 존재, 망막 색소형성의 변화 및/또는 위축증 영역의 존재를 검출하고 임상적 시력 상실이 없음을 검출하는 것을 포함한다. 일 구체예에서, 확인 단계는 야생형과 비교하여 개체의 보체 인자 H의 변이를 검출하는 것을 포함한다.
상기 기술한 방법의 일 구체예에서, 항-보체 앱타머는 고전 보체 경로의 성분, 대체 보체 경로의 성분 및 렉틴 경로의 성분으로 구성된 군으로부터 선택된 보체 표적을 억제한다. 일 구체예에서, 항-보체 앱타머는 막공격 경로의 보체 표적을 억제한다. 일 구체예에서, 항-보체 앱타머는 C1, C1q, C1r, C1s, C2, C3, C3a, C3a 수용체, C4, C5, C5a, C5a 수용체, C5b, C6, C7, C8, C9, 인자 B, 인자 D, 프로페르딘, 만난 결합 렉틴(이하, "MBL"), MBL 연합 세린 프로테아제 1("MASP 1") 및 MBL 연합 세린 프로테아제 2("MASP 2")로 구성된 군으로부터 선택된 보체 표적을 억제한다. 일 구체예에서, 항-보체 앱타머는 C3a, C3a 수용체, C5a 및 C5a 수용체로 구성된 군에서 선택된 보체 표적에 대해 친화성 및 높은 특이성을 갖는 앱타머가 아니다. 일 구체예에서, 항-보체 앱타머는 인자 B 및 인자 D로 구성된 군으로부터 선택된 보체 표적에 대해 친화성 및 높은 특이성을 갖는 앱타머가 아니다.
상기 기술한 방법의 일 구체예에서, 항-보체 앱타머는 안구 투여, 구체적으로 유리체내 또는 안구 주변 투여를 통해 개체에게 전달된다. 일 구체예에서, 개체에게 투여되는 항-보체 앱타머는 데포(depot) 제형이다.
본 발명에서 사용하는 용어 "항-보체 앱타머 투여시"는 의심되는 징후를 임상적으로 측정 또는 평가한 시점을 포함하는데, 여기서 측정 또는 평가는 항-보체 앱타머의 투여 전부터 항-보체 투여 직후의 측정을 포함하여 예를 들어, 투여 12시간 후, 24시간 후 또는 48시간 후까지 범위의 시기이다.
일 구체예에서, 항-보체 앱타머의 치료적 유효량, 예를 들어 보체 매개성 안구 질환을 안정화, 치료 및/또는 예방하기에 충분한 양을 포함하는 안구 약학 조성물을 제공한다. 본 발명의 약학 조성물은 약학적 허용 담체 또는 희석제를 포함할 수 있다. 이 측면에서, 본 발명은 생체 내, 구체적으로 인간 개체에서 안구 보체 표적의 기능을 억제하는 앱타머 또는 이의 염의 치료적 유효량 및 약학적 허용 담체 또는 희석제를 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 일 구체예에서, 안구 약학 조성물은 데포 제형을 포함한다.
일 구체예에서, 상기 방법에서 사용하기 위한 항-보체 앱타머는 생체 내 C5, 바람직하게는 인간 C5를 억제하는 앱타머이다. 구체예에서, 상기 방법에서 사용하기 위한 ARC186(서열 번호 4)에 따른 항-C5 앱타머 또는 PEG 부분에 접합된 ARC186(서열 번호 4)에 따른 뉴클레오티드 서열을 포함하는 앱타머를 제공한다. 특정 구체예에서, ARC186 앱타머/PEG 접합체는 PEG 부분은 결여되었지만 서열 번호 4에 따른 서열로 구성된 앱타머와 실질적으로 동일한 C5 보체 단백질에 대한 결합 친화성을 포함한다. 본 발명에서 사용하는 실질적으로 동일한 결합 친화성은 도트 블랏 분석으로 측정한 해리 상수에서 차이가 약 2 내지 10배를 넘지않고, 바람직하게는 2 내지 5배를 넘지 않는 것을 의미한다. 일 구체예에서, 해리 상수는 하기 실시예 1A에 기술된 바와 같은 경쟁 도트 블랏 분석법으로 측정한다. 일 구체예에서, 폴리에틸렌 글리콜 부분은 분자량이 10 kDa 보다 크고, 구체적으로는 분자량이 20 kDa, 보다 바람직하게는 30 kDa, 보다 바람직하게는 40 kDa이다. 일 구체예에서, PEG 부분은 ARC186(서열 번호 4)의 5' 말단에 접합된다. 일 구체예에서, 앱타머/PEG 접합체는 영장류에서 15시간 이상, 바람직하게는 24시간 이상, 보다 바람직하게는 48시간 이상의 반감기, 바람직하게는 하기 실시예 5E에 기술된 방법으로 측정한 바와 같은 2구획 모델에서 말단 반감기를 포함한다. 일 구체예에서, 앱타머/PEG 접합체는 래트에서 10시간 이상, 바람직하게는 15시간 이상의 반감기, 바람직하게는 2구획 모델에서의 말단 반감기를 포함한다. 일 구체예에서, ARC186(서열 번호 4)의 5' 말단에 접합된 PEG는 40 kDa PEG이다. 구체예에서, 40 kDa PEG는 분지형 PEG이다. 일 구체예에서, 분지형 40 kDa PEG는 1,3-비스(mPEG-[20 kDa]-프로필-2-(4'-부타미드)이다. 다른 구체예에서, 분지형 40 kDa PEG는 2,3-비스(mPEG-[20 kDa]-프로필-1-카바모일이다.
구체예에서, 분지형 40 kDa PEG는 1,3-비스(mPEG-[20 kDa]-프로필-2-(4'-부타미드)이고, 하기 구조를 갖는 앱타머가 제공된다:
Figure 112008070002540-pct00001
여기서,
''''은 링커를 의미한다.
앱타머 =
fCmGfCfCGfCmGmGfUfCfUfCmAmGmGfCGfCfUmGmAmGfUfCfUmGmAmGfUfUfUAfCfCfUmGfCmG-3T(서열 번호 4)이고, 이때, fC 및 fU = 2'-플루오로 뉴클레오티드, 및 mG 및 mA = 2'-OMe 뉴클레오티드이고 모든 다른 뉴클레오티드는 2'-OH이고 3T는 인버티드 데옥시티미딘이다.
일 구체예에서, 분지형 40 kDa PEG는 2,3-비스(mPEG-[20 kDa])-프로필-1-카바모일이고, 하기 구조를 갖는 앱타머를 제공한다:
Figure 112008070002540-pct00002
여기서,
''''는 링커를 의미한다.
앱타머 =
fCmGfCfCGfCmGmGfUfCfUfCmAmGmGfCGfCfUmGmAmGfUfCfUmGmAmGfUfUfUAfCfCfUmGfCmG-3T(서열 번호 4)이고, 여기서 fC 및 fU = 2'-플루오로 뉴클레오티드, 및 mG 및 mA = 2'-OMe 뉴클레오티드이고 모든 다른 뉴클레오티드는 2'-OH이고 3T는 인버티드 데옥시티미딘이다.
본 발명의 이 측면의 일 구체예에서, 링커는 알킬 링커이다. 구체예에서, 알킬 링커는 2 내지 18개의 연속적인 CH2 기를 포함한다. 바람직한 구체예에서, 알킬 링커는 2 내지 12개의 연속적인 CH2 기를 포함한다. 특히 바람직한 구체예에서, 알킬 링커는 3 내지 6개의 연속적인 CH2 기를 포함한다.
구체예에서, 하기의 구조를 갖는 앱타머, ARC187(서열 번호 5)을 제공한다:
Figure 112008070002540-pct00003
여기서, 앱타머 =
fCmGfCfCGfCmGmGfUfCfUfCmAmGmGfCGfCfUmGmAmGfUfCfUmGmAmGfUfUfUAfCfCfUmGfCmG-3T(서열 번호 4)이고, 이때, fC 및 fU = 2'-플루오로 뉴클레오티드, 및 mG 및 mA = 2'-OMe 뉴클레오티드이고 모든 다른 뉴클레오티드는 2'-OH이고 3T는 인버티드 데옥시티미딘이다.
다른 구체예에서는, 하기 구조를 갖는 앱타머, ARC1905(서열 번호 67)을 제공한다:
Figure 112008070002540-pct00004
여기서, 앱타머 =
fCmGfCfCGfCmGmGfUfCfUfCmAmGmGfCGfCfUmGmAmGfUfCfUmGmAmGfUfUfUAfCfCfUmGfCmG-3T(서열 번호 4)이고, 이때 fC 및 fU = 2'-플루오로 뉴클레오티드, 및 mG 및 mA = 2'-OMe 뉴클레오티드이고 모든 다른 뉴클레오티드는 2'-OH이고 3T는 인버티드 데옥시티미딘이다.
일 구체예에서, 개체에서 보체 매개 안구 질환을 치료, 안정화 및/또는 예방하는데 유효한 양으로 ARCl86(서열 번호 4), ARC187(서열 번호 5) 또는 ARC1905(서열 번호 67) 또는 이의 염을 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 본 발명의 약학 조성물은 약학적 허용 담체 또는 희석제를 포함할 수 있다. 이 측면에서, 본 발명은 생체 내에서 C5 보체 단백질 절단을 억제하는 앱타머 또는 이의 염의 치료적 유효량 및 약학적 허용 담체 또는 희석제를 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 본 발명의 이 측면에서, 생체 내에서 안구 질환을 치료, 안정화 및/또는 예방하는데 사용하기 위한 ARC186(서열 번호 4), ARC187(서열 번호 5) 또는 ARC1905(서열 번호 67) 약학 조성물을 제공한다. 또한, 본 발명의 이 측면에서, 개체에서 보체 매개성 안구 질환을 치료, 안정화 및/또는 예방하기 위한 약학 조성물을 제조하는데 사용하기 위한 ARC186(서열 번호 4), ARC187(서열 번호 5) 또는 ARC1905(서열 번호 67)를 제공한다.
다른 구체예에서, 본 발명의 안구 약학 조성물은 본 발명의 보체 매개성 안구 치료 방법에서 사용하기 위한 약학 조성물의 제조에서 사용하기 위한 서열 번호 1 내지 69, 75, 76, 81, 91, 95 및 96으로 구성된 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 항-C5 앱타머의 치료적 유효량을 포함하는 안구 약학 조성물을 제공한다. 이 측면에서, 본 발명은 생체 내에서 C5 보체 단백질 절단을 억제하는 앱타머 또는 이의 염의 치료적 유효량 및 약학적 허용 담체 또는 희석제를 포함하는 약학 조성물을 제공한다.
다른 측면에서, 본 발명은 약학 조성물을 제공한다. 일 구체예에서, ARC187 (서열 번호 5) 또는 ARC1905(서열 번호 67) 또는 이의 염의 치료적 유효량을 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 본 발명의 약학 조성물은 약학적 허용 담체 또는 희석제를 포함할 수 있다. 이 측면에서, 본 발명은 생체 내에서 C5 보체 단백질 절단을 억제하는 앱타머 또는 이의 염의 치료적 유효량 및 약학적 허용 담체 또는 희석제를 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 본 발명의 이 측면에서, 생체 내에서 질환을 치료, 예방 또는 경감하는데 사용하기 위한 ARC187(서열 번호 5) 또는 ARC1905(서열 번호 67) 약학 조성물을 제공한다. 또한, 본 발명의 이 측면에서, 약학 조성물의 제조에 사용하기 위한 ARC187(서열 번호 5) 또는 ARC1905(서열 번호 67)를 제공한다.
본 발명의 다른 측면에서, 치료 방법을 제공한다. 일 구체예에서, 본 발명의 방법은 C5 보체 단백질, 및/또는 이의 유도체 C5a 및 C5b-9에 의해 매개되는 질환을 치료, 예방 또는 경감하는 단계를 포함하고, 이 방법은 포유 동물에게 ARC187(서열 번호 5) 또는 ARC1905(서열 번호 67) 또는 이의 염을 포함하는 약학 조성물을 투여하는 단계를 포함한다. 일 구체예에서, 상기 방법은 포유 동물에게 본 발명의 약학 조성물을 투여하는 단계를 포함한다. 일 구체예에서, 포유 동물은 인간이다.
일 구체예에서, 치료할 C5 보체 단백질, C5a 및/또는 C5b-9 매개성 질환은 급성 허혈성 질환(심근 경색, 졸중, 허혈성/재관류성 손상); 급성 염증성 질환(감염성 질환, 패혈증, 쇼크, 급성/초급성 이식 거부); 만성 염증 및/또는 당뇨병성 망막병증을 비롯한 면역 매개성 질환, 삼출성 및 비삼출성 형태의 AMD를 비롯한 황반 변성증, 및 또한 알레르기, 천식, 류마티스성 관절염 및 기타 류마티스성 질환, 다발성 경화증 및 다른 신경 질환, 건선 및 기타 피부 질환, 중증 근무력증, 전신성 홍반성 낭창; 및 아급성/만성 염증 및/또는 면역 매개 질환(이식 거부, 사구체신염 및 다른 신장 질환 포함) 및 다른 안구 질환이다. 일 구체예에서, 치료할 C5 보체 단백질, C5a 및/또는 C5b-9 매개성 질환은 합성 튜빙 및/또는 외부 물질을 통해서 및/또는 이를 거쳐서 혈액이 통과하는 상황 또는 투석과 관련된 보체 활성화를 포함한다. 일 구체예에서, 치료할 C5 보체 단백질, C5a 및/또는 C5b-9 매개성 질환은 CABG 수술과 관련된 심근 손상, 풍선 혈관 형성술과 관련된 심근 손상 및 재협착과 관련된 심근 손상으로 구성된 군으로부터 선택된다. 일 구체예에서, 치료할 C5 보체 단백질, C5a 및/또는 C5b-9 매개성 질환은 CABG 수술과 관련된 심근 손상, 풍선 혈관 형성술과 관련된 심근 손상, 재협착과 관련된 심근 손상, CABG 수술과 관련된 보체 단백질 매개성 합병증, 경피적 관상 동맥 중재술과 관련된 보체 단백질 매개성 합병증, 발작성 야간 혈색뇨증, 급성 이식 거부증, 초급성 이식 거부증, 아급성 이식 거부증 및 급성 이식 거부증으로 구성된 군으로부터 선택된다. 일 구체예에서, 치료할 C5 보체 단백질, C5a 및/또는 C5b-9 매개성 질환은 CABG 수술과 관련된 합병증이다. 구체예에서, 치료할 질환은 CABG 수술과 관련된 심근 손상이다. 본 발명의 치료 방법의 구체예에서, 경감, 안정화 및/또는 예방할 징후는 안구 질환, 구체적으로 당뇨병성 망막병증, 삼출성 및/또는 비삼출성 AMD이다.
일 구체예에서, 본 발명의 방법은 내재성 C5 보체 단백질보다 약 .5 내지 약 10배로 앱타머 혈장 농도를 달성하도록 ARC187(서열 번호 5) 또는 ARC1905(서열 번호 67)를 포함하는 약학 조성물을 투여하는 단계를 포함한다. 일 구체예에서, 내재성 C5 보체 단백질보다 약 .75 내지 약 5배, .75 내지 약 3배, 및 1.5 내지 약 2배의 앱타머 혈장 농도에 도달하도록 약학 ARC187(서열 번호 5) 또는 ARC1905(서열 번호 67) 앱타머 조성물을 투여하는 반면, 다른 구체예에서는 내재성 보체 단백질과 동일한 농도에 도달하도록 앱타머 조성물을 투여한다. 일 구체예에서, ARC187(서열 번호 5) 또는 ARC1905(서열 번호 67)를 포함하는 본 발명의 약학 조성물을 약 5 uM, 약 4 uM, 약 3 uM, 약 2 uM, 약 1.5 uM, 약 1 uM 또는 약 500 nM의 앱타머 혈장 농도에 도달하도록 투여한다.
본 발명의 앱타머 혈장 농도에 도달하기에 충분한 투여 경로, 기간 및 비율의 임의 조합을 사용할 수 있다. 일 구체예에서, 약학 조성물은 정맥 내로 투여한다. 일 구체예에서, 약학 조성물은 볼러스로서 및/또는 연속 주입을 통해 투여한다.
CABG 수술과 관련된 합병증, 특히 CABG 수술과 관련된 심근 손상을 치료, 예방 및/또는 경감시키는 특정 구체예에서, 본 발명의 방법은 수술전에 약학 조성물을 투여하는 단계 및 적어도 24시간, 일 구체예에서는 약 48시간 또는 일 구체예에서는 약 72시간 연속 투여하는 단계를 포함한다. 본 발명의 일 측면의 특정 구체예에서, 내재성 보체 단백질 농도의 약 2배의 혈장 앱타머 농도는 저용량의 앱타머를 정맥내 주입 전에, 또는 동시에 또는 그 이후에 치료할 환자의 체중 1kg 당 약 .75 내지 1.25, 바람직하게는 약 1 mg의 앱타머의 정맥내 볼러스를 투여하여 얻을 수 있으며, 여기서 mg 용량은 접합된 PEG의 무게를 포함하지 않는다. 일 구체예에서, 저용량은 0.001 내지 0.005 mg/kg/분 범위에서 선택된 비율로 주입할 수 있으며, 여기서 mg은 접합된 PEG의 무게를 포함하지 않는다. 특정 구체예에서, 저용량은 약 0.0013 mg/kg/분의 비율로 주입된다. 본 발명의 이 측면의 다른 구체예에서, 앱타머/접합체는 충분하게 긴 반감기를 포함하고, 앱타머 약학 조성물은 정맥내 볼러스 용량으로서 1일 1회 또는 2회 투여할 수 있다.
본 발명의 다른 측면에서, 진단 방법이 제공된다. 일 구체예에서, 진단 방법은 ARC187(서열 번호 5) 또는 ARC1905(서열 번호 67)를 C5 보체 단백질 또는 이의 변이체를 포함하는 것으로 의심되는 조성물과 접촉시키는 단계, 및 C5 보체 단백질 또는 이의 변이체의 존재 유무를 검출하는 단계를 포함한다. 일 구체예에서, 보체 단백질 또는 변이체는 척추동물, 구체적으로 포유 동물, 보다 바람직하게는 인간이다. 본 발명은 시험관내 또는 생체 내 진단용으로서 사용하기 위한 ARC187(서열 번호 5) 또는 ARC1905(서열 번호 67) 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 측면에서, ARC330(서열 번호 2), ARC188-189, ARC250, ARC296-297, ARC331-334, ARC411-440, ARC457-459, ARC473, ARC522-525, ARC532, ARC543-544, ARC550-554, ARC657-658, ARC672, ARC706, ARC1537 및 ARC1730(서열 번호 6 내지 서열 번호 66)으로 구성된 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 앱타머를 제공한다. 다른 구체예에서, 약학 조성물의 제조에 사용하기 위한 ARC330(서열 번호 2) 및 ARC188-189, ARC250, ARC296-297, ARC331-334, ARC411-440, ARC457-459, ARC473, ARC522-525, ARC532, ARC543-544, ARC550-554, ARC657-658, ARC672, ARC706, ARC1537 및 ARC1730(서열 번호 6 내지 서열 번호 66) 중 어느 하나를 제공한다. 이 측면에서, 본 발명은 생체 내에서 C5 보체 단백질 절단을 억제하는 앱타머 또는 이의 염의 치료적 유효량 및 약학적 허용 담체 또는 희석제를 포함하는 약학 조성물을 제공한다.
특정 구체예에서, 서열 번호 1에 따른 뉴클레오티드 서열을 포함하는 앱타머를 제공한다. 특정 구체예에서, 서열 번호 61, 서열 번호 62 및 서열 번호 64 내지 서열 번호 66으로 구성된 군에서 선택된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 앱타머를 제공한다. 일 구체예에서, 앱타머는 서열 번호 61, 서열 번호 62 및 서열 번호 64 내지 서열 번호 66으로 구성된 군에서 선택된 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 상기 앱타머는 서열 번호 4에 따른 서열로 구성되었지만 PEG 부분은 결여된 앱타머와 C5 보체 단백질에 대해서 실질적으로 동일한 결합 친화성을 포함한다.
일 구체예에서, 앱타머는 서열 번호 61, 서열 번호 62 및 서열 번호 64 내지 서열 번호 66으로 구성된 군에서 선택된 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 이 앱타머는 영장류에서 15시간 이상, 바람직하게는 30시간 이상의 반감기, 바람직하게 이하의 실시예 5E에서 측정한 2구획 모델에서의 말단 반감기를 포함한다. 일 구체예에서, 상기 앱타머는 서열 번호 61, 서열 번호 62 및 서열 번호 64 내지 서열 번호 66으로 구성된 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 이 앱타머는 래트에서 1시간 반 이상, 바람직하게는 7시간 이상의 반감기, 바람직하게는 2구획 모델에서의 말단 반감기를 포함한다.
본 발명의 이 측면의 일 구체예에서, 앱타머는 서열 번호 61, 서열 번호 62 및 서열 번호 64 내지 서열 번호 66으로 구성된 군에서 선택된 뉴클레오티드 서열을 포함하며, 이 앱타머는 다음과 같이 5'링커를 갖게 합성된다:
Figure 112008070002540-pct00005
앱타머3', 여기서 ''''은 링커이다. 일 구체예에서, 링커는 다음과 같은 알킬 링커이다: H2N-(CH2)n-5'앱타머3', 여기서 n = 2∼18, 바람직하게 n = 2∼12, 보다 바람직하게 n = 3∼6, 보다 바람직하게 n = 6이고, 여기서 앱타머 =
fCmGfCfCGfCmGmGfUfCfUfCmAmGmGfCGfCfUmGmAmGfUfCfUmGmAmGfUfUfUAfCfCfUmGfCmG-3T(서열 번호 4)이며, 이때 fC 및 fU = 2'-플루오로 뉴클레오티드, 및 mG 및 mA = 2'-OMe 뉴클레오티드이고 모든 다른 뉴클레오티드는 2'-OH이고 3T는 인버티드 데옥시티미딘이다. 얻어진 아민 변형 앱타머는 10 kDa PEG, 20 kDa PEG, 30 kDa PEG 및 4OkDa 선형 PEG로 구성된 군에서 선택된 PEG 부분에 접합될 수 있다. 일 구체예에서, 서열 번호 1, 서열 번호 2 및 서열 번호 6 내지 서열 번호 66으로 구성된 군, 구체적으로는 서열 번호 61, 서열 번호 62 및 서열 번호 64 내지 서열 번호 66으로 구성된 군에서 선택된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 앱타머 또는 이의 염의 치료적 유효량을 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 본 발명의 약학 조성물은 약학적 허용 담체 또는 희석제를 포함할 수 있다. 본 발명의 이 측면에서, 서열 번호 2 및 서열 번호 6 내지 서열 번호 66으로 구성된 군, 구체적으로 서열 번호 61, 서열 번호 62 및 서열 번호 64 내지 서열 번호 66으로 구성된 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 앱타머를 포함하는 생체 내에서 질환의 치료, 예방 또는 경감에서 사용하기 위한 약학 조성물을 제공한다.
다른 구체예예서, C5 보체 단백질에 의해 매개되는 질환을 치료, 예방 또는 경감시키기 위한 방법을 제공하는데, 이 방법은 앱타머 또는 이의 염을 포함하는 약학 조성물을 척추 동물에게 투여하는 단계를 포함하고, 여기서 앱타머는 서열 번호 2 및 서열 번호 6 내지 서열 번호 66으로 구성된 군, 구체적으로 서열 번호 61, 서열 번호 62 및 서열 번호 64 내지 서열 번호 66으로 구성된 군에서 선택된 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 본 발명의 이 측면의 일 구체예에서, 상기 방법은 본 발명의 약학 조성물을 포유 동물, 바람직하게 인간에서 투여하는 단계를 포함한다.
일 구체예에서, 치료할 C5 보체 단백질, C5a 및/또는 C5b-9 매개성 질환은 급성 허혈성 질환(심근 경색, 졸중, 허혈성/재관류 손상); 급성 염증성 질환(감염성 질환, 패혈증, 쇼크, 급성/초급성 이식 거부); 만성 염증 및/또는 당뇨병성 망막병증을 비롯한 면역 매개성 질환, 삼출성 및 비삼출성 형태의 AMD를 비롯한 황반 변성증, 및 또한 알레르기, 천식, 류마티스성 관절염 및 기타 류마티스성 질환, 다발성 경화증 및 다른 신경 질환, 건선 및 기타 피부 질환, 중증 근무력증, 전신성 홍반성 낭창(SLE); 및 아급성/만성 염증 및/또는 면역 매개 질환(이식 거부, 사구체신염 및 다른 신장 질환 포함) 및 다른 안구 질환이다. 일 구체예에서, 치료할 C5 보체 단백질, C5a 및/또는 C5b-9 매개성 질환은 합성 튜빙 및/또는 외부 물질을 통해서 및/또는 이를 거쳐서 혈액이 통과하게 되는 상황 또는 투석과 관련된 보체 활성화를 포함한다. 일 구체예에서, 치료할 C5 보체 단백질, C5a 및/또는 C5b-9 매개성 질환은 CABG 수술과 관련된 심근 손상, 풍선 혈관 형성술과 관련된 심근 손상 및 재협착과 관련된 심근 손상으로 구성된 군에서 선택된다. 일 구체예에서, 치료할 C5 보체 단백질, C5a 및/또는 C5b-9 매개성 질환은 CABG 수술과 관련된 심근 손상, 풍선 혈관 형성술과 관련된 심근 손상, 재협착과 관련된 심근 손상, CABG 수술과 관련된 보체 단백질 매개성 합병증, 경피적 관상 동맥 중재술과 관련된 보체 단백질 매개성 합병증, 발작성 야간 혈색뇨증, 급성 이식 거부증, 초급성 이식 거부증, 아급석 이식 거부증 및 급성 이식 거부증으로 구성된 군으로부터 선택된다. 일 구체예에서, 치료할 C5 보체 단백질, C5a 및/또는 C5b-9 매개성 질환은 CABG 수술과 관련된 합병증이다. 구체예에서, 치료할 질환은 CABG 수술과 관련된 심근 손상이다. 본 발명의 치료 방법의 구체예에서, 경감, 안정화 및/또는 예방할 징후는 안구 질환, 구체적으로 당뇨병성 망막병증, 삼출성 및/또는 비삼출성 AMD이다.
일 구체예에서, 본 발명의 방법은 서열 번호 2 및 서열 번호 6 내지 서열 번호 66으로 구성된 군, 구체적으로 서열 번호 61, 서열 번호 62 및 서열 번호 64 내지 서열 번호 66으로 구성된 군에서 선택된 뉴클레오티드 서열을 갖는 앱타머를 포함하는 약학 조성물을 내재성 C5 보체 단백질의 약 .5 내지 약 10배의 앱타머 혈장 농도에 도달하도록 환자에게 투여하는 단계를 포함한다. 일 구체예에서, 약학 앱타머 조성물은 내재성 C5 보체 단백질의 약 .75 내지 약 5배, .75 내지 약 3배, 및 1.5 내지 약 2배의 앱타머 혈장 농도에 도달하도록 투여하는 한편, 다른 구체예에서 앱타머 조성물은 내재성 보체 단백질과 동일한 농도에 도달하도록 투여한다. 일 구체예에서, 본 발명의 약학 조성물은 약 5 uM, 약 4 uM, 약 3 uM, 약 2 uM, 약 1.5 uM, 약 1 uM 또는 약 500 mM의 앱타머 혈장 농도에 도달하도록 투여된다.
본 발명의 앱타머 혈장 농도에 도달하기에 충분한 투여 경로, 기간 및 비율의 임의 조합을 사용할 수 있다. 일 구체예에서, 약학 조성물은 정맥 내로 투여된다. 일 구체예에서, 약학 조성물은 볼러스로서 및/또는 연속 주입을 통해서 투여된다.
CABG 수술과 관련된 합병증, 구체적으로 CABG 수술과 관련된 심근 손상을 치료, 예방 및/또는 경감시키기 위한 방법의 일 구체예에서, 본 발명의 방법은 수술전에 약학 조성물을 투여하는 단계, 24시간 이상, 일 구체예에서는 약 48시간 또는 일 구체예에서 약 72시간 연속 투여하는 단계를 포함한다. 본 발명의 이 측면의 특정 구체예에서, 저용량의 앱탸머의 정맥내 주입 전, 이와 동시 또는 이후에 치료할 환자에게 정맥내 볼러스를 투여하여 바람직한 앱타머 혈장 농도, 예를 들어 일 구체예에서는 내재성 보체 단백질 농도의 2배에 도달하게 한다. 본 발명의 이 측면의 다른 구체예에서, 앱타머/접합체는 충분하게 긴 반감기를 포함하고, 앱타머 약학 조성물은 정맥내 볼러스 용량으로서 하루에 1회 또는 2회 투여할 수 있다.
본 발명의 다른 측면에서는 진단 방법을 제공한다. 일 구체예에서, 진단 방법은 서열 번호 2 및 서열 번호 6 내지 서열 번호 66으로 구성된 군, 구체적으로 서열 번호 61, 서열 번호 62 및 서열 번호 64 내지 서열 번호 66으로 구성된 군에서 선택된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 앱타머와 조성물을 접촉시키는 단계 및 이 조성물 내 C5 보체 단백질 또는 이의 변이체의 존재 유무를 검출하는 단계를 포함한다. 일 구체예에서, 보체 단백질 또는 이의 변이체는 척추 동물, 구체적으로 포유 동물이고, 보다 구체적으로는 인간이다. 본 발명은 시험관 내 또는 생체 내 진단용으로서 사용하기 위한 서열 번호 2 및 서열 번호 6 내지 서열 번호 66으로 구성된 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 앱타머를 갖는 앱타머 조성물을 제공한다. 본 발명에서는 약학 조성물의 제조에 사용하기 위한 서열 번호 2 및 서열 번호 6 내지 서열 번호 66으로 구성된 군에서 선택된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 앱타머를 제공한다.
본 발명의 다른 측면에서, 서열 번호 75 내지 81, 서열 번호 83 및 서열 번호 88 내지 98로 구성된 군에서 선택된 서열 중 어느 하나와 동일성이 80%인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 앱타머를 제공한다. 일 구체예에서, 서열 번호 75 내지 81 및 서열 번호 88 내지 98로 구성된 군에서 선택된 서열 중 어느 하나의 고유 영역과 동일성이 80%인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 앱타머를 제공한다. 다른 구체예에서, 서열 번호 75 내지 81, 서열 번호 83 및 서열 번호 88 내지 98로 구성된 군에서 선택된 서열 중 어느 하나와 동일성이 90%인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 앱타머를 제공한다. 특정 구체예에서, 서열 번호 75 내지 81 및 서열 번호 88 내지 98로 구성된 군에서 선택된 서열 중 어느 하나의 고유 영역과 동일성이 90%인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 앱타머를 제공한다. 다른 구체예에서, 서열 번호 75 내지 81 및 서열 번호 88 내지 98로 구성된 군에서 선택된 서열 중 어느 하나에 포함된 40개의 인접한 뉴클레오티드와 동일한 40개의 인접한 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 앱타머를 제공한다. 다른 구체예에서, 서열 번호 75 내지 81, 서열 번호 83 및 서열 번호 88 내지 98로 구성된 군에서 선택된 서열 중 어느 하나에 포함된 30개의 인접한 뉴클레오티드와 동일한 30개의 인접한 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 앱타머를 제공한다. 다른 구체예에서, 서열 번호 75 내지 81, 서열 번호 83 및 서열 번호 88 내지 98로 구성된 군에서 선택된 서열 중 어느 하나에 포함된 10개의 인접한 뉴클레오티드와 동일한 10개의 인접한 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 C5 보체 단백질에 특이적으로 결합하는 앱타머를 제공한다. 바람직한 구체예에서, 서열 번호 75 내지 81, 서열 번호 83 및 서열 번호 88 내지 98로 구성된 군에서 선택된 뉴클레오티드 서열 중 어느 하나에 따른 뉴클레오티드 서열을 포함하는 앱타머를 제공한다.
일 구체예에서, 상기 기술한 본 발명의 앱타머는 당 위치에서 화학 치환, 포스페이트 위치에서 화학 치환 및 핵산 서열의 염기 위치에서 화학 치환으로 구성된 군에서 선택된 화학 변형을 추가로 포함할 수 있다. 일 구체예에서, 변형은 변형 뉴클레오티드의 도입, 3' 캡핑, 고분자량, 비면역원성 화합물과의 접합, 친지성 화합물과의 접합 및 포스페이트 골격의 변형으로 구성된 군에서 선택된다.
본 발명의 이 측면의 바람직한 구체예에서, 앱타머는 C5 보체 단백질 또는 이의 변이체의 기능을 조정한다. 구체적으로 바람직한 구체예에서, 앱타머는 바람직하게 생체 내에서, 보다 바람직하게는 인간의 생체 내에서 C5 보체 단백질 또는 이의 변이체의 기능을 억제한다. 본 발명의 이 측면의 일 구체예에서, 앱타머에 의해서 조정, 바람직하게 억제되는 기능은 C5 보체 단백질 절단이다.
다른 측면의 일 구체예에서, 본 발명은 C5 보체 단백질의 생체 내 절단을 차단하는 앱타머 또는 이의 염의 치료적 유효량 및 약학적 허용 담체 또는 희석제를 포함하는 약학 조성물을 제공한다.
일 구체예에서, 서열 번호 75 내지 81, 서열 번호 83 및 서열 번호 88 내지 98로 구성된 군에서 선택된 뉴클레오티드 서열과 동일성이 80%, 바람직하게는 90%인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 앱타머 또는 이의 염의 치료적 유효량을 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 일 구체예에서, 서열 번호 75 내지 81, 서열 번호 83 및 서열 번호 88 내지 98로 구성된 군에서 선택된 뉴클레오티드 서열의 고유 영역에 동일성이 80%, 바람직하게는 90%인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 앱타머 또는 이의 염의 치료적 유효량을 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 다른 구체예에서, 서열 번호 75 내지 81, 서열 번호 83 및 서열 번호 88 내지 98로 구성된 군에서 선택된 뉴클레오티드 서열에 대해 각각 40, 30 또는 10 뉴클레오티드에 대해 동일한 40, 30 또는 10개의 인접한 뉴클레오티드를 갖는 앱타머의 치료적 유효량을 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 본 발명의 약학 조성물은 약학적 허용 담체 또는 희석제를 포함할 수 있다. 본 발명의 이 측면에서, 생체 내에서 질환의 치료, 예방 또는 경감에 사용하기 위한 약학 조성물을 제공하며, 이 약학 조성물은 서열 번호 3 내지 4, 서열 번호 75 내지 81, 서열 번호 83 및 서열 번호 88 내지 98로 구성된 군에서 선택된 뉴클레오티드 서열을 갖는 앱타머 또는 이의 염을 포함한다. 이 측면에서, 약학 조성물의 제조에 사용하기 위한 서열 번호 3 내지 4, 서열 번호 75 내지 81, 서열 번호 83 및 서열 번호 88 내지 98로 구성된 군에서 선택된 뉴클레오티드 서열을 갖는 앱타머를 제공한다. 이 측면에서, 본 발명은 생체 내에서 C5 보체 단백질 절단을 억제하는 앱타머 또는 이의 염의 치료적 유효량 및 약학적 허용 담체 또는 희석제를 포함하는 약학 조성물을 제공한다.
일 구체예에서, 치료할 C5 보체 단백질, C5a 및/또는 C5b-9 매개성 질환은 급성 허혈성 질환(심근 경색, 졸중, 허혈성/재관류 손상); 급성 염증성 질환(감염성 질환, 패혈증, 쇼크, 급성/초급성 이식 거부); 만성 염증 및/또는 당뇨병성 망막병증을 비롯한 면역 매개성 질환, 삼출성 및 비삼출성 형태의 AMD를 비롯한 황반 변성증, 및 또한 알레르기, 천식, 류마티스성 관절염 및 기타 류마티스성 질환, 다발성 경화증 및 다른 신경성 질환, 건선 및 기타 피부 질환, 중증 근무력증, 전신성 홍반성 낭창(SLE); 및 아급성/만성 이식 거부, 사구체신염 및 다른 신장 질환 및 다른 안구 질환이다. 일 구체예에서, 치료할 C5 보체 단백질, C5a 및/또는 C5b-9 매개성 질환은 합성 튜빙 및/또는 외부 물질을 통해서 및/또는 이를 거쳐서 혈액이 통과하게 되는 상황 또는 투석과 관련된 보체 활성화를 포함한다. 일 구체예에서, 치료할 C5 보체 단백질, C5a 및/또는 C5b-9 매개성 질환은 CABG 수술과 관련된 심근 손상, 풍선 혈관 형성술과 관련된 심근 손상 및 재협착과 관련된 심근 손상으로 구성된 군에서 선택된다. 일 구체예에서, 치료할 C5 보체 단백질, C5a 및/또는 C5b-9 매개성 질환은 CABG 수술과 관련된 심근 손상, 풍선 혈관 형성술과 관련된 심근 손상, 재협착과 관련된 심근 손상, CABG 수술과 관련된 보체 단백질 매개성 합병증, 경피적 관상 동맥 중재술과 관련된 보체 단백질 매개성 합병증, 발작성 야간 혈색뇨증, 급성 이식 거부증, 초급성 이식 거부증, 아급성 이식 거부증 및 급성 이식 거부증으로 구성된 군으로부터 선택된다. 일 구체예에서, 치료할 C5 보체 단백질, C5a 및/또는 C5b-9 매개성 질환은 CABG 수술과 관련된 합병증이다. 구체예에서, 치료할 질환은 CABG 수술과 관련된 심근 손상이다. 본 발명의 치료 방법의 구체예에서, 경감, 안정화 및/또는 예방할 징후는 안구 질환, 구체적으로 당뇨병성 망막병증, 삼출성 및/또는 비삼출성 AMD이다.
일 구체예에서, 본 발명의 방법은 서열 번호 3 내지 4, 서열 번호 75 내지 서열 번호 81, 서열 번호 83 및 서열 번호 88 내지 98로 구성된 군에서 선택된 뉴클레오티드 서열을 갖는 앱타머를 포함하는 약학 조성물을 내재성 C5 보체 단백질의 약 .5 내지 약 10배의 앱타머 혈장 농도에 도달하도록 환자에게 투여하는 단계를 포함한다. 일 구체예에서, 약학 앱타머 조성물은 내재성 C5 보체 단백질의 약 .75 내지 약 5배, .75 내지 약 3배, 및 1.5 내지 약 2배의 앱타머 혈장 농도에 도달하도록 투여하는 한편, 다른 구체예에서 앱타머 조성물은 내재성 보체 단백질과 동일한 농도에 도달하도록 투여된다. 일 구체예에서, 본 발명의 약학 조성물은 약 5 uM, 약 4 uM, 약 3 uM, 약 2 uM, 약 1.5 uM, 약 1 uM 또는 약 500 nM의 앱타머 혈장 농도에 도달하도록 투여된다.
본 발명의 앱타머 혈장 농도에 도달하기에 충분한 투여 경로, 기간 및 비율의 임의 조합을 사용할 수 있다. 일 구체예에서, 약학 조성물은 정맥 내로 투여된다. 일 구체예에서, 약학 조성물은 볼러스로서 및/또는 연속 주입을 통해서 투여된다.
CABG 수술과 관련된 합병증, 구체적으로 CABG 수술과 관련된 심근 손상을 치료, 예방 및/또는 경감시키기 위한 방법의 일 구체예에서, 본 발명의 방법은 수술전에 약학 조성물을 투여하는 단계, 24시간 이상, 일 구체예에서는 약 48시간 또는 일 구체예에서 약 72시간 연속 투여하는 단계를 포함한다. 본 발명의 이 측면의 특정 구체예에서, 저용량의 앱타머의 정맥내 주입 전, 이와 동시 또는 이후에 치료할 환자에게 정맥내 볼러스를 투여하여 바람직한 앱타머 혈장 농도, 예를 들어 일 구체예에서는 내재성 보체 단백질 농도의 2배에 도달하게 한다. 본 발명의 이 측면의 다른 구체예에서, 앱타머/접합체는 충분하게 긴 반감기를 포함하고, 앱타머 약학 조성물은 정맥내 볼러스 용량으로서 하루에 1회 또는 2회 투여할 수 있다.
다른 구체예에서, 진단 방법을 제공하며, 이 방법은 C5 보체 단백질 또는 이의 변이체를 포함하는 것으로 의심되는 조성물과 서열 번호 75 내지 81, 서열 번호 83 및 서열 번호 88 내지 98로 구성된 군에서 선택된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 앱타머를 접촉시키는 단계 및 C5 보체 단백질 또는 이의 변이체의 존재 유무를 검출하는 단계를 포함한다. 일 구체예에서, 보체 단백질 또는 변이체는 척추 동물, 구체적으로 포유 동물, 보다 구체적으로는 인간이다. 본 발명은 시험관 내 또는 생체 내 진단용으로서 사용하기 위한 서열 번호 75 내지 81, 서열 번호 83 및 서열 번호 88 내지 98로 구성된 군에서 선택된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 앱타머를 갖는 앱타머 조성물을 제공하다.
일 구체예에서, 서열 번호 68 및 서열 번호 69로 구성된 군에서 선택된 뉴틀레오티드 서열로 본질적으로 구성된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 앱타머를 제공한다. 일 구체예에서, 서열 번호 68 및 69로 구성된 군에서 선택된 뉴클레오티드로 구성된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 앱타머를 제공한다. 본 발명의 일 측면의 일 구체예에서, 앱타머는 진단 방법에 사용할 수 있다.
일 구체예에서, 본 발명의 방법은 보체 매개성 안구 질환을 치료, 안정화 및/또는 예방하는 것이고, 이 방법은 이러한 치료, 안정화 및/또는 예방이 필요한 개체에게 항-보체 앱타머의 치료적 유효량을 투여하는 단계를 포함한다. 일 구체예에서, 치료되는 안구 질환은 황반 변성증이다. 일 구체예에서, 치료할 안구 질환은 안구 신혈관생성 질환이다.
-본 발명의 상세한 설명-
본 발명의 하나 이상의 구체적인 설명을 이하 첨부된 도면을 참조하여 설명한다. 여기서 기술한 바와 동일하거나 유사한 임의 방법 및 물질을 본 발명의 시험 또는 실시에서 사용할 수 있지만, 바람직한 방법 및 물질을 이하 기술한다. 본 발명의 다른 특징, 목적 및 장점은 이러한 설명으로부터 자명하게 될 것이다. 명세서에서, 단수형은 또한 달리 분명하게 언급하지 않으면 복수형도 포함한다. 달리 정의하지 않으면 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속한 분야의 당업자에게 공통적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 분쟁의 경우, 본 명세서를 조정하게 된다.
항-C5 제제 및 안구 질환
최근 결과에 의하면 나이 관련 황반 변성증(AMD)은 또한 보체 활성화가 역할을 하는 염증 매개성 질환이다. 나이 관련 황반 변성증("AMD")은 만성 및 진행성 안구 질환이고 미국, 유럽 및 일본 등에서 회복불가능한 시력 상실의 주된 원인이다. AMD는 망막황반이라고하는 망막의 중심부에서 진행성 악화로서 특징된다. AMD로 발전되는 것에 대한 가장 분명한 징후는 망막하의 백황색 침착물인 드루센의 출현인데, 이는 망막 세포의 대사 폐생성물에서 유래된 물질의 플라크이다. 드루센의 출현은 삼출성("습성") 및 비삼출성("건성")의 두 AMD 형태의 중요한 성분이다. 습성 AMD는 망막 바로 아래에서 성장하는 신규한 혈관이 브루크(bruch) 막이라고 알려진 막을 통해서 망막층으로 침입할 때 발생한다. 이러한 비정상적인 혈관 성장은 일반적으로 혈관신생 또는 (맥락막) 신혈관생성이라고 한다. 이들 신규 혈관은 약해지기 쉬워서 종종 망막황반으로 출혈 및 유체를 누수시키는 경향이 있어서, 때때로 급작스럽게 심각한 시력 상실을 야기하게 된다. 신규 치료법(예를 들어, Lucentis™)이 혈관신생을 정지시킬 수 있고 유체 축적을 반전시킬 수 있고, 소수의 환자에서 시력을 회복시킬 수 있을 지라도, 신규혈관 병변은 종종 망막 세포에 손상 및/또는 반흔화를 초래하여 영구적인 시력 상실을 야기하기 된다. 습성 AMD는 대체로 보체 인자 H(CFH)를 포함하는 보체 단백질을 포함하고 축적되는 드루센의 성장이 선행된다. 중간 크기에서 거대 크기의 다양한 드루센의 존재는 지도형 위축증 및/또는 신혈관생성으로 특징되는 말기 질환으로 발전되는 가장 높은 위험성과 연관된다. 습성 AMD를 갖는 환자의 대다수는, 비록 시력 상실이 수시간 또는 수일 이내에 일어날 수 있지만, 질환으로 진단받은 후 수개월 내지 2년 이내에 영향받은 눈에 심각한 시력 상실을 경험하게 된다. 건성 AMD는 보다 점진적이고, 망막황반의 감광 세포가 서서히 위축성이되고, 영향받은 안구에서 중심 시력이 점차 흐려질때 발생한다. 시력 상실은, 비록 비정상적인 혈관 성장 및 출혈이 없더라도, 드루센의 형성 및 축적에 의해서, 그리고 때로 망막의 쇠약으로 인해 악화된다.
AMD 관련 시력 상실을 야기하는 병변에서 관찰되는 염증 세포 및 드루센 내 보체 성분 및 기타 매개인자가 존재한다(Haines 외, (2005) Science 308: 419-421). AMD는 보체 조절 경로의 유전적 결합과 강하게 연관되어 있다(Haines 외, 2005). 보체 인자 H(CFH)를 코딩하는 유전자 내 변이는 신혈관생성에 대한 전구체인 드루센의 성장에 대한 영향을 통해서 전적으로 또는 대부분 AMD 위험성을 증가시키고 AMD와 연관된 시력 상실에 관여하는 것으로 보인다(Edwards 외, (2005) Science 308:421-424). CFH의 주요 기능은 C3b에 결합하여 불활성화시키거나 또는 C3b로부터 인자 Bb의 해리를 촉진하여 대체 캐스캐이드 전환효소의 활성을 하향 조절하는 것이다(Hageman 외 (2005) PNAS 102(2):7227-7232). 최근의 유전적 데이타에 의하면 습성 AMD 유형을 지닌 사람은 CFH 대립 유전자를 보유할 가능성이 50-70%이고 그 결과 보체 중재와 AMD 치료간에 상관관계가 매우 예측가능하고 높다(Klein 외, (2005) Science 308: 385-389). 그 활성화를 차단하는 항-C5 앱타머는 환자가 AMD와 연관된 결함성 CFH 유전자를 보유하더라도, 그 기능을 하게된다. 유사하게, 대체 캐스캐이드 표적 예컨대 인자 B, 인자 D 및 프로페르딘, 공통 캐스캐이드 성분, 특히 C3 및 막공격 복합체 성분 등의 활성을 억제하는 앱타머는 환자가 AMD와 연관된 결함성 CFH 유전자를 보유하더라도 활성을 억제하게 된다. 보체 인자 H(CFH)의 몇몇 단상형이 황반 변성증(AMD)로 발전할 위험성과 연관된다는 것을 확증하였다. 구체적으로, 염색체 1 상의 보체 인자 H(CFH)에서 아미노산 402에 티로신-히스티딘 변화로 인해서 이병성과 강하게 관련된 CFH 유전자 변이체의 형성을 초래한다. 서열 변화는 헤파린 및 C 반응성 단백질에 결합하는 CFH 영역에 존재한다. 유전적 구성에 CFH 유전자의 변이를 포함하는 사람들은 AMD가 발병하기 보다 쉽다. CFH 유전자 변이는 미국 내 황반 변성증의 15백만 사례 중 절반에 대한 원인이다. 진행성 황반 변성증의 나머지는 CFH 유전자 변이를 갖게되면 약 2.5 내지 5.5 배만큼 증가한다.
CFH 유전자는 염증 경로(대체 보체 경로)를 조절하는데 관여한다. 이는 염증이 황반 변성증으로의 발전에서 상당히 중요한 역할을 한다는 것을 의미한다. 염증성 마커 C 반응성 단백질(CRP)의 혈중 농도도 황반 변성증에서는 상승한다는 것이 밝혀졌다(Science. 2005 Apr 15;308(5720):419-21, Science. 2005 Apr 15;308(5720):421-4, Science. 2005 Apr 15;308(5720):385-9). 인자 H의 헤파린 및 CRP 결합 영역에서 이의 위치에 기초하여, Y402H 변이는 숙주 세포 표면으로의 프로테오글리칸 및 인자 H의 CRP 매개 동원을 파괴하여, 이 세포 상에 축적된 C3b를 하향 조절하도록 인자 H의 능력을 방해한다. 억제되지 않은, 숙주 조직 내 보체 경로의 증폭은 C5a 및 C5b-9의 비제어적인 방출로 인한 주변 혈관 및 망막에 염증을 초래한다. CFH는 비제어적인 보체 활성화 및 염증을 방지하므로, CFH의 돌연변이는 염증 및 이의 영향이 증가된다. 황반 변성증에서 발생하는 과도한 보체(염증 경로) 활성화를 감소시켜서, 우리는 이 질환의 발전을 완화시킬 수 있을 것이다. 또한, 유전자 변이의 검출은 언젠가 영상화 기술과 병용되어서 가능한 현재보다 조기에 중증 AMD로 발전할 높을 위험성에 있는 개체를 확인할 수 있다(JAMA. 2005 Apr 20;293(15):18410).
보체 활성화는 또한 다른 안구 질환 예컨대 당뇨병성 망막병증에 관여하며, 망막 혈관 손상을 개시하거나 악화시킨다(Zhang 외, (2002) Diabetes 51:3499). 증식성 망막병증(PDR)은 망막 혈관에서의 변화로 야기되는 당뇨병 합병증이다. 망막 혈관이 손상되면, 이들은 혈액을 누수시키고 약한, 브러쉬 유사 분지 및 반흔 조직을 성장시키게 된다. 이는 망막이 뇌에 보내는 시상을 흐리게하거나 뒤틀리게 한다. 당뇨병의 25%가 당뇨병성 망막병증을 앓고있고 I형 당뇨병을 갖고 5년 후에는 발병률이 60%로 증가하고 10 내지 15년 후에는 80%로 증가하는 것으로 추정된다. 이 질환은 출혈 및 견인성 망막 박리를 통해서 실명을 초래할 수 있는 망막전 신혈관생성, 미세동맥류, 주변세포 손실, 기저막 비후화, 고혈당증으로 특징된다. 비증식성 당뇨병성 망막병증은 망막내 미세동맥류, 출혈, 신경섬유층 경색, 경성 삼출물 및 미세혈관 이상증으로 특징된다. 망막황반 부종은 시력 상실의 주요 기전이다. 이는 망막황반(망막의 중심부) 모세혈관 내 미세동맥류로부터의 혈관 누수에 의해 야기된다. 누수는 경성 삼출물 또는 유낭포 변화와 관련된 망막황반 비후화를 진행시킬 수 있고 이는 종종 다양한 정도로 중심 시력 상실을 일으킨다. 증식성 당뇨병성 망막병증은 망막 신혈관생성으로 특징된다. 망막 신혈관생성의 존재, 위치, 중증도 및 출혈 활성에 따라서 분류된다. 이는 심각한 시력 상실과 관련된다. 당뇨병성 망막병증의 병상은 후속되는 질병 상태에 의한 것일 수 있다. 순환 문제는 망막 영역이 산소 고갈 또는 허혈성이 되게한다. 신혈관생성은 적절한 산소 수준을 유지하기 위해 유리체 내에서 새로운 혈관이 성장을 시작하도록 야기한다. 새롭게 형성된 모세혈관으로부터의 혈액 누수 및 반흔 조직의 형성으로 망막상에 견인력이 생성되어 작은 열상을 초래한다. 열상으로 망막층사이 또는 그 아래에 유체가 축적되어 박리가 일어난다. 환자는 흐릿한 시력, 비문증, 섬광 및 출혈에 의한 급격한 시력 상실, 부종 및 반흔 조직 형성을 경험하게 된다.
저농도의 구성성 보체 활성화는 보통 비당뇨병성 안구에서 일어나는데, 비당뇨병성 래트의 안구에서 보체 조절 단백질 및 MAC의 존재로 증명되었고, 이는 보체 조절이상이 당뇨병 환자에게 일어난다는 것을 의미한다(Sohn 외, (2000) IOVS 41:3492). 또한, 당뇨병 인간 공여자의 망막 혈관에서는 C5b-9 침착이 검출되었고, 비당뇨병 인간 공여자에서는 존재하지 않았으며(Zhang 외), CD55 및 CD59의 발현 저하가 당뇨병성 망막에서 확인되었고(Zhang 외), 비효소적 당화(glycated) CD59가 당뇨병 환자의 소변에 존재하였지만 당뇨병이 아닌 환자에서는 존재하지 않았다(Acosta 외, (2002) PNAS 97, 5450-5455). 또한, 보체 및 혈관계는 I형 당뇨병에서 활성화되는 것으로 알려졌다. 예를 들어, 문헌 [Hansen, T.K. 외, Diabetes, 53: 1570-1576 (2004)]을 참조한다. C5a는 면역계 및 보체계와 상호작용을 통해서 내피 세포를 활성화시킨다. 예를 들어, 문헌 [Albrecht, E. A. 외, Am J Pathology, 164: 849-859 (2004)]을 참조한다. 혈관계는 당뇨병성 망막병증을 포함하는 안구 질환에서 활성화된다. 이는 예를 들어, 문헌 [Gert, V.B. 외, Invest Opthalmol Vis Sci, 43: 1104-1108 (2002)]을 참조한다. 보체계도 당뇨병성 망막병증에서 활성화된다. 예를 들어, 문헌 [Gert, V.B. 외, Invest Opthalmol Vis Sci, 43: 1104-1108 (2002)] 및 [Badouin, C 외, Am J Opthalmol, 105:383-388 (1988)]을 참조한다.
포도막염은 홍체, 모양체 및 맥락막(망막을 감싸서 보호하는 혈관 및 결합 조직층)으로 구성되고, 공막(섬유막) 및 망막(시력을 책임지는 감광성층) 사이에 위치하는 색소형성된 혈관층(또는 외막)인 포도막의 염증을 의미한다. 포도막의 복잡한 해부학적 구조로 인해, 여러 상이한 유형의 포도막이 존재하고, 다른 안구 구조(예를 들어, 망막)화 포도막의 해부학적 상관성으로 인해, 포도막염은 다른 조직의 염증을 종종 수반한다. 포도막염은 일반적으로 전방 포도막염(주로 홍체 및 관련 모양체에 영향을 주어서, 홍채와 각막 사이의 전실 및 수용된 투명한 수양액에 영향을 줌), 중간 포도막염(모양체의 직후 및 망막의 앞쪽 "엣지"의 편평부에 영향을 줌), 또는 후방 포도막염(망막과 직접 접촉하고 투명한 젤라틴성 유리체액으로 채워진, 홍채 뒤의 후실에 영향을 줌)으로 분류된다. 포도막염은 포도막의 임의 부분 또는 전체 부분을 포함할 수 있다(예를 들어, 맥락막염, 홍채염 등). 전방 포도막염은 가장 일반적인 형태이고 대체로 자가면역 질환 예컨대 류마티스성 관절염과 관련된다. 중간 포도막염은 두번째로 일반적인 형태이다. 후방 포도막염은 가장 드문 형태인데, 전신 감염(예를 들어, 바이러스, 박테리아 진균 또는 기생충성 감염 등) 이후에 발생할 수 있고 또는 자가면역 질환과 관련될 수 있다. 자가면역성 포도막염은 또한 전신성 연루없이 일어날 수도 있다. 포도막염은 또한 외상성 장애(예를 들어, 손상, 수술 등)에 의해서 또는 미지의 이유("특발성")로 인해 발생할 수 있다. 병인과 무관하게, 포도막에 영향을 주는 임의 염증성 병태도 역시 포도막염을 일으키게 된다.
안구 조직 및 유체는 정상적으로 많은 보체 성분, 예컨대 포도막 조직에서 인자 B 및 C2, C4, C3, C5, C6 및 C7(Brawman-Mintzer O, Invest Ophthalmol Vis Sci. 1989 Oct;30(10):2240-4), 수양액 내 C1, C4, C3 및 C5(Mondino BJ, Arch Ophthalmol. 1983 Mar;101(3):465-8), 및 각막 내 C1, C4, C2, C3, C5, C6 및 C7(Mondino BJ, Arch Ophthalmol. 1981 Aug;99(8): 1430-3) 등이 포함되어 있다. 이러한 보체 성분 및 관련 보체 조절 단백질은 안구 조직 내에서 정상적인 면역 감독에 중요한 것으로 여겨진다.
포도막염의 병인에서 보체의 활성화에 대한 중요한 역할은 망막 맥관염을 갖는 (대조군) 환자와 비교하여 전방 포도막염을 갖는 환자의 C4(C4B2) 알로타입의 발생 증가(Wakefield D, Hum Immunol. 1988 Apr;21(4):233-7.); 특발성 포도막염을 갖는 환자에서 혈장 C3d 및 보체 함유 면역 복합체 증가(Vergani S, Br J Ophthalmol. 1986 Jan;70(l):60-3); 전신성 염증 질환 및 동시발생 포도막염을 갖는 환자에서 누액(눈물)에 C3 및 C4 수준 및 보체 매개성 용혈 활성 증가(Drozdova EA, Vestn Oftalmol. 2004 Jul-Aug;120(4):24-6); 및 초기 이벤트로서 포도막염에서 포도막에 면역 복합체와 보체의 침착(O'Connor GR, Trans Ophthalmol Soc U K. 1981 Sep;101 (Pt 3)(3):297-300)으로 확인되었다. 보체 활성화는 베체트병(Cuchacovich M, Clin Exp Rheumatol.2005 Jul-Aug;23(4 Suppl 38):S27-34, Bardak Y, Ocul Immunol Inflamm. 2004 Mar;12(l):53-8), 푸크스 홍채 이색섬모체염(La Hey E, Am J Ophthalmol. 1992 Jan 15;113(l):75-80), 보그트-고야나기-하라다병(Sakamoto T, Arch Ophthalmol. 1991 Sep; 109(9): 1270-4) 및 망막하 섬유증 및 만성 포도막염(Palestine AG, Ophthalmology. 1985 Jun;92(6):838-44)을 비롯한 포도막염 안구 성분을 갖는 다수의 염증성 및/또는 자가면역 질환에 관여한다.
실험적으로 유도시킨 포도막염의 다양한 동물 모델을 통해서 보체 활성화가 포도막염의 병인에서 중요하다는 것이 증명되었고(Jha P, Invest Ophthalmol Vis Sci.2006 Mar;47(3):1030-8, Kasp E, Clin Exp Immunol. 1992 May;88(2):307-12), 보체 활성화가 보체 조절 단백질에 의해 강력하게 조절된다는 것이 증명되었다(Bardenstein DS, Immunology.2001 Dec;104(4):423-30, Sohn JH, Invest Ophthalmol Vis Sci. 2000 Oct;41(ll):3492-502). 이러한 보체 매개성 포도막염의 모델에서, 예를 들어 보체 활성화 경로의 중요 성분(C3)의 유전적 고갈 또는 코브라 독성 인자(CVF)를 이용한 치료 등에 의한 보체 고갈에 의해서 유도된 포도막염의 중증도를 상당히 감소되거나 예방된다.
종합적으로, 데이타는 보체 성분 및 조절 단백질이 안구 조직, 구체적으로 포도막의 중요한 정상 성분이고, 보체 활성화는 자가면역 포도막염의 실험 모델에서 포도막염의 원인이며, 보체 활성화는 인간에서 포도막염과 연관된다는 것을 의미한다. 따라서, 일 구체예에서, C5의 활성화 전 및 C5a 및 C5b-9(MAC)의 생성 이후에 대체 및 고전 보체 활성화 경로를 중지시키는 앱타머를 포도막염의 중증성, 발병 및/또는 지속 기간을 줄이기 위한 본 발명의 방법에서 사용하기 위해 제공된다.
녹내장은 일반적으로 안압("IOP") 증가와 관련되어 있고, 시신경 및 망막 손상에 의해 시력 상실이 일어나는 질환군을 의미한다. 원발성 개방우각 녹내장은 가장 일반적인 형태로서, 시간이 경과함에 따라 유체 배출 채널(즉, 소주 네트워크)의 점차적인 협소화 또는 차단하여서 수양액의 축적으로 인해 IOP 증가하여 야기된다. 녹내장은 개방우각 및 협각형의 두 종류로 분류된다. 원발성 개방우각 녹내장은 서서히 진행하고 고통이 없으며 종종 수년동안 시력 상실을 인지하지 못한다. 속발성 개방우각 녹내장은 다른 질환(예를 들어, 포도막염 또는 다른 염증성 질환, 당뇨병, 종양, 백내장 등), 둔상(blunt injury) 또는 일정 약물 예컨대 스테로이드 등에 의해 일어난다. 폐쇄각 녹내장(또한 협우각 녹내장 또는 급성 녹내장이라고 함)은 홍채 위치의 전위로 수양액 배출이 갑자기 차단되고, IOP가 급하게 증가하여 야기된다. 시력 상실이외에도 폐쇄각 녹내장의 징후는 안구 동통 및 매스꺼움 등이 포함된다. 신경 손상은 IOP 증가없이 일부 개체에서 발생하는데, 이러한 유형의 녹내장은 정상압(정상 압력 또는 저압력) 녹내장으로도 알려져 있다. 신경 손상과 이러한 유형의 녹내장의 원인은 알려지지 않았다.
녹내장 병인에서 보체의 역할은 다음과 같다: 1) 래트 녹내장 모델에서 IOP의 실험적 상승에서 보체 성분 mRNA(C1q, C1r, C1s, C3)의 망막 발현 증가(Ahmed, F, Brown, KM, Stephan, DA, Morrison, JC, Johnson, EC, Tomarev, SI (2004) IOVS 45, 1247-54); 2) 사이노멀거스 녹내장 모델에서 보체 성분 mRNAs(C4, B, C1q, C3)의 망막 발현 증가(Miyahara, T, Kikuchi, T, Akimoto, M, Kurokawa, T, Shibuki, H, Yoshimura, N (2003) IOVS 44, 4347-56); 3) 마우스 및 원숭이의 녹내장 모델 유래의 망막 아교 세포에서 C1q mRNA 및 단백질의 발현 증가(Stasi, K, Nagel, D, Yang, X, Wang, R, Ren, L, Podos, SM, Mittag, T, Danias, J (2006) IOVS 47, 1024-29); 4) 인간 피험체의 아교 세포에서 C1q에 대한 면역 조직 화학 염색(Stasi 외, 2006). 실험적 녹내장 마우스에서 보체 C1q 발현은 시간에 따른 IOP 증가와 관련되고 망막 신경절 세포에 대한 손상이 선행되는 것으로 보이는데, 이는 보체가 질환의 병인일 수 있음을 의미한다(Stasi 외, 2006). 항-보체 앱타머, 예를 들어, 항-C5 앱타머를 이용한 치료는 고압 또는 저압 녹내장의 퇴행성 신경질환에 대한 보호 효과를 가질 수 있다.
따라서, 일 구체예에서, 본 발명은 보체 매개성 안구 질환의 치료를 위한 항-C5 제제를 제공한다. 일 구체예에서, 본 발명의 항-C5 제제는 단독으로 사용되고, 다른 구체예에서는 항-VEGF 및/또는 항-PDGF 제제와 병용하여 사용된다.
본 발명의 다른 구체예는 보체 매개성 안구 질환의 치료, 안정화 및/또는 예방을 위한 항-보체 앱타머를 제공한다. 항-보체 앱타머는 SELEX™ 방법으로 생성할 수 있다. 특정 구체예에서, 본 발명은 안구 질환의 하나 이상의 징후, 구체적으로 당뇨병성 망막병증, 삼출성 및/또는 비삼출성 AMD의 징후를 경감, 안정화 및/또는 예방하는 방법에서 개체에게 항-보체 앱타머, 예를 들어 항-C5 앱타머를 투여하는 단계를 포함한다.
C5 특이적 앱타머
보체 매개성 안구 질환의 징후를 치료, 안정화, 예방 및/또는 경감시키는데 사용하기 위한 C5 특이적 앱타머는 SELEX™ 방법으로 생성할 수 있다. 특정 구체예에서, 본 발명은 하나 이상의 인구 질환 징후, 구체적으로 당뇨병성 망막병증, 삼출성 및/또는 비삼출성 AMD의 징후를 경감, 안정화 및/또는 예방하는 방법에서 개체에게 항-C5 앱타머 제제를 투여하는 단계를 포함한다.
앱타머는 고전적인 왓슨-크릭 염기쌍 형성 이외의 상호 작용을 통해서 분자에 대한 특이적 결합 친화성을 갖는 핵산 분자이다.
파지 디스플레이로 생성된 펩티드 또는 단일클론 항체("mAb")와 유사하게, 앱타머는 선택된 표적에 특이적으로 결합할 수 있고, 예를 들어 결합한 앱타머가 표적이 기능하는 능력을 차단하여, 표적의 활성을 조절할 수 있다. 무작위적인 서열의 올리고뉴클레오티드 풀로부터 시험관 내 선별 과정을 통해 생성시킨, 앱타머는 성장 인자, 전사 인자 효소, 면역글로불린 및 수용체를 포함하는 100 단백질 이상에 대해서 생성된다. 전형적인 앱타머는 그 크기가 10∼15 kDa(30∼45 뉴클레오티드)이고, 나노몰 이하의 친화성으로 이의 표적에 결합하며 밀접하게 관련된 표적과 구별된다(예를 들어, 앱타머는 전형적으로 동일한 유전자 패밀리 유래의 다른 단백질에 결합하지 않는다). 일련의 구조 연구에 따르면 앱타머는 항체-항원 복합체에서 친화성 및 특이성을 유도하는 것과 동일한 유형의 결합 상호작용(예를 들어, 수소 결합, 정전기적 상보 작용, 소수성 접촉, 입체 배제 등)을 이용할 수 있다.
앱타머는 높은 특이성 및 친화성, 생물학적 효능 및 우수한 약물 동력학적 특성을 비롯하여 치료 및 진단법에 사용하기에 바람직한 다수의 특징을 갖는다.
SELEX™ 방법
도 2에 개괄적으로 도시한, 앱타머를 생성하기 위한 바람직한 방법은 "Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment"("SELEX™")라고 하는 방법이다. 이 SELEX™ 방법은 표적 분자에 대한 높은 특이적 결합성을 갖는 핵산 분자를 시험관에서 발생시키기 위한 방법으로서, 예를 들어 1990년 6월 11일 출원되어, 현재는 포기된 건인 미국 특허 출원 제07/536,428호, "핵산 리간드"의 제목의 미국 특허 제5,475,096호 및 "핵산 리간드"라는 제목의 미국 특허 제5,270,163호(WO 91/19813)에 기술되어 있다. 선별 및 증폭 사이클을 반복 수행하여서, SELEX™는 임의 바람직한 수준의 표적 결합 친화성을 갖는, 여기서 "핵산 리간드"라고도 하는 앱타머를 얻는데 이용할 수 있다.
SELEX™ 방법은 핵산이 2차 및 3차의 다양한 구조를 형성할 수 있는 충분한 능력을 가지고, 단량체 또는 중합체이건 상관없이, 임의 화학적 화합물과 실제로 리간드(즉, 특이적 결합쌍을 형성)로서 이들 단량체 내에서 작용할 수 있는 충분하 화학적 다능성을 갖는다는 고유한 이해를 기반으로 한다. 임의 크기의 분자 또는 조성물이 표적으로서 제공될 수 있다.
SELEX™ 방법은 표적에 결합할 수 있는 능력을 기반으로한다. SELEX™를 통해서 얻은 앱타머는 따라서 표적 결합성을 갖는다. 그러나, SELEX™ 자체는 다른 앱타머 또는 표적 특성에 대해서 선택되지 않고 얻어진 앱타머가 다른 특성을 가지더라도, 목적하는 표적에 결합하는 것 이외에 SELEX™-유도된 앱타머가 임의 특성을 가질 것이라고 타당하게 예측할 수 없다. 따라서, 앱타머가 표적에 결합하는 것 이외에 표적에 대해 특정 영향을 가질 것이라고 기대할 수 있지만, 주어진 앱타머는 영향이 없거나, 몇몇 영향을 가질 수 있다. 예를 들어, 표적이 다수의 세포 표면 수용체와 상호작용하는 단백질인 경우, 앱타머는 단백질과 하나 이상의 이러한 수용체 간의 결합을 차단하거나 강화시키도록 작용할 수 있고 또는 임의 상호작용에 영향이 없을 수도 있다. 다른 예에서, 표적은 촉매성종일 수 있고, 앱타머는 촉매 기능의 효과를 차단하거나 강화할 수 있거나 또는 이 촉매 기능에 영향이 없을 수 있다. 하지만, 적절한 분석법으로 시험하기 전에, 당업자는 있을 수 있는 실제 주어진 앱타머가 갖는 특성을 예측할 수는 없다. 사실 단지 표적 결합성으로 앱타머 결합 작용에 의해 표적상에 가해질 수 있는 기능적 영향에 대한 어떠한 정보도 제공되지 않는다.
표적 분자의 특성 변형은, 표적의 특성에 변화를 주기위해서 표적 상의 일정 위치에 앱타머가 결합할 것이 요구된다. 이론적으로, SELEX™은 대량의 앱타머를 동정할 수 있게하는데, 여기서 각 앱타머는 표적의 상이한 부위에 결합한다. 실제로, 앱타머-표적 결합 상호 작용은 종종 상호작용에 대해 안정하고 접근가능한 구조적 계면을 제공하는 표적 상의 비교적 소수 또는 하나의 바람직한 결합 부위에서 일어난다. 또한, SELEX™를 생리적 표적 분자에 대해 수행할 경우 당업자는 일반적으로 표적에 대한 앱타머의 위치를 제어할 수 없다. 따라서, 표적 상의 앱타머 결합 부위의 위치는 표적 분자상에 임의 영향이 없을 수 있거나 바람직한 효과를 일어킬 수 있는 가능한 몇몇 결합 부위 중 하나이거나 그에 가까운 곳일 수도 아닐 수도 있다.
앱타머가 표적에 결합할 수 있는 능력을 통해서, 그 효과를 갖는 것으로 확인되더라도, 그 효과의 존재를 예측하거나 어떠한 효과일지에 대해서 미리 알수 있는 방법은 없다. SELEX™ 실험을 수행하는데 있어서, 당업자는 표적에 대해서 엡타머를 얻을 수 있는 가능성 정도로, 앱타머가 표적 결합성을 가질 것이라는 어떠한 가능성을 갖는다는 것만을 알 수 있다. 동정된 앱타머의 일부가 또한, 확실하지는 않지만 표적에 결합하는 것 외에도 표적에 대해 영향을 줄것이라는 기대로 SELEX™ 실험을 수행할 수 있다.
SELEX™ 방법은 출발 시점에서 무작위적인 서열들을 포함하는 단일 가닥 올리고뉴클레오티드의 거대한 풀 또는 라이브러리에 의존한다. 올리고뉴클레오티드는 변형 또는 비변형된 DNA, RNA 또는 DNA/RNA 하이브리드일 수 있다. 일례에서, 풀은 100% 무작위 또는 부분 무작위 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 다른 예에서, 풀은 무작위적인 서열 내에 도입된 하나 이상의 고정 서열 및/또는 보존 서열을 함유하는 무작위 또는 부분 무작위 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 다른 예에서, 풀은 올리고뉴클레오티드 풀의 모든 분자에 의해 공유되는 서열을 포함할 수 있는 5' 및/또는 3' 말단에 하나 이상의 고정 서열 및/또는 보존 서열을 함유하는 무작위 또는 부분 무작위 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 고정 서열은 예비 선별 목적 예컨대 하기 추가로 기술되는 CpG 부분, PCR 프라이머의 하이브리화 부위, RNA 폴리머라제(예를 들어, T3, T4, T7 및 SP6 등)를 위한 프로모터 서열, 제한 효소 부위 또는 단독 중합체 서열 예컨대 polyA 또는 polyT 트랙, 촉매성 코어, 친화성 컬럼에 선별적으로 결합하는 부위 및 목적 올리고뉴클레오티드의 클로닝 및/또는 서열분석을 촉진하기 위한 다른 서열 등을 위해 도입되는 풀 중 올리고뉴클레오티드에 공통되는 서열이다. 보존 서열은 상기 기술한 고정 서열 이외에, 동일 표적에 결합하는 다수의 앱타머들이 공유하는 서열이다.
풀의 올리고뉴클레오티드는 바람직하게 효율적인 증폭을 위해 필요한 고정 서열을 비롯하여 무작위화된 서열 부분을 포함한다. 전형적으로, 출발 풀의 올리고뉴클레오티드는 30 내지 50의 무작위 뉴클레오티드의 내부 영역에 측접하는 고정된 5' 및 3' 말단 서열을 함유한다. 무작위화된 뉴클레오티드는 화학 합성법 및 무작위로 절단한 세포 핵산으로부터의 크기 선별을 포함하는 다양한 방법으로 제조할 수 있다. 시험 핵산 중 서열 변이는 또한 선별/증폭 반복 동안 또는 그 전에 돌연변이화를 통해 도입하거나 증가시킬 수 있다.
올리고뉴클레오티드의 무작위 서열 부분은 임의 길이일 수 있고 리보뉴클레오티드 및/또는 데옥시리보뉴클레오티드를 포함할 수 있도 변형 또는 비천연 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유사체를 포함할 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 제5,958,691호; 미국 특허 제5,660,985호; 미국 특허 제5,958,691호; 미국 특허 제5,698,687호; 미국 특허 제5,817,635호; 미국 특허 제5,672,695호 및 국제 특허 출원 공개 번호 제WO 92/07065호 등을 참조한다. 무작위 올리고뉴클레오티드는 당분야의 공지된 합성 방법으로 합성할 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Froehler 외, Nucl. Acid Res. 14:5399- 5467 (1986)] 및 [Froehler 외, Tet. Lett. 27:5575-5578 (1986)]을 참조한다. 무작위 올리고뉴클레오티드는 용액상 방법 예컨대 트리에스테르 합성법 등을 이용하여 합성할 수도 있다. 예를 들어, 문헌 [Sood 외, Nucl. Acid Res. 4:2557 (1977)] 및 [Hirose 외, Tet. Lett., 28:2449 (1978)]를 참조한다. 자동화 DNA 합성 장치 상에서 수행되는 전형적인 합성법은 1014∼1016의 개별 분자를 생산하는데, 이는 대부분의 SELEX™ 실험에 충분한 수이다. 서열 디자인에서 무작위 서열을 충분하게 큰 영역은 각각의 합성된 분자가 고유한 서열을 나타낼 가능성을 증가시킨다.
올리고뉴클레오티드의 출발 라이브러리는 DNA 합성기 상에서 자동화 화학 합성에 의해 생성시킬 수 있다. 무작위화 서열을 합성하기 위해서, 4종의 모든 뉴클레오티드의 혼합물을 합성 과정 동안 각 뉴클레오티드 첨가 단계에서 첨가하여 뉴클레오티드의 무작위 도입을 가능하게 한다. 상기에 언급한 바와 같이, 일 구체예에서, 무작위 올리고뉴클레오티드는 전적으로 무작위적인 서열을 포함하지만, 다른 구체예에서, 무작위 올리고뉴클레오티드는 무작위적이지 않거나 부분 무작위적인 서열 가닥을 포함할 수 있다. 부분 무작위 서열은 각 첨가 단계에서 4종의 뉴클레오티드를 상이한 몰비율로 첨가하여 생성시킬 수 있다.
올리고뉴클레오티드의 출발 라이브러리는 RNA, DNA, 치환된 RNA 또는 DNA 또는 이의 조합일 수 있다. RNA 라이브러리가 출발 라이브러리로 사용되는 경우에 있어서, DNA 라이브러리를 합성하고, 경우에 따라 PCR 증폭한 후, T7 RNA 폴리머라제 또는 변형 T7 RNA 폴리머라제를 이용하여 시험관 내에서 DNA 라이브러리를 전사시키고, 전사된 라이브러리를 정제하여 생성시킨다. 핵산 라이브러리는 결합에 호의적인 조건하에서 표적과 혼합하고, 동일한 일반적인 선별 과정을 이용하여 결합, 분획화 및 증폭을 단계적으로 반복하여 결합 친화성 및 선택성의 임의 바람직한 기준을 실제로 얻는다. 보다 구체적으로, 핵산의 출발 풀을 함유하는 혼합물로부터 시작하여, SELEX™ 방법은 (a) 결합에 호의적인 조건하에서 상기 혼합물과 표적을 접촉시키는 단계; (b) 표적 분자에 특이적으로 결합한 핵산으로부터 미결합 핵산을 분획화하는 단계; (c) 핵산-표적 복합체를 해리하는 단계; (d) 핵산-표적 복합체에서 해리된 핵산을 증폭하여 핵산의 리간드 농축된 혼합물을 얻는 단계; 및 (e) 표적 분자에 대해 특이성, 친화력이 높은 핵산을 얻기에 바람직한 정도로 다수의 사이클을 통해서 결합, 분획화, 해리 및 증폭 단계를 반복하는 단계를 포함한다. RNA 앱타머를 선택한 경우에, SELEX™ 방법은 (i) 단계 (d)의 증폭 전에 핵산-표적 복합체으로부터 해리된 핵산을 역전사하는 단계; 및 (ii) 과정을 재시작하기 전에 단계 (d)로부터의 증폭된 핵산을 전사하는 단계를 추가로 포함한다.
다수의 가능한 서열 및 구조를 함유하는 핵산 혼합물 내에는, 주어진 표적에 대한 결합 친화력이 다양한 범위로 존재한다. 표적에 대해 보다 높은 친화력(보다 낮은 해리 상수)을 갖는 것들은 대부분 표적에 결합할 것이다. 분획화, 해리 및 증폭 후, 2차 핵산 혼합물을 생성시키고, 보다 높은 결합 친화력의 후보물로 농축시킨다. 추가적인 선별 라운드는 얻어진 핵산 혼합물이 주로 하나만 또는 소수의 서열로만 구성될 때까지 최선의 리간드에 대해 점진적으로 유리해진다. 이후, 이를 클로닝하고, 서열분석하며 1) 표적 결합 친화성 및 2) 표적 기능에 대한 효능에 대해서 리간드 또는 앱타머로서 개별적으로 시험할 수 있다.
선별 및 증폭 사이클은 원하는 목표에 도달할 때까지 반복한다. 가장 일반적인 경우에서, 선별/증폭은 사이클 반복시 결합 강도에 어떠한 유의한 개선을 얻을 수 없을 때까지 반복한다. 이 방법은 전형적으로 샘플로서 대략 1014의 상이한 핵산종을 이용하지만 약 1018의 상이한 핵산종 정도로 많은 샘플을 사용할 수 있다. 일반적으로 핵산 앱타머 분자는 5 내지 20 사이클을 진행하여 선별된다. 일 구체예에서, 초기 선별 단계에서만 이종성을 도입한다.
SELEX™ 방법의 일 구체예에서, 선별 과정은 선택된 표적에 가장 강하게 결합하는 핵산 리간드를 단리하는 것이 상당히 효율적이어서 한번의 선별 및 증폭 사이클만이 요구된다. 이러한 효율적인 선별은 예를 들어, 컬럼 상에 결합된 표적과 연합되는 핵산의 능력에 의해서, 컬럼에 의해 가장 높은 친화성의 핵산 리간드의 분리 및 단리가 충분히 가능한 방식으로 이루어지는 크로마토그래피형 방법으로 수행할 수 있다.
많은 경우에서, 단일 핵산 리간드를 동정할 때까지 SELEX™의 단계를 반복 수행하는 것이 반드시 요구되는 것은 아니다. 표적-특이적 핵산 리간드 용액은 다수의 보존 서열 및 표적에 대한 핵산 리간드의 친화성에 유의한 영향을 주지않으면서 치환 또는 첨가될 수 있는 다수의 서열을 갖는 핵산 구조물 또는 부분의 패밀리를 포함한다. 완료전에 SELEX™ 과정을 종결하여서, 다수의 핵산 리간드 용액 패밀리의 서열을 결정하는 것이 가능하다.
다양한 핵산의 1차, 2차 및 3차 구조가 알려져 있다. 왓슨 크릭형 이외의 상호작용이 관여하는 것으로 가장 일반적으로 알려진 구조 또는 부분은 헤어핀 루프, 대칭 및 비대칭성 벌지, 슈도노트 및 이의 무수한 조합들로서 알려져 있다. 이러한 부분의 대부분의 모든 알려진 경우들은 30 뉴클레오티드를 넘지 않는 핵산 서열로 형성될 수 있음이 알려져 있다. 이러한 이유로, 인접한 무작위적인 단편을 이용하는 SELEX™ 방법은 약 20 내지 약 50 뉴클레오티드, 일 구체예에서는 약 30 내지 약 40 뉴클레오티드의 무작위적인 단편을 함유하는 핵산 서열을 이용하여 개시하는 것이 대체로 바람직하다. 일례에서, 5'-고정:무작위:3'-고정 서열은 약 30 내지 약 50 뉴클레오티드의 무작위 서열을 포함한다.
코어 SELEX™ 방법은 다수의 특수 목적을 이루기 위해 변형되었다. 예를 들어, 미국 특허 제5,707,796호는 특이적인 구조적 특징을 갖는 핵산 분자, 예컨대 벤트 DNA를 선별하기 위해 겔 전기영동과 함께 SELEX™을 이용하는 것에 대해 기술하였다. 미국 특허 제5,763,177호는 표적 분자에 결합 및/또는 광가교 및/또는 광불활성화시킬 수 있는 광반응성 기를 함유하는 핵산 리간드를 선별하기 위한 SELEX™ 기반 방법을 기술하고 있다. 미국 특허 제5,567,588호 및 제5,861,254호는 표적 분자에 대해서 높은 친화성 및 낮은 친화성을 갖는 올리고뉴클레오티드를 매우 효율적으로 분획화하는 SELEX™ 기반 방법을 기술하고 있다. 미국 특허 제5,496,938호는 SELEX™ 과정을 수행한 후에 개선된 핵산 리간드를 얻기 위한 방법을 기술하고 있다. 미국 특허 제5,705,337호는 그 표적에 리간드를 공유적으로 결합시키는 방법을 기술하고 있다.
SELEX™는 또한 표적 분자 상의 하나 이상의 부위에 결합하는 핵산 리간드를 얻기 위해서, 그리고 표적 상의 특이적 부위에 결합하는 비핵산종을 포함하는 핵산 리간드를 얻기위해 사용할 수 있다. SELEX™는 보조인자 및 다른 소형 분자를 비롯하여 생물학적 기능의 일부로서 핵산에 결합하는 미지의 단백질 및 핵산 결합 단백질 등과 같은 큰 생분자 및 작은 생분자를 포함하여, 임의의 예상되는 표적에 결합하는 핵산 리간드를 단리 및 동정하기 위한 수단을 제공한다. 예를 들어, 미국 특허 제5,580,737호는 카페인 및 밀접하게 관련된 유사체인 테오필린에 대해 높은 친화성으로 결합할 수 있는, SELEX™을 통해 동정된 핵산 서열을 개시하고 있다.
카운터-SELEX™은 하나 이상의 비표적 분자에 대한 교차 반응성을 갖는 핵산 리간드 서열을 제거하여 표적 분자에 대한 핵산 리간드의 특이성을 개선시키기 위한 방법이다. 카운터-SELEX™은 (a) 핵산의 후보물 혼합물을 제조하는 단계; (b) 표적과 후보 혼합물을 접촉시키는 단계로서, 여기서 후보물 혼합물에 대해서 표적에 대해 증가된 친화성을 갖는 핵산은 후보물 혼합물의 나머지로부터 분획화할 수 있는 것인 단계; (c) 후보물 혼합물의 나머지로부터 친화성이 증가된 핵산을 분획화하는 단계; (d) 표적으로부터 친화성이 증가된 핵산을 해리하는 단계; (e) 비표적 분자(들)에 대해 특이적 친화성을 갖는 핵산 리간드가 제거되도록 하나 이상의 비표적 분자와 친화력이 증가된 핵산을 접촉시키는 단계; 및 (f) 표적 분자에만 특이적 친화성을 갖는 핵산을 증폭하여 표적 분자에 결합하기 위해 비교적 높은 친화성 및 특이성을 갖는 핵산 서열을 농축시킨 핵산 혼합물을 생성하는 단계를 포함한다. SELEX™에 대해 상기에서 기술한 바와 같이, 선별 및 증폭 사이클은 원하는 목표를 이룰 때까지 필요에 따라 반복한다.
치료제, 진단제 및 백신으로서 핵산을 사용하면서 접하게 되는 가능한 문제 중 하나는 포스포디에스테르 형태의 올리고뉴클레오티드가 목적하는 효과를 발현하기 전에 엔도뉴클레제 및 엑소뉴클라제 등과 같은 세포내 및 세포외 효소에 의해서 유체 내에서 쉽게 분해될 수 있다는 것이다. 따라서, SELEX™ 방법은 예컨대 개선된 안정성 또는 개선된 전달 특성 등과 같이, 리간드에 개선된 특성을 부여하는 변형된 뉴클레오티드를 함유하는 고친화성 핵산 리간드를 동정하는 것을 포함한다. 이러한 변형의 예에는 당 및/또는 인 및/또는 염기 위치에 화학적 치환을 포함한다. 변형된 뉴클레오티드를 함유하는 SELEX™-동정된 핵산 리간드는 예를 들어, 미국 특허 제5,660,985호에 기술되어 있는데, 리보스의 2' 위치, 피리미딘의 5' 위치 및 퓨린의 8' 위치에서 화학적으로 변형된 뉴클레오티드 유도체를 함유하는 올리고뉴클레오티드를 기술하고 있고, 미국 특허 제5,756,703호는 다양한 2'-변형된 피리미딘을 함유하는 올리고뉴클레오티드를 기술하고 있으며, 미국 특허 제5,580,737호는 2'아미노(2'-NH2), 2'-플루오로(2'-F) 및/또는 2'-O-메틸(2'-OMe) 치환기로 변형된 하나 이상의 뉴클레오티드를 함유하는 매우 특이적인 핵산 리간드를 기술하고 있다.
본 발명에서 고려하는 핵산 리간드의 변형에는 이에 제한되는 것은 아니며, 전체로서 핵산 리간드 또는 핵산 리간드 염기에 유연성, 정전기적 상호작용, 수소결합, 소수성, 극성, 추가적인 전하를 도입하는 다른 화학기를 제공하는 것을 포함한다. 뉴클레아제에 대해 내성을 갖는 올리고뉴클레오티드 집단을 생성하기 위한 변형에는 또한 하나 이상의 치환기 뉴클레오티드간 결합, 변형 당류, 변형 염기류 또는 이의 조합이 포함된다. 이러한 변형은 제한되는 것인 아니나, 2'-위치 당 변형, 5-위치 피리미딘 변형, 8-위치 퓨린 변형, 외향 고리 아민에서 변형, 4-티오유리딘의 치환, 5-브로모 또는 5-요오도-우라실의 치환; 골격 변형, 포스포로티오에이트 또는 알킬 포스페이트 변형, 메틸화 및 특이적인 염기쌍 조합 예컨대 이소염기 이소시티딘 및 이소구안노신 등을 포함한다. 변형은 또한 3' 및 5' 변형 예컨대 캡핑, 예를 들어, 엑소뉴클레아제 내성을 증가시키기 위한 3'-3'-dT 캡 첨가 등을 포함한다(예를 들어, 미국 특허 제5,674,685호; 제5,668,264호; 제6,207,816호; 및 제6,229,002호, 이들 각각을 전체로 본 발명에 참조하여 포함시킨다).
일 구체예에서, 올리고뉴클레오티드는 P(O)) 기를 P(O)S("티오에이트"), P(S)S("디티오에이트"), P(O)NR2("아미데이트"), P(O)R, P(O)OR', CO 또는 CH2("포르마세탈") 또는 3'-아민(-NH-CH2-CH2-)으로 치환되어 제공되는데, 여기서 각각의 R 또는 R'은 독립적으로 H 또는 치환 또는 미치환된 알킬이다. 결합 기는 -O-, -N-, 또는 -S- 결합을 통해서 인접한 뉴클레오티드에 부착될 수 있다. 올리고뉴클레오티드내 모든 결합이 동일할 필요는 없다.
추가 구체예에서, 올리고뉴클레오티드는 변형된 당 기를 포함하고, 예를 들어, 하나 이상의 히드록실 기가 할로겐, 지방족기로 치환되거나 또는 에테르 또는 아민으로 작용화된다. 일 구체예에서, 푸라노스 잔기의 2'-위치는 O-메틸, O-알킬, O-알릴, S-알킬, S-알릴 또는 할로 기 중 어느 것으로 치환된다. 2'-변형된 당의 합성 방법은 예를 들어, 문헌 [Sproat, 외, Nucl. Acid Res. 19:733-738 (1991); Gotten, 외, Nucl. Acid Res. 19:2629-2635 (1991); 및 Hobbs, 외, Biochemistry 12:5138-5145 (1973)]에 기술되어 있다. 다른 변형은 당분야의 당업자에게 공지이다. 이러한 변형은 프리-SELEX™ 방법 변형 또는 포스트-SELEX™ 방법 변형(사전에 동정된 비변형 리간드의 변형)일 수 있고 또는 SELEX™ 방법에 도입하여 만들 수도 있다.
프리-SELEX™ 방법 변형 또는 SELEX™ 방법에 도입하여 만든 것은 이의 SELEX™ 표적에 대한 특이성 및 개선된 안정성, 예를 들어 생체내 안정성을 둘다 갖는 핵산 리간드를 생성한다. 핵산 리간드에 대해 이루어진 포스트-SELEX™ 방법 변형은 핵산 리간드의 결합능에 악영향을 주지않으면서 안정성, 예를 들어 생체 내 안정성을 개선시킬 수 있다.
SELEX™ 방법은 미국 특허 제5,637,459호 및 제5,683,867호에 기술된 바와 같이, 선별된 올리고뉴클레오티드와 다른 선별된 올리고뉴클레오티드 및 비올리고뉴클레오티드 작용 단위를 조합하는 것을 포함한다. SELEX™ 방법은 예를 들어, 미국 특허 제6,011,020호, 미국 특허 제6,051,698호 및 PCT 공개 특허 제WO 98/18480호에 기술된 바와 같이, 진단 또는 치료 복합체에서 친지성 또는 비면역원성 고분자량 화합물과 선별된 핵산 리간드를 조합하는 것을 더욱 포함한다. 이들 특허 및 출원은 광범위한 배열의 형태 및 다른 특성을 올리고뉴클레오티드의 효율적인 증폭 및 복제성, 및 다른 분자의 바람직한 특성과 조합하는 것을 교시하고 있다.
SELEX™ 방법을 통해서 소형의, 연성 펩티드에 대한 핵산 리간드의 동정을 시험하였다. 소형 펩티드는 연성 구조를 가지며 일반적으로 다양한 이형태체가 평형 상태인 용액 중에 존재하므로, 초기에 결합 친화성이 연성 펩티드에 결합시 입체 형태의 엔트로피 손실에 의해 제한될 것으로 여겨졌었다. 그러나, 용액중 소형 펩티드에 대해 동정된 핵산 리간드의 타당성은 미국 특허 제5,648,214호에서 검증되었다. 이 특허에서, 11 아미노 펩티드인 기질 P에 대한 고친화성 RNA 핵산을 동정하였다.
본 발명의 보체 표적(들)에 대해 특이성 및 결합 친화성을 갖는 앱타머는 대체로 여기에 기술한 바와 같은 SELEX™ 방법을 통해서 선별하였다. 추가적으로, 선별은 생체내 분해에 대해 앱타머 분자를 안정화시키기 위해서 변형된 뉴클레오티드를 도입한 서열을 이용하여 수행하였다.
2' 변형된 SELEX™
앱타머를 치료 또는 진단에 사용하기 적합하게 하기 위해서, 생체 내에서 안정하고 안전하게 저렴하게 합성하는 것이 바람직하다. 야생형 RNA 및 DNA 앱타머는 대체로 뉴클레아제에 의한 분해에 감수성을 갖기 때문에 생체 내에서 불안정하다. 뉴클레아제 분해에 대한 내성은 2'-위치에 변형 기를 도입하여 상당히 증가시킬 수 있다.
2'-플루오로 및 2'-아미노기를 앱타머를 이후 선별하게 되는 올리고뉴클레오티드 풀에 성공적으로 도입하였다. 그러나, 이러한 변형은 얻어지는 앱타머의 합성 비용을 상당히 증가시켰고, 변형된 뉴클레오티드의 분해로 인해 변형 뉴클레오티드가 숙주 DNA로 재순환되어 이후 DNA 합성의 기질로서 이 뉴클레오티드를 사용할 수 있다는 가능성때문에 일부 경우에 안정성 문제가 있을 수 있다.
본 발명에서 제공하는 바와 같은, 2'-O-메틸("2'-OMe") 뉴클레오티드를 함유하는 앱타머는 수많은 이러한 단점을 극복한다. 2'-OMe 뉴클레오티드를 함유하는 올리고뉴클레오티드는 뉴클레아제 내성이고 합성이 저렴하다. 2'-OMe 뉴클레오티드가 생물계에 편재해 있지만, 천연 폴리머라제는 생리적 조건하에서 기질로서 2'-OMe NTP를 수용하지 않으므로, 숙주 DNA로 2'-OMe 뉴클레오티드가 재순환되는 안정성 문제는 존재하지 않는다. 2'-변형된 앱타머를 생성하기 위해 사용되는 SELEX™ 방법은 예를 들어, 2002년 12월 3일 출원된 미국 가출원 제60/430,761호, 2003년 7월15일 출원된 미국 가출원 제60/487,474호, 2003년 11월 4일 출원된 미국 가출원 제60/517,039호, 2003년 12월 3일 출원된 미국 출원 제10/729,581호, 2004년 6월 21일에 "Method for in vitro Selection of 2'-O-Methyl Substituted Nucleic Acids"라는 명칭으로 출원된 미국 출원 제10/873,856호, "Improved Materials and Methods for the Generation of Fully 2'-Modified Containing Nucleic Acid Transcripts"라는 명칭으로 2005년 6월 30일 출원된 미국 가출원 제60/696,292호 및 "Materials and Methods for the Generation of Fully 2'-Modified Containing Nucleic Acid Transcripts"라는 명칭으로 2006년 6월 30일 출원된 미국 출원 제11/480,188호에 기술되어 있으며, 이들을 전체로 참조하여 본 발명에 포함시킨다.
본 발명은 열적 및 물리적 분해를 비롯하여 효소 및 화학적 분해에 대해 비변형 올리고뉴클레오티드에 비해 보다 안정한 올리고뉴클레오티드를 제조하기 위하여 변형된 뉴클레오티드(예를 들어, 2'-위치에 변형을 갖는 뉴클레오티드)를 함유하는, 보체 표적에 결합하여 그 기능을 조절하는 앱타머를 포함한다. 바람직한 구체예에서, 상기 보체 표적은 보체 단백질 C5이다. 문헌(예를 들어, [Green 외, Current Biology 2, 683-695, 1995] 참조)에 2'-OMe 함유 앱타머의 몇몇 예가 존재하지만, 이들은 C 및 U 잔기를 2'-플루오로(2'-F)로 치환하고 A 및 G 잔기가 2'-OH인 변형 전사체 라이브러리에서 시험관 내 선별을 통해서 생성된 것들이다. 기능성 서열이 동정되면 각 A 및 G 잔기에 대해서 2'-OMe 치환에 대한 내성에 대해 시험하고, 2'-OMe 잔기로서 2'-OMe 치환에 내성인 모든 A 및 G 잔기를 갖는 앱타머를 재합성하였다. 이러한 2단계식으로 합성한 앱타머의 대부분의 A 및 G 잔기는 평균적으로 대략 20%는 그러하지 않지만, 2'-OMe 잔기로의 치환에 내성을 갖는다. 결과적으로 이러한 방법으로 생성된 앱타머는 2 내지 4개의 2'-OH 잔기를 함유하는 경향이 있고, 그 결과 안정성 및 합성 비용에 손해를 보게 된다. 앱타머를 SELEX™(및/또는 여기서 기술한 것들을 비롯하여 이의 임의 별법 및 개선법)에 의해 선별 및 농축시킨 올리고뉴클레오티드 풀에서 사용하는 안정화된 올리고뉴클레오티드를 생성하는 전사 반응에서 변형 뉴클레오티드를 도입하여, 본 발명의 방법은 선별된 앱타머 올리고뉴클레오티드를 안정화시킬 필요성이 제거된다(예를 들어, 변형 뉴클레오티드를 이용한 앱타머 올리고뉴클레오티드를 재합성하여).
일 구체예에서, 본 발명은 ATP, GTP, CTP, TTP 및 UTP 뉴클레오티드의 2'-OH, 2'-F, 2'-데옥시 및 2'-OMe 변형의 조합을 포함한다. 다른 구체예에서, 본 발명은 ATP, GTP, CTP, TTP 및 UTP 뉴클레오티드의 2'-OH, 2'-F, 2'-데옥시, 2'-OMe, 2'-NH2, 및 2'-메톡시에틸 변형의 조합을 포함한다. 다른 구체예에서, 본 발명은 ATP, GTP, CTP, TTP 및 UTP 뉴클레오티드의 2'-OH, 2'-F, 2'-데옥시, 2'-OMe, 2'-NH2 및 2'-메톡시에틸 변형의 56 조합을 포함한다. 바람직한 구체예에서, 본 발명은 모두 또는 실질적으로 모두 2'-OMe 변형된 ATP, GTP, CTP, TTP 및 UTP 뉴클레오티드를 포함한다.
본 발명의 2'-변형된 앱타머는 변형 폴리머라제, 예를 들어, 야생형 폴리머라제에 비하여 높은, 푸라노스 2' 위치에서 벌키한 치환기를 갖는 변형 뉴클레오티드의 도입율을 갖는 변형 T7 폴리머라제를 이용하여 선별할 수 있다. 예를 들어, 위치 639에 티로신 잔기가 페닐알라닌(Y639F)로 변화된 돌연변이체 T7 폴리머라제는 벌키 2'-치환기 예컨대 2'-OMe 또는 2'-아지도(2'-N3) 치환기를 갖는 NTP가 아닌 2'-데옥시, 2'-아미노 및 2'-플루오로-뉴클레오티드 트리포스페이트(NTP)를 용이하게 활용(도입)한다. 벌키 2'-치환기를 도입하기 위한, Y639F 돌인변이 이외에도 위치 784의 히스티딘이 알라닌 잔기로 변화된 돌연변이체 T7 폴리머라제(Y639F/H784A)가 기술되어 있으며 변형된 피리미딘 NTO를 도입하려는 상황에 제한적으로 사용되었다. 문헌 [Padilla, R. and Sousa, R., Nucleic Acids Res., 2002, 30(24): 138]을 참조한다. 위치 639에 티로신 잔기가 페닐알라닌으로 바뀌고, 위치 784에 히스티딘 잔기가 알라닌으로 변경되고, 위치 378의 리신 잔기가 아르기닌으로 변경된 돌연변이체 T7 RNA 폴리머라제(Y639F/H784A/K378R)가 전사를 위해서 2'-OH GTP의 스파이크를 요구하지만, 변형된 퓨린 및 피리미딘 NTP, 예를 들어 2'-OMe NTP를 도입하는 상황에 제한적으로 사용되었다. 문헌 [Burmeister 외, (2005) Chemistry and Biology, 12: 25-33]을 참조한다. 특별히 한정하는 것은 아니며, K378R 돌연변이는 폴리머라제의 활성 부위 근처가 아니므로 2'-OMe 변형된 NTP를 도입하는데 영향이 없는 침묵 돌연변이로 여겨진다. 위치 784의 히스티딘이 알라닌 잔기로 변경된 돌연변이체 T7(H784A)이 또한 기술되어 있다. 문헌 [Padilla 외, Nucleic Acids Research, 2002, 30: 138]을 참조한다. Y639F/H784A 돌연변이체 및 H784A 돌연변이체 T7 폴리머라제 양자에 있어서, 보다 작은 아미노산 잔기 예컨대 알라닌으로의 변화는 보다 벌키한 뉴클레오티드 기질, 예를 들어 2'-OMe 치환된 뉴클레오티드의 도입을 가능하게 한다. 예를 들어, 문헌 [Chelliserry, K. and Ellington, A.D., (2004) Nature Biotech, 9: 1155-60]을 참조한다. 벌키한 2'-변형 기질을 보다 용이하게 도입하는, T7 RNA 폴리머라제의 활성 부위에 돌연변이를 갖는 추가적인 T7 RNA 폴리머라제, 예를 들어 위치 639에 티로신 잔기가 루신(Y639L)으로 변화된 돌연변이체 T7 RNA 폴리머라제가 기술되어 있다.
일반적으로, 본 발명에 개시된 조건하에서, Y693F 돌연변이체를 GTP를 제외한 모든 2'-OMe 치환된 NTP를 도입하기 위해 사용할 수 있고, Y639F/H784A, Y639F/H784A/K378R, Y639L/H784A, Y639L/H784A/K378R, Y639L, Y639L/K378R, P266L/Y639L/H784A 또는 P266L/Y639L/H784A/ K378R 돌연변이체 T7 RNA 폴리머라제는 2'-0Me GTP를 비롯한 모든 2'-OMe 치환된 NTP를 도입하기 위해 본 발명에서 개시하는 조건하에서 사용할 수 있다.
2'-변형된 올리고뉴클레오티드는 변형된 뉴클레오티드 서프셋을 이용하거나, 전체적으로 변형된 뉴클레오티드로 합성할 수 있다. 변형은 동일하거나 상이할 수 있다. 일부 또는 전부의 올리고뉴클레오티드를 변형할 수 있고, 변형된 것들은 동일한 변형을 함유할 수 있다. 일부 또는 전부의 뉴클레오티드가 변형될 수 있고, 변형된 것들은 상이한 변형을 가질 수 있으며, 예를 들어, 동일한 염기를 포함하는 모든 뉴클레오티드가 하나의 유형의 변형을 가질 수 있고, 또 한편으로 다른 염기들을 함유하는 뉴클레오티드가 상이한 유형의 변형을 가질 수 있다. 모든 퓨린 뉴클레오티드는 한 유형의 변형(또는 비변형)을 가질 수 있으며, 그에 반해 모든 피리미딘 뉴클레오티드는 또 다른, 상이한 유형의 변형(또는 비변형)을 가질 수 있다. 이러한 방식으로, 전사체 또는 전사체 풀은 예를 들어, 리보뉴클레오티드(2'-OH), 데옥시리보뉴클레오티드(2'-데옥시), 2'-아민 뉴클레오티드(2'-NH2), 2'-플루오로 뉴클레오티드(2'-F) 및 2'-O-메틸(2'-OMe) 뉴클레오티드를 포함하는 변형의 임의 조합을 이용하여 생성한다. 2'-OH A 및 G 및 2'-F C 및 U를 함유하는 전사 혼합물은 "rRfY" 혼합물이라고 하고, 이로부터 선별된 앱타머는 "rRfY" 앱타머라고 한다. 데옥시 A 및 G 및 2'-OMe U 및 C를 함유하는 전사 혼합물을 "dRmY" 혼합물이라고 하며 이로부터 선별된 앱타머를 "dRmY" 앱타머라고 한다. 2'-OMe A, C 및 U, 및 2'-OH G를 함유하는 전사 혼합물을 "rGmH" 혼합물이라고 하고 이로부터 선별된 앱타머를 "rGmH" 앱타머라고 한다. 대안적으로 2'-OMe A, C, U 및 G 및 2'-OMe A, U 및 C 및 2'-F G를 함유하는 전사 혼합물은 "대체 혼합물"이라고 하고 및 이로부터 선택된 앱타머는 "대체 혼합물" 앱타머라고 한다. 2'-OMe A, U, C 및 G를 함유하는 전사 혼합물로서, 여기서 G'의 최대 10%는 "r/mGmH" 혼합물이라고 하고 이로부터 선택된 앱타머는 "r/mGmH" 앱타머라고 한다. 2'-OMe A, U 및 C, 및 2'-F G를 함유하는 전사 혼합물은 "fGmH" 혼합물이라 하고 이로부터 선택된 앱타머는 "fGmH" 앱타머라고 한다. 2'-OMe A, U 및 C, 및 데옥시 G를 함유하는 전사 혼합물을 "dGmH" 혼합물이라고 하고 이로부터 선택된 앱타머는 "dGmH" 앱타머라고 한다. 데옥시 A, 및 2'-OMe C, G 및 U를 함유하는 전사 혼합물은 "dAmB" 혼합물이라고 하고 이로부터 선택된 앱타머는 "dAmB" 앱타머라고 하며, 모두 2'-0H 뉴클레오티드를 함유하는 전사 혼합물은 "rN" 혼합물이라고 하고 이로부터 선택된 앱타머는 "rN", "rRrY" 또는 "RNA" 앱타머라고 한다. 2'-0H 아데노신 트리포스페이트 및 구아노신 트리포스페이트 및 데옥시 시티딘 트리포스페이트 및 티미딘 트리포스페이트를 함유하는 전사 혼합물은 rRdY 혼합물이라하고 이로부터 선별된 앱타머는 "rRdY" 앱타머라고 한다. "MNA" 앱타머라고도 하는 "mRmY"는 또한 2'-OH 구아노신 또는 임의 야생형 구아노신인 출발 뉴클레오티드를 제외하고는 2'-O-메틸 뉴클레오티드를 함유하는 것이고, 가능하다면 2'-OMe G로 임의 2'-OH G의 포스트-SELEX™ 치환한 r/mGmH로부터 유도시킬 수 있다. 다르게는, mRmY 앱타머는 mRmY SELEX™을 통해서 동정할 수 있다.
바람직한 구체예는 2'-OH, 2'-데옥시 및 2'-OMe 뉴클레오티드의 임의 조합을 포함한다. 보다 바람직한 구체예는 2'-데옥시 및 2'-OMe 뉴클레오티드의 임의 조합을 포함한다. 보다 더욱 바람직한 구체예는 피리미딘이 2'-OMe(예컨대, dRmY, mRmY 또는 dGmH)인 2'-데옥시 및 2'-OMe 뉴클레오티드의 임의 조합이다.
본 발명의 앱타머에 변형 뉴클레오티드의 도입은 선별 과정전(프리)(예를 들어, 프리-SELEX™ 방법 변형)에 수행한다. 선택적으로, 프리-SELEX™ 방법 변형으로 변형 뉴클레오티드를 도입한 본 발명의 앱타머는 포스트-SELEX™ 변형 방법(즉, SELEX™ 이후 포스트-SELEX™ 방법 변형)에 의해 추가로 변형시킬 수 있다. 프리-SELEX™ 방법 변형은 SELEX™ 표적에 대한 특이성 및 또한 개선된 생체 내 안정성을 갖는 변형 핵산 리간드를 생성시킨다. 포스트-SELEX™ 방법 변형에서, 즉 변형(예를 들어, 프리-SELEX™ 방법 변형에 의해 도입된 뉴클레오티드를 갖는 사전에 동정된 리간드의 절두, 결실, 치환 또는 추가 뉴클레오티드 변형 등)은 프리-SELEX™ 방법 변형으로 도입된 뉴클레오티드를 갖는 핵산 리간드의 결합능에 역효과를 주지않으면서 생체내 안정성을 추가로 개선시킬 수 있다.
폴리머라제가 2'-변형된 NTP를 수용하는 조건에서 2'-변형(예를 들어, 2'-OMe) RNA 전사체 풀을 생성하기 위해서, Y693F, Y693F/ K378R, Y693F/H784A, Y693F/H784A/K378R, Y693L/H784A, Y693L/H784A/K378R, Y639L, Y639L/K378R, P266L/Y639L/H784A 및 P266L/Y639L/H784A/ K378R 돌연변이체 T7 RNA 폴리머라제를 모두 사용할 수 있다. 다른 T7 RNA 폴리머라제, 구체적으로 벌키 2'-치환기에 대해 높은 내성을 나타내는 폴리머라제를 또한 본 발명에서 사용할 수 있다. 본 발명에서 기술한 조건을 사용하여 주형-지정된 중합법에서 사용하는 경우, Y639L/H784A, Y639L/H784A/K378R, P266I/Y639L/H784A 또는 P266L/Y639L/H784A/K378R 돌연변이체T7 RNA 폴리머라제를, Y639F, Y639F/K378R, Y639F/H784A, Y639F/H784A/K378R, Y639L, Y639L/K378R 돌연변이체 T7 RNA 폴리머라제를 사용하여 얻게되는 것보다 높은 전사체 수율로, 2'-OMe GTP를 포함하여, 모든 2'-OMe NTP를 도입하기 위해 사용할 수 있다. Y639L/H784A, Y639L/H784A/K378R, P266L/Y639L/H784A 및 P266L/Y639L/H784A/ K378R 돌연변이체 T7 RNA 폴리머라제는 2'-변형, 예를 들어, 2'-OMe 함유 올리고뉴클레오티드를 높은 수율로 얻기 위해서 2'-OH GTP를 필요로하지는 않지만, 사용할 수 있다.
다른 폴리머라제, 구체적으로 벌키 2'-치환기에 대해 높은 내성을 나타내는 것을 본 발명에서 또한 사용할 수 있다. 이러한 폴리머라제는 본 발명에서 개시하는 전사 조건하에서 변형 뉴클레오티드를 도입하는 이들의 능력을 분석하여 그 역량을 스크리닝할 수 있다.
본 발명에서 개시한 방법에서 유용한 전사 조건에 중요한 다수의 인자를 결정하였다. 예를 들어, DNA 전자 주형의 5'-말단에서 고정 서열에 도입된 리더 서열은 예를 들어, 하기에 기술하는 dRmY 또는 r/mGmH 전사 조건하에서, Y639F/K378R 또는 Y639F/H784A/K378R 돌연변이체 T7 RNA 폴리머라제를 사용하는 경우 변형 전사체의 수율을 증가시키기 위해 중요할 수 있다. 추가적으로, 리더 서열은 반드시 필요한 것은 아니지만 예를 들어, 하기에 기술한 mRmY 전사 조건하에서 Y639L/H784A 또는 Y639L/H784A/K378R 돌연변이체 T7 RNA 폴리머라제를 전사용으로 사용하는 경우 변형 전사체의 수율을 증가시키기 위해 사용할 수 있다. 리더 서열은 전형적으로 6∼15 뉴클레오티드 길이이고, 모든 퓨린으로 구성되거나 또는 퓨린 및 피리미딘 뉴클레오티드의 혼합물로 구성될 수 있다.
변형 뉴클레오티드가 도입된 전사체를 얻기 위해 중요한 다른 인자는 2'-OH(예를 들어, GMP, GTP 또는 다른 비-2'-OMe 비-트리포스페이트)의 존재 및 농도이다. 전사는 2기로 나뉠 수 있다. 제1 기는 개시로서, 이 동안 NTP가 GTP(또는 GMP, 또는 다른 비-2'-OMe 비-트리포스페이트)의 3'-히드록실 말단에 첨가되어서 디뉴클레오티드가 생성되고 이어서 약 10 내지 12 뉴클레오티드만큼 확장된다. 제2기는 연장으로서, 이 동안 약 10 내지 12 뉴클레오티드의 제1 첨가 이상으로 진행된다. 과량의 2'-OMe GTP를 함유하는 전사 혼합물에 첨가된 소량의 2'-OH GTP(또는 GMP 또는 다른 비-2'-OMe 비-트리포스페이트)는 폴리머라제가 2'-OH GTP(또는 GMP 또는 다른 비-2'-OMe 비-트리포스페이트)를 이용하여 전사를 개시할 수 있는데 충분하다는 것이 확인되었다. 따라서, 예를 들어 dRmY 전사 혼합물(데옥시 퓨린 및 2'-OMe 피리미딘 함유)은 폴리머라제가 전사를 개시할 수 있도록 소량의 GMP를 첨가하는 것이 필요한 반면, r/mGmH 전사 혼합물(최대 10% 2'-OH GTP 함유)에서는, 2'-OH GTP가 이미 전사 혼합물에 존재하기 때문에, 소량의 GMP를 전사 혼합물에 첨가할 수는 있지만 폴리머라제가 전사를 개시하기 위해 필요한 것은 아니다. 전사가 연장기에 들어가면, 2'-OMe와 2'-OH GTP 간의 구별이 감소하고, 2'-OH GTP에 비해 과량인 2'-OMe GTP에 의해 주로 2'-OMe GTP의 도입이 가능하다.
상기에 바로 언급한 바와 같이, 2'-OH 구아노신(예를 들어, GMP, GTP 또는 다른 비-2'-OMe 비-트리포스페이트)을 이용하여 전사가 시작되는 것이 중요하다. 이러한 영향은 개시 뉴클레오티드에 대한 폴리머라제의 특이성에 의한 것이다. 그 결과, 이러한 방색으로 생성된 임의 전사체의 5'-말단 뉴클레오티드는 2'-OH G일 수 있다. GMP의 바람직한 농도는 0.5 mM이고 보다 더욱 바람직하게는 1 mM이다. 변형 뉴클레오티드의 도입을 최대화하기 위해서 전사 반응에 PEG, 바람직하게는 PEG-8000을 포함시키는 것이 유용하다는 것을 또한 확인하였다.
전사체에 2'-OMe 치환된 뉴클레오티드를 도입하는데 중요한 또 다른 인자는 전사 혼합물에 2가의 마그네슘 및 망간 둘을 사용하는 것이다. 염화마그네슘 및 염화망간 농도의 상이한 조합은 2'-O-메틸화 전사체의 수율에 영향을 주는 것으로 확인되었는데, 염화마그네슘 및 염화망간의 최적 농도는 2가 금속 이온과 착체를 형성하는 NTP의 전사 반응 혼합물 중 농도에 따라 좌우된다. 모든 2'-O-메틸화 전사체(즉, 모든 2'-OMe, A, C 및 U 및 약 90%의 G 뉴클레오티드)를 최대 수율로 얻기 위해서, 각 NTP가 0.5 mM의 농도로 존재할 경우에 대략 5 mM의 염화마그네슘 및 1.5 mM의 염화망간 농도가 바람직하다. 각 NTP 농도가 1.0 mM인 경우, 대략 6.5 mM 염화마그네슘 및 2.0 mN 염화망간 농도가 바람직하다. 각 NTP 농도가 2.0 mM인 경우, 대략 9.6 mM 염화마그네슘 및 2.9 mM 염화망간 농도가 바람직하다. 임의 경우에서, 최대 2배 농도를 넘는 경우에도 상당한 양의 변형 전사체를 얻는다.
일 구체예에서, GMP 또는 구아노신을 이용하여 전사를 개시하는 것이 이롭다. 이러한 영향은 개시 뉴클레오티드에 대한 폴리머라제의 특이성에 의한 것이다. 그 결과, 이러한 방식으로 생성된 임의 전사체의 5'-말단 뉴클레오티드는 2'-OH G일 수 있다. GMP(또는 구아노신)의 바람직한 농도는 0.5 mM이고 보다 바람직하게는 1 mM이다. 변형 뉴클레오티드의 도입을 최대화하기 위해서 전사 반응물에 PEG, 바람직하게는 PEG-8000를 포함시키는 것이 유용하다는 것을 또한 확인하였다.
전사체에 2'-OMe ATP(100%), UTP(100%), CTP(100%) 및 GTP(∼90%)("r/mGmH")를 최대로 도입하기 위해서는 하기의 조건이 바람직하다: HEPES 완충액 200 mM, DTT 40 mM, 스퍼미딘 2 mM, PEG-8000 10%(w/v), Triton X-100 0.01%(w/v), MgCl2 5 mM(6.5 mM, 여기서 각 2'-OMe NTP의 농도는 1.0 mM임), MnCl2 1.5 mM(2.0 mM, 여기서 각 2'-0Me NTP의 농도는 1.0 mM이다), 2'-OMe NTP(개별) 500 μM(보다 바람직하게는, 1.0 mM), 2'-OH GTP 30 μM, 2'-OH GMP 500 μM, pH 7.5, Y639F/H784A T7 RNA 폴리머라제 15 유닛/mL, 무기 파이로포스파타제 5 유닛/mL, 및 8 뉴클레오티드 이상의 길이인 모두 퓨린인 리더 서열. 본 발명에서 사용하는, Y639F/H784A 돌연변이체 T7 RNA 폴리머라제(또는 본 발명에서 특정한 임의 다른 돌연변이체 T7 RNA 폴리머라제)의 1 유닛은 r/mGmH 조건하에서 전사체에 1 nmole의 2'-OMe NTP를 도입하는데 필요한 효소의 양으로서 정의한다. 여기서 사용되는, 무기 파이로포스파타제 1 유닛은 pH 7.2 및 25℃에서 1분당 무기 오르쏘포스페이트 1.0 mole을 유리시키는 효소의 양으로서 정의한다.
전사체에 2'-OH GTP 및 2'-0Me ATP, UTP 및 CTP("rGmH")를 최대로 도입(100%)하기 위해서, 다음의 조건이 바람직하다: HEPES 완충액 200 mM, DTT 40 mM, 스퍼미딘 2 mM, PEG-8000 10%(w/v), Triton X-100 0.01%(w/v), MgCl2 5 mM (9.6 mM, 여기서 각 NTP의 농도는 2.0 mM임), MnCl2 1.5 mM(2.9 mM, 여기서 각 NTP의 농도는 2.0 mM), NTP(각각) 500 μM(보다 바람직하게는 2.0 mM), 2'-OH GMP 1 mM, pH 7.5, Y639F/K378R T7 RNA 폴리머라제 200 nM, 무기 파이로포스파타제 5 유닛/mL, 및 8 뉴클레오티드 이상 길이의 모두 퓨린인 리더 서열.
전사체에 2'-0Me ATP(100%), 2'-OMe UTP(100%), 2'-OMe CTP(100%) 및 2'-OMe GTP(100%)("mRmY" 또는 "MNA")를 최대 도입하기 위해서, 다음의 조건이 바람직하다: HEPES 완충액 200 mM, DTT 40 mM, 스퍼미딘 2 mM, PEG-8000 10%(w/v), Triton X-100 0.01%(w/v), MgCl2 8 mM, MnCl2 2.5 mM, 2'-OMe NTP(각각) 1.5 mM, 2'-OH GMP 1 mM, pH 7.5, Y639L/H784A/K378R 돌인변이체 T7 RNA 폴리머라제 20OnM, 무기 파이로포스파타제 5 유닛/mL, 및 유도된 전사 조건하에서 전사 수율을 증가시키는 선택적인 리더 서열. 일 구체예에서, 선택적인 리더 서열은 모두 퓨린인 리더 서열이다. 다른 구체예에서, 선택적인 리더 서열은 퓨린과 피리미딘의 혼합물이다.
전사체에 2'-OH ATP 및 GTP, 및 2'-OMe UTP 및 CTP("rRmY")의 최대 도입(100%)을 위해서, 하기 조건이 바람직하다: HEPES 완충액 200 mM, DTT 40 mM, 스퍼미딘 2 mM, PEG-8000 10%(w/v), Triton X-100 0.01%(w/v), MgCl2 5 mM(9.6 mM, 여기서 각 NTP의 농도는 2.0 mM임), MnC12 1.5 mM(2.9 mM, 여기서 각 NTP의 농도는 2.0 mM임), NTP(각각) 500μM(보다 바람직하게, 2.0 mM), 2'-OH GMP 1 mM, pH 7.5, Y639F/H784A/K378R T7 RNA 폴리머라제 200 nM, 무기 파이로포스파타제 5 유닛/mL, 및 8 뉴클레오티드 길이 이상의 모두 퓨린인 리더 서열.
전사체에 2'-OMe ATP, UTP 및 CTP("rGmH")의 최대 도입(100%)을 위해서, 하기의 조건이 바람직하다: HEPES 완충액 200 mM, DTT 40 mM, 스퍼미딘 2 mM, PEG-8000 10%(w/v), Triton X-100 0.01%(w/v), MgCl2 5 mM(9.6 mM, 각각의 2'-OMe NTP의 농도는 2.0 mM임), MnCl2 1.5 mM(2.9 mM, 각각의 2'-OMe NTP의 농도는 2.0 mM임), 2'-OMe NTP(각각) 500 μM(보다 바람직하게, 2.0 mM), pH 7.5, Y639F T7 RNA 폴리머라제 15 유닛/mL, 무기 파이로포스파타제 5 유닛/mL, 및 8 뉴클레오티드 길이 이상의 모두 퓨린인 리더 서열.
전사체로 2'-OMe UTP 및 CTP("rRmY")의 최대 도입(100%)을 위해서, 하기의 조건이 바람직하다: HEPES 완충액 200 mM, DTT 40 mM, 스퍼미딘 2 mM, PEG-8000 10%(w/v), Triton X-100 0.01%(w/v), MgCl2 5 mM(9.6 mM, 여기서 각 2'-OMe NTP의 농도는 2.0 mM임), MnCl2 1.5 mM(2.9 mM, 여기서 각 2'-OMe NTP의 농도는 2.0 mM임), 2'-OMe NTP(각각) 500μM(보다 바람직하게, 2.0 mM), pH 7.5, Y639F/H784A T7 RNA 폴리머라제 15 유닛/mL, 무기 파이로포스파타제 5 유닛/mL, 및 8 뉴클레오티드 길이 이상의 모두 퓨린인 리더 서열.
전사체로 데옥시 ATP 및 GTP 및 2'-OMe UTP 및 CTP("dRmY")의 최대 도입(100%)을 위해서, 하기 조건이 바람직하다: HEPES 완충액 200 mM, DTT 40 mM, 스퍼민 2 mM, 스퍼미딘 2 mM, PEG-8000 10%(w/v), Triton X-100 0.01%(w/v), MgCl2 9.6 mM, MnCl2 2.9 mM, NTP(각각) 2.0 mM, 2'-OH GMP 1 mM, pH 7.5, Y639F/K3787R T7 RNA 폴리머라제 200 nM, 무기 파이로포스파타제 5 유닛/mL, 및 8 뉴클레오티드 길이 이상의 모두 퓨린인 리더 서열.
전사체로 2'-OMe ATP, UTP 및 CTP 및 2'-F GTP("fGmH")의 최대 도입(100%)을 위해서, 하기의 조건의 바람직하다: HEPES 완충액 200 mM, DTT 40 mM, 스퍼미딘 2 mM, PEG-8000 10%(w/v), Triton X-100 0.01%(w/v), MgCl2 9.6 mM, MnCl2 2.9 mM, 2'-OMe NTP(각각) 2.0 mM, 2'-OH GMP 1 mM, pH 7.5, Y639F/K378R T7 RNA 폴리머라제 20OnM, 무기 파이로포스파타제 5 유닛/mL, 및 8 뉴클레오티드 길이 이상의 모두 퓨린인 리더 서열.
전사체로 데옥시 ATP 및 2'-OMe UTP, GTP 및 CTP("dAmB")의 최대 도입(100%)을 위해서, 하기의 조건이 바람직하다: HEPES 완충액 200 mM, DTT 40 mM, 스퍼미딘 2 mM, PEG-8000 10%(w/v), Triton X-100 0.01%(w/v), MgCl2 9.6 mM, MnCl2 2.9 mM, NTP(각각) 2.0 mM, 2'-OH GMP 1 mM, pH 7.5, Y639F/K378R T7 RNA 폴리머라제 20OnM, 무기 파이로포스파타제 5 유닛/mL, 및 8 뉴클레오티드 길이 이상의 모두 퓨린인 리더 서열.
상기 각각에 있어서, (a) 전사는 바람직하게 약 20℃∼약 50℃, 바람직하게는 약 30℃∼45℃, 보다 바람직하게는 약 37℃의 온도에서 2시간 이상의 기간 동안 수행하고, (b) 이중 가닥 DNA 전사 주형은 50∼300 nM를 사용하며(200 nM 주형을 1 라운드에서 사용하여 다양성을 증가시킴(300 nM 주형은 dRmY 전사에 사용함)), 후속 라운드 동안, 본 발명에서 기술한 조건을 이용하는 최적 PCR 반응의 1/10 희석물, 대략 50 nM을 사용한다). 바람직한 DNA 전사 주형은 하기에 기술하였다(여기서, ARC254 및 ARC256은 모두 2'-OMe 조건하에서 전사하고 ARC255는 rRmY 조건하에서 전사한다).
ARC 254 (서열 번호 99)
5'CATCGATGCTAGTCGTAACGATCCNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCGAGAACGTTCTCTCCTCTCCCTATAGTGAGTCGTATTA-3'
ARC 255 (서열 번호 100)
5'CATGCATCGCGACTGACTAGCCGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGTAGAACGTTCTCTCCTCTCCCTATAGTGAGTCGTATTA-3'
ARC 256 (서열 번호 101)
5'CATCGATCGATCGATCGACAGCGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGTAGAACGTTCTCTCCTCTCCCTATAGTGAGTCGTATTA-3'
rN 전사 조건 하에서, 전사 반응 혼합물은 2'-OH 아데노신 트리포스페이트(ATP), 2'-OH 구아노신 트리포스페이트(GTP), 2'-OH 시티딘 트리포스페이트 (CTP) 및 2'-OH 우리딘 트리포스페이트(UTP)를 포함한다. 본 발명의 rN 전사 혼합물을 이용하여 생성된 변형 올리고뉴클레오티드는 실질적으로 모든 2'-OH 아데노신, 2'-OH 구아노신, 2'-OH 시티딘 및 2'-OH 우리딘을 포함한다. rN 전사의 바람직한 구체예에서, 얻어진 변형 올리고뉴클레오티드는 모든 아데노신 뉴클레오티드의 80% 이상이 2'-OH 아데노신이고, 모든 구아노신 뉴클레오티드의 80% 이상이 2'-OH 구아노신이며, 모든 시티딘 뉴클레오티드의 80% 이상이 2'-OH 시티딘이며, 모든 우리딘 뉴클레오티드의 80% 이상이 2'-OH 우리딘인 서열을 포함한다. rN 전사의 보다 바람직한 구체예에서, 본 발명의 얻어진 변형 올리고뉴클레오티드는 모든 아데노신 뉴클레오티드의 90% 이상이 2'-OH 아데노신이고, 모든 구아노신 뉴클레오티드의 90% 이상이 2'-OH 구아노신이며, 모든 시티딘 뉴클레오티드의 90% 이상이 2'-OH 시티딘이고, 모든 우리딘 뉴클레오티드의 90% 이상이 2'-OH 우리딘인 서열을 포함한다. rN 전사의 가장 바람직한 구체예에서, 본 발명의 변형 올리고뉴클레오티드는 모든 아데노신 뉴클레오티드의 100%가 2'-OH 아데노신이고, 모든 구아노신 뉴클레오티드의 100%가 2'-OH 구아노신이며, 모든 시티딘 뉴클레오티드의 100%가 2'-OH 시티딘이고, 모든 우리딘 뉴클레오티드의 100%가 2'-OH 우리딘인 서열을 포함한다.
rRmY 전사 조건 하에서, 전사 반응 혼합물은 2'-OH 아데노신 트리포스페이트, 2'-OH 구아노신 트리포스페이트, 2'-OMe 시티딘 트리포스페이트 및 2'-OMe 우리딘 트리포스페이트를 포함한다. 본 발명의 rRmY 전사 혼합물을 이용하여 생성된 변형 올리고뉴클레오티드는 실질적으로 모든 2'-OH 아데노신, 2'-OH 구아노신, 2'-0Me 시티딘 및 2'-OMe 우리딘을 포함한다. 바람직한 구체예에서, 얻어진 변형 올리고뉴클레오티드는 모든 아데노신 뉴클레오티드의 80% 이상이 2'-OH 아데노신이고, 모든 구아노신 뉴클레오티드의 80% 이상이 2'-OH 구아노신이며, 모든 시티딘 뉴클레오티드의 80%가 2'-OMe 시티딘이고, 모든 우리딘 뉴클레오티드의 80% 이상이 2'-OMe 우리딘인 서열을 포함한다. 보다 바람직한 구체예예서, 얻어진 변형 올리고뉴클레오티드는 모든 아데노신 뉴클레오티드의 90% 이상이 2'-OH 아데노신이고, 모든 구아노신 뉴클레오티드의 90% 이상이 2'-OH 구아노신이며, 모든 시티딘 뉴클레오티드의 90% 이상이 2'-OMe 시티딘이고, 모든 우리딘 뉴클레오티드의 90% 이상이 2'-OMe 우리딘인 서열을 포함한다. 가장 바람직한 구체예예서, 얻어진 변형 올리고뉴클레오티드는 모든 아데노신 뉴클레오티드의 100%가 2'-OH 아데노신이고, 모든 구아노신 뉴클레오티드의 100%가 2'-OH 구아노신이며, 모든 시티딘 뉴클레오티드의 100%가 2'-0Me 시티딘이며, 모든 우리딘 뉴클레오티드의 100%가 2'-0Me 우리딘인 서열을 포함한다.
dRmY 전사 조건하에서, 전사 반응 혼합물은 2'-데옥시 아데노신 트리포스페이트, 2'-데옥시 구아노신 트리포스페이트, 2'-O-메틸 시티딘 트리포스페이트 및 2'-O-메틸 우리딘 트리포스페이트를 포함한다. 본 발명의 dRmY 전사 조건을 이용하여 생성된 변형 올리고뉴클레오티드는 실질적으로 모든 2'-데옥시 아데노신, 2'-데옥시 구아노신, 2'-O-메틸 시티딘 및 2'-O-메틸 우리딘을 포함한다. 바람직한 구체예에서, 본 발명에서 얻어진 변형 올리고뉴클레오티드는 모든 아데노신 뉴클레오티드의 80% 이상이 2'-데옥시 아데노신이고, 모든 구아노신 뉴클레오티드의 80% 이상이 2'-데옥시 구아노신이며, 모든 시티딘 뉴클레오티드의 80% 이상이 2'-O-메틸 시티딘이고, 모든 우리딘 뉴클레오티드의 80% 이상이 2'-O-메틸 우리딘인 서열을 포함한다. 보다 바람직한 구체예에서, 본 발명에서 얻어진 변형 올리고뉴클레오티드는 모든 아데노신 뉴클레오티드의 90% 이상이 2'-데옥시 아데노신이고, 모든 구아노신 뉴클레오티드의 90% 이상이 2'-데옥시 구아노신이며, 모든 시티딘 뉴클레오티드의 90% 이상이 2'-O-메틸 시티딘이고, 모든 우리딘 뉴클레오티드의 90% 이상이 2'-O-메틸 우리딘인 서열을 포함한다. 본 발명에서 얻어진 변형 올리고뉴클레오티드는 모든 아데노신 뉴클레오티드의 100%가 2'-데옥시 아데노신이고, 모든 구아노신 뉴클레오티드의 100%가 2'-데옥시 구아노신이며, 모든 시티딘 뉴클레오티드의 100%가 2'-O-메틸 시티딘이고, 모든 우리딘 뉴클레오티드의 100%가 2'-O-메틸 우리딘인 서열을 포함한다.
rGmH 전사 조건 하에서, 전사 반응 혼합물은 2'-OH 구아노신 트리포스페이트, 2'-OMe 시티딘 트리포스페이트, 2'-OMe 우리딘 트리포스페이트 및 2'-0Me 아데노신 트리포스페이트를 포함한다. 본 발명의 rGmH 전사 혼합물을 이용하여 생성된 변형 올리고뉴클레오티드는 실질적으로 모든 2'-OH 구아노신, 2'-OMe 시티딘, 2'-OMe 우리딘 및 2'-OMe 아데노신을 포함한다. 바람직한 구체에에서, 얻어진 변형 올리고뉴클레오티드는 모든 구아노신 뉴클레오티드의 80% 이상이 2'-OH 구아노신이고, 모든 시티딘 뉴클레오티드의 80% 이상이 2'-OMe 시티딘이며, 모든 우리딘 뉴클레오티드의 80% 이상이 2'-OMe 우리딘이고, 모든 아데노신 뉴클레오티드의 80% 이상이 2'-OMe 아데노신인 서열을 포함한다. 보다 바람직한 구체예에서, 얻어진 변형올리고뉴클레오티드는 모든 구아노신 뉴클레오티드의 90% 이상이 2'-OH 구아노신이고, 모든 시티딘 뉴클레오티드의 90% 이상이 2'-0Me 시티딘이며, 모든 우리딘 뉴클레오티드의 90% 이상이 2'-0Me 우리딘이고, 모든 아데노신 뉴클레오티드의 90% 이상이 2'-OMe 아데노신인 서열을 포함한다. 가장 바람직한 구체예에서, 얻어진 변형 올리고뉴클레오티드는 모든 구아노신 뉴클레오티드의 100%가 2'-OH 구아노신이고, 모든 시티딘 뉴클레오티드의 100%가 2'-OMe 시티딘이며, 모든 우리딘 뉴클레오티드의 100%가 2'-OMe 우리딘이고, 모든 아데노신 뉴클레오티드의 100%가 2'-O-메틸 아데노신인 서열을 포함한다.
r/mGmH 전사 조건 하에서, 전사 반응 혼합물은 2'-O-메틸 아데노신 트리포스페이트, 2'-O-메틸 시티딘 트리포스페이트, 2'-O-메틸 구아노신 트리포스페이트, 2'-O-메틸 우리딘 트리포스페이트 및 2'-OH 구아노신 트리포스페이트를 포함한다. 본 발명의 r/mGmH 전사 혼합물을 이용하여 생성된 최종 변형 올리고뉴클레오티드는 실질적으로 모든 2'-O-메틸 아데노신, 2'-O-메틸 시티딘, 2'-O-메틸 구아노신 및 2'-O-메틸 우리딘을 포함하고, 여기서 구아노신 뉴클레오티드 집단은 최대 약 10% 2'-OH 구아노신을 갖는다. 바람직한 구체예에서, 본 발명에서 얻어진 r/mGmH 변형 올리고뉴클레오티드는 모든 아데노신 뉴클레오티드의 80% 이상이 2'-O-메틸 아데노신이고, 모든 시티딘 뉴클레오티드의 80% 이상이 2'-O-메틸 시티딘이며, 모든 구아노신 뉴클레오티드의 80% 이상이 2'-O-메틸 구아노신이고, 모든 우리딘 뉴클레오티드의 80% 이상이 2'-O-메틸 우리딘이며, 모든 구아노신 뉴클레오티드 중 10% 이하가 2'-OH 구아노신인 서열을 포함한다. 보다 바람직한 구체예에서, 얻어진 변형 올리고뉴클레오티드는 모든 아데노신 뉴클레오티드의 90% 이상이 2'-O-메틸 아데노신이고, 모든 시티딘 뉴클레오티드의 90% 이상이 2'-O-메틸 시티딘이며, 모든 구아노신 뉴클레오티드의 90% 이상이 2'-O-메틸 구아노신이고, 모든 우리딘 뉴클레오티드의 90% 이상이 2'-O-메틸 우리딘이고 모든 구아노신 뉴클레오티드의 10% 이하가 2'-OH 구아노신인 서열을 포함한다. 가장 바람직한 구체예에서, 얻어진 변형 올리고뉴클레오티드는 모든 아데노신 뉴클레오티드의 100%가 2'-O-메틸 아데노신이고, 모든 시티딘 뉴클레오티드의 100%가 2'-O-메틸 시티딘이며, 모든 구아노신 뉴클레오티드의 90%가 2'-O-메틸 구아노신이며, 모든 우리딘 뉴클레오티드의 100%가 2'-O-메틸 우리딘이고, 모든 구아노신 뉴클레오티드의 약 10% 이하가 2'-OH 구아노신인 서열을 포함한다.
mRmY(또한, MNA라고도 함) 전사 조건하에서, 전사 혼합물은 단지 2'-O-메틸 아데노신 트리포스페이트, 2'-O-메틸 시티딘 트리포스페이트, 2'-O-메틸 구아노신 트리포스페이트, 2'-O-메틸 우리딘 트리포스페이트만을 포함한다. 본 발명의 mRmY 전사 혼합물을 이용하여 생성된 최종 변형 올리고뉴클레오티드는 모든 아데노신 뉴클레오티드의 100%가 2'-O-메틸 아데노신이고, 모든 시티딘 뉴클레오티드의 100%가 2'-O-메틸 시티딘이며, 모든 구아노신 뉴클레오티드의 100%가 2'-O-메틸 구아노신 (올리고뉴클레오티드의 제1 구아노신 제외)이며, 모든 우리딘 뉴클레오티드의 100%가 2'-O-메틸 우리딘인 서열을 포함한다.
fGmH 전사 조건하에서, 전사 반응 혼합물은 2'-O-메틸 아데노신 트리포스페이트, 2'-O-메틸 우리딘 트리포스페이트, 2'-O-메틸 시티딘 트리포스페이트 및 2'-F 구아노신 트리포스페이트를 포함한다. 본 발명의 fGmH 전사 조건을 이용하여 생성된 변형 올리고뉴클레오티드는 실질적으로 모든 2'-O-메틸 아데노신, 2/-O-메틸 우리딘, 2'-O-메틸 시티딘 및 2'-F 구아노신을 포함한다. 바람직한 구체예에서, 얻어진 변형 올리고뉴클레오티드는 모든 아데노신 뉴클레오티드의 80% 이상이 2'-O-메틸 아데노신이고, 모든 우리딘 뉴클레오티드의 80% 이상이 2'-O-메틸 우리딘이며, 모든 시티딘 뉴클레오티드의 80% 이상이 2'-O-메틸 시티딘이고, 모든 구아노신 뉴클레오티드의 80% 이상이 2'-F 구아노신인 서열을 포함한다. 보다 바람직한 구체예에서, 얻어진 변형 올리고뉴클레오티드는 모든 아데노신 뉴클레오티드의 90% 이상이 2'-O-메틸 아데노신이고, 모든 우리딘 뉴클레오티드의 90% 이상이 2'-O-메틸 우리딘이며, 모든 시티딘 뉴클레오티드의 90% 이상이 2'-O-메틸 시티딘이고, 모든 구아노신 뉴클레오티드의 90% 이상이 2'-F 구아노신인 서열을 포함한다. 가장 바람직한 구체예에서, 얻어진 최종 올리고뉴클레오티드는 모든 아데노신 뉴클레오티드의 100%가 2'-O-메틸 아데노신이고, 모든 우리딘 뉴클레오티드의 100%가 2'-O-메틸 우리딘이며, 모든 시티딘 뉴클레오티드의 100%가 2'-O-메틸 시티딘이고, 모든 구아노신 뉴클레오티드의 100%가 2'-F 구아노신인 서열을 포함한다.
dAmB 전사 조건하에서, 포스페이트, 2'-O-메틸 시티딘 트리포스페이트, 2/-O-메틸 구아노신 트리포스페이트, 및 2'-O-메틸 우리딘 트리포스페이트를 포함한다. 본 발명의 dAmB 전사 혼합물을 이용하여 생성된 변형 올리고뉴클레오티드는 실질적으로 모든 2'-데옥시 아데노신, 2'-O-메틸 시티딘, 2'-O-메틸 구아노신 및 2/-O-메틸 우리딘을 포함한다. 바람직한 구체예에서, 얻어진 변형 올리고뉴클레오티드는 모든 아데노신 뉴클레오티드의 80% 이상이 2'-데옥시 아데노신이고, 시티딘 뉴클레오티드의 80% 이상이 2/-O-메틸 시티딘이며, 모든 구아노신 뉴클레오티드의 80% 이상이 2'-O-메틸 구아노신이고, 모든 우리딘 뉴클레오티드의 80% 이상이 2'-O-메틸 우리딘인 서열을 포함한다. 보다 바람직한 구체예에서, 얻어진 변형 올리고뉴클레오티드는 모든 아데노신 뉴클레오티드의 90% 이상이 2'-데옥시 아데노신이고, 모든 시티딘 뉴클레오티드의 90% 이상이 2'-O-메틸 시티딘이며, 모든 구아노신 뉴클레오티드의 90% 이상이 2'-O-메틸 구아노신이고, 모든 우리딘 뉴클레오티드의 90% 이상이 2'-O-메틸 우리딘인 서열을 포함한다. 가장 바람직한 구체예에서, 본 발명에서 얻어진 변형 올리고뉴클레오티드는 모든 아데노신 뉴클레오티드의 100%가 2'-데옥시 아데노신이고, 모든 시티딘 뉴클레오티드의 100%가 2'-O-메틸 시티딘이며, 모든 구아노신 뉴클레오티드의 100%가 2'-O-메틸 구아노신이고, 모든 우리딘 뉴클레오티드의 100%가 2'-O-메틸 우리딘인 서열을 포함한다.
각 경우에서, 전사 생성물은 이후 주어진 표적에 대해 결합 특이성을 갖는 서열의 보존 부분을 결정하고/하거나 앱타머를 동정하기 위한 SELEX™ 방법의 라이브러리로서 사용될 수 있다. 얻어진 서열은 이미 안정하고, 상기 방법으로부터 안정화된 앱타머 서열을 얻기 위한 단계를 제거하여 그 결과 보다 안정성이 높은 앱타머를 얻게된다. 2'-0Me SELEX™ 방법의 다른 장점은 얻어진 서열이 서열에 요구되는 2'-OH 뉴클레오티드를 보다 소수로 갖거나, 가능한 갖지 않을 수 있다. 어느 정도 2'OH 뉴클레오티드가 남으며, 이들은 포스트-SELEX 변형을 통해 제거할 수 있다.
이하에 기술하는 바와 같이, 상기 기술한 최적 조건 이외의 조건하에서 2'-치환기가 완전하게 도입된 전사체의 보다 낮지만 여전히 유용한 수율을 달성할 수 있다. 예를 들어, 상기 전사 조건에 대한 별법은 다음을 포함한다:
HEPES 완충액 농도는 0 내지 1 M 범위일 수 있다. 본 발명은 또한, 예를 들어, 트리스(히드록시메틸)아미노메탄을 포함하는 pKa가 5 내지 10인 다른 완충제를 사용하는 것을 고려할 수도 있다.
DTT 농도는 0∼400 mM 범위일 수 있다. 본 발명의 방법은 또한 예를 들어, 머캅토에탄올을 포함하는, 다른 환원제를 이용할 수 있다.
스퍼미딘 및/스퍼민 농도는 0∼20 mM 범위일 수 있다.
PEG-8000 농도는 0∼50%(w/v)일 수 있다. 본 발명의 방법은 또한 예를 들어, 다른 분자량의 PEG 또는 다른 폴리알킬렌 글리콜을 포함하는 다른 친수성 중합체를 사용하는 것을 제공한다.
Triton X-100 농도는 0∼0.1%(w/v) 범위일 수 있다. 본 발명의 방법은 또한, Triton-X 세정제를 포함하여, 다른 비이온성 세정제를 사용하는 것을 제공한다.
MgCl2 농도는 0.5 mM∼50 mM 범위일 수 있다. MnCl2 농도는 0.15 mM∼15 mM 범위일 수 있다. MgCl2 및 MnCl2는 둘다 기술한 범위 내에 존재해야만하고, 바람직한 구체예에서 MgCl2:MnCl2의 비율이 약 10∼약 3이고, 바람직하게 이 비율은 약 3∼5:1이며, 보다 바람직하게, 비율은 약 3∼4:1로 존재한다.
2'-OMe NTP 농도(각각 NTP)는 5 μM∼5 mM일 수 있다.
2'-OH GTP 농도는 0 μM∼300 μM 범위일 수 있다. 일 구체예에서, 전사는 2'-OH GTP(0 μM)의 부재하에서 일어난다.
2' 당 위치 이외의 위치에서 구아노신 또는 다른 2'-OH G 치환된 2'-OH GMP의 농도는 0∼5 mM 범위일 수 있고, 여기서 일 구체예에서 2'-OH GTP는 반응 중에 포함되지 않고, 2'-OH GMP는 필요하며 이의 범위는 5μM∼5 mM 범위일 수 있다.
DNA 주형의 농도는 5 nM∼5 μM 범위일 수 있다.
돌연변이체 폴리머라제 농도는 2 nM∼20 μM 범위일 수 있다.
무기 파이로포스파타제는 0∼100 유닛/mL 범위일 수 있다.
pH는 pH 6∼pH 9의 범위일 수 있다. 본 발명의 방법은 변형 뉴클레오티드를 도입하는 대부분의 폴리머라제의 pH 범위 내에서 실시할 수 있다.
전사 반응은 약 1시간 내지 수주간, 바람직하게는 약 1시간 내지 약 24시간 동안 수행할 수 있다.
하기 실시예에서 기술한 생물학적 분석법으로 검증된 최고의 친화성 및 특이적 결합성을 갖는 것으로 선별된 앱타머는 C5 보체 단백질이 병인에 관여하는 병태를 치료하기 위한 치료제로서 적합하다.
앱타머 의약화학
목적 표적에 결합한 앱타머를 동정하면, 몇몇 기술을 선택적으로 수행하여 동정된 앱타머 서열의 기능적 특징 및/또는 결합성을 추가로 증가시킬 수 있다. SELEX™ 방법(2'-변형 SELEX™)을 통해서 동정된 목적 표적에 결합하는 앱타머는 선택적으로 절두시켜서 목적하는 결합 및/또는 기능적 특징을 갖는 최소 앱타머 서열(또한, "최소화 구성체"라고도 함)을 얻을 수 있다. 이를 수행하기 위한 방법 중 하나는 최소화 구성체의 디자인에 대한 정보를 알기위해 폴딩 프로그램 및 서열 분석법(예를 들어, 보존 부분 및/또는 공변이를 찾기 위해 선별물로부터 얻은 클론 서열의 정렬화 등)을 이용하는 것이다. 생화학적 규명 실험을 또한 실시하여서 최소화 구성체에 대한 정보를 얻기 위해 앱타머 서열의 5' 및 3' 경계를 결정할 수 있다. 최소화 구성체는 이어 화학적으로 합성하고 이들이 유도된 비최소화 서열과 비교하여 결합 및 기능 특징에 대해 시험한다. 일련의 5', 3' 및/또는 내부 결실을 함유하는 앱타머 서열의 변이체를 또한 직접 화학적으로 합성하고 이들의 유도된 비최소화 앱타머 서열과 비교하여 결합 및/또는 기능적 특징을 시험할 수 있다.
추가적으로, 도핑 재선별법을 이용하여 단일 활성 앱타머 서열(즉, SELEX™ 방법(2'-변형 SELEX™ 포함)을 통해 동정된 목적 표적에 결합하는 앱타머), 또는 단일 최소화 앱타머 서열 내에서 서열 필요조건을 확인할 수 있다. 도핑 재선별법은 목적하는 단일 서열을 기초로 디자인된 합성된, 축퇴형 풀을 이용하여 수행한다. 축퇴성 정도는 일반적으로 야생형 뉴클레오티드, 즉 목적하는 단일 서열에서 70% 내지 85% 정도로 다양하다. 일반적으로, 중성 돌연변이를 갖는 서열은 도핑 재선별법으로 동정되지만, 일부 경우에서 서열 변화는 친화성을 개선시킬 수 있다. 도핑 재선별법을 이용하여 동정된 클론에서 얻은 복합 서열 정보를 사용하여 최소 결합 부분을 확인하고 최적 성과에 도움이 될 수 있다.
SELEX™ 방법(2'-변형 SELEX 및 도핑 재선별법 포함)을 이용하여 동정되고/되거나 앱타머 서열을 최소화한 앱타머 서열을 또한 결합 친화성 및/또는 기능적 특징을 증가시키기 위해 서열의 직접 또는 무작위적 돌연변이화를 수행하기 위해서, 또는 다르게는 서열의 어느 위치가 결합 활성 및/또는 기능적 특징에 필수적인가를 결정하기 위해서 앱타머 의약화학을 이용하는 포스트 SELEX™로 선택적으로 최적화할 수 있다.
앱타머 의약 화학은 변이체 앱타머 세트를 화학적으로 합성하는 앱타머 개선법이다. 이러한 변이체 세트는 전형적으로 단일 치환기를 도입하여 모앱타머와는 상이하고, 이 치환기의 위치도 서로 상이하다. 이러한 변이체를 이후 상호 비교하고 모체와 비교한다. 특징의 개선은 단일 치환기의 도입이 특정 치료 기준을 얻기에 필수적인 모든 것이기에 충분할 정도로 그 정도가 양호할 수 있다.
다르게, 단일 변이체 세트에서 수집한 정보를 사용하여 하나 이상의 치환기가 동시에 도입된 변이체 세트를 추가로 디자인할 수 있다. 제1 디자인 과정에서, 모든 단일 치환기 변이체를 등급을 매기고, 상위 4개를 선택해서 이들 4 단일 치환기 변이체의 모든 가능한 이중(6), 삼중(4) 및 사중(1) 조합을 합성하고 분석한다. 제2 디자인 과정에서, 최선의 단일 치환기 변이체를 새로운 모체로서 고려하고 이러한 최고 등급 단일 치환기 변이체를 포함하는 모든 가능한 이중 치환기 변이체를 합성하고 분석한다. 다른 디자인 과정을 이용하여서, 이러한 과정을 반복적으로 적용하여 치환기 수를 점차적으로 증가시키는 한편 추가로 개선된 변이체를 계속 동정한다.
앱타머 의약 화학은 구체적으로 전체적이기 보다는 국지적인 치환기 도입을 조사하기 위한 방법으로서 사용된다. 앱타머는 전사에 의해 생성된 라이브러리 내에서 발견되므로, SELEX™ 방법 동안 도입된 임의 치환기가 전체적을 도입되어진다. 예를 들어, 뉴클레오티드 사이에 포스포로티오에이트 결합을 도입하고자 한다면, 이들은 단지 모든 A(또는 모든 G, C, T, U 등)에 도입된다(전체적으로 치환됨). 일부 A(또는 일부 G, C, T, U 등)에 포스포로티오에이트를 필요로하고(국지적 치환) 다른 A에는 이를 허용할 수 없는 앱타머는 이 방법으로는 쉽게 찾을 수가 없다.
앱타머 의학 화학에 의해 활용할 수 있는 종류의 치환기는 고상 합성 시약으로서 이들을 생성하고 올리고머 합성 과정에 이들을 도입할 수 있는 능력으로 한정되어진다. 이 방법은 단독 뉴클레오티드에만 제한되지 않는다. 앱타머 의학 약학 과정은 입체 벌크, 소수성, 친수성, 친지성, 소지성, 양전하, 음전하, 중성전하, 쯔위터이온, 극성, 뉴클레아제 내성, 입체 형태 강성, 입체 형태 연성, 단백질 결합 특성, 질량 등을 도입하는 치환기를 포함할 수 있다. 앱타머 의약 화학 과정은 염기 변형, 당 변형 또는 포스포디에스테르 결합 변형을 포함할 수 있다. 치료용 앱타머라는 관점에서 유용할 수 있는 종류의 치환기를 고려할 때, 하기 카테고리 중 하나 이상에 속하는 치환기를 도입하는 것이 바람직하다:
(1) 몸체에 이미 존재하는 치환기, 예를 들어 2'-데옥시, 2'-리보, 2'-O-메틸 퓨린 또는 피리미딘 또는 5-메틸 시토신. (2) 이미 승인된 치료제의 일부인 치환기, 예를 들어 포스포로티오에이트 결합된 올리고뉴클레오티드. (3) 상기 두 카테고리 중 하나로 가수분해 또는 분해되는 치환기, 예를 들어 메틸포스포네이트 결합된 올리고뉴클레오티드.
본 발명의 앱타머는 본 발명에서 기술한 바와 같은 앱타머 의약 화학을 통해 개발된 앱타머를 포함한다.
본 발명의 앱타머의 표적 결합 친화성은 미량의 32P-표지된 앱타머를 완충 매질 중 표적의 일련의 희석물과 항온 반응시키고, 이어서 진공 여과 매니폴드를 이용하여 니트로셀룰로스 여과를 통해 분석하는, 앱타머와 표적(예를 들어, 단백질)간의 일련의 결합 반응을 통해서 평가할 수 있다. 본 발명에서 도트 블랏 결합 분석법으로 언급하는 이 방법은 니트로셀룰로스, 나일론 필터 및 겔 블랏 종이로 (상부에서 하부로) 구성된 3층 여과 매체를 이용한다. 표적에 결합한 RNA를 니트로셀룰로스 필터 상에 포획하는 한편, 비표적 결합 RNA는 나일론 필터 상에 포획한다. 겔 블랏 종이는 다른 필터를 위한 지지체로서 포함된다. 여과 후, 필터층을 분리, 건조하고 인광물질 스크린에 노출시키고 인광화상형성 시스템을 이용하여 정량한다. 정량한 결과를 이용하여 앱타머 결합 곡선을 작성하고 이로부터 해리 상수(KD)를 산출할 수 있다. 바람직한 구체예에서, 결합 반응을 수행하기 위해 사용하는 완충 매질은 0.1 mg/mL BSA가 추가된 1X Dulbecco PBS(Ca++ 및 Mg++ 포함)이다.
일반적으로, 표적의 기능적 활성을 조절하는 앱타머의 능력, 즉 앱타머의 기능적 활성은 표적의 생물학적 기능에 따라 다양한, 시험관 내 및 생체 내 모델을 이용하여 평가할 수 있다. 일 구체예에서, 본 발명의 앱타머는 표적의 기지의 생물학적 기능을 억제할 수 있는 한편, 다른 구체예에서, 본 발명의 앱타머는 표적의 기지의 생물학적 기능을 자극할 수 있다.
본 발명의 앱타머는 당분야의 당업자가 이용하는 다수의 기술에 따른 진단 목적을 위해 일상으로 조정할 수 있다. 진단 용도는 생체 내 또는 시험관 내 진단 용도를 둘다 포함한다. 필요한 진단제는 사용자가 특정 부위 또는 농도에서 소정 표적의 존재를 확인할 수 있도록만 할 수 있다. 당분야의 당업자는 또한 이러한 리간드의 존재를 추적하기 위해서 표지화 태그를 도입하기 위해 당분야에 공지된 과정을 통해서 임의 앱타머를 조정할 수도 있다. 이러한 태그는 다수의 진단법에서 사용할 수 있다.
앱타머 치료제의 약물 동력학 및 생분포성의 조절
앱타머를 포함하여, 모든 올리고뉴클레오티드 기반 치료제에 대한 약물 동력학적 특성은 목적하는 약학 용도에 맞도록 제작되는 것이 중요하다. 세포외 표적에 대한 앱타머는 세포내 전달(이 경우는 안티센스 및 RNAi계 치료제)와 연합된 어려움을 겪지않지만, 이러한 앱타머를 표적 기관 및 조직에 분포시킬 수 있어야하고, 목적하는 투여 계획과 일관되는 시간 기간 동안 체내(비변형)에 잔존해야한다.
따라서, 본 발명은 앱타머 조성물의 약물 동력락, 구체적으로 앱타머 약물동력학을 조정할 수 있는 능력에 영향을 주는 물질 및 방법을 제공한다. 앱타머 약물동력학의 조정성(즉, 조절능)은 핵산의 화학 조성을 변경하도록 변형 뉴클레오티드(예를 들어, 2'-플루오로 또는 2'-O-메틸)를 도입하고/하거나 앱타머와 변형 부분(예를 들어, PEG 중합체)을 접합하여서 이룰 수 있다. 앱타머 약물동력학을 조정하는 능력은 현행 치료 용도의 개선, 또는 다르게는 신규 치료 용도의 개발에서 사용한다. 예를 들어, 일부 치료 용도에서, 예를 들어 빠른 약물 제거성 또는 턴오프가 바람직할 수 있는 항신생물 또는 급성 케어 세팅에서, 순환계 중 앱타머의 체류 시간을 감소시키는 것이 바람직하다. 다르게, 기타 치료 용도, 예를 들어 치료제의 전신 순환이 바람직한 유지 치료법에서, 순환계 중 앱타머의 체류 시간을 증가시키는 것이 바람직할 수 있다.
또한, 앱타머 약물동력학의 조정능은 개체에서 앱타머 치료제의 생분포성을 변화시키는데 사용한다. 예를 들어, 일부 치료 용도에서, 특정 유형의 조직 또는 특수 장기(또는 장기 세트)를 표적으로 하려는 시도에서 앱타머 치료제의 생분포성을 변화시키는 것이 바람직할 수 있다. 이러한 용도에서, 앱타머 치료제는 특수 조직 또는 장기(들)에 우선적으로 축적된다. 다른 치료 용도에서, 세포 마커를 표지하는 조직 또는 주어진 질환과 연합된 징후, 세포 손상 또는 다른 비정상적인 병상을 표적화하여서, 병을 앓고있는 조직에 앱타머 치료제가 우선적으로 축적되게 하는 것이 바람직하다. 예를 들어, "Controlled Modulation of the Pharmacokinetics and Biodistribution of Aptamer Therapeutics"의 명칭으로 2004년 3월5일 출원된 미국 가출원 제60/550790호, 및 "Controlled Modulation of the Pharmacokinetics and Biodistribution of Aptamer Therapeutics"의 명칭으로 2005년 3월 7일 출원된 미국 출원 제11/075,648호에 기술된 바에 따르면, 앱타머 치료제의 PEG화(예를 들어, 20 kDa 중합체로 PEG화)를 이용하여 염증이 일어난 조직을 표적화하여서, 염증이 일어난 조직에 PEG화된 앱타머 치료제가 우선적으로 축적되도록 한다.
앱타머 치료제(예를 들어, 변경화 화학성, 예컨대 변형 뉴클레오티드를 갖는 앱타머 또는 앱타머 접합체 등)의 약물동력학 및 생분포성 프로파일을 결정하기 위해서 다양한 파라미터를 모니터링한다. 이러한 파라미터에는 예를 들어, 앱타머 조성물의 반감기(t1/2), 혈장내 제거율(Cl), 분포 용적(Vss) 농도-시간 곡선하의 면적(AUC), 최대 관찰 혈청 또는 혈장 농도(Cmax) 및 평균 체류 시간(MRT) 등이 포함된다. 본 발명에서 기술한 바와 같이, 용어 "AUC"는 앱타머 투여후 시간에 따른 앱타머의 혈장 농도에 대한 곡선하의 면적을 의미한다. AUC 값은 생체이용률(즉, 앱타머 투여후 순환계 중 투여된 앱타머 치료제의 비율) 및/또는 소정 앱타머 치료제의 총 제거율(Cl)(즉, 앱타머 치료제가 순환계에서 제거되는 속도)을 평가하는데 사용한다. 분포 용적은 신체에 존재하는 앱타머 양에 대한 앱타머 치료제의 혈장 농도와 관련된다. Vss가 클수록, 보다 많은 앱타머가 혈장 외부에서 발견된다(즉, 유출이 보다 많음).
본 발명은 소분자, 펩티드 또는 중합체 말단기 등의 조절 부분에 앱타머를 접합시켜서, 또는 앱타머에 변형 뉴클레오티드를 도입하여 생체 내에서 안정화된 앱타머의 약물동력학 및 생분포성을 제어적인 방식으로 조절하는 방법 및 물질을 제공한다. 본 발명에서 기술하는 바와 같이, 변형 부분 및/또는 변경 뉴클레오티드(들) 화학 조성물의 접합으로 조적에 대한 분포 및 순환계 중 앱타머의 체류 시간의 기본적인 측면을 변화시킨다.
뉴클레아제에 의한 제거이외에도, 올리고뉴클레오티드 치료제는 신장 여과를 통해 제거된다. 이와 같이, 정맥 내로 투여된 뉴클레아제 내성 올리고뉴클레오티드는 전형적으로 여과를 차단하지 않는다면, 생체 내 반감기가 < 10분으로 나타난다. 이는 혈류로부터 나와 조직으로 들어가는 빠른 분포성을 촉진하거나 또는 사구체에 대한 효율적인 크기 컷오프 이상의 올리고뉴클레오티드의 분명한 분자량 증가를 통해서 수행할 수 있다. 하기에 기술한 바와 같이, PEG 중합체에 소형 치료제의 접합(PEG화)을 통해서 순환계 내 앱타머의 체류 시간을 현저하게 연장시킬 수 있고, 투여 빈도를 줄이고 혈관 표적에 대한 효율성을 증가시킬 수 있다.
또한, 안구 조직으로부터의 앱타머 여과는 본 발명의 앱타머의 분자량을 분명하게 증가시켜서 에컨대 PEG 중합체와 접합시켜서 조절, 구체적으로 차단할 수 있다.
앱타머는 다양한 변형 부분, 예컨대 고분자량 중합체, 예를 들어 PEG; 펩티드, 예를 들어 Tat(HTV Tat 단백질의 13 아미노산 단편(Vives, 외, (1997), J. Biol. Chem. 272(25): 16010-7)), Ant(드로소필라 안테나페디아(Drosophila antennapedia) 이형화 단백질 유래의 16-아미노산 서열(Pietersz, 외, (2001), Vaccine 19(11-12): 1397-405)) 및 Arg7(폴리아르기닌으로 구성된 짧은 양으로 하전된 세포 투과성 펩티드(Arg7) (Rothbard, 외, (2000), Nat. Med. 6(11): 1253-7; Rothbard, J 외, (2002), J. Med. Chem. 45(17): 3612-8)); 및 소형 분자 예컨대 친지성 화합물 예를 들어 콜레스테롤에 접합시킬 수 있다. 본 발명에서 기술한 다양한 접합체 중에서, 앱타머의 생체 내 특성은 PEG 기와의 접합을 통해 가장 깊이있게 변경시킨다. 예를 들어, 상기 기술한 특허 출원(2005년 3월 7일에 "Controlled Modulation of the Pharmacokinetics and Biodistribution of Aptamer Therapeutics"의 명칭으로 출원된 미국 출원 제11/075,648호)에 기술된 바와 같이, 20 kDa PEG 중합체로 앱타머 치료제를 접합시키면 신장 여과를 방해하고 앱타머가 건강한 조직 및 염증성 조직 둘 다에 분포하도록 촉진시킨다. 또한, 20 kDa PEG 중합체-앱타머 접합체는 앱타머의 신장 여과를 방지하는데 거의 40 kDa PEG 중합체만큼 효과가 있는 것으로 증명되었다. PEG화의 효과 중 하나는 앱타머 제거에 대한 영향인데, 20 kDa 부분의 존재에 의해 제공되는 장기간의 전신 노출은 또한 조직에 대한 앱타머의 분포를 촉진하고, 구체적으로 고관류 장기 및 염증 부위에 대한 분포를 촉진시킨다. 앱타머-20 kDa PEG 중합체 접합체는 앱타머가 염증 부위에 분포하도록 지정하여서, PEG화 앱타머가 염증 조직에 우선적으로 축적된다. 일례에서, 20 kDa PEG화 앱타머 접합체는 세포 내부, 예를 들어 신장 세포에 접근할 수 있다.
전체적으로, 콜레스테롤 및 세포 투과성 펩티드를 포함하는 저분자량 변형 부분에 의해 생성되는 앱타머 약물동력학 및 조직 분포성에 대한 영향은 전형적으로 PEG화 또는 뉴클레오티드 변형(예를 들어, 변화된 화학 조성 등)에 의해 생성되는 것에 비하여 충분하지 않다. 특정하게 한정하려는 의도는 아니지만, 안티센스 접합체의 경우에 일어나는 것으로 가정되는 혈장 지단백질과의 콜레스테롤 매개 연합은 앱타머-콜레스테롤 접합체 폴딩된 구조의 면에서는 배제되고/되거나 콜레스테롤 기의 친지성 성질의 측면과 관련되는 것으로 주장되고 있다. 콜레스테롤과 유사하게, Tat 펩티드 태그의 존재는 혈류로부터 앱타머의 제거를 촉진하며, 48시에 신장에 출현하는 접합체의 농도가 비교적 높아진다. 시험관 내에서 세포막을 가로지르는 거대분자의 통행을 매개하는 것으로 당분야에서 보고된 다른 펩티드(예를 들어, Ant, Arg7)는 순환계로부터 앱타머 제거를 촉진하는 것으로 보이지 않는다. 그러나, Tat와 유사하게, Ant 접합체는 다른 앱타머에 비하여 신장에 상당히 축적된다. 특정하게 한정하려는 의도는 아니지만, 생체내 3차원적으로 폴딩된 앱티머에 있어서 Ant 및 Arg7 펩티드의 바람직하지 않은 제시는 이들 펩티드가 앱타머 수송성에 대한 영향을 손상시킬 가능성이 있다.
변형 뉴클레오티드는 또한, 앱타머의 혈장 제거를 조정하는데 사용할 수 있다. 예를 들어, 2'-플루오로, 2'-OMe 및/또는 포스포로티오에이트 안정화 화학성이 도입된 비접합 앱타머는 전형적인 현형 생성 앱타머이고, 시험관 내 및 생체 내에서 높은 정도로 뉴클레아제 안정성을 나타내는데, 비변형 앱타머와 비교시 혈장에서 빠르게 손실되는 것으로 나타나고(즉, 빠른 혈장 제거성), 조직, 주로 신장에 빠르게 분포된다.
PAG-유도된 핵산
기술한 바와 같이, 고분자량의 비면역원성 중합체로 핵산을 유도하는 것은 핵산의 약물동력학 및 약물역학을 변경시켜서 이들을 보다 효율적인 치료제로 만드는 가능성을 갖는다. 활성에 호의적인 변화에는 뉴클레아제 분해에 의한 내성 증가, 신장을 통한 여과율 감소, 면역계에 대한 노출 감소 및 신체 전체에 대한 치료제의 분포성 변경을 포함할 수 있다.
본 발명의 앱타머 조성물은 폴리알킬렌 글리콜("PAG") 부분으로 유도화시킬 수 있다. PAG-유도된 핵산의 예는 2003년 11월 21일에 출원된 미국 출원 제10/718,833호에서 확인할 수 있으며, 이를 전체로 본 발명에 참조하여 포함시킨다. 본 발명에서 사용하는 전형적인 중합체에는 폴리(에틸렌 옥시드("PEO")라고도 알려진 폴리(에틸렌 글리콜)("PEG') 및 폴리프로필렌 글리콜(폴리이소프로필렌 글리콜 포함)을 포함한다. 추가적으로 상이한 알킬렌 옥시드(예를 들어, 에틸렌옥시드 및 프로필렌옥시드)의 랜덤 또는 블록 공중합체를 다양한 용도로 사용할 수 있다. 가장 일반적인 형태로, 폴리알킬렌글리콜, 예컨대 PEG는 각 말단이 히드록실 기로 종결된 선형 중합체이다: HO-CH2CH2O-(CH2CH2O)n-CH2CH2-OH. 이 중합체는, 알파-, 오메가-디히드록실폴리(에틸렌글리콜)이고, 이는 또한 HO-PEG-OH로서 표시할 수 있으며, 여기서, -PEG-심볼은 다음의 구조단위: -CH2CH2O-(CH2CH2O)n-CH2CH2-를 나타내며, 이때 n은 대체로 약 4 내지 약 10,000 범위이다.
치료 조치용으로 적합한 PAG 중합체는 대체로 수용해성 및 다양한 용매에 대한 가용성을 가지고, 독성이 없으며, 면역원성이 없다. PEG의 일 용도는 얻어진 PAG-분자 "접합체"가 가용성이 되도록 불용성 분자에 이 중합체를 공유적으로 결합하는 것이다. 예를 들어, 수불용성 약물 파클리탁셀이, PEG와 커플링되면, 수용해성이 된다는 것은 알려져 있다. 문헌 [Greenwald, 외, J. Org. Chem., 60:331-336 (1995)]을 참조한다. PAG 접합체는 종종 가용성 및 안정성을 증가시키기 위해서 사용될 뿐만 아니라 분자의 혈류 반감기를 연장시키기 위해 사용된다.
PAG 유도체화, 예를 들어 PEG 접합의 치료제의 생분포성을 변경하는 능력은 접합체의 크기(예를 들어, 수력학적 반지름으로 측정)를 비롯한 다양한 인자와 관련된다. 보다 큰 접합체(> 10 kDa)는 신장을 통한 여과를 보다 효율적으로 차단하고 결과적으로 소형 거대분자(예를 들어, 펩티드, 안티센스 올리고뉴클레오티드)의 혈청 반감기를 증가시키는 것으로 알려져 있다. PEG 접합체가 여과를 차단하는 능력은 약 50 kDa 이하의 PEG 크기로 증가시킬 수 있는 것으로 알려졌다(추가 증가는 신장을 통한 제거보다는 마크로파지 매개성 기전으로 반감기가 한정되는 것처럼 최소의 유효한 효과를 갖는다).
본 발명의 PAG 유도체화된 화합물은 대체로 그 크기가 5 내지 80 kDa이지만 임의 크기를 사용할 수 있고, 선택은 앱타머 및 용도에 따라 좌우된다. 본 발명의 다른 PAG 유도체화된 화합물은 크기가 10 내자 80 kDa이다. 또 다른 본 발명의 PAG 유도체화된 화합물은 크기가 10 내지 60 kDa이다. 일 구체예에서, 본 발명의 조성물에 유도체화된 PAG 부분은 크기가 10, 20, 30, 40, 50, 60 또는 80 kDa 범위인 PEG이다. 일 구체예에서, PEG는 선형 PEG인 반면, 다른 구체예에서, PEG는 분지형 PEG이다. 또 다른 구체예에서, PEG는 도 4에 도시한 바와 같이 40 kDa 분지형 PEG이다. 일 구체예에서, 40 kDa 분지형 PEG는 도 5에 도시한 바와 같은 앱타머의 5' 말단에 결합된다.
본 발명은 다중 PEG화 핵산을 포함하여 고분자량 PEG-핵산(바람직하게, 앱타머) 접합체를 합성하기 위한 비용 효율적인 경로를 제공한다. 본 발명은 또한 PEG 결합된 다량체 올리고뉴클레오티드, 예를 들어 이량체 앱타머를 포함한다. 생물학적으로 발현되는 단백질 치료제와 대조적으로, 핵산 치료제는 대체로 활성화된 단량체 뉴클레오티드로부터 화학적으로 합성된다. PEG-핵산 접합체는 동일한 반복 단량체 합성을 이용하여 PEG를 도입하여 제조할 수 있다. 예를 들어, 포스포라미다이트 형태로 전환시켜서 활성화된 PEG를 고체상 올리고뉴클레오티드 합성에 도입할 수 있다. 다르게, 올리고뉴클레오티드 합성은 반응성 PEG 결합 부위의 부위 특이적 도입을 통해 이행할 수 있다.
활성화된 PEG
고분자량 PEG(> 10 kDa)의 생산은 어렵고, 비효율적이며 값비쌀 수 있다. 고분자량 PEG-핵산 접합체의 합성 경로로서, 사전 작업은 보다 높은 분자량의 활성화된 PEG의 생성에 맞춰져있었다. 이러한 분자를 생성하는 방법은 선형의 활성화된 PEG 또는 활성화된 기를 보유하는 중심 코어에 둘 이상의 PEG가 부착된 분지형 활성화 PEG의 형성을 포함한다. 이러한 고분자량 PEG 분자의 말단부분, 즉 비교적 비반응성인 히드록실(-OH) 부분은 화합물 상의 반응성 부위에서 다른 화합물에 하나 이상의 PEG를 부착하기 위해서 작용성 부분으로 전환되거나, 활성화될 수 있다. 분지형 활성화 PEG는 둘 이상의 말단을 가질 수 있고, 이 경우에서 둘 이상의 말단이 활성화되며, 이러한 활성화된 고분자량 PEG 분자를 본 발명에서는 다중 활성화 PEG라고 한다. 일부 경우에서, 분지형 PEG 분자의 모든 말단이 활성화되는 것은 아니다. 분지형 PEG 분자의 임의 두 말단이 활성화되는 경우에서, 이러한 PEG 분자는 이중 활성화 PEG라고 한다. 분지형 PEG 분자의 한 말단만 활성화된 경우에, 이러한 PEG 분자를 단일 활성화라고 한다. 이러한 접근법의 일례로서, 이후 반응에서 활성화되는 리신 코어에 2개의 모노메톡시 PEG를 부착시켜서 제조된 활성화 PEG가 기술되어 있다(Harris 외, Nature, vol.2: 214-221, 2003).
도 6에 도시한 바와 같이, 선형 PEG 분자는 2작용성이고 때때로 "PEG 디올"이라고 한다. PEG 분자의 말단 부부능 비교적 비반응성 히드록실 부분, -OH 기이고, 화합물 상의 반응성 부위에서 다른 화합물에 PEG를 부착시키기 위한 기능성 부분으로 전환되거나, 활성화될 수 있다. 이러한 활성화 PEG 디올은 이중 활성화 PEG라고 한다. 예를 들어, PEG 디올의 말단 부분은 비교적 비반응성 히드록실 부분, -OH를 N-히드록시 숙신이미드 유래의 숙신이미딜 활성 에스테르 부분으로 치환시켜서 아미노 부분과 선별적인 반응을 위한 활성 카르보네이트 에스테르로서 작용화된다. 다르게, PEG 디올은 접합과 동등하게 또는 활성화 카르보닐을 적절한 조작으로 만들기 전에 이에 제한되지는 않으나, α-할로 아세트산, 에피할로히드린, 말레에이트, 타르트레이트 및 카르보히드레이트를 비롯한 다양한 기로 활성화시킬 수 있다. PEG를 활성화시키는 다른 방법은 예를 들어, 문헌 [Roberts 외, (2002) Advanced Drug Deliver Reviews 54:549-476]에 기술되어 있고, 이를 전체로 본 발명에 참조하여 포함시킨다. 상기 기술한 방법 중 하나를 이용하여 PEG를 활성화시키는 것 이외에도, PEG 분자의 말단 알콜 작용성 중 하나 또는 둘을 변형시켜서 핵산에 상이한 유형의 접합을 가능하게 할 수 있다. 예를 들어, 아민 또는 디올로 말단 알콜 작용성 중 하나를 전환시켜서 우레아 및 티오우레탄 접합체로의 접근을 가능하게 한다.
다양한 용도에서, PEG 분자가 단일 작용성(또는 단일 활성화)이도록 필수적으로 비반응성 부분을 갖는 한쪽 말단에서 PEG 분자를 캡핑시키는 것이 바람직하다. 활성화된 PEG를 위한 다수의 반응 부위를 일반적으로 나타내는 단백질 치료제의 경우에 있어서, 이중 작용성 활성화 PEG는 고가의 가교결합을 일으키고, 불충분한 기능성 응집체를 만든다. 단일 작용성 PEG를 생성하기 위해서, PEG 디올 분자의 말단에 하나의 히드록실 부분은 대체로 비작용성 메톡시 말단 부분, -OCH3으로 치환된다. PEG 분자의 다른 비캡핑된 말단은 단백질과 같은 분자 또는 표면상의 반응성 부위에서 부착되기 위해 활성화될 수 있는 반응성 말단 부분으로 전환된다.
하나 이상의 PEG에 접합된 앱타머
가장 일반적으로, 고분자량 PAG-핵산 접합체를 합성하는 것은 5'-말단에 유리 1차 아민을 첨가하여 수행한다(고체상 합성의 마지막 커플링 단계에서 변형제 포스포라미다이트를 이용하여 도입함). 이러한 방법을 이용하여, 반응성 PEG(예를 들어, 아민과 반응하여 결합을 형성하도록 활성화되는 것)는 정제된 올리고뉴클레오티드와 배합하여서 커플링 반응을 용액 중에서 수행한다.
또한, 고분자량 PAG-핵산-PAG 접합체는 하나 이상의 반응성 부위를 함유하는 핵산과 단일 작용성 활성화 PEG를 반응시켜서 제조할 수 있다. 일 구체예에서, 핵산은 이중 반응성이고, 2개의 반응성 부위: 통상의 포스포라미다이트 합성을 통해서 3'아민 고체 지지체에서 출발하여 도입되는 5'-아미노 기 및 3'-아미노 기를 함유하며, 예를 들어 도 6에 도시한 바와 같은 3'-5'-디-PEG화이다. 다른 구체예에서, 반응성 부위는 예를 들어, 피리미딘의 5 위치, 퓨린의 8 위치 또는 리보스의 2' 위치를 1차 아민의 부착 부위로서 사용하여 내부 위치에 도입할 수 있다. 다른 구체예에서, 핵산은 몇몇 활성화 또는 반응성 부위를 가질 수 있고 이를 다중 활성화라고 한다.
핵산-PEG-핵산 접합체를 생성하기 위해서, 핵산은 단일 반응성 부위(예를 들어, 단일 활성화된 것임)를 보유하도록 처음부터 합성한다. 바람직한 구체예에서, 이 반응성 부위는 올리고뉴클레오티드의 고체상 합성의 마지막 단계로서 변형제 포스포라미다이트를 첨가하여 5' 말단에 도입된 아미노기이다. 다른 바람직한 구체예에서, 합성은 5' 말단에 아민을 도입하는 것과 함께, 3'-아만 변형제를 이용하여 수행해서 3',5'-디-아민 올리고뉴클레오티드를 만든다. 변형된 올리고뉴클레오티드의 탈보호화 및 정제 이후에, 활성화 PEG의 자발적 가수분해를 최소화하는 용액 중에 고농도로 재구성시킨다. 바람직한 구체에에서, 올리고뉴클레오티드의 농도는 1 mM이고 재구성 용액은 200 mM NaHCO3 완충액(pH 8.3)을 함유한다. 접합체의 합성은 고정제된 활성화 PEG를 서서히 단계적으로 첨가하여 개시한다. 바람직한 구체예에서, PEG는 p-니트로페닐 카르보네이트로서 활성화된다. 반응 후, PEG-핵산 접합체를 겔 전기영동 또는 액상 크로마토그래피를 통해 정제해서 완전 접합종, 부분 접합종 및 미접합 종을 분리한다.
하나의 PEG에 접합된 다중 앱타머
본 발명은 또한 둘 이상이 핵산 부분이 하나 이상의 폴리알킬렌 글리콜 부분에 공유 접합된 고분자량 앱타머 조성물을 포함한다. 폴리알킬렌 글리콜 부분은 안정화 부분으로서 제공된다. 안정화 부분은 본 발명의 고분자량 앱타머 조성물의 약물동력학 및 약물역학 특성을 개선시키는 분자 또는 분자의 일부이다. 일부 경우에서, 안정화 부분은 본 발명의 고분자량 조성물의 감소된 전체 회전 자유성을 제공하거나, 둘 이상의 앱타머 또는 앱타머 도메인을 근접시키는 분자 또는 분자의 일부이다. 안정화 부분은 폴리알킬렌 글리콜이고, 이러한 폴리에틸렌 글리콜은 선형 또는 분지형, 단독중합체 또는 이종중합체일 수 있다. 다른 안정화 부분은 중합체 예컨대 펩티드 핵산(PNA)을 포함한다. 올리고뉴클레오티드는 또한 안정화 부분일 수 있으며, 이러한 올리고뉴클레오티드는 변형 뉴클레오티드, 및/또는 변형 결합 예컨대 포스포로티오에이트를 포함할 수 있다.
안정화 부분은 앱타머 조성물의 완전한 부분일 수 있는데, 즉 앱타머에 공유적으로 결합된다. 폴리알킬렌 글리콜 부분이 앱타머의 양 말단에 공유 결합되어, 폴리알킬레글리콜이 하나의 분자 내에서 핵산 부분과 함께 연결된 조성물에서, 폴리알킬렌 글리콜은 연결 부분이라고 한다. 이러한 조성물에서, 공유 분자의 1차 구조는 선형 배열 핵산-PAG-핵산을 포함한다. PEG 안정화 부분이 앱타머의 상이한 부분을 분리하는 링커로서 제공되는 조성물의 일례로서는 단일 앱타머 서열 내에 PEG가 접합되어서 고분자량 앱타머 조성물의 선형 배열이 핵산-PEG-핵산(-PEG-핵산)n(여기서, n은 1 이상임)이도록 하는 조성물이다.
핵산-PEG-핵산 접합체를 생성하기 위해서, 핵산은 단일 반응성 부위(예를 들어, 단일 활성화됨)를 보유하도록 처음부터 합성된다. 바람직한 구체예예서, 이 반응성 부위는 올리고뉴클레오티드의 고체상 합성의 마지막 단계로서 변형제 포스포라미다이트를 첨가하여 5' 말단에 도입된 아미노 기이다. 변형된 올리고뉴클레오티드의 탈보호화 및 정제이후, 활성화된 PEG의 자발적인 가수분해를 최소화하는 용액중에 고농도로 재구성시킨다. 바람직한 구체예에서, 올리고뉴클레오티드의 농도는 1 mM이고 재구성된 용액은 200 mM NaHCO3 완충액, pH 8.3을 함유한다. 접합체의 합성은 고정제된 이중 작용성 PEG를 서서히 단계식으로 첨가하여 개시한다. 바람직한 구체예에서, PEG 디올은 p-니트로페닐 카르보네이트로서 유도체화하여 양 말단(이중 활성화)에서 활성화된다. 반응 후, PEG-핵산 접합체는 겔 전기영도 또는 액상 크로마토그래피를 통해 정제하여 완전 접합종, 부분 접합종 및 비접합종을 분리시킨다. 농축된 다중 PAG 분자(예를 들어, 랜덤 또는 블록 공중합체로서) 또는 보다 작은 PAG 사슬을 연결하여 다양한 길이(또는 분자량)를 얻을 수 있다. 비PAG 링커를 다양한 길이의 PAG 사슬 사이에 사용할 수 있다.
연결 도메인은 또한 이에 부착된 하나 이상의 폴리알킬렌 글리콜 부분을 가질 수 있다. 이러한 PAG는 길이가 다양할 수 있고 조성물의 목적하는 분자량을 얻기 위해 적절한 조합으로 사용할 수 있다.
특정 링커의 효과는 화학 조성 및 길이 둘 다에 영향을 줄 수 있다. 너무 길거나, 너무 짧거나 보체 성분 표적과 바람직하지 않은 정적 및/또는 이온 상호작용을 형성하는 링커는 앱타머와 보체 성분 표적 간의 복합체 형성을 배제시킨다. 핵산 사이의 거리를 회전하는데 필요한 것보다 긴 링커는 리간드의 유효 농도를 감소시켜서 결합 안정성을 감소시킬 수 있다. 따라서, 표적에 대한 앱타머의 친화성을 최대화하기 위해서 링커의 조성 및 길이를 최적화하는 것이 종종 필요하다.
보체계 단백질 C5에 대한 결합 친화성을 갖는 앱타머
일 구체예에서, 본 발명의 물질은 보체 단백질 C5에 특이적으로 결합하고 시생체 내 및/또는 세포 기반 분석법에서 보체 단백질 C5의 활성을 기능적으로 조정, 예를 들어 차단하는 길이가 약 15 내지 약 60 뉴클레오티드인 일련의 핵산 앱타머를 포함한다.
본 발명의 일 구체예에서, 보체 단백질 C5에 특이적으로 결합하고 조정할 수 있는 앱타머를 기술한다. 이 앱타머는 예를 들어 보체 관련 심장 질환(예를 들어, 심근 손상; 관상 동백 우회로(CABG) 수술과 관련된 C5 매개성 보체 합병증 예컨대 수술 후 출혈, 전신성 호중구 및 백혈구 활성화, 심근 경색 위험률 증가 및 인지 장애; 재협착 및 경피적 관상동맥 중재술과 관련된 C5 매개성 보체 합병증 등), 허혈성 재관류 손상(예를 들어, 심근경색, 졸중, 동상), 보체 관련 염증성 질환(예를 들어, 천식, 관절염, 패혈증 및 장기 이식 후 거부 등), 및 보체 관련 자가면역 질환(예를 들어, 중증 근무력증, 전신 홍반성 낭창(SLE)) 등을 포함하는 다양한 보체 관련 질환 또는 질병을 치료, 완화 및/또는 예방하는 유효한 방식, 저독성 및 안정성을 제공한다. C5 억제가 바람직한 다른 증상에는 예를 들어, 폐 염증(Mulligan 외, (1998) J. Clin. Invest. 98:503), 체외 보체 활성화(Kinder 외, (1995) J. Clin. Invest. 96:1564), 항체 매개성 보체 활성화(Biesecker 외, (1989) J. Immunol. 142:2654), 사구체신염 및 다른 신장 질환, 안구 징후 예컨대 C5 매개성 안구 조직 손상, 예를 들어 당뇨병성 망막병증, 삼출성 및/또는 비삼출성 나이 관련 황반 변성증(AMD), 및 발작성 야간 혈색뇨증 등이 포함된다. 이들 앱타머는 또한 진단용으로 사용할 수 있다.
일 구체예에서, 본 발명의 앱타머는 급성 또는 만성 염증성 및/또는 면역 매개성 안구 질환, 알레르기성 및 거대 유두성 결막염을 비롯한 염증성 결막염, 황반 부종, 포도막염, 안내염, 공막염, 각막 궤양, 건성안 증후군, 녹내장, 허혈성 망막 질환, 각막 이식 거부증, 안구내 수술 예컨대 안구내 렌즈 이식술과 관련된 합병증 및 백내장 수술과 관련된 염증, 베체트병, 면역 복합 혈관염, 푸크스 질환, 보그트-고야나기-하라다병, 망막하 섬유증, 각막염, 초자체 망막 염증, 안구 기생충성 감염/이동, 망막 색소 변성증, 거대세포바이러스 망막염 및 맥락막 염증, 황반 변성증, 나이 관련 황반 변성증("AMD"), 비삼출성("건성") AMD 또는 당뇨병성 망막병증 또는 삼출성("습성") AMD를 비롯한 안구 신혈관생성 질환을 포함하는 본 발명의 방법에서 다양한 보체 관련 안구 질환 또는 질병을 치료, 안정화 및/또는 예방하는 유효한 방식, 저독성, 안정성으로 사용할 수 있다.
이들 앱타머는 예를 들어, 친지성 또는 고분자량 화합물(예를 들어, PEG)과의 접합, 캡핑 부분의 도입, 변형 뉴클레오티드의 도입 및 포스페이트 골격의 변형 등을 포함하는 본 발명에서 기술된 변형을 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, C5 보체 단백질에 결합하는 단리된, 비천연 발생 앱타머를 제공한다. 다른 구체예에서, 보체 매개성 안구 질환을 치료, 안정화 및/또는 예방하기 위한 본 발명의 방법에서 사용하기 위한 C5 보체 단백질에 결합하는 단리된, 비천연 발생 앱타머를 제공한다. 일 구체예에서, 단리된, 비천연 발생 앱타머는 C5 보체 단백질에 대한 해리 상수("Kd")가 100 μM 미만, 1 μM 미만, 500 nM 미만, 100 nM 미만, 50 nM 미만, 1 nM 미만, 50O pM 미만, 100 pM 미만, 50 pM 미만이다. 본 발명의 일 구체예에서, 해리 상수는 하기 실시예 1에 기술된 바와같이 도트 블랏 적정을 통해 측정한다.
다른 구체예에서, 본 발명의 방법에서 사용하는 앱타머는 C5 보체 단백질의 기능을 조절, 구체적으로는 C5 보체 단백질 기능 및/또는 C5 보체 단백질 변이체 기능을 억제한다. 본 발명에서 사용하는 C5 보체 단백질 변이체는 C5 보체 단백질 기능과 본질적으로 동일한 기능을 수행한다. C5 보체 단백질 변이체는 바람직하게, 실질적으로 동일한 구조를 포함하고 일 구체예에서는 하기 아미노산 서열(서열 번호 102)(문헌 [Haviland 외, J Immunol. 1991 Jan l;146(l):362-8] 인용)을 포함하는 C5 보체 단백질의 아미노산 서열과의 서열 동일성이 80% 이상인 서열, 보다 바람직하게는 90% 이상인 서열, 보다 바람직하게는 95% 이상인 서열을 포함한다.
Figure 112008070002540-pct00006
본 발명의 일 구체예에서, 표적 변이체의 서열 동일성은 하기 기술하는 BLAST를 이용하여 결정하였다. 둘 이상의 핵산 또는 단백질 서열에 대한 용어 "서열 동일성"은 실제 조사 또는 하기 서열 비교 알고리즘 중 하나를 사용하여 측정되는, 최대 일치성에 대해 비교 및 정렬시, 동일한 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드의 특정 비율을 갖거나 또는 동일한 둘 이상의 서열 또는 하부 서열을 의미한다. 서열 비교를 위해서, 전형적으로 시험 서열을 비교하기 위한 기준 서열로서 하나의 서열이 사용된다. 서열 비교 알고리즘을 이용하는 경우, 시험 및 기준 서열을 컴퓨터에 입력하고, 필요에 따라 하부 서열 좌표를 지정하고, 서열 알고리즘 프로그램 파라미터를 지정한다. 이후, 서열 비교 알고리즘으로 지정된 프로그램 파라미터를 기준으로, 기준 서열에 대한 시험 서열(들)의 서열 동일성 비율을 산출한다. 비교를 위한 서열의 최적 정렬은 예를 들어, 문헌 [Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2: 482 (1981)]의 국소 상동성 알고리즘, 문헌 [Needleman & Wunsch, J MoI. Biol. 48: 443 (1970)]의 상동성 정렬 알로기즘, 문헌[Pearson & Lipman, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85: 2444 (1988)]의 유사성 방법에 대한 조사, 이들 알고리즘의 컴퓨터 실행(GAP, BESTFIT, FASTA, and TFASTA in the Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wis.] 또는 시각 조사(대체로, 문헌 [Ausubel 외, 상동] 참조)를 통해서 수행할 수 있다.
서열 동일성의 비율을 결정하기 위해 적절한 알고리즘의 일례로는 기초적인 국소 정렬 조사 툴(여기서는 "BLAST")에서 사용하는 알고리즘이 있으며, 예를 들어 문헌 [Altschul 외, J MoI. Biol. 215: 403-410 (1990)] 및 [Altschul 외, Nucleic Acids Res., 15: 3389-3402 (1997)]을 참조한다. BLAST 분석을 수행하기 위한 소프트웨어는 미국 생물학 정보 센터(이하, "NCBI")를 통해 입수가능하다. NCBI에서 입수가능한 소프트웨어를 이용하여 서열 동일성을 결정하는데 사용되는 디폴트 파라미터, 예를 들어 BLASTN(뉴클레오티드 서열용) 및 BLASTP(아미노산 서열용)가 문헌 [McGinnis 외, Nucleic Acids Res., 32: W20-W25 (2004)]에 기술되어 있다.
본 발명의 다른 구체예에서, 앱타머는 서열 번호 1, 2, 5-67, 75-81, 83 또는 88-98 중 어느 하나를 포함하는 앱타머와 동일한 C5 보체 단백질 결합능을 실질적으로 갖는다. 본 발명의 다른 구체예에서, 앱타머는 서열 번호 1-2, 5-67, 75-81, 83 또는 88-98 중 어느 하나를 포함하는 앱타머와 실질적으로 농일한 구조 및 C5 보체 단백질 결합능을 갖는다. 다른 구체예에서, 본 발명의 앱타머는 서열 번호 2, 5-67, 75-81, 83 또는 88-98 중 어느 하나에 따른, 임의 화학 변형을 포함하는, 서열을 갖는다. 다른 구체예에서, 본 발명의 앱타머는 약학 조성물의 활성 성분으로서 사용된다. 다른 구체예에서, 본 발명의 앱타머를 포함하는 조성물 또는 앱타머는 보체 관련 심장 질환(예를 들어, 심근 손상; 관상 동맥 우회로(CABG) 수술과 관련된 C5 매개성 보체 합병증 예컨대 수술후 출혈, 전신 호중구 및 백혈구 활성화, 심근 경색 위험률 증가 및 인지 기능 장애 증가; 재협착 및 경피적 관상 동맥 중재술과 관련된 C5 매개성 보체 합병증 증), 허혈성 재관류 손상(예를 들어, 심근 경색, 졸중, 동상 등), 보체 관련 염증 질환(예를 들어, 천식, 관절염, 패혈증 및 장기 이식 후 거부), 및 보체 관련 자가 면역 질환(예를 들어, 중근 근무력증, 전신 홍반성 낭창(SLE)), 폐 염증, 체외 보체 활성화, 항체 매개성 보체 활성화 및 보체 관련 안구 질환 예컨대 당뇨병성 망막병증과 나이 관련 황반 변성증(AMD)로 구성된 군에서 선택된 어느 하나를 포함하는 다양한 보체 관련 질환 또는 질병을 치료하는데 사용된다.
일 구체예에서, 본 발명의 항-C5 앱타머는 2'-플루오로 변형 뉴클레오티드, 2'-OMe 변형 뉴클레오티드("2'-OMe") 및 2'-OH 퓨린 잔기의 혼합물을 포함한다. 변형 항-C5 앱타머에 대해 예시한 유전 서열(서열 번호 1)은 하기 표 1에 도시하였고, 구조는 도 3A에 도시하였다. 2'-OH로 남은 두개의 G 잔기를 제외하고는(밑줄 친 잔기) 다량의 퓨린(A 및 G)이 2'-OMe로 변형되었다. 동그라미로 표시한 잔기는 앱타머의 항-C5 활성을 실질적으로 변화시키기 않고 2'-H로 동시에 변형시킬 수 있는 피리미딘 서브세트를 나타낸다(하기 표 1의 ARC330 참조(서열 번호 2, 도 3B). 도 3A에 도시한 밑줄 친 잔기는 2'-플루오로 또는 2'-H 변형(2'-OMe는 아님)을 함유할 수 있는 피리미딘 잔기를 나타내는 한편, 박스 표시한 잔기는 2'-플루오로 또는 2-OMe 변형(2'-H 아님)을 함유할 수 있는 피리미딘 잔기를 나타낸다. 화살표(→)로 표시한 잔기는 2'-플루오로 변형을 함유해야 한다. 화살표(→)로 표시한 잔기에 2'-플루오로 잔기가 없으면, 얻어진 앱타머의 최종 용혈 활성이 실질적으로 감소한다. 바람직한 구체예에서, 본 발명의 항-C5 앱타머는 서열 번호 1에 따른 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
본 발명에 따른 항-C5 앱타머의 예는 도 3C에 도시하였고 본 발명에서 전체로 참조하여 포함시킨 미국 특허 제6,395,888호에 기술된 ARC186(서열 번호 4)이다. ARC186의 모든 21 피리미딘 잔기는 2'-플루오로 변형을 갖는다. 퓨린(14 잔기)의 대다수는 2'-OMe 변형을 갖지만, 3개의 2'-OH 퓨린 잔기도 갖는다(도 3C에 밑줄로 표시). 본 발명의 항-C5 앱타머는 또한 2'-플루오로 및 2'-H 변형의 상이한 혼합물을 포함한다. 예를 들어, 본 발명의 다른 항-C5 앱타머는 도 3B에 도시한 ARC330(서열 번호 2)이다. ARC330(서열 번호 2)은 7개의 2'-H 변형(도 3B에 동그라미 표시), 2'-플루오로 변형을 갖는 14 피리미딘 잔기, 2'-OMe 변형을 갖는 14 퓨린 잔기 및 3개의 2'-OH 퓨린 잔기(도 3B에 밑줄로 표시)를 포함한다.
각각 ARC186(서열 번호 4)에서 유도되고, 2'-플루오로 변형, 2'-OMe 변형, 2'-OH 퓨린 잔기의 혼합물, 및 다양한 크기의 고분자량, 비면역원성 화합물(예를 들어, PEG)과의 접합을 포함하는 앱타머의 다른 조합을 하기 표 1에 나타내었다. 본 발명은 하기 표 1에 기술한 바와 같은 앱타머를 포함한다. 본 발명은 또한, 하기에 표시되었지만 표시된 3'캡(예를 들어, 인버티드 데옥시티미딘 캡)이 없는 앱타머 및/또는 하기에 표시되었지만 3'캡(예를 들어, 인버티드 dT)을 포함하는 앱타머(3'캡은 표시하지 않음)를 포함한다.
본 발명의 일 구체예에서 기술한 방법에서 사용하기 위한 항-C5 앱타머는 하기 기술한 서열 번호 1 내지 69, 75, 76, 81, 91, 95 및 96 중 어느 하나를 포함하는 앱타머일 수 있다.
달리 표시하지 않으면, 하기 표 1의 뉴클레오티드 서열은 5'에서 3' 방향으로 열거하였다. 표 1의 개별 서열 각각에 대해서, 모든 2'-OMe 퓨린 또는 피리미딘 변형은 상응하는 뉴클레오티드 앞에 "m"으로 표시하였다. 모든 2'-플루오로 피리미딘 변형은 상응하는 뉴클레오티드 앞에 "f"로 표시하였다. 모든 퓨린 또는 피리미딘 데옥시 변형은 상응하는 뉴클레오티드 앞에 "d"로 표시하였다. 상응하는 뉴클레오티드 앞에 "m", "f" 또는 "d"가 표시되지 않은 임의 퓨린 또는 피리미딘은 2'-OH 잔기를 나타낸다. 또한, "3T"는 인버티드 데옥시 티미딘을 의미하고, "NH"는 헥실아민 링커를 나타내며, "NH2"는 헥실아민 말단 기를 나타내고, "PEG"는 표시한 분자량을 갖는 폴리에틸렌 글리콜 기를 나타내며, "바이오틴"은 5' 말단에 접합된 바이오틴을 갖는 앱타머를 나타낸다.
[표 1]
Figure 112008070002540-pct00007
Figure 112008070002540-pct00008
Figure 112008070002540-pct00009
Figure 112008070002540-pct00010
Figure 112008070002540-pct00011
Figure 112008070002540-pct00012
Figure 112008070002540-pct00013
본 발명은 또한, 하기 표 2의 앱타머를 포함한다. 표 2의 앱타머는 5'에서 3' 방향으로 열거하였고, 제공된 dRmY SELEX™ 조건하에서 선별된 앱타머의 리보뉴클레오티드 서열을 나타낸다. 이러한 선별로 유도된(및 열거한 서열에 나타낸 바와 같은) 본 발명의 일 구체예에서, 퓨린(A 및 G)은 데옥시이고 피리미딘(U 및 C)은 2'-OMe이다. 일 구체예에서, 앱타머는 캡(예를 들어, 3'-인버티드 dT)을 포함한다. 일 구체예에서, 앱타머는 PEG를 포함한다.
[표 2] dRmY 항-C5 앱타머
Figure 112008070002540-pct00014
보체 단백질 C5에 결합하는 본 발명의 다른 앱타머는 하기 실시예 3에 기술하였다. C5 특이적 앱타머는 또한, 미국 가출원 제60/544,542호, 제60/547,747호, 제60/581,685호 및 제60/608,048호에 기술되어 있고, 이들을 전체로 참조하여 본 발명에 포함시킨다.
일 구체예에서, 본 발명의 앱타머 치료제는 표적에 대한 높은 친화성 및 특이성을 가지면서 앱타머 치료제가 환자 또는 개체의 몸에서 분해되는 경우에 비천연 발생 뉴클레오티드 치환에 의한 유해한 영향이 경감되었다. 일 구체예에서, 본 발명의 앱타머 치료제를 함유하는 치료 조성물은 플루오르화 뉴클레오티드가 없거나 감소된 양으로 존재한다.
본 발명의 앱타머는 당분야에서 공지된 고체상 올리고뉴클레오티드 합성법(예를 들어, 문헌 [Froehler 외, Nucl. Acid Res. 14:5399-5467 (1986)] 및 [Froehler 외, Tet. Lett. 27:5575-5578 (1986)]) 및 용액상 방법 예컨대 트리에스테르 합성 방법(예를 들어, 문헌 [Sood 외, Nucl. Acid Res. 4:2557 (1977) 및 [Hirose 외, Tet. Lett., 28:2449 (1978)] 참조)을 비롯한 당분야의 공지된 임의 올리고뉴클레오티드 합성법을 이용하여 합성할 수 있다.
본 발명은 또한, 각각 안구 질환을 안정화, 치료 및/또는 예방하는 본 발명의 방법에서, PDGF 및/또는 VEGF 및/또는 이의 동족 수용체 PDGFR 및 VEGFR에 특이적인 앱타머와 본 발명의 항-C5 제제의 용도를 포함한다. 따라서, 상기 기술한 방법은 리간드(예를 들어, PDGF 또는 VEGF)와 그 표적 예컨대 동족 수용체의 결합을 차단하기 위한 본 발명의 앱타머를 생성하기 위한 용도일 수 있다.
본 발명의 방법에서 사용하기 위한 항-PDGF의 예는 2005년 11월 2일 출원된 국제 특허 출원 제PCT/US2005/039975호에 개시되어 있으며, 이를 전체로 본 발명에 참조하여 포함시키고, 구체적으로는 ARC513, ARC594, ARC127 및 ARC404가 개시되어 있다.
본 발명의 방법에 사용하기 위한 VEGE 특이적 앱타머의 예는 미국 특허 출원 제5,919,455호, 제5,932,462호, 제6,113,906호, 제6,011,020호, 제6,051,698호 및 제6,147,204호에 개시되어 있다. 예를 들어, 본 발명이 항-C5 제제와 조합하여 안구 질환의 치료에 사용하기 위해 특히 유용한 앱타머는 PEG화 형 및 비PEG화 형의 EYEOOl(이전 NXl838), 구체적으로 페가타닙 나트륩 주입물이다(Macugen®, Eyetech Pharmaceuticals, Inc. and Pfizer, Inc. NY, NY).
항-C5 항체 제제
본 발명의 항-C5 제제는 보체 단백질 C5에 대한 길항제 항체 및 C5 매개성 안구 질환의 치료에서의 이의 용도를 포함한다. 본 발명의 C5 길항제 항체는 C5에 강하게 결합하여 이의 활성화 및 절단을 방지한다. 특정 구체예에서, 본 발명은 안구 질환의 하나 이상의 징후, 구체적으로 당뇨병성 망막병증, 삼출성 및/또는 비삼출성 AMD의 징후를 경감, 안정화 및/또는 예방하기 위한 방법에서 개체에 항-C5 항체를 투여하는 단계를 포함한다.
본 발명의 길항제 항체는 단일클론 억제성 항체를 포함한다. 단일클론 항체 또는 이의 단편은 모든 면역글로불린 부류 예컨대 IgM, IgG, IgD, IgE, IgA 또는 이의 하부부류, 예컨대 IgG 하부부류 또는 이의 혼합물을 포함한다. IgG 및 이의 하부부류 예컨대 IgG1, IgG2, IgG2a, IgG2b, IgG3 또는 IgGM이 유용하다. IgG 서브타입IgG.sub.1/kappa 및 IgG.sub.2b/kapp가 유용한 구체예로서 포함된다. 언급할 수 있는 단편은 포유류 C5에 대해 표유류에 대해서 높은 결합 및 중성화 활성을 나타내는 하나 또는 두개의 항원-보체 결합 부위를 갖는 모든 절두형 또는 변형 항체 단편이고, 예를 들어 항체에 상응하고 경쇄 및 중쇄, 예컨대 Fv, Fab 또는 F(ab')2 단편, 또는 단일 가닥 단편에 의해 형성되는 결합 부위를 갖는 항체의 일부이다. 절두형 이중 가닥 단편 예컨대 Fv, Fab 또는 F(ab')2가 특히 유용하다. 이러한 단편은 예를 들어 파파인 또는 펩신 등의 효소로 항체의 Fc 부분을 제거하는 효소적 수단에 의해서, 화학 산화에 의해서, 또는 항체 유전자의 유전자 조작에 의해서 얻을 수 있다. 유전적으로 조작된, 비절두형 단편을 사용하는 것이 또한 가능하고 이롭다.
신규 항체, 항체 단편, 이의 혼합물 또는 유도체는 이롭게, C5에 대한 결합 친화성이 l.x.10-7 M 내지 l.x.10-12 M, 또는 1.x.10-8 M 내지 l.x.10-11 M, 또는 l.x.10-9 M 내지 5.X.10-10 M 범위이다.
유전자 조작을 위한 항체 유전자는 예를 들어 당분야의 당업자에게 공지된 방식으로 하이브리도마 세포에서 단리할 수 있다. 이러한 목적을 위해서, 항체 생성 세포를 배양하고, 세포의 광학 밀도가 충분하면, 세포를 구아니디늄 티오시아네이트로 용해시키고, 아세트산나트륨으로 산성화시키며, 페놀, 클로로포름/이소아밀알콜로 추출하고, 이소프로판올로 추출하고 에탄올로 세정하는 공지의 방법으로 세포로부터 mRNA를 단리한다. 이어 역전사효소를 이용하여 mRNA로부터 cDNA를 합성한다. 합성된 cDNA를직접 삽입시키거나 또는 유전자 조작 후에, 예를 들어 부위 지정 돌연변이를 통해서, 삽입, 역위, 결실 또는 염기 교환 등을 한 후, 적절한 동물, 진균류, 박테리아 또는 바이러스 벡터에 삽입하고 적절한 숙주 유기체에서 발현시킨다. 박테리아 예컨대 E.coli 또는 효모 예컨대 사카로마이세스 세레비지아(Saccharomyces cerevisiae)유전자를 클로닝하고 발현하기 위해 유용한 박테리아 또는 효모 벡터는 pBR322, pUC18/19, pACYC184, 람다 또는 효모 mu 벡터 등이다.
본 발명은 또한 C5 항체를 합성하는 세포에 관한 것이다. 여기에는 상기 기술한 바와 같이 형질전환 후 동물, 진규, 박테리아 세포 또는 효모 세포가 포함된다. 이들은 이롭게는 하이브리도마 세포 또는 트리오마 세포이고, 전형적으로는 하이브리도마 세포이다. 이러한 하이브리도마 세포는 예를 들어, C5로 동물을 면역화하고 이러한 항체 생성 B 세포를 단리하고, C5 결합 항체에 대한 세포를 선별하며 이어서 이 세포를 예를 들어 인간 또는 동물, 예를 들어 마우스 골수종 세포, 인간 림프모구 세포 또는 이종하이브리도마 세포(예를 들어, 문헌 [Koehler 외, (1975) Nature 256: 496] 참조)와 융합시키는 공지의 방식으로 또는 적절한 바이러스로 세포를 감염시켜 불멸화 세포주를 생성하는 공지의 방식으로 생성할 수 있다. 융합으로 생성된 하이브리도마 세포는 유용하고 마우스 하이브리도마 세포주가 특히 유용하다. 본 발명의 하이브리도마 세포주는 IgG 형의 유용한 항체를 분비한다. 본 발명의 mAb 항체의 결합은 높은 친화성으로 결합하고 보체 단백질 C5의 생물학적 활성(예를 들어, C5 절단)을 감소 또는 중성화시킨다.
본 발명은 또한, C5 억제 활성은 보유하지만 약학 제제로서 이들의 용도, 예를 들어 생성 효율 또는 안정성에 관련된 하나 이상의 특성은 변화시킨 항-C5 항체의 유도체를 포함한다. 이러한 항-C5 항체 유도체의 예로는 펩티드, 항체의 항원 결합 영역에서 유도된 펩티드 모방체, 및 고체 또는 액체 담체 예컨대 폴리에틸렌 글리콜, 유리, 합성 중합체 예컨대 폴리아크릴아미드, 폴리스티렌, 폴리프로필렌, 폴리에틸렌 또는 천연 중합체 예컨대 셀룰로스, 세파로스 또는 아가로스 또는 효소와의 접합체, 독소 또는 방사성 또는 비방사성 마커 예컨대 3H, 123I, 125I, 131I, 32P, 35S, 14C, 51Cr, 36Cl, 57Co, 55Fe, 59Fe, 90Y, 99mTc, 75Se에 결합된 항체, 항체 단편 또는 펩티드, 또는 형광/화학발광 라벨 예컨대 로다민, 플루오레세인, 이소티오시아네이트, 파이코에리트린, 파이코시아닌, 플루오레스카민, 금속 킬레이트, 아비딘, 스트렙타비딘 또는 바이오틴 등에 공유 결합된 항체, 단편 또는 펩티드를 포함한다.
신규한 항체, 항체 단편, 이의 혼합물 및 유도체는 직접 사용하거나, 또는 건조, 예를 들어 동결 건조한 후, 상기 담체에 부착시킨 후 또는 약학 조제물을 생성하기 위한 다른 약학 활성 및 보조 성분과 제형화시킨 후에 사용할 수 있다. 언급할 수 있는 활성 및 보조 성분의 예에는 다른 항체, 살균 작용 또는 미생물 성장 저지 작용을 하는 항미생물성 활성 성분 예컨대 일반적인 항생제, 설폰아미드, 항종양제, 물, 완충제, 염수, 알콜, 지방, 왁스, 불활성 비히클 또는 다른 비경구용으로 통상적인 다른 성분, 예컨대 아미노산, 증점제 또는 당류 등이 있다. 이러한 약학 조제물은 질병을 치료하는데 사용되고, AMD(삼출성 및/또는 비삼출성) 및 당뇨병성 망막병증을 포함하는 안구의 신혈관성 질환 또는 질병의 하나 이상의 징후 발병을 안정화, 경감 및/또는 예방하기 위해 유용하다.
신규한 항체, 항체 단편, 이의 혼합물 또는 유도체는 치료 또는 진단에 직접 사용하거나 또는 상기 기술한 고체 또는 액체 담체, 효소, 독소, 방사성 또는 비방사성 라벨 또는 형광/화학발광 라벨에 커플링시킨 후 사용할 수 있다.
본 발명의 인간 C5 단일클론 항체는 당분야의 공지된 임의 방법으로 얻을 수 있다. 예를 들어, 포유류를 인간 C5로 면역화시킨다. 정제된 C5가 상업적으로 판매되고 있다(예를 들어, Quidel Corporation(미국, 캘리포니아, 샌디에고) 또는 Advanced Research Technologies(미국, 캘리포니아, 샌디에고)에서 판매). 다르게, 인간 C5는 인간 혈장에서 용이하게 정제할 수 있다. 항인간 C5 항체를 생성시키기 위해 사용되는 포유류는 제한적이지 않고 영장류, 설치류(예컨대, 마우스, 래트 또는 토끼), 소과 동물, 양, 염소 또는 개일 수 있다.
다음으로, 항체 생성 세포 예컨대 비장 세포를 면역화된 동물로부터 적출하고 골수종 세포와 융합시킨다. 골수종 세포는 당분야에서 공지되어 있다(예를 들어, p3x63-Ag8-653, NS-O, NS-1 또는 P3U1 세포를 사용할 수 있다). 세포 융합 작업은 당분야에서 공지된 통상의 임의 방법으로 수행할 수 있다.
세포 융합 작업을 수행한 후에, 세포를 이어 HAT 선별 배지에서 배양하여서 하이브리도마를 선별한다. 항인간 단일클론 항체를 생산하는 하이브리도마를 이후 스크리닝한다. 이 스크리닝은 예를 들어서 샌드위치 ELISA(enzyme linked immunosorben assay)로 수행하거나 또는 생성된 단일클론 항체를 인간 C5가 고정된 웰에 결합시켜서 수행한다. 이 경우, 2차 항체로서, 면역화된 동물의 면역글로불린에 특이적이고, 효소 예컨대 퍼옥시다제, 알칼리 포스파타제, 글루코스 옥시다제, 베타-D-갈락토시다제 등으로 표지화된 항체를 사용할 수 있다. 표지는 이의 기질과 표지화된 효소를 반응시켜서 생성된 색상을 측정하여 검출할 수 있다. 기질로서, 3,3-디아미노벤지딘, 2,2-디아미노비스-o-디아니시딘, 4-클로로나프톨, 4-아미노안티피린, o-페닐렌디아민 등이 제조된다.
상기 기술한 작업을 통해서, 항 인간C5 항체를 생산하는 하이브리도마를 선별할 수 있다. 선별된 하이브리도마는 통상의 제한 희석법 또는 소프트 아가법을 통해 클로닝한다. 바람직하다면, 클론된 하이브리도마를 혈청 함유 또는 무혈청 배지를 이용하여 대량 배양하거나, 마우스의 복강에 접종하고 복수를 회수하여서 다수의 클론된 하이브리도마를 얻을 수 있다.
선별된 항인간 C5 단일클론 항체 중에서, C5 절단을 방지하는 능력을 갖는 것(예를 들어, 세포 기반 C5 분석 시스템에서)을 선택하여 추가 분석 및 조작을 수행한다. 항체가 C5 절단을 차단하면, 시험한 단일클론 항체간 인간 C5의 C5 활성을 저하 또는 중성화시키는 능력을 갖는다는 의미이다. 즉, 이 단일클론 항체가 C5 절단 및 활성화를 특이적으로 인지 및/또는 방해한다는 것이다.
여기서 단일클론 항체는 또한, 바람직한 생물학적 활성을 갖는 한, 불변 도메인을 갖는 항-C5 항체(예를 들어, "인간화" 항체)의 가변(극가변 포함) 도메인, 또는 중쇄를 갖는 경쇄 또는 다른 종유래 쇄를 갖는 하나의 종 유래 쇄의 스플라이싱에 의해, 또는 항체 단편(예를 들어, Fab, F(ab)2 및 Fv)을 비롯하여, 기원 종 또는 면역글로불린 부류 또는 하부부류와 무관하게, 이종 단백질과의 융합을 통해서 생성된 하이브리드 및 재조합 항체를 포함한다(문헌 미국 특허 제4,816,567호 및 문헌 [Mage & Lamoyi, in Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp.79-97 (Marcel Dekker, Inc.), New York (1987)] 참조).
따라서, 용어 "단일클론"은 얻어진 항체의 특성이 항체의 실질적으로 동종 집단에서 유래하고, 임의 특정 방법에 의한 항체 생산을 요구하는 것에 한정되지 않는다. 예를 들어, 본 발명에 따라 사용되는 단일클론 항체는 문헌 [Kohler & Milstein, Nature 256:495 (1975)]에 처음 기술된 하이브리도마 방법으로 제조할 수 있고, 또는 재조합 DNA 방법(미국 특허 제4,816,567호)으로 제조할 수 있다. "단일클론 항체"는 또한 예를 들어, 문헌 [McCafferty 외, Nature 348:552-554 (1990)]에 기술된 기술을 이용하여 생성된 파지 라이브러리로부터 단리할 수 있다.
비인간(예를 들어, 쥣과 동물) 항체의 "인간화" 형태는 비인간 면역글로불린 유래의 최소 서열을 함유하는 특이적 키메라 면역글로불린, 면역글로불린쇄 또는 이의 단편(예컨대, Fv, Fab, Fab', F(ab)2 또는 항체의 다른 항원 결합 하부서열)이다. 대부분의 경우에서, 인간화 항체는 인간 면역글로불린(수용자 항체)로서 수용자 항체의 상보성 결정 영역(CDR) 유래 잔기가 비인간 종(공여자 항체) 예컨대 바람직한 특이성, 친화성 및 수용능을 갖는 마우스, 래트 또는 토끼 등의 CDR 유래 잔기로 치환된다. 일례에서, 인간 면역글로불린의 Fv 골격 영역(FR) 잔기를 상응하는 비인간 FR 잔기로 치환한다. 또한, 인간화 항체는 수용자 항체 또는 도입되는 CDR 또는 FR 서열 중에서 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 이러한 변형은 추가로 항체의 성능을 세련되게하고 최적화시킨다. 일반적으로, 인간화 항체는 하나 이상, 전형적으로 두개의 가변 영역의 실질적으로 모두를 포함하게 되는데, 여기서 CDR 영역의 모두 또는 실질적으로 모두는 비인간 면역글로불린의 것에 상응하고 FR 잔기의 모두 또는 실질적으로 모두는 인간 면역글로불린의 공통 서열의 것이다. 인간화 항체는 선택적으로 또한 전형적으로 인간 면역글로불린의 것인 면역글로불린 불변 영역(Fc)의 적어도 일부를 포함한다.
비인간 항체를 인간화하는 방법은 당분야에서 공지이다. 일반적으로, 인간화 항체는 비인간 공급원에서 유래하여 이 항체에 도입된 하나 이상의 아미노산 잔기를 갖는다. 이 비인간 아미노산 잔기는 통상 "유입된(import)" 가변 영역에서 유래하는 "유입된" 잔기라고 한다. 인간화는 본질적으로 하기 윈터 및 그 공통 연구자들의 방법(Jones 외, (1986) Nature 321: 522-525; Riechmann 외, (1988) Nature 332: 323-327; 및 Verhoeyen 외, (1988) Science 239: 1534-1536)에 따라 수행되는데, 설치류 CDR 또는 CDR 서열을 인간 항체의 상응하는 서열로 치환시켜서 수행한다. 따라서, 이러한 "인간화" 항체는 키메라 항체이고, 여기서 실질적으로 완전한 인간 가변 도메인보다 작은 부분이 비인간 종 유래의 상응하는 서열로 치환된 것이다. 실제로, 인간화 항체는 전형적으로, 일부 CRT 잔기 및 가능한 일부 FR 잔기가 설치류 항체 내 유사 부위 유래 잔기로 치환된 인간 항체이다.
인간화 항체를 제조하는데 사용하기 위한 인간 가변 도메인, 경쇄 및 중쇄의 선택은 항원성을 감소시키는데 매우 중요하다. "최상 적합"이라고 하는 방법에 따라서, 설치류 항체의 가변 도메인의 서열을 공지된 인간 가변 도메인 서열의 전체 라이브러리에 대해 스크리닝한다. 설치류의 것에 가장 가까운 인간 서열을 인간화 항체를 위한 인간 골격(FR)으로 사용한다(Sims 외, (1993) J. Immunol., 151 :2296; 및 Chothia and Lesk (1987) J. MoL Biol., 196:901). 다른 방법은 경쇄 또는 중쇄의 특정 하부 그룹의 모든 인간 항체의 공통 서열에서 유래하는 특정 골격을 사용한다. 동일한 골격을 몇몇 상이한 인간화 항체를 위해 사용할 수 있다(Carter 외, (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 89: 4285; 및 Presta 외, (1993) J. Immol., 151:2623).
항원에 대한 높은 친화성 및 다른 바람직한 생물학적 특성을 유지시키면서 항체를 인간화하는 것이 또한 중요하다. 이러한 목적을 이루기 위해서, 하나의 유용한 방법에 따르면, 인간화 항체는 모서열 및 인간화 서열의 3차원적 모델을 이용하여 모서열 및 다양한 개념적 인간화 산물을 분석하는 과정을 통해 제조한다. 3차 면역글로불린 모델이 일반적으로 이용가능하고 이는 당분야의 당업자에게 친숙하다. 선별된 후보 면역글로불린 서열의 가능한 3차 입체 구조를 설명하고 제시하는 컴퓨터 프로그램을 이용가능하다. 이러한 디스플레이 검사는 후보 면역글로불린 서열의 작용성에서 잔기의 가능한 역할을 분석할 수 있게 하는데, 즉 항원에 결합하는 후보 면역글로불린의 능력에 영향을 주는 잔기를 분석할 수 있게 한다. 이러한 방식으로, FR 잔기를 선별하고 공통 및 유입 서열로부터 조합하여서 목적하는 항체 특징, 예를 들어, 표적 항원(들)에 대해 증가된 친화성을 얻을 수 있다. 일반적으로, CDR 잔기는 직접적이고 가장 실질적으로 항원 결합에 영향을 주는데 관여하다.
C5에 대한 인간 단일클론 항체가 또한 본 발명에 포함된다. 이러한 항체는 하이브리도마 방법으로 제조할 수 있다. 인간 단일클론 항체의 제조를 위한 인간 골수종 및 마우스-인간 이종골수종 세포주가 예를 들어 문헌 [Kozbor (1984) J. Immunol., 133, 3001; Brodeur, 외, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp.51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987); 및 Boemer 외, (1991) J. Immunol., 147:86-95]에 기술되어 있다.
면역화 시, 내재성 면역글로불린 생산이 없는 경우 인간 항체의 완전한 레파토리를 생산할 수 있는 형질전환 동물(예를 들어, 마우스)을 생산하는 것이 이제 가능하다. 예를 들어, 키메라 및 생식계열 돌연변이체 마우스에 항체 중쇄 연결 영역(J.sub.H) 유전자의 동형접합 결실을 통해서 내재성 항원 생산을 완전하게 억제하는 것에 대해 개시되어 있다. 이러한 생식계열 돌연변이체 마우스에 인간 생식계열 면역글로불린 유전자 배열을 전이시켜서 항원 공격 시 인간 항체를 생산하게 된다(예를 들어, 문헌 [Jakobovits 외, (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 90: 2551; Jakobovits 외, (1993) Nature, 362:255-258; 및 Bruggermann 되, (1993) Year in Immuno., 7:33] 참조한다).
다르게, 파지 디스플레이 방법(McCafferty 외, (1990) Nature, 348: 552- 553)을 사용하여 비면역화 공여자 유래의 면역글로불린 가변(V) 도메인 유전자 레파토리로부터 인간 항체 및 항체 단편을 생산할 수 있다(예를 들어, 문헌 [Johnson 외, (1993) Current Opinion in Structural Biology, 3:564-571]을 참조한다). V-유전자 절편의 몇몇 공급원을 파지 디스플레이에 사용할 수 있다. 예를 들어, Clackson 등((1991) Nature, 352: 624-628)은 면역화된 마우스의 비장에서 유리된 V 유전자의 소규모의 무작위적으로 조합된 라이브러리에서 항옥사졸론 항체의 다양한 배열을 단리하였다. 비면역화 인간 공여자 유래의 V 유전자의 레파토리를 제작할 수 있고, 항원(자가 항원 포함)의 다양한 배열에 대한 항체를 하기 문헌에 기술된 방법에 따라 실질적으로 분리할 수 있다(Marks 외, ((1991) J. MoL Biol., 222:581-597, 또는 Griffith 외, (1993) EMBO J., 12:725- 734).
천연 면역 반응에서, 항체 유전자는 높은 비율로 돌연변이를 축적시킨다(체세포성 과변이). 도입되는 변화 중 일부는 보다 높은 친화성을 부여하고, 이후 항원 공격 동안 고친화성 표면 면역글로불린을 제시하는 B 세포가 우선적으로 복제되어 분화된다. 이러한 자연적인 과정은 "사슬 셔플링"이라고 알려진 기술을 사용하여 모방할 수 있다(문헌 [Marks 외, (1992) Bio. Technol., 10:779-783] 참조). 이 방법에서, 파지 디스플레이로 얻은 "1차" 인간 항체의 친화성은 비면역화 공여자에서 얻은 V 도메인 유전자의 천연 발생 변이체(레파토리)의 레파토리로 중쇄 및 경쇄 V 영역 유전자를 연속적으로 치환시켜서 개선시킬 수 있다. 이러한 방법은 nM 범위의 친화성을 갖는 항체 및 항체 단편을 생산 가능하게 한다. 매우 거대한 파지 항체 레파토리를 만들기 위한 과정은 문헌 [Waterhouse 외, 1993, Nucl. Acids Res., 21 :2265-2266]을 참조한다.
유전자 셔플링을 또한 사용하여 설치류 항체로부터 인간 항체를 유도시킬 수 있는데, 여기서 인간 항체는 출발 설치류 상체와 유사한 친화성 및 특이성을 갖는다. 이 방법은 또한, "에피토프 임프린팅"이라고 하며, 이 방법에 따라서, 파지 디스플레이를 통해 얻은 설치류 항체의 중쇄 또는 경쇄 V 도메인을 인간 V 도메인 유전자의 레파토리로 교체하여, 설치류-인간 키메라를 생성시킨다. 항원에 대한 선별을 통해서 기능성 항원 결합 부위를 복원할 수 있는 인간 가변부를 단리하게 되고, 즉 에피토프가 파트너의 선택을 제어(임프린트)한다. 나머지 설치류 V 도메인을 교체하기 위해 이 방법을 반복하여, 인간 항체를 얻는다(예를 들어, 1993년 4월 1일 공개된 국제 공개 특허 제WO93/06213호 참조). CDR 그래프팅을 통해 설치류 항체의 전통적인 인간화와 달리, 이 방법은 설치류 기원의 골격 또는 CDR 잔기가 없는 완전한 인간 항체를 제공한다).
본 발명의 방법에서 항-C5 제제로서 사용할 수 있는 단일클론 항체 및 항체 단편의 예로는 각각 에쿨리주맙(Soliris™, Alexion, Cheshire, CT로도 알려짐) 및 페셀리주맙(Alexion, Cheshire, CT)이 있고, 이 둘은 미국 특허 제6,355,245호 기술되어 있으며, 이를 전체로 참조하여 본 발명에 포함시킨다.
본 발명은 또한, 안구 질환을 안정화, 치료 및/또는 예방하는 본 발명의 방법에서 각각 PDGF 및/또는 VEGF 및 이의 동종 수용체 PDGFR 및/또는 VEGFR에 대한 길항제 항체와 본 발명의 항-C5 제제의 용도를 포함한다. 따라서, 상기 기술한 방법은 리간드(예를 들어, PDGF 또는 VEGF)와 이의 표적 예컨대 동종 수용체의 결합을 차단하기 위해서 본 발명의 항체 길항제를 생성하기 위한 용도일 수 있다. 따라서, 본 발명의 PDGF 길항제 항체는 PDGF와 PDGFR 표적에 대한 항체를 포함한다.
본 발명의 방법에서 항-C5 제제와 함께 사용하기 위한 VEGF에 대한 길항제 항체의 예에는 미국 특허 제6,054,297호(본 발명에 전체로 참조하여 포함시킴)에 기술된 베바시주맙(Avastin®이라고도 알려짐, Genentech 제조(미국, 캘리포니아, 샌프란시스코)) 및 라니비주맙(Lucentis®이라고도 알려짐, Genentech 제조(미국, 캘리포니아, 샌프란시스코)이 있다.
안티센스 및 리보자임 항-C5 제제
본 발명의 항-C5 제제는 C5를 표적화하고 매신저 RNA로부터 단백질 번역을 억제하여 또는 상응하는 C5 mRNA의 분해를 표적화하여 C5를 억제하는 효과를 보이는 안티센스 올리고뉴클레오티드 및 리보자임을 포함한다. 안구 질환의 치료 방법에서 항-C5 안티센스 및 리보자임 제제의 용도를 또한 제공한다. 특정 구체예에서, 본 발명은 안구 질환의 하나 이상의 징후, 구체적으로 당뇨병성 망막병증, 삼출성 및/또는 비삼출성 AMD의 징후를 경감, 안정화 및/또는 예방하는 방법에서 개체에게 항-C5 안티센스 또는 리보자엠 제제를 투여하는 단계를 포함한다.
안티센스 올리고뉴클레오티드 및 리보자임의 디자인 및 합성 방법은 당분야에서 공지이다. 추가적인 지침을 제공한다.
특이적이고 유효한 mRNA 표적화 올리고뉴클레오티드(안티센스 ODN) 및 리보자임을 디자인하는데 있어서 문제는 표적 mRNA(그 자체로 부분 자체 쌍형성 2차 구조로 폴딩됨) 내에서 안티센스 쌍 형성의 접근가능 부위를 확인하는 것이다. RNA 쌍형성 접근성을 예측하기 위한 컴퓨터 보조 알고리즘 및 분자 스크리닝의 조합으로 대부분의 mRNA 표적에 대해 특이적이고 유효한 리보자임 및/또는 안티센스 올리고뉴클레오티드를 생성하는 것이 가능해 진다. 또한, 안티센스 또는 리보자임 억제제에 대한 표적 RNA 분자의 접근성을 결정하는 몇몇 방법이 기술되어 있다. 그 중 한 방법은 가능한 많은 안티센스 올리고데옥시뉴클레오티드를 사용하는 시험관 내 스크리닝 분석법을 사용한다(예를 들어, 문헌 [Monia 외, (1996) Nature Med., 2:668-675; 및 Milner 외, (1997) Nature Biotechnol., 15:537-541] 참조). 다른 방법은 ODN의 라이브러리를 활용한다((Ho 외, (1996) Nucleic Acids Res., 24:1901-1907; Birikh 외, (1997) RNA 3:429-437; 및 Lima 외, (1997) J. Biol. Chem., 272:626-638). 접근가능한 부위는 RNase H 절단을 통해 모니터링할 수 있다(문헌 [Birikh 외, 상동; 및 Ho 외, (1998) Nature Biotechnol., 16:59-63). RNase H는 DNA-RNA 듀플렉스의 RNA 가닥의 포스포디에스테르 골격의 가수분해 절단을 촉매한다.
다른 방법에서는 반무작위적인, 키메라 화학 합성된 ODN을 사용하여, 시험관 내 합성된 RNA 표적 상에서 RNase H로 절단되는 접근가능 부위를 확인한다. 이어서, 프라이머 확장 분석법을 사용하여 표적 분자 내에서 이 부위들을 확인한다(Lima 외, 상동). RNA에서 안티센스 표적을 디자인하는 다른 방법은 RNA에 대한 폴딩 모델을 보조하는 컴퓨터를 기반으로 한다. 효율적인 절단을 스크리닝하기 위한 무작위적인 리보자임 라이브러리를 사용하는 몇몇 보고서가 공개되었다(Campbell 외, (1995) RNA 1:598-609; Lieber 외, (1995) MoI. Cell Biol., 15: 540-551; 및 Vaish 외, (1997) Biochem., 36:6459-6501).
다른 시험관 내 방법은 ODN의 무작위 또는 반무작위적 라이브러리를 사용하는데, RNase H가 컴퓨터 시뮬레이션보다 유용할 수 있다(Lima 외, 상동). 그러나, 시험관 내 합성된 RNA의 사용으로 생체 내 안티센스 ODN의 접근성을 예측할 수 없는데, 최근 관찰에 의하면 폴리뉴클레오티드의 어닐링 상호작용이 RNA-결합 단백질에 의해 영향을 받기 때문이다(Tsuchihashi 외, (1993) Science, 267:99-102; Portman 외,(1994) EMBO J., 13:213-221; 및 Bertrand and Rossi (1994) EMBO J., 13:2904-2912). 전체로 참조하여 본 발명의 포함시킨 미국 특허 제6,562,570호는 생체내 조건을 모방한, 세포 추출물 존재하에서 mRNA 내 접근가능 부위를 결정하는 조성물 및 방법을 제공한다.
간략하게, 이 방법은 하나 이상의 RNA 결합 단백질의 존재로 세포 추출물을 모방하거나, 또는 내재성 RNA 결합 단백질을 함유하는 세포 추출물을 포함하는 반응 배지 중에 하이브리드화 조건하에서, 무작위 또는 반무작위 ODN, 리보자임 또는 DNA자임 라이브러리, 또는 한정된 안티센스 ODN, 리보자임 또는 DNA자임과, 천연 또는 시험관 내 합성 RNA를 항온 반응시키는 것을 포함한다. 표적 RNA 내 접근가능 부위에 상보적인 임의 안티센스 ODN, 리보자임 또는 DNA자임이 그 부위에 하이브리드하게 된다. 한정된 ODN 또는 ODN 라이브러리를 사용하는 경우, RNase H가 하이브리드화 동안 존재하거나 하이브리드화 후에 첨가되어 하이브리드화가 일어난 RNA를 절단한다. RNAse H는 리보자임 또는 DNA자임을 사용하는 경우에 존재할 수 있지만, 필수적이지는 않은데, 리보자임 및 DNA자임은 하이브리드화가 일어난 RNA를 절단하기 때문이다. 일례에서, 내재성 mRNA, RNA 결합 단백질 및 RNase H를 함유하는 세포 추출물 내 무작위 또는 반무작위 ODN 라이브러리를 사용한다.
다음으로, 다양한 방법을 사용하여 안티센스 ODN, 리보자임 또는 DNA자임이 결합하고 절단이 일어난 표적 RNA 상의 부위를 확인할 수 있다. 예를 들어, 말단 데옥시뉴클레오티딜 트랜스퍼라제 의존적 폴리머라제 사슬 반응(TDPCR)을 이러한 목적으로 사용할 수 있다(Komura and Riggs (1998) Nucleic Acids Res., 26:1807-11). 역전사 단계를 사용하여 RNA 주형을 DNA로 전환시킨 후, TDPCR을 실시한다. 본 발명에서, TDPCR에 필요한 3' 말단은 임의 적절한 RNA 의존적 DNA 폴리머라제(예를 들어, 역전사효소)를 이용하여 목적하는 표적 RNA를 역전사시켜서 생성시킨다. 이는 시험중인 표적 RNA 분자의 일부로부터 하류(즉, RNA 분자 상의 5' 에서 3' 방향)인 영역 내 RNA에 제1 ODN 프라이머(P1)를 하이브리드화시켜 이룰 수 있다. dNTP 존재하에서 폴리머라제는 P1의 3'말단으로부터 RNA에서 DNA로 복제하고 안티센스 ODN/RNase H, 리보자임 또는 DNA자임에 의해 생성된 절단 부위에서 복제를 종결한다. 새로운 DNA 분자(제1 가닥 DNA라고 함)는 RNA 상에 존재하는 대응되는 접근가능 표적 서열을 확인하기 위해 사용되는, TDPCR 방법의 PCR 부분에서의 제1 주형으로 제공된다.
예를 들어, TDPCR 방법은, 즉 구아노신 트리포스페이트(rGTP)를 이용하여 역전사된 DNA를 말단 데옥시뉴클레오티딜 트랜스퍼라제(TdT) 존재하에서 반응시켜서 DNA 분자의 3'말단 상에 (rG)2-4 테일을 첨가하는데 사용할 수 있다. 다음으로, (rG)2-4 테일과 염기쌍을 이루는 하나의 가닥 상에 3'2-4 오버행을 갖는 이중 가닥 ODN 링커를 결찰시킨다. 이어 두 PCR 프라이머를 첨가한다. 하나는 (rG)2-4 테일(종종 짧은 가닥이라고 함)에 결찰되는 TDPCR 링커의 가닥에 상보적인 링커 프라이머(LP)이다. 나머지 프라이머(P2)는 P1과 동일하지만, P1에 대해서 포개질 수 있는데, 즉 P1이 결합하는 영역으로부터 적어도 부분적으로 상류(즉, RNA 분자 상의 3' 에서 5' 방향)이지만, 시험 중인 표적 RNA 분자 부분의 하류에 있는 영역에서 표적 RNA에 상보적이다. 즉, 접근가능한 결합 부위를 갖는가에 대해 결정하기 위해 실험 중인 표적 RNA 분자의 부분은 P2에 상보적인 영역의 상류에 있는 영역이다. 이어 프라이머 LP 및 P2로 한정되는 DNA 절편을 증폭하기 위하여 DNA 폴리머라제 및 dNTP의 존재하에서 공지의 방식으로 PCR을 수행한다. 증폭된 생성물은 임의 다양한 공지 방법을 통해 포획할 수 있어 이어 자동 DNA 분석기 상에서 서열 분석하여 절단 부위의 정밀한 동정을 가능하게 한다. 이러한 주체를 결정하면, 정해진 서열 안티센스 DNA 또는 리보자임을 시험관 내 또는 생체 내에서 사용하기 위해 합성할 수 있다.
특정 유전자 발현에서 안티센스 중재는 합성된 안티센스 올리고뉴클레오티드 서열을 사용하여 이룰 수 있다(예를 들어, 문헌 [Lefebvre-dΗellencourt 외, (1995) Eur. Cyokine Netw., 6:7; Agrawal (1996) TIBTECH, 14: 376; 및 Lev-Lehman 외, (1997) Antisense Therap. Cohen and Smicek, eds. (Plenum Press, New York)] 참조한다). 간략하게, 안티센스 올리고뉴클레오티드 서열은 목적하는 표적 mRNA에 상보적이도록 디자인된 짧은 DNA 서열로서, 전형적으로 15∼30mer이지만 7mer정도로 작을수도 있고(문헌 [Wagner 외, (1994) Nature, 372: 333] 참조) RNA: AS 듀플렉스를 형성한다. 이러한 듀플렉스 형성은 관련 mRNA의 프로세싱, 스플라이싱, 수송 또는 번역을 방해할 수 있다. 또한, 일정 AS 뉴클레오티드 서열은 이들 표적 mRNA와 하이브리드화시에 RNAse H 활성을 유도시켜서 mRNA를 분해시킬 수 있다(Calabretta 외, (1996) Semin. Oncol., 23:78). 이러한 경우에서, RNase H는 듀플렉스의 RNA 성분을 절단하게되고 AS를 강력하게 방출하여서 표적 RNA의 추가 분자와 더욱 하이브리드화시킬 수 있다. 게놈 DNA와 AS의 상호작용에 의한 추가적인 작용 모드는 전사적으로 불활성인 삼중 헬릭스를 형성시킨다.
상기 기술한 바와 같은 안티센스 서열의 비제한적이고, 또는 이에 더하여, 또는 이를 대체하여, 리보자임을 유전자 기능을 억제하는데 사용할 수 있다. 이는 안티센스 치료법이 화학양론적 고려 사항에 의해 제한되는 경우에 특히 필요하다. 리보자임은 동일한 서열을 표적화하는데 사용할 수 있다. 리보자임은 표적 RNA에 특정 부위를 절단하는 RNA 촉매능을 보유하는 RNA 분자이다. 리보자임에 의해 절단되는 RNA 분자의 수는 1:1 화학양론으로 예측되는 수보다 많다(예를 들어, 문헌 [Hampel and Tritz (1989) Biochem., 28: 4929-33; 및 Uhlenbeck (1987) Nature, 328: 596-600] 참조). 따라서, 본 발명은 또한 적절한 촉매 중심을 함유하고 PDGF 또는 VEGF mRNA의 접근가능 도메인을 표적화하는 리보자임 서열의 사용을 가능하게 한다. 리보자임은 당분야에서 공지된 바에 따라 제조 및 전달되고 이하 추가 설명한다. 리보자임은 안티센스 서열과 조합하여 사용할 수 있다.
리보자임은 RNA의 포스포디에스테르 결합 절단을 촉매한다. 몇몇 리보자임 구조 패밀리가 그룹 I 인트론, RNase P, 헤파티티스 델타 바이러스 리보자임, 해머헤드 리보자임 타바코 링스팟 바이러스 위성 RNA(sTRSV)의 음성 가닥으로부터 기원하는 헤어핀 리보자임을 포함하여 동정되었다(예를 들어, 문헌 [Sullivan (1994) Investig. Dermatolog., (Suppl.) 103: 95S] 및 미국 특허 제5,225,347호 참조). 뒤의 두 패밀리는 비로이드 및 비루소이드로부터 유래하는데, 여기서 리보자임은 롤링 서클 복제 동안 생성된 올리고머로부터 단량체를 분리하는 것으로 여겨진다( 문헌 [Symons (1989) TEBS, 14: 445-50; Symons (1992) Ann. Rev. Biochem., 61: 641-71] 참조). 해머헤드 및 헤어핀 리보자임 모티프는 유전자 치료법을 위한 mRNA의 트랜스 절단을 위해 가장 일반적으로 채택된다. 본 발명에서 사용되는 리보자임 유형은 당분야에서 공지된 바에 따라 선택된다. 헤어핀 리보자임은 현재 임상 실험 중이고 특히 유용한 유형이다. 일반적으로, 리보자임은 그 길이가 30 내지 100 뉴클레오티드이다.
부위 특이적 인지 서열에서 mRNA를 절단하는 리보자임은 특정 mRNA를 파괴하기 위해 사용될 수 있는 한편, 해머헤드 리보자임의 사용는 특히 유용하다. 해머헤드 리보자임은 표적 mRNA와 상보적 염기쌍을 형성하는 영역이 측접되어 지정된 위치에서 mRNa를 절단한다. 유일한 요구 사항은 표적 mRNA가 하기의 두 염기 서열 5'-UG-3'을 갖는 것이다. 해머헤드 리보자임의 제작 및 생산은 당분야에서 공지이고 보다 자세하게는 문헌 [Haseloff and Gerlach (1988) Nature, 334: 585]을 참조한다.
본 발명의 리보자임은 또한 RNA 엔도리보뉴클레아제(여기서는 "Cech형 리보자임"이라 함) 예컨대 테트라하이메나 써모필리아(Tetrahymena thermophila)에서 천연적으로 발생하는 것(IVS 또는 L-19 IVS RNA로 공지됨)으로서 Thomas Cech 및 그의 공동 연구자 들에 의해 광범위하게 기술되어진 것이 있다(문헌 [Zaug 외, (1984) Science, 224:574-578; Zaug and Cech (1986) Science, 231:470-475; Zaug, 외, (1986) Nature, 324:429-433; 국제 공개 특허 제W088/04300호; Been and Cech (1986) Cell, 47:207-216] 참조함). Cech형 리보자임은 8 염기쌍 활성 부위를 가지며, 이는 표적 RNA 서열과 하이브리드화하고 여기서 표적 RNA의 절단이 일어난다. 본 발명은 8 염기쌍 활성 서열을 표적화하는 Cech형 리보자임을 포함한다. 본 발명은 특정 작용 기전에 한정되지 않으며, 본 발명의 해머헤드 리보자임을 사용하는 것은 PDGF/VEGF 지정 안티센스를 사용하는 것보다 장점을 가질 수 있는데, 최근 보고에 의하면 해머헤드 리보자임이 mRNA 표적의 특이적 절단 및/또는 RNA 번역을 차단하여 작용하는 것으로 나타났다.
안티센스 방법에서 처럼, 리보자임은 변형된 올리고뉴클레오티드(예를 들어, 안정성, 표적화 등의 개선을 위해)로 구성될 수 있고, 표적 mRNA를 발현하는 세포에 전달된다. 유용한 전달 방법은 강력한 구성성 polIII 또는 polII 프로모터의 제어하에 리보자임을 "인코딩"하는 DNA 구성체를 이용하여, 형질 감염된 세포가 표적화된 메신저를 파괴하고 번역을 억제하는데 충분한 양의 리보자임을 생성하도록 하는 것을 포함한다. 리보자임은 안티센스 분자와 달리, 촉매성이기때문에, 효능을 위해 보다 낮은 세포 농도를 요구한다.
상기 기술한 바와 같이, 필요한 경우, 뉴클레아제 내성은, 사용 및 전달 방법에 필요한 바와 같은 안티센스 올리고데옥시뉴클레오티드 또는 리보자임의 생물학적 활성을 실질적으로 방해하지 않는 당분야에서 공지된 임의 방법으로 제공된다((Iyer 외, (1990) J. Org. Chem., 55: 4693-99; Eckstein (1985) Ann. Rev. Biochem., 54: 367-402; Spitzer and Eckstein (1988) Nucleic Acids Res., 18: 11691-704; Woolf 외, (1990) Nucleic Acids Res., 18: 1763-69; and Shaw 외, (1991) Nucleic Acids Res., 18: 11691-704). 앱타머에 대해 상기 기술한 바와 같이, 뉴클레아제 내성을 증가시키기 위해서 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 리보자임에 수행할 수 있는 비제한적인 대표적 변형에는 포스페이트 골격 내 인 또는 산소 이종 원자의 변형, 단쇄 알킬 또는 시클로알킬 당내 결합 또는 단쇄 이종원자 또는 복소환 당내 결합 등이 포함된다. 여기에는 예를 들어, 2'-플루오르화, O-메틸화, 메틸 포스포네이트, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 및 모르포리노 올리고머를 제저하는 것이 포함된다. 예를 들어, 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 리보자임은 4 내지 6 3' 말단 뉴클레오티드 염기 사이에 포스포로티오에이트 결합 연결을 가질 수 있다. 다르게, 포스포로티오에이트 결합은 모든 뉴클레오티드 염기를 연결할 수 있다. 포스포로티오에이트 안티센스 올리고뉴클레오티드는 정상적으로는 유효한 농도에서 유의한 독성을 나타내지 않고 동물에서 충분한 약물역학적 반감기를 나타내며(예를 들어, 문헌 [Agarwal 외, (1996) TEBTECH, 14: 376] 참조), 뉴클레아제 내성이다. 다르게, AS-ODN에 대한 뉴클레아제 내성은 뉴클레오티드 서열 CGCGAAGCG를 가지는 3' 말단 9 뉴클레오티드 루프 형성 서열을 제공하여 부여할 수 있다. 아비딘-바이오틴 접합 반응을 이용하여 또한 혈청 뉴클레아제 분해에 대한 AS-ODN의 보호능을 개선시킬 수 있다(문헌 [Boado and Pardridge (1992) Bioconj. Chem., 3: 519-23] 참조). 이러한 개념에 따라서, AS-ODN 제제를 이의 3' 말단에서 단일 바이오틴화시킬 수 있다. 아미딘과 반응시, 이들은 강한, 뉴클레아제 내성 복합체를 형성하는데, 안정성이 비접합 ODN에 비해 6배 개선된다.
다른 연구는 안티센스의 올리고데옥시뉴클레오티드의 생체내 연장을 보여준다(Agarwal 외, (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 88: 7595). 순환계로부터 외부 AS-올리고뉴클레오티드를 제거하기 위한 스캐빈저 기전에 유용한 이 방법은 연장이 일어나는 부착된 올리고뉴클레오티드 내 유리 3' 말단의 존재에 의존적이다. 따라서, 이 중요한 위치에 부분 포스포로티오에이트, 루프 보호 또는 바이오틴-아비딘은 AS-올리고데옥시뉴클레오티드의 안정성을 보장하기에 충분해야한다.
상기 기술한 바와 같이 변형 염기를 사용하는 것 이외에도, 뉴클레오티드 유사체를 제조할 수 있는데, 여기서 뉴클레오티드의 구조는 기본적으로 변경되고 치료 또는 실험 시약으로서 보다 적합하다. 뉴클레오티드 유사체의 예에는 헵티드에서 발견되는 것과 유사하게, DNA(또는 RNA) 내 데옥시리보스(또는 리보스) 포스페이트 골격이 폴리아미드 골격으로 교체된 펩티드 핵산(PNA)가 있다. PNA 유사체는 효소에 의한 분해에 내성을 나타내고 생체 내 및 시험관 내 수명이 연장되었다. 또한, PNA는 DNA 분자에 비해 상보성 DNA 서열에 보다 강하게 결합하는 것으로 확인되었다. 이러한 관찰 결과는 PAN 가닥과 DNA 가닥 사이에 전하 반발이 없는 것에 의한다. 올리고뉴클레오티드에 가할 수 있는 다른 변형에는 폴리머 골격, 모르폴리노 중합체 골격(예를 들어, 미국 특허 제5,034,506호를 참조하며, 이의 내용을 참조하여 본 발명에 포함시킨다), 환형 골격 또는 비환형 골격, 당 모방체 또는 올리고뉴클레오티드의 약물역학을 개선시킬 수 있는 것을 포함한 임의 다른 변형을 포함한다.
본 발명의 추가 측면은 표적 mRNA의 발현을 감소시키기 위한 DNA 효소의 용도에 관한 것으로서, 예를 들어, C5 효소는 안티센스 및 리보자임 두 방법의 기술적 특징의 일부를 포함한다. DNA 효소는 이들이 안티센스 올리고뉴클레오티드처럼 특정 표적 핵산 서열을 인지하지만, 리보자임처럼 촉매성이고 표적 핵산을 특이적으로 절단하도록 디자인된다.
현재 기본적인 2 유형의 DNA 효소가 존재하는데 이들 둘은 Santoro 및 Joyce(예를 들어, 미국 특허 제6,110,462호 참조)가 동정하였다. 10∼23 DNA 효소는 두개의 암이 연결된 루프 구조를 포함한다. 이 두 암은 특정 표적 핵산 서열을 인지하는 특이성을 제공하는 한편 루프 구조는 생리적 조건하에서 촉매 기능을 제공한다.
간략하게, 표적 핵산을 특이적으로 인지하고 절단하는 DNA 효소를 디자인하기 위해서, 당분야의 당업자는 우선 고유한 표적 서열을 동정해야한다. 이는 안티센스 올리고뉴클레오티드에 대해 약술한 바와 동일한 방법을 사용하여 수행할 수 있다. 일례에서, 고유하거나 실질적인 서열은 G/C가 풍부한 대략 18 내지 22 뉴클레오티드이다. 높은 G/C 함량은 DNA 효소와 표적 서열 간의 보다 강력한 상호작용을 보장한다.
DNA 효소를 합성하는 경우, 메세지에 대해 효소를 표적화하는 특이적 안티센스 인지 서열은 DNA 효소의 두 암을 포함하고, DNA 효소 루프가 이 두 특이적 암 사이에 위치하도록 나뉜다.
DNA 효소를 제조 및 투여하는 방법은 예를 들어, 미국 특허 제6,110,462호에서 확인할 수 있다. 유사하게, 시험관 내 또는 생체 내 DNA 리보자임 전달 방법은 본 발명에서 개략적으로 기술한 바와 같이, RNA 리보자임 전달 방법을 포함한다. 추가적으로, 당분야의 당업자들은, 안티센스 올리고뉴클레오티드와 유사하게, DNA 효소를 선택적으로 변형하여 분해에 대한 내성을 개선하고 안정성을 개선할 수 있다는 것을 인지할 수 있다.
본 발명은 또한 안구 질환의 안정화, 치료 및/또는 예방하는 본 발명에서 PDGF 및/또는 VEGE 발현에 대한 안티센스, 리보자임 및/또는 DNA 효소 제제와 함께 본 발명의 항-C5 제제를 사용하는 것을 포함한다. 따라서, 상기 기술한 방법은 본 발명의 항-C5 제제와 함께 사용하기 위한 PDGF 및/또는 VEGF 발현을 차단 또는 억제하기 위한 안티센스, 리보자임 및/또는 DNA 효소 제제를 생성하는데 사용할 수 있다.
항-C5 RNAi 제제
본 발명의 몇몇 구체예는 RNA 간섭(RNAi)에 의한 C5의 억제를 실시하기 위한 재료 및 방법을 이용한다. 따라서, 본 발명의 항-C5 제제는 항-C5 RNAi 제제를 포함한다. 본 발명은 본 발명의 안구 질환을 치료하는 방법에 있어서 항-C5 RNAi 제제의 이용을 포함한다. 특정 구체예에서, 본 발명은 안구 질환의 1 이상의 징후, 특히 당뇨병성 망막병증, 삼출성 및/또는 비삼출성 AMD의 징후를 경감, 안정화 및/또는 예방하는 방법에 있어서 개체에게 항-C5 RNAi 제제를 투여하는 것을 포함한다.
RNAi는 진핵 세포에서 발생할 수 있는 서열 특이적 전사후 유전자 억제의 과정이다. 일반적으로, 이 과정은 상기 서열에 일치하는 이중 가닥 RNA(dsRNA)에 의해 유도된 특정 서열의 mRNA의 퇴화를 포함한다. 예를 들어, 특정 단일 가닥 mRNA(ss mRNA)의 서열에 상응하는 긴 dsRNA의 발현은 그 메세지를 불안정하게 할 것이고, 이로써 상응하는 유전자의 발현에 "간섭"한다. 따라서, 임의의 선택된 유전자는 그 유전자에 대한 mRNA의 모두 또는 실질적인 부분에 상응하는 dsRNA를 도입함으로써 억제될 수 있다. 긴 dsRNA가 발현될 때, 그것은 초기에 리보뉴클레아제 HI에 의해 겨우 21∼22개 염기쌍 길이의 더 짧은 dsRNA 올리고뉴클레오티드로 처리되는 것으로 보인다. 따라서, RNAi는 비교적 짧은 일치하는 dsRNA의 도입 또는 발현에 의해 실시될 수 있다. 실제로, 비교적 짧은 일치하는 dsRNA의 이용은 하기 기술한 바와 같이 소정의 이점을 가질 수 있다.
포유동물 세포는 이중 가닥 RNA(dsRNA)에 의해 실시된 2 이상의 경로를 가진다. RNAi(서열 특이적) 경로에서, 전술한 바와 같이 개시 dsRNA는 우선 짧은 간섭하는 (si)RNA로 깨어진다. siRNA는 각각의 3' 말단에서 2개의 뉴클레오티드 돌출부를 가진 대략 19개의 뉴클레오티드 siRNA를 형성하는 약 21개의 뉴클레오티드의 센스 및 안티센스 가닥을 가진다. 짧은 간섭 RNA는 특이적 메신저 RNA가 퇴화의 표적이 되도록 허용하는 서열 정보를 제공한다. 이에 반해, 비특이적 경로는, 그것이 약 30개 이상의 염기쌍 길이가 되는 한, 임의의 서열의 dsRNA에 의해 시작된다. 비특이적 효과는 dsRNA가 2개의 효소: 그것의 활성 형태로 모든 단백질 합성을 차단하는 번역 개시 인자 eIF2를 인산화하는 PKR(이중 가닥 RNA 활성화 프로테인 키나제), 및 모든 mRNA를 표적으로 하는 비특이적 효소, RNase L을 활성화하는 분자를 합성하는 2', 5'-올리고아데닐레이트 합성효소(2', 5'-AS)를 활성화하기 때문에 발생한다. 비특이적 경로는 스트레스 또는 바이러스 감염에 대한 숙주 반응을 나타낼 수 있고, 일반적으로, 비특이적 경로의 효과는 본 발명의 특히 유용한 방법에서 최소화된다. 두드러지게, 더 긴 dsRNA는 비특이적 경로의 유도를 필요로 하며, 따라서, 약 30개 염기쌍보다 짧은 dsRNA가 RNAi에 의한 유전자 억제를 실시하기에 특히 유용한 것으로 보인다(예컨대, Hunter et al., (1975) J. Biol. Chem., 250: 409-17; Manche et al., (1992) Mol. Cell Biol., 12: 5239-48;Minks et al., (1979) J. Biol. Chem., 254: 10180-3; and Elbashir et al., (2001) Nature, 411 : 494-8 참조).
RNAi를 실시하는 데 사용된 소정의 이중 가닥 올리고뉴클레오티드는 30개 미만의 염기쌍 길이이고, 리보핵산의 약 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18 또는 17개의 염기쌍을 포함할 수 있다. 경우에 따라, 본 발명의 dsRNA 올리고뉴클레오티드는 3' 돌출부 말단을 포함할 수 있다. 비제한적인 실예가되는 2-뉴클레오티드 3' 돌출부는 임의의 형태의 리보뉴클레오티드 잔기로 이루어질 수 있고, 심지어 2'-데옥시티미딘 잔기로 이루어질 수도 있으며, 이는 RNA 합성의 비용을 낮추고, 세포 배양 배지 및 트랜스펙션 세포 내에서 siRNA의 뉴클레아제 내성을 강화할 수 있다(Elbashi et al., (2001) Nature, 411 : 494-8 참조).
또한, 50, 75, 100 또는 심지어 500개 이상 염기쌍의 더 긴 dsRNA가 본 발명의 소정의 구체예에서 이용될 수 있다. RNAi를 실시하기 위한 dsRNA의 실예가되는 농도는, 약 0.05 nM, 0.1 nM, 0.5 nM, 1.0 nM, 1.5 nM, 25 nM 또는 100 nM이지만, 처리되는 세포의 특성, 유전자 표적 및 당업자가 용이하게 식별가능한 기타 요인에 따라 다른 농도를 이용할 수도 있다. 실예가되는 dsRNA는 화학적으로 합성될 수 있거나, 또는 적당한 발현 벡터를 이용하여 시험관 내 또는 생체 내에서 생성될 수 있다. 실예가되는 합성 RNA는 당업계에 공지된 방법(예컨대, Expedite RNA 포스포라미다이트 및 티미딘 포스포라미다이트(프롤리고, 독일) 참조)을 이용하여 화학적으로 합성된 21개의 뉴클레오티드 RNA를 포함한다. 합성 올리고뉴클레오티드는 당업계에 공지된 방법(예컨대, Elbashir et al., (2001) Genes Dev., 15: 188-200 참조)을 이용하여 탈보호되고 겔 정제될 수 있다. 더 긴 RNA는 당업계에 공지된 프로모터, 예컨대 T7 RNA 폴리머라제 프로모터로부터 전사될 수 있다. 시험관 내 프로모터의 양쪽 가능한 위치 다운스트림에 위치한 단일 RNA 표적은, 목적하는 표적 서열의 dsRNA 올리고뉴클레오티드를 생성하기 위한 표적의 양 가닥을 전사할 것이다.
올리고뉴클레오티드의 디자인에서 이용된 특이적 서열은 표적(예컨대, C5)의 발현된 유전자 메시지 내에 함유된 뉴클레오티드의 임의의 인접 서열일 수 있다. 적당한 표적 서열을 선택하는 데 당업계에 공지된 프로그램 및 알고리즘이 이용될 수 있다. 또한, 앞서 부가적으로 기술한 바와 같이, 상술된 단일 가닥 핵산 서열의 2차 구조를 예측하도록 디자인된 프로그램을 이용하여 최적의 서열이 선택될 수 있고, 그러한 서열의 선택은 접힌 mRNA의 노출된 단일 가닥 영역에서 발생하기 쉽도록 한다. 적당한 올리고뉴클레오티드를 디자인하는 방법 및 조성은 예를 들어, 그 내용이 본원에 참고로 포함된 미국 특허 제6,251,588호에서 찾아볼 수 있다. mRNA는 리보뉴클레오티드의 서열 내에서 단백질 합성을 가리키는 정보를 함유하는 선형 분자로서 생각된다. 하지만, 연구들은 대부분 mRNA에 존재하는 다수의 2차 및 3차 구조를 밝혀냈다. RNA에 있는 2차 구조 요소들은 대부분 동일한 RNA 분자의 상이한 영역 사이의 왓슨-크릭 유형 상호작용에 의해 형성된다. 중요한 2차 구조 요소들은 이중 RNA 및 내부 루프에서 분자내 이중 가닥 영역, 헤어핀 루프, 중배(bulg)를 포함한다. 2차 구조 요소들이 서로 접촉되거나 또는 단일 가닥 영역과 접촉하여 더 복합적인 3차원 구조를 생성할 때 3차 구조 요소들이 형성된다. 다수의 연구원들이 다수의 RNA 이중 구조의 결합 에너지를 측정하고, RNA의 2차 구조를 예측하는 데 사용될 수 있는 규칙 세트를 유도해냈다(예컨대, Jaeger et al., (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 86:7706 (1989); 및 Turner et al., (1988) Ann. Rev. Biophys. Biophys. Chem., 17:167 참조). 그 규칙들은 RNA 구조적 요소들의 동정, 특히 단일 가닥 RNA 영역을 동정하는 데 유용하고, 이는 RNAi, 리보자임 또는 안티센스 기술을 침묵시키기 위한 표적이 되기에 특히 유용한 mRNA의 분절을 나타낼 수 있다. 따라서, mRNA 표적의 특정 분절은, dsRNA 올리고뉴클레오티드를 조정하는 RNAi의 디자인뿐 아니라 본 발명의 적당한 리보자임 및 해머헤드리보자임 조성물의 디자인으로 규명될 수 있다.
dsRNA 올리고뉴클레오티드는 점착성 세포주에 대해 제조자가 기술한 바와 같이 당업계에 공지된 리포솜과 같은 캐리어 조성물, 예컨대, 리포펙타민 2000(Life Technologies, Rockville Md.)을 사용하여 이종의 표적 유전자로 트랜스펙션 함으로써 세포 안으로 도입될 수 있다. 외인성 유전자를 표적화하기 위한 dsRNA 올리고뉴클레오티드의 트랜스펙션은 올리고펙타민(Life Technologies)을 사용하여 수행될 수 있다. 트랜스펙션 효율은 pAD3을 암호화하는 hGFP의 동시 트랜스펙션 후에 포유 세포주에 대하여 형광 현미경법을 이용하여 조사할 수 있다(Kehlenback et al., (1998) J. Cell. Biol., 141: 863-74). RNAi의 유효성은 dsRNA의 도입을 수반하는 임의의 다수 분석에 의해 평가될 수 있다. 이러한 분석은 새로운 단백질 합성 후 외인성 풀의 전도가 억제되는 데 충분한 시간이 걸리는 표적화 유전자 생성물을 인식하는 항체를 이용한 웨스턴 블롯 분석법, 및 존재하는 표적 mRNA의 농도를 측정하기 위한 노던 블롯 분석법을 포함하나, 이에 국한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명에서 사용하기 위한 조성물, 방법 및 RNAi 기술의 적용은, 본원에 참고로서 포함된 미국 특허 제6,278,039호, 제5,723,750호 및 제5,244,805호에서 제공된다.
본 발명은 또한 안구 질환의 안정화, 치료 및/또는 예방을 위한 본 발명의 방법에 있어서, PDGF 및/또는 VEGF 억제를 위한 RNAi 제제와 본 발명에 따른 항-C5 제제의 사용을 포함한다. 따라서, 직전에 기술한 방법은 본 발명에 따른 항-C5 제제의 사용을 위해, RNAi 제제를 산출하여 PDGF 및/또는 VEGF를 억제하는 데 사용될 수 있다.
단백질 및 폴리펩티드 항-C5 제제
본 발명의 몇몇 구체예, 항-C5 제제 단백질 또는 폴리펩티드이다. 본 발명은 안구 질환을 치료하는 방법에 있어서 항-C5 단백질 또는 폴리펩티드 제제의 사용을 포함한다. 특정 구체예에서, 본 발명은 안구 질환, 특히 당뇨병성 망막병증, 삼출성 및/또는 비삼출성 AMD의 1 이상의 징후를 경감, 안정화 및/또는 예방하는 방법에 있어서 개체에게 항-C5 단백질 또는 폴리펩티드 제제를 투여하는 것을 포함한다.
예를 들어, 미국 특허 제5,212,071호, 제5252,216호, 제5,256,642호, 제5,456,909호, 제5,472,939호, 제5,840,858호, 제5,856,297호, 제5,858,969호, 제5,981,481호, 제6,057,131호, 제6,169,068호 및 제6,316,604호(이들 각각은 그 전체가 본원에 참고로 포함됨)에서 예를 들어 기재된 TP1O(Avant Immunotherapeutics, Inc. Needham, MA) 가용성 결절된 보체 수용체 1형 및 항-C5 단백질 또는 폴리펩티드 제제는 본 발명에서 사용될 수 있다. APT070(마이로코셉트®로도 공지됨, Inflazyme Pharmaceuticals, LTD., Richmond, B.C. Canada)은 본 발명의 방법에서 사용될 수 있다.
또한, 본 발명은 안구 질환을 안정화, 치료 및/또는 예방하기 위한 본 발명의 방법에 있어서, 단백질 및/또는 폴리펩티드 항PDGF 및/또는 항VEGF 제제와 함께 본 발명에 따른 항-C5 제제의 사용을 포함한다.
소분자 항-C5 제제
본 발명의 몇몇 구체예에서, 항-C5 제제는 소분자, 특히 작은 유기 분자이다. 본 발명은 안구 질환을 치료하는 방법에 있어서 항-C5 소분자 제제의 사용을 포함한다. 특정 구체예에서, 본 발명은 안구 질환, 특히 당뇨병성 망막병증, 삼출성 및/또는 비삼출성 AMD의 1 이상의 징후를 경감, 안정화 및/또는 예방하는 방법에 있어서, 개체에게 항-C5 소분자 제제를 투여하는 것을 포함한다.
또한, 본 발명은 안구 질환을 안정화, 치료 및/또는 예방하기 위한 본 발명의 방법에서 소분자 항PDGF 및/또는 항VEGF 제제와 본 발명에 따른 항-C5 제제의 사용을 포함한다. 예를 들어, 본 발명의 항-C5 제제는 항PDGF 제제 이매티닙 메실레이트(Gleevec®, Novartis Pharmaceuticals,Inc. East Hanover, NJ)와 함께 사용될 수 있다. 또한, 본 발명의 항-C5 제제는 항VEGF 제제, 예컨대 소라페닙(Nexavar® Onyx Pharmaceuticals, Inc.Emeryville, CA and Bayer Pharmaceuticals Corportion, West Haven, CT); 수니트납 말레이트(Sutent®, Pfizer, Inc. NY, NY)와 함께 사용될 수 있다.
항C3 앱타머
몇몇 구체예에서, 본 발명의 물질은 보체 단백질 C3에 매우 특이적으로 결합하고, 생체 내 및/또는 세포 기반 분석에서 보체 단백질 C3의 활성을 기능적으로 조정, 예컨대, 차단하는 일련의 핵산 앱타머를 포함한다. 이들 앱타머는, 예를 들어, 급성 또는 만성 염증 및/또는 면역조절 안구 질환, 알레르기성 및 거대 유두성 결막염을 비롯한 염증성 결막염, 황반 부종, 포도막염, 안내염, 공막염, 각막 궤양, 건성안 증후군, 녹내장, 허혈성 망막 질환, 각막 이식 거부증, 안구내 수술 예컨대 안구내 렌즈 이식술과 관련된 합병증 및 백내장 수술과 관련된 염증, 베체트병, 면역 복합 혈관염, 푸크스 질환, 보그트-고야나기-하라다 병, 망막하 섬유증, 각막염, 초자체 망막 염증, 안구 기생충성 감염/이동, 망막 색소 변성증, 거대세포바이러스 망막염 및 맥락막 염증, 황반 변성증, 나이 관련 황반 변성증("AMD"), 비삼출성("건조") AMD형, 또는 당뇨병성 망막병증 또는 삼출성("함습") AMD형을 비롯한 안구 신혈관생성 질환을 포함하는 다양한 보체 매개성 안구 질병 또는 질환을 치료, 안정화 및/또는 예방하는 저 독성의 안전하고 유효적인 양상을 제공한다. 또한, 이러한 앱타머는 안구 진단에 사용될 수 있다.
본 발명의 방법에서 사용하기 위한 이들 앱타머는, 본원에 기재된 바와 같은 변형, 예를 들어, 친유성 또는 고분자량 화합물(예컨대, PEG)에 대한 접합, 캡핑 부분의 혼합, 변성 뉴클레오티드의 혼합, 및 인산 골격에 대한 변형을 포함할 수 있다.
일 구체예에서, 보체 매개성 안구 질환을 치료, 안정화 및/또는 예방하는 방법에서 사용하기 위해 C3 보체 단백질에 결합하는 단리된 비천연 발생 앱타머가 제공된다. 몇몇 구체예에서, 본 발명의 방법에서 사용하기 위한 단리된 비천연 발생 앱타머는 C3 보체 단백질에 대한 해리 상수("KD")가 100 μM 미만, 1 μM 미만, 500 nM 미만, 100 nM 미만, 50 nM 미만, 1 nM 미만, 50O pM 미만, 100 pM 미만, 50 pM 미만이다. 본 발명의 몇몇 구체예에서, 해리 상수는 하기 실시예 2에 기재한 바와 같이 블롯 적정에 의해 측정된다.
다른 일 구체예에서, 본 발명의 방법에서 사용하기 위한 앱타머는 C3 보체 단백질의 작용을 조정하고, 특히 C3 보체 단백질 작용 및/또는 C3 보체 단백질 변이체 작용을 억제한다. 본원에서 사용한 바와 같은 C3 보체 단백질 변이체는 C3 보체 단백질 작용과 동일한 작용을 필수적으로 수행하는 변이체를 포함한다. 바람직하게는, C3 보체 단백질 변이체는 실질적으로 동일한 구조를 포함하고, 몇몇 구체예에서, 문헌[De Bruijn, MH and Fey, GH (1985) Human complement component C3: cDNA coding sequence and derived primary structure. Proc Natl Acad Sci USA 82, 708-12]에서 설명된 아미노산 서열을 포함하는 C3 보체 단백질의 아미노산 서열에 대해 80% 이상의 서열 동일성, 더욱 바람직하게는 90% 이상의 서열 동일성, 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 동일성을 포함한다.
또한, 보체 단백질 C3에 결합하는, 본 발명의 다른 앱타머는 미국 특허 출원 일련 번호 제6,140,490호, 제6,395,888호 및 제6,566,343호에 기재되며, 이들 각각은 그 전체가 본원에 참고로 포함된다.
항C1q 앱타머
몇몇 구체예에서, 본 발명의 물질은 보체 단백질 C1q에 매우 특이적으로 결합하고, 생체 내 및/또는 세포 기반 분석에서 보체 단백질 C3의 활성을 기능적으로 조정, 예컨대 차단하는 일련의 핵산 앱타머를 포함한다..
이들 앱타머는, 예를 들어 급성 또는 만성 염증 및/또는 면역조절 안구 질환, 알레르기성 및 거대 유두 결막염을 비롯한 염증성 결막염, 황반 부종, 포도막염, 안내염, 공막염, 각막 궤양, 건성안 증후군, 녹내장, 허혈성 망막 질환, 각막 이식 거부증, 안구내 수술 예컨대 안구내 렌즈 이식술과 관련된 합병증 및 백내장 수술과 관련된 염증, 베체트병, 면역 복합 혈관염, 푸크스 질환, 보그트-고야나기-하라다 병, 망막하 섬유증, 각막염, 초자체 망막 염증, 안구 기생충성 감염/이동, 망막 색소 변성증, 거대세포바이러스 망막염 및 맥락막 염증, 황반 변성증, 나이 관련 황반 변성증("AMD"), 비삼출성 ("건조") AMD형, 또는 당뇨병성 망막병증 또는 삼출성 ("함습") AMD형을 비롯한 안구 신혈관생성 질환을 포함하는 다양한 보체 매개성 안구 질병 또는 질환을 치료, 안정화 및/또는 예방하는 저 독성의 안전하고 유효적인 양상을 제공한다. 또한, 이러한 앱타머는 안구 진단에 사용될 수 있다.
본 발명의 방법에서 사용하기 위한 이들 앱타머는, 본원에 기재된 바와 같은 변형, 예를 들어, 친유성 또는 고분자량 화합물(예컨대, PEG)에 대한 접합, 캡핑 부분의 혼합, 변성 뉴클레오티드의 혼합, 및 인산 골격에 대한 변형을 포함할 수 있다.
일 구체예에서, 보체 매개성 안구 질환을 치료, 안정화 및/또는 예방하는 방법에서 사용하기 위해 C1q 보체 단백질에 결합하는 단리된 비천연 발생 앱타머가 제공된다. 몇몇 구체예에서, 본 발명의 방법에서 사용하기 위한 단리된 비천연 발생 앱타머는 C1q 보체 단백질에 대한 해리 상수("KD")가 100 μM 미만, 1 μM 미만, 500 nM 미만, 100 nM 미만, 50 nM 미만, 1 nM 미만, 50O pM 미만, 100 pM 미만, 50 pM 미만이다. 본 발명의 몇몇 구체예에서, 해리 상수는 하기 실시예 2에 기재한 바와 같이 도트 블롯 적정에 의해 측정된다.
다른 일 구체예에서, 본 발명의 방법에서 사용하기 위한 앱타머는 C1q 보체 단백질의 작용을 조정하고, 특히 C1q 보체 단백질 작용 및/또는 C1q 보체 단백질 변이체 작용을 억제한다. 본원에서 사용한 바와 같은 C1q 보체 단백질 변이체는 C1q 보체 단백질 작용과 동일한 작용을 필수적으로 수행하는 변이체를 포함한다. 바람직하게는, C1q 보체 단백질 변이체는 실질적으로 동일한 구조를 포함하고, 몇몇 구체예에서, 문헌[Seller, GC, Blake, DJ and Reid, KB(1991) Characterization and organization of the gene encoding the A-, B- and C-chains of human complement subcomponent C1q. The complete derived amino acid sequence of human C1q. Biochem J. 274, 481-90]에서 설명된 아미노산 서열을 포함하는 C1q 보체 단백질의 아미노산 서열에 대해 80% 이상의 서열 동일성, 더욱 바람직하게는 90% 이상의 서열 동일성, 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 동일성을 포함한다.
또한, 보체 단백질 C1q에 결합하는, 본 발명의 다른 앱타머는 미국 특허 출원 일련 번호 제6,140,490호, 제6,395,888호 및 제6,566,343호에 기재되며, 이들 각각은 그 전체가 본원에 참고로 포함된다.
몇몇 구체예에서, 본 발명의 항-C5, C3 및/또는 C1q를 비롯한 앱타머 치료제는 이들의 표적에 대한 친화력이 크고 매우 특이적인 한편, 앱타머 치료제가 환자 또는 개체의 신체에서 분해되는 경우에 비천연 발생 뉴클레오티드 치환체로부터 해로운 부작용을 경감시킨다.
본 발명의 항-C5, C3 및/또는 C1q 앱타머를 비롯한 본 발명의 항보체 앱타머는 당업계에 공지된 고상 올리고뉴클레오티드 합성 기술(예컨대, Froehler et al, Nucl. Acid Res. 14:5399-5467 (1986) and Froehler et al, Tet. Lett.27:5575-5578 (1986) 참조), 및 트리에스테르 합성법(예컨대, Sood et al, Nucl. Acid Res. 4:2557 (1977) and Hirose et al, Tet. Lett., 28:2449 (1978) 참조)과 같은 액상법을 비롯한 임의의 올리고뉴클레오티드 합성 기술을 이용하여 합성될 수 있다.
또한, 본 발명은 안구 질환을 안정화, 치료 및/또는 예방하는 본 발명의 방법에서 각각 PDGF 및/또는 VEGF 및/또는 이들의 동종의 수용체 PDGFR 및 VEGFR에 대한 앱타머와 함께, 본 발명의 항보체 앱타머(항-C5, C3 및/또는 C1q 앱타머를 포함)의 사용을 포함한다.
본 발명의 방법에서 사용하기 위한 항PDGF 앱타머의 예는 국제 특허 출원 PCT/US2005/039975(2005년 11월 2일 출원)에 기재되어 있고, 본원에 그 전체, 특히 그것에 개시된 ARC513, ARC594, ARC127 및 ARC404는 참고로 포함된다.
본 발명의 방법에서 사용하기 위한 VEGF 특이적 앱타머의 예는, 미국 특허 제5,919,455호, 제5,932,462호, 제6,113,906호, 제6,011,020호, 제6,051,698호 및 제6,147,204호에 개시된다. 예를 들어, 본 발명의 항보체 앱타머, 특히 항-C5 앱타머와 병용하여 안구 질환의 치료에 사용하기에 특히 유용한 앱타머는 이의 페길화 및 비페길화 형태인 EYEOO1(이전에 NX1838), 특히 페갑타닌 소듐 주사(Macugen®, Eyetech Pharmaceuticals, Inc. and Pfizer, Inc. NY, NY)일 것이다.
약학 조성물
또한, 본 발명은 항-C5 제제, 특히 보체 단백질 C5에 결합하는 앱타머 분자, 특히 보체 단백질 C5에 결합하고 그것의 절단을 방지하는 앱타머를 함유하는 약학 조성물을 포함한다. 몇몇 구체예에서, 상기 조성물은 내복 용도에 적절하고, 유효량으로 본 발명의 약물학적 활성 화합물을 단독 또는 1 이상의 약학적 허용 담체와 함께 포함한다. 이 화합물은 만약 독성이 있다면 매우 낮은 것이 특히 유용하다.
본 발명의 조성물은 환자에게서 질병 또는 질환과 같은 병상을 치료 또는 예방하거나, 또는 질병 또는 질환과 같은 징후를 완화하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 조성물은 보체 매개성 심장 질환[예컨대, 심근 손상; 수술 후 출혈 등의 관상 동맥 우회술(CABG), 전신성 호중구 및 백혈구 활성화, 심근경색증의 위험 증가 및 지각 기능장애 증가와 연관된 C5 조절 보체 합병증; 재발협착증; 및 경피적 관동맥 중재술과 연관된 C5 조절 합병증]; 허혈-재관류 손상(예컨대, 심근경색증, 발작, 동상); 보체 매개성 염증성 질환(예컨대, 천식, 관절염, 패혈증, 및 장기 이식 후 거부증); 및 보체 매개성 자가면역 질환[예컨대, 중증 근무력증, 전신성 홍반성 낭창(SLE 또는 루푸스); 폐 염증; 체외의 보체 활성화; 항체 조절된 보체 활성화; 및 안구 신혈관생성 질환, 특히 당뇨병성 망막병증 및 나이 관련 황반 변성증(AMD)과 같은 보체 조절 안구 징후]와 관련된 병증을 치료 또는 예방하는 데 사용될 수 있다. 특정 구체예에서, 본 발명의 조성물은 C5 조절된 안구 질환의 징후, 특히 당뇨병성 망막병증, 삼출성 및/또는 비삼출성 AMD를 경감, 안정화 및/또는 예방하는 데 사용된다.
몇몇 구체예에서, 본 발명의 조성물은 환자에게서 안구 질병 또는 질환 등의 병증을 안정화, 치료 및/또는 예방하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 조성물은 급성 또는 만성 염증성 및/또는 자가면역 안구 질환, 알레르기성 및 거대 유두 결막염을 비롯한 염증성 결막염, 황반 부종, 포도막염, 안내염, 공막염, 각막 궤양, 건성안 증후군, 녹내장, 허혈성 망막 질환, 각막 이식 거부증, 안구내 수술 예컨대 안구내 렌즈 이식술과 관련된 합병증 및 백내장 수술과 관련된 염증, 베체트병, 면역 복합 혈관염, 푸크스 질환, 보그트-고야나기-하라다 병, 망막하 섬유증, 각막염, 초자체 망막 염증, 안구 기생충성 감염/이동, 망막 색소 변성증, 거대세포바이러스 망막염 및 맥락막 염증, 황반 변성증, 나이 관련 황반 변성증("AMD"), 비삼출성("건조") AMD형, 또는 당뇨병성 망막병증 또는 삼출성("함습") AMD형을 비롯한 안구 신혈관생성 질환과 같은 보체 매개성 안구 질환과 관련된 병증을 안정화, 치료 및/또는 예방하는 데 사용될 수 있다.
본 발명의 조성물은 본 발명의 항-C5 제제가 억제하거나 또는 본 발명의 항-C5 제제가 특이적으로 결합하는 보체 단백질 C5와 연관되거나 또는 그로부터 기인한 질병 또는 질환을 겪고 있거나 또는 걸리기 쉬운 개체로의 투여에 유용하다. 몇몇 구체예에서, 본 발명의 조성물은 본 발명의 항보체 앱타머가 저해하거나 또는 본 발명의 항보체 앱타머가 특이적으로 결합하는 보체 단백질과 연관되거나 또는 그로부터 기인한 질병 또는 질환을 겪고 있거나 또는 걸리기 쉬운 개체로의 투여에 특히 유용하다.
몇몇 구체예에서, 보체 매개성 안구 질환을 앓거나 또는 걸리기 쉬운 개체의 치료용 조성물이 제공된다. 특정 구체예에서, 보체 매개성 안구 질환, 특히 비삼출성 AMD형 및/또는 안구 신혈관생성 질환, 특히 당뇨병성 망막병증 및 삼출성 AMD형을 앓거나 또는 위험 상태인 개체의 치료용 조성물이 제공된다. 몇몇 구체예에서, 위험 상태인 개체는 드루센 및/또는 망막 색소 형성의 변화를 가지나 임상적인 시력 상실은 없는 것들이다. 드루센은 안과경(opthalmascope)을 이용하여 검출되며, 전형적으로 망막의 적색 배경에 대하여 황색 반점 및 입자로 나타난다. 임상적인 시력 상실은 당뇨병성 망막병증 연구 차트("ETDRS 차트")에 관한 조기 치료를 이용한 1∼3 라인의 황반 변성증의 증거이다. 황반 변성증과 관련된 다른 시력 변화는 암슬러 격자를 이용하여 검출되는 블라인드 스팟(암점) 및/또는 뒤틀림, 어둠 적응의 변화(간상 세포 건강의 진단) 또는 색깔 해석의 변화(추상체 건강의 진단)를 포함한다. 몇몇 구체예에서, 위험 상태인 개체는 야생형에 비해, 개체의 보체 인자 H에서 변화를 가지는 것들이다. 예를 들어, 문헌[Edwards et al., Science vol 308, pp421-422 (2005), Hageman, G. et al., PNAS, vol.102, pp. 7227-7231 (2005), and Haines, J. et al., Science, vol. 308, pp 419-421 (2005)]에 기재된 변이를 참조한다. 몇몇 구체예에서, 위험 상태인 개체는 드루센의 조합물이 있고, 시력 상실은 없으며, 보체 인자 H의 변화를 가지는 것들이다. 몇몇 구체예에서, 위험 상태인 개체는 드루센이 검출되는 개체이다. 몇몇 구체예에서, 치료해야할 위험 상태인 개체는 드루센이 검출되고, 시력의 임상적 손실 및/또는 시력의 다른 변화가 있는 것들이다.
본 발명의 조성물은 몇몇 바람직한 구체예에서 안구 병증인 병증을 앓는 환자 또는 개체를 치료하는 방법에서 사용될 수 있다. 본 발명의 방법은 환자 또는 개체에게 항-C5 제제, 특히 C5 특이적 앱타머 또는 이를 포함하는 조성물 투여하여, 항-C5 제제가 보체 단백질 C5에 결합하고, 보체 단백질 C5로의 결합이 그것의 생물학적 작용, 예를 들어 생체 내에서 그것의 절단을 방지하는 것을 바꾸며, 이로써 C5 조절 병증을 치료하는 것을 포함한다. 특정 구체예에서, 본 발명의 항-C5 제제, 특히 본 발명의 C5 특이적 앱타머의 결합은 특히 망막 조직, RPE 세포, 맥락막 혈관 및/또는 망막성 모세혈관에서 VEGF 및/또는 PDGF 발현 및/또는 bFGF 및/또는 내피세포 성장을 자극하는 다른 성장 인자의 농도를 경감시킴으로써, 환자에게서 VEGF 및/또는 PDGF 조절 질환, 특히 AMD 및/또는 당뇨병성 망막병증 등의 안구 신혈관생성 질환을 치료한다.
일 구체예에 있어서, 본 발명의 항보체 앱타머, 특히 본 발명의 항-C5 앱타머는, 생체 내에서 안구 VEGF 및/또는 PDGF 발현의 농도를 감소시키기에 충분한 양으로 개체에게 안구 또는 안구 주변으로 투여된다. 본 발명의 특정 구체예에 있어서, 항보체 앱타머, 특히 본 발명의 항-C5 앱타머를 투여하는 개체는 안구 신혈관생성 질환을 앓거나 위험 상태로서 정의되며, 투여에 의해 경감된 VEGF 및/또는 PDGF 발현이 안구 신혈관생성 질환의 1 이상의 징후의 예방, 안정화 및/또는 경감에 도움이 된다.
안구 병증을 앓는 환자 또는 개체, 즉 본 발명의 방법으로 치료받을 환자 또는 개체는 척추 동물, 더욱 특히 포유동물 또는 더욱 특히 인간이 될 수 있다.
실제로, 본 발명의 항-C5 제제, 특히 본 발명의 C5 특이적 앱타머 또는 이의 약학적 허용 염 또는 프로드러그는 이들의 목적하는 생물학적 활성(예를 들어, 앱타머 표적이 그것의 수용체로 결합하는 것을 억제, 표적 단백질의 절단을 방지)을 발휘하기에 충분한 양으로 투여된다.
본 발명의 일 측면은 C5 조절 보체 장애에 대한 다른 치료와 병용하는 본 발명의 앱타머 조성물을 포함한다. 일 구체예에서, 본 발명은 보체 조절 안구 질환에 대한 다른 치료와 병용하는 본 발명의 조성물을 기재한다. 예를 들어, 본 발명의 앱타머 조성물은 1 이상의 앱타머를 함유한다. 몇몇 예에서, 본 발명의 1 이상의 화합물을 함유하는 본 발명의 앱타머 조성물은 항염증성 제제, 면역억제제, 항바이러스 제제 등과 같은 다른 유용한 조성물과 병용하여 투여된다. 더욱이, 본 발명의 화합물은 전술한 바와 같이 세포 독성, 세포 증식 억제제, 또는 화학 요법 제제, 예컨대 알킬화제, 항대사 산물, 핵분열 억제제 또는 세포독성 항생제와 병용하여 투여될 수 있다. 특정 구체예에서, 일반적으로 그러한 결합물로 사용하기 위한 공지된 치료제의 시중에서 입수가능한 투약 형태와 같은, 본 발명의 항-C5 제제가 적절할 것이다.
"병용 요법"(또는 "공동 요법")은 이러한 치료제의 공동작용으로부터 이로운 효과를 제공하도록 하는 특이적 치료법의 부분으로서, 본 발명의 항-C5 제제, 특히 본 발명의 C5 특이적 앱타머 조성물 및 1 이상의 제2 제제의 투여를 포함한다. 상기 병용법의 이점은, 이에 국한되는 것은 아니지만, 치료제의 조합으로부터 기인하는 약물동력학적 또는 약력학적 공동 작용을 포함한다. 전형적으로, 이러한 치료제의 병용 투여는 한정된 기간(대개 선택되는 조합에 따라 분, 시간, 일 또는 주)에 걸쳐서 수행된다. 몇몇 구체예에서, 제2 제제는 항VEGF 제제 및/또는 항PDGF 제제일 수 있다.
전술한 방법의 구체예에서, 상기 방법은 개체에게 항VEGF 제제를 투여하는 단계를 추가적으로 포함하고, 상기 항VEGF 제제는 핵산 분자, 앱타머, 안티센스 분자, RNAi 분자, 단백질, 펩티드, 환형 펩티드, 항체 또는 항체 단편, 당류, 중합체 및 소분자로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
전술한 방법의 구체예에서, 상기 방법은 개체에게 항PDGF 제제를 투여하는 단계를 추가적으로 포함하고, 상기 항PDGF 제제는 핵산 분자, 앱타머, 안티센스 분자, RNAi 분자, 단백질, 펩티드, 환형 펩티드, 항체 또는 항체 단편, 당류, 중합체 및 소분자로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
전술한 방법의 몇몇 구체예에서, 상기 방법은 개체에게 항혈관제를 투여하는 단계를 더 포함하고, 상기 항혈관제는 포르피린 유도체이다. 몇몇 구체예에서, 상기 포르피린 유도체는 주사용 베르테폴핀(Visudyne®, Novartis Pharmaceuticals Corporation, East Hanover, NJ)이다. 몇몇 구체예에서, 상기 방법은 레이저광을 사용하여 포르피린 유도체를 활성화하는 단계를 더 포함한다.
"병용 요법"은, 대체로 그렇지는 않지만, 구분된 단일 치료법의 부분으로서 이러한 치료제 2종 이상을 투여하여 우연히 마음대로 본 발명의 병용법을 초래하고자 한다. "병용 요법"은 이러한 치료제를 순차적인 방식으로 투여하는 것, 즉 각각의 치료제를 다른 시간에 투여하는 투여법뿐만 아니라, 이러한 치료제, 또는 2 이상의 치료제를 실질적으로 동시에 투여하는 투여법을 포함한다. 실질적인 동시 투여는, 예를 들어 각각의 치료제의 고정 비율 또는 복합물을 가지는 단일 캡슐, 각각의 치료제에 대한 단일 캡슐을 개체에게 투여함으로써 수행할 수 있다. 다른 일 구체예에서, 실질적인 동시 투여는 예를 들어 각각의 치료제의 고정 비율 또는 복합물을 가지는 단일 주사, 각각의 치료제에 대한 단일 캡슐을 개체에게 투여함으로써 수행할 수 있다.
각각의 치료제의 순차적인 또는 실질적인 동시 투여는, 이에 국한되는 것은 아니지만, 국소 경로, 경구 경로, 정맥 경로, 근육내 경로, 안구 경로 및 점막 조직을 통한 직접적인 흡수를 비롯한 임의의 적당한 경로에 의해 실시될 수 있다. 상기 치료제는 동일한 경로 또는 상이한 경로에 의해 투여될 수 있다. 예를 들어, 선택된 병용법의 제1 치료제는 주사에 의해 투입될 수 있는 한편, 병용법의 다른 치료제는 국소적으로 투여될 수 있다.
대안으로, 예를 들어, 모든 치료제는 국소적으로 투여될 수 있거나 또는 모든 치료제는 주사에 의해 투여될 수 있다. 치료제가 투여된 순서는 달리 명시되지 않는 한 그리 중요하지는 않다. 또한, "병용 요법"은 전술한 바와 같이 다른 생물학적 활성 성분과 추가 병용하는 치료제의 투여를 포함한다. 상기 병용 요법이 비약물(non-drug) 치료를 더 포함하는 경우, 비약물 치료는 치료제와 비약물 치료의 병용의 공동작용으로부터 이로운 효과가 달성되는 한, 임의의 적절한 시간에 수행될 수 있다. 예를 들어, 적당한 경우에 있어서, 이로운 효과는 상기 비약물 치료가 치료제의 투여로부터 일시적으로, 아마도 수일 또는 심지어 수주일 동안 제거될 때 또한 달성된다.
본 발명의 치료 조성물 또는 약물학적 조성물은 약학적 허용 배지에서 용해 또는 분산된 치료법의 활성 성분(들)을 유효량으로 포함할 것이다. 약학적 허용 배지 또는 담체는 임의의 용매 및 모든 용매, 분산 배지, 코팅제, 항균성 및 항진균성 제제, 등장성 및 흡수 지연 제제 등을 포함한다. 약학적 활성 물질에 대한 이러한 배지 및 제제의 사용은 당업계에 공지되어 있다. 또한, 보충 활성 성분이 본 발명의 치료 조성물로 포함된다.
약학적 또는 약물학적 조성물의 제조는 본 기재에 비추어 당업계에 공지될 것이다. 전형적으로, 이러한 조성물은 주입가능한, 용액 또는 현탁액으로서; 주입 전에 용액 또는 현탁액, 액체에 적절한 고체 형태; 경구 투여용 정제 또는 다른 고형물로서; 시간 방출 캡슐로서; 또는 점안약, 크림, 로션, 연고, 흡입제 등을 비롯한, 현재 사용되는 임의의 다른 형태로서 제조될 수 있다. 또한, 수술 분야에서 특정 부위를 치료하기 위해, 외과의, 내과의 또는 보건 요원들에 의한 식염수계 세척액과 같은 멸균 제제의 사용이 특히 유용할 수 있다. 또한, 조성물은 마이크로장치, 극미립자 또는 스폰지를 통해 전달될 수 있다.
제제의 경우, 치료제는 약물학적으로 유효한 양으로 투약 제제와 양립가능한 방식으로 투여될 수 있다. 제제는 전술한 주입가능한 용액 형태 등의 다양한 투약 형태로 용이하게 투여될 수 있으나, 약물 방출 캡슐 등이 또한 사용될 수 있다.
본 발명에서, 투여되는 활성 성분의 양과 조성물의 부피는 치료받는 숙주 동물에 따라 달라진다. 투여에 필요한 활성 화합물의 정확한 양은 개업의의 판단에 따라 달라지고, 각각의 개인에 따라 특이하다.
전형적으로, 활성 화합물을 분산하는 데 필요한 최소 부피의 조성물이 사용된다. 적절한 투여법은 또한 다양하나, 처음에 상기 화합물을 투여하고 그 결과를 측정한 후 추가 간격으로 조절된 투여량을 주는 것을 특징으로 한다.
예를 들어, 정제 또는 캡슐(예컨대, 젤라틴 캡슐) 형태의 경구 투여에 있어서, 활성 약물 성분은 에탄올, 글리세롤, 물 등과 같은 경구용 비독성 약학적 허용 비활성 담체와 배합될 수 있다. 또한, 목적하거나 또는 필요할 때, 적절한 결합제, 윤활제, 붕해제 및 착색제는 또한 혼합물에 포함될 수 있다. 적절한 결합제는 전분, 마그네슘 알루미늄 실리케이트, 전분 페이스트, 젤라틴, 메틸셀룰로오스, 소듐 카복시메틸셀룰로오스 및/또는 폴리비닐피롤리돈, 글루코오스 또는 베타-락토오스 등의 천연 당류, 옥수수 감미료, 아카시아, 트래거캔스 또는 소듐 알지네이트 등의 천연 고무 및 합성 고무, 폴리에틸렌 글리콜, 왁스 등을 포함한다. 이들 제형 형태에서 사용된 윤활제는 올레산나트륨, 스테아르산나트륨, 스테아르산마그네슘, 벤조산나트륨, 아세트산나트륨, 염화나트륨, 실리카, 탈크, 스테아르산, 이의 마그네슘염 또는 칼슘염 및/또는 폴리에틸린글리콜 등을 포함한다. 붕해제는, 국한되는 것은 아니지만, 전분, 메틸셀룰로오스, 아가, 벤토나이트, 크산탄 고무 전분, 아가, 알긴산 또는 이의 나트륨염, 또는 비등성 혼합물 등을 포함한다. 희석제는 예를 들어, 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 만니톨, 소르비톨, 셀룰로오스 및/또는 글리신을 포함한다.
또한, 본 발명의 화합물은 시간 방출형 및 지연 방출형 정제 또는 캡슐, 알약, 분말, 미립, 엘릭시르, 팅크제, 현탁제, 시럽 및 유화제와 같은 경구 제형 형태로서 투여될 수 있다.
주입가능한 조성물은 등장 수용액 또는 현탁액이 바람직하고, 좌제는 지방 유화제 또는 현탁제로부터 이롭게 제조된다. 상기 조성물은 멸균되거나, 또는 보존제, 안정제, 습윤제 또는 유화제, 용액 프로모터, 삼투압을 조절하기 위한 염 및/또는 완충제와 같은 보조제를 함유할 수 있다. 또한, 그것들은 또한 다른 치료상 유용한 물질을 함유한다. 상기 조성물은 각각 통상적인 혼합, 미립화 또는 코팅법에 따라 제조되고, 전형적으로 약 0.1∼75%, 바람직하게는 약 1∼50%의 활성 성분을 함유한다.
액체, 특히 주입가능한 조성물은, 예를 들어 용해, 분산 등에 의해 제조될 수 있다. 활성 화합물은 약학적 순수 용매, 예컨대 물, 식염수, 수성 덱스트로오스, 글리세롤, 에탄올 등에 용해하거나 또는 혼합하고, 그로써 주입가능한 용액 또는 현탁액을 형성한다. 또한, 주입에 앞서 용해하기에 적절한 고체 형태가 조제될 수 있다.
본 발명의 화합물은 정맥 주사(환약 및 주입액), 복강 주사, 피하 주사 또는 근육 주사 형태, 약학 분야에서 당업자에게 공지된 모든 사용 형태로 투여될 수 있다. 주입 가능 의약품은 통상적인 형태, 액체용액 또는 현탁액으로 제조될 수 있다.
일반적으로, 비경구 주입가능한 투여는 피하, 근육내 또는 정맥 주사 및 주입액에 대해 사용된다. 또한, 비경구 투여에 대한 하나의 접근은 일정한 제형 농도가 본원에 참고로 포함된 미국 특허 제3,710,795호에 따라 유지되는 것이 보장된 서방 또는 지연방출 시스템의 이식을 사용한다.
또한, 본 발명의 바람직한 화합물은 적절한 비강내 비히클, 흡입제의 국소적 사용을 통해, 또는 경피성 경로를 통해, 당업계에 공지된 경피성 피부 패치의 그런 형태들을 사용하여 비강내 형태로 투여될 수 있다. 경피성 전달 시스템의 형태로 투여하기 위해, 적량 투여는 물론 적량 투약을 통해 간혈적 보다는 연속적일 것이다. 다른 바람직한 국소 제제는 크림, 연고, 로션, 에어로졸 스프레이 및 겔을 포함하며, 활성 성분의 농도는 전형적으로 0.01%∼15%, w/w 또는 w/v 범위일 것이다.
고체 조성물에 있어서, 약학적 등급의 만니톨, 락토오스, 전분, 스테아르산마그네슘, 사카린나트륨, 탈크, 셀룰로오스, 글루코오스, 수크로오스, 탄산마그네슘 등을 포함하는 부형제가 사용될 수 있다. 또한, 앞서 정의된 활성 화합물은, 담체로서 예를 들어 폴리알킬렌 글리콜, 예컨대 프로필렌 글리콜을 사용하여 좌제로서 조제될 수 있다. 몇몇 구체예에서, 좌제는 지방 유화제 또는 현탁제로부터 이롭게 제조된다.
또한, 본 발명의 화합물은 작은 단일 라멜라 소포체, 큰 단일 라멜라 소포체 및 복합 라멜라 소포체 등의 리포솜 전달계의 형태로 투여될 수 있다. 리포솜은 콜레스테롤, 스테아릴아민 또는 포스파티딜콜린을 함유하는 다양한 인지질로부터 형성될 수 있다. 몇몇 구체예에서, 지질 성분의 막은 미국 특허 제5,262,564호에 기재된 바와 같이, 약물의 수용액으로 수소화하여 약물을 포위하는 지질 층을 형성한다. 예를 들어, 본원에 기재된 앱타머 분자는 당업계에 공지된 방법을 이용하여 구조화된 친유성 화합물 또는 비면역성 고분자량 화합물과 함께 착물로서 제공될 수 있다. 핵산 관련 착물의 예는 미국 특허 제6,011,020에서 제공된다.
또한, 본 발명의 화합물은 표적화 가능한 약물 담체로서 가용성 중합체와 결합될 수 있다. 이러한 중합체는 폴리비닐피롤리돈, 피란 공중합체, 폴리히드록시프로필메타크릴아미드페놀, 폴리히드록시에틸아스판아미드페놀, 또는 팔미톨 잔기로 치환된 폴리에틸렌옥시드폴리리신을 포함할 수 있다. 더욱이, 본 발명의 화합물은 약물, 예컨대 폴리락트산, 폴리엡실론 카프로락톤, 폴리히드록시 부티르산, 폴리오르토에스테르, 폴리아세탈, 폴리디히드로피란, 폴리시아노아크릴레이트 및 히드로겔의 가교 또는 양친매성 블록 공중합체의 제어 방출을 달성하기에 유용한 일종의 생물 분해성 중합체에 결합할 수 있다.
바람직한 구체예에서, 본 발명의 화합물은 안구 구멍, 또는 안구 조직 또는 안구 주변 조직 안으로의 직접 유리체내, 안구 주변, 수정체 중심부, 결막하, 또는 공막 주입에 의해 안구 구획으로 전달될 수 있다. 본 발명의 화합물은 후테논낭하(subtenon) 공간 또는 구후(retrobulbar) 공간으로 주입될 수 있다. 또한, 본 발명의 화합물은 안구 및 이의 조직으로의 전신 혈액 및 유액을 통해 안구 부분 또는 조직으로 전달될 수 있고, 그리하여 비경구 전신 주입에 의해, 정맥내, 근육내 또는 피하 전달 경로에 의해 투여된다. 본 발명에 따른 약학 조성물의 결막하, 유리체내 또는 공막 투여는 안구 질병 및/또는 안구 징후를 가진 전신 질병의 치료를 위한 치료제의 전신 투여에 보충제로서 유용할 수 있다. 당뇨병성 망막병증 및/또는 베체트병을 안정화, 치료 및/또는 예방하는 본 발명에 따른 방법의 몇몇 구체예에서, 항보체 앱타머는 전신으로 투여되지 않고, 바람직하게는 안구 투여된다.
또한, 본 발명의 화합물은 저장되거나, 지연 방출 겔 또는 중합체 제형으로 생물 분해성 극소의 중합체 시스템, 예컨대 마이크로장치, 극미립자 또는 스폰지의 외과적 삽입 또는 질병의 치료 중에 삽입된 다른 느린 방출 공막 장치, 또는 안구 전달 장치, 예컨대 전달 지연된 중합체 접촉 렌즈 장치에 의해 안구 구획 또는 조직으로 투여될 수도 있다. 또한, 본 발명의 화합물은 국소적으로, 예를 들어 안약 형태, 본 발명의 화합물이 장입된 접촉 렌즈 형태, 또는 약물을 표면으로부터 안구의 후방으로 추진하는 전기 전류를 이용하는 전리 요법에 의해 안구 구획 또는 조직으로 투여될 수 있다.
목적에 따라, 투여할 약학 조성물은 또한 최소량의 비독성 보조제 물질, 예컨대 습윤제 또는 유화제, pH 완충제, 및 다른 물질, 예컨대 아세트산나트륨, 및 트리에탄올아민 올레에이트를 함유할 수 있다.
앱타머를 이용하는 적량 투약은 환자의 유형, 종, 나이, 무게, 성 및 의학적 상태; 치료할 상태의 정도; 투여 경로; 환자의 신장 및 간 기능; 및 사용한 특정 앱타머 또는 이의 염을 비롯한 다양한 요건에 따라 선택된다. 숙련된 내과의 또는 수의사는 상태의 진행을 예방하고, 거스르거나 또는 멈추는 데 필요한 약물의 유효량을 용이하게 결정하여 처방할 수 있다.
본 발명에 따른 앱타머 조성물의 경구 적량은, 지시된 효과를 위해 사용될 때, 경구로 1일당 약 0.05∼7500 mg 범위가 될 것이다. 바람직하게는, 상기 조성물은 0.5, 1.0, 2.5, 5.0, 10.0, 15.0, 25.0, 50.0, 100.0, 250.0, 500.0 및 1000.0 mg의 활성 성분을 함유하는 장식(scored) 정제의 형태로 제공된다. 본 발명의 화합물은 하루 용량을 한번에 투여되거나, 또는 전체 하루 용량을 매일 2회, 3회 또는 4회의 나눠진 용량으로 투여될 수 있다.
본 발명에 따른 앱타머 조성물의 주입된 적량, 비강내 적량 및 경피적 적량은 1일당 0.05∼7500 mg 범위가 될 것이다. 본 발명에 따른 앱타머 조성물의 피하, 정맥 주사 및 회음내 적량은 1일당 0.05∼3800 mg 범위가 될 것이다.
본 발명에 따른 앱타머 조성물의 안구 적량은 안구로, 예를 들어 유리체내 주입에 의해, 매 3달에 한번 또는 지연 방출 장치 또는 제형에 의해 안구당 0.001∼10 mg 투여된다.
본 발명에 따른 앱타머 화합물의 유효한 혈장 농도는 0.002 mg/mL∼50 mg/mL 범위이다. 본 발명의 앱타머 화합물의 유효적인 안구 농도는 20 nM∼250μM 범위일 수 있다.
치료의 유효성
신생혈관 질환
신생혈관 질환, 예를 들어 AMD, 특히 삼출형 유형 AMD 또는 당뇨병성 망막병증의 치료의 유효성은 신생혈관형성이 느려지거나 또는 경감하는지를 측정하는, 임의의 수용된 방법으로 평가된다. 이는 주요 징후 또는 객관적인 생리 지수를 평가하는 등의 직접적 관찰 및 간접적 평가를 포함한다. 예를 들어, 치료 효능은 신혈관생성, 미세혈관병증, 혈관 누출 또는 혈관 부종 또는 이의 임의의 조합의 예방, 안정화 및/또는 반전을 기초로 하여 평가될 수 있다. 또한, 안구 신생혈관 질환의 억제를 평가하기 위한 치료 효능은 시력을 안정화하거나 증진시킴으로써 정의될 수 있다.
징후를 안정화, 경감시키고/시키거나 안구 신생혈관 질환을 예방하는 데 있어서, 항-C5 제제 단독 또는 항VEGF 제제 및/또는 항PDGF 제제와의 병용한 유효성을 측정하는 경우에, 환자는 또한 주입 후 수일 및 다음 주입 직전에 안과 의사에 의해 임상적으로 평가될 수 있다. 또한, ETDRS 시력, 코다크롬 촬영 및 형광 안저조영술을 매달 수행할 수 있다.
징후를 안정화, 경감시키고/시키거나 안구 신생혈관 질환을 예방하는 데 있어서, 항보체 앱타머 단독 또는 항VEGF 제제 및/또는 항PDGF 제제와의 병용한 유효성을 측정하는 경우에, 환자는 또한 주입 후 수일 및 다음 주입 직전에 안과 의사에 의해 임상적으로 평가될 수 있다. 또한, ETDRS 시력, 안저 촬영, 광 간섭성 단층촬영술 및 형광 안저조영술을 매달 수행할 수 있다.
예를 들어, 안구 신혈관생성을 치료하기 위한 항-C5 제제, 특히 C5 특이적 앱타머 단독 또는 항VEGF 제제 및/또는 항PDGF 제제와 병용한 유효성을 평가하기 위해, 황반 변성증 안과 분야에서 공지된 표준 방법에 따른 나이 관련 황반 변성증에 부차적인 황반하 맥락막 신혈관생성을 앓고 있는 환자에 있어서 항-C5 제제, 특히 C5 특이적 앱타머 단독 또는 항VEGF 제제 및/또는 항PDGF 제제와 병용한 것을 단일 또는 복수 유리체내 주사의 투여를 포함하는 연구를 수행하였다. 나이 관련 황반 변성증(AMD) 외에도 황반하 맥락막 신혈관생성(CNV)을 앓는 환자들은 항-C5 제제, 특히 C5 특이적 앱타머 및/또는 VEGF 특이적 앱타머 및/또는 PDGF 특이적 앱타머의 단일 유리체내 주사를 받는다. 유효성은, 예를 들어 안과적 평가 및/또는 형광 안저조영술에 의해 측정된다. 치료 3달 후 안정한 또는 개선된 시력을 나타내는, 예를 들어, ETDRS 차트에서 3 라인 이상의 시력 개선을 나타내는 환자는 유효한 적량을 받은 것으로 여겨진다.
기타 안구 질환
알레르기성 결막염 및 거대 유두 결막염을 비롯한 염증성 결막염, 황반 부종, 포도막염, 안내염, 공막염, 각막 궤양, 건성안 증후군, 녹내장, 허혈성 망막 질환, 당뇨병성 망막병증, 각막 이식 거부증, 안구내 수술 예컨대 안구내 렌즈 이식술과 관련된 합병증 및 백내장 수술과 관련된 염증, 베체트병, 스타르가르트병, 면역 복합 혈관염, 푸크스 질환, 보그트-고야나기-하라다병, 망막하 섬유증, 각막염, 초자체 망막 염증, 안구 기생충성 감염/이동, 망막 색소 변성증, 사이토메칼로바이러스성 망막염 및 맥락막 염증의 치료는 당 분야에서 허용된 방법으로 평가된다. 징후의 안정화 및 경감 및/또는 안구 질환의 예방에 있어서 항보체 앱타머 단독 또는 다른 제제와 병용한 유효성을 측정하는 경우, 환자는 또한 안과 의사에 의해 임상적으로 평가될 수 있다. 상기 임상 평가는 주입 후 수일 및 다음 주입 직전에 일어날 수 있다. 임상 평가는 주요 징후 또는 객관적인 생리 지수를 평가하는 등의 직접적 관찰 및 간접적 평가를 포함할 수 있다. 예를 들어, 치료 효능은 혈관 누출 또는 혈관 부종 또는 이들의 임의의 조합의 예방, 안정화 및/또는 반전을 기초로 하여 평가될 수 있다. 치료 효능은, 녹내장의 경우에, 안저 촬영 또는 광 간섭성 단층촬영술을 이용하여 측정될 수 있는 망막 신경 섬유 층 또는 광 신경의 건강의 안정화에 대해 평가할 수 있다
본원에서 인용한 모든 간행물 및 특허 문헌은, 각각의 상기 간행물 또는 문헌이 참고로서 본원에 포함되었음을 특이적 및 개별적으로 나타낸 것처럼 본원에 참고로 포함된다. 간행물 및 특허 문헌의 인용은 임의의 것이 관련된 종래 기술이라는 승인을 의도하는 것이 아니며, 또는 그것이 동일한 내용 또는 날짜에 관한 임의의 승인을 구성하는 것도 아니다. 본 발명은 기재된 설명에 의해 기술되고 있으며, 당업자들은 본 발명이 다양한 구체예에서 수행될 수 있고, 전술한 설명 및 하기 실시예는 예시의 목적일 뿐 후술하는 청구항을 한정하는 것이 아님을 인식할 것이다.
실시예 1
고전 및 대체 보체 경로에 있어서 항-C5 앱타머 활성
실시예 1A: 용혈 분석
CH50 테스트는 항체 코팅된 양 적혈구의 정형화된 현탁액 중에 세포의 50%를 용해한 혈청 테스트 시료에서 보체 시스템의 능력을 측정한다. 0.2% 인간 혈청의 용액을 여러 가지 항-C5 앱타머의 존재 또는 부재하에 항체 코팅된 양 적혈구(Diamedix EZ Complement CH50 Kit, Diamedix Corp., Miami, FL)와 혼합하였다. 칼슘, 마그네슘 및 1% 젤라틴(GVB++ 보체 완충제)을 함유하는 베로날 완충된 염수 중에 키트 프로토콜을 따라 분석을 진행하고, 37℃에서 30분간 배양하였다. 배양 후, 상기 시료들을 펠릿 그대로의 적혈구로 원심분리했다. 용혈 정도(Green et al., (1995) Chem. Biol. 2:683-95)에 비례하는 가용성 헤모글로빈의 방출을 정량하기 위해 상기 상청액의 412 nm에서 광학 밀도(OD412)를 판독하였다. 앱타머가 C5 활성화를 차단한다는 것을 증명하기 위해, 약간의 용혈 상청액을 ELISA(C5b-9 ELISA kit, Quidel, San Diego, CA; C5a ELISA kit, BD Biosciences, San Diego, CA) 후 ELISA 키트 프로토콜에 의해 C5a 및 C5b-9의 존재에 대하여 분석하였다.
투여량 의존 방식으로 용혈을 저해하는 반응 혼합물로의 비페길화 항-C5 앱타머(ARC186)(서열 번호: 4)의 첨가는, 도 7A의 그래프에 나타낸 바와 같이, 니트로셀룰로오스 여과에 의해 측정한 KD와 일치하는 값인 IC50이 0.5±0.1 nM이다(도 7B 참조). 매우 높은 앱타머 농도(>10 nM)의 경우에, ARC186(서열 번호: 4)이 보체 활성을 완전하게 차단할 수 있음을 가리키는 용혈의 정도는 배경(첨가 혈청 없음)과 필수적으로 구별되었다. 20 kDa(ARC657; 서열 번호: 61), 30 kDa(ARC658; 서열 번호: 62), 분지형 40 kDa(1,3-비스(mPEG-[20 kDa])-프로필-2-(4'-부타미드)(ARC187; 서열 번호: 5), 분지형 40 kDa(2,3-비스(mPEG-[20 kDa])-프로필-1-카바모일)(ARC1905; 서열 번호: 67), 선형 40 kDa(ARC1537; 서열 번호: 65) 및 선형 2x20 kDa(ARC1730; 서열 번호: 66) PEG 기와 ARC186(서열 번호: 4) 앱타머의 접합은 CH50 용혈 분석에서 앱타머 저해 활성에 거의 효과가 없다(도 7A∼도 7D).
추가 연구에 있어서, 페길화 항-C5 앱타머 ARC1905(분지형 40 kDa (2,3-비스(mPEG-[20 kDa])-프로필-1-카바모일); 서열 번호: 67)의 저해 활성을, 전술한 CH50 용혈 분석에서 말단 5'-아민을 함유하는 ARC672(서열 번호: 63)인 그것의 비페길화 전구체와 비교하였다. 인간 혈청액(Innovative Research, Southfield, MI)을 각각 다양한 농도의 ARC1905 및 ARC627의 존재 또는 부재하에 항체 코팅된 양 적혈구(Diamedix EZ complement CH50 kit, Diamedix Corp., Miami, FL)와 혼합하여, 각각의 분석에서 혈청의 최종 농도가 0.1%가 되도록 하고, 상기 분석을 제조자가 추천한 프로토콜에 따라 분석을 진행하였다. 이 용혈 반응물을 37℃에서 교반하면서 1시간 동안 배양하여 세포가 현탁액에 잔존함을 보증하였다. 배양의 마지막에, 그대로의 세포를 원심분리(2000 rpm, 2분, 실온)에 의해 펠릿화하고, 200 ㎕ 상청액을 평평한 바닥의 폴리스티렌 판(VWR, cat#62409-003)으로 옮겼다. 상기 상청액의 415 nm에서 광학 밀도(OD415)를 판독하여 가용성 헤모글로빈의 방출을 정량 하였다. 측정된 각각의 앱타머 농도에서 저해율(%)을 식 %inh = 100 - 100 × (A시료 - A혈청 없음)/(A앱타머 없음- A혈청 없음)을 이용하여 측정하였고, 이때 A시료는 앱타머의 농도를 다양화할 때 시료 흡광도이고, A혈청 없음은 혈청의 부재 시(100% 저해 대조군) 배경 용혈로 인한 흡광도이고, A앱타머 없음은 앱타머의 부재시(0% 저해 대조군) 기본 보체 활성으로 인한 흡광도이다. IC50 값은 식 %inh = (%inh)최대 × [저해제]n/(IC50 n + [저해제]n) + 배경을 이용하여 저해율(%) 대 [저해제]의 도식으로부터 측정하였다. IC9O 및 IC99 값은 식 IC90 = IC50 × [9O/(100-90)]1/n 및 IC90 = IC50 × [99/(100-99)]1/n을 이용하여 IC50 값으로부터 계산하였다. 이 평행 연구에 있어서 ARC1905 및 ARC627에 대한 IC50 값은 각각 0.648 +/- 0.0521 및 0.913 +/- 0.0679이고(도 58 참조), 이는 페길화가 앱타머 기능에 거의 영향을 주지 않음을 더욱 확신시킨다.
용혈 상청액의 ELISA 분석법은 이 기능적 저해가 C5a 방출의 봉쇄와 상관관계가 있음을 나타내었다. 따라서, 상기 용혈 데이터는 ARC186(서열 번호: 4) 및 이의 페길화 결합체가 C5의 전환효소 촉매된 활성화를 차단함으로써 기능하는 매우 강력한 보체 저해제임을 나타낸다.
비페길화 물질에 의한 용혈 분석은 항-C5 앱타머가 래트, 기니아 피그, 개 및 피그를 비롯한, 다수의 비우위 종으로부터의 C5와 교차반응하지 않음을 가리킨 다. 하지만, 유의적인 저해제 활성을 사이노멀거스 원숭이, 붉은털 원숭이 및 침팬지로부터의 혈청을 포함하는 우위 혈청의 스크린에서 관찰하였다. 항-C5 앱타머의 시험관 내 효능은 ARC658(서열 번호: 62), ARC186(서열 번호: 4)의 30 kDa PEG 유사체를 이용하여 사이노멀거스 혈청에서 추가 조사하였다. 동등 비교 시(n = 3), ARC658은 IC50이 0.21±0.0 nM인 인간 보체 활성 및 IC50이 1.7±0.4 nM인 사이노멀거스 보체 활성을 저해했다(도 8). 따라서, 이 측정에 의해 ARC658(서열 번호: 62)은 인간에 비해 사이노멀거스 혈청에 있어서 8±3배 덜 강력하다.
관련 연구에 있어서, 양 적혈구 용혈에 의해 분석한 고전 보체 경로 활성화에 대한 분지형 40 kDa(2,3-비스(mPEG-[20 kDa])-프로필-1-카바모일) 페길화 항-C5 앱타머, ARC 1905(서열 번호: 67)의 효과를, 인간(Innovative Research, Southfield, MT), 사이노멀거스 원숭이(Bioreclamation, Hicksville, NY), 또는 래트 혈청(Bioreclamation, Hicksville, NY)의 존재하에 조사하였다. 이러한 분석은, 위에서 직접 기술한 바와 같이 양 적혈구 용혈에 대한 ARC1905 대 ARC672의 저해 효과를 비교하는 데 사용했던 것과 동일한 조건하에, 인간과 사이노멀거스 원숭이의 경우 0.1%, 및 래트의 경우 0.3%로 매우 희석한 혈청에서 수행하였다. 동등 비교 시, 인간 및 사이노멀거스 원숭이 둘 다의 혈청에서는 ARC1905가 시험관 내 보체 활성의 완전한 저해(90-99%)를 달성한 한편, 래트 보체 시료에서는 ARC1905가 아무런 특이적 저해 활성을 나타내지 않았다(도 59A). ARC658과 유사하게, ARC1905는 도 59B에 기록된 IC90 및 IC99 값에 반영된 바와 같이, 분석의 조건하에서 사이노 멀거스 보체 활성에 대해 ∼10배 덜 강력하다 .
니트로셀룰로오스 여과기 결착 분석. 각각의 앱타머를 γ-32P-ATP 및 폴리뉴클레오티드 키나아제(New England Biolabs, Beverly, MA)를 사용한 배양에 의해 5' 말단에서 32P-표지하였다. 폴리아크릴아미드 겔 전기영동을 수반한 겔 여과에 의해 유리 ATP로부터 방사성 표지된 앱타머를 정제하였다. 항-C5 앱타머 친화도를 측정하기 위해, 방사성 표지된 앱타머(≤10 pM)를 1 mM MgCl2를 함유하는 인산염 완충된 염수 중에 실온(23℃) 및 37℃에서 15분 동안 4시간 간격으로 정제된 C5 단백질(Quidel, San Diego, CA)의 농도(0.05∼100 nM)를 증가시키면서 배양하였다. 상기 결착 반응을 미니폴드 I 도트 블롯, 96 웰 진공 여과 매니폴드(Schleicher & Schuell, Keene, NH)를 이용한 니트로셀룰로오스 여과에 의해 분석하였다. 프로트란 니트로셀룰로오스(Schleicher & Schuell), 하이본드-P 나일론(Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) 및 GB002 겔 블롯 페이퍼(Schleicher & Schuell)로 이루어진(꼭대기에서 바닥으로) 3층 여과 배지를 사용하였다. 핵산에 대하여 단백질을 선택적으로 결합하는 니트로셀룰로오스 층은 우선적으로 단백질 리간드와의 착체에서 항-C5 앱타머를 유지하는 한편, 비착화한 항-C5 앱타머는 니트로셀룰로오스를 관통하여 나일론에 부착하였다. 상기 겔 블롯 페이퍼는 단지 다른 여과기에 대한 지지하는 배지로서 포함하였다. 여과를 수행한 후, 여과기 층을 분리하고, 건조하고 인광 물질 스크린(Amersham Biosciences)에 노출시켰으며, 스톰 860 인광화 상기® 블롯 화상계(Amersham Biosciences)를 사용하여 정량화하였다.
도 9 및 도 10에서 나타낸 바와 같이, 증가하는 C5 농도는 니트로셀룰로오스 막에 포획된 ARC186의 비율을 향상시킨다. 증가하는 C5 농도에 대한 결합 ARC186의 의존성은 단일 부위 결착 모델(C5 + ARC186 ↔ C5ㆍARC186; 결합율% = C최대/(1 + KD/[C5])에 의해 잘 기술되고; C최대는 포화 [C5]에서 최대 결합율(%)이고; KD는 해리 상수임). 15분 또는 4시간 배양을 수반하는 2가지 온도에서 ARC186 결착 곡선은 각각 도 9 및 10에 도해된다. 15분 배양을 수행한 후, 23 및 37℃에서 상기 ARC186 결착 곡선은 반드시 0.5∼0.6 nM의 KD 값에 일치하는 에러 내에서 분간하기 어렵다(도 9). 23 및 37℃에서 결착 곡선 사이의 차이는 배양 시간이 길어질 때 더욱 확실해진다. 4시간 배양(도 10)을 수행한 후, 23℃에서 관찰한 KD는 0.08±0.01 nM로 감소하는 한편, 37℃에서 관찰한 KD는 변화없이 유지된다(0.6±0.1 nM).
실온에서 긴 배양 요건에 대한 근거를 증명하기 위해, 이 온도에서 친화도를 역학법을 이용하여 추가 조사하였다. C5ㆍARC186의 해리를 나타내는 역반응의 속도는 vrev = k -1[C5ㆍARC186]이고, 이때 vrev는 속도(M-1min-1의 단위)이고, k - 1은 1차 해리 속도 상수(M-1min-1의 단위)이다. C5ㆍARC186 착체의 형성을 나타내는 정반응의 속도는 vfor = k 1[C5][ARC186]이고, 이때 vfor는 속도(M-1min-1의 단위)이고, k 1은 2차 해리 속도 상수(M-1min-1의 단위)이다. 허위 1차 가정을 이용하여 데이터를 분석하였고, 하나의 반응물(이 경우에 C5)의 농도는 다른 하나([C5]>>[ARC186]에 대하여 막대한 양으로 유지되고, 따라서 반응 과정에 걸쳐서 반드시 변화없이 유지된다. 이러한 조건하에, 정반응은 1차 공정에 대한 속도식, vfor = k 1'[ARC186]에 의해 기술되고, 이때 k 1' = k 1[C5]이다.
C5ㆍARC186의 해리를 분석하기 위해, 방사성 표지된 ARC186(≤ 10 pM)를 실온(23℃)에서 1 mM MgCl2를 함유하는 인산염 완충 염수 중에 5 nM의 C5 단백질로 미리 평형화하였다. 유리 C5에 대한 트랩으로서 작용하는 비표지된 ARC186(1 μM)를 첨가하여 해리 반응을 개시하고, 결합의 니트로셀룰로오스 여과 분리 및 유리 방사성 표지된 ARC186에 의해 멈췄다. 상기 해리 반응의 개시와 여과 사이의 기간을 다양화함으로써 ARC186 해리의 시간경과를 얻었다. 니트로셀룰로오스 여과기에 포획된 방사성 표지된 ARC186의 퍼센트(C5에 대한 결합 퍼센트와 동등)의 감소로서 관찰되는 해리의 시간경과는, ARC186 결합율(%) = 100 × e-k-1t인 단일 지수 붕괴에 의해 잘 기술된다(도 11 참조). 이 방법으로 측정된 해리 속도 상수, k-1의 값은 53±8분의 반감기(t1/2 = ln2 / k-1)에 해당하는 0.013±0.02 min-1이다.
결합 반응을 분석하기 위해, C5ㆍARC186의 형성에 대한 평형 속도 상수(keg)를 다양한 농도의 C5 단백질(1∼5 nM) 존재하에 측정하였다. 착물 형성은 실온(23 ℃)에서 1 mM MgCl2를 함유하는 PBS 중에 C5 단백질과 방사성 표지된 ARC186을 함께 혼합하여 개시하고, 니트로셀룰로오스 여과 분리에 의해 멈췄다. 해리 반응에 대해 기술한 바와 같이, 반응의 개시와 여과 사이의 기간을 다양화함으로써 착물 형성의 시간경과를 얻었다. 니트로셀룰로오스 여과기에 포획된 방사성 표지된 ARC186의 퍼센트의 증가로서 관찰되는 평형의 시간경과는, ARC186 결합율(%) = 100 X (1- e-k1t)인 단일 지수 붕괴에 의해 잘 기술된다. 1, 2 및 4 nM의 C5에 대한 평형의 시간경과를 도 12에 나타내었다. 예상대로, keq의 값은 [C5](keg(1 nM) = 0.19±0.02 min-1; keg(2 nM) = 0.39±0.03 min-1; keg(3 nM) = 0.59±0.05 min-1; keg(4 nM) = 0.77±0.06 min-1; keg(5 nM) = 0.88±0.06 min-1)로 직선으로 증가한다. 실험의 조건하에, keq, k1 및 k-1 사이의 상관관계는 keq = k1[C5] + k-1이다. 따라서, k1의 추정치는 keq 대 [C5] 도식(도 12 삽입 참조)의 기울기로부터 유도되고, 이 경우에 0.18±0.01 nM-1min-1이다.
이러한 데이터는, 낮은 C5 농도(예컨대, 0.1 nM)의 조건하에서, C5 및 방사성 표지된 ARC186의 혼합물이 평형에 도달하기 위해서 확장된 배양이 요구된다. 이러한 조건하에, keq = (0.18±0.01 nM-1min-1)(0.1 nM) + 0.013 min-1 = 0.03 min-1이고, 이는 22분의 반감기에 해당한다. 따라서, 완전한(> 95%) 평형을 위해 거의 2시 간의 실온 배양(∼5 반감기)이 필요했다. 앞서 15분(KD = 0.5 nM) 대 4시간(KD = 0.08 nM) 배양에 대하여 관찰된 친화도 차이로 나타낸 바와 같이, 짧은 배양 시간(예컨대, 15분)은 착물의 실제 친화도를 유의적으로 낮게 어림할 것이다. 실온 KD의 대안적인 평가치는 상관관계 KD = k -1/k 1에 따른 역학적 데이터로부터 계산될 수 있다. 이 경우에, 상기 계산된 KD는 0.07±0.01 nM이고, 이것은 앞서 열역학적 방법에 의해 측정된 KD와 완전하게 일치한다.
또한, 니트로셀룰로오스 여과 분석에서 보체 캐스캐이드에 있는 C5로부터 업스트림 및 다운스트림 둘 다의 보체 성분과 비교함으로써 C5에 대한 ARC186(서열 번호: 4)의 특이성을 평가하였다. C1q(cat. # A099.18; 2.3 μM), C3(cat. # A113c.8; 27 μM), C5(cat. # A120.14; 5.4 μM), C5a des Arg(cat. # A145.6; 60 μM), sC5b-9(cat. # A127.6; 1 μM), 인자 B(cat. # A135.12; 11 μM) 및 인자 H(cat. # A137.13P; 6.8 μM)를 비롯한 정제한 인간 단백질 및 단백질 착물을 Complement Technologies(Tyler, TX)로부터 구입하였다. 25℃ 또는 37℃에서 1∼4시간 동안 배양한 단백질을, 1 mM MgCl2, 0.02 mg/mL BSA 및 0.002 mg/mL tRNA를 더한 PBS 중에 연속적인 희석을 수행함으로써 결착 반응을 수립하고, 그 다음 전술한 바와 같이 니트로셀룰로오스 여과 기기에 적용하였다. 식: % 니트로셀룰로오스 결착 = 넓이 X [C5]/(KD + [CS])에 대한 데이터의 적합에 의해 해리 상수 KD를 % 니트로셀룰로오스 결착 대 [C5]의 준로그 도식으로부터 측정하였다.
도 13에서 도해한 결과들은, 앱타머가 반드시 C5a(KD >> 3 μM)를 인식하는 것은 아니지만, 추측건대 C5b 성분과의 상호작용으로 인해 그것은 가용성 C5b-9 (KD > 0.2 μM)에 대해 약한 친화도를 나타낸다. 다른 보체 성분들은 앱타머에 대한 약한 친화도를 적절하게 나타낸다. 비활성화 C3이 반드시 앱타머에 결착하는 것은 아니고; 하지만, 훨씬 적은 범위로 인자 H(KD ∼ 100 nM) 및 C1q(KD > 0.3 μM)는 결착한다. 함께 고려해보면, 상기 데이터는 ARC186(서열 번호: 4)이 주로 C5b 도메인의 인식을 통해 인간 C5에 높은 친화도로 결착한다는 것을 가리킨다. 따라서, ARC186 및 이의 페길화 유도체, 예컨대 ARC1905는 세균의 도포에 중요한 C3b의 생성 또는 조절 인자에 의한 C' 활성화의 본질적인 제어에 간섭하지 않아야 한다.
고분자량 PEG 부분을 가진 앱타머의 접합은 친화도 감소를 유도하는 입체적 장애의 가능성을 도입한다. 표적 단백질의 부재 시에도 니트로셀룰로오스에 부착하는 이들 앱타머의 경향으로 인해 니트로셀룰로오스 여과 분석에 의한 직접적 결착에 대해 PEG 변성 앱타머를 쉽게 평가하지 않는다. 하지만, 이러한 앱타머의 상대 친화도는, 37℃에서 작동하는 경쟁 결착 분석으로 공지된 니트로셀룰로오스 여과에 의해 측정된 표적으로의 결착을 위해 방사성 표지된 비페길화 앱타머(< 10 pM)와 경쟁하는 그들의 상당한 능력으로 평가될 수 있다. 차가운(즉, 비방사성 표지된) 경쟁자의 농도가 증가함에 따라, 표적 단백질에 결합한 방사성 표지된 앱타머의 퍼센트는 감소한다. 도 14에 나타낸 바와 같이, 증가 농도의 차가운 ARC186(서열 번호: 4) 또는 페길화 앱타머(ARC657(서열 번호: 61), ARC658(서열 번호: 62) 및 ARC187(서열 번호: 5)(0.05∼1000 nM)은 2 nM의 C5 단백질 존재하에서 결착을 위해 방사성표지된 ARC186(서열 번호: 4)과 쉽게 경쟁한다. 또한, 모든 4개의 앱타머에 대한 적정 곡선은 거의 겹치고, 이는 ARC657, ARC658 및 ARC187의 경우에 PEG 접합이 C5에 대한 앱타머의 친화도에 거의 또는 전혀 영향을 미치지 않음을 가리킨다.
유사 연구에 있어서, ARC672(5'-말단 아민을 가진 ARC186; 서열 번호: 63)와 ARC1905(분지형 40 kDa (2,3-비스(mPEG-[20 kDa])-프로필-1-카바모일)PEG와 결합된 ARC627)를 경쟁 결착 분석을 이용하여 비교함으로써 C5로의 결착에 대한 PEG 접합의 효과를 테스트하였다. 1 mM의 MgCl2, 0.01 mg/mL의 BSA, 0.002 mg/mL의 tRNA를 더한 PBS 중에 각각의 앱타머의 10 μM 저장액을 제조하고, 이어서 희석하여 >100배 범위의 앱타머 농도를 포함하는 일련의 1OX 시료를 생성하였다. 그 다음, 각각의 시료의 12 ㎕ 균등물(aliquot)을 96 웰 플레이트에서 96 ㎕ 32P-방사성 표지된 ARC186에 넣어 표지 및 차가운 경쟁자의 1.1X 용액을 생성하였다. 그 다음, 90 ㎕의 표지/경쟁자 용액을 10 ㎕의 1OX C5 단백질에 첨가하여 반응을 개시하였다. 각각의 반응 중에 방사성 표지된 ARC186의 최종 농도를 일정하게 유지하였다. 결착 반응은 37℃에서 15∼30분간 평형을 유지하고, 그 다음 전술한 니트로셀룰로오스 여과 장치상으로 여과하였다. 데이터 분석의 목적으로, 차가운 경쟁자 앱타머를 ARC186/C5 상호작용의 경쟁적인 저해제로서 처리하고; 경쟁자(0% 저해 대조군)를 약화시키는 반응을 제어하는 데이터를 표준화하여 저해율(%)을 계산하였다. 상기 데이터를 식: 저해율(%) = 넓이 X [경쟁자]n/(IC50 n + [경쟁자]n)에 대입하여 저해율(%) 대 [ARC672] 또는 [ARC1905]의 반로그 도식으로부터 IC50 값을 측정하였다.
도 60에 나타낸 바와 같이, 분지형 40 kDa (2,3-비스(mPEG-[20 kDa])-프로필-1-카바모일)PEG의 첨가는 경쟁적인 결착에 의해 측정된 바와 같이 앱타머 친화도에 거의 또는 전혀 영향을 미치지 않았다. 0.46+/- 0.149 nM 및 0.71 +/- 0.130 nM의 KD 값은 각각, 도 60에서 IC50 대 C5 데이터에 해당하는 선의 y절편으로 ARC672 및 ARC1905에 대해 추정되었다. 두 값은 37℃에서 ARC186에 대해 측정한 KD에 가깝다.
또한, ARC1905와 C5 사이의 상호작용의 온도 의존성을 경쟁 분석으로 평가하였다. 이어서, ARC1905를 희석하여 전술한 일련의 1OX 시료를 생성하였다. 결착 반응은 25℃ 또는 37℃에서 1∼4시간 동안 균형을 유지하고, 그 다음 니트로셀룰로오스 여과 장치상에 여과하였다. 경쟁자(0% 저해 대조군)를 약화시키거나, 또는 C5 단백질 20(100% 저해 대조군)을 약화시키는 반응을 제어하기 위한 데이터를 표준화하여 저해율(%)을 측정하였다. 상기 데이터를 식: 저해율(%) = 넓이 x [경쟁자]n/(IC50 n + [경쟁자]n)에 대입하여 저해율(%) 대 [ARC672] 또는 [ARC1905]의 반로그 도식으로부터 IC50 값을 측정하였다. 도 61에 나타낸 바와 같이, ARC1905는 25℃ 및 37℃ 둘 다에서 높은 친화도로 C5에 결착한다. 0.15±0.048 nM 및 0.69±0.148 nM의 KD 값을 각각 25℃ 및 37℃에서 IC50 대 C5 데이터의 y절편으로부터 얻었다. 두 값 모두는 전술한 ARC186/C5 상호작용에 대해 측정한 KD 값과 일치한다.
실시예 1B: 전혈 분석
후술하는 전혈 분석을 이용하여 보체 시스템의 대체 경로에 대한 항-C5 앱타머의 효과를 분석하였다. 항응고제가 없는 경우에, 정상적인 인간 지원자로부터 채혈하였다. 실온 또는 37℃에서 ARC186(서열 번호: 4)의 농도를 증가시키면서 5시간 동안 혈액 균등물(항응고제 함유하지 않음)을 배양하였다. 시료를 원심분리하여 혈청을 단리하고, sC5b-9 ELISA(C5b-9 ELISA kit, Quidel, San Diego, CA)에 의해 혈청 중에 C5b의 존재를 검출하였다. 도 15에 나타낸 바와 같이, C5b-9의 제조에서 반영된 바와 같은 상이한 온도에서 배양한 시료 사이의 항보체 활성은 3 μM에서 갈라졌다. 실온 데이터는 양적인 저해에 요구되는 앱타머의 농도가 3∼6 μM 범위인 한편, C5의 기록된 농도는 대략 400 nM임을 나타내었다. 이러한 결과는 C5 활성의 완전한 저해를 위해 10배가 넘는 몰 과량의 항-C5 앱타머(ARC186; 서열 번호: 4)가 필요할 수 있음을 제시한다.
실시예 1C: 자이모산에 의한 보체 활성화
자이모산은 효모 세포벽의 다당류 성분이고, 대체 보체 캐스캐이드의 강력한 활성자이다. 혈액, 혈장 또는 혈청의 생체 밖 시료에 대한 자이모산의 첨가는 C5a 및 가용성 버전의 C5b-9(sC5b-9)를 비롯한 보체 활성화 산물의 축적을 초래한다. 희석하지 않은 인간 혈청(Center for Blood Research, Boston, 3VLA), 구연산화 인 간 전혈(Center for Blood Research, Boston, MA) 또는 사이노멀거스 혈청(Charles River Labs, Wilmington, MA)의 시료를 ARC658(서열 번호: 62), ARC186(서열 번호: 4)의 3OK PEG 유사체의 농도를 증가시키면서 섞었다. 보체를 활성화하기 위해, 1OX 현탁액 중 자이모산(Sigma, St. Louis, MO)을 시료에 첨가하여 최종 농도를 5 mg/mL로 하였다. 37℃에서 15분 배양한 후, 자이모산 입자들을 원심분리에 의해 제거하고, C5a 및/또는 sC5b-9 ELISA(C5b-9 ELISA kit, Quidel, San Diego, CA; C5a ELISA kit, BD Biosciences, San Diego, CA)에 의해 보체 활성화의 정도를 측정하였다.
앱타머의 부재 시, 자이모산 치료는 처리하지않은 시료 중 ∼1% 활성화에 비해 ∼50%의 혈청 또는 전혈 C5를 활성화한다. 최대 50 nM(혈액 중 ∼10%의 C5 농도) 항-C5 앱타머의 첨가는 sC5b-9 형성에 거의 효과가 없다. 하지만, ARC658(서열 번호: 62)의 농도를 증가시키면서 C5의 추가 적정은 도 16에서 알 수 있는 바와 같이 투여량 의존 방식으로 C5 활성화를 저해하였다. 인간 혈청 또는 전혈의 경우에, 정량적인(∼99%) 저해는 C5에 대한 ∼2 몰 당량의 앱타머에 해당하는 0.8∼1 μM ARC658(서열 번호: 62)에서 관찰되었다. 사이노멀거스 혈청에서 상당한 저해를 달성하는 데 더 높은 농도의 앱타머가 필요하였다. 이 경우에, 99% 저해율은 C5에 대해 단지 10 μM 앱타머, 또는 ∼20몰 당량의 앱타머의 존재 시에 달성되었다.
유사 연구에 있어서, ARC1905(ARC186의 분지형 40 kDa(2,3-비스(mPEG-[20 kDa])-프로필-1-카바모일) 페길화 버전)의 저해 효과는, 후술하는 대체 경로를 통해 보체를 활성화하기 위해 자이모산을 사용하여 인간 및 사이노멀거스 원숭이 시 료에서 테스트하였다. 사카로마이세스 세레비지아(Saccharomyces cerevisiae)로부터의 자이모산 A는 시그마-알드리치사(cat. no. Z4250-1G, St. Louis, MO)에서 입수하였다. 상기 자이모산 A는 분말로서 공급되었고, 둘베코의 PBS(Gibco, Carlsbad, CA, cat. no. 14190-144)에 현탁시켜 50 mg/mL의 현탁액을 얻었다. 냉동 혼합된 정상적인 인간 혈청(cat. no. IPLA-SER)을 이노베이티브 리서치(Southfield, MI)로부터 구입하였다. 냉동 혼합된 사이노멀거스 원숭이 혈청(cat. no. CYNSRM)을 바이오레클러메이션(Hicksville, NY)으로부터 구입하였다. 공급자에 의해 제공된 5∼10 mL의 혈청 유리병을 37℃에서 녹여, 균등하고(∼1 mL) -20℃에서 저장하였다. 균등물은 필요에 따라 사용하기 직전에 37℃에서 배양함으로써 녹이고, 실험 중에 얼음에 저장하였다. 각각의 분석에서 혈청의 최종 농도는 -100%이었다. ARC1905의 20 μM 저장액을 0.9% 염수에서 제조하고, 이어서 희석하여 ∼90배 범위의 앱타머 농도를 포함하는 일련의 1OX 시료를 생성하였다. 또한, 앱타머가 없는(단지 염수만) 시료를 음성(0% 저해) 대조군으로서 포함하였다.
90 ㎕의 혈청을 96 웰 PCR 플레이트(VWR, cat. no. 1442-9596)의 웰 안에 피펫으로 옮겼다. 앱타머 시료 10 ㎕를 실온에서 혈청으로 직접 희석하고 혼합하였다. 50 mg/mL의 자이모산 8 ㎕를 구분된 96 웰 PCR 플레이트의 웰 안에 피펫으로 옮겼다. 두 플레이트 모두 37℃에서 15분간 동시에 예비배양하였다. 예비배양 직후, 혈청/앱타머 혼합물 80 ㎕를 8 ㎕의 자이모산에 직접 첨가하고 혼합하여, 5 mg/mL의 자이모산 최종 농도를 얻었다. 상기 반응 플레이트를 밀봉하고, 37℃에서 15분간 배양하였다. 상기 배양의 마지막에, 0.5M의 EDTA 8 ㎕를 웰 안에 피펫으로 옮기고 혼합함으로써 상기 반응을 켄칭하였다. 원심분리(3700 rpm, 5분, 실온)에 의해 자이모산을 펠릿화하고, ∼80 ㎕ 켄칭한 상청액을 새로운 96 웰 PCR 플레이트로 옮기고 밀봉하였다. 상청액을 액체 질소에서 급속 냉동하고, -20℃에서 저장하였다. 자이모산 의존성 배경 활성화에 대해 제어하기 위하여, 자이모산 대신에 8 ㎕의 염수를 첨가한 것을 제외하고는 전술한 바와 똑같이 혈청 시료를 제조하고 처리하였다.
C5a ELISA 키트 프로토콜에 이어 C5a ELISA(ALPCO Diagnostics, Windham, NH, cat. no. EIA-3327)에 의해 측정된 각각의 자이모산 활성화 시료에서 생성된 C5a의 상대 농도로부터 C5 활성화 정도를 측정하였다. 상기 C5a ELISA 키트는 인간 특이적 반응물을 포함하고, 혈장 또는 혈청 시료 중에 인간 C5a(hC5a)의 분석을 위해 구성된다. 따라서, 사이노멀거스 농도 기준을 이용하여 사이노멀거스 원숭이 C5a에 대한 ELISA의 반응을 특성화하는 것이 필수적이었다. 한 세트의 통상 기준을 작성하기 위해, 인간 또는 사이노멀거스 원숭이 혈청의 0.5 mL 균등물들을 5 mg/mL 자이모산으로 15분 동안 37℃에서 배양하고, 12.5 ㎕의 0.5M EDTA로 켄칭하고, 원심분리하여 자이모산을 제거하였다. 자이모산 활성화한 인간 혈청 시료 중에 C5a의 농도를 키트를 사용하여 제공된 hC5a 기준 혈장과 비교하여 대략 2 μg/mL hC5a로 측정하였다. 인간 C5a 동등물(hC5a eq) 중에 발현된 사이노멀거스 원숭이 시료 중에 C5a의 농도는, 대략 0.6 μg/mL hC5a eq로 측정하였다. 래트 혈청(ELISA에 간섭하지 않음) 안으로 희석하여 0.4∼400 ng/mL hC5a 또는 0.12∼120 ng/mL hC5a eq 범위를 포함하는 일련의 기준을 제조하였다. ELISA 키트 프로토콜에 지시된 바와 같이 기준을 단백질 침전 반응물로 예비처리하고, 추가로 희석하지 않고 ELISA 플레이트에 적용하였다. ELISA 플레이트는 VersaMax UV/vis 흡광도 플레이트 판독기(Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA)를 이용하여 450 nm(A450)의 최대 흡광도에서 판독되었다. A450은 낮은 C5a에서 0.1∼0.2의 낮은 것으로부터 높은 C5a에서 ∼3.5에 달하는 C5a 농도로 변화하였다. 분석 시료 중에 C5a의 정량화를 목적으로, 정량화의 상한 및 하한은 각각 인간의 경우 25 및 0.78 ng/mL hC5a이고, 사이노멀거스 원숭이의 경우 15 및 0.94 ng/mL hC5a eq이었다. A450 대 ng/mL hC5a 또는 hC5a eq를 도 62에 나타낸 바와 같이 도면을 작성하였고, 식 y = ((A - D)/(1 + (x/C)B)) + D를 이용하여 데이터에 맞는 4-파라미터로부터 기준 곡선을 얻었다.
C5a 분석 직전에, 분석 시료(염수만 있고 자이모산이 없는 대조군을 포함)를 ELISA 키트 프로토콜에 지시된 바와 같이 단백질 침전 반응물로 예비처리하고, 그 다음 이어서 0.9% 염수로 희석하였다. 희석하지않은 분석 시료(자이모산이 없는 대조군의 약간을 포함) 중에 C5a 농도는 전형적으로 정량화의 상한(ULOQ)을 초과한다. 그러므로, 1/5, 1/50 및 1/250의 희석물을 테스트하여 분석 시료 C5a 농도의 전체 범위를 조정하였다. C5a 농도를 적당한(인간 또는 사이노멀거스 원숭이) 기준 곡선과 비교하여 정량화하고, 희석을 위해 보정하였다. 식 %inh = 100 - 100 x (C5시료 - C5a자이모산 없음) / (C5a염수만 - C5a자이모산 없음)]을 이용하여 각각의 앱타머 농도에서 저해율(%)을 계산하였다. IC50 값은 식 %inh = (%inh최대 X [ARC1905]n/(IC50 n + [ARC1905]n) + 배경을 이용한 저해율(%) 대 [ARC1905]의 도식으로부터 측정하였다. IC90 및 IC99 값은 식 IC90 = IC50 X [90/(100-90]1/n 및 IC99 = IC50 X [99/(100-99]1/n을 이용한 IC50 값으로부터 계산하였다.
C3 활성화(C5의 바로 상류인 통상의 보체 경로에서의 단계)의 범위는 C3a ELISA 키트 프로토콜을 수행하는 C3a ELISA(Becton-Dickinson OptiEIA C3a ELISA kit, cat. no. 550499, Franklin Lakes, NJ)로 측정한 각각의 자이모산 활성화 시료 중에 생성되는 C3a의 상대 농도로부터 측정하였다.
C3a 분석 직전에, 시료(염수만 있고 자이모산이 없는 대조군을 포함)를 순차적으로 0.9% 염수로 희석하였다. C3a ELISA는 C5a 경우의 것보다 더 민감하고; 따라서, 1/500, 1/5,000 및 1/25,000의 희석은 시료 C3a 농도의 전체 범위를 조정하는 데 필수적이었다. C5a 분석을 위해 제조한 통상 기준 대신에 인간 혈청으로부터 유래된 키트 기준을 사용하였다. C3a 농도는 크게 변화하지않기 때문에, 인간 특이적 기준은 이들의 상대 농도의 충분한 지표를 제공하였다.
C5a 및 C3 ELISA 둘 다에서 생성된 데이터는 Microsoft Excel을 이용하여 분석하고, 평균 저해(%) 값을 Kaleidagraph(v. 3.51, Synergy Software)를 이용하여 도식화하였다. IC50, IC90 및 IC99 값은 XLfit 4.1 plug-in to Excel을 이용하여 측정하였다. 이러한 접근에 의해 측정한 인간 및 사이노멀거스 원숭이 보체 활성화에 대한 ARC1905의 상당한 효과를 도 63 및 도 64에서 요약하였다. 이러한 도면에서 알 수 있는 바와 같이, 대체 경로를 통한 C5 활성화의 완전한 저해는 인간 및 사이노멀거스 원숭이 혈청 둘 다에서 ARC1905를 가진 시험관 내에서 달성될 수 있다. 인간 혈청의 경우, 희석하지않은 시료에서 C5 활성화를 90% 저해하는 데 요구되는 ARC1905의 농도는 442±23 nM이었고, C5의 평균 몰 농도와 대략 동등하다. 하지만, IC90 및 IC99 값에서 비춰볼 수 있는 바와 같이, 분석의 조건하에서 ARC1905는 사이노멀거스 원숭이 보체 활성에 비해 4∼6배 덜 강력하였다.
C3a 농도에 의해 측정한 ARC1905 C3 활성화의 효과는 도 65에서 요약하였다. 보체 경로의 꼬리 말단을 특이적으로 표적화하는 이론은, C3a 및 C3b 생성에서 최고조에 달하는 상류 인자의 병원균 투쟁 작용을 타협하지 않고 C5a 및 세포막 공격 복합체(MAC)의 전구염증성 작용을 차단하는 것이다. 도 65의 데이터는 2 μM 이하의 ARC1905가 C3a 생성을 저해하지 않음을 논증하고, 상류 보체 활성화가 ARC1905에 의해 음성적으로 영향받지 않음을 가리킨다. 대체 경로 C5 활성화의 필수적으로 완전한 차단은 ARC1905를 이용하여 인간 및 사이노멀거스 원숭이 혈청 시료 둘 다에서 달성되었다. 대략적으로, ARC1905는 이 분석의 조건하에서 인간 C5 활성화보다 사이노멀거스 원숭이 C5 활성화를 저해하는 데 있어서 덜 강력한 크기의 정도였다. 이론에 결부시키고자 하는 것은 아니지만, 보체 활성화에 대한 ARC1905의 저해 효과는 C3의 활성화를 저해하지 않았기 때문에 C5에 특이적이다.
실시예 1D: 보체 활성화의 관 루프 모델
외부 물질로의 노출에 의해 유도된 보체 활성화를 차단하는 항-C5 앱타머의 능력을 테스트하기 위해, 심폐 우회로에서 발견된 바와 같이, 닐슨과 동료들[Gong et al, (1996) Journal of Clinical Immunology 16, 222-9; Nilsson et al, (1998) Blood 92, 1661-7]에 의해 기술된 관 루프 모델을 이용하였다. 타이곤 S-50-HL 의학용/외과용 관(1/4" 내부 직경)(United States Plastic Corp. ((Lima, OH), cat. #00542)을 대략 300 mm(대략 9 mL 부피)의 길이로 절단하고, 0.4 units/mL 헤파린(Celsus)을 함유하는 인간 공여자 혈액 5 mL로 채우고, ARC658(서열 번호: 62)(0∼5 μM)의 농도를 다양하게 하였다. Gong 외에 기재된 바와 같이, 각각 길이의 타이곤 관을 짧은 부분(∼50 mm)의 비외과용 실리콘 링커 관(3/8" 내부 직경)(United States Plastic Corp. (formulation R-3603, cat. # 00271)을 가진 루프 안으로 폐쇄하였다. 관 루프를 37℃ 물 베스에서 대략 30 rpm으로 1시간 동안 회전시켰다. 그 다음, 상기 루프 내용물을 EDTA(10 mM 최종 농도)를 함유하는 폴리프로필렌 원뿔 관 안으로 부어 보체 활성화를 켄칭하였다. 혈소판 부족 혈장을 원심분리에 의해 단리하고, ELISA(C3a ELISA kit, Quidel, San Diego, CA; C5a ELISA kit, BD Biosciences, San Diego, CA)에 의해 C5a 및 C3a에 대하여 분석하였다.
앱타머의 부재 시 전체 보체 활성화는 자이모산 분석에 비해 작았다. 전형적으로, 1시간 배양에 따라 C5a 농도는 대략 6 ng/mL씩 증가하였고, 이는 입수가능한 C5의 <1% 활성화에 해당한다. 그럼에도 불구하고, 이 증가는 재현가능하였고, ARC658(서열 번호: 62)을 사용한 적정에 의해 저해되었다. 도 17에 나타낸 바와 같이, 혈액 중에 C5의 몰 농도와 동등하거나 또는 약간 적은 농도인 300∼400 nM의 ARC658(서열 번호: 62)은 C5 활성화의 99% 저해를 달성하기에 충분하였다. 임의의 이론에 결부시키고자 하는 것은 아니지만, 자이모산 모델에 비해 이 모델에서 C5 활성화의 99% 저해를 얻는 데 앱타머가 덜 필요함에도 불구하고, 이 관찰은 두 가지 분석에서 사용된 보체 활성화 자극의 실질적인 차이를 반영할 수 있었다. 또한, ARC658(서열 번호: 62)이 보체 캐스캐이드에서 C5보다 더 일찍 활성화 단계들을 차단하지는 않음을 증명하기 위한 대조군으로서 C3a 생성을 측정하였다. 입수가능한 C3의 대략 10%의 활성화에 상응하는 1시간 배양에 따라 C3a 농도는 대략 4000 ng/mL씩 증가하였다. C5a 생성과 반대로, ARC658(서열 번호: 62)의 적정 시 C3a 생성의 용량 의존성 저해가 거의 관찰되지 않았고, 이는 ARC658(서열 번호: 62)이 C5 절단을 특이적으로 차단하는 것을 논증한다.
관 루프 모델 연구는 항-C5 앱타머 ARC1905(서열 번호: 67)를 사용하여 반복하였다. 이어서 ARC1905를 0.9% 염수로 희석하여, 100배 범위의 앱타머 농도(분석 시 최종 10∼1000 nM)를 포함하는 2OX 시료 시리즈를 생성하였다. 부적절한 앱타머(ARC127)를 함유하는 시료를 비특이적 올리고뉴클레오티드 효과를 위한 대조군에 포함하였다. 또한, 비앱타머(염수만) 시료를 음성 대조군으로서 포함하였다. 단일 공여자 혈액 시료를 사내 지원자로부터 기준 정맥 절개 방법에 의해 채혈하였다. 전혈을 5명의 개별 공여자로부터 60 mL 시린지(Becton-Dickinson, (Franklin Lakes, NJ), cat. # 309653) 안으로 직접 채혈하고, 즉시 비발리루딘(20 μM 최종)(Prospec-Tany Technogene Ltd., (Israel), lot # 105BIV01) +/- 앱타머로 균등배분하였다. 보체 활성화에 간섭하는 헤파린 대신에, 직접적인 트롬빈 저해제인 항응고제 비발리루딘을 사용하였다.
바로 위에서 기술한 바와 같이, 관 루프 모델을 필수적으로 수행하였다. 관(직경 1/4", 부피 ∼9 mL)의 ∼300 mm 부분을 상기 공여자들로부터 혈액을 채혈한 직후의 혈액/앱타머/비발리루딘 시료 5 mL로 채웠다. 그 다음, 상기 관을 실리콘 링커 관의 짧은 부분(∼50 mm)을 가진 루프 안으로 단단하게 고정하여, ∼4 mL의 가스 부피를 산출하였다. 상기 관 루프를 37℃ 물 베스에서 배양하는 동안 32 rpm으로 1시간 동안 수직으로 회전시켰다. 배양 후, 5 mL의 시료 모두를 0.5M의 EDTA 100 ㎕를 함유하는 15 mL의 원뿔 관(Corning, (Corning, NY), cat. # 430766)으로 옮겨서, 최종 EDTA 농도를 10 mM로 하였다. 1 mL의 혈장 상청액을 각각의 켄칭된 시료로부터 모아서, 4℃(3,300 rpm, 20분)에서 원심분리하였다(Eppendorf Centrifuge 5804). 상청액을 액체 질소에서 급속 냉동시키고, -20℃에서 저장하였다. 배경 활성화를 조절하기 위해, 얼음 위에서 0.5M의 EDTA 100 ㎕를 함유하는 15 mL의 원뿔 관에 5 mL의 새로운 혈액을 첨가함으로써 예비 CPB 시료를 제조하였다. 이 시료를 혈장에 대해 가공하고, 전술한 바와 같이 저장하였다.
직전에 기술한 바와 같이 C5a ELISA에 의해 측정한, 각각의 활성화 시료에서 생성된 C5a의 상대 농도로부터 C5 활성화 범위를 측정하였다. C5a ELISA는 ELISA 키트 프로토콜에 따라 희석하지않은 혈장 시료에서 수행하였고, 제조업자에 의해 제공된 C5a 기준과 비교하여 시료 C5a 농도를 정량화하였다. 각각의 앱타머 농도에서 C5a 생성의 저해(%)는 식 %inh = 100 - 100 X (C5a시료 - C5apre-CPB)/(C5asaline-only - C5apre-CPB)을 이용하여 계산하였다. 식 %inh = (% inh)최대 x [ARC1905]n/(IC50 n + [ARC1905]n) + 배경을 이용한 저해(%) 대 [ARC19O5]의 도식으로부터 IC50 값을 측정하였다. 식 IC9O = IC50 × [90/(100-90]1/n 및 IC99 = IC50 × [99/(100-99]1/n을 이용하여 IC50 값으로부터 IC90 및 IC99 값을 계산하였다.
직전에 기술한 바와 같이 C3a ELISA에 의해 측정한, 각각의 활성화 시료에서 생성된 C3a의 상대 농도로부터 C3의 활성화의 범위를 측정하였다. C3a 분석 직전에, 시료(염수만을 포함하고 예비 CPB 대조군)를 이어서 0.9% 염수로 희석하였다. C3a ELISA는 C5a의 것보다 더욱 민감하고; 그러므로, 1/5000의 희석은 시료 C3a 농도의 범위를 조정하는 데 필수적이었다. 키트 기준과 비교하여 시료 C3a 농도를 정량화하였고, C5a에 대해 기술한 바와 같이 저해율(%)을 측정하였다. 상기 데이터는 Microsoft Excel을 이용하여 분석하였고, Kaleidagraph(v3.5 Synergy Software)를 이용하여 평균 저해율(%) 값을 도식화하였다. XLfit 4.1 plug-in to Excel을 이용하여 IC50, IC90 및 IC99 값을 측정하였다.
5명의 공여자에게서 보체 활성화에 대한 ARC1905 및 부적합한 앱타머, ARC127의 평균 효과를 도 66에서 요약하였다. 도 67에 나타낸 바와 같이 C5a의 생성을 반영하는 C5 활성화의 완전한 차단이 <500 nM의 ARC 1905로 달성되는 한편, 부적합한 앱타머는 1 μM 이하의 저해 효과를 가지지 않았다. 평균 전혈 IC50, IC90 및 IC99 값은 각각 119±28.6 nM, 268±39.2 nM 및 694±241 nM이었다(도 66). 이론 에 결부시키고자 하는 것은 아니지만, ARC1905가 세포의 혈액 부피로부터 제외되고, 전체의 대략 45%를 포함하는 것으로 추정하는 것이 합리적이다. 그러므로, 혈장에서 C5 저해를 반영하도록 조정된 IC50, IC90 및 IC99 값들은 216±52.0 nM, 487±71 nM 및 1261±438 nM이었다. 이들 값은 혈청에서 자이모산 유도 보체 활성화의 ARC1905 저해에 대해 계산한 파라미터와 일치하고, 이는 세포의 혈액 성분이 항-C5 활성에 유의적으로 간섭하지 않음을 암시한다. C3a 생성은 1 μM 이하의 부적합한 앱타머 또는 ARC1905에 의해 저해되지 않았다. 이론에 결부시키고자 하는 것은 아니지만, 이는 ARC1905가 C3 전환효소 반응을 저해하지 않거나 C3 공탁(deposition) 및 전환효소 어셈블리 등의 대체 캐스캐이드 활성화에 기여하는 다른 단계를 차단하지 않음을 암시한다.
실시예 2
드 노보 선택 및 서열
dRmY 풀을 이용한 C5 선택
두 가지 선택을 수행하여 dRmY 앱타머를 인간 전장 C5 단백질로 동정하였다. 상기 C5 단백질(Quidel Corporation, San Diego, CA or Advanced Research Technologies, San Diego, CA)을 전장("FL") 형태 및 부분적으로 트립신화한("TP") 형태로 사용하였고, 두 가지 선택은 소수성 플레이트 상에 고정된 단백질 표적에 대한 직접적인 선택이었다. 두 가지 선택은 고유(naive), 미선택된 풀에 대해 전장 C5 결착을 유의적으로 풍부하게 한 풀을 산출하였다. 본 실시예에 나타낸 서열은 5'→3'로 나타낸다.
풀 제조: 서열을 가진 DNA 주형
TAATACGACTCACTATAGGGAGAGGAGAGAACGTTCTACN(30)GGTCGATCGATCGATCATCGATG(ARC520; 서열 번호: 70)는 ABIEXPEDITETM DNA 합성기를 이용하여 합성하였고, 표준법으로 탈보호하였다. 상기 주형을 5' 프라이머 TAATACGACTCACTATAGGGAGAGGAGAGAACGTTCTAC(서열 번호: 71) 및 3' 프라이머 CATCGATGATCGATCGATCGACC(서열 번호: 72)를 이용하여 증폭시키고, 그 다음 Y639F 단일 돌연변이 T7 RNA 폴리머라제를 이용한 시험관 내 전사에 있어서 주형으로 사용하였다. 200 mM HEPES, 40 mM DTT, 2 mM 스페르미딘, 0.01% 트리톤X-100, 10% PEG-8000, 9.5 mM MgCl2, 2.9 mM MnCl2, 2 mM NTP, 2 mM GMP, 2 mM 스페르민, 0.01 units/㎕ 무기 피로포스파타아제, 및 Y639F 단일 돌연변이 T7 폴리머라제를 이용하여 전사를 수행하였다.
선택: 1 라운드의 경우, 니트로셀룰로오스 여과기 결착 컬럼 상에서 양성 선택 단계를 수행하였다. 간단히 말해서, 1 X 1015 분자(0.5 nm)의 풀 RNA를 결착 완충액(1X DPBS) 100 ㎕에서 3 μM의 전장 C5 또는 2.6 μM의 부분적으로 트립신화한 C5를 이용하여 실온에서 1시간 동안 배양하였다. RNA: 단백질 착물 및 유리 RNA 분자를 0.45 μm 니트로셀룰로오스 스핀 컬럼[Schleicher & Schuell(Keene, NH)]을 이용하여 분리하였다. 상기 컬럼을 1X DPBS 1 mL로 예비세척한 후 RNA:단백질 함유 용액을 컬럼에 넣고, 원심분리기에서 1500 g에서 2분간 회전시켰다. 완충액 1 mL의 세척을 3회 수행하여 여과기로부터 비특이적 결합제를 제거하고, 그 다음 여과기에 부착된 RNA:단백질 착물을 용리 완충액(7 M 우레아, 100 mM 아세트산나트륨, 3 mM EDTA, 95℃로 예비가열)의 세척액 200 ㎕로 2회 용리시켰다. 이 용리된 RNA를 침전시켰다(2 ㎕ 글리코겐, 1 부피 이소프로판올, 1/2 부피 에탄올). 위에서 서열 번호: 72로 기재된 3' 프라이머를 사용하여 제조자의 지침에 따라 ThermoScript RT-PCRTM 시스템(Invitrogen, Carlsbad, CA)으로 상기 RNA를 역전사한 후, PCR 증폭(20 mM 트리스 pH 8.4, 50 mM KCl, 2 mM MgCl2, 0.5 μM 프라이머 서열 번호: 71 및 서열 번호: 72, 0.5 mM 각각의 dNTP, 0.05 units/㎕ Taq 폴리머라제(New England Biolabs, Beverly, MA))을 수행하였다. PCR 주형을 Centricep 컬럼(Princeton Separations, Princeton, NJ)을 이용하여 정제하고, 다음 라운드 풀을 전사하는 데 사용하였다.
선택의 다음 라운드의 경우에, Nunc Maxisorp 소수성 플레이트(Nunc, Rochester, NY) 상에서 결합된 RNA와 유리 RNA의 분리를 수행하였다. 1X DPBS 100 ㎕에서 20 pM의 전장 C5와 부분적으로 트립신화한 C5 둘 다를 플레이트의 표면에 실온에서 1시간 동안 고정함으로써 상기 라운드를 개시하였다. 그 다음 상청액을 제거하고, 웰을 세척 완충액(1X DPBS) 120 ㎕로 4회 세척하였다. 그 다음 효모 tRNA 0.1 mg/mL 및 연어 정액 DNA 0.1 mg/mL를 경쟁자로서 함유하는 1X DPBS 완충액을 사용하여 상기 단백질 웰을 차단하였다. 사용한 풀 농도는 항상 상기 단백질 농도의 5배 이상 초과하였다. 또한, 풀 RNA를 빈 웰에서 실온에서 1시간 동안 배양하여 임의의 가소성 결착 서열을 제거하고, 그 다음 양성 선택 단계에 앞서 단백질이 없는 차단된 웰에서 배양하여 상기 풀로부터 임의의 경쟁자 결착 서열을 제거하였다. 그 다음, 풀 RNA를 실온에서 1시간 동안 배양하고, RT 믹스(3' 프라이머, 서열 번호:72 및 Thermoscript RT, Invitrogen)를 첨가하여 선택 플레이트에서 고정된 C5에 결합한 RNA를 직접 역전사한 후, 65℃에서 1시간 동안 배양하였다. 얻어진 cDNA를 PCR(Taq Polymerase, New England Biolabs)용 주형으로서 사용하였다. 증폭된 풀 주형 DNA를 제조자의 제안 조건에 따라 Centrisep 컬럼(Princeton Separations)으로 탈염시키고, 다음 선택 라운드에 있어서 풀 RNA 프로그램 전사에 사용하였다. 라운드마다 전사된 풀을 10% 폴리아크릴아미드 겔 상에서 겔 정제하였다.
선택 진행은 샌드위치 여과기 결착(도트 블롯) 분석을 이용하여 모니터하였다. C5, 1X DPBS + 0.1 mg/mL tRNA 및 0.1 mg/mL 연어 정액 DNA로 5'-32P-표지된 풀 RNA(미량 농도)를 실온에서 30분간 배양하고, 그 다음 도트 블롯 장치(Schleicher and Schuell)에서 니트로셀룰로오스 및 나일론 여과기 샌드위치에 적용하였다. 단일점 스크린(+/-300 nM C5)을 이용하여 대략 3 라운드마다 니트로셀룰로오스에 결합한 풀 RNA의 퍼센트를 계산하고 모니터하였다. 풀 Kd 측정값은 단백질의 적정 및 전술한 도트 블롯 장치를 이용하여 측정하였다.
선택 데이터: 두 가지 선택 모두는 고유 풀에 대한 10개의 라운드 후에 풍부 해졌다. 도 18 참조. 10 라운드에서, 풀 Kd는 전장의 경우 대략 115 nM이고 트립신화한 선택의 경우 150 nM이었으나, 둘 다의 정체기에서 결착의 정도는 단지 약 10%이었다. TOPO TA 클로닝 키트(Invitrogen)를 이용하여 R1O 풀을 클론화하고 배열하였다.
서열 정보: 각각의 풀로부터 45개의 클론을 배열하였다. R1O 전장 풀은 24%의 풀로 구성된 하나의 단일 클론 ARC913(서열 번호: 75), 2 세트의 복제물 및 나머지를 구성한 단일 서열을 특징으로 하였다. R1O 트립신화한 풀은 동일한 서열 ARC913(서열 번호: 75)의 복사본 8개를 함유하였으나, 풀은 다른 서열(AMX221.A7; 46%)을 특징으로 하였다. 클론 ARC913(서열 번호: 75)은 Kd 약 140 nM이었고, 결착의 정도는 20%가 되었다. 도 19 참조.
표 3에 열거된 각각의 서열은 5'→3' 방향으로 열거되었고, 제공된 dRmY SELEXTM 조건하에 선택된 앱타머의 리보뉴클레오티드 서열을 나타낸다. 이 선택으로부터 유래된 본 발명의 구체예에 있어서(서열 목록에서 반영된 바와 같이), 푸린(A 및 G)은 데옥시이고 피리미딘(U 및 C)은 2'-OMe이다. 표 3에 열거된 서열은 캡핑(예컨대, 3'-역전 dT)을 함유하거나 함유하지 않을 수 있다. 하기 앱타머의 유일한 서열은 뉴클레오티드 23에서 시작하고, 즉시 고정된 서열 GGGAGAGGAGAGAACGUUCUAC(서열 번호: 73)를 따르고, 그것이 3'고정된 핵산 서열 GGUCGAUCGAUCGAUCAUCGAUG(서열 번호: 74)을 만날 때까지 계속 한다.
[표 3]
C5 dRmY 앱타머의 뉴클레오티드 서열
ARC913(서열 번호: 75)
GGGAGAGGAGAGAACGUUCUACCUUGGUUUGGCACAGGCAUACAUACGCAGGGGUCGAUCGAUCGAUCAUCGAUG
용혈 분석: 보체 시스템의 전통적인 경로에 대한 ARC913(서열 번호: 75)의 효과는, 전술한 용혈 분석을 이용하여 ARC186(서열 번호: 4)(항-C5 앱타머, 양성 대조군) 및 미선택된 dRmY 풀(음성 대조군) 둘 다와 비교하여 분석하였다. 용혈 저해의 분석에 있어서, 적정한 ARC913(서열 번호: 75)의 존재하에 0.2% 전체 인간 혈청의 용액을 항체 코팅된 양 적혈구(Diamedix EZ Complement CH50 Test, Diamedix Corporation, Miami, FL)와 혼합하였다. 칼슘, 마그네슘 및 1% 젤라틴(GVB++ 보체 완충제)을 함유하는 베로날 완충된 염수에서 분석을 진행하였고, 25℃에서 1시간 동안 배양하였다. 배양 후, 시료를 원심분리하였다. 상청액의 415 nm에서 광학 밀도(OD415)를 판독하였다. 용혈 활성의 저해는 대조군에 비한 %용혈 활성으로서 발현된다. 도 20을 참조. 앱타머의 IC50을 약 30 nM로 계산하였다.
실시예 3
조성물 및 서열 최적화
실시예 3A: ARC913의 최소화
ARC913(서열 번호: 75)을 기본으로 하는 6개의 구성물을 전사하고, 겔 정제하고, 도트 블롯에서 C5로의 결착을 시험하였다. ARC954는 Kd가 130 nM인 모체 클론 과 유사하고, 결착의 정도는 20%인 한편, ARC874(서열 번호: 76)는 단지 1 μM의 Kd로 C5에 결합한 다른 클론이었다.
표 4에 열거된 각각의 서열은 5'→3' 방향으로 열거되고, 제공된 dRmY SELEX 조건하에 선택된 앱타머로부터 유래되었다. 이 선택으로부터 유래된 본 발명의 구체예에 있어서(서열 목록에서 알 수 있는 바와 같이), 푸린(A 및 G)은 데옥시이고 피리미딘(U 및 C)은 2'-OMe이다. 표 4에 열거된 각각의 서열은 캡핑(예컨대, 3'-역전 dT)을 함유하거나 함유할 수 없다.
[표 4]
ARC913 최소화 클론의 뉴클레오티드 서열
ARC874(서열 번호: 76)
CCUUGGUUUGGCACAGGCAUACAUACGCAGGG
ARC875(서열 번호: 77)
CCUUGGUUUGGCACAGGCAUACAAACGCAGGG
ARC876(서열 번호: 78)
GGGUUUGGCACAGGCAUACAUACCC
ARC877(서열 번호: 79)
GGGUUUGGCACAGGCAUACAAACCC
ARC878(서열 번호: 80)
GGCGGCACAGGCAUACAUACGCAGGGGUCGCC
ARC954(서열 번호: 81)
CGUUCUACCUUGGUUUGGCACAGGCAUACAUACGCAGGGGUCGAUCG
실시예 3B: ARC913의 최적화: 도핑형 재선별
C5 결합 친화도를 위해 클론 ARC913(서열 번호 75)을 최적화하고 주요 결합 성분을 결정하기 위해서, 도핑형 재선별을 실시하였다. 활성 클론 또는 소형체 내의 서열 요건을 조사하기 위해 도핑형 재선별을 사용한다. 단일 서열을 기준으로 고안된 합성 축퇴성 풀로 선별을 실시한다. 축퇴성 수준은 일반적으로 70∼85% 야생형 뉴클레오티드로 다양하다. 일반적으로, 중성 돌연변이가 관찰되었지만, 일부 경우에는 서열 변화로 친화도가 향상될 수 있다. 이어서, 복합 서열 정보를 이용하여 최소 결합 모티프를 확인하여 최적화 노력에 도움을 줄 수 있다.
풀 제조:
주형 서열 taatacgactcactataGGGAGAGGAGAGAACGTTCTACN(30)GTTACGACTAGCAT CGATG(서열 번호 82)는 ARC913(서열 번호 75)에 기초한 것이고, 15% 수준으로 도핑된 랜덤 영역에서 유래한 각 잔기로 합성하였다. 즉, 각 랜덤("N") 위치에서 잔기가 야생형 서열 CTTGGTTTGGCACAGGCATACATACGCAGGGGTCGATCG(서열 번호 83)에서 발견되는 뉴클레오티드일 가능성이 85%이고 다른 3개의 뉴클레오티드 중 하나일 가능성이 15%이다.
도핑형 재선별을 위한 주형 및 RNA 풀은 본질적으로 상기 개시한 바와 같이 제조하였다. 주형은 프라이머 taatacgactcactataGGGAGAGGAGAGAACGTTCTAC(서열 번호 84) 및 CATCGATGCTAGTCGTAAC(서열 번호 85)로 증폭시켰다. 전길이 C5로 2회 선별을 실시하였고, 세척 단계에서 더 높은 농도의 염을 사용하여 1회 선별을 실시하였다. 하기의 2가지 예외 사항을 제외하고는 상기 개시된 바와 같이 선별 프로토콜을 실시하였다: 1) 제1 라운드(뿐 아니라 후속되는 모든 라운드)는 양성 단계만을 이용하여 소수성 플레이트에서 실시하였고; 2) 선별 과정에서 경쟁자는 전혀 사용하지 않았다. C5 농도 및 RNA 풀 농도는 각각 200 nM 및 1 μM로 일정하게 유지하였다.
도핑형 재선별 데이타
나이브 풀에 대해 5 라운드 선별 후에 정상 선별물 및 고농도의 염 선별물을 농축하였다. 제5 라운드에서 풀 Kd는 고 농도 염 선별물에 대해 약 165 nM이고, 정상 염 선별물에 대해 175 nM이었다. 결합도는 양쪽 모두에서 평탄역에서 약 20%였다. TOPO TA 클로닝 키트(미국 캘리포니아주 칼스배드의 Invitrogen)를 사용하여 클로닝하고, 각 풀로부터 얻은 48 클론을 서열분석하였다. 각 풀로부터 얻은 12개 클론을 전사시켜 500 nM C5에서 단일점 도트 블롯 분석으로 분석하였다. 해리 상수(Kd)를 앞서 개시한 도트 블롯 분석을 이용하여 다시 측정하였다. 하기 식에 데이타를 대입하여, 단일점 스크린에서 확인된 11개의 최상 클론에 대해 Kd를 평가하였다: 결합 RNA 분율 = 크기*Kd/(Kd + [C5]). 3개의 최상 Kd를 가지는 클론은 서열 번호 91(73 nM), 서열 번호 96(84 nM) 및 서열 번호 95(92 nM)였다. 11개의 클론에 대한 서열은 하기 표 5에 제시되어 있다.
표 5에 제시된 서열은 5'에서 3' 방향으로 제시한 것이며, 제공된 dRmY SELEX 조건 하에서 선별한 앱타머의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다. 이러한 선별로부터 유래한(그리고 서열 목록에 반영된 바와 같은) 본 발명의 구체예에서, 여기서 상응하는 서열은 잔기의 dRmY 조합을 포함하고, 본문에 제시된 바와 같이, 푸린(A 및 G)이 데옥시이고 피리미딘(U 및 C)이 2'-OMe이다. 표 5에 제시된 각 서열은 캡핑(예, 3'-역 dT)를 포함할 수도 포함하지 않을 수도 있다. 하기의 각 앱타머의 고유 서열은 5' 고정 서열 GGGAGAGGAGAGAACGUUCUAC(서열 번호 86) 직후의 뉴클레오티드 23에서 시작하여 3' 고정 핵산 서열 GUUACGACUAGCAUCGAUG(서열 번호 87)에 도달할 때까지 계속된다.
[표 5] 도핑형 재선별로부터의 뉴클레오티드 서열
Figure 112008070002540-pct00015
실시예 3C: ARC186의 40 kDa 분지형 PEG 변형
올리고뉴클레오티드 5' NH2-fCmGfCfCGfCmGmGfUfCfUfCmAmGmGfCGfCfUmGmAmGfUfCfUmGmAmGfUfUfUAfCfCfUmGfCmG-3T-3'(ARC672, 서열 번호 63)를, 표준 시판용 2'-OMe RNA 및 2'-F RNA 및 TBDMS-보호된 RNA 포스포르아미디트(미국 버지니아주 스터링의 Glen Research)와 역 데옥시티미딘 CPG 지지체를 사용하여 제조자의 권장 절차에 따라서 Expedite DNA 합성기(미국 캘리포니아주 포스터 시티의 ABI)에서 합성하였다. 말단 아민 작용기는 5'-아미 노 변형자, 6-(트리플루오로아세틸아미노)헥실-(2-시아노에틸)-(N,N-디이소프로필)-포스포르아미디트, C6-TFA(미국 버지니아주 스터링의 Glen Research)를 사용하여 부착하였다. 탈보호 후에, 올리고뉴클레오티드를 Super Q 5PW (30) 수지(Tosoh Biosciences) 상에서의 이온 교환 크로마토그래피로 정제하고 에탄올 침전시켰다.
아민 변형 앱타머를 상이한 PEG 부분에 합성후 접합시켰다. 앱타머를 물/DMSO(1:1) 용액에서 1.5∼3 mM 농도로 용해시켰다. 탄산나트륨 완충액 pH 8.5를 100 mM의 최종 농도로 첨가하고, 아세토니트릴 동부피에 용해된 1.7몰 과량의 목적하는 PEG 시약(예, ARC1905 40 kDa Sunbright GL2-400NP p-니트로페닐 카르보네이트 에스테르[일본의 NOF Corp], 또는 ARC187 40 kDa mPEG2-NHS 에스테르[미국 알라바마주 헌츠빌의 Nektar])과 밤새 올리고를 반응시켰다. 그 결과 얻어진 생성물을 Super Q 5PW (30) 수지(Tosoh Biosciences) 상에서의 이온 교환 크로마토그래피로 정제하고, Amberchrom CG300-S 수지(Rohm and Haas) 상에서 역상 크로마토그래피를 사용하여 탈염하고, 동결건조하였다. ARC187(서열 번호 5)의 구조는 도 21에 도시되어 있고 ARC1905(서열 번호 67)의 구조는 도 22에 도시되어 있다.
실시예 4
분리된 관류 심장 모델
실시예 4A: ARC186을 이용한 원리 검증
인간 혈장 중 보체 성분 C5의 평균 농도는 약 500 nM이다. Krebs Heinseleit 완충액으로 관류한 분리된 마우스 심장을 6% 인간 혈장에 노출시키면, 인간 보체 캐스케이드가 활성화되어, C5가 C5a 및 C5b로 분해된다. 성분 C5b는 후속하여 심혈 관 및 심근세포를 손상시키는 "세포막 공격 복합체"("MAC" 또는 C5b-9)라고도 알려진 보체 성분 C6, C7, C8 및 C9와의 복합체를 형성하여, 따라서 심근 기능부전(이완 말기압 증가, 부정맥) 및 무수축을 초래할 수 있다(Evans et. al., Molecular Immunology, 32, 1183-1195 (1995)). 이전에, 인간 C5 분해를 차단하는 모노클로날 및 단쇄 항체(펙셀리주맵 또는 펙셀리주맵의 단쇄 scFv 형태)를 이 모델에서 시험하여 심근 손상 및 기능부전을 억제한다는 것을 확인하였다(Evans 등, 1995).
이 모델을 이용하여 펙셀루지맵과 같은 C5-블록킹 앱타머 ARC186(서열 번호 4)이 분리된 마우스 관류 심장에 대한 인간 C5 매개의 보체 손상을 억제한다는 것을 확립하였다. C57 B1/6 마우스를 Charles River Laboratories(미국 매사츄세츠주 윌밍턴)로부터 입수하였다. 간단히 설명하면, 깊이 마취한 후에, 각 마우스 심장을 꺼내 대동맥으로 블런트 니들을 삽입하고, 이를 통해 심장을 Krebs Heinseleit 완충액으로 연속 관류시켰다. 압력 변환기(미국 매사츄세츠주 보스톤의 Mouse Specifics)를 좌심실로 삽입하여 심박수 및 심실내 압력을 연속 측정하였다. 기준선 측정이 실시되는 평형 15분 후에, 완충액과 6% 인간 혈장 +/- 각종 농도의 앱타머로 후속 관류시켰다(도 23 참조). 이 연구 과정에서 Evans 등이 설명한 바와 같이, 본 발명자들은 Krebs Heinseleit 완충액 + 6% 인간 혈장으로 관류시킨 심장이 혈장을 관류액에 첨가한지 5분 내에 정지한 반면에, 완충액만으로 연속 관류시킨 심장은 2 시간 이상 계속 박동한다는 것을 입증하였다. 따라서, 각 실험 시간은 임의로 15분으로 정의하였다. ARC186을 이용한 연구 개요는 도 23에 제시되어 있다.
심실내압을 모니터링하고 연속적으로 기록하여 압력파 트레이싱을 얻었다(도 24 및 도 25). 최저 편향점은 이완말기압("EDP")을 나타내고, 최대 편향점은 수축기압("SP")을 나타낸다. 기준선 압력파는 각 트레이싱에 제시된 "0"으로 표시된 수직 검은선의 좌측에 나타난다. 이미 공개된 바와 같이(Evans 등, 1995), 6% 인간 혈장으로 관류시킨 심장에서는 좌심실 이완말기압이 급속히 증가하여, 궁극적으로 5분 내에 무수축(심장 정지)이 된다(도 24). 비관련 앱타머를 인간 혈장에 50배 몰 과량으로 첨가하면, EDP 증가 및 무수축이 또한 관찰되었다(도 24).
몰 동량으로 ARC186을 계에 첨가하면 EDP가 급격히 증가하여 무수축이 된다(도 25). 보체 매개 손상, EDP 증가 및 무수축을 경험한 3그룹 모두의 심장에서, 실험 종료시까지 심장은 육안으로 보기에 부종성이고 종창성이었다. ARC186을 혈장에 10배 또는 50배(도 25) 몰 과량으로 첨가하면, 심실 압력파가 정상이고 무수축이 관찰되지 않았다. 또한, 앞서 설명한 부종 및 종창은 이들 그룹에서 나타나지 않았다.
각 실험 과정에서, 5분 간격으로 심박수를 기록하고, 각각의 간격 동안 해당 그룹에 대한 평균 심박수를 그래프화하였다. 도 26에 도시된 바와 같이, 앱타머의 부재 하에 또는 비관련 앱타머의 존재 하에 관류시킨 심장은 빠르게, 일반적으로 5분 내에 무수축을 일으켰다. 몰 동량으로 ARC186을 계에 첨가하면 무수축의 개시가 약간 지연되었다. 그러나, 이 그룹의 심장은 결국 정지하였다. 10배 또는 50배 몰 과량으로 혈장에 ARC186을 첨가하면 각 실험 기간 동안 심박수가 유지되었다.
기준선에 대한 심장 중량 증가율(%)을 정지한 심장(앱타머 부재 또는 50배 몰 과량의 비관련 앱타머)의 대표 샘플에 대해 계산하고, ARC186-보호된 심장(10배 및 50배 몰 과량의 ARC186)과 비교하였다. 도 27에 도시된 바와 같이, ARC186 보호된 심장은 대조군의 정지 심장보다 유의적으로 적은 중량 증가를 나타내었다.
ARC186은 C5 분해는 억제하나 C3 분해는 억제하지 않기 때문에, C5 분해 산물(C5a 또는 C5b)이 아니라 C3 분해 산물(C3a)이 ARC186에 의해 보호되는 분리 심장으로부터 흐르는 유출물에서 발견되어야 한다. ARC186이 인간 혈장 C5의 분해를 억제한다는 것을 직접 보여주기 위해서, 인간 보체 단백질 C5a 및 C5b(C5 분해 산물)과 C3a(C3 분해 산물)의 상대 수준을, 각종 그룹으로부터의 완충액 유출물 중에서 시판용 ELISA 키트(C5b-9 ELISA 키트, 미국 캘리포니아주 샌 디에고의 Quidel; C5a 및 C3a ELISA 키트, 미국 캘리포니아주 샌 디에고의 BD Biosciences)로 측정하였다. ARC186은 인간 혈장 C5 분해와 C5a(도 28) 및 C5b-9(도 29)의 생성을 용량 의존적 방식으로 억제하였다. 대조적으로, ARC186은 인간 C3의 C3a 및 C3b로의 분해에 영향을 미치지 않았는데(도 30), 이는 분자의 C5 특이성을 추가로 입증하는 것이다.
보체 C3b 및 C5b 단편은, 일단 생성되면, 보체 활성화 부위 근처 조직에 국소적으로 부착된다. 실험 완료 후에, 마우스 심장을 OCT 매체(미국 캘리포니아주 토란스의 Sakura Finetek) 중에서 냉동시키고, 절편화한 다음, 인간 C3b(클론 H11, 미국 캘리포니아주 터메큘라의 Chemicon), 인간 C5b-9(클론 aE11, 미국 캘리포니아주 카핀터리아의 DAKO) 또는 대조군 마우스 IgG(미국 캘리포니아주 버링검의 Vector Laboratories)의 존재 하에 표준 면역조직화학법으로 염색하였다. 연구 결과는 도 31에 제시되어 있다.
이 연구에서 언급한 바와 같이, C5-블록킹 앱타머 ARC186은, 항-C5 항체인 펙셀루지맵의 보체계에 대한 효과를 테스트한 이전에 공개된 연구에 제시된 모델을 기초로 하여(Evans, Molecular Immunol 32:1183, (1995)), Krebs Heinseleit 완충액 및 6% 헤파린처리된 인간 혈장으로 관류시킨 분리된 마우스 심장을 사용한 보체 성분 C5 매개된 조직 손상의 생체외 모델에서 테스트하였다. 이 모델을 사용하여, C5-블록킹 앱타머는 (a) 인간 혈장 C5의 분해(C3의 분해는 아님)를 억제하고, (b) 마우스 심장 조직에 대한 인간 C5b의 부착(C3b의 부착은 아님)을 억제하고, (c) 임상적으로 적당한 농도(5 μM, C5에 대해 10배 몰 과량의 앱타머)에서 인간 C5b-9 매개된 심근 기능부전을 억제한다는 것을 입증하였다. 이들 데이타는 인간 보체 캐스케이드가 생리적으로 적당한 방식으로 활성화되는 경우, C5-블록킹 앱타머가 혈장 C5의 분해를 억제하고 심근 손상 및 기능부전을 예방할 수 있다는 것을 보여준다.
실시예 4B: PEG화된 앱타머의 효능
이 연구에 사용된 재료 및 방법은 상기 실시예 4A에 개시된 바와 정확히 동일하였다. 실험 고안 및 결과는 도 32에 제시되어 있다. 실험 전반부에서는 인간 헤파린처리된 혈장(미국 보스톤의 Harvard Medical School, Center for Blood Research)을 보체원으로서 사용하였고, 후반부에서는 헤파린처리된 사이노몰거스 마카쿠(cynomolgus macaque) 혈장(미국 매사츄세츠주 윌밍턴의 Charles River Laboratories)을 보체원으로서 사용하였다. PEG화 앱타머(ARC658; 서열 번호 62)를, 몰 비율을 증가시키면서 계에 첨가하였다. 모든 관련된 심실압 트레이싱을 수 집하였지만, 표에는 이완말기압(EDP) 증가의 존재 또는 부재, 무수축 발생 여부, 심부전(EDP 상승 및 무수축의 존재로 정의됨)까지의 시간을 기재한다.
인간 혈장을 이용한 실험 과정에서는 ARC658(서열 번호 62)의 최적 용량이 몰 동량(500 nM)으로 측정된 반면에, 비인간 영장류 혈장을 이용한 실험 과정에서는 심장이 C5b 매개 손상을 입지 않도록 보호하는 데 50배 몰 과량(25 μM)이 필요하였다(도 32 참조).
이들 데이타는 시험관내 데이타에 제시된 인간 대 비인간 영장류 C5에 대한 항-C5 앱타머의 친화도 차이와 일치하는 것이다. 특정 이론에 얽매이려고 하는 것은 아니지만, 실시예 5에 개시된 후속 사이노몰거스 마카쿠 PK/PD 연구 과정에서, 본 발명자들은 30배 몰 과량의 앱타머가 자이모산 매개의 혈장 C5 분해를 억제하는 데 필요하다는 것을 추가로 입증하였는데, 이는 앱타머가 인간 C5보다 영장류 C5에 더 낮은 친화도로 결합한다는 생각을 뒷받침하는 것이다.
총괄하여, 이들 연구는 C5-블록킹 앱타머 ARC186(서열 번호 4) 및 대부분은 ARC(서열 번호 62)가 모두 분리된 관류 심장 마우스 모델에서 효과적이라는 것을 제시한다. 이 모델은, 인간 C5 매개된 심장 손상(몰 동량)을 억제하는 것과 비교하여, 사이노몰거스 마카쿠 혈장 C5 매개된 심장 손상(30+ 몰 과량)을 억제하기 위해서 유의적으로 더 많은 ARC658(서열 번호 62)을 사용해야 한다는 것을 또한 입증하였는데, 이는 영장류 C5에 대한 앱타머의 친화도가 더 낮다는 것을 제시하는 시험관 내 데이타를 뒷받침하는 것이다. 마지막으로, 이들 데이타는 PK/PD 연구 과정에서 생체 내 C5 블록킹을 입증하기 위해서 사이노몰거스 마카쿠에게는 30배 몰 과량 을 초과하는 용량이 필요하다는 것을 제시한다.
실시예 5
동물에서의 항-C5 앱타머의 약물 대사작용 및 약물동력학
실시예 5A 내지 5G에서, 모든 질량 기초 농도 데이타는 PEG 접합에 의해 부여되는 질량과 무관하게, 앱타머의 올리고뉴클레오티드 부분의 분자량에만 관련된다.
실시예 5A: 영장류 및 래트 혈장에서의 C5 억제제 ARC186의 대사 안정성
앱타머(즉, ARC186; 서열 번호 4)의 비-PEG화된 올리고뉴클레오티드 전구체를 래트 및 사이노몰거스 마카쿠 혈장(미국 매사츄세츠주 윌밍톤의 Charles River Labs)에서 테스트하여 안정성, 반응속도론 및 분해 경로를 평가하였다. 50 시간 동안 95% 풀 혈장(구연산처리)에서 37℃에서 항온처리한 5' 말단 방사선 표지된 (32P) 앱타머를 사용하여 테스트를 실시하였다. 선택된 시점에서, 앱타머 함유 혈장분액을 빼내고, 즉시 액체 질소 중에서 순간 냉동하고, -80℃에서 보관하였다. 혈장에서의 앱타머 및 그 대사산물의 검출 및 분석은 액체-액체(페놀-클로로포름) 추출과 이어서 (10% 변성 폴리아크릴아미드 서열화 겔 상에서의) 겔 전기영동 및 고해상도 방사능사진촬영을 사용하여 실시하였다.
도 33은 래트 및 사이노몰거스 마카쿠 혈장에서 항온시간에 따른 전길이 앱타머의 잔존율(%)의 로그-선형 플롯을 도시한다. 이들 두 종에서의 분해 프로필은 실질적으로 단상인 것으로 나타나며, 속도 상수는 약 k ~ 0.002 hr-1이다.
실시예 5B: 정맥내 투여 후 래트에서의 ARC657, ARC658 및 ARC187의 약물동력학
ARC657(서열 번호 61), ARC658(서열 번호 62) 및 ARC187(서열 번호 5)의 약물동력학을 평가하고 영장류 및 인간에서 필요한 투약량 및 투약빈도를 평가하기 위해서, 카테터삽입한 Sprague-Dawley 래트(미국 매사츄세츠주 윌밍톤의 Charles River Labs)에서 약물동력학 연구를 수행하였다. 앱타머를 표준 염수 중 10 ㎎/㎖(올리고 중량)으로 주사하도록 제형화한 후, 무균 조건 하에서 사전멸균된 투약 바이알로 멸균 여과하였다(0.2 ㎛). 래트 연구를 위해 사용되는 투여 경로는 꼬리 정맥을 통한 10 ㎎/kg 용량의 정맥내 볼루스였다. 연구 대상은 그룹당 3마리 동물로 구성되었으며, 이로부터 48 시간 동안 특정 시점에서 소정량으로 연속 채혈하였다. 이 연구 디자인은 도 34에 요약되어 있다. 혈액 샘플은 수술로 이식한 목정맥 카테터로부터 얻어서, EDTA 코팅된 튜브로 바로 옮기고, 뒤집어서 혼합한 다음, 혈장을 위한 처리 전까지 얼음 위에 두었다.
5분간 5000 rpm에서의 혈액-EDTA 튜브의 원심분리로 혈장을 수거하고, 상청액(혈장)을 사전 표지한 새 튜브로 옮겼다. 혈장 샘플을 분석시까지 -80℃에서 보관하였다. 시판 형광 핵산 검출 시약 OligreenTM(미국 오리간주 유진의 Molecular Probes)을 함유하는 분석 웰에 혈장 분액을 직접 첨가하는 균질 분석 형식을 사용하여 ARC187에 대한 혈장 샘플 분석을 실시하였다. 실온에서 빛을 차단하고 잠시 항온처리(5분)한 후에, 형광 플레이트 판독기(미국 캘리포니아주 서니베일의 Molecular Devices, SpectraMax Gemini XS)로 판독하였다. 각 웰로부터의 형광 신호는 웰 중의 앱타머 농도에 비례하며, 형광-농도 표준 곡선(이중 및 삼중 곡선으로부터의 평균값)으로부터의 형광값을 내삽하여 샘플 농도를 계산하였다. 각 그룹의 3마리 동물로부터 각 시점에서 평균 혈장 농도를 얻었다. 산업용 표준 약물동력학 모델링 소프트웨어 WinNonLinTM v.4.0(미국 캘리포니아주 마운틴뷰의 Pharsight Corp.)을 이용하여 혈장 농도 대 시간 데이타를 비구획 분석(noncompartmental analysis; NCA)하였다. 하기 1차 약물동력학 파라미터에 대한 추정값을 얻었다: 최대 혈장 농도, Cmax; 농도-시간 곡선하 면적, AUC; 말기 반감기 t1/2; 말기 제거율, Cl; 및 정상 상태에서의 분포 용적, Vss.
평균 혈장 농도 대 시간 데이타는 도 35에 도시되어 있으며, 도 36에 플롯되어 있다. 농도 대 시간 데이타에 대해 WinNonLinTM v.4.0를 사용한 비구획 분석(NCA)을 실시하였다. 분석 결과 도 37에 제시된 값을 얻었다.
예상한 바와 같이, 40 kDa 앱타머 ARC187(서열 번호 5)의 반감기가 가장 길었고, 20 kDa 앱타머 ARC657(서열 번호 61)의 반감기가 가장 짧았다. 기지의 혈장 농도(∼40 ㎖/kg)에 대한 관찰된 Vss는 혈관외 공간에서의 단백질 및/또는 조직 기질에의 ARC187(서열 번호 5)의 중간 정도의 결합/격절을 나타내었다. 5배 몰 과량의 앱타머를 유지해야한다는 가정 하에, 이 연구 결과는 ARC187(서열 번호 5)이 소정의 혈장 농도를 유지하는 데 필요한 앱타머 총량 및 투약 빈도 측면에서 상당히 유리하다는 것을 제시하였다.
유사한 조성의 앱타머를 이용한 설치류 및 영장류에서의 이전 연구(데이타는 제시되지 않음)는 30 ㎎/kg 용량까지 용량 비례/선형을 나타내었기 때문에, 투약량이 비선형 약물동력학 거동을 나타낼 것이라고는 기대하지 않았다.
실시예 5C: 정맥내 투여 후 마우스에서의 ARC187 및 ARC1905의 약물동력학
ARC187(서열 번호 5)보다는 상이한 40 kDa 분지된 PEG에 접합된 ARC186(서열 번호 4) 올리고뉴클레오티드 골격의 약물동력학 프로필을 평가하기 위해서, 암컷 CD-1 마우스(미국 매사츄세츠주 윌밍톤의 Charles River Labs에서 입수)에서 약물동력학 연구를 수행하였다. 앱타머를 표준 염수 중 2.5 ㎎/㎖(올리고 중량)의 주사용으로 제형화한 후, 무균 조건 하에서 사전멸균된 투약 바이알로 멸균 여과하였다(0.2 ㎛). 마우스 연구를 위해 사용되는 투여 경로는 꼬리 정맥을 통한 10 ㎎/kg 용량의 정맥내 볼루스였다. 연구 대상은 그룹당 3마리 동물로 구성되었으며, 이로부터 72 시간 동안 특정 시점에서 투약전(즉, 투약하지 않은 대조군) 말기 혈액을 채취하였다. 이 연구 디자인은 도 38A에 요약되어 있다.
말단 심장 천자로 혈액 샘플을 얻고, EDTA 코팅된 튜브로 바로 옮기고, 뒤집어서 혼합한 다음, 혈장을 위한 처리 전까지 얼음 위에 두었다. 5분간 5000 rpm에서의 혈액-EDTA 튜브의 원심분리로 혈장을 수거하고, 상청액(혈장)을 사전 표지한 새 튜브로 옮겼다. 혈장 샘플을 분석시까지 -80℃에서 보관하였다. 시판 형광 핵산 검출 시약 OligreenTM(미국 오리간주 유진의 Molecular Probes)을 함유하는 분석 웰 에 혈장 분액을 직접 첨가하는 균질 분석을 사용하여 ARC187 및 1905에 대한 혈장 샘플 분석을 실시하였다. 실온에서 빛을 차단하고 잠시 항온처리(5분)한 후에, 형광 플레이트 판독기(SpectraMax Gemini XS, 미국 캘리포니아주 서니베일의 Molecular Devices)로 판독하였다. 각 웰로부터의 형광 신호는 웰 중의 앱타머 농도에 비례하며, 형광-농도 표준 곡선(이중 및 삼중 곡선으로부터의 평균값)으로부터의 형광값을 내삽하여 샘플 농도를 계산하였다. 각 그룹의 3마리 동물로부터 각 시점에서 평균 혈장 농도를 얻었다. 산업용 표준 약물동력학 모델링 소프트웨어 WinNonLinTM v.4.0(미국 캘리포니아주 마운틴뷰의 Pharsight Corp.)를 이용하여 혈장 농도 대 시간 데이타를 비구획 분석(NCA)하였다. 하기 1차 약물동력학 파라미터에 대한 추정값을 얻었다: 최대 혈장 농도, Cmax; 농도-시간 곡선하 면적, AUC; 말기 반감기 t1/2; 말기 제거율, Cl; 및 정상 상태에서의 분포 용적, Vss. 평균 혈장 농도 대 시간 데이타는 도 38B에 플롯되어 있다.
농도 대 시간 데이타에 대해 WinNonLinTM v.4.0를 사용한 비구획 분석(NCA)을 실시하였다. 분석 결과 도 38C에 제시된 값을 얻었다. 예상한 바와 같이, 판매자로부터의 40 kDa PEG는 마우스에서 약물동력학 동치를 나타내었다.
바로 앞서 개시한 oligreen 분석에 사용되는 ARC187 및 1905에 대한 동일한 혈장 샘플은, UV 검출과 인증된 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC) 분석을 이용하여 분석하였다.
Microsoft Excel 2003을 이용하여 ARC187 및 ARC1905에 대한 평균 혈장 농도값을 계산하였다. 혈장 농도값이 투약전(시점 0) 생분석 검정법의 LLOQ 미만일 때, 0값을 할당하였다. 투약후 채취한 샘플로부터 얻은 LLOQ 미만의 값은 평균 혈장 농도 계산으로부터 누락시켰다. 평균 혈장 농도 데이타는 WinNonlin, 버젼 5.1(미국 캘리포니아주 마우틴뷰의 Pharsight Corporation)를 사용한 모델-독립적 PK 분석에서 사용하였다. 혈장 농도-시간 곡선 하의 면적(AUC0-최종)은 선형 사다리꼴 공식을 사용하여 추정하였다. 계산을 위해서, 투약전 샘플을 제외하고 분석의 LLOQ 미만인 임의의 값은 PK 파라미터 추정값에 대한 계산에서 제외시켰다. 겉보기 말기 반감기는, 공식 t1/2 = 0.693/λz[이 때, λz는 농도 대 시간 곡선의 말단 기울기의 회귀로부터 추정한 제거 속도 상수임]를 사용하여 계산하였다. 말기의 피크 농도 후의 적어도 3개의 혈장 농도값을 이용하여 λz를 결정하였으며, 결정 계수(r2)는 ≥0.85여야 한다.
전체적으로, HPLC 분석은 평균 Cmax, AUC0-최종 및 AUC0-∞ 파라미터 추정값의 비교에 기초하여 볼 때 ARC1905 및 ARC187가 생물등가물인 것으로 밝혀졌다는 것을 보여주는 바로 앞에 개시한 oligreen 분석을 확인시켜준다. (HPLC에 의해 측정된 바와 같이) ARC187에 대한 ARC1905의 AUC0-최종 및 AUC0-∞ 값의 차는 ±20%의 생물등가 허용 기준 내에 있었다.
실시예 5D: 정맥내 볼루스 투여 후 마우스에서 C5 억제제인 ARC657, ARC658 및 ARC187의 조직 흡수 연구
암컷 CD-1 마우스를 Charles River Labs(미국 매사츄세츠주 윌밍턴)로부터 입수하였다. 5 ㎎/㎖로 염수 중 ARC657(서열 번호 61), ARC658(서열 번호 62) 및 ARC187(서열 번호 5)의 주사용 제제를 제형화하였다. 무균 조건 하에서 사전멸균된 투약 바이알로 투약 제제를 멸균 여과하고(0.2 ㎛), 꼬리 정맥을 통해 25 ㎎/kg 용량으로 정맥내 볼루스를 투여하였다. 연구는 3 마리의 동물 그룹으로 이루어지며, 각각에 대해 4회 시점, t= 투약전, 3 시간, 6 시간, 12 시간에 조사하였다. 방혈 후에, 각 동물의 혈관계를 염수로 집중적으로 씻어내려(V~30 ㎖) 혈관계에 암아있는 임의의 혈액을 제거하였다. 조직(심장, 간, 신장)을 수거하고, 중량을 측정한 다음, 표준 염수 중 50% w/v에서 균질화하고, 분석시까지 -80℃에서 보관하였다.
ARC657(서열 번호 61), ARC658(서열 번호 62), 및 ARC187(서열 번호 5)에 대한 조직 분석은, 하이브리드화계 ELISA형 분석을 이용하여 실시하였다. 이 분석에서, 3 시간 동안 125 nM의 결합액 농도로 96웰 마이크로플레이트의 웰에 비오티닐화된 포집 프로브를 미리고정하였다. 플레이트 웰을 1X PBS로 5회 세척하였다. 이어서 플레이트를 TBS 중 1X SuperBlock(미국 일리노이주 록포드의 Pierce Chemical) 150 ㎕/웰로 차단하였다. 플레이트를 다시 세척하고, 피복하고, 사용시까지 4℃에서 보관하였다. 별도의 튜브에서, 90℃에서 10분간, 200 nM의 FAM-표지된 (5'-플루오레세인) 샘플 검출 프로브를 함유하는 완충액 중에서 샘플(들)을 어닐링시키고, 얼음 위에서 급냉시켰다. 혈장/조직의 대조군 샘플 및 농도 표준물을 샘플 검출 프로브 용액과 사전어닐링한 다음, 고정된 비오틴 포집 프로브를 함유하 는 분석 플레이트 웰로 피펫팅하고, 2.5 시간 동안 45℃에서 어닐링하였다. 이어서, 플레이트를 다시 세척하고, 1X PBS 중의 호스 래디쉬 퍼옥시다제에 접합된 항-플루오레세인 모노클로날 항체(항-FITC MAb-HRP, 미국 오리건주 유진의 Molecular Probes) 1 ㎍/㎖를 함유하는 1X PBS를 포함하는 용액 100 ㎕/웰로 채우고, 약 1 시간 동안 항온처리하였다. 플레이트를 상기한 바와 같이 다시 세척하였다. 그 다음 분석 플레이트 웰을 형광성 HRP 기질(QuantaBlu, 미국 일리노이주 록포드의 Pierce Chemical)을 함유하는 용액 100 ㎕로 채우고, 빛을 차단하면서 20∼30분 동안 항온처리하였다. 45분 항온처리한 후에, 정지 용액 100 ㎕/웰을 첨가하여 형광 침전물 생산 반응을 급냉시켰다. 325 nm에서의 형광 여기와 420 nm에서 검출되는 발광으로 형광 마이크로플레이트 판독기(SpectraMax Gemini XS, 미국 캘리포니아주 서니베일의 Molecular Devices)에서 플레이트를 즉시 판독하였다. 각 웰을 10회 판독하였다. 3종 앱타머 모두는 3가지 시점에서의 심장 조직에서 검출가능하였다(도 39).
실시예 5E: 정맥내 투여 후의 사이노몰거스 마카쿠에서의 C5 억제제 ARC657, ARC658 및 ARC187의 약물동력학 및 약력학 - 연구 1
표준 염수에서 10 ㎎/㎖로 ARC657(서열 번호 61), ARC658(서열 번호 62) 및 ARC187(서열 번호 5)의 주사용 제제를 제형화하고, 투약 제제를 무균 조건 하에서 사전멸균된 투약 바이알로 멸균 여과하였다(0.2 ㎛). 마카쿠 연구를 위해 사용된 투여 경로는 외과적으로 이식한 대퇴정맥 카테터를 통해 30 ㎎/kg 용량(약 50배 몰 과량)으로 투여된 정맥내 볼루스였다. 연구 디자인은 도 40에 요약되어 있다. 혈액 샘플을 대퇴정맥 카테터로부터 얻고, 구연산나트륨 코팅된 튜브로 직접 전달하고, 뒤집어서 혼합하고, 분리 혈장으로 원심분리(5분간 3000 rpm)될 때까지 얼음 위에 두었다. 그 다음 혈장을 250 ㎕ 분액으로 나누어 -80℃에서 보관하고, 상기 PK 래트 섹션에서 이미 기술한 형광계 OligreenTM 분석을 이용하여 각 샘플 중 하나의 분액의 앱타머 농도를 평가하였다.
1차 혈장 농도 대 시간 데이타는 도 41에 표 형태로 제시되어 있다. 예상한 바와 같이, 40 kDa PEG 앱타머 ARC187(서열 번호 5)이 최장 시간 동안 혈장 중에 유지된 반면, 20 kDa PEG 앱타머 ARC657(서열 번호 61)은 최단 시간 동안 유지되었다. 도 41에 도시된 데이타의 조사 결과는, 이 데이타가 2분획 모델에 의해 최적으로 대입된다는 것을 제시한다. 따라서, 도 42에 보고된 약물동력학 파라미터 추정값은 산업 표준 약물동력학 모델링 소프트웨어 WinNonLinTM v.4.0(미국 캘리포니아주 마우틴 뷰의 Pharsight Corp.)을 사용한 2구획 모델로부터 유도하였다.
도 42에 도시된 바와 같이, 모든 앱타머는 Cmax 값이 23∼30 μM로 유사하였는데, 이는 앱타머 용량(30 ㎎/kg)이 C5 농도에 대한 혈장 앱타머 50배 몰 과량(50배 몰 과량, 약 25 μM)을 실현하기에 충분하다는 것을 제시한다. ARC657(20 kDa PEG)(서열 번호 61)와 ARC658(30 kDa PEG)(서열 번호 62)는, 10,000 분자량만큼 차이가 나지만, 노출값(AUC), t1/2(α) 및 t1/2(β) 값이 유사하다. 대조적으로, ARC187(서열 번호 5)은 다른 분자들보다 유의적으로 높은 노출값(AUC), 연장된 t1/2(α) 및 약간 더 긴 t1/2(β)를 나타내었다.
후속하여 약물동력학 연구 과정에서 수집한 추가의 혈장 샘플 분액을 시험관 내에서 분석하여 영장류 C5 블록킹의 효능을 측정하였다. 상기 개시된 바와 같이 자이모산 활성화 분석을 실시하여 각각 생성된 영장류 C5b-9 및 C5a 양을 측정하였다. C5b-9 농도 대 샘플 시간(도 43a), C5b-9 농도 대 앱타머 농도(도 43b), C5a 농도 대 샘플 시간(도 43c), 및 C5a 농도 대 앱타머 농도(도 43d)를 포함하여 몇몇 상이한 형태로 데이타를 플롯하였다.
40 kDa PEG 앱타머 ARC187(서열 번호 5)은 최장 시간 동안 영장류 C5 분해(C5b-9 및 C5a 농도)를 억제하였다(도 43a 및 43c). C5b-9 및 C5a 데이타를 앱타머 농도에 대해 플롯하면, C5 분해를 완전히 억제하기 위해서는 PEG 분자의 크기와 무관하게 C5 블록킹 앱타머의 농도가 30배 몰 과량을 초과해야 한다는 것이 나타난다(도 43b 및 43d).
요약하면, 사이노몰거스 마카쿠 PK/PD 연구로부터 얻은 데이타는, (a) 예상한 바와 같이, PEG 기의 크기와 관련없이 사이노몰거스 마카쿠에서 생체내 C5 분해를 억제하기 위해서는 적어도 30배 몰 과량의 앱타머(약 15 μM 혈장 앱타머 농도)가 필요하고, (b) C5 블록킹 앱타머는 이 종에서는 명백한 독성을 유발하지 않으며, (c) 비교적 고용량(50배 몰 과량)으로 동물에게 투약한 경우, 샘플링 기간 중에 혈장 앱타머 농도가 적당한 분석 범위 내에 있어서 약물동력학 변수의 산정이 가능하다는 것을 입증하였다.
실시예 5F: 정맥내 투여 후의 사이노몰거스 마카쿠에서의 C5 억제제 ARC658 및 ARC187의 약물동력학 및 약력학 - 연구 2
연구 2는, a) 2종의 화합물만(ARC658(서열 번호 62) 및 ARC187(서열 번호 5))을 평가하고; b) 동물의 수를 그룹당 4마리로 증가시켰으며; c) 1분 혈장 샘플을 줄이고 144 시간 샘플로 대체하여 추가의 데이타점에 기초하여 말기 반감기를 계산한 것을 제외하고는, 상기 개시된 연구 1의 디자인과 유사하였다. 2종 앱타머의 조제 및 투약, 혈액 샘플링 및 혈장 분리법은 상기 연구 1에 개시된 방법과 동일하였다. 연구 2의 디자인은 도 44에 요약되어 있다.
연구 2의 완료 후에, 연구 1에 개시된 바와 같이 혈장 분액을 분석하여 a) 정맥내 투여 후의 각종 시점에서의 혈장 중 앱타머 농도 및 b) C5 블록킹 효능을 결정하였다.
혈장 농도를 시간의 함수에 대해 플롯하였으며(도 45), ARC658(서열 번호 62) 및 ARC187(서열 번호 5)에 대한 1차 데이타는 각각 도 39 및 40에 표 형태로 제시되어 있다. 40 kDa PEG 앱타머 ARC187(서열 번호 5)이 최장 시간 동안 혈장 중에 유지되었다. 도 45에 도시된 데이타의 조사 결과는, 이 데이타가 2구획 모델에 의해 최적으로 대입된다는 것을 제시한다. 따라서, 도 46에 보고된 약물동력학 파라미터 추정값은 WinNonLinTM v.4.0(미국 캘리포니아주 마우틴 뷰의 Pharsight Corp.)을 사용한 2구획 모델로부터 유도하였다.
상기 PK/PD 연구 1 및 연구 2 과정에서 형성된 약물동력학 파라미터를 비교하면, ARC658(서열 번호 62) 및 ARC187(서열 번호 5)에 대한 데이타는 ARC187에 대한 t1/2(α) 측정값을 제외하고 유사하였다. 특정 이론에 구애받고자 하는 것은 아 니지만, 2가지 연구에 있어서 ARC187에 대한 t1/2(α) 측정값 차이는 파일롯 연구에서 샘플 크기가 작기 때문에 생기는 것 같다.
도 46에서 입증되는 바와 같이, ARC658(서열 번호 62) 및 ARC187(서열 번호 5)에 대한 Cmax 값은 유사하였다. 대조적으로, 약물 노출값(AUC)은 ARC187(서열 번호 5)로 처리한 동물에서 유의적으로 높았다. 또한, ARC187은 ARC658(서열 번호 62)과 비교하여 연장된 t1/2(α) 및 t1/2(β) 값을 나타내었다. 이들 데이타는, PK/PD 연구 1 과정에서 형성된 데이타와 함께, C5 블록킹 앱타머 ARC187이 소정의 용량에서 생체내 C5 블록킹에 가장 효과적일 수 있다는 것을 제시한다.
후속하여 약물동력학 연구 과정에서 수집한 추가의 혈장 샘플 분액을 시험관 내에서 분석하여 영장류 C5 블록킹의 효능을 측정하였다. 전술한 바와 같이 자이모산 활성화 분석을 실시하여 각각 생성된 영장류 C5b-9 및 C5a 양을 측정하였다. C5b-9 농도 대 앱타머 농도(도 47) 및 C5a 농도 대 앱타머 농도(도 48)로서 데이타를 플롯하였다. PK/PD 연구 1 과정에서 이미 입증된 바와 같이, C5 블록킹 앱타머 농도는, C5 분해를 완전히 억제하기 위해서는 PEG 분자의 크기와 무관하게, 30배 몰 과량(혈장 C5 농도에 대한 앱타머)을 초과하거나, 또는 약 15 μM이어야 한다(도 41 및 42).
도 39 및 40의 표에 제시된 데이타를 조사하면, 30 ㎎/kg I.V. 볼루스 후에 ARC658(서열 번호 62)은 약 4시간 동안 15 μM 이상으로 잔존하는 반면, ARC187은 약 8 시간 동안 15 μM 이상으로 잔존한다는 것이 분명하다. 따라서, 약물을 유사 한 용량으로 제공한 경우, 40K 앱타머 ARC187이 30K 앱타머 ARC658(서열 번호 62)보다 대략 2배의 시간 동안 임상적 효능을 나타낸다.
요약하면, 생체내에서 C5 전환을 차단하기 위해서는 혈장 C5에 대해 적어도 30배몰 과량의 앱타머로 사이노몰거스 마카쿠를 처리해야 한다. 이들 데이타는, C5 결합 앱타머가 인간 C5에 비해 영장류 C5와의 친화도가 더 낮다고 제안한 이전의 시험관내(용혈) 및 생체외(분리된 관류 마우스 심장) 연구와 일치한다. C5 블록킹 앱타머를, C5 농도에 대해 약 50배 몰 과량의 앱타머에 해당하는 30 ㎎/kg까지의 용량으로 정맥내 볼루스로서 안전하게 전달할 수 있다는 것이 확인되었다.
실시예 5G: 볼루스 IV 투여 후에 사이노몰거스 마카쿠에서의 ARC1905
정맥내 투여 후 사이노몰거스 마카쿠에서 C5 억제제 ARC1905의 약력학을 평가하였다. ARC1905를 표준 염수 중에서 7.5 ㎎/㎖의 주사용으로 제형화한 후, 투약 제제를 무균 조건 하에서 사전멸균된 투약 바이알로 멸균 여과하였다(0.2 ㎛). 0(염수 대조군) 또는 30 ㎎/kg 용량으로 정맥내 볼루스 투여로 사이노몰거스 원숭이(n=4)에게 투약하였다. 말초 정맥 또는 동맥 접근 포트로부터 혈액 샘플을 얻어서, 혈액 샘플(0.5 ㎖)을 이칼륨(K2) EDTA 튜브로 옮기고, 젖은 얼음 뒤에 두고, 약 4℃에서 30분간의 수거 시간 내에 원심분리하였다.
영장류 C5 블록킹에서의 ARC1905의 효능을 측정하기 위해서 혈장 샘플을 시험관 내에서 분석하였다. 실시예 1C에서 ARC1905에 대해 앞서 기재한 자이모산 분석을 이용하여 형성된 영장류 C5a의 양을 측정하였다. 투약 후 0.5 시간 및 2 시간 에서의 후-자이모산 C5a 값 감소는, ARC1905가 자이모산 활성화 분석을 이용하여 시험관 내에서 측정한 바와 대략 동일한 농도 및 동일한 투여 경로로 투약된 경우 ARC187과 유사한 방식으로 사이노몰거스 마카쿠에서 생체내 C5 분해를 억제한다는 것을 제시한다.
실시예 5H: 볼루스 IV 투여 및 주입 후 사이노몰거스 마카쿠에서 C5 억제제 ARC187의 약물동력학 및 약력학
ARC187(서열 번호 5)의 약물동력학(PK) 및 약력학(PD) 프로필은, 정맥내 주입용 볼루스 직후 정맥내 주입 개시 후에 사이노몰거스 마카쿠에서 또한 평가하였다. 이 연구 디자인은 도 49에 도시되어 있다.
1 μM의 표적 정상 상태 혈장 농도를 얻기 위해 필요한 주입용 볼루스 투약 및 주입 속도는, 도 50에 제시된 IV 볼루스-단독 연구로부터 유도된 약물동력학 파라미터를 사용하여 계산하였다.
총 3마리 사이노몰거스 마카쿠에게 1 ㎎/kg으로 ARC187의 IV 볼루스를 투여한 직후, 48 시간 동안 0.0013 ㎎/kg/분의 속도로 IV 주입을 개시하였다. 처리 후 0∼192 시간에 전혈 샘플을 수거하고, 젖은 얼음 위에 보관하고, 혈장을 위해 처리한 다음, -80℃에서 냉동 보관하였다. 혈장 샘플 중 ARC187 농도는, 형광 핵산 염색 분석(실시예 5B에 개시됨)과 GLP-인증 성능 액체 크로마토그래피(HPLC) 분석을 사용하여 측정하였다. 원숭이 혈장 중 ARC187의 측정을 위한 HPLC 분석법은 ClinTrials Bio-Research(캐나다 몬트리얼)가 인증하였다. 이 인증 연구는 미국 식품의약품국(FDA)의 우수 실험실 운영기준(Good Laboratory Practice; GLP) 규정(21 CFR §58)에 따르는 것이었다. HPLC 분석법은, 선택도, 선형도, 정량 하한치(LLOQ), 이월량(carry-over), 분석내 정밀성 및 정확성, 분석간 정밀성 및 정확성, 원액 안정성, 주입 매체 안정성, 단기간 매트릭스 안정성, 냉동-해동 안정성, 장기간 매트릭스 안정성 및 희석 완전성에 대해 인증되었다. 분석의 이용 가능한 1차 동적 농도 범위는 0.080∼50.0 μM로 측정되었다.
이들 조건 하에 ARC187의 측정된 PK 프로필은, IV 볼루스 PK 파라미터만을 사용하여 형성된 계측 프로필과 잘 맞았다(도 51 참조). 1 μM의 표적 혈장 농도는 투약후 < 5분으로 설정하였으며, 전체 주입 기간 동안 유지하였다. 주입 중단 후에, 앱타머는 말기 제거 반감기, t1/2(β) ~40∼60 시간을 나타내었다.
사이노몰거스 마카쿠에서의 ARC187(서열 번호 5)의 약역학 활성은, 앞서 개시한 바와 같지만, 단 사이노몰거스 샘플 혈장을 10% 인간 혈장으로 10배 희석한 다음 5 ㎎/㎖ 자이모산으로 처리하는 것으로 변형시킨 자이모산 활성화 분석에서의 PK 연구 과정에서 수집한 혈장 샘플을 사용하여 생체 외에서 평가하였다. C5a 분해 산물의 출현으로 나타나는 바와 같은 C5 활성화는 인간 C5a에 특이적인 ELISA(C5a ELISA 키트, 미국 캘리포니아주 샌디에고의 BD Biosciences)로 측정하였다. 각 샘플에서의 활성 ARC187 농도는 기지의 ARC187 수준으로 제조한 샘플을 사용한 자이모산 분석으로부터 유도된 표준 곡선과 비교하여 정량화하였다(도 52 참조). 이 연구는, ARC187이 상기 개시된 약물동력학 프로필과 실질적으로 일치하는 수준에서, 주입 기간 및 그 이후에, 항-보체 활성을 유지한다는 것을 보여준다.
실시예 5I: 인간 투약 조건 예측
CABG 수술과 관련된 합병증의 예방, 완화 또는 치료에 대한 인간 투약 조건은 하기 가정에 기초한다: 첫번째, CABG 환자에게 수술 개시 전에 항-C5 앱타머의 1회의 정맥내 볼루스 용량을 투약한 다음, 계속 주입하여 CABG 수술 후 24∼48 시간 동안 1.5 μM의 정상 상태 혈장 농도를 확립 및 유지하였다. 볼루스 용량 및 주입 속도 추정값은, 앞서 개시한 사이노몰거스 마카쿠에서의 IV 볼루스 단독 및 볼루스 + 주입 연구로부터 유도된 약물동력학 파라미터를 사용한 계산에 기초하였다. ARC187 볼루스의 추정 용량은 1 ㎎/kg이며, 관련 주입 속도는 0.0013 ㎎/kg/분이었다. 볼루스 + 48 시간 주입법의 경우, 예상되는 총 약물 요구량은 ARC187에 대해 0.4 g이며, 여기서 질량은 올리고뉴클레오티드 중량만을 의미하는 것이다(도 53의 표 중 컬럼 7 참조). 도 53에 도시된 표 2의 컬럼 2는 ARC187의 올리고뉴클레오티드 부분에 접합된 PEG기의 중량에 관한 것이고, 컬럼 3은 ARC187의 올리고뉴클레오티드 부분의 분자량에 관한 것이며(올리고뉴클레오티드 서열로서 ARC186(서열 번호 4)을 포함하는 본원의 모든 앱타머에 대해 동일할 것이며), 컬럼 4는 상기 실시예 3C에 개시된 바와 같이 아민 반응성 화학을 통해 ARC186(서열 번호 4)에 접합된 40 kDa PEG의 분자량에 관한 것이며, 컬럼 5는 2 구획 모델에서 ARC187 α기 반감기에 관한 것이며, 컬럼 6은 2구획 모델에서 ARC187의 β 기 반감기에 관한 것이다.
실시예 6
항-C5 앱타머 및 헤파린/프로타민 상호작용
항-C5 앱타머의 예상되는 용도는 관상 동맥 우회로 이식술(CABG)과 관련된 염증성 부작용의 예방 또는 경감을 위한 예방제로서의 용도이다. 고 농도의 항응고 헤파린(3∼5 단위/㎖ 또는 1∼2 μM)을 통상 CABG 과정에서 투여하여 혈전을 예방하고 우회로 펌프 성분 내의 개방성을 유지하며; 정상 지혈 복구 및 수술 후에 헤파린 효과의 역전은 유사하게 높은 농도의 프로타민(~ 5 μM)을 투여하여 실현한다. 이들 약물 중 어느 약물의 효능에 있어서의 임의의 저해는 환자에게 잠재적인 위험을 주기 때문에, 항-C5 앱타머가 (1) 약물의 활성을 변경시키지 않고 (2) 환자의 항응고 치료를 복잡하게 하는 지혈에 대한 고유 효과를 나타내지 않는다는 것을 입증할 필요가 있다.
헤파린은 순 음 전하를 띄는 황산화된 다당류로서, 평균 분자량이 약 15 kDa이며, 항트롬빈과의 상호작용을 촉진하여 응고 캐스케이드의 프로테아제 수에 대한 억제 효과를 나타낸다. 고도의 양으로 하전된 폴리펩티드인 프로타민은 자연적으로 적어도 부분적으로 정전성이며, 그 특성이 잘 알려지지 않은 상호작용을 통해 헤파린 활성을 차단할 수 있다. 헤파린과 같이 ARC187(서열 번호 5)의 작용 중심은 매우 음이온성이다. 따라서, ARC187은 헤파린 결합 부위 또는 프로타민에 비특이적으로 결합하여, 이들 분자의 활성을 저해하는 것으로 생각할 수 있다. 하기 연구에서는 ARC187의 고유(즉, 헤파린 유사) 항응고 특성, 헤파린 기능에 대한 ARC187의 효과, 프로타민에 의한 헤파린 중화에 대한 ARC187의 효과, 및 ARC187의 보체 억제 특성에 대한 프로타민의 효과를 조사하였다.
실시예 6A: 응고에 대한 ARC187의 시험관내 효과
혈장 응고성에 대한 ARC187(서열 번호 5)의 고유 효과는, 각각 응고 캐스케 이드의 외인성 및 내인성 영향력, 프로트롬빈 시간(PT) 및 활성화된 부분 트롬보플라스틴 시간(aPTT)의 표준 임상 시험을 이용하여 조사하였다. 도 54에 도시된 바와 같이, 계획된 용량(최대 20 μM)을 초과한 농도로 구연산처리 인간 혈장을 적정하면 PT에는 변화가 없었고, aPTT만 약간 상승하였다.
헤파린 및 프로타민 기능에 대한 ARC187의 시험관내 효과를 평가하기 위해서, 3명의 개체로부터의 혈액을 CABG 수술에 사용된 헤파린 수준과 관련된 용량인 4∼5 단위/㎖ 헤파린에 넣었다. 이들 샘플의 응고성은, 수술 과정에서 헤파린 활성을 모니터링하기 위해서 일상적으로 이용되는 전혈 응고 시험인 활성화된 응혈 시간(ACT)을 이용하여 평가하였다. 이들 헤파린 농도에서, 다른 첨가제의 부재 하에 ACT는, 4 U/㎖ 헤파린의 존재 하에 ~150초 내지 ~500초, 또는 5 U/㎖ 헤파린의 존재 하에 ~800초의 기준선 값으로부터 유의적으로 연장되었다. 이들 샘플에의 10 μM ARC187의 첨가는 응혈 시간에 거의 영향을 미치지 않았는데, 이는 ARC187이 헤파린의 항응고 활성을 저해하지 않는다는 것을 입증하는 것이다.
최대 6∼8 μM (4 U/㎖ 헤파린) 또는 12 μM (5 U/㎖ 헤파린)의 프로타민으로 적정하여 헤파린 항응고 효과를 쉽게 중화시켰다. 헤파린의 존재 하의 ACT 값과 프로타민의 중화 농도는 실질적으로 기준선으로부터 구별할 수 없었다. ARC187의 핵산 중심(12 kDa)은 프로타민(5 kDa)보다 분자량이 크기 때문에, 프로파민에 첨가된 ARC187의 등몰 농도는 프로타민의 중화 활성을 완전히 역전시키는데 충분할 것으로 기대된다. 그러나, 프로타민을 대략 동일한 농도의 ARC187과 사전 배양하는 것은 ACT에 거의 영향을 미치지 않았다. 프로타민의 중화 농도를 함유하는 혈액 샘 플은 10 μM ARC187의 존재 또는 부재 하에 유사한 ACT 값을 나타내었는데, 이는 ARC187이 프로타민의 응고촉진(procoagulant) 활성에 미치는 영향은 있다고 해도 매우 작다는 것을 의미한다. 이들 결과는 도 55에 요약되어 있다.
실시예 6B: 응고에 대한 ARC187의 생체내 효과
헤파린의 임상적 용량 및 프로타민의 임상적/무증상/초임상적(superclinical) 용량에서, 항-C5 앱타머 ARC187(서열 번호 5)을 동시 투여하는 과정에서의 헤파린과 프로타민의 기능 사이의 상호작용은, 무증상/초임상 혈장 농도의 ARC187의 존재가 프로타민에 의한 헤파린 항응고의 역전을 저해하지 않는지를 결정하기 위해서 조사하였다. 연구 결과는 도 56에 요약되어 있다. 간단히 설명하면, 기준선 ACT 값은 시험한 모든 헤파린 용량에서 ARC187 10 μM(즉, 임상적 용량의 10배 몰 과량)에 의해 영향을 받지 않았다. 유사하게, 헤파린에 의한 항응고 정도는 10 μM ARC187에 의해 영향을 받지 않았다. ARC187의 부재 하에, 최소 유효량의 프로타민은 ~30%(임상 용량 = 100%)였다. 또한, 30% 프로타민에 의한 헤파린 항응고 역전은 임상 용량의 10배 몰 과량(즉, 10 μM)의 ARC187에 의해 영향을 받지 않았다. 따라서, 임상적 세팅(예, CABG)에서의 보체 억제를 위한 ARC187의 사용은 전형적인 용량의 헤파린 및 프로타민의 동시 사용에 의해 영향을 받지 않아야 한다.
실시예 6C: ARC187 항-보체 기능에 대한 헤파린 및 프로타민의 효과
ARC187(서열 번호 5)의 항-보체 활성에 대한 헤파린 및 프로타민의 효과는, 실시예 1에 개시된 바와 같이 자이모산으로 활성화된 구연산처리 전혈 샘플에서 조 사하였다. 자이모산 활성화 직전에, ARC187을 하기 4가지 조건 하에 처리된 구연산처리 혈액 샘플로 적정하였다; 1) 무처리(헤파린 또는 프로타민 무처리); 2) 4 U/㎖ 헤파린; 3) 6 μM 프로타민; 4) 4 U/㎖ 헤파린 + 6 μM 프로타민. 자이모산을 이용한 활성화 후에, C5 활성화는 혈장 중 sC5b-9의 ELISA 측정(C5b-9 ELISA 키트, 미국 캘리포니아주 샌디에고의 Quidel)으로 정량화하였다. 각 조건에 있어서, ARC187 농도에 대한 C5 활성화의 억제율(%)로서 표시된 결과는 오차 범위 내에서 구별할 수 없었다(도 57 참조). 모든 경우에, 완전 억제는 1∼2 μM ARC187로 실현되었다. 따라서, CABG 수술시의 사용에 적절한 농도로 별도 사용하거나 또는 병용한 헤파린 및 프로타민은 ARC187의 항보체 활성에 영향을 미치는 것으로 나타나지 않는다.
실시예 7
맥락막 신혈관형성
레이저 유도된 맥락막 신혈관형성은 노화 관련 황반 변성 모델로서 흔히 사용된다. 이것은 또한 당뇨병성 망막증 모델로서도 사용될 수 있다. 본 발명의 바람직한 구체예에서 본원에 개시된 항-보체 앱타머인 항-C5 제제의 맥락막 신혈관형성의 예방 및 안정화 및/또는 복구에 대한 투여 효과는, 하기 및 문헌[Krzystolik, M.G. 등., Arch Opthalmol, vol. 120, pp 338-346 (2002)]에 개시된 바와 같이 이 모델에서 평가한다.
맥락막 신혈관형성의 예방을 평가하는 경우에는, 항-C5 제제, 특히 사이노몰거스 보체 단백질 C5에 결합하여 기능을 억제하는 C5 특이적 앱타머를 각 사이노몰 거스 마카쿠의 한쪽 눈으로 초자체내 주사하면서, 대조군 눈에는 비히클을 투여한다. 앱타머 주사한 지 수 일 내지 수 주 후에, 각 사이노몰거스 원숭이의 양안에서 레이저 광응고술을 실시한다. 각 동물의 눈을 안검사, 색상 사진 및 플루오로세인 혈관조영술로 모니터링하였다. (혈관조영술로 평가한) 맥락막 신혈관형성의 발생이, 대조군 눈에서보다 항-C5 제제, 특히 C5 특이적 앱타머로 처리한 눈에서 유의적으로 낮은 경우, 항-C5 특이적 제제는 효과적인 것으로 간주한다. 맥락막 신혈관형성 예방을 항-C5 제제 및 항-VEGF 제제 및/또는 항-PDGF 제제의 조합을 이용한 처리에 대해 평가하는 경우, 레이저 광응고술 수 일 내지 수 주 전에 각 동물의 한쪽 눈을 항-C5 제제 및 항-VEGF 제제 및/또는 항-PDGF 제제로 처리한 것을 제외하고는 상기 절차를 따른다.
또 다른 구체예에서, 맥락막 신혈관형성 예방을 평가하는 경우, 항-보체 앱타머, 특히 C5 또는 C3와 같은 사이노몰거스 보체 단백질의 기능을 억제하는 앱타머를 각 사이노몰거스 마카쿠의 한쪽 눈으로 초자체내 주사하면서, 대조군 눈에는 비히클을 투여한다. 앱타머 주사한 지 수 일 내지 수 주 후에, 각 사이노몰거스 원숭이의 양안에서 레이저 광응고술을 실시한다. 각 동물의 눈을 안검사, 색상 사진 및 플루오로세인 혈관조영술로 모니터링하였다. (혈관조영술로 평가한) 맥락막 신혈관형성의 발생이, 대조군 눈에서보다 항-보체 앱타머로 처리한 눈에서 유의적으로 낮은 경우, 항-보체 앱타머는 효과적인 것으로 간주한다. 맥락막 신혈관형성 예방을 항-보체 앱타머 및 항-VEGF 제제 및/또는 항-PDGF 제제의 조합을 이용한 처리에 대해 평가하는 경우, 레이저 광응고술 수 일 내지 수 주 전에 각 동물의 한쪽 눈을 항-보체 앱타머 및 항-VEGF 제제 및/또는 항-PDGF 제제로 처리한 것을 제외하고는 상기 절차를 따른다.
맥락막 신혈관형성의 안정화 및/또는 복구를 평가하는 경우, 각 사이노몰거스 마카쿠의 양안에 레이저 광응고술을 실시한다. 레이저 광응고술을 실시한 지 수 일 내지 수 주 후에. 본 발명의 항-C5 제제를 각 동물의 한쪽 눈으로 초자체내 주사하면서, 다른 눈에는 비히클을 투여한다. 일 구체예에서, 항-C5 제제는 항-보체 앱타머이다. 바람직한 구체예에서, 상기 항-보체 앱타머는 C5 및/또는 C3 억제 앱타머이다. 각 동물의 눈을 안검사, 색상 사진 및 플루오로세인 혈관조영술로 모니터링하였다. (혈관조영술로 평가한) 맥락막 신혈관형성의 발생이, 대조군 눈에서보다 항-C5 제제, 특히 C5 앱타머 처리된 눈에서 유의적으로 낮고/낮거나, 이와 동일한 경우, 이 앱타머는 각각 안정화 및/또는 복구에 효과적인 것으로 간주한다. 맥락막 신혈관형성의 안정화 및/또는 복구를 항-C5 제제 및 항-VEGF 제제 및/또는 항-PDGF 제제의 조합을 이용한 처리에 대해 평가하는 경우, 레이저 광응고술 수 일 내지 수 주 후에 각 동물의 한쪽 눈을 항-C5 제제 및 항-VEGF 제제 및/또는 항-PDGF 제제로 처리한 것을 제외하고는 상기 절차를 따른다.
바로 앞서 개시한 사이노몰거스 마카쿠 평가와 유사하게, 맥락막 신혈관형성의 예방, 안정화 및/또는 복구에 있어서 항-C5 제제 및 항-보체 앱타머 단독 또는 항-VEGF 제제 및/또는 항-PDGF 제제와의 병용시 효능은, 뮤린 C5 보체 단백질 또는 다른 종의 C5 보체 단백질을 조절하는 항-C5 제제를 사용하여 마우스에서 또는 기타 종에서 평가할 수 있다. 또 다른 구체예에서, 상기 개시한 바와 동일한 사이노 몰거스 마카쿠 평가와 유사하게, 맥락막 신혈관형성의 예방, 안정화 및/또는 복구에 있어서 항-보체 앱타머 단독 또는 항-VEGF 제제 및/또는 항-PDGF 제제와의 병용시 효능은, 해당 뮤린 보체 단백질 또는 기타 종의 해당 보체 단백질을 조절, 특히 억제하는 항-보체 앱타머를 사용하여 마우스에서 또는 기타 종에서 평가할 수 있다. 예컨대 Bora 등의 문헌[Journal of Immunolgy, 174: 491-497 (2005)] 참조.
실시예 8
건성 AMD 뮤린 모델의 망막 변성
단핵구 화학유인성 단백질 1(MCP-1 또는 Ccl-2) 또는 이의 동족 C-C 케모킨 수용체 2(Ccr-2)에 변이를 가지는 마우스 모델은 드루젠 발생, 광수용체 위축 및 맥락막 신혈관형성을 비롯하여 인간의 노화 관련 황반 변성의 증상을 모방한다. Ambati 등의 문헌[Nature Medicine. 2003 Nov 2003; 9(11): 1390-7] 참조. 이 마우스 모델은 망막 색소 상피 및 맥락막에서의 유의적인 C5 축적을 나타내는데, 이는 보체가 질병과 관련하여 발현된다는 것을 의미한다. 또한, CD46(보체의 막결합 조절인자), 비트로넥틴(MAC의 조절인자) 및 C3c(C3b의 분해 산물)가 망막 색소 상피 및/또는 맥락막에 존재하는데, 이는 보체 활성화가 일어나고 있음을 제시하는 것이다.
망막 변성의 안정화 및/또는 복구를 평가하는 경우, 본 발명의 항-보체 앱타머, 예를 들어 뮤린 C5 또는 C3 억제 앱타머를 각 동물의 한쪽 눈으로 초자체내 주사하면서, 다른 눈에는 비히클을 투여한다. 망막 변성, 예컨대 RPE/맥락막에서의 보체 산물 축적, 비정상 전기생리학의 발생 및/또는 RPE 및/또는 광수용체의 국소 화된 위축, 및 맥락막 신혈관형성의 발생에 대해 각 동물의 눈을 모니터링한다. 망막 변성의 발생이 대조군 눈에서보다 항-보체 앱타머 처리된, 특히 항-C5 또는 항-C3 앱타머 처리된 눈에서 유의적으로 낮고/낮거나 이와 동일한 경우, 앱타머는 각각 안정화 및/또는 복구에 대해 효과적인 것으로 간주된다.
본 발명을 개시된 설명 및 실시예에 의해 기술하였지만, 당업자는 본 발명이 각종 구체예로 실시될 수 있으며, 상기 설명 및 실시예는 예시를 위한 것으로서 하기 특허청구범위를 제한하지 않는다는 것을 알 것이다.
SEQUENCE LISTING <110> Archemix Corporation, et al. <120> Complement Binding Aptamers and Anti-C5 Agents Useful in the Treatment of Ocular Disorders <130> 23239-591-061 <140> Not Yet Assigned <141> 2007-03-08 <150> U.S.S.N. 60/780,905 <151> 2006-03-08 <150> U.S.S.N. 60/848,274 <151> 2006-09-29 <160> 102 <170> PatentIn version 3.2 <210> 1 <211> 38 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> misc_feature <223> cytosine at positions 3, 4, 6 and 37 are 2'-fluoro <220> <221> misc_feature <223> uridine at positions 9, 30 and 31 are 2'-fluoro <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> n at position 1 is 2'-fluoro cytidine or 2'-O-methyl cytidine <220> <221> misc_feature <222> (2)..(2) <223> n at position 2 is 2'-OH guanosine or 2'-O-methyl guanosine <220> <221> misc_feature <222> (7)..(7) <223> n at position 7 is 2'-OH guanosine or 2'-O-methyl guanosine <220> <221> misc_feature <222> (8)..(8) <223> n at position 8 is 2'-OH guanosine or 2'-O-methyl guanosine <220> <221> misc_feature <222> (10)..(10) <223> n at position 10 is 2'-fluoro cytosine or deoxy cytidine <220> <221> misc_feature <222> (11)..(11) <223> n at position 11 is 2'-fluoro uridine or deoxy thymidine <220> <221> misc_feature <222> (12)..(12) <223> n at position 12 is 2'-fluoro cytosine or deoxy cytidine <220> <221> misc_feature <222> (13)..(13) <223> n at position 13 is 2'-OH adenosine or 2'-O-methyl adenosine <220> <221> misc_feature <222> (14)..(14) <223> n at position 14 is 2'-OH guanosine or 2'-O-methyl guanosine <220> <221> misc_feature <222> (15)..(15) <223> n at position 15 is 2'-OH guanosine or 2'-O-methyl guanosine <220> <221> misc_feature <222> (16)..(16) <223> n at position 16 is 2'-fluoro cytosine or deoxy cytidine <220> <221> misc_feature <222> (18)..(18) <223> n at position 18 is 2'-fluoro cytosine or 2'-O-methyl cytosine <220> <221> misc_feature <222> (19)..(19) <223> n at position 19 is 2'-fluoro uridine or 2'-O-methyl uridine <220> <221> misc_feature <222> (20)..(20) <223> n at position 20 is 2'-OH guanosine or 2'-O-methyl guanosine <220> <221> misc_feature <222> (21)..(21) <223> n at position 21 is 2'-OH adenosine or 2'-O-methyl adenosine <220> <221> misc_feature <222> (22)..(22) <223> n at position 22 is 2'-OH guanosine or 2'-O-methyl guanosine <220> <221> misc_feature <222> (23)..(23) <223> n at position 23 is 2'-fluoro uridine or deoxy thymidine <220> <221> misc_feature <222> (24)..(24) <223> n at position 24 is 2'-fluoro cytosine or deoxy cytidine <220> <221> misc_feature <222> (25)..(25) <223> n at position 25 is 2'-fluoro uridine or deoxy thymidine <220> <221> misc_feature <222> (26)..(26) <223> n at position 26 is 2'-OH guanosine or 2'-O-methyl guanosine <220> <221> misc_feature <222> (27)..(27) <223> n at position 27 is 2'-OH adenosine or 2'-O-methyl adenosine <220> <221> misc_feature <222> (28)..(28) <223> n at position 28 is 2'-OH guanosine or 2'-O-methyl guanosine <220> <221> misc_feature <222> (29)..(29) <223> n at position 29 is 2'-fluoro uridine or deoxy thymidine <220> <221> misc_feature <222> (32)..(32) <223> n at position 32 is 2'-OH adenosine or 2'-O-methyl adenosine <220> <221> misc_feature <222> (33)..(33) <223> n at position 33 is 2'-fluoro cytosine or deoxy cytidine <220> <221> misc_feature <222> (34)..(34) <223> n at position 34 is 2'-fluoro cytosine or deoxy cytidine <220> <221> misc_feature <222> (35)..(35) <223> n at position 35 is 2'-fluoro uridine or deoxy thymidine <220> <221> misc_feature <222> (36)..(36) <223> n at position 36 is 2'-OH guanosine or 2'-O-methyl guanosine <220> <221> misc_feature <222> (38)..(38) <223> n at position 38 is 2'-OH guanosine or 2'-O-methyl guanosine <400> 1 nnccgcnnun nnnnnngnnn nnnnnnnnnu unnnnncn 38 <210> 2 <211> 38 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38) <223> all pyrimidines are 2'-fluoro; except at positions 10, 12, 16 and 24, wherein cytidine is deoxy, and at positions 11, 23 and 25, which are deoxy thymidine <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38) <223> all purines are 2'-O-methyl; except at positions 5 and 17, wherein guanosine is 2'-OH, and position 32, wherein adenosine is 2'-OH <400> 2 cgccgcgguc tcaggcgcug agtctgaguu uaccugcg 38 <210> 3 <211> 42 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(42) <223> all pyrimidines are 2'-fluoro <400> 3 gacgaugcgg ucucaugcgu cgagugugag uuuaccuucg uc 42 <210> 4 <211> 39 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38) <223> all pyrimidines are 2'-fluoro <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38) <223> all purines are 2'-O-methyl; except at positions 5 and 17, wherein guanosine is 2'-OH, and at position 32, wherein adenosine is 2'-OH <220> <221> misc_feature <222> (39)..(39) <223> thymidine at position 39 is a 3' inverted deoxy thymidine (3'-3' linked) <400> 4 cgccgcgguc ucaggcgcug agucugaguu uaccugcgt 39 <210> 5 <211> 39 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> cytosine at position 1 is modified by a 40 kDa branched (1,3-bis(mPEG-[20 kDa])-propyl-2-(4'-butamide)) PEG attached to the nucleotide via an amine linker <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38) <223> all pyrimidines are 2'-fluoro <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38) <223> all purines are 2'-O-methyl; except at positions 5 and 17, wherein guanosine is 2'-OH, and at position 32, wherein adenosine is 2'-OH <220> <221> misc_feature <222> (39)..(39) <223> thymidine at position 39 is a 3' inverted deoxy thymidine (3'-3' linked) <400> 5 cgccgcgguc ucaggcgcug agucugaguu uaccugcgt 39 <210> 6 <211> 44 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(44) <223> all pyrimidines are 2'-fluoro <400> 6 aggacgaugc ggucucaugc gucgagugug aguuuaccuu cguc 44 <210> 7 <211> 40 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(40) <223> all pyrimidines are 2'-fluoro <220> <221> misc_feature <222> (1)..(40) <223> all purines are 2'-O-methyl; except at positions 2, 7 and 19, wherein guanosine is 2'-OH, and positions 1 and 34, wherein adenosine is 2'-OH <400> 7 agcgccgcgg ucucaggcgc ugagucugag uuuaccugcg 40 <210> 8 <211> 40 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(40) <223> all pyrimidines are 2'-fluoro <400> 8 ggcgccgcgg ucucaggcgc ugagucugag uuuaccugcg 40 <210> 9 <211> 39 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38) <223> all purines are 2'-O-methyl; except at positions 5 and 17, wherein guanosine is 2'-OH, and position 32, wherein adenosine is 2'-OH <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38) <223> all pyrimidines are 2'-fluoro; except at positions 10, 12, 16, 24, 33 and 34, wherein cytidine is deoxy, and at positions 11, 23, and 25, which are deoxy thymidine <220> <221> misc_feature <222> (39)..(39) <223> thymidine at position 39 is a 3' inverted deoxy thymidine (3'-3' linked) <400> 9 cgccgcgguc tcaggcgcug agtctgaguu uaccugcgt 39 <210> 10 <211> 39 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38) <223> all purines are 2'-O-methyl, except at positions 5 and 17, wherein guanosine is 2'-OH, and position 32, wherein adenosine is 2'-OH <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38) <223> all pyrimidines are 2'-fluoro, except at positions 10, 12, 16, 24, 33 and 34, wherein cytidine is deoxy; at positions 1, 3, and 37, wherein cytosine is 2'-O-methyl; and at postions 11, 23, and 25, which are deoxy thymidine <220> <221> misc_feature <222> (39)..(39) <223> thymidine at position 39 is a 3' inverted deoxy thymidine (3'-3' linked) <400> 10 cgccgcgguc tcaggcgcug agtctgaguu uaccugcgt 39 <210> 11 <211> 38 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38) <223> all purines are 2'-O-methyl, except at positions 5 and 17, wherein guanosine is 2'-OH, and position 32, wherein adenosine is 2'-OH <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38) <223> all pyrimidines are 2'-fluoro; except at positions 1, 3, 10, 12, 16, 24 and 37, wherein cytidine is deoxy; and at positions 11, 23 and 25, which are deoxy thymidine <400> 11 cgccgcgguc tcaggcgcug agtctgaguu uaccugcg 38 <210> 12 <211> 38 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38) <223> all purines are 2'-O-methyl; except at positions 5 and 17, wherein guanosine is 2'-OH, and position 32, wherein adenosine is 2'-OH <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38) <223> all pyrmidines are 2'-fluoro; except at positions 1, 10, 12, 16 and 24, wherein cytidine is deoxy, and at positions 11, 23 and 25, which are deoxy thymidine <400> 12 cgccgcgguc tcaggcgcug agtctgaguu uaccugcg 38 <210> 13 <211> 38 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38) <223> all purines are 2'-O-methyl; except at positions 5 and 17, wherein guanosine is 2'-OH, and position 32, wherein adenosine is 2'-OH <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38) <223> all pyrimidines are 2'-fluoro; except at positions 3, 10, 12, 16 and 24, wherein cytidine is deoxy; and positions 11, 23, and 25, which are deoxy thymidine <400> 13 cgccgcgguc tcaggcgcug agtctgaguu uaccugcg 38 <210> 14 <211> 38 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38) <223> all purines are 2'-O-methyl; except at positions 5 and 17, wherein guanosine is 2'-OH, and position 32, wherein adenosine is 2'-OH <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38) <223> all pyrimidines are 2'-fluoro; except at positions 10, 12, 16, 24 and 37, wherein cytidine is deoxy; and at positions 11, 23, and 25, which are deoxy thymidine <400> 14 cgccgcgguc tcaggcgcug agtctgaguu uaccugcg 38 <210> 15 <211> 38 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38) <223> all purines are 2'-O-methyl; except at positions 5 and 17, wherein guanosine is 2'-OH, and position 32, wherein adenosine is 2'-OH <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38) <223> all pyrimidines are 2'-fluoro; except at positions 10, 12, 16, and 24, wherein cytidine is deoxy; at position 3, wherein cytosine is 2'-O-methyl; and at positions 11, 23, and 25, which are deoxy thymidine <400> 15 cgccgcgguc tcaggcgcug agtctgaguu uaccugcg 38 <210> 16 <211> 38 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38) <223> all purines are 2'-O-methyl; except at positions 5 and 17, wherein guanosine is 2'-OH, and position 32, wherein adenosine is 2'-OH <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38) <223> all pyrimidines are 2'-fluoro; except at positions 10, 12, 16 and 24, wherein cytidine is deoxy; at position 37, wherein cytosine is 2'-O-methyl; and at positions 11, 23 and 25, which are deoxy thymidine <400> 16 cgccgcgguc tcaggcgcug agtctgaguu uaccugcg 38 <210> 17 <211> 38 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38) <223> all purines are 2'-O-methyl; except at positions 5 and 17, wherein guanosine is 2'-OH, and position 32, wherein adenosine is 2'-OH <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38) <223> all pyrimidines are 2'-fluoro; except at positions 10, 12, 16 and 24, wherein cytidine is deoxy; at position 1, wherein cytosine is 2'-O-methyl; and at positions 11, 23 and 25, which are deoxy thymidine <400> 17 cgccgcgguc tcaggcgcug agtctgaguu uaccugcg 38 <210> 18 <211> 38 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38) <223> all purines are 2'-O-methyl; except at positions 5 and 17, wherein guanosine is 2'-OH, and position 32, wherein adenosine is 2'-OH <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38) <223> all pyrimidines are 2'-fluoro; except at positions 10, 12, 16 and 24, wherein cytidine is deoxy; at positions 1, 3 and 37, wherein cytosine is 2'-O-methyl; and at positions 11, 23 and 25, which are deoxy thymidine <400> 18 cgccgcgguc tcaggcgcug agtctgaguu uaccugcg 38 <210> 19 <211> 38 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38) <223> all purines are 2'-O-methyl; except at positions 5 and 17, wherein guanosine is 2'-OH, and position 32, wherein adenosine is 2'-OH <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38) <223> all pyrimidines are 2'-fluoro; except at positions 4, 10, 12, 16 and 24, wherein cytidine is deoxy; and at positions 11, 23, and 25, which are deoxy thymidine <400> 19 cgccgcgguc tcaggcgcug agtctgaguu uaccugcg 38 <210> 20 <211> 38 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38) <223> all purines are 2'-O-methyl; except at positions 5 and 17, wherein guanosine is 2'-OH, and position 32, wherein adenosine is 2'-OH <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38) <223> all pyrimidines are 2'-fluoro; except at positions 6, 10, 12, 16 and 24, wherein cytidine is deoxy; and at positions 11, 23 and 25, which are deoxy thymidine <400> 20 cgccgcgguc tcaggcgcug agtctgaguu uaccugcg 38 <210> 21 <211> 38 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38) <223> all purines are 2'-O-methyl; except at positions 5 and 17, wherein guanosine is 2'-OH, and position 32, wherein adenosine is 2'-OH <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38) <223> all pyrimidines are 2'-fluoro; except at positions 4, 6, 10, 12, 16 and 24, wherein cytidine is deoxy; and at positions 11, 23 and 25, which are deoxy thymidine <400> 21 cgccgcgguc tcaggcgcug agtctgaguu uaccugcg 38 <210> 22 <211> 38 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38) <223> all purines are 2'-O-methyl; except at positions 5 and 17, wherein guanosine is 2'-OH, and position 32, wherein adenosine is 2'-OH <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38) <223> all pyrimidines are 2'-fluoro; except at positions 10, 12, 16, 18 and 24, wherein cytidine is deoxy; and at positions 11, 23 and 25, which are deoxy thymidine <400> 22 cgccgcgguc tcaggcgcug agtctgaguu uaccugcg 38 <210> 23 <211> 38 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38) <223> all purines are 2'-O-methyl; except at positions 5 and 17, wherein guanosine is 2'-OH, and position 32, wherein adenosine is 2'-OH <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38) <223> all all pyrimidines are 2'-fluoro; except at positions 10, 12, 16 and 24, wherein cytidine is deoxy; and at positions 11, 19, 23 and 25, which are deoxy thymidine <400> 23 cgccgcgguc tcaggcgctg agtctgaguu uaccugcg 38 <210> 24 <211> 38 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38) <223> all purines are 2'-O-methyl; except at positions 5 and 17, wherein guanosine is 2'-OH, and position 32, wherein adenosine is 2'-OH <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38) <223> all pyrimidines are 2'-fluoro; except at positions 10, 12, 16, 18 and 24, wherein cytidine is deoxy; and at positions 11, 19, 23 and 25, which are deoxy thymidine <400> 24 cgccgcgguc tcaggcgctg agtctgaguu uaccugcg 38 <210> 25 <211> 38 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38) <223> all purines are 2'-O-methyl; except at positions 5 and 17, wherein guanosine is 2'-OH, and position 32, wherein adenosine is 2'-OH <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38) <223> all pyrimidines are 2'-fluoro; except at positions 10, 12, 16 and 24, wherein cytidine is deoxy; and at positions 11, 23, 25 and 29, which are deoxy thymidine <400> 25 cgccgcgguc tcaggcgcug agtctgagtu uaccugcg 38 <210> 26 <211> 38 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38) <223> all purines are 2'-O-methyl; except at positions 5 and 17, wherein guanosine is 2'-OH, and position 32, wherein adenosine is 2'-OH <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38) <223> all pyrimidines are 2'-fluoro; except at positions 10, 12, 16 and 24, wherein cytidine is deoxy; and at positions 11, 23, 25 and 30, which are deoxy thymidine <400> 26 cgccgcgguc tcaggcgcug agtctgagut uaccugcg 38 <210> 27 <211> 38 <212> DNA <213> artificial sqeuence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38) <223> all purines are 2'-O-methyl; except at positions 5 and 17, wherein guanosine is 2'-OH, and position 32, wherein adenosine is 2'-OH <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38) <223> all pyrimidines are 2'-fluoro; except at positions 10, 12, 16 and 24, wherein cytidine is deoxy; and at positions 11, 23, 25 and 31, which are deoxy thymidine <400> 27 cgccgcgguc tcaggcgcug agtctgaguu taccugcg 38 <210> 28 <211> 38 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38) <223> all purines are 2'-O-methyl; except at positions 5 and 17, wherein guanosine is 2'-OH, and position 32, wherein adenosine is 2'-OH <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38) <223> all pyrimidines are 2'-fluoro; except at positions 10, 12, 16 and 24, wherein cytidine is deoxy; and at positions 11, 23, 25, 29, 30 and 31, which are deoxy thymidine <400> 28 cgccgcgguc tcaggcgcug agtctgagtt taccugcg 38 <210> 29 <211> 38 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38) <223> all purines are 2'-O-methyl; except at positions 5 and 17, wherein guanosine is 2'-OH, and position 32, wherein adenosine is 2'-OH <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38) <223> all pyrimidines are 2'-flouro; except at positions 10, 12, 16 and 24, wherein cytidine is deoxy; and at positions 11, 23, 25 and 35, which are deoxy thymidine <400> 29 cgccgcgguc tcaggcgcug agtctgaguu uacctgcg 38 <210> 30 <211> 38 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38) <223> all purines are 2'-O-methyl; except at positions 5 and 17, wherein guanosine is 2'-OH, and position 32, wherein adenosine is 2'-OH <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38) <223> all pyrimidines are 2'-fluoro; except at positions 10, 12, 16, 24, 33 and 34, wherein cytidine is deoxy; at position 9, wherein uridine is 2'-O-methyl; and at positions 11, 23 and 25, which are deoxy thymidine <400> 30 cgccgcgguc tcaggcgcug agtctgaguu uaccugcg 38 <210> 31 <211> 38 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38) <223> all purines are 2'-O-methyl; except at positions 5 and 17, wherein guanosine is 2'-OH, and position 32, wherein adenosine is 2'-OH <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38) <223> all pyrimidines are 2'-fluoro; except at positions 10, 12, 16 and 24, wherein cytidine is deoxy; at position 4, wherein cytosine is 2'-O-methyl; and at positions 11, 23, and 25, which are deoxy thymidine <400> 31 cgccgcgguc tcaggcgcug agtctgaguu uaccugcg 38 <210> 32 <211> 38 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38) <223> all purines are 2'-O-methyl; except at positions 5 and 17, wherein guanosine is 2'-OH, and position 32, wherein adenosine is 2'-OH <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38) <223> all pyrimidines are 2'-fluoro; except at positions 10, 12, 16 and 24, wherein cytidine is deoxy; at position 6, wherein cytosine is 2'-O-methyl; and at positions 11, 23, and 25, which are deoxy thymidine <400> 32 cgccgcgguc tcaggcgcug agtctgaguu uaccugcg 38 <210> 33 <211> 38 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38) <223> all purines are 2'-O-methyl; except at positions 5 and 17, wherein guanosine is 2'-OH, and position 32, wherein adenosine is 2'-OH <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38) <223> all pyrimidines are 2'-fluoro; except at positions 10, 12, 16 and 24, wherein cytidine is deoxy; at position 4 and 6, wherein cytosine is 2'-O-methyl; and at positions 11, 23, and 25, which are deoxy thymidine <400> 33 cgccgcgguc tcaggcgcug agtctgaguu uaccugcg 38 <210> 34 <211> 38 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38) <223> all purines are 2'-O-methyl; except at positions 5 and 17, wherein guanosine is 2'-OH, and position 32, wherein adenosine is 2'-OH <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38) <223> all pyrimidines are 2'-fluoro; except at positions 10, 12, 16 and 24, wherein cytidine is deoxy; and at position 18, wherein cytosine is 2'-O-methyl <400> 34 cgccgcgguc ucaggcgcug agucugaguu uaccugcg 38 <210> 35 <211> 38 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38) <223> all purines are 2'-O-methyl; except at positions 5 and 17, wherein guanosine is 2'-OH, and position 32, wherein adenosine is 2'-OH <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38) <223> all pyrimidines are 2'-fluoro; except at positions 10, 12, 16 and 24, wherein cytidine is deoxy; and at position 19, wherein uridine is 2'-O-methyl <400> 35 cgccgcgguc ucaggcgcug agucugaguu uaccugcg 38 <210> 36 <211> 38 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38) <223> all purines are 2'-O-methyl; except at positions 5 and 17, wherein guanosine is 2'-OH, and position 32, wherein adenosine is 2'-OH <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38) <223> all pyrimidines are 2'-fluoro; except at positions 10, 12, 16 and 24, wherein cytidine is deoxy; at position 18, wherein cytosine is 2'-O-methyl; and at position 19, wherein uridine is 2'-O-methyl <400> 36 cgccgcgguc ucaggcgcug agucugaguu uaccugcg 38 <210> 37 <211> 38 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38) <223> all purines are 2'-O-methyl; except at positions 5 and 17, wherein guanosine is 2'-OH, and position 32, wherein adenosine is 2'-OH <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38) <223> all pyrimidines are 2'-fluoro; except at positions 10, 12, 16 and 24, wherein cytidine is deoxy; at position 29, wherein uridine is 2'-O-methyl; and at positions 11, 23 and 25, which are deoxy thymidine <400> 37 cgccgcgguc tcaggcgcug agtctgaguu uaccugcg 38 <210> 38 <211> 38 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38) <223> all purines are 2'-O-methyl; except at positions 5 and 17, wherein guanosine is 2'-OH, and position 32, wherein adenosine is 2'-OH <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38) <223> all pyrimidines are 2'-fluoro; except at positions 10, 12, 16 and 24, wherein cytidine is deoxy; at position 30, wherein uridine is 2'-O-methyl; and at positions 11, 23 and 25, which are deoxy thymidine <400> 38 cgccgcgguc tcaggcgcug agtctgaguu uaccugcg 38 <210> 39 <211> 38 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38) <223> all purines are 2'-O-methyl; except at positions 5 and 17, wherein guanosine is 2'-OH, and position 32, wherein adenosine is 2'-OH <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38) <223> all pyrimidines are 2'-fluoro; except at positions 10, 12, 16 and 24, wherein cytidine is deoxy; at position 31, wherein uridine is 2'-O-methyl; and at positions 11, 23 and 25, which are deoxy thymidine <400> 39 cgccgcgguc tcaggcgcug agtctgaguu uaccugcg 38 <210> 40 <211> 38 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38) <223> all purines are 2'-O-methyl; except at positions 5 and 17, wherein guanosine is 2'-OH, and position 32, wherein adenosine is 2'-OH <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38) <223> all pyrimidines are 2'-fluoro; except at positions 10, 12, 16 and 24, wherein cytidine is deoxy; at positions 29, 30 and 31, wherein uridine is 2'-O-methyl; and at positions 11, 23 and 25, which are deoxy thymidine <400> 40 cgccgcgguc tcaggcgcug agtctgaguu uaccugcg 38 <210> 41 <211> 38 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38) <223> all purines are 2'-O-methyl; except at positions 5 and 17, wherein guanosine is 2'-OH, and position 32, wherein adenosine is 2'-OH <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38) <223> all pyrimidines are 2'-fluoro; except at positions 10, 12, 16 and 24, wherein cytidine is deoxy; at position 35, wherein uridine is 2'-O-methyl; and at positions 11, 23 and 25, which are deoxy thymidine <400> 41 cgccgcgguc tcaggcgcug agtctgaguu uaccugcg 38 <210> 42 <211> 38 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38) <223> all purines are 2'-O-methyl; except at position 5, wherein guanosine is deoxy; at position 17, wherein guanosine is 2'-OH; and position 32, wherein adenosine is 2'-OH <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38) <223> all pyrimidines are 2'-fluoro; except at positions 10, 12, 16 and 24, wherein cytidine is deoxy; and at positions 11, 23 and 25, which are deoxy thymidine <400> 42 cgccgcgguc tcaggcgcug agtctgaguu uaccugcg 38 <210> 43 <211> 38 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38) <223> all purines are 2'-O-methyl; except at position 5, wherein guanosine is 2'-OH; at position 17, wherein guanosine is deoxy; and position 32, wherein adenosine is 2'-OH <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38) <223> all pyrimidines are 2'-fluoro; except at positions 10, 12, 16 and 24, wherein cytidine is deoxy; and at positions 11, 23 and 25, which are deoxy thymidine <400> 43 cgccgcgguc tcaggcgcug agtctgaguu uaccugcg 38 <210> 44 <211> 38 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38) <223> all purines are 2'-O-methyl; except at positions 5 and 17, wherein guanosine is 2'-OH; and position 32, wherein adenosine is deoxy <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38) <223> all pyrimidines are 2'-fluoro; except at positions 10, 12, 16 and 24, wherein cytidine is deoxy; and at positions 11, 23 and 25, which are deoxy thymidine <400> 44 cgccgcgguc tcaggcgcug agtctgaguu uaccugcg 38 <210> 45 <211> 40 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(40) <223> all purines are 2'-O-methyl; except at positions 6 and 18, wherein guanosine is 2'-OH; and position 33, wherein adenosine is 2'-OH <220> <221> misc_feature <222> (1)..(40) <223> all pyrimidines are 2'-fluoro; except at positions 11, 13, 17 and 25, wherein cytidine is deoxy; at position 40, wherein cytosine is 2'-O-methyl; and at positions 12, 24 and 26, which are deoxy thymidine <400> 45 gcgucgcggu ctcaggcgcu gagtctgagu uuaccuacgc 40 <210> 46 <211> 38 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38) <223> all purines are 2'-O-methyl; except at positions 5 and 17, wherein guanosine is 2'-OH; and position 32, wherein adenosine is deoxy <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38) <223> all pyrimidines are 2'-fluoro; except at positions 10, 12, 16 and 24, wherein cytidine is deoxy; at positions 36, 37 and 38 wherein cytosine is 2'-O-methyl; and at positions 11, 23 and 25, which are deoxy thymidine <400> 46 gggcgcgguc tcaggcgcug agtctgaguu uaccuccc 38 <210> 47 <211> 40 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(40) <223> all purines are 2'-O-methyl; except at positions 6 and 18, wherein guanosine is 2'-OH; and position 33, wherein adenosine is 2'-OH <220> <221> misc_feature <222> (1)..(40) <223> all pyrimidines are 2'-fluoro; except at positions 11, 13, 17 and 25, wherein cytidine is deoxy; at position 40, wherein cytosine is 2'-O-methyl; and at positions 12, 24 and 26, which are deoxy thymidine <400> 47 gcgccgcggu ctcaggcgcu gagtctgagu uuaccugcgc 40 <210> 48 <211> 45 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(44) <223> all purines are 2'-O-methyl; except at positions 8 and 20, wherein guanosine is 2'-OH; and position 35 wherein adenosine is 2'-OH <220> <221> misc_feature <222> (1)..(44) <223> all pyrimidines are 2'-fluoro <220> <221> misc_feature <222> (45)..(45) <223> thymidine at position 45 is a 3' inverted deoxy thymidine (3'-3' linked) <400> 48 ggacgccgcg gucucaggcg cugagucuga guuuaccugc gucut 45 <210> 49 <211> 42 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(42) <223> all purines are 2'-O-methyl; except at positions 7 and 19, wherein guanosine is 2'-OH; and at position 34, wherein adenosine is 2'-OH <220> <221> misc_feature <222> (1)..(42) <223> all cytosines are 2'-fluoro; except at positions 12, 14, 18, 26, 35 and 36, which are deoxy cytidine; and at positions 20, 41 and 42, wherein cytosine is 2'-O-methyl <220> <221> misc_feature <222> (1)..(42) <223> all uridines are 2'-fluoro; except at position 21, wherein uridine is 2'-O-methyl; and at positions 13, 25, 27, 31 and 37, which are deoxy thymidine <400> 49 ggcgccgcgg uctcaggcgc ugagtctgag tuuacctgcg cc 42 <210> 50 <211> 42 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(42) <223> all purines are 2'-O-methyl; except at positions 7 and 19, wherein guanosine is 2'-OH; and at position 34, wherein adenosine is 2'-OH <220> <221> misc_feature <222> (1)..(42) <223> all cytosines are 2'-fluoro; except at positions 12, 14, 18, 26, 35, 36 and 39, which are deoxy cytidine; and at positions 3, 20, 41 and 42, wherein cytosine is 2'-O-methyl <220> <221> misc_feature <222> (1)..(42) <223> uridine at position 11 is 2'-fluoro; uridine at position 21 is 2'-O-methyl; positions 13, 25, 27, 31, 32, 33 and 37 are deoxy thymidine <400> 50 ggcgccgcgg uctcaggcgc ugagtctgag tttacctgcg cc 42 <210> 51 <211> 42 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(42) <223> all purines are 2'-O-methyl; except at positions 7 and 19, wherein guanosine is 2'-OH <220> <221> misc_feature <222> (1)..(42) <223> cytosine at positions 5, 6, 8, 12, 14, 18, 26, 35, 36 and 39 are deoxy cytidine; and cystosine at positions 3, 20, 41 and 42 are 2'-O-methyl <220> <221> misc_feature <222> (1)..(42) <223> uridine at position 21 is 2'-O-methyl; positions 11, 13, 25, 27, 31, 32, 33 and 37 are deoxy thymidine <400> 51 ggcgccgcgg tctcaggcgc ugagtctgag tttacctgcg cc 42 <210> 52 <211> 42 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(42) <223> all purines are 2'-O-methyl; except at positions 7 and 19, wherein guanosine is 2'-OH <220> <221> misc_feature <222> (1)..(42) <223> uridine at positions 13, 21, 25 and 27 are 2'-O-methyl; positions 11, 31, 32, 33 and 37 are deoxy thymidine <220> <221> misc_feature <222> (1)..(42) <223> cytosine at positions 5, 6, 8, 12, 18, 35, 36 and 39 are deoxy cytidine; and cytosine at positions 3, 14, 20, 26, 41 and 42 are 2'-O-methyl <400> 52 ggcgccgcgg tcucaggcgc ugagucugag tttacctgcg cc 42 <210> 53 <211> 40 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> adenosine at position 1 has a biotin conjugated to the 5' end <220> <221> misc_feature <222> (1)..(40) <223> all purines are 2'-O-methyl; except at positions 3, 8 and 20, wherein guanosine is 2'-OH; and at position 2, wherein adenosine is 2'-OH <220> <221> misc_feature <222> (1)..(40) <223> all pyrimidines are 2'-fluoro <400> 53 agcgccgcgg ucucaggcgc ugagucugag uuuaccugcg 40 <210> 54 <211> 42 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(42) <223> all purines are 2'-O-methyl; except at positions 7 and 19, wherein guanosine is 2'-OH; and at position 34, wherein adenosine is 2'-OH <220> <221> misc_feature <222> (1)..(42) <223> all cytosines are 2'-fluoro; except at positions 12, 14, 18 and 26, which are deoxy cytidine; and at positions 41 and 42, wherein cytosine is 2'-O-methyl <220> <221> misc_feature <222> (1)..(42) <223> all uridines are 2'-fluoro; positions 13, 25, and 27 are deoxy thymidine <400> 54 ggcgccgcgg uctcaggcgc ugagtctgag uuuaccugcg cc 42 <210> 55 <211> 42 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(42) <223> all purines are 2'-O-methyl; except at positions 7 and 19, wherein guanosine is 2'-OH; and at position 34, wherein adenosine is 2'-OH <220> <221> misc_feature <222> (1)..(42) <223> all cytosines are 2'-fluoro; except at positions 12, 14, 18, 26, 41 and 42, wherein cytosine is 2'-O-methyl <220> <221> misc_feature <222> (1)..(42) <223> all uridines are 2'-fluoro; except at positions 13, 25, and 27, wherein uridine is 2'-O-methyl <400> 55 ggcgccgcgg ucucaggcgc ugagucugag uuuaccugcg cc 42 <210> 56 <211> 39 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38) <223> all pyrimidines are 2'-fluoro <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38) <223> all purines are 2'-O-methyl; except at positions 5 and 17, wherein guanosine is 2'-OH <220> <221> misc_feature <222> (39)..(39) <223> thymidine at position 39 is a 3' inverted deoxy thymidine (3'-3' linked) <400> 56 cgccgcgguc ucaggcgcug agucugaguu uaccugcgt 39 <210> 57 <211> 39 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38) <223> all pyrimidines are 2'-fluoro; except at position 18, wherein cytosine is 2'-O-methyl; and at position 19 wherein uridine is 2'-O-methyl <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38) <223> all purines are 2'-O-methyl; except at positions 5 and 17, wherein guanosine is 2'-OH; and at position 32, wherein adenosine is 2'-OH <220> <221> misc_feature <222> (39)..(39) <223> thymidine at position 39 is a 3' inverted deoxy thymidine (3'-3' linked) <400> 57 cgccgcgguc ucaggcgcug agucugaguu uaccugcgt 39 <210> 58 <211> 39 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38) <223> all pyrimidines are 2'-fluoro; except at position 29, which is deoxy thymidine <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38) <223> all purines are 2'-O-methyl; except at positions 5 and 17, wherein guanosine is 2'-OH; and at position 32, wherein adenosine is 2'-OH <220> <221> misc_feature <222> (39)..(39) <223> thymidine at position 39 is a 3' inverted deoxy thymidine (3'-3' linked) <400> 58 cgccgcgguc ucaggcgcug agucugagtu uaccugcgt 39 <210> 59 <211> 39 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38) <223> all purines are 2'-O-methyl; except at positions 5 and 17, wherein guanosine is 2'-OH <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38) <223> all pyrimidines are 2'-fluoro; except at position 18, wherein cytosine is 2'-O-methyl; and position 19, wherein uridine is 2'-O-methyl <220> <221> misc_feature <222> (39)..(39) <223> thymidine at position 39 is a 3' inverted deoxy thymidine (3'-3' linked) <400> 59 cgccgcgguc ucaggcgcug agucugaguu uaccugcgt 39 <210> 60 <211> 39 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38) <223> all purines are 2'-O-methyl; except at positions 5 and 17, wherein guanosine is 2'-OH <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38) <223> all pyrimidines are 2'-fluoro; except at position 18, wherein cytosine is 2'-O-methyl; at position 19, wherein uridine is 2'-O-methyl; and at position 29, which is deoxy thymidine <220> <221> misc_feature <222> (39)..(39) <223> thymidine at position 39 is a 3' inverted deoxy thymidine (3'-3' linked) <400> 60 cgccgcgguc ucaggcgcug agucugagtu uaccugcgt 39 <210> 61 <211> 39 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> cytosine at position 1 is modified by a 20 kDa PEG attached to the nucleotide via an amine linker <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38) <223> all pyrimidines are 2'-fluoro <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38) <223> all purines are 2'-O-methyl; except at positions 5 and 17, wherein guanosine is 2'-OH, and at position 32, wherein adenosine is 2'-OH <220> <221> misc_feature <222> (39)..(39) <223> thymidine at position 39 is a 3' inverted deoxy thymidine (3'-3' linked) <400> 61 cgccgcgguc ucaggcgcug agucugaguu uaccugcgt 39 <210> 62 <211> 39 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> cytosine at position 1 is modified by a 30 kDa PEG attached to the nucleotide via an amine linker <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38) <223> all pyrimidines are 2'-fluoro <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38) <223> all purines are 2'-O-methyl; except at positions 5 and 17, wherein guanosine is 2'-OH, and at position 32, wherein adenosine is 2'-OH <220> <221> misc_feature <222> (39)..(39) <223> thymidine at position 39 is a 3' inverted deoxy thymidine (3'-3' linked) <400> 62 cgccgcgguc ucaggcgcug agucugaguu uaccugcgt 39 <210> 63 <211> 39 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> cytosine at position 1 is modified by a 5' amine linker <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38) <223> all pyrimidines are 2'-fluoro <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38) <223> all purines are 2'-O-methyl; except at positions 5 and 17, wherein guanosine is 2'-OH, and at position 32, wherein adenosine is 2'-OH <220> <221> misc_feature <222> (39)..(39) <223> thymidine at position 39 is a 3' inverted deoxy thymidine (3'-3' linked) <400> 63 cgccgcgguc ucaggcgcug agucugaguu uaccugcgt 39 <210> 64 <211> 39 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> cytosine at position 1 is modified by a 10 kDa PEG attached to the nucleotide via an amine linker <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38) <223> all pyrimidines are 2'-fluoro <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38) <223> all purines are 2'-O-methyl; except at positions 5 and 17, wherein guanosine is 2'-OH, and at position 32, wherein adenosine is 2'-OH <220> <221> misc_feature <222> (39)..(39) <223> thymidine at position 39 is a 3' inverted deoxy thymidine (3'-3' linked) <400> 64 cgccgcgguc ucaggcgcug agucugaguu uaccugcgt 39 <210> 65 <211> 39 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> cytosine at position 1 is modified by a linear 40 kDa PEG attached to the nucleotide via an amine linker <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38) <223> all pyrimidines are 2'-fluoro <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38) <223> all purines are 2'-O-methyl; except at positions 5 and 17, wherein guanosine is 2'-OH, and at position 32, wherein adenosine is 2'-OH <220> <221> misc_feature <222> (39)..(39) <223> thymidine at position 39 is a 3' inverted deoxy thymidine (3'-3' linked) <400> 65 cgccgcgguc ucaggcgcug agucugaguu uaccugcgt 39 <210> 66 <211> 38 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> cytosine at position 1 is modified by a 20 kDa PEG attached to the nucleotide via an amine linker <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38) <223> all pyrimidines are 2'-fluoro <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38) <223> all purines are 2'-O-methyl; except at positions 5 and 17, wherein guanosine is 2'-OH, and at position 32, wherein adenosine is 2'-OH <220> <221> misc_feature <222> (38)..(38) <223> guanosine at position 38 is modified by a 20 kDa PEG attached to the nucleotide via an amine linker <400> 66 cgccgcgguc ucaggcgcug agucugaguu uaccugcg 38 <210> 67 <211> 39 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> cytosine at position 1 is modified by a 40 kDa branched (2,3-bis(mPEG-[20 kDa])-propyl-1-carbamoyl) PEG attached to the nucleotide via an amine linker <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38) <223> all pyrimidines are 2'-fluoro <220> <221> misc_feature <222> (1)..(38) <223> all purines are 2'-O-methyl; except at positions 5 and 17, wherein guanosine is 2'-OH, and at position 32, wherein adenosine is 2'-OH <220> <221> misc_feature <222> (39)..(39) <223> thymidine at position 39 is a 3' inverted deoxy thymidine (3'-3' linked) <400> 67 cgccgcgguc ucaggcgcug agucugaguu uaccugcgt 39 <210> 68 <211> 46 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(46) <223> all pyrimidines are 2'-fluoro <400> 68 ggcgauuacu gggacggacu cgcgauguga gcccagacga cucgcc 46 <210> 69 <211> 40 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(40) <223> all pyrimidines are 2'-fluoro <400> 69 ggcuucugaa gauuauuucg cgaugugaac uccagacccc 40 <210> 70 <211> 92 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic template <220> <221> misc_feature <222> (40)..(69) <223> n may be any nucleotide (a, c, g, or t) <400> 70 taatacgact cactataggg agaggagaga acgttctacn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 60 nnnnnnnnng gtcgatcgat cgatcatcga tg 92 <210> 71 <211> 39 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic primer <400> 71 taatacgact cactataggg agaggagaga acgttctac 39 <210> 72 <211> 23 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic primer <400> 72 catcgatgat cgatcgatcg acc 23 <210> 73 <211> 22 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic fixed region <400> 73 gggagaggag agaacguucu ac 22 <210> 74 <211> 23 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic fixed region <400> 74 ggucgaucga ucgaucaucg aug 23 <210> 75 <211> 75 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(75) <223> wherein all purines are deoxy, and all pyrimidines are 2'-O-methyl <400> 75 gggagaggag agaacguucu accuugguuu ggcacaggca uacauacgca ggggucgauc 60 gaucgaucau cgaug 75 <210> 76 <211> 32 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(32) <223> wherein all purines are deoxy, and all pyrimidines are 2'-O-methyl <400> 76 ccuugguuug gcacaggcau acauacgcag gg 32 <210> 77 <211> 32 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(32) <223> wherein all purines are deoxy, and all pyrimidines are 2'-O-methyl <400> 77 ccuugguuug gcacaggcau acaaacgcag gg 32 <210> 78 <211> 25 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(25) <223> wherein all purines are deoxy, and all pyrimidines are 2'-O-methyl <400> 78 ggguuuggca caggcauaca uaccc 25 <210> 79 <211> 25 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(25) <223> wherein all purines are deoxy, and all pyrimidines are 2'-O-methyl <400> 79 ggguuuggca caggcauaca aaccc 25 <210> 80 <211> 32 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(32) <223> wherein all purines are deoxy, and all pyrimidines are 2'-O-methyl <400> 80 ggcggcacag gcauacauac gcaggggucg cc 32 <210> 81 <211> 47 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(47) <223> wherein all purines are deoxy, and all pyrimidines are 2'-O-methyl <400> 81 cguucuaccu ugguuuggca caggcauaca uacgcagggg ucgaucg 47 <210> 82 <211> 88 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic template <220> <221> misc_feature <222> (40)..(69) <223> n may be any nucleotide (a, t, c, or g) <400> 82 taatacgact cactataggg agaggagaga acgttctacn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 60 nnnnnnnnng ttacgactag catcgatg 88 <210> 83 <211> 39 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic template <400> 83 cttggtttgg cacaggcata catacgcagg ggtcgatcg 39 <210> 84 <211> 39 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic primer <400> 84 taatacgact cactataggg agaggagaga acgttctac 39 <210> 85 <211> 19 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic primer <400> 85 catcgatgct agtcgtaac 19 <210> 86 <211> 22 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic fixed region <400> 86 gggagaggag agaacguucu ac 22 <210> 87 <211> 19 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic fixed region <400> 87 guuacgacua gcaucgaug 19 <210> 88 <211> 80 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(80) <223> wherein all purines are deoxy, and all pyrimidines are 2'-O-methyl <400> 88 gggagaggag agaacguucu accuugguuu ggcacaggca uacauacgca ggggucgauc 60 gguuacgacu agcaucgaug 80 <210> 89 <211> 80 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(80) <223> wherein all purines are deoxy, and all pyrimidines are 2'-O-methyl <400> 89 gggagaggag agaacguucu accuugguuu ggcacaggca uacauacgca ggugucgauc 60 uguuacgacu agcaucgaug 80 <210> 90 <211> 80 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(80) <223> wherein all purines are deoxy, and all pyrimidines are 2'-O-methyl <400> 90 gggagaggag agaacguucu accuugguuu ggcacaggca uaaauacgca gggcucgauc 60 gguuacgacu agcaucgaug 80 <210> 91 <211> 80 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(80) <223> wherein all purines are deoxy, and all pyrimidines are 2'-O-methyl <400> 91 gggagaggag agaacguucu accuugguuu ggcccaggca uauauacgca gggauugauc 60 cguuacgacu agcaucgaug 80 <210> 92 <211> 78 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(78) <223> wherein all purines are deoxy, and all pyrimidines are 2'-O-methyl <400> 92 gggagaggag agaacguucu accuugguuu ggcgcaggca uacauacgca ggucgaucgg 60 uuacgacuag caucgaug 78 <210> 93 <211> 80 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(80) <223> wherein all purines are deoxy, and all pyrimidines are 2'-O-methyl <400> 93 gggagaggag agaacguucu accuuguugu ggcacagcca acccuacgca cggaucgccc 60 gguuacgacu agcaucgaug 80 <210> 94 <211> 69 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(69) <223> wherein all purines are deoxy, and all pyrimidines are 2'-O-methyl <400> 94 gggagaggag agaacguucu accuugguuu ggcacaggca uacauacgca ggucgaucgg 60 uuacgacua 69 <210> 95 <211> 79 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(79) <223> wherein all purines are deoxy, and all pyrimidines are 2'-O-methyl <400> 95 gggagaggag agaacguucu accuuagguu cgcacuguca uacauacaca cgggcaaucg 60 guuacgacua gcaucgaug 79 <210> 96 <211> 75 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(75) <223> wherein all purines are deoxy, and all pyrimidines are 2'-O-methyl <220> <221> misc_feature <222> (34)..(34) <223> n may be any nucleotide (a, t, u, c, or g) <220> <221> misc_feature <222> (43)..(43) <223> n may be any nucleotide (a, t, u, c, or g) <400> 96 gggagaggag agaacguucu accuugguuu ggcncaggca uanauacgca cgggucgauc 60 gguuacgacu agcau 75 <210> 97 <211> 80 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(80) <223> wherein all purines are deoxy, and all pyrimidines are 2'-O-methyl <400> 97 gggagaggag agaacguucu accuuucucu gccacaagca uaccuucgcg ggguucuauu 60 gguuacgacu agcaucgaug 80 <210> 98 <211> 79 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic aptamer <220> <221> misc_feature <222> (1)..(79) <223> wherein all purines are deoxy, and all pyrimidines are 2'-O-methyl <400> 98 gggagaggag agaacguucu accuugguuu ggcacaggca uauauacgca gggucgaucc 60 guuacgacua gcaucgaug 79 <210> 99 <211> 93 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> synthetic template <220> <221> misc_feature <222> (25)..(54) <223> n may be any nucleotide (a, t, c, or g) <400> 99 catcgatgct agtcgtaacg atccnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnncgagaa 60 cgttctctcc tctccctata gtgagtcgta tta 93 <210> 100 <211> 92 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic template <220> <221> misc_feature <222> (24)..(53) <223> n may be any nucleotide (a, t, c, or g) <400> 100 catgcatcgc gactgactag ccgnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnngtagaac 60 gttctctcct ctccctatag tgagtcgtat ta 92 <210> 101 <211> 92 <212> DNA <213> artificial <220> <223> synthetic template <220> <221> misc_feature <222> (24)..(53) <223> n may be any nucleotide (a, t, c, or g) <400> 101 catcgatcga tcgatcgaca gcgnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnngtagaac 60 gttctctcct ctccctatag tgagtcgtat ta 92 <210> 102 <211> 1676 <212> PRT <213> artificial <220> <223> synthetic C5 <400> 102 Met Gly Leu Leu Gly Ile Leu Cys Phe Leu Ile Phe Leu Gly Lys Thr 1 5 10 15 Trp Gly Gln Glu Gln Thr Tyr Val Ile Ser Ala Pro Lys Ile Phe Arg 20 25 30 Val Gly Ala Ser Glu Asn Ile Val Ile Gln Val Tyr Gly Tyr Thr Glu 35 40 45 Ala Phe Asp Ala Thr Ile Ser Ile Lys Ser Tyr Pro Asp Lys Lys Phe 50 55 60 Ser Tyr Ser Ser Gly His Val His Leu Ser Ser Glu Asn Lys Phe Gln 65 70 75 80 Asn Ser Ala Ile Leu Thr Ile Gln Pro Lys Gln Leu Pro Gly Gly Gln 85 90 95 Asn Pro Val Ser Tyr Val Tyr Leu Glu Val Val Ser Lys His Phe Ser 100 105 110 Lys Ser Lys Arg Met Pro Ile Thr Tyr Asp Asn Gly Phe Leu Phe Ile 115 120 125 His Thr Asp Lys Pro Val Tyr Thr Pro Asp Gln Ser Val Lys Val Arg 130 135 140 Val Tyr Ser Leu Asn Asp Asp Leu Lys Pro Ala Lys Arg Glu Thr Val 145 150 155 160 Leu Thr Phe Ile Asp Pro Glu Gly Ser Glu Val Asp Met Val Glu Glu 165 170 175 Ile Asp His Ile Gly Ile Ile Ser Phe Pro Asp Phe Lys Ile Pro Ser 180 185 190 Asn Pro Arg Tyr Gly Met Trp Thr Ile Lys Ala Lys Tyr Lys Glu Asp 195 200 205 Phe Ser Thr Thr Gly Thr Ala Tyr Phe Glu Val Lys Glu Tyr Val Leu 210 215 220 Pro His Phe Ser Val Ser Ile Glu Pro Glu Tyr Asn Phe Ile Gly Tyr 225 230 235 240 Lys Asn Phe Lys Asn Phe Glu Ile Thr Ile Lys Ala Arg Tyr Phe Tyr 245 250 255 Asn Lys Val Val Thr Glu Ala Asp Val Tyr Ile Thr Phe Gly Ile Arg 260 265 270 Glu Asp Leu Lys Asp Asp Gln Lys Glu Met Met Gln Thr Ala Met Gln 275 280 285 Asn Thr Met Leu Ile Asn Gly Ile Ala Gln Val Thr Phe Asp Ser Glu 290 295 300 Thr Ala Val Lys Glu Leu Ser Tyr Tyr Ser Leu Glu Asp Leu Asn Asn 305 310 315 320 Lys Tyr Leu Tyr Ile Ala Val Thr Val Ile Glu Ser Thr Gly Gly Phe 325 330 335 Ser Glu Glu Ala Glu Ile Pro Gly Ile Lys Tyr Val Leu Ser Pro Tyr 340 345 350 Lys Leu Asn Leu Val Ala Thr Pro Leu Phe Leu Lys Pro Gly Ile Pro 355 360 365 Tyr Pro Ile Lys Val Gln Val Lys Asp Ser Leu Asp Gln Leu Val Gly 370 375 380 Gly Val Pro Val Thr Leu Asn Ala Gln Thr Ile Asp Val Asn Gln Glu 385 390 395 400 Thr Ser Asp Leu Asp Pro Ser Lys Ser Val Thr Arg Val Asp Asp Gly 405 410 415 Val Ala Ser Phe Val Leu Asn Leu Pro Ser Gly Val Thr Val Leu Glu 420 425 430 Phe Asn Val Lys Thr Asp Ala Pro Asp Leu Pro Glu Glu Asn Gln Ala 435 440 445 Arg Glu Gly Tyr Arg Ala Ile Ala Tyr Ser Ser Leu Ser Gln Ser Tyr 450 455 460 Leu Tyr Ile Asp Trp Thr Asp Asn His Lys Ala Leu Leu Val Gly Glu 465 470 475 480 His Leu Asn Ile Ile Val Thr Pro Lys Ser Pro Tyr Ile Asp Lys Ile 485 490 495 Thr His Tyr Asn Tyr Leu Ile Leu Ser Lys Gly Lys Ile Ile His Phe 500 505 510 Gly Thr Arg Glu Lys Phe Ser Asp Ala Ser Tyr Gln Ser Ile Asn Ile 515 520 525 Pro Val Thr Gln Asn Met Val Pro Ser Ser Arg Leu Leu Val Tyr Tyr 530 535 540 Ile Val Thr Gly Glu Gln Thr Ala Glu Leu Val Ser Asp Ser Val Trp 545 550 555 560 Leu Asn Ile Glu Glu Lys Cys Gly Asn Gln Leu Gln Val His Leu Ser 565 570 575 Pro Asp Ala Asp Ala Tyr Ser Pro Gly Gln Thr Val Ser Leu Asn Met 580 585 590 Ala Thr Gly Met Asp Ser Trp Val Ala Leu Ala Ala Val Asp Ser Ala 595 600 605 Val Tyr Gly Val Gln Arg Gly Ala Lys Lys Pro Leu Glu Arg Val Phe 610 615 620 Gln Phe Leu Glu Lys Ser Asp Leu Gly Cys Gly Ala Gly Gly Gly Leu 625 630 635 640 Asn Asn Ala Asn Val Phe His Leu Ala Gly Leu Thr Phe Leu Thr Asn 645 650 655 Ala Asn Ala Asp Asp Ser Gln Glu Asn Asp Glu Pro Cys Lys Glu Ile 660 665 670 Leu Arg Pro Arg Arg Thr Leu Gln Lys Lys Ile Glu Glu Ile Ala Ala 675 680 685 Lys Tyr Lys His Ser Val Val Lys Lys Cys Cys Tyr Asp Gly Ala Cys 690 695 700 Val Asn Asn Asp Glu Thr Cys Glu Gln Arg Ala Ala Arg Ile Ser Leu 705 710 715 720 Gly Pro Arg Cys Ile Lys Ala Phe Thr Glu Cys Cys Val Val Ala Ser 725 730 735 Gln Leu Arg Ala Asn Ile Ser His Lys Asp Met Gln Leu Gly Arg Leu 740 745 750 His Met Lys Thr Leu Leu Pro Val Ser Lys Pro Glu Ile Arg Ser Tyr 755 760 765 Phe Pro Glu Ser Trp Leu Trp Glu Val His Leu Val Pro Arg Arg Lys 770 775 780 Gln Leu Gln Phe Ala Leu Pro Asp Ser Leu Thr Thr Trp Glu Ile Gln 785 790 795 800 Gly Val Gly Ile Ser Asn Thr Gly Ile Cys Val Ala Asp Thr Val Lys 805 810 815 Ala Lys Val Phe Lys Asp Val Phe Leu Glu Met Asn Ile Pro Tyr Ser 820 825 830 Val Val Arg Gly Glu Gln Ile Gln Leu Lys Gly Thr Val Tyr Asn Tyr 835 840 845 Arg Thr Ser Gly Met Gln Phe Cys Val Lys Met Ser Ala Val Glu Gly 850 855 860 Ile Cys Thr Ser Glu Ser Pro Val Ile Asp His Gln Gly Thr Lys Ser 865 870 875 880 Ser Lys Cys Val Arg Gln Lys Val Glu Gly Ser Ser Ser His Leu Val 885 890 895 Thr Phe Thr Val Leu Pro Leu Glu Ile Gly Leu His Asn Ile Asn Phe 900 905 910 Ser Leu Glu Thr Trp Phe Gly Lys Glu Ile Leu Val Lys Thr Leu Arg 915 920 925 Val Val Pro Glu Gly Val Lys Arg Glu Ser Tyr Ser Gly Val Thr Leu 930 935 940 Asp Pro Arg Gly Ile Tyr Gly Thr Ile Ser Arg Arg Lys Glu Phe Pro 945 950 955 960 Tyr Arg Ile Pro Leu Asp Leu Val Pro Lys Thr Glu Ile Lys Arg Ile 965 970 975 Leu Ser Val Lys Gly Leu Leu Val Gly Glu Ile Leu Ser Ala Val Leu 980 985 990 Ser Gln Glu Gly Ile Asn Ile Leu Thr His Leu Pro Lys Gly Ser Ala 995 1000 1005 Glu Ala Glu Leu Met Ser Val Val Pro Val Phe Tyr Val Phe His 1010 1015 1020 Tyr Leu Glu Thr Gly Asn His Trp Asn Ile Phe His Ser Asp Pro 1025 1030 1035 Leu Ile Glu Lys Gln Lys Leu Lys Lys Lys Leu Lys Glu Gly Met 1040 1045 1050 Leu Ser Ile Met Ser Tyr Arg Asn Ala Asp Tyr Ser Tyr Ser Val 1055 1060 1065 Trp Lys Gly Gly Ser Ala Ser Thr Trp Leu Thr Ala Phe Ala Leu 1070 1075 1080 Arg Val Leu Gly Gln Val Asn Lys Tyr Val Glu Gln Asn Gln Asn 1085 1090 1095 Ser Ile Cys Asn Ser Leu Leu Trp Leu Val Glu Asn Tyr Gln Leu 1100 1105 1110 Asp Asn Gly Ser Phe Lys Glu Asn Ser Gln Tyr Gln Pro Ile Lys 1115 1120 1125 Leu Gln Gly Thr Leu Pro Val Glu Ala Arg Glu Asn Ser Leu Tyr 1130 1135 1140 Leu Thr Ala Phe Thr Val Ile Gly Ile Arg Lys Ala Phe Asp Ile 1145 1150 1155 Cys Pro Leu Val Lys Ile Asp Thr Ala Leu Ile Lys Ala Asp Asn 1160 1165 1170 Phe Leu Leu Glu Asn Thr Leu Pro Ala Gln Ser Thr Phe Thr Leu 1175 1180 1185 Ala Ile Ser Ala Tyr Ala Leu Ser Leu Gly Asp Lys Thr His Pro 1190 1195 1200 Gln Phe Arg Ser Ile Val Ser Ala Leu Lys Arg Glu Ala Leu Val 1205 1210 1215 Lys Gly Asn Pro Pro Ile Tyr Arg Phe Trp Lys Asp Asn Leu Gln 1220 1225 1230 His Lys Asp Ser Ser Val Pro Asn Thr Gly Thr Ala Arg Met Val 1235 1240 1245 Glu Thr Thr Ala Tyr Ala Leu Leu Thr Ser Leu Asn Leu Lys Asp 1250 1255 1260 Ile Asn Tyr Val Asn Pro Val Ile Lys Trp Leu Ser Glu Glu Gln 1265 1270 1275 Arg Tyr Gly Gly Gly Phe Tyr Ser Thr Gln Asp Thr Ile Asn Ala 1280 1285 1290 Ile Glu Gly Leu Thr Glu Tyr Ser Leu Leu Val Lys Gln Leu Arg 1295 1300 1305 Leu Ser Met Asp Ile Asp Val Ser Tyr Lys His Lys Gly Ala Leu 1310 1315 1320 His Asn Tyr Lys Met Thr Asp Lys Asn Phe Leu Gly Arg Pro Val 1325 1330 1335 Glu Val Leu Leu Asn Asp Asp Leu Ile Val Ser Thr Gly Phe Gly 1340 1345 1350 Ser Gly Leu Ala Thr Val His Val Thr Thr Val Val His Lys Thr 1355 1360 1365 Ser Thr Ser Glu Glu Val Cys Ser Phe Tyr Leu Lys Ile Asp Thr 1370 1375 1380 Gln Asp Ile Glu Ala Ser His Tyr Arg Gly Tyr Gly Asn Ser Asp 1385 1390 1395 Tyr Lys Arg Ile Val Ala Cys Ala Ser Tyr Lys Pro Ser Arg Glu 1400 1405 1410 Glu Ser Ser Ser Gly Ser Ser His Ala Val Met Asp Ile Ser Leu 1415 1420 1425 Pro Thr Gly Ile Ser Ala Asn Glu Glu Asp Leu Lys Ala Leu Val 1430 1435 1440 Glu Gly Val Asp Gln Leu Phe Thr Asp Tyr Gln Ile Lys Asp Gly 1445 1450 1455 His Val Ile Leu Gln Leu Asn Ser Ile Pro Ser Ser Asp Phe Leu 1460 1465 1470 Cys Val Arg Phe Arg Ile Phe Glu Leu Phe Glu Val Gly Phe Leu 1475 1480 1485 Ser Pro Ala Thr Phe Thr Val Tyr Glu Tyr His Arg Pro Asp Lys 1490 1495 1500 Gln Cys Thr Met Phe Tyr Ser Thr Ser Asn Ile Lys Ile Gln Lys 1505 1510 1515 Val Cys Glu Gly Ala Ala Cys Lys Cys Val Glu Ala Asp Cys Gly 1520 1525 1530 Gln Met Gln Glu Glu Leu Asp Leu Thr Ile Ser Ala Glu Thr Arg 1535 1540 1545 Lys Gln Thr Ala Cys Lys Pro Glu Ile Ala Tyr Ala Tyr Lys Val 1550 1555 1560 Ser Ile Thr Ser Ile Thr Val Glu Asn Val Phe Val Lys Tyr Lys 1565 1570 1575 Ala Thr Leu Leu Asp Ile Tyr Lys Thr Gly Glu Ala Val Ala Glu 1580 1585 1590 Lys Asp Ser Glu Ile Thr Phe Ile Lys Lys Val Thr Cys Thr Asn 1595 1600 1605 Ala Glu Leu Val Lys Gly Arg Gln Tyr Leu Ile Met Gly Lys Glu 1610 1615 1620 Ala Leu Gln Ile Lys Tyr Asn Phe Ser Phe Arg Tyr Ile Tyr Pro 1625 1630 1635 Leu Asp Ser Leu Thr Trp Ile Glu Tyr Trp Pro Arg Asp Thr Thr 1640 1645 1650 Cys Ser Ser Cys Gln Ala Phe Leu Ala Asn Leu Asp Glu Phe Ala 1655 1660 1665 Glu Asp Ile Phe Leu Asn Gly Cys 1670 1675

Claims (88)

  1. 항-C5 제제(anti-C5 agent) 및 항-VEGF 제제(anti-VEGF agent)를 포함하는, 삼출성 나이 관련 황반 변성증(AMD)의 치료가 필요한 피험체의 삼출성 AMD를 치료하기 위한 약학적 조합물로서,
    상기 항-C5 제제는 C5 보체에 결합하고, 하기 식:
    Figure 712015000747969-pct00094
    [여기서,
    Figure 712015000747969-pct00095
    는 링커를 나타내고,
    앱타머는 fCmGfCfCGfCmGmGfUfCfUfCmAmGmGfCGfCfUmGmAmGfUfCfUmGmAmGfUfUfUAfCfCfUmGfCmG-3T(서열 번호 4)이며, 여기서 fC 및 fU는 2'-플루오로 뉴클레오티드이고, mG 및 mA는 2'-OMe 뉴클레오티드이며, 모든 다른 뉴클레오티드는 2'-OH이고, 3T는 인버티드 데옥시티미딘을 나타냄]을 갖는 PEG화 앱타머이고;
    상기 항-VEGF 제제는 라니비주맙(ranibizumab) 또는 베바시주맙(bevacizumab)이며;
    상기 항-C5 제제와 상기 항-VEGF 제제는 순차적으로 또는 동시에 투여되는 것인 약학적 조합물.
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서, 상기 링커가 알킬 링커인 약학적 조합물.
  4. 제3항에 있어서, 상기 알킬 링커가 2 내지 18개의 연속된 CH2 기를 포함하는 것인 약학적 조합물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 항-C5 제제가 하기 구조를 갖는 PEG화 앱타머인 약학적 조합물:
    Figure 712015000747969-pct00093
    여기서,
    앱타머는 fCmGfCfCGfCmGmGfUfCfUfCmAmGmGfCGfCfUmGmAmGfUfCfUmGmAmGfUfUfUAfCfCfUmGfCmG-3T(서열 번호 4)이고, 여기서 fC 및 fU는 2'-플루오로 뉴클레오티드이고, mG 및 mA는 2'-OMe 뉴클레오티드이며, 모든 다른 뉴클레오티드는 2'-OH이고, 3T는 인버티드 데옥시티미딘이다.
  6. 삭제
  7. 삭제
  8. 삭제
  9. 삭제
  10. 제1항에 있어서, 상기 항-C5 제제와 상기 항-VEGF 제제가 안구 투여, 유리체내 투여, 또는 안구 주변 투여에 의해 투여되는 것인 약학적 조합물.
  11. 제1항에 있어서, 상기 항-C5 제제와 상기 항-VEGF 제제가 피험체의 시력 수준을 유지하거나 개선시키기에 유효한 양으로 투여되는 것인 약학적 조합물.
  12. 제1항에 있어서, 상기 항-C5 제제와 상기 항-VEGF 제제 각각이 별개의 조성물로 존재하는 것인 약학적 조합물.
  13. 제1항에 있어서, 상기 항-C5 제제와 상기 항-VEGF 제제가 동일한 조성물로 존재하는 것인 약학적 조합물.
  14. 제12항 또는 제13항에 있어서, 상기 조성물이 데포 제형(depot formulation)인 약학적 조합물.
  15. 삭제
  16. 삭제
  17. 삭제
  18. 삭제
  19. 삭제
  20. 삭제
  21. 삭제
  22. 삭제
  23. 삭제
  24. 삭제
  25. 삭제
  26. 삭제
  27. 삭제
  28. 삭제
  29. 삭제
  30. 삭제
  31. 삭제
  32. 삭제
  33. 삭제
  34. 삭제
  35. 삭제
  36. 삭제
  37. 삭제
  38. 삭제
  39. 삭제
  40. 삭제
  41. 삭제
  42. 삭제
  43. 삭제
  44. 삭제
  45. 삭제
  46. 삭제
  47. 삭제
  48. 삭제
  49. 삭제
  50. 삭제
  51. 삭제
  52. 삭제
  53. 삭제
  54. 삭제
  55. 삭제
  56. 삭제
  57. 삭제
  58. 삭제
  59. 삭제
  60. 삭제
  61. 삭제
  62. 삭제
  63. 삭제
  64. 삭제
  65. 삭제
  66. 삭제
  67. 삭제
  68. 삭제
  69. 삭제
  70. 삭제
  71. 삭제
  72. 삭제
  73. 삭제
  74. 삭제
  75. 삭제
  76. 삭제
  77. 삭제
  78. 삭제
  79. 삭제
  80. 삭제
  81. 삭제
  82. 삭제
  83. 삭제
  84. 삭제
  85. 삭제
  86. 삭제
  87. 삭제
  88. 삭제
KR1020087024533A 2006-03-08 2007-03-08 안질환의 치료에 유용한 보체 결합 앱타머 및 항-ｃ5 제제 KR101513308B1 (ko)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US78090506P 2006-03-08 2006-03-08
US60/780,905 2006-03-08
US84827406P 2006-09-29 2006-09-29
US60/848,274 2006-09-29
PCT/US2007/006020 WO2007103549A2 (en) 2006-03-08 2007-03-08 Complement binding aptamers and anti-c5 agents useful in the treatment of ocular disorders

Related Child Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020157002274A Division KR20150017388A (ko) 2006-03-08 2007-03-08 안질환의 치료에 유용한 보체 결합 앱타머 및 항-ｃ5 제제
KR1020147014128A Division KR101584468B1 (ko) 2006-03-08 2007-03-08 안질환의 치료에 유용한 보체 결합 앱타머 및 항-ｃ5 제제

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20080100388A KR20080100388A (ko) 2008-11-17
KR101513308B1 true KR101513308B1 (ko) 2015-04-28

Family

ID=38475591

Family Applications (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020087024533A KR101513308B1 (ko) 2006-03-08 2007-03-08 안질환의 치료에 유용한 보체 결합 앱타머 및 항-ｃ5 제제
KR1020147014128A KR101584468B1 (ko) 2006-03-08 2007-03-08 안질환의 치료에 유용한 보체 결합 앱타머 및 항-ｃ5 제제
KR1020157002274A KR20150017388A (ko) 2006-03-08 2007-03-08 안질환의 치료에 유용한 보체 결합 앱타머 및 항-ｃ5 제제

Family Applications After (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020147014128A KR101584468B1 (ko) 2006-03-08 2007-03-08 안질환의 치료에 유용한 보체 결합 앱타머 및 항-ｃ5 제제
KR1020157002274A KR20150017388A (ko) 2006-03-08 2007-03-08 안질환의 치료에 유용한 보체 결합 앱타머 및 항-ｃ5 제제

Country Status (21)

Country Link
US (2) US20090269356A1 (ko)
EP (5) EP3034094A1 (ko)
JP (3) JP5406534B2 (ko)
KR (3) KR101513308B1 (ko)
CN (1) CN104623692A (ko)
AU (1) AU2007223796B2 (ko)
BR (1) BRPI0708588A2 (ko)
CA (4) CA3009854A1 (ko)
DK (2) DK2596807T3 (ko)
ES (2) ES2527695T3 (ko)
HK (3) HK1127281A1 (ko)
HU (1) HUE026496T2 (ko)
IL (1) IL193828A (ko)
MX (1) MX2008011323A (ko)
NZ (1) NZ571791A (ko)
PL (2) PL1991275T3 (ko)
PT (2) PT1991275E (ko)
RU (2) RU2477137C2 (ko)
SG (3) SG172686A1 (ko)
SI (2) SI2596807T1 (ko)
WO (1) WO2007103549A2 (ko)

Families Citing this family (90)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6395888B1 (en) * 1996-02-01 2002-05-28 Gilead Sciences, Inc. High affinity nucleic acid ligands of complement system proteins
EP1355666B1 (en) 2000-12-22 2012-06-13 Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Use of repulsive guidance molecule (RGM) and its modulators
US7803931B2 (en) 2004-02-12 2010-09-28 Archemix Corp. Aptamer therapeutics useful in the treatment of complement-related disorders
US8840893B2 (en) 2004-06-10 2014-09-23 Omeros Corporation Methods for treating conditions associated with MASP-2 dependent complement activation
CN101277974A (zh) 2005-09-30 2008-10-01 阿伯特有限及两合公司 排斥性引导分子(rgm)蛋白质家族的蛋白质的结合结构域及其功能性片段和它们的用途
CN104761637B (zh) 2006-03-31 2021-10-15 中外制药株式会社 调控抗体血液动力学的方法
SMP200800060B (it) 2006-04-07 2009-07-14 Procter & Gamble Anticorpi che legano la proteina umana tirosina fosfatasi beta (hptbeta) e loro usi
US7622593B2 (en) 2006-06-27 2009-11-24 The Procter & Gamble Company Human protein tyrosine phosphatase inhibitors and methods of use
MX2010003109A (es) * 2007-09-24 2010-04-01 Noxxon Pharma Ag Acidos nucleicos de enlace c5a.
BRPI0817294A2 (pt) 2007-09-26 2015-03-17 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Método de modificação do ponto isoelétrico de anticorpo via substituição de aminoácido em cdr.
TW200927169A (en) * 2007-11-07 2009-07-01 Alcon Res Ltd Complement Clq inhibitors for the prevention and treatment of glaucoma
KR20100105587A (ko) * 2007-11-08 2010-09-29 제넨테크, 인크. 항-인자 ｂ 항체 및 이들의 용도
US8962803B2 (en) 2008-02-29 2015-02-24 AbbVie Deutschland GmbH & Co. KG Antibodies against the RGM A protein and uses thereof
WO2009125825A1 (ja) 2008-04-11 2009-10-15 中外製薬株式会社 複数分子の抗原に繰り返し結合する抗原結合分子
US9891219B2 (en) 2008-10-10 2018-02-13 Mayo Foundation For Medical Education And Research Methods for treating neuromyelitis optica (NMO) by administration of eculizumab to an individual that is aquaporin-4 (AQP4)-IgG autoantibody positive
US20110125090A1 (en) * 2008-11-13 2011-05-26 Peyman Gholam A Ophthalmic drug delivery system and method
WO2010108657A2 (en) * 2009-03-23 2010-09-30 Noxxon Pharma Ag C5a binding nucleic acids and the use thereof
US9175075B2 (en) 2009-12-08 2015-11-03 AbbVie Deutschland GmbH & Co. KG Methods of treating retinal nerve fiber layer degeneration with monoclonal antibodies against a retinal guidance molecule (RGM) protein
US9320647B2 (en) 2010-03-31 2016-04-26 Ocuject, Llc Device and method for intraocular drug delivery
US9408746B2 (en) 2010-03-31 2016-08-09 Ocuject, Llc Device and method for intraocular drug delivery
WO2012070618A1 (ja) 2010-11-24 2012-05-31 株式会社カネカ 増幅核酸検出方法及び検出デバイス
RU2658504C9 (ru) 2010-11-30 2018-08-21 Чугаи Сейяку Кабусики Кайся Антигенсвязывающая молекула, способная многократно связываться с множеством антигенных молекул
PH12013501436A1 (en) 2011-01-04 2013-09-09 Novartis Ag Indole compounds or analogues thereof useful for the treatment of age-related macular degeneration (amd)
US9644035B2 (en) 2011-04-08 2017-05-09 Omeros Corporation Methods for treating conditions associated with MASP-2 dependent complement activation
AU2013201606B2 (en) * 2011-04-08 2016-02-25 Omeros Corporation Methods for treating conditions associated with MASP-2 dependent complement activation
WO2012139081A2 (en) 2011-04-08 2012-10-11 University Of Leicester Methods for treating conditions associated with masp-2 dependent complement activation
WO2012157479A1 (ja) 2011-05-13 2012-11-22 国立大学法人 東京大学 自己免疫疾患治療及び予防薬としてのｃｔｒｐ６
CN104039351A (zh) 2011-10-13 2014-09-10 阿尔皮奥治疗学股份有限公司 用于治疗血管渗漏综合征和癌症的方法
EA201491214A1 (ru) 2011-12-21 2015-02-27 Новартис Аг Композиции и способы применения антител, нацеленных на фактор p
MX362061B (es) 2012-01-10 2019-01-07 Noxxon Pharma Ag Ácidos nucleicos de enlace c5a nuevos.
CN104487455A (zh) 2012-01-27 2015-04-01 艾伯维德国有限责任两合公司 用于诊断和治疗与神经突变性相关的疾病的组合物和方法
US9808502B2 (en) 2012-02-20 2017-11-07 Swedish Orphan Biovitrum Ab (Publ) Polypeptides binding to human complement C5
US9421129B2 (en) 2012-04-02 2016-08-23 Ocuject, Llc Intraocular delivery devices and methods therefor
US9504603B2 (en) 2012-04-02 2016-11-29 Ocuject, Llc Intraocular delivery devices and methods therefor
US9783844B2 (en) * 2012-04-27 2017-10-10 Kaneka Corporation Method for amplifying nucleic acid and method for detecting amplified nucleic acid
HUE053727T2 (hu) * 2012-06-18 2021-07-28 Omeros Corp MASP-1 és/vagy MASP-2 és/vagy MASP-3 gátlására szolgáló készítmények és eljárások különbözõ betegségek és rendellenességek kezelésére
JP6155332B2 (ja) 2012-06-28 2017-06-28 ノバルティス アーゲー ピロリジン誘導体、および補体経路調節因子としてのその使用
WO2014002052A1 (en) 2012-06-28 2014-01-03 Novartis Ag Pyrrolidine derivatives and their use as complement pathway modulators
WO2014002058A2 (en) 2012-06-28 2014-01-03 Novartis Ag Complement pathway modulators and uses thereof
EP2867226B1 (en) 2012-06-28 2018-11-14 Novartis AG Complement pathway modulators and uses thereof
JP6209605B2 (ja) 2012-06-28 2017-10-04 ノバルティス アーゲー ピロリジン誘導体、および補体経路調節因子としてのその使用
CN104684910B (zh) 2012-07-12 2016-10-12 诺华股份有限公司 补体途经调节剂及其用途
CN112007045A (zh) 2012-07-13 2020-12-01 波涛生命科学有限公司 手性控制
CA2887050A1 (en) 2012-10-04 2014-04-10 Novelmed Therapeutics, Inc. Alternative pathway specific antibodies for treating hemolytic diseases
EP2912065A4 (en) 2012-10-25 2016-10-19 True North Therapeutics Inc ANTI COMPLEMENT C1S ANTIBODIES AND USES THEREOF
CN108610418B (zh) 2012-11-02 2022-11-01 美国比奥维拉迪维股份有限公司 抗补体C1s抗体和其用途
WO2014119969A1 (ko) * 2013-01-31 2014-08-07 서울대학교 산학협력단 보체 관련 질환의 예방 및 치료를 위한 c5 항체 및 방법
EP3312281A3 (en) 2013-03-14 2018-06-27 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Complement component c5 irna compositions and methods of use thereof
CA2897334A1 (en) 2013-03-29 2014-10-02 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for increasing the serum half-life of a therapeutic agent targeting complement c5
AU2014286996A1 (en) * 2013-07-12 2016-01-07 Iveric Bio, Inc. Methods for treating or preventing ophthalmological conditions
RU2733897C2 (ru) * 2013-08-28 2020-10-09 Сведиш Орфан Биовитрум Аб (Пабл) Стабильные полипептиды, связывающиеся с с5 комплемента человека
JP6654137B2 (ja) * 2013-09-16 2020-02-26 チルドレンズ ホスピタル メディカル センター Ｈｓｃｔ関連血栓性微小血管症の治療のための組成物及び方法
EP3054965B1 (en) * 2013-10-07 2021-04-14 Massachusetts Eye & Ear Infirmary Anti-factor d antibody for use in preventing or reducing retinal detachment
JP6691380B2 (ja) 2013-11-22 2020-04-28 株式会社カネカ 短鎖ｒｎａの検出方法
WO2015099838A2 (en) 2013-12-24 2015-07-02 Novelmed Therapeutics, Inc. Compositions and methods of treating ocular diseases
SG11201606379UA (en) * 2014-02-05 2016-09-29 Univ Deakin Aptamer construct
US9840553B2 (en) 2014-06-28 2017-12-12 Kodiak Sciences Inc. Dual PDGF/VEGF antagonists
WO2016040589A1 (en) * 2014-09-12 2016-03-17 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Polynucleotide agents targeting complement component c5 and methods of use thereof
WO2016044419A1 (en) * 2014-09-16 2016-03-24 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Complement component c5 irna compositions and methods of use thereof
CA3103560C (en) 2014-09-26 2023-01-17 Somalogic, Inc. Cardiovascular risk event prediction and uses thereof
US20160168237A1 (en) * 2014-12-12 2016-06-16 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Method for treating a complement mediated disorder caused by an infectious agent in a patient
RS62749B1 (sr) 2014-12-19 2022-01-31 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Anti-c5 antitela i načini njihove upotrebe
EA201791253A1 (ru) 2014-12-19 2018-04-30 Чугаи Сейяку Кабусики Кайся Антитела к миостатину, полипептиды, содержащие варианты fc-областей, и способы их применения
EA201792080A1 (ru) 2015-04-06 2018-03-30 БИОВЕРАТИВ ЮЭсЭй ИНК. Гуманизированные анти-c1s антитела и способы их применения
US11840564B2 (en) 2015-06-09 2023-12-12 Children's Hospital Medical Center Dosing algorithm for complement inhibitor
US10952992B2 (en) 2015-09-23 2021-03-23 Aerpio Pharmaceuticals, Inc. Methods of treating intraocular pressure with activators of Tie-2
BR112018009067A8 (pt) * 2015-12-18 2019-02-26 Chugai Pharmaceutical Co Ltd anticorpos anti-c5 e métodos de uso
SG11201805420SA (en) 2015-12-30 2018-07-30 Kodiak Sciences Inc Antibodies and conjugates thereof
EP3405577B8 (en) 2016-01-20 2023-02-15 396419 B.C. Ltd. Compositions and methods for inhibiting factor d
AU2017217677A1 (en) * 2016-02-08 2018-07-26 Vitrisa Therapeutics, Inc. Compositions with improved intravitreal half-life and uses thereof
US20190127453A1 (en) 2016-06-07 2019-05-02 Novartis Ag An anti-c5 antibody dosing regimen
KR102102734B1 (ko) 2016-08-05 2020-04-22 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 Il-8 관련 질환의 치료용 또는 예방용 조성물
WO2018136827A1 (en) 2017-01-20 2018-07-26 Vitrisa Therapeutics, Inc. Stem-loop compositions and methods for inhibiting factor d
JP7364221B2 (ja) 2017-03-06 2023-10-18 ザ トラスティーズ オブ ザ ユニバーシティ オブ ペンシルバニア 抗ｃ５抗体およびその使用
WO2019040397A1 (en) * 2017-08-21 2019-02-28 Ophthotech Corporation METHOD FOR TREATING OR PREVENTING MACULAR DEGENERATION OF THE NEOVASCULAR AGE
US12037389B2 (en) 2017-12-01 2024-07-16 Children's Hospital Medical Center Compositions for interferon blockade and methods of using same
CA3092588A1 (en) 2018-03-02 2019-09-06 Kodiak Sciences Inc. Il-6 antibodies and fusion constructs and conjugates thereof
WO2019210194A1 (en) * 2018-04-26 2019-10-31 Vitrisa Therapeutics, Inc. Pegylated compositions for ocular use, and methods thereof
EP3597222A1 (en) * 2018-07-16 2020-01-22 Easemedcontrol R & D GmbH & Co KG Treatment and diagnosis of unresolved inflammatory diseases
AU2019336214A1 (en) 2018-09-06 2021-04-29 Kira Pharmaceuticals (Us) Llc Humanized anti-C5 antibodies and uses thereof
WO2020109343A1 (en) 2018-11-29 2020-06-04 F. Hoffmann-La Roche Ag Combination therapy for treatment of macular degeneration
CA3138682A1 (en) 2019-04-29 2020-11-05 EyePoint Pharmaceuticals, Inc. Tie-2 activators targeting the schlemm's canal
AU2020364071A1 (en) 2019-10-10 2022-05-26 Kodiak Sciences Inc. Methods of treating an eye disorder
AU2020378982A1 (en) 2019-10-27 2022-05-26 Astellas Us Llc Anti-C5 agent for treatment of dry age-related macular degeneration (AMD) or geographic atrophy secondary to dry AMD
RU2738001C1 (ru) * 2020-03-23 2020-12-07 Борис Сергеевич Першин Способ определения риска развития цитомегаловирусного (ЦМВ) ретинита после трансплантации гемопоэтических стволовых клеток
US20230203176A1 (en) 2021-09-17 2023-06-29 Novartis Ag Methods For Prevention Of Graft Rejection In Xenotransplantation
WO2023183556A2 (en) * 2022-03-24 2023-09-28 Amcyte Pharma, Inc. Treatment for retinal disorders
WO2023212719A1 (en) * 2022-04-29 2023-11-02 Annexon, Inc. Compositions and methods for treating ocular diseases
IL317316A (en) 2022-06-30 2025-01-01 Astellas Us Llc Sustained-release silica hydrogel composites for treating ophthalmological conditions and methods of using them
WO2024059873A2 (en) * 2022-09-16 2024-03-21 Sirnaomics, Inc. Products and compositions

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004064760A2 (en) * 2003-01-21 2004-08-05 Archemix Corp. Aptamer therapeutics useful in ocular pharmacotherapy
WO2005079363A2 (en) * 2004-02-12 2005-09-01 Archemix Corporation Aptamer therapeutics useful in the treatment of complement-related disorders

Family Cites Families (91)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3710795A (en) * 1970-09-29 1973-01-16 Alza Corp Drug-delivery device with stretched, rate-controlling membrane
US5981481A (en) 1974-12-06 1999-11-09 The Johns Hopkins University Human C3b/C4b receptor (CR1)
US5212071A (en) * 1988-04-01 1993-05-18 The Johns Hopkins University Nucleic acids encoding a human C3b/C4b receptor (CR1)
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4959309A (en) * 1983-07-14 1990-09-25 Molecular Diagnostics, Inc. Fast photochemical method of labelling nucleic acids for detection purposes in hybridization assays
US5034506A (en) 1985-03-15 1991-07-23 Anti-Gene Development Group Uncharged morpholino-based polymers having achiral intersubunit linkages
US4683195A (en) * 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
GB2183661B (en) * 1985-03-30 1989-06-28 Marc Ballivet Method for obtaining dna, rna, peptides, polypeptides or proteins by means of a dna recombinant technique
US4987071A (en) 1986-12-03 1991-01-22 University Patents, Inc. RNA ribozyme polymerases, dephosphorylases, restriction endoribonucleases and methods
US4935363A (en) * 1987-03-30 1990-06-19 Board Of Regents, The University Of Texas System Sterol regulatory elements
US5256642A (en) 1988-04-01 1993-10-26 The Johns Hopkins University Compositions of soluble complement receptor 1 (CR1) and a thrombolytic agent, and the methods of use thereof
US5244805A (en) * 1989-05-17 1993-09-14 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Baculovirus expression vectors
US5225347A (en) 1989-09-25 1993-07-06 Innovir Laboratories, Inc. Therapeutic ribozyme compositions and expression vectors
US5070010A (en) * 1989-10-30 1991-12-03 Hoffman-La Roche Inc. Method for determining anti-viral transactivating activity
US5726017A (en) * 1990-06-11 1998-03-10 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. High affinity HIV-1 gag nucleic acid ligands
US5503978A (en) * 1990-06-11 1996-04-02 University Research Corporation Method for identification of high affinity DNA ligands of HIV-1 reverse transcriptase
US5635615A (en) * 1990-06-11 1997-06-03 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. High affinity HIV nucleocapsid nucleic acid ligands
US5648214A (en) 1990-06-11 1997-07-15 University Research Corporation High-affinity oligonucleotide ligands to the tachykinin substance P
US5637459A (en) 1990-06-11 1997-06-10 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: chimeric selex
US5527894A (en) * 1990-06-11 1996-06-18 Nexstar Pharmacueticals, Inc. Ligands of HIV-1 tat protein
US6011020A (en) 1990-06-11 2000-01-04 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. Nucleic acid ligand complexes
US5763177A (en) 1990-06-11 1998-06-09 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: photoselection of nucleic acid ligands and solution selex
US5707796A (en) * 1990-06-11 1998-01-13 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. Method for selecting nucleic acids on the basis of structure
US5660985A (en) 1990-06-11 1997-08-26 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. High affinity nucleic acid ligands containing modified nucleotides
US5270163A (en) 1990-06-11 1993-12-14 University Research Corporation Methods for identifying nucleic acid ligands
US5476766A (en) * 1990-06-11 1995-12-19 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. Ligands of thrombin
US5668264A (en) 1990-06-11 1997-09-16 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. High affinity PDGF nucleic acid ligands
US5472841A (en) * 1990-06-11 1995-12-05 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. Methods for identifying nucleic acid ligands of human neutrophil elastase
US5567588A (en) * 1990-06-11 1996-10-22 University Research Corporation Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: Solution SELEX
US5789157A (en) * 1990-06-11 1998-08-04 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: tissue selex
US5861254A (en) 1997-01-31 1999-01-19 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. Flow cell SELEX
US5683867A (en) 1990-06-11 1997-11-04 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: blended SELEX
US5654151A (en) * 1990-06-11 1997-08-05 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. High affinity HIV Nucleocapsid nucleic acid ligands
US5459015A (en) * 1990-06-11 1995-10-17 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. High-affinity RNA ligands of basic fibroblast growth factor
US6147204A (en) * 1990-06-11 2000-11-14 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. Nucleic acid ligand complexes
US6395888B1 (en) * 1996-02-01 2002-05-28 Gilead Sciences, Inc. High affinity nucleic acid ligands of complement system proteins
US5543293A (en) * 1990-06-11 1996-08-06 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. DNA ligands of thrombin
US5496938A (en) 1990-06-11 1996-03-05 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. Nucleic acid ligands to HIV-RT and HIV-1 rev
US5674685A (en) 1990-06-11 1997-10-07 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. High affinity PDGF nucleic acid ligands
KR970002255B1 (ko) 1990-06-11 1997-02-26 넥스스타 파아마슈티컬드, 인크. 핵산 리간드
US5763173A (en) * 1990-06-11 1998-06-09 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. Nucleic acid ligand inhibitors to DNA polymerases
US6140490A (en) 1996-02-01 2000-10-31 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. High affinity nucleic acid ligands of complement system proteins
US5705337A (en) * 1990-06-11 1998-01-06 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: chemi-SELEX
US5580737A (en) 1990-06-11 1996-12-03 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. High-affinity nucleic acid ligands that discriminate between theophylline and caffeine
US5672695A (en) 1990-10-12 1997-09-30 Max-Planck-Gesellschaft Zur Forderung Der Wissenschaften E.V. Modified ribozymes
AU732820B2 (en) 1995-06-02 2001-05-03 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. High-affinity oligonucleotide ligands to growth factors
WO1994004679A1 (en) 1991-06-14 1994-03-03 Genentech, Inc. Method for making humanized antibodies
CA2119930C (en) 1991-09-23 2002-10-01 Hendricus R. J. M. Hoogenboom Production of chimeric antibodies - a combinatorial approach
US5252216A (en) 1992-03-24 1993-10-12 Smithkline Beecham Corporation Protein purification
US5456909A (en) 1992-08-07 1995-10-10 T Cell Sciences, Inc. Glycoform fractions of recombinant soluble complement receptor 1 (sCR1) having extended half-lives in vivo
US5338671A (en) * 1992-10-07 1994-08-16 Eastman Kodak Company DNA amplification with thermostable DNA polymerase and polymerase inhibiting antibody
US5262564A (en) 1992-10-30 1993-11-16 Octamer, Inc. Sulfinic acid adducts of organo nitroso compounds useful as retroviral inactivating agents anti-retroviral agents and anti-tumor agents
US6169068B1 (en) * 1993-02-12 2001-01-02 Avant Immunotherpeutics, Inc. Pulmonary administration of soluble complement receptor-1 (sCR1) and its derivatives
US5428149A (en) * 1993-06-14 1995-06-27 Washington State University Research Foundation Method for palladium catalyzed carbon-carbon coulping and products
RU2073518C1 (ru) * 1993-06-17 1997-02-20 Совместное русско-американское акционерное общество закрытого типа "Неофарм" Средство, восстанавливающее функцию сетчатой оболочки глаза
WO1995001797A1 (en) 1993-07-09 1995-01-19 Smithkline Beecham Corporation Protein purification
US5817635A (en) * 1993-08-09 1998-10-06 Max-Planck-Gesellschaft Zur Forderung Der Wissenschaften E.V. Modified ribozymes
US5919455A (en) 1993-10-27 1999-07-06 Enzon, Inc. Non-antigenic branched polymer conjugates
US6074642A (en) 1994-05-02 2000-06-13 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Use of antibodies specific to human complement component C5 for the treatment of glomerulonephritis
US5932462A (en) * 1995-01-10 1999-08-03 Shearwater Polymers, Inc. Multiarmed, monofunctional, polymer for coupling to molecules and surfaces
US5723750A (en) 1995-01-12 1998-03-03 Vanderbilt University Transgenic plants expressing disassembly deficient viral coat proteins
US6013443A (en) * 1995-05-03 2000-01-11 Nexstar Pharmaceuticals, Inc. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: tissue SELEX
EP2080813B1 (en) * 1995-06-07 2011-01-05 Gilead Sciences, Inc. Nucleic acid ligands that bind to and inhibit DNA polymerases
US6229002B1 (en) * 1995-06-07 2001-05-08 Nexstar Pharmaceuticlas, Inc. Platelet derived growth factor (PDGF) nucleic acid ligand complexes
US6051698A (en) 1997-06-06 2000-04-18 Janjic; Nebojsa Vascular endothelial growth factor (VEGF) nucleic acid ligand complexes
DE122006000029I2 (de) 1996-10-25 2007-11-08 Gilead Sciences Inc Gefaesszellen Wachstumsfaktor (vegf) nukleinsäureligand-komplexe
US6278039B1 (en) 1997-05-28 2001-08-21 Axys Pharmaceuticals, Inc. C. elegans deletion mutants
US7419663B2 (en) * 1998-03-20 2008-09-02 Genentech, Inc. Treatment of complement-associated disorders
US6251588B1 (en) 1998-02-10 2001-06-26 Agilent Technologies, Inc. Method for evaluating oligonucleotide probe sequences
DE69926536T3 (de) * 1998-12-22 2013-09-12 Genentech, Inc. Antagonisten von vaskular-endothelialen zellwachstumsfaktoren und ihre anwendung
US20020102581A1 (en) * 1999-02-19 2002-08-01 Hageman Gregory S. Diagnostics and therapeutics for ocular disorders
US6110462A (en) 1999-03-03 2000-08-29 The Scripps Research Institute Enzymatic DNA molecules that contain modified nucleotides
AU4028800A (en) 1999-04-02 2000-10-23 City Of Hope Method for identifying accessible binding sites on rna
US7306799B2 (en) * 1999-06-08 2007-12-11 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Use of VEGF inhibitors for treatment of eye disorders
US6573299B1 (en) * 1999-09-20 2003-06-03 Advanced Medical Instruments Method and compositions for treatment of the aging eye
AU6110301A (en) * 2000-04-29 2001-11-12 Univ Iowa Res Found Diagnostics and therapeutics for macular degeneration-related disorders
US20020097408A1 (en) 2001-01-19 2002-07-25 Chang William Ho Output device for universal data output
US20040249130A1 (en) * 2002-06-18 2004-12-09 Martin Stanton Aptamer-toxin molecules and methods for using same
WO2003106659A2 (en) * 2002-06-18 2003-12-24 Archemix Corp. Aptamer-toxin molecules and methods for using same
WO2004041160A2 (en) * 2002-10-30 2004-05-21 University Of Kentucky Research Foundation Methods and animal model for analyzing age-related macular degeneration
AU2003294437A1 (en) * 2002-11-21 2004-06-18 Archemix Corporation Multivalent aptamer therapeutics with improved pharmacodynamic properties and methods of making and using the same
WO2004050899A2 (en) * 2002-12-03 2004-06-17 Archemix Corporation Method for in vitro selection of 2’-substituted nucleic acids
US20050037394A1 (en) * 2002-12-03 2005-02-17 Keefe Anthony D. Method for in vitro selection of 2'-substituted nucleic acids
CN102380098B (zh) * 2003-08-27 2015-07-22 奥普索特克公司 用于治疗眼新血管疾病的组合治疗
US7803931B2 (en) * 2004-02-12 2010-09-28 Archemix Corp. Aptamer therapeutics useful in the treatment of complement-related disorders
WO2005084412A2 (en) * 2004-03-05 2005-09-15 Archemix Corp. Controlled modulation of the pharmacokinetics and biodistribution of aptamer therapeutics
US7919094B2 (en) * 2004-06-10 2011-04-05 Omeros Corporation Methods for treating conditions associated with MASP-2 dependent complement activation
EP1907590B1 (en) * 2005-06-30 2012-09-19 Archemix LLC T7 rna polymerase and methods for the generation of fully 2'-modified nucleic acid transcripts
US7564805B1 (en) 2005-08-08 2009-07-21 At&T Intellectual Property, Ii, L.P. Systems, methods, and device for simulating capacity in a network
US9119701B2 (en) 2012-10-22 2015-09-01 Alcon Research, Ltd. Pressure control in phacoemulsification system
AU2015306082B2 (en) 2014-08-18 2020-04-30 Magnetica Limited Magnet for head and extremity imaging

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004064760A2 (en) * 2003-01-21 2004-08-05 Archemix Corp. Aptamer therapeutics useful in ocular pharmacotherapy
WO2005079363A2 (en) * 2004-02-12 2005-09-01 Archemix Corporation Aptamer therapeutics useful in the treatment of complement-related disorders

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Miho Nozaki et al., PNAS, VOL.103(7), pages 2328-2333 (2006.2.14. 공개)*

Also Published As

Publication number Publication date
PL1991275T3 (pl) 2015-04-30
CA3148917A1 (en) 2007-09-13
EP1991275A2 (en) 2008-11-19
JP2014172910A (ja) 2014-09-22
KR20150017388A (ko) 2015-02-16
JP5746232B2 (ja) 2015-07-08
CA3009846C (en) 2021-08-31
CN104623692A (zh) 2015-05-20
SG2014011290A (en) 2014-06-27
RU2008139901A (ru) 2010-04-20
WO2007103549A2 (en) 2007-09-13
CA2643951A1 (en) 2007-09-13
DK2596807T3 (en) 2016-03-07
ES2562423T3 (es) 2016-03-04
HK1127281A1 (en) 2009-09-25
SG172686A1 (en) 2011-07-28
WO2007103549A3 (en) 2007-12-27
HK1225996A1 (zh) 2017-09-22
EP2596807A1 (en) 2013-05-29
PL2596807T3 (pl) 2016-06-30
EP1991275B1 (en) 2014-11-05
MX2008011323A (es) 2008-11-18
CA3009854A1 (en) 2007-09-13
BRPI0708588A2 (pt) 2011-06-07
EP4159220A1 (en) 2023-04-05
AU2007223796B2 (en) 2013-01-24
NZ571791A (en) 2012-03-30
US20090269356A1 (en) 2009-10-29
JP5406534B2 (ja) 2014-02-05
SG10201706440RA (en) 2017-09-28
EP3360582A1 (en) 2018-08-15
DK1991275T3 (en) 2014-12-08
ES2527695T3 (es) 2015-01-28
KR20140072219A (ko) 2014-06-12
KR101584468B1 (ko) 2016-01-13
IL193828A0 (en) 2009-08-03
PT1991275E (pt) 2015-02-03
SI2596807T1 (sl) 2016-03-31
PT2596807E (pt) 2016-03-18
IL193828A (en) 2015-03-31
EP2596807B1 (en) 2015-12-16
EP3034094A1 (en) 2016-06-22
US20170145416A1 (en) 2017-05-25
SI1991275T1 (sl) 2015-03-31
HK1181308A1 (zh) 2013-11-08
JP2013067661A (ja) 2013-04-18
EP1991275A4 (en) 2009-07-08
RU2012153978A (ru) 2014-06-20
CA3009846A1 (en) 2007-09-13
AU2007223796A1 (en) 2007-09-13
HUE026496T2 (en) 2016-06-28
KR20080100388A (ko) 2008-11-17
CA2643951C (en) 2019-03-05
JP2009529058A (ja) 2009-08-13
RU2477137C2 (ru) 2013-03-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR101513308B1 (ko) 안질환의 치료에 유용한 보체 결합 앱타머 및 항-ｃ5 제제
JP5242918B2 (ja) 補体関連障害の治療に有用なアプタマー治療法
KR20150095956A (ko) 보체-관련 질환의 치료에 유용한 압타머 치료제
WO2018136831A1 (en) Pseudoknot compositions and methods for inhibiting factor d
AU2022202115A1 (en) Complement binding aptamers and anti-C5 agents useful in the treatment of ocular disorders
CN101443050A (zh) 治疗视觉失调中使用的补体结合适体和抗-c5药物
AU2016204713B2 (en) Complement Binding Aptamers and Anti-C5 Agents Useful in the Treatment of Ocular Disorders

Legal Events

Date Code Title Description
PA0105 International application

Patent event date: 20081007

Patent event code: PA01051R01D

Comment text: International Patent Application

PG1501 Laying open of application
A201 Request for examination
PA0201 Request for examination

Patent event code: PA02012R01D

Patent event date: 20120229

Comment text: Request for Examination of Application

N231 Notification of change of applicant
PN2301 Change of applicant

Patent event date: 20121204

Comment text: Notification of Change of Applicant

Patent event code: PN23011R01D

E902 Notification of reason for refusal
PE0902 Notice of grounds for rejection

Comment text: Notification of reason for refusal

Patent event date: 20130731

Patent event code: PE09021S01D

AMND Amendment
E90F Notification of reason for final refusal
PE0902 Notice of grounds for rejection

Comment text: Final Notice of Reason for Refusal

Patent event date: 20140226

Patent event code: PE09021S02D

A107 Divisional application of patent
AMND Amendment
PA0104 Divisional application for international application

Comment text: Divisional Application for International Patent

Patent event code: PA01041R01D

Patent event date: 20140526

E601 Decision to refuse application
PE0601 Decision on rejection of patent

Patent event date: 20141027

Comment text: Decision to Refuse Application

Patent event code: PE06012S01D

Patent event date: 20140226

Comment text: Final Notice of Reason for Refusal

Patent event code: PE06011S02I

Patent event date: 20130731

Comment text: Notification of reason for refusal

Patent event code: PE06011S01I

A107 Divisional application of patent
J201 Request for trial against refusal decision
PA0104 Divisional application for international application

Comment text: Divisional Application for International Patent

Patent event code: PA01041R01D

Patent event date: 20150127

PJ0201 Trial against decision of rejection

Patent event date: 20150127

Comment text: Request for Trial against Decision on Refusal

Patent event code: PJ02012R01D

Patent event date: 20141027

Comment text: Decision to Refuse Application

Patent event code: PJ02011S01I

Appeal kind category: Appeal against decision to decline refusal

Decision date: 20150327

Appeal identifier: 2015101000420

Request date: 20150127

AMND Amendment
PB0901 Examination by re-examination before a trial

Comment text: Amendment to Specification, etc.

Patent event date: 20150226

Patent event code: PB09011R02I

Comment text: Request for Trial against Decision on Refusal

Patent event date: 20150127

Patent event code: PB09011R01I

Comment text: Amendment to Specification, etc.

Patent event date: 20140526

Patent event code: PB09011R02I

Comment text: Amendment to Specification, etc.

Patent event date: 20130930

Patent event code: PB09011R02I

B701 Decision to grant
PB0701 Decision of registration after re-examination before a trial

Patent event date: 20150327

Comment text: Decision to Grant Registration

Patent event code: PB07012S01D

Patent event date: 20150305

Comment text: Transfer of Trial File for Re-examination before a Trial

Patent event code: PB07011S01I

PR0701 Registration of establishment

Comment text: Registration of Establishment

Patent event date: 20150413

Patent event code: PR07011E01D

PR1002 Payment of registration fee

Payment date: 20150413

End annual number: 3

Start annual number: 1

PG1601 Publication of registration
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20180330

Year of fee payment: 4

PR1001 Payment of annual fee

Payment date: 20180330

Start annual number: 4

End annual number: 4

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20190419

Year of fee payment: 5

PR1001 Payment of annual fee

Payment date: 20190419

Start annual number: 5

End annual number: 5

PR1001 Payment of annual fee

Payment date: 20200421

Start annual number: 6

End annual number: 6

PR1001 Payment of annual fee

Payment date: 20210330

Start annual number: 7

End annual number: 7

PR1001 Payment of annual fee

Payment date: 20220420

Start annual number: 8

End annual number: 8

PR1001 Payment of annual fee

Payment date: 20230328

Start annual number: 9

End annual number: 9

PR1001 Payment of annual fee

Payment date: 20240326

Start annual number: 10

End annual number: 10