KR101480495B1 - C형 간염바이러스의 표면 단백질 e2에 대한 압타머 및 이의 용도 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 C형 간염 바이러스 (Hepatitis C Virus, HCV) 표면 단백질 E2에 특이적으로 결합하는 압타머 및 이의 용도에 관한 것이다. 보다 상세하게, 본 발명은 C형 간염 바이러스 표면 단백질 E2에 특이적으로 결합하는 압타머, 및 상기 압타머를 이용하여 C형 간염 바이러스를 검출하거나, C형 간염 바이러스를 정량하거나, 또는 C형 간염을 진단하는 용도에 관한 것이다. 나아가, 본 발명은 상기 압타머를 이용하여 C형 간염 치료제를 모니터링 및 스크리닝 하는 방법에 관한 것이다.
Description
본 발명은 C형 간염 바이러스 (Hepatitis C Virus, HCV)의 표면 단백질 E2에 특이적으로 결합하는 압타머 및 이의 용도에 관한 것이다. 보다 상세하게, 본 발명은 C형 간염 바이러스 표면 단백질 E2에 특이적으로 결합하는 압타머, 및 상기 압타머를 이용하여 C형 간염 바이러스를 검출하거나, C형 간염 바이러스를 정량하거나, 또는 C형 간염을 진단하는 용도에 관한 것이다. 나아가, 본 발명은 상기 압타머를 이용하여 C형 간염 치료제를 모니터링 및 스크리닝 하는 방법에 관한 것이다.
현재 C형 간염 바이러스에 감염된 사람은 전세계인구의 약 3%정도이고 우리나라에서도 그 수가 점차 증가하고 있다. C형 간염 바이러스에 감염되면 80%정도는 만성감염으로 진행되고, 10% 정도의 환자에서 간경변과 간암으로 발전하여 목숨을 잃게 된다. 그럼에도 불구하고 C형 간염 바이러스에 특이적이고 효율적인 치료제가 개발되어 있지 않다. 따라서 C형 간염 바이러스를 검침하고 정량하는 것이 C형 간염 바이러스의 진단과 연구에서 매우 중요하다. 특히 바이러스의 감염도(infectivity)를 측정하는 것은 모든 연구와 진단의 기초가 되고 있고, 또한 항바이러스제 개발을 위해서 바이러스 증식 저해 능력을 모니터링 하는데도 감염도 측정이 반드시 필요하다.
C형 간염 바이러스는 대략 3,010개의 아미노산으로 구성된 중합 단백질을 해독하는 9,600개의 염기서열 길이의 단일 양성 가닥 RNA 게놈을 가지고 있다. 상기 중합 단백질의 전구체는 세포와 바이러스의 프로테아제에 의해 적어도 10개의 원숙한 구조적, 비구조적 단백질(C, E1, E2, p7, NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A, NS5B)로 된다.
현재 C형 간염 바이러스 감염도를 측정하는 방법에는 C형 간염 바이러스 단백질에 대한 항체를 이용한 항체염색 방법이 있다. 이 방법은 C형 간염 바이러스 단백질에 대한 항체를 이용해서 바이러스가 세포에 어느 정도 감염이 되는지를 확인하는 것이다. 그러나 이 방법은 바이러스를 세포에 감염시켜야 결과를 알 수 있기 때문에 시간이 오래 걸린다는 단점이 있고, 항체를 이용해서 감염된 세포를 염색한 뒤 감염된 세포를 일일이 세어야 하는 번거로움이 있는 방법이다.
또한, C형 간염 바이러스의 감염에 의해 발생하는 질환인 C형 간염의 진단 방법으로서, HCV 특이항원들을 사용하여 기존의 공지된 효소면역 측정법(ELISA immunoassay, EIA)원리에 따라 환자의 혈청으로부터 C형 간염 바이러스에 대한 항체를 검정하는 진단방법이 보고된 바 있으며 (한국등록특허 제236,765호), HCV의 표면 단백질들의 항원 결정기(epitope)를 밝히고 이들 항원결정기만을 융합시킨 단백질인 UB E1E2 단백질을 재조합 대장균에서 발현시키고(한국등록특허 제236,767호), 이 UB E1E2 단백질을 UB NS4 단백질과 융합시킨 UB NS4 E1E2 단백질을 재조합 대장균에서 발현시켜 이를 이용하여 더욱 정확한 C형 간염 환자의 진단을 가능케 하였다.
그러나 상기 ELISA방법을 이용한 진단의 경우, C형 간염 외의 다른 많은 간질환(예를 들면, 쓸개즙 간 경변증, 자가 면역성 간염, 잠원성 간 경변증 등)에 걸린 환자의 혈청들이 양성으로 나타나는 문제가 있고(Contreras M., et.al., Lancet 2, 505(1989);Cash J.D., et.al., Lancet 2 505 (1989)), 또 류마티스 관절염에 걸린 환자의 경우에는 약 60% 이상이 오르토사의 제1세대 C형 간염 진단방법에서 양성으로 나타났다는 보고도 있었다(Theilmann L. et.al., Lancet 335, 1346,(1990)). 이와 같은 사실은 기존의 ELISA 진단 방법의 경우 가양성(false positive)이 나타날 가능성이 높음을 시사한다.
따라서, 감염성이 있는 C형 간염 바이러스의 존재 여부를 검침하고 그 양을 측정하는 기존의 방법이 복잡하고, 효율적이지 않으며, 많은 시간이 필요하여 빠르고 쉬운 방법의 개발이 필요하다.
이에, 본 발명자들은 세포 밖으로 방출되는 C형 간염 바이러스 중에 표피 단백질이 없어서 감염하는 능력은 없지만 RNA와 캡시드(capsid) 단백질인 코어(core)를 가지고 있는 비감염성인 바이러스 구조체들(non-infectious HCV particles)이 있고, 그것의 수가 표피단백질이 있는 감염성이 있는 C형 간염 바이러스 보다 훨씬 많다 많다는 점에 착안하여, 실제 감염성이 있는 바이러스의 양을 측정하기 위해서는 C형 간염 바이러스 RNA나 코어(core) 단백질의 양을 재는 것이 아닌, 표피 단백질의 양을 정량함으로써 기존의 ELISA 진단방법보다 더욱 특이도가 높은 C형 간염 진단방법, C형 간염 바이러스의 검침 및 정량방법을 개발하고자 하였다.
그 결과 본 발명자들은 C형 간염 바이러스 표면 단백질 E2에 특이적으로 결합하는 압타머를 발굴하였고, 이를 이용하여 감염성이 있는 C형 간염 바이러스의 존재 여부를 검출 및 정량하고 C형 감염 질환을 정확하고 신속하게 진단할 수 있을 뿐만 아니라, C형 감염 치료제의 모니터링 및 치료제 개발에도 널리 활용할 수 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 실제 감염에 중요한 C형 간염 바이러스 표피 단백질 E2에 특이적으로 결합하는 압타머를 발굴하고, 이를 이용해서 감염성이 있는 C형 간염 바이러스의 존재 여부를 검출 및 정량하고 질환을 진단하는 다양한 용도를 제공하는 것이다.
보다 상세하게, 본 발명은 C형 간염 바이러스 E2 에 특이적으로 결합하고, U(uracil) 또는 dU(deoxyuracil)에 벤질기가 첨가되어 있는 변형된 염기를 5 내지 15개 포함하며, 총 25 내지 100개의 염기로 이루어진 압타머를 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한 본 발명은 상기 압타머를 포함하는, C형 간염 바이러스 검출용 조성물, 정량용 조성물, C형 간염 진단용 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한 본 발명은 C형 간염 바이러스 검출용 조성물을 포함하는 C형 간염 바이러스 검출용 키트를 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한 본 발명은 발명은 C형 간염 바이러스 정량용 조성물을 포함하는 C형 간염 바이러스 정량용 키트를 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한 본 발명은 C형 간염 진단용 조성물을 포함하는 C형 간염 진단용 키트를 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 또 다른 목적은 압타머가 고정된 기재를 포함하는 C형 간염 바이러스 검출용 칩을 제공하는 것이다.
또한 본 발명은 압타머가 고정된 기재를 포함하는, C형 간염 바이러스 정량용 칩을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한 본 발명은 압타머가 고정된 기재를 포함하는, C형 간염 바이러스 진단용 칩을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 또 다른 목적은 압타머를 시료와 반응시키는 단계를 포함하는, C형 간염 바이러스를 검출하는 방법을 제공하는 것이다.
또한 본 발명은 압타머를 시료와 반응시키는 단계를 포함하는, C형 간염 바이러스를 정량하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 또 다른 목적은 압타머를 환자의 시료와 반응시키는 단계를 포함하는, C형 간염 진단에 정보를 제공하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 항바이러스제 또는 C형 간염 치료제의 모니터링 방법을 제공하는 것이다. 바람직하게, C형 간염 바이러스, 또는 C형 간염 바이러스를 포함하는 시료에 항바이러스제 또는 C형 간염 치료제를 처리하는 단계, 및 상기 시료에서 항바이러스제 또는 C형 간염 치료제를 처리하기 전과 처리한 후의 압타머 결합 정도를 측정하는 단계를 포함한다.
또한 본 발명은 C형 간염 치료제의 스크리닝 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다. 바람직하게, C형 간염 바이러스, 또는 C형 간염 바이러스를 포함하는 시료에 C형 간염 치료제 후보물질을 처리하는 단계, 및 상기 시료에서 후보물질을 처리하기 전과 처리한 후의 압타머 결합 정도를 측정하는 단계를 포함한다.
상기 본 발명의 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 C형 간염 바이러스 E2 에 특이적으로 결합하고, U(uracil) 또는 dU(deoxyuracil)에 벤질기가 첨가되어 있는 변형된 염기를 5 내지 15개 포함하며, 총 25 내지 100개의 염기로 이루어진 압타머(aptamer)에 관한 것이다.
본 발명은 C형 간염 바이러스의 감염에 중요한 표피 단백질 E2에 결합하는 압타머들을 개발하고, 표피 단백질 E2의 서로 다른 부위에 결합하는 압타머 조합을 찾아내며, 이 압타머들을 이용하며 C형 간염 바이러스의 존재 유무를 판별하며 정량화할 수 있는 방법을 제공한다.
본 발명에서, 압타머란 특정 물질에 대해 높은 특이성과 친화도를 가지는 단일가닥 DNA(ssDNA) 또는 RNA 를 말한다. 압타머는 특정 물질에 대한 친화도가 매우 높고 안정하고, 비교적 단순한 방법으로 합성할 수 있으며, 결합력을 높이기 위해 다양한 변형이 가능하고, 세포, 단백질, 및 작은 유기물질까지도 표적물질이 될 수 있기 때문에, 그 특이성 및 안정성이 이미 개발되어 있는 항체에 비해 매우 높은 특징이 있다.
바람직하게, 본 발명의 압타머는 C형 간염 바이러스의 E2 단백질에 특이적으로 결합하는 압타머를 말하며, 상기 E2 단백질은 C형 간염 바이러스 유전형 2a (UniProtKB: Q99IB8), 1b (UniProtKB: Q9WMX2) 및 1a (UniProtKB: P27958)에서 유래된 것일 수 있다.
상기 압타머는 E2에 특이적으로 결합하는 것이라면 특별히 제한되지 않으나, 바람직하게는 U(uracil) 또는 dU(deoxyuracil)에 벤질기가 첨가되어 있는 변형된 염기를 포함하여 총 염기 길이가 25 내지 100개, 보다 바람직하게는 25 내지 80개, 더욱 바람직하게는 25 내지 50개의 염기로 이루어진 것일 수 있다. 상기 변형된 염기 이외의 본 발명의 E2 압타머에 사용되는 염기는 특별한 언급이 없는 한, A, G, C, U 이들의 deoxy 형태의 염기들로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있다.
상기 변형된 염기는, U(uracil) 또는 dU(deoxyuracil)에 소수성 작용기인 벤질기가 첨가됨으로써 변형되지 않은 경우와 비교하여 단백질과의 친화력(affinity)이 현저하게 높아지는 이점이 있다. 압타머 내의 상기 변형된 염기 개수는 5개 내지 15개일 수 있다.
바람직한 양태로서, 상기 압타머는 서열번호 1 내지 서열번호 4로 이루어진 군에서 선택된 염기서열을 포함하고, 총 염기길이가 25 내지 100개의 염기로 이루어진 것으로서, 이 때 상기 염기서열 중 U 은 U(uracil) 또는 dU(deoxyuracil)이거나, 벤질기가 첨가된 U(uracil) 또는 dU(deoxyuracil)것일 수 있다.
보다 바람직한 양태로서, 상기 압타머는 서열번호 1 내지 서열번호 4로 이루어진 군에서 선택된 염기서열을 포함하고, 총 염기길이가 25 내지 100개의 염기로 이루어진 것으로서, 이 때 상기 염기서열 중 U 은 벤질기가 첨가된 U(uracil) 또는 dU(deoxyuracil)일 수 있다.
더욱 바람직한 양태로서, 상기 압타머는 서열번호 1 내지 서열번호 4로 이루어진 군에서 선택된 염기서열을 포함하고, 총 염기길이가 25 내지 100개의 염기로 이루어진 것으로서, 이 때 상기 염기서열 중 U 은 벤질기가 첨가된 dU(deoxyuracil)일 수 있다.
가장 바람직한 양태로서, 상기 압타머는 서열번호 1 내지 서열번호 4로 이루어진 군에서 선택된 염기서열을 포함하고, 총 염기길이가 25 내지 100개의 염기로 이루어진 것으로서, 이 때 상기 염기서열 중 U 은 벤질아미노카보닐-데옥시우리딘(benzylaminocarbonyl-dUridine) 일 수 있다.
또한, 상기 압타머는, 혈청 내 안정성 증진을 위하여, 5' 말단 부위, 중간 부위, 3' 말단 부위, 또는 양 말단 부위에 폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycol, PEG), idT (inverted deoxythymidine), LNA (Locked Nucleic Acid), 2'-메톡시 뉴클레오사이드, 2'-아미노 뉴클레오사이드, 2'F-뉴클레오사이드, 아민 링커, 티올 링커 및 콜레스테롤로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 것이 결합되어 변형된 것일 수 있다.
상기 idT (inverted deoxythymidine)는 일반적으로 뉴클레아제에 대한 내성이 약한 압타머의 뉴클레아제에 의한 분해를 막기 위하여 사용되는 분자 중 하나로서, 핵산단위체는 앞 단위체의 3'-OH와 다음 단위체의 5'-OH와 결합하여 사슬을 이루지만, idT는 앞 단위체의 3'-OH와 다음 단위체의 3'-OH를 결합하여 3'-OH가 아닌 5'-OH가 노출이 되도록 인위적인 변화를 가함으로써 뉴클레아제의 일종인 3' 엑소뉴클레아제(3' exonuclease)에 의한 분해를 억제하는 효과를 일으키는 분자이다.
바람직하게, 상기 압타머는 이합체, 삼합체 또는 사합체일 수 있다.
후술하는 실시예 2에서도 뒷받침되는 바와 같이, 본 발명에서 다중 압타머와 단일 압타머를 이용하여 바이러스 검침을 비교해 본 결과, 다중 압타머가 더 강한 민감도를 나타냄을 알 수 있었다.
C형 간염 바이러스의 구조를 살펴보면 바깥쪽에 표피(envelope)가 있고 그 안쪽으로는 게놈을 감싸고 있는 캡시드(capsid)로 이루어져 있다. 바이러스가 숙주세포에 감염하기 위해서는 세포 표면에 있는 단백질과 바이러스 표피에 있는 표피단백질(envelope protein)의 상호작용이 필수적이다. 알려진 바에 의하면 표피단백질 E2와 세포표면 단백질들인 CD81, claudin 1 및 SR-B1 등의 직접적인 결합이나 간접적인 상호작용에 의해서 바이러스가 세포 안으로 들어가게 된다. 그리고 최근 연구에 의하면 C형 간염 바이러스의 경우에 표피단백질이 있는 바이러스와 없는 바이러스로 나뉘게 되는데 표피단백질이 있는 바이러스가 강한 감염성을 가지고 있다고 알려져 있다.
본 발명자들은 상기 압타머가 E2 단백질 및 감염성 있는 바이러스에 결합하는 것을 이용하여 C형 간염 바이러스를 검출 및 정량할 수 있다는 것을 확인하였다 (실시예 2 및 실시예 3 참조).
따라서, 본 발명의 압타머는 C형 간염 바이러스를 검출 및 정량하는 용도로 사용될 수 있으며, 나아가 C형 간염 바이러스의 감염에 의하여 발생하는 C형 감염 질환을 진단하는 용도로 사용될 수 있다. 이러한 바이러스의 검출, 정량 및 질환 진단 용도는 조성물, 키트, 칩 등의 형태로 다양하게 구현될 수 있다.
이에, 또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기한 바와 같은 압타머를 포함하는, C형 간염 바이러스 검출용 조성물에 관한 것이다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 압타머를 포함하는, C형 간염 바이러스를 정량용 조성물에 관한 것이다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 압타머를 포함하는, C형 간염 진단용 조성물에 관한 것이다.
종래 바이러스를 정량하는 방법으로서 바이러스 DNA량을 PCR에 의해 정량하는 방법 등이 알려져 있으며, 레트로 바이러스의 경우 바이러스 DNA량을 정량적 PCR에 의해 측정할 때, 표지 서열을 포함하는 바이러스 핵산을 포함하는 레트로 바이러스를 내부 표준으로서 이용하는 방법도 개시되어 있다 (국제특허공개 WO95/034684). 또한 바이러스 단백질의 양을 측정하는 방법으로 바이러스 단백질에 대한 항체를 이용한 면역 측정법으로서 샌드위치 ELISA법 등이 있으며 (Gerna, G.,et.al., J.Chn.Microbiol.,(1983) 17:942-944), 용액 중의 바이러스 농도를 높여서 측정하는 초원심법 등이 있다. 이러한 방법들은 고가의 기기와 긴 분리 시간을 요하고, 작업에 있어서 많은 노력을 필요로 하며, 정확도가 떨어지는 단점이 있다.
이에, 본 발명은 C형 간염 바이러스의 E2 단백질에 특이적으로 결합하는 압타머를 시료와 반응시킴으로써, 신속하고 정확하게 C형 간염 바이러스의 존재 및 존재량을 확인할 수 있는 기술을 제공한다. 나아가, 본 발명의 압타머를 이용한 C형 간염 바이러스의 검출, 정량 및 진단 기술은 본 발명자가 개발한, 소위 ELASA(Enzyme Linked Apto-Sorbent Assay) 방법에 의해 구현될 수 있다. 상기 ELASA는 바이러스의 표피단백질의 양을 정량하는 것으로서 C형 간염 바이러스 감염여부에 대한 정확도를 높이고, 포획압타머와 탐지압타머를 사용하여 흡광도를 측정함으로서 보다 간편하게 C형 간염 바이러스의 검출 및 정량을 수행할 수 있는 기술을 말한다. 또한 C형 간염 바이러스의 검출 및 정량이 보다 정확하고 용이해짐으로써 C형 간염의 감염여부 진단이 더 정확하도록 할 수 있다.
이하에서는, 본 발명의 압타머를 이용한 C형 간염 바이러스의 검출, 정량 및 진단 기술을 구현하기 위한 각종 구현예로서, 키트, 칩, 그리고 검출 방법, 정량 방법 및 질환 진단 방법에 대하여 보다 상세하게 설명한다.
하나의 양태로서, 본 발명은 상기 C형 간염 바이러스 검출용 조성물을 포함하는 C형 간염 바이러스 검출용 키트에 관한 것이다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 C형 간염 바이러스 정량용 조성물을 포함하는 C형 간염 바이러스 정량용 키트에 관한 것이다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 C형 간염 진단용 조성물을 포함하는, C형 간염 진단용 키트에 관한 것이다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 압타머가 고정된 기재를 포함하는, C형 간염 바이러스 검출용 칩에 관한 것이다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 압타머가 고정된 기재를 포함하는, C형 간염 바이러스 정량용 칩에 관한 것이다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 압타머가 고정된 기재를 포함하는, C형 간염 바이러스 진단용 칩에 관한 것이다.
상기 키트 및 칩은 C형 간염 바이러스에 특이적으로 결합하는 본 발명의 압타머를 포함하고 있으며, 압타머에는 당업계에 널리 사용되는 검출 표지들, 예를 들어 바이오틴 잔기가 부착될 수 있다. 바이오틴이 부착된 압타머에 표지물질을 도입한 다음, 이의 분석을 통해 C형 간염 바이러스의 검출, 정량 및 진단에 이용할 수 있다. 바이오틴에 사용되는 표지물질로서 다양한 공지된 분석용 표지물질이 사용될 수 있으며, 예를 들면, 스트렙타비딘, 아비딘, Cy3, Cy5, Alexa, BODIPY, Rhodamine 또는 Q-dot 등을 사용하여 형광분석을 할 수 있다. 또한 C형 간염 바이러스 검출을 위한 압타머에는 바이오틴 잔기 외에도, 기타 형광물질, 자성체, 염색물질, 효소, 방사성동위원소 등과 같은 통상의 표지 물질로 표지할 수 있으며, 통상의 검출 수단, 예를 들어, 형광 현미경, Radioimmnodetection(RAID) 등을 통하여 검출할 수 있다.
또한, 상기 키트 및 칩은 압타머와 시료 내 C형 간염 바이러스의 결합 여부를 정성 또는 정량적으로 측정하는 데 사용할 수 있는 각종 도구 또는 시약으로서, 지지체(기재), 완충용액, 반응 정지제, 용해제, 세척제 또는 안정화제 등을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에서 압타머가 고정된 기재는, 예컨대 고체 기재로서 고분자, 유리, 금, 종이 및 생체막(membrane)으로 이루어진 군에서 선택된 것을 사용할 수 있다. 보다 구체적으로는, 폴리스틸렌, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리에스테르, 폴리아크릴로니트릴, 불소 수지, 아가로스, 셀룰로즈, 니트로셀룰로즈, 덱스트란, 세파덱스, 세파로즈, 리포솜, 카복시메틸 셀룰로즈, 폴리아크릴아미드, 폴리스테린, 반려암, 여과지, 이온교환수지, 플라스틱 필름, 플라스틱 튜브, 폴리아민-메틸 비닐-에테르-말레산 공중합체, 아미노산 공중합체, 에틸렌-말레산 공중합체, 나일론, 금속, 유리, 글래스 비드, 또는 자성 입자 등을 사용할 수 있다. 그 외의 다른 고체 기질로는 세포 배양 플레이트, ELISA 플레이트, 튜브 및 폴리머성 막 등을 사용할 수 있다. 상기 기재는 임의의 가능한 형태, 예를 들어 구형 (비드), 원통형 (시험관 또는 웰 내면), 평면형 (시트, 시험 스트립)을 가질 수 있다.
보다 바람직하게는 멀티 웰 플레이트(예를 들어, 24웰, 96웰, 192웰, 384웰, 576웰 등)를 사용할 수 있다.
본 발명의 압타머가 칩으로 구현되는 경우, 하나 이상의 압타머가 고체 기재 위의 정해진 위치에 배열되어 고밀도로 고정화되어 있는 칩으로 사용될 수 있다. 상기 칩에 대상 시료를 처리하여 시료 내 C형 간염 바이러스와 압타머가 결합체를 형성했는지 여부를 판독함으로써, 시료 내 C형 간염 바이러스의 존재 여부를 확인할 수 있다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 압타머를 시료와 반응시키는 단계를 포함하는, C형 간염 바이러스를 검출하는 방법에 관한 것이다.
보다 구체적으로, 본 발명은
제1 압타머를 고체 기재에 고정화하는 단계,
상기 고체 기재에 시료를 처리하는 단계, 및
상기 고체 기재에 검출표지가 결합된, 제2 압타머를 처리하는 단계를 포함하며,
상기 제1 압타머 및 제2 압타머는 서로 다른 종류의 것임을 특징으로 하는, 시료 내 C형 간염 바이러스를 검출하는 방법을 제공한다.
바람직하게, 제2 압타머는 바이오틴 잔기 등의 검출 표지를 가지고 있어 스트랍타비딘과 결합할 수 있으며, C형 간염 바이러스의 검출은 스트랍타비딘에 결합된 호그래디쉬 퍼락시데이스(streptavidin conjugated HRP)의 활성을 재는 방법으로 수행할 수 있다. 예를 들어, 호그래디쉬 퍼락시데이스에서 나오는 화학발광을 흡광도 450nm에서 측정하는 방법으로 수행할 수 있다. 상기 C형 간염 바이러스 검출을 위한 제2 압타머에는 바이오틴 잔기 외에도, 기타 형광물질, 자성제, 염색물질, 효소, 방사성동위원소 등과 같은 통상의 표지 물질로 표지할 수 있다. 상기 제2 압타머는 제1 압타머와는 다른 E2 단백질 결합 부위와 반응할 수 있기 때문에 신호 증폭이 발생하여 압타머 및 시료 간의 상호작용 유무에 대한 가시적인 확인이 용이하며, 통상의 검출 수단, 예를 들어, 형광 현미경, Radioimmnodetection(RAID) 등을 통하여 검출할 수 있으며, 후술하는 정량방법에도 이용할 수 있다.
또한, 바람직하게, 상기 제1 압타머(포획 압타머)는 서열번호 2의 압타머이고 제2 압타머(탐지 압타머)는 서열번호 4의 압타머인 경우 바이러스를 검출하는 효과가 특히 우수하다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 압타머를 시료와 반응시키는 단계를 포함하는, C형 간염 바이러스를 정량하는 방법에 관한 것이다.
보다 구체적으로, 본 발명은
제1 압타머를 고체 기재에 고정화하는 단계,
상기 고체 기재에 시료를 처리하는 단계, 및
상기 고체 기재에 검출표지가 결합된 제2 압타머를 처리하는 단계를 포함하며,
상기 제1 압타머 및 제2 압타머는 서로 다른 종류의 것임을 특징으로 하는,
시료 내 C형 간염 바이러스를 정량하는 방법을 제공한다.
바람직하게, 상기 제1 압타머(포획 압타머)는 서열번호 2의 압타머이고 제2 압타머(탐지 압타머)는 서열번호 4의 압타머인 경우 바이러스를 정량하는 효과가 특히 우수하다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은, 상기 압타머를 환자의 시료와 반응시키는 단계를 포함하는, C형 간염 진단에 정보를 제공하는 방법에 관한 것이다.
보다 구체적으로, 본 발명은
상기 압타머를 환자의 시료와 반응시키는 단계, 및
상기 환자의 시료에서의 압타머의 결합 정도를 측정하는 단계를 포함하고,
상기 환자의 시료에서의 압타머의 결합 정도가 정상 시료에서의 결합 정도보다 높은 경우 상기 환자를 C형 간염 환자로 판단하는 것을 특징으로 하는, C형 간염 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
본 발명에서의 "시료"는 C형 간염 바이러스를 함유하거나 또는 함유할 것으로 추정되는 임의의 물질을 말한다. 시료는 천연 또는 합성된 것일 수 있고, 통상의 기술자에게 공지된 임의 수단을 통해 수득될 수 있다. 시료는 조직, 세포, 전혈, 혈장, 혈청, 혈액, 타액, 객담, 림프액, 뇌척수액, 세포간액 또는 뇨 뿐만 아니라, 시험관 내 세포 배양 성분의 시료, 예를 들면, 세포 성분, 세포배양배지, 재조합세포 등을 포함할 수 있다.
본 발명에서 "환자의 시료"는 C형 간염 질환의 발병 여부를 판단할 대상개체로부터 얻어진 생물학적 시료를 말하며, 조직, 세포, 전혈, 혈장, 혈청, 혈액, 타액, 객담, 림프액, 뇌척수액, 세포간액 또는 뇨일 수 있다.
본 발명에서 "정상 시료"는 C형 간염 질환이 발병하지 않은 개체로부터 얻어진 생물학적 시료를 말한다.
상기 생물학적 시료에서 압타머의 결합 정도를 측정하는 단계는 관련 기술분야에서 통상적으로 사용되는 DNA 압타머 결합 측정 기술을 이용하여 수행될 수 있으며, 예컨대, 압타머 말단에 형광 또는 방사성 물질 표지하거나 비오틴을 결합시켜 형광 또는 방사성 세기를 측정하거나, 이미지화하여 관찰하는 방법 등을 이용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은
C형 간염 바이러스, 또는 C형 간염 바이러스를 포함하는 시료에 항바이러스제 또는 C형 간염 치료제를 처리하는 단계,
상기 시료에 압타머를 처리하는 단계, 및
상기 시료에서 항바이러스제 또는 C형 간염 치료제를 처리하기 전과 처리한 후의 압타머 결합 정도를 측정하는 단계를 포함하는,
항바이러스제 또는 C형 간염 치료제의 모니터링 방법에 관한 것이다.
본 발명에서는 항바이러스제 또는 C형 간염 치료제를 처리한 시료에 대하여 본 발명의 압타머를 처리하여 압타머의 결합 정도의 변화를 측정함으로써, 해당 항바이러스제 또는 C형 간염 치료제의 바이러스 저해능 및 치료 효과를 모니터링 할 수 있다. 예를 들어, 항바이러스제 또는 C형 간염 치료제의 처리에 따라 시료 내 압타머 결합체의 검출 정도가 감소하는 경우, 해당 항바이러스제 또는 C형 간염 치료제의 항바이러스 효과 및 치료 효과가 우수한 것으로 판단할 수 있다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은
C형 간염 바이러스, 또는 C형 간염 바이러스를 포함하는 시료에 C형 간염 치료제 후보물질을 처리하는 단계,
상기 시료에 압타머를 처리하는 단계, 및
상기 시료에서 후보물질을 처리하기 전과 처리한 후의 압타머 결합 정도를 측정하는 단계를 포함하는,
C형 간염 치료제의 스크리닝 방법에 관한 것이다.
본 발명에서는 C형 간염 치료제 후보물질을 처리한 시료에 대하여 본 발명의 압타머를 처리하여 압타머 결합 정도의 변화를 측정함으로써, 해당 후보물질의 바이러스 저해능 및 치료 효과를 결정할 수 있다. 예를 들어, 후보물질의 처리에 따라 시료 내 압타머 결합체의 검출 정도가 감소하는 경우, 해당 후보물질을 C형 간염 치료제로 선별할 수 있다.
본 발명은 C형 간염 바이러스의 감염 여부를 판별하는데 사용할 수 있으며, 감염성이 있는 C형 간염 바이러스의 양을 측정할 수 있으며, C형 간염 바이러스에 대한 치료제의 개발을 위한 항바이러스 효과의 측정 도구로 사용할 수 있어, 기존의 방법보다 훨씬 간단하고 빠르게 C형 간염 바이러스의 감염 여부를 판단할 수 있다. 또한 C형 간염 바이러스의 검출 및 정량을 함에 있어서 용이하면서도 보다 정확할 수 있으며, C형 간염 치료제의 치료효과를 측정할 수 있다.
도 1은 압타머 스크리닝을 위해 C형 간염 바이러스 E2 단백질의 분리정제 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 벤질기가 붙어 있는 변형된 염기(benzylaminocarbonyl-dUridine)의 구조를 나타낸 것이다.
도 3은 E2 압타머를 이용한 샌드위치 방식 에세이 과정을 그림으로 나타낸 것이다.
도 4는 여러 가지 E2 압타머 쌍 중 가장 효율이 높은 것을 찾은 결과를 나타낸다.
도 5는 단일 탐지 압타머를 이용한 탐지 과정을 그림으로 나타낸 것이다.
도 6은 단일 압타머 와 다중 압타머의 효율을 농도별로 비교한 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 ELASA를 이용해서 C형 간염 바이러스의 E2 단백질을 농도별로 검침한 결과를 나타내는 것으로, (a)는 유전형 2a인 C형 간염 바이러스의 E2 단백질, (b)는 유전형 1a인 C형 간염 바이러스의 E2 단백질, (c)는 유전형 1b인 C형 간염 바이러스의 E2 단백질에 관한 것이다.
도 8은 ELASA를 이용하여 C형 간염 바이러스를 감염 농도별로 검침한 결과를 나타내는 것으로서, (a)는 유전형 2a인 C형 간염 바이러스, (b)는 유전형 1a인 C형 간염 바이러스에 관한 것이다.
도 9는 항바이러스제를 처리 하였을 때 바이러스가 증식하지 못하거나 치료되는 과정을 ELASA를 이용해 모니터링 한 것을 나타낸 것이다. (a)는 항바이러스제 처리시 배양액에 나오는 바이러스의 양을 나타내었으며, (b)는 바이러스에 감염된 세포에 항바이러스제 처리시의 치료 효과를 나타내었다.
도 10은 바이러스 감염도와 ELASA값의 상관관계를 그래프로 보여주는 것이다. (a)는 절대값을 비교한 것이고 (b)는 (a)를 이용해서 correlation coeffeciency 를 구한 그래프이다.
도 11은 C형 간염바이러스의 RNA 카피 수와 ELASA값의 상관관계를 그래프로 보여주는 것이다. (a)는 절대값을 비교한 것이고 (b)는 (a)를 이용해서 correlation coeffeciency 를 구한 그래프이다.
도 2는 벤질기가 붙어 있는 변형된 염기(benzylaminocarbonyl-dUridine)의 구조를 나타낸 것이다.
도 3은 E2 압타머를 이용한 샌드위치 방식 에세이 과정을 그림으로 나타낸 것이다.
도 4는 여러 가지 E2 압타머 쌍 중 가장 효율이 높은 것을 찾은 결과를 나타낸다.
도 5는 단일 탐지 압타머를 이용한 탐지 과정을 그림으로 나타낸 것이다.
도 6은 단일 압타머 와 다중 압타머의 효율을 농도별로 비교한 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 ELASA를 이용해서 C형 간염 바이러스의 E2 단백질을 농도별로 검침한 결과를 나타내는 것으로, (a)는 유전형 2a인 C형 간염 바이러스의 E2 단백질, (b)는 유전형 1a인 C형 간염 바이러스의 E2 단백질, (c)는 유전형 1b인 C형 간염 바이러스의 E2 단백질에 관한 것이다.
도 8은 ELASA를 이용하여 C형 간염 바이러스를 감염 농도별로 검침한 결과를 나타내는 것으로서, (a)는 유전형 2a인 C형 간염 바이러스, (b)는 유전형 1a인 C형 간염 바이러스에 관한 것이다.
도 9는 항바이러스제를 처리 하였을 때 바이러스가 증식하지 못하거나 치료되는 과정을 ELASA를 이용해 모니터링 한 것을 나타낸 것이다. (a)는 항바이러스제 처리시 배양액에 나오는 바이러스의 양을 나타내었으며, (b)는 바이러스에 감염된 세포에 항바이러스제 처리시의 치료 효과를 나타내었다.
도 10은 바이러스 감염도와 ELASA값의 상관관계를 그래프로 보여주는 것이다. (a)는 절대값을 비교한 것이고 (b)는 (a)를 이용해서 correlation coeffeciency 를 구한 그래프이다.
도 11은 C형 간염바이러스의 RNA 카피 수와 ELASA값의 상관관계를 그래프로 보여주는 것이다. (a)는 절대값을 비교한 것이고 (b)는 (a)를 이용해서 correlation coeffeciency 를 구한 그래프이다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예
1.
E2
압타머
발굴
압타머 발굴을 위해서 E2 단백질의 소포체 바깥에 존재하는 부분 (UniProtKB Q99IB8 아미노산 383-729)을 효모에서 발현한 후에 분리정제 하였다 (도 1). 변형된 핵산 (도 2)를 이용한 advanced SELEX (PLoS One. 2010; 5(12): e15004)를 진행해서 최종적으로 E2에 강하게 결합하는 네 종류의 압타머를 얻게 되었다 (표 1과 2).
| Aptamer | Aptamer Sequence (variable region) | 서열번호 |
| E2-A | CUUUAUGCGUUUGCCUCGGAGUUUGGAGAGACUCGGCC | 1 |
| E2-B | AUUAGACCCAUUGCCAUUUUAUCAUUAAUUUAUACCGUGC | 2 |
| E2-C | UCGAGCUUUAUGCGUUUGCCUCGGAGUUUGCGAGCGGAA | 3 |
| E2-D | AAACGUGGGUGGUUUGGUGGGGGUUGGUGGGUGGGUUUA | 4 |
* U: benzylaminocarbonyl-dUridine
| Pool | Round 6 | Round 8 | E2-A | E2-B | E2-C | E2-D | |
| Kd(nM) | N/A | 9.9 ± 1.4 | 4.6 ± 0.3 | 1 ± 0.5 | 4 ± 0.8 | 3.5 ± 1.5 | 0.8 ± 0.2 |
| Bmax(%) | 19 ± 2 | 63 ± 3 | 56 ± 1 | 75 ± 6 | 71 ± 8 | 64 ± 11 | 80 ± 5 |
상기 얻어진 E2 압타머와 SELEX round를 거친 pool간의 결합 친화력을 상기 표 2에 나타내었다. Bmax는 input 대비 결합한 압타머의 비율을 나타낸 것으로, 1에 가까울수록 좋은 성능을 의미하는 것이고, Kd(dissociation constant)는 친화력을 나타내는 수치로 수치가 낮을수록 결합력이 높음을 의미한다. Round는 SELEX 단계 중 특정 Round 후 얻어지는 pool을 의미한다.
실시예
2.
E2
에 대한
압타머를
이용한 새로운 C형 간염 바이러스 검침 방법인 '
Enzyme
Linked
Apto
-
Sorbent
Assay
(
ELASA
)'개발
실시예 1에서 발굴한 네 종류의 E2 압타머를 이용해서 E2 단백질의 정량과 C형 간염 바이러스의 감염도를 정확히 측정할 수 있는 방법을 개발하였으며, 본 발명에서는 이를 ‘Enzyme Linked Apto-Sorbent Assay (ELASA)' 라고 명명하였다.
ELASA의 작동 원리는 기본적으로 항체를 이용하는 ELISA의 그것과 유사하며, 한 종류의 압타머를 96 well 용기 바닥에 고정시켜 포획(Capture) 압타머로 사용하고, 다른 종류의 압타머에는 바이오틴을 붙여서 탐지(Detection) 압타머로 사용하였다. 조사하고자 하는 샘플에 C형 간염바이러스가 존재하면 포획 압타머와 결합하고, 포획되지 않는 샘플의 나머지 부분은 씻어낸 후 탐지 압타머를 처리하여 포획 압타머에 결합한 C형 간염바이러스에 결합하였다. 탐지 압타머가 바이오틴 잔기를 가지고 있어서 스트랍타비딘과 결합할 수 있음을 이용하여, 결합하지 않은 탐지 압타머는 씻어버리고, 용기에 남아 있는 탐지 압타머의 양은 스트랍타비딘에 결합된 호스래디쉬 퍼락시데이스 (streptavidin conjugated HRP)의 활성을 잴 수 있는 방법으로 정량하였다. 호스래디쉬 퍼락시데이스에서 나오는 화학발광을 흡광도 450 nm에서 측정하였다 (도 3).
상기 고안된 방법을 이용해서 E2에 대한 4가지 압타머 중 가장 잘 작동하는 압타머 쌍을 찾기 위해서 세포배양액에 존재하는 바이러스 샘플을 이용해서 ELASA를 진행하였다. 그 결과 포획 압타머 B(서열번호 2)와 탐지 압타머 D(서열번호 4) 쌍이 가장 잘 바이러스를 검침하였다 (도 4).
상기 발굴된 E2 압타머 (포획 압타머 B 와 탐지 압타머 D)의 결합력을 높이기 위해서 다중 압타머 (multivalent aptamer)를 디자인하였다. 스트랍타비딘에 4가지 바이오틴 결합 부위가 있다는 것을 이용해서 바이오틴에 결합된 압타머와 스트랍타비딘에 결합된 호스래디쉬 퍼락시데이스를 미리 반응시켜 다중 압타머와 호스래디쉬 퍼락시데이스의 결합체를 생성시켰다 (도 5).
상기와 같이 만든 다중 압타머와 단일 압타머를 이용해서 바이러스 검침 한계를 비교하였다. 그 결과 다중 압타머가 4 배정도 (3.13 ~ 6.25 x 102 FFU/ml) 더 강한 민감도를 보였으므로 ELASA에서 다중 압타머를 이용하는 것이 더 바람직하다 (도 6).
실시예
3.
ELASA
를 이용한 분리 정제된
E2
단백질 및 C형 간염 바이러스
존재여부
검침 및 정량
ELASA가 E2 단백질이나 C형 간염바이러스를 어느 정도까지 검침할 수 있는지 확인하기 위해서 여러 유전형의 E2 단백질 (2a, 1a 및 1b) 및 바이러스 (2a 및 1a)를 각각 이용해서 검침 한계를 측정해보았다. 단백질의 경우 2a, 1a 및 1b 유전형 모두 약 16 ng/ml까지 측정할 수 있었고 (도 7), 바이러스의 경우 3.8 ~ 6.25 x 102 FFU/ml까지 측정 할 수 있었다 (도 8).
이러한 결과를 통해서 ELASA는 여러 가지 유전형의 E2 단백질 및 C형 간염바이러스를 측정하는데 있어서 적합한 검침 시스템임을 알 수 있었다.
실시예
4.
ELASA
를 이용한 항바이러스제의 효과 확인
바이러스 증식을 정확히 모니터링 하는 것은 항바이러스제의 개발에 있어서 매우 중요하다. 위에서 언급한 감염성 있는 바이러스 양을 측정하는데 적합하다고 여겨지는 ELASA를 이용해서 항바이러스제를 투여하고 시간에 따라서 바이러스 증식여부를 확인하였다. 바이러스를 세포에 감염시키고 기존에 잘 알려진 항바이러스제 (BMS-790052, IFN-α)를 처리하였을 때 배양액에 나오는 바이러스의 양을 측정하였다. 항바이러스제를 처리하지 않았을 때는 ELASA 값이 바이러스 양과 마찬가지로 계속 증가하지만 항바이러스제를 처리하였을 때는 값이 증가하지 않았다 (도 9(a)). 그리고 이미 감염되어 있는 세포에 항바이러스제를 처리하였을 때의 치료 효과 역시 ELASA로 잘 관찰됨을 알 수 있었다 (도 9(b)).
실시예
5. C형 간염 바이러스의 감염도 및
RNA
카피 수와
ELASA
값과의 상호 연관성
본 발명에서 개발된 ELASA는 C형 간염바이러스 감염도와 직접적으로 관련이 있는 C형 간염바이러스 표면 단백질인 E2를 인식하므로, 실제 감염도와 ELASA 값이 상호 연관성이 있는지 확인해보았다. 또한 대조군으로 C형 간염바이러스 감염도와 상호 연관성이 낮은 C형 간염바이러스 RNA 카피 수와 비교하였다.
ELASA 값은 감염성 있는 바이러스 양과 높은 상호 연관성이 보였으나 (도 10), RNA 카피수의 경우, 감염성 있는 바이러스 양과의 상관관계가 낮게 나타났다 (도 11). 이 결과는 ELASA가 감염성이 있는 C형 간염바이러스의 정량에 활용할 수 있음을 보여준다.
<110> POSTECH ACADEMY-INDUSTRY FOUNDATION
<120> Aptamer for envelope protein E2 of Hepatitis C Virus and uses
thereof
<160> 4
<170> KopatentIn 1.71
<210> 1
<211> 38
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> E2 aptamer (E2-A)
<400> 1
cuuuaugcgu uugccucgga guuuggagag acucggcc 38
<210> 2
<211> 40
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> E2 aptamer (E2-B)
<400> 2
auuagaccca uugccauuuu aucauuaauu uauaccgugc 40
<210> 3
<211> 39
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> E2 aptamer (E2-C)
<400> 3
ucgagcuuua ugcguuugcc ucggaguuug cgagcggaa 39
<210> 4
<211> 39
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> E2 aptamer (E2-D)
<400> 4
aaacgugggu gguuuggugg ggguuggugg guggguuua 39
Claims (29)
- C형 간염 바이러스 E2 에 특이적으로 결합하고, 서열번호 1 내지 서열번호 4로 이루어진 군에서 선택된 염기서열을 포함하며, U(uracil) 또는 dU(deoxyuracil)에 벤질기가 첨가되어 있는 변형된 염기를 5 내지 15개 포함하며, 총 25 내지 100개의 염기로 이루어진 압타머.
- 삭제
- 제1항에 있어서,
상기 압타머는 5' 말단 부위, 중간 부위, 3' 말단 부위, 또는 양 말단 부위에 폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycol, PEG), idT (inverted deoxythymidine), LNA (Locked Nucleic Acid), 2'-메톡시 뉴클레오사이드, 2'-아미노 뉴클레오사이드, 2'F-뉴클레오사이드, 아민 링커, 티올 링커 및 콜레스테롤로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상이 결합되어 변형된 것을 특징으로 하는 압타머.
- 제1항에 있어서, 상기 압타머는 이합체, 삼합체 또는 사합체인 것을 특징으로 하는 압타머.
- 제1항, 제3항, 및 제4항 중 어느 하나의 항의 압타머를 포함하는, C형 간염 바이러스 검출용 조성물.
- 제1항, 제3항, 및 제4항 중 어느 하나의 항의 압타머를 포함하는, C형 간염 바이러스를 정량용 조성물.
- 제1항, 제3항, 및 제4항 중 어느 하나의 항의 압타머를 포함하는, C형 간염 진단용 조성물.
- 제5항의 조성물을 포함하는, C형 간염 바이러스 검출용 키트.
- 제6항의 조성물을 포함하는, C형 간염 바이러스 정량용 키트.
- 제7항의 조성물을 포함하는, C형 간염 진단용 키트.
- 제1항, 제3항, 및 제4항 중 어느 하나의 항의 압타머가 고정된 기재를 포함하는, C형 간염 바이러스 검출용 칩.
- 제11항에 있어서, 상기 압타머가 고정된 기재는 고체기재로서 고분자, 유리, 금, 종이 및 생체막으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는 C형 간염 바이러스 검출용 칩.
- 제1항, 제3항, 및 제4항 중 어느 하나의 항의 압타머가 고정된 기재를 포함하는, C형 간염 바이러스 정량용 칩.
- 제13항에 있어서, 상기 압타머가 고정된 기재는 고분자, 유리, 금, 종이 및 생체막으로 이루어진 군에서 선택된 고체 기재인, C형 간염 바이러스 정량용 칩.
- 제1항, 제3항, 및 제4항 중 어느 하나의 항의 압타머가 고정된 기재를 포함하는, C형 간염 바이러스 진단용 칩.
- 제15항에 있어서, 상기 압타머가 고정된 기재는 고분자, 유리, 금, 종이 및 생체막으로 이루어진 군에서 선택된 고체 기재인, C형 간염 바이러스 진단용 칩.
- 제1항, 제3항, 및 제4항 중 어느 하나의 항의 압타머를 시료와 반응시키는 단계를 포함하는, C형 간염 바이러스를 검출하는 방법.
- 제17항에 있어서, 제1 압타머를 고체 기재에 고정화하는 단계,
상기 고체 기재에 시료를 처리하는 단계, 및
상기 고체 기재에 검출표지가 결합된 제2 압타머를 처리하는 단계를 포함하며,
상기 제1 압타머 및 제2 압타머는 서로 다른 종류의 것임을 특징으로 하는,
시료 내 C형 간염 바이러스를 검출하는 방법.
- 제18항에 있어서, 상기 검출표지는 바이오틴, 형광물질, 자성체, 염색물질, 효소, 방사성 동위원소로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는 제2 압타머를 처리하는 단계를 포함하는, 시료 내 C형 간염 바이러스를 검출하는 방법.
- 제18항에 있어서, 상기 제1 압타머는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 압타머이고, 상기 제2 압타머는 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 압타머인, 시료 내 C형 간염 바이러스를 검출하는 방법.
- 제1항, 제3항, 및 제4항 중 어느 하나의 항의 압타머를 시료와 반응시키는 단계를 포함하는, C형 간염 바이러스를 정량하는 방법.
- 제21항에 있어서, 제1 압타머를 고체 기재에 고정화하는 단계,
상기 고체 기재에 시료를 처리하는 단계, 및
상기 고체 기재에 검출표지가 결합된 제2 압타머를 처리하는 단계를 포함하며,
상기 제1 압타머 및 제2 압타머는 서로 다른 종류의 것임을 특징으로 하는,
시료 내 C형 간염 바이러스를 정량하는 방법.
- 제22항에 있어서, 상기 검출표지는 바이오틴, 형광물질, 자성체, 염색물질, 효소, 방사성동위원소로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는 제2 압타머를 처리하는 단계를 포함하는, 시료 내 C형 간염 바이러스를 정량하는 방법.
- 제22항에 있어서, 상기 제1 압타머는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 압타머이고, 상기 제2 압타머는 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 압타머인, 시료 내 C형 간염 바이러스를 정량하는 방법.
- 제1항, 제3항, 및 제4항 중 어느 하나의 항의 압타머를 환자의 시료와 반응시키는 단계를 포함하는, C형 간염 진단에 정보를 제공하는 방법.
- 제25항에 있어서, 압타머를 환자의 시료와 반응시키는 단계, 및
상기 환자의 시료에서의 압타머의 결합 정도를 측정하는 단계를 포함하고,
상기 환자의 시료에서의 압타머의 결합 정도가 정상 시료에서의 결합 정도보다 높은 경우 상기 환자를 C형 간염 환자로 판단하는 것을 특징으로 하는,
C형 간염 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법.
- 제26항에 있어서, 상기 환자의 시료는 조직, 세포, 전혈, 혈장, 혈청, 혈액, 타액, 객담, 림프액, 뇌척수액, 세포간액 또는 뇨 시료인 방법.
- C형 간염 바이러스, 또는 C형 간염 바이러스를 포함하는 시료에 항바이러스제 또는 C형 간염 치료제를 처리하는 단계, 및
상기 시료에서 항바이러스제 또는 C형 간염 치료제를 처리하기 전과 처리한 후의 제1항, 제3항, 및 제4항 중 어느 하나의 항의 압타머 결합 정도를 측정하는 단계를 포함하는,
항바이러스제 또는 C형 간염 치료제의 모니터링 방법.
- C형 간염 바이러스, 또는 C형 간염 바이러스를 포함하는 시료에 C형 간염 치료제 후보물질을 처리하는 단계, 및
상기 시료에서 후보물질을 처리하기 전과 처리한 후의 제1항, 제3항, 및 제4항 중 어느 하나의 항의 압타머 결합 정도를 측정하는 단계를 포함하는,
C형 간염 치료제의 스크리닝 방법.
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|---|---|---|---|---|
| KR20080048382A (ko) * | 2006-11-28 | 2008-06-02 | (주) 벡스코아 | 씨형 간염 바이러스 레플리콘 증식을 억제하는 알엔에이분해효소 저항성 알엔에이 압타머 |
| KR20100072527A (ko) * | 2008-12-22 | 2010-07-01 | 한국전자통신연구원 | 바이오 칩 및 이를 이용한 바이오 물질 검출 장치 |
| US20100184837A1 (en) | 2008-10-21 | 2010-07-22 | Xiaolian Zhang | Small-molecule nucleotide aptamer for hepatitis C virus, preparation method and use thereof |
| KR20130012140A (ko) * | 2013-01-09 | 2013-02-01 | 대한민국 (식품의약품안전청장) | Ｅｒｂｂ2 수용체에 선택적으로 결합하는 압타머 및 이의 용도 |
-
2013
- 2013-04-30 KR KR20130048749A patent/KR101480495B1/ko active IP Right Grant
Patent Citations (4)
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