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KR101458367B1 - 원숭이 아데노바이러스 혈청형 19로부터 분리된 헥손, 그의 초가변 영역 및 그를 이용한 키메라 아데노바이러스 - Google Patents

원숭이 아데노바이러스 혈청형 19로부터 분리된 헥손, 그의 초가변 영역 및 그를 이용한 키메라 아데노바이러스 Download PDF

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KR101458367B1 KR1020127029771A KR20127029771A KR101458367B1 KR 101458367 B1 KR101458367 B1 KR 101458367B1 KR 1020127029771 A KR1020127029771 A KR 1020127029771A KR 20127029771 A KR20127029771 A KR 20127029771A KR 101458367 B1 KR101458367 B1 KR 101458367B1
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고대경
이홍규
조의철
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재단법인 목암생명공학연구소
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Abstract

서열번호: 3으로 정의된 폴리뉴클레오티드로 암호화된 원숭이 아데노바이러스 혈청형 19로부터 분리된 신규 헥손, 그의 초가변 영역, 그를 포함하는 키메라 아데노바이러스 및 그의 치료적 사용은 아데노바이러스를 이용하는 유전자 치료제를 개발하기 위한 안전성 및 효과적인 전신 치료의 문제에 대한 해결책을 제공한다.

Description

원숭이 아데노바이러스 혈청형 19로부터 분리된 헥손, 그의 초가변 영역 및 그를 이용한 키메라 아데노바이러스{HEXON ISOLATED FROM SIMIAN ADENOVIRUS SEROTYPE 19, HYPERVARIABLE REGION THEREOF AND CHIMERIC ADENOVIRUS USING THE SAME}
본 발명은 원숭이 아데노바이러스 혈청형 19("SAd19")로부터 분리된 신규 헥손, 그의 초가변 영역("HVR"), 그를 이용한 키메라 아데노바이러스 및 그의 치료 용도에 관한 것이다.
아데노바이러스는 1953년에 처음으로 분리된 아데노바이러스과(Adenoviridae)에 속한다. 인간 아데노바이러스는 게놈 유사성, 발암성 및 혈액 응고 특성을 기준으로 6개의 아속(A 내지 F)으로 분류된다. 아데노바이러스는 근육, 폐, 뇌 및 심장 세포와 같은 대부분의 비분열 세포를 감염시키며, 그의 분자 생물학적 특성은 당해 분야에 공지되어 있다. 아데노바이러스의 게놈은 35 kb의 선형 이중-가닥 DNA로 이루어지며, 숙주 세포에서의 그의 복제는 바이러스 단백질인 E1A에 의존한다.
아데노바이러스의 상기 특성들은 그로부터 결실된 E1A를 갖는 비복제성 벡터를 사용함으로써 활용될 수 있다. 아데노바이러스 E1 유전자가 삽입된 HEK293 세포주가 개발된 이래로, 아데노바이러스 벡터 시스템은 많은 연구에 사용되어 왔으며, 숙주 세포의 세포독성을 이용하는 바이러스치료제의 개발로 이어졌다. 2005 년 중국에서 상업화된 종양용해성(oncolytic) 바이러스치료제인 온코린(Oncorine, 등록상표)은 p53-결핍성 종양에서 선택적으로 세포자멸성(apoptotic) 세포 사멸을 유도하는 E1B55-결핍성 아데노바이러스이다.
선택적 복제성 아데노바이러스 치료제의 개발에서, E1A 단백질의 선택적 발현이 가장 중요하며, 종양 선택적 발현 프로모터를 이용한 가능한 종양-선택성 아데노바이러스 유전자 치료제에 관한 많은 사례들이 제안되었다. 대부분의 종양-선택성 아데노바이러스는 흔히 발견되는 인간 아데노바이러스 혈청형 5("HAd5")를 이용하여 제조된다. HAd5는 80%의 유병률을 차지하기 때문에 인간은 높은 수준의 아데노바이러스 중화 항체를 갖는 것으로 보고되었다[Appaiahgari, M.B., et al., Clinical and Vaccine Immunol. 14, 1053-1055 (2007)]. 아데노바이러스 외피(capsid) 단백질에 대한 상기 중화 항체는 전신 투여된 아데노바이러스의 효능 및 독성에 영향을 미친다[Chen, Y., et al., Hum. Gene Ther. 11, 1553-1567 (2000)].
바이러스 외피는 3 종류의 단백질, 즉, 헥손, 파이버 및 펜톤으로 이루어지며, 240개 헥손과 12개 펜톤으로 이루어지는 대칭 20면체 구조를 갖는 캡소미어(capsomere)를 포함한다. 각각의 펜톤은 70 내지 100 nm의 돌출되어 있는 삼량체성 파이버와 결합한다. 아데노바이러스에 의해 감염되면, 삼량체성 파이버는 아데노바이러스 감염 과정에서 숙주 세포의 표면 막 상의 콕사키 아데노바이러스 수용체(Coxackie Adenovirus Receptor, CAR)에 결합한다. 펜톤의 RGD 영역은 인테그린(integrin)에 결합하고, 이것은 바이러스 흡수 및 숙주 세포내로의 침투로 이어진다.
헥손 단백질의 루프 1(L1) 및 루프 2(L2)는 바이러스 캡소미어 구조의 외부상으로 노출되는 것으로 보고되었다. L1 및 L2는 각각 132 번째에서 320 번째 아미노산 사이에 6개의 초가변 영역(hepervariable region, HVR), 즉, HVR-1 내지 HVR-6, 및 헥손 단백질의 408 번째에서 459 번째 아미노산 사이에 7번째 HVR(HVR-7)을 함유한다.
아데노바이러스는 치료 유전자를 세포내로 전달하는 정밀하고 효과적인 수단을 제공한다. 그러나, 생체내 유전자 전달을 위한 아데노바이러스 벡터의 사용에 따른 한가지 문제는 아데노바이러스 외피 단백질 상의 항원 에피토프에 대한 항체의 생성이다.
아데노바이러스를 인체에 투여하는 경우, 헥손 단백질에 대한 중화 항체가 생성되며, 상기 항체는 주로 지배적인 HVR 영역을 표적으로 한다. 항체는 숙주 세포의 감염을 억제함으로써 바이러스 복제 효율을 감소시키는 것으로 또한 알려져 있다[Wohlfart, C., J. Virol. 62, 2321-2328 (1988); Toogood, C.I.A., et al., J. Gen. Virol. 73, 1429-1435 (1992); Sumida, S.M. et al., J. Immunol. 174, 7179-7185 (2005)].
인간에서 HAd5에 대한 인간 중화 항체의 편중에 의해 야기된 문제는 바이러스 유전자 전달 벡터 및 바이러스 치료제를 사용하여 아데노바이러스를 투여할 때 해결되어야만 한다. 중화 항체와 관련된 상기 언급한 문제 이외에, 아데노바이러스는 전신 노출시 간을 감염시키는 것으로 보고되었다. 이와 관련하여, 아데노바이러스는 간친화성(hepatotropism)을 갖는 것으로 보고되었으며, 아데노바이러스를 정맥내 경로에 의해 투여하는 경우 24시간 이내에 투여량의 90%가 간으로 이동한다[Worgall, S., et al., Hum. Gene Ther. 8, 37-44 (1997)]. 아데노바이러스의 상기 간선택성으로 인해, 1999 년에, 아데노바이러스 유전자 치료제를 사용한 임상 실험중이던 젊은 환자였던 제시 겔싱어(Gessie Gelsinger)는 급성 간독성으로 인해 사망하였다. 그 이후로 아데노바이러스의 용량은 1x1013 vp를 초과하지 않는 양으로 제한되었다. 따라서, 간독성은 일반적으로 아데노바이러스를 사용하는 많은 유전자 치료제에 대한 비임상/임상 실험에서 용량-제한 인자로 고려된다[Alemany, R. et al., Gene Ther., 8(17), 1347-1353 (2001); Christ, M., et al., Hum. Gene Ther., 11(3), 415-427 (2000); Lieber, A., et al., J. Virol., 7(11), 8798-8807 (1997)]. 상기 언급된 간 선택성과 중화 항체 문제는 아데노바이러스 치료제의 전신 투여에 의한 효과적인 치료를 달성하는데 주된 문제이다[Worgall, S., et al., Hum. Gene Ther., 8, 37-44 (1997)].
이와 관련하여, 워딩턴(Waddington) 등은 최근에 혈액 응고 인자의 Gla 영역이 혈액중 아데노바이러스의 헥손 단백질과 결합하여, 간으로의 아데노바이러스 이동을 촉진하는 것으로 보고하였다[Waddington, S.N., et al., Cell, 132, 397-409 (2008)]. 헥손의 HVR-3, HVR-5 또는 HVR-7이 혈액 응고 인자의 Gla 영역과 결합할 수 있는 것으로 예측되었다[Kalyuzhniy, O., et al., Proc. Natl Acd. Sci. 105, 5483-5488 (2008)]. HVR은 아데노바이러스의 혈청형에 따라 달라지며, 혈액 응고 인자에 대한 결합 친화성에 중요한 요인이 무엇인지는 아직 명확하지 않다. RGD, RFP 및 BAP(비오틴 수용체 펩티드)와 같은 특정 단백질을 삽입시켜 혈액 응고 인자에 대한 결합 친화성을 상당히 약화시키고 간친화성을 감소시킴으로써, 아데노바이러스의 최대 허용 용량은 10배 이상 증가될 수 있는 것으로 보고되었다[Shashkova, E.V., et al., Mol. Ther. 17, 2121-2130 (2009)].
현재, 헥손 단백질의 많은 기능들이 알려져 있으며, 간독성 및 항-아데노바이러스 면역 문제들을 해결하기 위해 헥손 단백질을 변형시키는 많은 연구가 진행되고 있다. 헥손 단백질을 변형시키기 위한 방법으로는 4가지가 있다: (1) 헥손 유전자를 다른 아데노바이러스 혈청형의 상응하는 헥손 유전자로 교체한다, (2) 펩티드를 HVR에 삽입한다, (3) 헥손 단백질의 HVR을 암호화하는 유전자를 다른 아데노바이러스 혈청형의 HVR을 암호화하는 상응하는 유전자로 교체한다, 및 (4) 혈액 응고 인자 및 중화 항체에 결합하는 영역을 HVR로부터 제거한다. 현재까지, 펩티드를 HVR 내에 삽입하는 방법 및 HVR을 암호화하는 유전자를 상응하는 다른 아데노바이러스 혈청형의 HVR을 암호화하는 유전자로 교체시키는 방법이 헥손 변형을 위해 수행된다. 상기 언급한 4가지 방법 중에서, 전체 헥손 치환이 바이러스 면역원성을 변화시키는 가장 확실한 방법이다. 그러나, 헥손 단백질을 변형하기 위해 전체 헥손 교환을 달성하는 방법은 헥손, 펜톤 및 파이버가 결합하는데 있어 발생하는 미묘한 구조적 차이가 아데노바이러스 외피 구조의 불안정성을 유도하는 사실로 인해 생산성 악화의 문제를 갖는다[Roberts, D.M., et al., Nature, 441, p239-243 (2006); Youil, R., et al., Hum. Gene. Ther. 13, p311-320 (2002); Shashkova, E., et al., Mol. Ther. 17, 2121-2130 (2009)].
또한, 이종 아데노바이러스의 혈청형 및 인간 아데노바이러스의 혈청형을 사용한 외피 단백질의 변형에 대한 집중적인 연구가 진행 중이다. 원숭이 아데노바이러스 혈청형 22 내지 25로 분류되는 침팬지 아데노바이러스 pan 5, 6, 7 및 9에 대한 중화 항체의 유병률은 6% 미만이므로, 침팬지 아데노바이러스를 포함하는 원숭이 아데노바이러스 벡터 시스템은 유전자 치료용 벡터로 유용할 수 있음이 보고되었다[Roy, S. et al., Hum. Gene Ther. 15, p519-530 (2004)]. 국제 특허 공개 WO 2006/040330 호 및 WO 2002/083902 호는 재조합 키메라 아데노바이러스에서 중화 항체에 의해 야기된 면역 반응을 억제하기 위해 인간 혈청형 11, 24, 26, 30, 34, 35, 48, 49 및 50의 파이버 또는 헥손 단백질의 사용을 교지하고 있으며, 이때 CAR 또는 헥손 단백질에 결합하는 아데노바이러스 놉(knob) 영역은 다른 혈청형의 놉 영역으로 치환된다. 원숭이 아데노바이러스 혈청형과 관련하여, 국제 특허 공개 WO 2005/001103 호는 원숭이 아데노비아러스 혈청형 18을 사용한 키메라 아데노바이러스를 개시하고 있다.
그러나, 보다 낮은 면역원성 및 보다 낮은 독성을 갖는 아데노바이러스를 개발하는 것이 여전히 강하게 요구되고 있다. 따라서, 본 발명자들은 개코원숭이 배설물로부터 분리된 신규 SAd19 헥손 유전자를 동정하였으며, 상기 유전자가 HAd5에 대한 중화 항체를 탁월하게 피할 수 있으며 낮은 독성을 나타내는 것을 밝혀내었다.
따라서, 본 발명의 목적은 키메라 아데노바이러스의 제조에 사용하기 위한 신규 헥손 단백질 및 이를 암호화하는 DNA를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 신규 헥손 단백질을 포함하는 키메라 아데노바이러스를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 키메라 아데노바이러스를 포함하는 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 키메라 아데노바이러스를 사용하는 유전자 치료 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 한 양태에 따라서, SAd19로부터 분리된 헥손 및 상기 헥손을 암호화하는 DNA가 제공된다.
본 발명의 또 다른 양태에 따라서, SAd19로부터 분리된 헥손의 HVR 및 상기 HVR을 암호화하는 DNA가 제공된다.
본 발명의 다른 양태에 따라서, SAd19로부터 분리된 헥손 단백질 또는 그로부터의 7개 이상의 연속 잔기를 치환함으로써 헥손에 비천연 아미노산 서열을 갖는 키메라 아데노바이러스가 제공된다.
본 발명의 또 다른 양태에 따라서, 본 발명의 키메라 아데노바이러스를 포함하는 조성물이 제공된다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 포유동물 세포 내에 본 발명의 키메라 아데노바이러스를 도입시키는 것을 포함하는, 상기 포유동물 세포에 치료용 전이유전자(transgene)를 전달하는 방법이 제공된다.
본 발명의 또 다른 양태에 따라서, 대상에게 본 발명의 키메라 아데노바이러스를 투여하는 것을 포함하는, 암 치료 방법이 제공된다.
본 발명의 또 다른 양태에 따라서, 인간 아데노바이러스의 헥손중의 7개 이상의 아미노산 잔기를 본 발명의 헥손 단백질의 7개 이상의 잔기로 치환시키는 것을 포함하는, 유전자 치료를 위한 아데노바이러스 벡터의 제조 방법이 제공된다.
본 발명의 또 다른 양태에 따라서, 본 발명의 키메라 아데노바이러스를 포함하는 분리된 숙주 세포가 제공된다.
본 발명의 상기 및 기타 목적 및 특징은, 각각 다음을 나타내는 첨부 도면과 함께 본 발명의 하기의 설명으로부터 명백해질 것이다.
도 1은 인간 아데노바이러스(HAd) 혈청형 5(1a) 및 41(1b), 및 SAd19로부터의 헥손 단백질의 아미노산 서열이고;
도 2는 pHex-SAd19 헥손 벡터(2a), pAd H5/S19_8DS 벡터(2b), pAd328 H5/S19_DS 벡터(2c), 및 pAd328 H5/S19_DSΔ19k(2d)의 분열 지도이고;
도 3은 Ad H5_8DS 및 Ad H5/S19_8DS의 감염된 유닛에 비례하는 종양-특이적 E1A의 발현 수준을 나타내는 웨스턴 블롯 분석의 결과이고;
도 4는 인간 혈액 응고 인자 X와 Ad H5/S19_8DS 사이의 결합 친화성을 측정하기 위한 SPR 결과(4a), 및 인간 혈액 응고 인자 IX 또는 X와, Ad H5_8DS, Ad H5/S19_8DS, Ad328 H5/S19_DS 또는 Ad328 H5/S19_DSΔ19k와의 동시-면역침전 후 인간 혈액 응고 인자 및 아데노바이러스 파이버 단백질에 대한 웨스턴 블롯 결과(4b 내지 4d)이고;
도 5는 Ad H5_8DS 및 Ad H5/S19_8DS의 정맥내 주사 후, 각 장기에서 아데노바이러스 파이버 유전자의 PCR-증폭된 DNA 밴드를 보여주는 아가로스 겔 전기영동의 결과이며;
도 6은 HAd5에 대한 중화 항체를 사용함으로써, 원숭이 아데노바이러스 혈청형 19, Ad H5/S19_8DS(6a), AD328 H5/S19_DS 및 Ad328 H5/S19_DSΔ19k(6b)의 헥손을 갖는 키메라 아데노바이러스의 감염-회피 능력을 나타내는 웨스턴 블롯 분석 결과이고;
도 7은 HAd5에 대한 중화 항체를 사용함으로써, SAd19, Ad H5/S19_8DS(7a), AD328 H5/S19_DS 및 Ad328 H5/S19_DSΔ19k(7b)의 헥손을 갖는 키메라 아데노바이러스의 감염-회피 능력을 보여주는 면역염색 사진 및 막대 그래프이고;
도 8은 HAd5로 면역화된 시리안(Syrian) 햄스터에 투여된 Ad H5/S19_8DS 및 Ad H5_8DS에 의해 전달된 혈액 중 LK8 유전자의 발현 패턴을 보여주는 그래프이고;
도 9는 Ad H5_8DS 및 Ad H5/S19_8DS가 용량-의존적으로 정맥내 투여된, 부검된 마우스로부터 적출된 각각의 장기의 사진이고;
도 10은 Ad H5_8DS가 정맥내 투여된 마우스의 혈액 분석 데이터이며;
도 11은 Ad H5/S19_8DS가 정맥내 투여된 마우스의 혈액 분석 데이터이고;
도 12는 AD H5/S19_8DS의 정맥내 주사후 H460 비-소세포 폐암에 대한 동물 모델에서의 종양-성장 곡선이고;
도 13은 HAd5에 대한 면역화에 따른, 종양-특이성 키메라 아데노바이러스, Ad H5/S19_8DS 주사 후 부검된 H2172 동소성(orthotopic) 폐암에 대한 동물 모델의 폐 사진이고;
도 14는 도 13의 폐 표면에 분포하는 종양의 부피, 중량, 수 및 크기를 분석한 결과이다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 기술 및 과학 용어들은 본 발명이 속한 분야에서 통상의 기술을 가진 자에 의해 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 또한, 본원에 언급된 모든 문서들은 본원에 그대로 참고로 인용된다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "아데노바이러스"는 약 35 kb의 선형 게놈을 갖는 비-피막형(non-enveloped) 20면체 이중-가닥 DNA 바이러스를 말한다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "키메라 아데노바이러스"는 그 핵산 서열이 2개 이상의 아데노바이러스 혈청형의 핵산 서열로 이루어진 아데노바이러스를 말한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "치환"은 상이한 폴리뉴클레오티드 또는 아미노산 각각에 의한 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 또는 아미노산의 교체로부터 야기된다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "초가변 영역" 또는 "HVR"은 그 서열이 초가변성이어서 구조적으로 한정된 루프를 형성하는 가변 영역을 의미한다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "비천연 아미노산 서열"은 아데노바이러스의 해당 혈청형의 천연 헥손 단백질에서 발견되지 않으며 유전자 발현 수준으로(즉, 비천연 아미노산 서열을 암호화하는 핵산 서열의 생성에 의해) 헥손 단백질내에 도입되는 임의의 아미노산 서열을 의미한다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "치료용 전이유전자"는 세포 내에 도입되고 적절한 조건하에서 번역 및/또는 발현될 수 있으며 그것이 도입되는 세포에 바람직한 성질을 제공하거나 그렇지 않으면 바람직한 치료 결과를 야기하는 폴리뉴클레오티드를 말한다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "벡터"는 상기 용어가 당해 분야에 숙련된 자에 의해 이해되는 바와 같이 유전자 전달체를 말하며, 바이러스, 플라스미드 등을 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "중화 항체"는 아데노바이러스(즉, 세포 침입체)의 감염력 또는 아데노바이러스에 의해 제어되는 유전자 발현을 억제할 수 있는 항체를 의미한다. 중화 항체는 혈청으로부터 정제되거나 또는 혈청에 존재하는 항체일 수 있다.
이하에서 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명에서는, SAd19로부터 분리된 헥손, 그의 HVR 및 상기 헥손을 암호화하는 DNA가 제공된다.
본 발명에 따른 SAd19는 개코원숭이 배설물로부터 분리에 의해 제공될 수 있으며, 아형(subgroup) F로 분류된다. SAd19의 헥손은 서열번호: 16의 아미노산 서열을 가지며, 상기 서열은 인간 아데노바이러스 혈청형 41("HAd41") 헥손과 85%의 상동성 및 HAd5 헥손과 76%의 상동성을 갖는다. 또한, SAd19의 헥손을 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 HAd41 헥손과 76%의 상동성 및 HAd5 헥손과 70% 상동성을 갖는다. 바람직하게, 본 발명에 따른 SAd19의 헥손은 서열번호: 3의 DNA 서열을 갖는다.
SAd19의 헥손 또는 그로부터의 7개 이상의 잔기가 키메라 아데노바이러스를 제공하기 위해 치환에 의해 다양한 유형의 아데노바이러스 내에 삽입될 수 있다. 따라서, 본 발명의 SAd19의 헥손 단백질 또는 그로부터의 하나 이상의 잔기를 치환함으로써 헥손에 비천연 아미노산 서열을 갖는 키메라 아데노바이러스가 제공된다.
바람직하게, 키메라 아데노바이러스는 서열번호: 16의 아미노산 서열을 갖는 헥손으로부터 7개 이상의 잔기를 치환함으로써 헥손에 비천연 아미노산 서열을 가질 수 있다. SAd19의 헥손으로부터의 7개 이상의 잔기는 HVR일 수 있다. HVR은 서열번호: 21의 아미노산 서열을 가질 수 있으며, 서열번호: 20의 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화될 수 있다. 보다 바람직하게, 키메라 아데노바이러스는 서열번호: 21의 아미노산 잔기 11 내지 41, 46 내지 52, 69 내지 78, 106 내지 119, 126 내지 138, 160 내지 173, 및 275 내지 303 각각에 상응하는 HVR, 즉, HVR-1 내지 -7의 단편을 치환함으로써 헥손에 비천연 아미노산 서열을 가질 수 있다.
SAd19의 헥손 또는 그로부터의 7개 이상의 아미노산 잔기를 갖는 키메라 아데노바이러스는 중화 항체에 의한 면역 억제 및 간독성을 거의 나타내지 않는다.
다양한 유형의 아데노바이러스, 바람직하게는 인간 아데노바이러스 혈청형, 보다 바람직하게는 인간 아데노바이러스 혈청형 5, 11, 24, 26, 30, 34, 35, 48, 49 및 50이 본 발명의 키메라 아데노바이러스의 제조에 유용할 수 있다. 종양-특이성, 복제-가능 아데노바이러스, 또는 종양-특이성, 복제-불능 아데노바이러스가 아데노바이러스 치료제로 유용할 수 있다. 본 발명의 키메라 아데노바이러스는 면역 반응 및 간독성 문제를 해결하기 위해 비천연 아미노산 서열을 갖는다.
특히, 본 발명에 따른 비천연 아미노산 서열은 야생형 아데노바이러스의 헥손 영역을 SAd19의 헥손 영역으로 치환시킴으로써 제조된다. 최적으로, 수득된 비천연 아미노산 서열은 상응하는 야생형 아데노바이러스 헥손 단백질에 대해 유도된 중화 항체에 대한 7개 이상의 기존 에피토프가 비-면역성이 된 것이다.
본 발명에 따르면, 키메라 아데노바이러스는 7개 이상의 아미노산의 헥손 변형을 포함하며, 상기 헥손 변형은 7개 이상의 영역에서 이루어진다.
가장 바람직한 키메라 아데노바이러스는, 아데노바이러스 벡터 pAd H5/S19_8DS를 인간 폐암 상피 세포주 A549에 형질감염시켜 인간 아데노바이러스 헥손을 SAd19의 헥손으로 치환시킴으로써 제조된 AD H5/S19_8DS일 수 있다.
본 발명의 바람직한 양태에서, 본 발명의 키메라 아데노바이러스는 또한 치료용 전이유전자를 함유할 수 있다. 상기 치료용 전이유전자의 비-제한 예로는 종양 억제인자 유전자, 항원성 유전자, 세포독성 유전자, 세포증식억제(cytostatic) 유전자, 자살 유전자, 항-혈관신생 유전자 및 면역-조절 유전자가 포함된다.
구체적으로, "종양 억제인자 유전자"는 표적 세포에서 그의 발현이 종양 표현형을 억제하고/하거나 세포자멸(apoptosis)을 유도할 수 있는 뉴클레오티드 서열이다. 종양 억제인자 유전자의 예로는 p53-유전자, APC-유전자, DPC-4/Smad4 유전자, BRCA-1 유전자, BRCA-2 유전자, WT-1 유전자, 망막아세포종 유전자[Lee et al., Nature, 329, 642 (1987)], MMAC-1 유전자, 선종성 용종증 코일 단백질(미국 특허 제 5,783,666 호), DCC(deleted in colorectal cancer, 결장암에서 결실된) 유전자, MMSC-2 유전자, 염색체 3p21.3 상에 위치한 비인후암 억제인자 유전자[Cheng et al., Proc. Nat. Acad. Sci., 95, 3042-3047 (1998)], MTS1 유전자, CDK4 유전자, NF-1 유전자, NF-2 유전자, VHL 유전자 등이 포함된다.
"항원성 유전자"는 표적 세포에서 그의 발현이 면역 시스템에 의해 인지될 수 있는 세포 표면 항원 단백질의 생성을 야기하는 뉴클레오티드 서열이다. 상기 항원성 유전자의 예로는, 암태아성 항원(CEA), CD3, CD133, CD44 및 p53(국제 특허 공개 WO94/02167 호)이 포함된다. 면역 시스템에 의한 용이한 인지를 위해, 항원성 유전자는 MHC I형 항원과 결합될 수 있다.
"세포독성 유전자"는 세포에서 발현될 때 독성 효과를 나타내는 뉴클레오티드 서열이다. 세포독성 유전자의 예로는 슈도모나스(Pseudomonas) 외독소(exotoxin), 리신 독소, 디프테리아 독소 등을 암호화하는 뉴클레오티드 서열이 포함된다.
"세포증식억제 유전자"는 세포에서 발현될 때 세포 주기 정지를 유도하는 뉴클레오티드 서열이다. 세포증식억제 유전자의 비-제한 예로는 p21, 망막아세포종 유전자, E2F-Rb 융합 단백질, 사이클린-의존성 키나제 억제제를 암호화하는 유전자(예를 들면, P16, p15, p18 및 p19), 성장 정지 특이성 호메오박스(homeobox) 유전자(국제 특허 공개 WO97/16459 호 및 WO96/30385 호) 등이 포함된다.
"자살 유전자"는 세포에서 발현될 때 세포자멸을 통해 세포 사멸을 유도하는 뉴클레오티드이다. 자살 유전자의 비-제한 예로는 단순 포진(herpes simplex) 바이러스 티미딘 키나제, 수두 티미딘 키나제, 사이토신 디아미나제, 퓨린 뉴클레오시드 포스포릴라제, 베타-락타나제, 카복시펩티다제 G2, 사이토크롬 P450-2B1, 니트로리덕타제, 베타-글루쿠로니다제, TRAIL(TNF 관련 세포자멸-유도 리간드) 등이 포함된다.
"항-혈관신생 유전자"는 그 발현에 의해 항-혈관신생 인자의 세포외 분비가 야기되는 뉴클레오티드 서열이다. 항-혈관신생 인자로는 안지오스타틴(angiostatin), 혈관 내피 성장 인자(VEGF) 및 태반 성장 인자(PlGF)의 억제제, 예를 들면, 가용성 VEGFR1(sFLT-1)[PNAS(USA), 95, 8795-8800 (1998)], 엔도스타틴 및 아포리포단백질(a) 크링글(kringle) 영역(LK8)이 포함된다. 바람직한 항-혈관신생 유전자는 LK8을 암호화하는 유전자이다. LK8은 혈관 내피 세포에 직접 영향을 미쳐 세포자멸을 유도하고 내피 세포의 이동을 억제한다[Kim JS et al., J. Biol. Chem., 278, 29000 (2003)]. 특히, LK8의 아데노바이러스-매개 발현은 마우스에서 간암 성장을 억제하는 것으로 보고되었다[Lee K. et al., Hepatology, 43, 1063 (2006)]. 그러므로, 아데노바이러스의 종양용해 효과가 LK8의 도입에 의해 개선될 수 있는 것으로 예상된다.
"면역-조절 유전자"는 세포에서 발현될 때 체액 및 세포성 면역 반응을 조절하는 뉴클레오티드 서열이다. 면역-조절 유전자의 비-제한 예로는 CD16, CTLA-4, IL24, GM-CSF 등을 암호화하는 유전자가 포함된다.
치료용 전이유전자는 당해 분야에 공지되어 있는 다양한 DNA 재조합 기술에 의해 본 발명의 키메라 아데노바이러스 내에 삽입될 수 있다.
본 발명은 또한 종양 세포 성장의 억제 뿐 아니라, 종양 및 다른 질환의 치료에 유용한 치료용 전이유전자를 전달하기 위한 아데노바이러스 벡터의 제조를 위한 본 발명의 키메라 아데노바이러스의 용도를 제공한다. 특히, 포유동물 세포에 본 발명의 키메라 아데노바이러스를 도입하는 것을 포함하는, 포유동물 세포에 치료용 전이유전자를 전달하기 위한 방법; 상기 아데노바이러스를 대상에게 투여하는 것을 포함하는, 암을 치료하는 방법; 및 인간 아데노바이러스의 헥손 중 7개 이상의 아미노산 잔기를 SAd19 헥손 단백질의 7개 이상의 잔기로 치환시키는 것을 포함하는, 유전자 치료용 아데노바이러스 벡터를 제조하는 방법이 제공된다.
본 발명에서는, 본 발명의 키메라 아데노바이러스를 포함하는 조성물이 또한 제공된다. 본 발명의 조성물은 유전자 치료 또는 바이러스 치료, 바람직하게는 암 치료에 유용하다.
본 발명의 조성물은 약학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제와 함께 다양한 제형을 제공하기 위해 제형화될 수 있다. 따라서, 상기 제형은 오일 또는 수성 매질 중의 용액, 현탁액 또는 유화액, 추출물, 분말, 과립, 정제 또는 캡슐의 형태일 수 있다.
경구용 제형의 경우, 예를 들면, 유드라짓(Eudragit) 또는 타임클락(timeclock) 방출 시스템을 이용함으로써, 아데노바이러스 방출을 위해 특별히 고안된 것들을 포함하여 다양한 제조 방법을 이용할 수 있다[Lubeck et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86(17), 6763-6767 (1989); and Chourasia and Jain, J. Pharm. Pharm. Sci., 6(1), 33-66 (2003)].
상기 언급한 바와 같이, 키메라 아데노바이러스는 당해 분야에 공지되어 있는 임의의 유전자 전달 시스템에 의해 전달될 수 있다. 문헌 [Rolland, Crit. Rev. Therap. Durg Carrier Systems, 15, 143-198 (1998)] 및 그에 인용된 참조문헌들에 개시된 것들과 같은 많은 유전자 전달 시스템이 당해 분야에 공지되어 있다. 따라서, 본 발명의 조성물은 상기 유전자 전달 시스템에 적합하게 제형화될 수 있다.
본 발명의 조성물은 당해 분야에 공지되어 있는 임의의 약학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있다. 적합한 담체의 예는 물, 염수, 알콜, 지질, 왁스, 완충액, 고체 담체, 예를 들면, 만니톨, 락토스, 전분, 마그네슘 스테아레이트, 나트륨 사카린, 활석, 셀룰로스, 글루코스, 슈크로스 및 탄산마그네슘, 또는 생분해성 미립구(예, 폴리락테이트 폴리글리콜레이트)이다.
본 발명의 조성물은 밀봉 앰플 또는 바이알과 같은 단일 용량 또는 다중-용량 용기의 형태로 제공될 수 있다. 바람직하게, 상기 용기는 사용 전에 약학 제형의 무균 조건을 보존하기 위해 밀봉될 수 있다. 일반적으로, 제형은 현탁액, 유체, 및 오일 또는 수성 비히클 중의 유화액으로 보존될 수 있다. 또한, 약학 제형은 냉동 건조 조건하에서 보존될 수 있다.
상기 키메라 아데노바이러스 및 이를 포함하는 조성물은 부위-특이적 주사 또는 정맥내 주사에 의해 투여될 수 있다. 부위-특이적 주사로는, 예를 들면, 복강내 주사, 흉막내 주사, 척추강내 주사, 동맥내 주사, 종양내 주사 또는 국소 적용이 포함된다. 상기 투여 방법은 또한 아데노바이러스 벡터를 사용하는 치료와 다른 표적 질환 치료의 병용치료에 용이하게 적용될 수 있다. 바람직한 방법은 정맥내 주사이다.
실제로 투여되는 활성 성분의 적합한 양은 치료될 질병, 개별 환자의 연령 및 체중, 음식물, 투여 시간, 배설률, 환자 증상의 중증도 및 반응 민감성을 포함한 다양한 관련 요인들의 견지에서 결정되어야 하며; 따라서 상기 용량은 어떻게도 본 발명의 범위를 제한하려는 것이 아님을 이해해야 한다. 일반적으로, 본 발명의 조성물은 1 x 107 내지 1 x 1013 pfu/ml의 본 발명의 키메라 아데노바이러스를 함유하며, 본 발명의 키메라 아데노바이러스는 3 내지 5 주동안 일주일에 1회 1 x 1011 pfu의 양으로 주사될 수 있다.
본 발명의 조성물은 단일 요법으로 이용될 수 있다. 그러나, 상기 조성물은 암을 치료하기 위한 통상적인 화학요법 또는 방사선 요법과 같은 다른 항-종양 프로토콜과 병용될 수 있다. 본 발명의 조성물과 함께 사용될 수 있는 화학요법 약물로는 파클리탁셀(paclitaxel), 시스플라틴(cisplatin), 카보플라틴(carboplatin), 프로카바진(procarbazine), 메클로레타민(mechlorethamine), 사이클로포스파미드(cyclophosphamide), 이포스파미드(ifosfamide), 멜팔란(melphalan), 클로람부실(chlorambucil), 비술판(bisulfan), 니트로소우레아(nitrosourea), 닥티노마이신(dactinomycin), 다우노루비신(daunorubicin), 독소루비신(doxorubicin), 블레오마이신(bleomycin), 플리코마이신(plicomycin), 미토마이신(miotomycin), 에토포시드(etoposide), 타목시펜(tamoxifen), 탁솔(taxol), 트랜스플라티눔(transplatinum), 5-플루오로우라실(5-fluorouracil), 빈크리스틴(vincristin), 빈블라스틴(vinblastin) 및 메토트렉세이트(methotrexate)가 포함된다. 본 발명의 조성물과 함께 사용될 수 있는 방사선 요법은 X-선 조사 및 γ-선 조사 등일 수 있다.
본 발명의 키메라 아데노바이러스는 혈액 응고 인자와 상호작용하지 않고 낮은 간독성을 나타내기 때문에 간으로의 형질도입이 거의 되지 않는다. 따라서, 그의 면역 반응 및 간독성의 낮은 위험성으로 인해 고용량의 본 발명의 키메라 아데노바이러스를 대상에게 투여할 수 있으므로, 본 발명의 키메라 아데노바이러스는 안전하고 효과적인 유전자 치료 및 바이러스 치료에 유용하다.
하기의 실시예는 본 발명의 범위를 제한하지 않고 본 발명을 예시하기 위한 것이다.
실시예 1: SAd19 의 헥손 유전자의 동정
PCR을 이용하여 SAd19로부터 헥손 유전자를 증폭시키고, pGEM-T 이지(easy) 벡터에 클로닝시키고, ABI 자동 DNA 서열분석기로 서열분석하였다.
<1-1> 헥손 유전자의 동정
SAd19의 게놈을 디엔이지 티슈 키트(DNeasy Tissue Kit)(키아겐(QIAGEN), 독일)를 사용하여 분리하고, 서열번호: 1 및 2의 프라이머 세트를 사용한 PCR에 의한 헥손 유전자의 증폭에 주형으로 사용하였다. 증폭된 헥손 유전자는 위자드(Wizard, 등록상표) SV 겔 및 PCR 클린-업 시스템(프로메가(Promega), 미국 위스콘신)을 사용하여 정제하고, T4 DNA 리가제(로슈(Roche), 스위스)를 사용하여 pGEM-T 이지 벡터(프로메가, 미국 위스콘신) 내에 삽입하였다. 생성된 재조합 벡터는 pGEM-SAd19 헥손 벡터로 명명하였다. 상기 벡터로 이. 콜라이(E. coli)를 형질전환시킨 후, 형질전환체의 10개 클론으로부터 벡터 DNA를 추출하고, ABI 자동 DNA 서열분석기를 사용하여 서열분석하였다. 10개의 염기 서열중에서 다른 것들과 최고의 서열 상동성을 갖는 1개 서열을 선택하여, SAd19의 헥손 유전자의 뉴클레오티드 서열을 결정하였다(서열번호: 3).
<1-2> 인간 아데노바이러스 혈청형의 염기 및 아미노산 서열과의 비교
SAd19의 헥손 유전자의 염기 및 아미노산 서열을 51개 인간 혈청형 아데노바이러스의 상기 서열과 비교하였다. 아형 F에 속하는 SAd19의 헥손은 아미노산 서열에서 85% 상동성하에 HAd41의 헥손과 가장 유사한 것으로 나타났다. HAd5의 헥손과는 75%의 아미노산 상동성을 나타내었다. 또한, SAd19의 헥손은 HAd41 및 HAd5와 각각 76% 및 70%의 뉴클레오티드 서열 상동성을 공유하는 것으로 나타났다(도 1).
실시예 2: 치환된 SAd19 의 헥손을 갖는 키메라 아데노바이러스의 제조
헥손 유전자를 교환하기 위한 셔틀 벡터를 제작하고 pHex 벡터로 명명하였으며, 상기 벡터는 상동 재조합을 위한 헥손 유전자의 좌측- 및 우측-연장 영역을 갖고 있다. SAd19의 헥손 유전자를, 헥손의 좌측- 및 우측-연장 팔 사이에 위치한 pHex 벡터의 단일 제한효소 부위내에 클로닝하여 재조합 벡터를 수득하고 pHex-SAd19 헥손으로 명명하였다. SphI-선형화된 pHex-SAd19 헥손을 BJ5183(스트레이타진(Stratagene), 미국 캘리포니아)에서 AsiSI-선형화된 pAd H5_8DS와 상동 재조합시켜 SAd19 헥손-함유 재조합 벡터를 수득하고 pAd H5/S19_8DS로 명명하였다. PacI으로 선형화시킨 후에, pAd H5/S19_8DS를 A549 세포에 형질감염시켜 SAd19의 헥손이 치환된 새로운 키메라 아데노바이러스(Ad H5/S19_8DS)를 생성하였다.
<2-1> 셔틀 벡터의 제작
상동 재조합을 통한 헥손 유전자의 치환에 적합한 셔틀 벡터를 제작하였다. 이와 관련하여, HAd5의 헥손 유전자의 5' 말단 상위의 약 1 kb-길이의 영역을 서열번호: 4 및 5의 프라이머 세트를 사용하여 PCR에 의해 증폭시켰다. 상기와 같이 수득된 PCR 산물을 헥손 L로 명명한 다음 pCR2.1 토포(Topo) 벡터(인비트로겐(Invitrogen), 미국 캘리포니아) 내에 삽입하였다. DNA 서열 분석에 의해 돌연변이를 갖지 않는 클론을 선택하고, pCR2.1-헥손 L로 명명하였다. 별개로, HAd5의 헥손 유전자의 3' 말단의 하위의 약 1 kb-길이의 영역을 서열번호: 6 및 7의 프라이머 세트를 사용하여 PCR에 의해 증폭시켰다. 상기와 같이 수득된 PCR 산물을 헥손 R로 명명한 다음, pCR2.1 토포(Topo) 벡터(인비트로겐, 미국 캘리포니아) 내에 삽입하였다. DNA 서열분석에 의해 분석할 때 돌연변이-비함유 클론을 pCR2.1-헥손 R로 명명하였다.
헥손 L을, XhoI 및 EcoRI 둘 다를 사용하여 pCR2.1-헥손 L로부터 절취한 후에, SalI 및 EcoRI 둘 다로 미리 절단된 pENTR2B(인비트로겐, 미국 캘리포니아) 내에 삽입시켜 재조합 벡터 pENTR2B-헥손 L을 수득하였다. pCR2.1-헥손 R을 HindIII로 절단한 다음, 클레나우(Klenow) 단편으로 처리하여 평활 말단으로 만들었다. EcoRI으로 절단하여 평활-말단 pCR2.1-헥손R로부터 헥손 R을 축츨하였다. 상기 헥손 R을 pENTR2B-헥손 L 벡터의 평활화된 XbaI 및 EcoRI 부위 내에 삽입하였다. 생성된 재조합 벡터를 pHex로 명명하였다. pGEM-SAd19 헥손이 주형으로 작용하고 서열번호: 1 및 2의 프라이머 세트를 사용하여 pfu 폴리머라제(스트레이타진, 미국 캘리포니아)의 존재하에 PCR을 수행하였다. SAd19의 Mfe-1-제한효소처리된 헥손 유전자를 pHex 벡터의 EcoRI 부위에 클로닝하였다. DNA 서열분석에 의해 분석할 때 정확한 위치에 SAd19의 헥손을 갖는 것으로 밝혀진 생성된 재조합 플라스미드를 pHex-SAd19 헥손으로 명명하였다(도 2A).
<2-2> 상동 재조합을 통한 SAd19 의 헥손으로의 치환
SAd19의 헥손으로 재조합된 키메라 아데노바이러스를 제조하기 위해, 먼저 pENTR2B 벡터(인비트로겐, 캘리포니아)를 EcoRI으로 처리하여 그로부터 ccdB 영역을 제거하였다. 본 발명자들에 의해 이전에 제작된 pAAV-CMV_LK8_UN 벡터(PCT 공개 WO 2009/102085 호 참조)를 KpnI/BglII로 처리하여 CMV_LK8 단편(나중에 평활 말단화됨)을 수득한 다음, 이것을 EcoRI-처리된 pENTR2B의 KpnI/XhoI 부위(나중에 평활 말단화됨) 내에 삽입시켜 재조합 플라스미드 pENTR-CMV_LK8을 수득하였다.
E1A 유전자의 종양 특이성 발현 유닛을 갖는 플라스미드 벡터를 제작하기 위해, DNMT-1(DNA (사이토신-5)-메틸트랜스퍼라제) 유전자의 근접 프로모터 영역(DS 프로모터)을 인간 게놈 DNA로부터 증폭시키고 pCR2.1-토포 벡터(인비트로겐, 캘리포니아) 내에 클로닝시켜 재조합 플라스미드 pCR-DS를 수득하였다. Ex-Taq 폴리머라제(타카라(Takara), 일본)의 존재하에서, PCR 주형으로 인간 게놈 DNA 및 서열번호: 8(5'-CTT CTC GCT GCT TTA TCC CCA TC-3') 및 서열번호: 9(5'-CTC GGA GGC TTC AGC AGA CGC-3')의 프라이머 세트를 사용하여 유전자 증폭을 수행하여, DNMT-1 유전자의 근접 프로모터 영역의 양쪽 말단을 결합시켰다. 94 ℃에서 5 분동안의 변성으로부터 시작하여, 94 ℃에서 30 초동안 변성, 56 ℃에서 30 초동안 어닐링 및 72 ℃에서 1 분동안 연장의 30 주기에 이어, 72 ℃에서 추가로 3 분동안 연장시켜 PCR을 수행하였다.
SacI 및 XhoI에 의해 pCR-DS로부터 절취한 DNA 단편을 pΔE1Sp1B-E2F-1 Rb7Δ19k 벡터[Kim, J., et al., Hum. Gene Ther. 19, p773-786 (2007); mE1A, 대한민국 특허 제 746122 호; ΔE1B19K, 대한민국 특히 제 432953 호]에서 돌연변이 E1A 유전자 전방의 ClaI 및 SalI 부위 내에 삽입시켜 재조합 플라스미드 pSP72-DS_mE1A_ΔE1B19K를 제작하였다. pSP72-DS_mE1A_ΔE1B19K를 BamH1으로 처리하여 수득된 단편을 pENTR-CMV_LK8의 BglII 부위내에 삽입시켜 셔틀 벡터를 수득하고 pENTR-CMV_LK8-DS_mE1A_ΔE1B19K로 명명하였다.
100 ng의 pAD-PL 데스트(Dest)(인비트로겐, 미국 캘리포니아)와 500 ng의 pENTR-CMV_LK8-DS_mE1A_ΔE1B19K의 혼합물에 16 ㎕의 클로나제 I 반응 완충액(인비트로겐, 미국 캘리포니아)을 가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 2 ㎕의 클로나제 I과 함께 1 시간동안 배양한 후, 37 ℃에서 2 ㎕의 프로테이나제 K(2 ㎍/㎕)와 함께 10 분간 배양하였다. 생성된 반응 혼합물 10 ㎕를 취하여 대장균 DH5α 반응능(competent) 세포를 형질전환시킨 다음 암피실린 플레이트 상에 도말하였다. 제한효소 지도에서 양성인 콜로니로부터 추출된 플라스미드 DNA를 DNA 서열분석에 의해 해당 아데노바이러스 벡터로 동정한 다음, pAd H5-8DS로 명명하였다.
pAd H5_8DS의 헥손 유전자를 SAd19 헥손으로 치환시키기 위해, 먼저 500 ng의 pHex-SAd19 헥손 및 50 ng의 pAd H5_8DS를 각각 SphI 및 AsiSi으로 선형화시키고 함께 혼합한 후 전기천공에 의해 대장균 BJ5183 내에 형질전환시켰다. 상동 재조합을 검사하기 위해 고안된 서열번호: 10(5'-ATG CGC AAG GTG TAG CCA-3') 및 서열번호: 11(5'-AGC GTG CTG GCC AGC GTG-3')의 프라이머 세트를 사용한 PCR로 상동 재조합을 스크리닝하였다. 94 ℃에서 5 분동안 변성으로부터 시작하여, 94 ℃에서 30 초동안 변성, 55 ℃에서 40 초동안 어닐링 및 72 ℃에서 1.5 분동안 연장의 30 주기 후 72 ℃에서 추가로 3 분동안 연장시켜 PCR을 수행하였다. 양성으로 스크리닝된 콜로니를, LK8 및 E1A 유전자 둘 다를 포함하는 영역을 증폭시키기 위해 고안된 서열번호: 12(5'-CCC GTT ACA TAA CTT ACG-3')(CMV 센스 프라이머) 및 서열번호: 13(5'-TTA TGG CCT GGG GCG TTT ACA G-3')(E1A 안티센스 프라이머)의 프라이머 세트를 사용한 PCR에 의해 2차 스크리닝하였다. 94 ℃에서 5 분동안 변성으로부터 시작하여, 94 ℃에서 30 초동안 변성, 55 ℃에서 40 초동안 어닐링 및 72 ℃에서 30 초동안 연장의 30 주기 후에 72 ℃에서 추가로 5 분동안 연장시켜 PCR을 수행하였다. 2번의 PCR에 의해 양성으로 스크리닝된 클론으로부터 DNA를 분리하고 이. 콜라이 DH5α에서 증폭시켰다. EcoRI, SpeI, XbaI 및 PshAI에 의한 모든 절단 패턴에서 일치하는 클론을 확보하고 pAd H5/S19_8DS로 명명하였다(도 2B). DNA 서열분석에 의해 pAd H5/S19_8DS가 SAd19의 헥손을 함유한 것을 다시 확인하였다.
DS 프로모터를 함유하는 DNA 단편을 EcoRI 절단에 의해 pCR-DS로부터 절취하고 phRL-nul1 벡터(프로메가, 미국 위스콘신)의 EcoRI 부위내에 클로닝하여 phRL-DS를 생성하였다. phRL-DS를 SalI 및 PstI으로 처리하여 수득된 단편을 pE1.2(O.D.260 인코포레이티드 보이스(Inc. Boise), 미국 아이다호) 셔틀 벡터의 SalI 및 PstI 부위 내에 삽입시켜 pE1.2-DS를 수득하였다. pE1.2-DS로부터 AlwNI 절단에 의해 절취한 1.7 kb 크기의 DNA 단편을, 대장균 XL1-블루 전기-반응능 세포를 사용한 효소-결합 방법에 의해 pAd328(O.D.260 인코포레이티드 보이스, 미국 아이다호)의 SfiI 부위에 클로닝하였다. 암피실린 및 카나마이신으로 보충된 LB 플레이트 상에서 성장한 콜로니로부터 추출된 플라스미드 DNA를 EcoRI, SpeI, XbaI 및 PshAI에 의한 모든 절단 패턴에서 일치하는 것으로써 확보하고 pAd328-DS 아데노바이러스 벡터로 명명하였다(도 2C). 아데노바이러스 E1 유전자를 HAd5의 게놈 DNA로부터 증폭시키고 pGEM-T 이지 벡터(프로메가, 미국 위스콘신)에 클로닝하여 재조합 플라스미드 pGEMT-Ad E1을 수득하였다. pGEMT-Ad E1을 BssHI 절단후 EcoNI로 매우 짧게 처리하여 그로부터 E1B19k 영역을 제거하였다. E1B19k-결실된 pGEMT-Ad E1을 pGEMT-Ad E1Δ19k로명명하였다. pAd328-DS의 E1 유전자를 E1BΔ19k-결실된 E1 유전자로 치환시키기 위해, 먼저 100 ng의 pAd328-DS 및 1 ㎍의 SphI-선형화된 pGEMT-Ad E1Δ19k를 함께 혼합한 후 전기천공에 의해 대장균 BJ5183에 형질전환시켰다. HindIII, SphI 및 EcoRV로 절단시켜 상동 재조합을 스크리닝하였다. 절단 패턴 모두에서 일치하는 클론을 확보하여 pAd328-DSΔ19k로 명명하였다. pAd H5/S19 8DS 플라스미드를 제조하기 위해 전술한 절차에 따라서, pHex-SAd19 헥손 및 pAd328_DS 또는 pAd328-DSΔ19k 사이에 상동 재조합에 의해 pAd328 H5/S19_DS 및 pAd328 H5/S19_DSΔ19k를 제조하였다(도 2D).
<2-3> SAd19 의 헥손으로 재조합된 키메라 아데노바이러스의 제조
플라스미드 pAd H5/S19_8DS를 PacI으로 선형화시키고 A549 세포에 형질감염시켰다. 형질감염 14 일후에, 세포들은 세포변성(cytopathy)을 나타내는 것으로 관찰되어, 배지와 함께 수거하였다. 그로부터 바이러스를 완전히 분리하기 위해, 먼저 세포를 3회 냉동 및 해동시킨 후 원심분리하였다. 바이러스를 함유하는 상등액을 2회의 플라크 정제에 적용시켜 순수한 바이러스를 수득하고 Ad H5/S19_8DS 바이러스로 명명하였다. Ad H5/S19_8DS 바이러스를 그의 게놈 DNA의 서열분석으로 분석하여 SAd19의 헥손 유전자를 갖는 키메라 아데노바이러스로 동정하였다. Ad328 H5/S19_DS 및 Ad328 H5/S19_DSΔ19k 바이러스를 Ad H5/S19_8DS의 제조에 대해 상기 언급한 절차와 같이 제조하였다.
<2-4> SAd19 의 헥손을 갖는 키메라 아데노바이러스의 제조 및 정제
A549 폐암 세포를 150 mm-크기의 30개 배양 접시에서 80% 컨플루언시(confluency)로 성장시킨 다음 20의 MOI의 Ad H5/S19_8DS 바이러스로 감염시켰다. 37 ℃에서 2 일동안 배양시킨 후, 세포를 12,000 x g에서 10 분간 원심분리하여 수거한 다음 10 ml의 용해 완충액(0.5 M 트리스, pH 8.0, 1 mM MgCl2)에 현탁시켰다. 3회의 냉동 및 해동에 의해 세포를 용해시킨 후, 12,000 x g에서 10 분간 냉장 원심분리하여 세포 파편들을 제거하였다. 불연속 CsCl 농도구배를 만들기 위해, 1.4의 비중을 갖는 CsCl 용액 8 ml를 초원심분리관에 넣고, 1.2의 비중을 갖는 CsCl 용액 6 ml로 그들 사이에 경계가 명확히 유지되도록 하는 방식으로 덮었다. 0.22 ㎛ 필터를 통해 여과시킨 바이러스 샘플을 경계가 흐트러지지 않도록 CsCl 1.4/1.2 위에 부하시키고, 상기 관을 10 mM 트리스-HCl(pH 7.9)로 중량 균형을 맞추었다. 상기 관을 SW28 회전자에 적용하고 냉장 조건하에서 23,000 rpm으로 90 분동안 초원심분리하여 바이러스 밴드를 형성시켰다.
상기와 같이 분리된 바이러스를 연속 CsCl 구배 초원심분리 공정을 이용하여 다시 정제하였다. 이를 위해, 1.4의 비중을 갖는 CsCl 용액 8 ml를 초원심분리관(베크만(Beckman), 미국 캘리포니아)에 넣은 다음, 1.2의 비중을 갖는 CsCl 용액 6 ml로 그들 사이에 명확한 경계를 유지하도록 하는 방식으로 덮었다. 구배 스테이션(gradient station)(바이오콤(Biocomp), 캐나다)을 사용하여, 관에 연속 구배를 형성시켰다. 불연속 CsCl 구배 초원심분리에 의해 수득된 바이러스 샘플을 한 부피의 10 mM 트리스-HCl(pH 7.9)로 희석하고, 경계가 흐트러지지 않도록 CsCl 1.4/1.2 구배 관에 부하시켰다. 10 mM 트리스-HCl(pH 7.9)로 중량 균형을 맞춘 후, 상기 관을 냉장 조건하에서 23,000 rpm으로 90 분동안 초원심분리하여 바이러스 밴드를 형성시켰다. 6 시간마다 완충액을 새로운 것으로 교체하면서, PBSG 완충액(10% 글리세롤을 함유하는 PBS)으로 3회 투석시켰다.
실시예 3: SAd19 의 헥손을 갖는 키메라 아데노바이러스의 시험관내 연구
다양한 MOI의 Ad H5/S19_8DS 바이러스로 감염시킨 폐암 세포주 A549 및 정상 세포주 MRC5에서 E1A 및 LK8의 발현 수준을 비교함으로써 Ad H5/S19_8DS 바이러스를 폐암에 대한 선택성에 대해 시험관내 분석하였다. 또한, Ad H5/S19_8DS 바이러스를 간으로의 상기 바이러스의 혈액-순환을 매개하는 응고 인자에 대한 친화도에 대해 측정하였다.
<3-1> MOI -의존성 E1A 발현
6-웰 플레이트에서 약 80% 컨플루언시로 성장시킨 A549 폐암 세포 및 MRC5 정상 세포를 100, 25, 10 및 1의 MOI의 Ad H5/S19_8DS 바이러스로 감염시켰다. 37 ℃에서 24 시간동안 배양한 후, 세포를 3,000 rpm에서 5 분간 원심분리하여 수거하고, 1x SDS-PAGE 완충액(50 mM 트리스(pH 6.8), 2% SDS, 100 mM 다이티오트레이톨, 0.1% 브로모페놀 블루, 10% 글리세롤)에 현탁시키고, 100 ℃, 수조에서 5 분동안 가열하고, 10,000 rpm에서 2 분동안 원심분리하였다. 생성된 현탁액을 4 내지 12% SDS-PAGE 겔(인비트로겐, 미국 캘리포니아) 상에서 20 mA에서 약 2 시간동안 전기영동시켰다. 겔 상에서 분리된 단백질 밴드를, 300 mA의 전기장이 인가된 트리스-글리신 완충액(39 mM 글리신, 48 mM 트리스, 0.037% SDS, 20% 메탄올)에서 이동 유닛(인비트로겐, 미국 캘리포니아)을 사용하여 약 90 분동안 PVDF 막 상으로 옮겼다. 막을 실온에서 TBS 블로킹 용액(터모 사이언티픽(Thermo Scientific), 미국 일리노이)으로 1 시간동안 블로킹시켰다. 1차 항체로 작용하는 마우스 항-E1A 단클론성 항체(BD 파밍겐(BD Pharmingen), 미국 캘리포니아)를 5% 탈지유/1x TBST 완충액으로 1:3,000으로 희석하고, 실온에서 1 시간동안 프로빙(probing)하고, 1x TBST 완충액으로 각각 5 분씩 6회 세척하였다. 2차 항체로 작용하는 항-마우스 HRP(KPL, 미국 매사추세츠)를 5% 탈지유/1x TBST 완충액으로 1:5,000으로 희석하고, 30 분동안 프로빙하고, 1x TBST 완충액으로 각각 5 분씩 6회 세척하고, 발색제(ECL, 아머샴(Amersham), 영국)와 반응시켜 E1A 단백질 밴드를 가시화시켰다. E1A의 발현 수준은 MOI-의존성 방식으로 증가하여, MRC-5 정상 세포에서보다 A549 암세포에서 100배 더 높았다(도 3).
<3-2> 응고 인자 X에 대한 친화도
Ad H5/S19_8DS를 SPR(표면 플라스몬 공명) 방법을 이용하여 응고 인자 X에 대한 친화도에 대해 분석하였다. 정제된 응고 인자 X(HCX-0050, 헤마톨로지컬 테크놀로지 인코포레이티드(Haematological Technologies Inc.), 미국 버몬트)를 CS5 센서 칩(비아코어(Biacore), 스웨덴)에 적용하였다. 정제된 Ad H5_8DS 및 Ad H5/S19_8DS 바이러스 각각을 5 mM CaCl2를 함유하는 HBSP 완충액(10 mM HEPES, pH 7.4, 150 mM NaCl, 0.005% 트윈(Tween)20) 중에 3.0 x 1011 VP/ml, 1.5 x 1011 VP/ml 및 0.75 x 1011 VP/ml의 농도로 희석하였다. HBSEP(10 mM HEPES, pH 7.4, 150 mM NaCl, 3 mM EDTA, 0.005% 트윈20)를 칩으로부터 바이러스를 분리시키기 위한 재생 완충액으로 사용하였다. 바이러스 용액을 30 ㎕/분의 유량으로 응고 인자 X-고정화된 CM5 센서 칩 위로 통과시키는 동안 RU 값을 기록하였다. 상기 상이한 세 농도에서, 아데노바이러스 혈청형 5 Ad H5_8DS는 각각 300, 150 및 70 RU의 고정화된 인자에 대해 SPR 신호를 나타낸 반면, Ad H5/S19_8DS는, SPR 신호가 세 농도 모두에서 5 RU 미민인 것으로 나타나 응고 인자 X에 대한 친화도가 매우 약하거나 거의 나타내지 않았다(도 4A). Ad328 H5/S19_DS 및 Ad328 H5/S19_DSΔ19k도 또한 인자 IX 대신 응고 인자 X 단백질을 사용하여 하기 <3-3>에 기술된 바와 같은 면역침전 방법에 의해 응고 인자 X에 대한 친화도에 대해 분석하였다(도 4D).
<3-3> 응고 인자 IX 에 대한 친화도
Ad H5/S19_8DS를 면역침전 방법을 이용하여 응고 인자 IX에 대한 친화도에 대해 분석하였다. 관 중의 1 ml의 PBS에 1 x 1011 VP의 Ad H5_8DS 또는 Ad H5/S19_8DS를 10 ㎍의 정제된 응고 인자 IX(HCIX-0040, 헤마톨로지컬 테크놀로지 인코포레이티드, 미국 버몬트), 5 ㎍의 염소 항-응고 인자 IX 항체 및 50 ㎕의 세파로스-단백질 G(50% 슬러리)와 함께 첨가한 후, 4 ℃, 오비탈 진탕기에서 2 시간동안 배양하였다. 5,000 rpm에서 5 분간 원심분리한 후, 상기와 같이 수득된 세파로스-단백질 G 펠릿을 PBS로 3회 세척하고, 100 ㎕의 1x SDS-PAGE 샘플 완충액(50 mM 트리스(pH 6.8), 2% SDS, 100 mM 다이티오트레이톨, 0.1% 브로모페놀 블루, 10% 글리세롤)에 현탁시키고, 5 분간 가열하였다. 상기 현탁액을 원심분리하고, 생성된 상등액을 4 내지 12% SDS-PAGE 겔 상에서 20 mA로 약 2 시간동안 전기영동하였다. 상기와 같이 분리된 단백질을 약 90 분동안, 300 mA가 인가된 트리스-글리신 완충액(39 mM 글리신, 48 mM 트리스, 0.037% SDS, 20% 메탄올)을 함유하는 이동 유닛 중의 PVDF 막 상으로 옮겼다. 상기 막을 실온에서 TBS 블로킹 용액(터모 사이언티픽, 미국 일리노이)으로 1 시간동안 블로킹하였다. 1차 항체로 작용하는 마우스 항-HAd5 섬유 단클론성 항체(네오마커스(NeoMarkers), 미국 캘리포니아)를 5% 탈지유/1x TBST 완충액으로 1:3,000으로 희석하고, 실온에서 1 시간동안 프로빙하고, 1x TBST 완충액으로 각각 5 분씩 6회 세척하였다. 2차 항체로 작용하는 항-마우스 HRP(KPL, 미국 매사추세츠)를 5% 탈지유/1x TBST 완충액으로 1:5,000으로 희석하고, 30 분동안 프로빙하고, 1x TBST 완충액으로 각각 5 분씩 6회 세척하고, 발색제(ECL, 아머샴, 영국)와 반응시켜 E1A 단백질 밴드를 가시화시켰다. PVDF 막 상의 블롯을 오비탈 진탕기 상에서 진탕시키면서 레스토어(Restore, 등록상표) 웨스턴 블롯 스트리핑 완충액(터모 사이언티픽, 미국 일리노이)에 1 시간동안 침지시키고, 1x TBST 완충액으로 각각 10 분씩 3회 세척하고, 실온에서 TBS 블로킹 용액으로 1 시간동안 블로킹하였다. 1차 항체로 작용하는 양의 항-응고 인자 IX 항체(어피니티 바이올로지칼스(Affinity Biologicals), 캐나다)를 5% 탈지유/1x TBST 완충액으로 1:3,000으로 희석하고, 실온에서 1 시간동안 프로빙하고, 1x TBST 완충액으로 각각 5 분씩 6회 세척하였다. 2차 항체로 작용하는 항-양 HRP(KPL, 미국 매사추세츠)를 5% 탈지유/1x TBST 완충액으로 1:5,000으로 희석하고, 30 분동안 프로빙하고, 1x TBST 완충액으로 각각 5 분씩 6회 세척하고, 발색제(ECL, 아머샴, 영국)와 반응시켜 응고 인자 IX 밴드를 가시화시켰다(도 4B). Ad328 H5/S19_DS 및 Ad328 H5/S19_DSΔ19k도 또한 전술한 바와 같은 면역침전 방법을 이용하여 응고 인자 IX에 대한 친화도에 대해 분석하였다(도 4C).
실시예 4: SAd19 의 헥손을 갖는 키메라 아데노바이러스의 생체내 연구
<4-1> 생체분포
Ad H5/S19_8DS를 3 x 1010 VP의 용량으로 6 주령된 Balb/c 정상 마우스 및 누드 마우스에 정맥내 주사하였다. 주사 2일 후에, DNeasy 혈액 및 조직 키트(키아겐, 독일)를 이용하여 뇌, 간, 폐, 심장, 흉선, 비장, 난소, 자궁 및 혈액으로부터 DNA를 분리하였다. 분리된 DNA를 OD 분광광도계를 사용하여 정량적으로 분석하고 PCR에 주형으로서 200 ng의 양으로 사용하였다. 아데노바이러스의 E4 영역을 서열번호: 14(5'-ACT CGA GCA CGT TGT GCA TTG TCA-3') 및 15(5'-TGT CGA CTA GTT TTC TTA AAA TGG-3')의 프라이머 세트를 사용하여 PCR로 증폭시켰다. 94 ℃에서 5 분간 변성으로 시작하여, 94 ℃에서 30 초동안 변성, 55 ℃에서 40 초동안 어닐링 및 72 ℃에서 1 분동안 연장의 30 주기에 이어 72 ℃에서 추가로 3 분간 연장시켜 PCR을 수행하였다. PCR 산물을 전기장의 존재 하에 1% 아가로스 겔 상에 전기영동시켜 장기에 따른 아데노바이러스의 분포를 분석하였다. 주사 시, HAd5, 즉, Ad H5_8DS는 간 및 폐에서 가장 많이 관찰되었고, 심장 및 비장에서 부분적으로 검출되었다. 대조적으로, SAd19의 헥손을 갖는 키메라 아데노바이러스인 Ad H5/S19_8DS 바이러스는 주로 심장 및 비장에서 검출되었으며, 간 및 폐에서는 단지 일부가 검출되었다(도 5). 이러한 분포 패턴은 정맥내 주사 시 간으로 형질도입되며 대용량으로 주사시 간독성을 유도하는 것으로 알려져 있는 아데노바이러스 혈청형 5의 생체분포와 매우 상이하다. 즉, Ad H5/S19_8DS 바이러스는, 바이러스가 응고 인자 X에 대한 친화도를 거의 나타내지 않은 실시예 <3-2>의 관찰로부터 예측되는 바와 같이, 간으로 매우 소량으로 형질도입되었다.
실시예 5: HAd5 중화 항체의 면역 인식을 회피하는, SAd19 의 헥손을 갖는 키 메라 아데노바이러스의 능력에 대한 시험관내 분석
<5-1> E1A 발현 패턴에 의한 AD H5 / S19 _8 DS 및 Ad328 H5 / S19 _ DS 의 형질도입에 대한 항- HAd5 -양성 혈장의 영향 검사
야생형 HAd5를 마우스의 뒷다리에 1 x 1011 VP의 용량으로 근육내 주사하고, 2주 후에 동일한 용량의 바이러스를 다시 주사하여 면역 반응을 유발하였다. 바이러스를 주사한 모든 마우스로부터 취한 혈액으로부터 혈청을 분리한 다음, 항-아데노바이러스 항체 수준에 대해 측정하였다. 이와 관련하여, 혈청의 1/25, 1/100 및 1/1,000 희석물을 아데노바이러스-코팅된 ELISA 플레이트에 가하고, 1 시간동안 배양하고, PBST(0.1% 트윈20 함유 PBS)로 3회 세척한 후, HRP-결합 항-마우스 IgG 항체의 1/5,000 희석물과 함께 1 시간동안 배양하였다. 플레이트를 PBST(0.1% 트윈20 함유 PBS)로 5회 세척한 후, 30 분동안 TMB 기질과 반응시켜 색을 발현시키고 1 M 인산으로 종료시켰다. 플레이트를 흡광도에 대해 측정하였다. 항-아데노바이러스 항체(AbD 세로텍(AbD Serotec), 미국 노스캐롤라이나)의 1/1000 희석물과 반응시켜 제조한 양성 대조군과 비교하여 흡광도가 50% 이상 더 높을 때 이들을 양성 면역 반응을 유도하는 것으로 간주하였다. 6-웰 플레이트에서 90% 컨플루언시로 성장시킨 A549 세포를 Ad H5/S19_8DS 또는 Ad328 H5/S19_DS로 25의 MOI로 감염시키고, 1 시간후에 실온에서 양성 면역 반응을 갖는 것으로 측정된 마우스 혈장과 함께 배양하였다. 37 ℃에서 24 시간동안 배양한 후, 세포를 3,000 rmp에서 5 분간 원심분리하여 수거하고, 1x SDS-PAGE 샘플 완충액(50 mM 트리스(pH 6.8), 2% SDS, 100 mM 다이티오트레이톨, 0.1% 브로모페놀 블루, 10% 글리세롤)에 현탁시키고, 100 ℃, 수조에서 5 분간 가열하고, 10,000 rpm으로 2 분간 원심분리하였다. 정화시킨 상등액을 전기영동 키트(노벡스(Novex))를 사용하여 20 mA의 존재하에 4 내지 12% SDS-PAGE 겔 상에서 약 2 시간동안 전기영동하였다. 분리된 단백질을 300 mA의 전기장이 인가된 트리스-글리신 완충액(39 mM 글리신, 48 mM 트리스, 0.037% SDS, 20% 메탄올)을 함유하는 이동 유닛(노벡스)에서 PVDF 막 위로 90 분동안 옮겼다. 상기 막을 실온에서 TBS 블로킹 용액(터모 사이언티픽, 미국 일리노이)으로 1 시간동안 블로킹하였다. 상기 막을 실온에서 5% 탈지유/1x TBST 완충액 중의 1차 항체로서 마우스 항-E1A 단클론성 항체(BD 파밍겐, 미국 캘리포니아)의 1:3,000 희석물과 함께 1 시간동안 배양한 다음, 1x TBST 완충액으로 각각 5 분씩 6회 세척하였다. 5% 탈지유/1x TBST 완충액 중에서 2차 항체로서 항-마우스 HRP(KPL, 미국 매사추세츠)의 1:5,000 희석물과 함께 30 분동안 배양한 후, 1x TBST 완충액으로 각각 5 분씩 6회 세척하였다. 발색 시약(ECL, 아머샴, 영국)으로 E1A 단백질 밴드를 가시화시켰다. Ad H5_8DS의 형질도입은 항-HAd5 항체-양성 혈장에 의해 억제된 반면, 키메라 아데노바이러스인 Ad H5/S19_8DS(도 6A), Ad328 H5/S19_DS 및 Ad328 H5/S19_DSΔ19k(도 6B)의 형질도입에 대한 항-HAd5 항체-양성 혈장의 영향은 없었다.
<5-2> 면역염색에 의한 H5 / S19 _8 DS 형질도입에 대한 항- HAd -양성 혈장의 영향 검사
양성 면역 반응인 것으로 결정된 마우스 혈장과 함께 실온에서 1 시간동안 배양한 후, 90% 컨플루언시로 배양된 A549 세포를 Ad H5/S19_8DS 또는 Ad H5/S19_DS로 25의 MOI로 감염시킨 다음, 37 ℃에서 2 일동안 배양하였다. 세포를 냉 메탄올로 고정시키고, 무단백질(protein-free) T20(TBS) 블로킹 완충액(터모 사이언티픽, 미국 일리노이)으로 1 시간동안 블로킹하였다. 세포를 PBST 완충액 중의 마우스 항-E1A 단클론성 항체(BD 파밍겐, 미국 캘리포니아)의 희석물(1/3,000)과 함께 1 시간동안 배양하고, PBST 완충액으로 각각 5 분씩 6회 세척하였다. 이어서, 세포를 PBST 완충액 중의 HRP-결합 항-마우스 2차 항체의 희석물(1/5,000)로 다시 처리하고, DAB 용액과 반응시켜 발색시켰다. 항-HAd5 항체-양성 혈장은 Ad H5_8DS의 형질도입을 억제하지만 키메라 아데노바이러스 Ad H5/S19_8DS(도 7A), Ad328 H5/S19_DS 및 Ad H5/S19_DSΔ19k(도 7B)의 형질도입에는 영향을 미치지 않는 것으로 나타났다.
<5-3> HAd5 중화 항체의 면역 인식을 회피하는, SAd19 의 헥손을 갖는 키메라 아데노바이러스의 능력에 대한 생체내 검사
야생형 HAd5를 햄스터의 뒷다리에 1 x 1011 VP의 용량으로 근육내 주사하고, 2주 후에 동일한 용량의 바이러스를 다시 주사하여 면역 반응을 유발하였다. 바이러스를 주사한 모든 햄스터로부터 취한 혈액으로부터 혈청을 분리한 다음, 항-아데노바이러스 항체 수준에 대해 측정하였다. 이와 관련하여, 혈청의 1/25, 1/100 및 1/1,000 희석물을 아데노바이러스-코팅된 ELISA 플레이트에 가하고, 1 시간동안 배양하고, PBST(0.1% 트윈20 함유 PBS)로 3회 세척한 후, HRP-결합 항-햄스터 IgG 항체의 1/5,000 희석물과 함께 1 시간동안 배양하였다. 플레이트를 PBST(0.1% 트윈20 함유 PBS)로 5회 세척한 후, 30 분동안 TMB 기질과 반응시켜 색을 발현시키고 1 M 인산으로 종료시켰다. 플레이트를 흡광도에 대해 측정하였다. 항-아데노바이러스 항체의 1/1,000 희석물과 반응시켜 제조한 양성 대조군과 비교하여 흡광도가 50% 이상 더 높을 때 이들을 양성 면역 반응을 유도하는 것으로 간주하였다. HAd5, 즉, AD H5_8DS를 1 x 1011 VP의 용량으로 정맥내 주사한 면역화 햄스터는 혈중 LK8 수준이 검출하기에 너무 낮은 것으로 나타났다. 대조적으로, 1 x 1011 VP 용량의 Ad H5/S10_8DS의 정맥내 주사는 200 ng/ml 이상의 혈중 LK8 수준을 나타내었으며, 발현량은 28 일동안 200 ng/ml 이상의 수준으로 유지되어, SAd19의 헥손을 갖는 키메라 아데노바이러스가 항-인간 아데노바이러스 혈청형 5 중화 항체에 의해 그의 형질도입이 억제되지 않음을 시사하였다(도 8).
실시예 6: SAd19 의 헥손을 갖는 키메라 아데노바이러스의 독성
SAd19의 헥손을 독성에 대해 연구하였다. 이를 위해, 바이러스를 각각 1 x 1011 VP, 5 x 1010 VP, 1 x 1010 VP, 5 x 109 VP 및 1 x 109 VP의 용량으로 5마리 Balb/c 마우스의 5개 군에 정맥내 주사하고 이들을 격일로 체중을 측정하였다. 주사후 3 주 및 6 주째에, 마우스로부터 혈액 및 혈청을 취하고, 백혈구, 적혈구, 혈소판 및 헤모글로빈 수준, 헤마토크릿(hematocrit), MCV(mean corpuscular volume, 평균 적혈구 용적), MCH(mean corpuscular hemoglobin, 평균 적혈구 혈색소량), MCHC(mean corpuscular hemoglobin concentration, 평균 적혈구 혈색소 농도), 및 백혈구 감별 계수(differential leucocyte count)에 대해 분석하였다. 간 기능 검사를 위해 알부민, 총단백질, SGPT(ALT), SGOT(AST) 및 ALP의 수준을 검사하고, 신장 기능 검사를 위해 크레아티닌 및 BUN을, 근육 검사를 위해 크레아티닌 키나제를 검사하고, 대사 검사를 위해 총 콜레스테롤 및 글루코스를 검사하였다. 1 x 1011 VP의 용량을 인간 아데노바이러스 혈청형 5 바이러스 Ad H5_8DS를 주사한 군에서 5 마리 마우스 중, 4 마리가 5 일째에 죽었으며, 나머지 한마리는 매우 병약하였다. 이들은 부검에 의해 간경변을 앓고 있는 것으로 나타났으며, 다른 장기에는 이상이 없었다. 다른 군은 모두 부검으로 검사시 정상인 것으로 관찰되었다(도 9).
<6-1> 혈액 검사
HAd5, 즉, Ad H5_8DS를 1 x 1011 VP, 5 x 1010 VP, 1 x 1010 VP, 5 x 109 VP 및 1 x 109 VP의 용량으로 정맥내 주사하였다. 5 일째에, 1 x 1011 VP의 바이러스를 주사한 마우스가 모두 죽었다. 다른 한편으로, 다른 군은 이상 독성의 소견을 나타내지 않았다. 시험군과 음성 대조군 사이의 혈액학적 및 혈액생화확 검사에서 통계적인 차이를 나타내지 않았다(도 10). 이상 독성 소견은 SAd19의 헥손을 갖는 키메라 아데노바이러스인 Ad H5/S19_8DS를 1 x 1011 VP, 5 x 1010 VP, 1 x 1010 VP, 5 x 109 VP 및 1 x 109 VP의 용량으로 주사한 군에서는 나타나지 않았다. 또한, 시험군과 PBS-주사 음성 대조군 사이에 혈액학적 및 혈액 생화학 검사에서 통계적 차이가 나타나지 않았다(도 11). 최대 용량의 HAd5를 주사한 군에서 검출된 간독성은 SAd19의 헥손을 갖는 키메라 아데노바이러스를 주사한 상응하는 군에서는 관찰되지 않았다.
<6-2> 생체검사
주사한 마우스로부터 뇌, 심장, 간, 폐, 신장, 비장, 자궁 및 난소를 절취하고, 3.7% 중성 포르말린으로 고정시키고, 파라핀에 침지시키고, 슬라이싱하고, H&E로 염색하였다. 1 x 1011 VP의 인간 아데노바이러스 혈청형을 주사한 군을 제외하고 검사 군 모두에서 장기의 이상은 발견되지 않았다. 간 생검 결과는 1 x 1011 VP-주사군에서 광범위한 간 괴사를 나타내었으며, 이에 의해 급성 간부전이 마우스가 죽도록 유도한 것으로 생각되었다. 이것은 아데노바이러스 간독성의 일반적인 소견이었다. SAd19의 헥손을 갖는 키메라 아데노바이러스에 있어서, 1 x 1011 VP의 용량에서 주사시에도 간독성을 나타내지 않아서, SAd19의 헥손이 HAd5가 사용될 때 야기된 간독성 문제에 대한 가망성 있는 해결책일 수 있음을 시사하였다.
실시예 7: 동물 종양 모델에서 SAd19 의 헥손을 갖는 키메라 아데노바이러스 의 항-종양 활성
<7-1> 인간 폐암 이종이식 동물 모델에 대한 키메라 아데노바이러스의 종양-선택적 항-종양 활성
비-소세포 폐암(NSCLC) 세포주 NCI-H460을 5 x 106 세포의 용량으로 면역-결핍 Balb/c 누드 마우스에 피하 주사하여 50 내지 100 mm3 크기의 종양을 형성하였다. 마우스를 무작위로 5 마리 마우스의 4개 군으로 나누었다. 대조군의 마우스에 LK8 유전자를 갖는 복제 결핍 아데노바이러스, Ad-LK8을 1 x 109 pfu의 용량으로, 또는 PBS를 2일의 규칙적 간격으로 3회 정맥내 투여하였다. 시험군의 경우, 이들 마우스에 Ad H5/S19_8DS를 1 x 109 pfu 및 2 x 108 pfu의 용량으로 규칙적 간격으로 3회 정맥내 주사하였다. 종양을 2 또는 3 일마다 크기를 측정하여 종양 성장 곡선을 플로팅하였다. 첫번째 바이러스 주사후 24일에, Ad H5/S19_8DS를 1 x 109 pfu의 용량으로 주사한 군은 PBS-투여군보다 74% 더 높은 종양 성장 억제율을 나타내었으며, Ad-LK8-투여군보다 64% 더 높은 종양 성장 억제율을 나타내었다. 다른 한편으로, Ad H5/S19_8DS를 2 x 108 pfu의 용량으로 주사한 군은 PBS-투여군보다 61% 더 높은 종양 성장 억제율을 나타내었고, Ad-LK8-투여군보다 48% 더 높은 종양 성장 억제율을 나타내었다. 2-원 RM ANOVA 시험은 주사후 17 일부터 PBS-투여군에 비해 Ad H5/S19_8DS를 주사한 두 군 모두의 통계적 유의성을 나타내었다(주사후 17 일째 P<0.05; 주사후 21 및 24 일째 P<0.01)(도 12).
<7-2> HAd5 로 면역화된 인간 폐암 동소성 동물 모델에 대한 키메라 아데노바 이러스의 종양-선택적 항-종양 활성
Balb/c 누드 마우스 뒷다리에 HAd5를 1 x 1010 VP의 용량으로 매회 2주의 규칙적 간격으로 2회 근육내 주사하였다. 마우스로부터 취한 혈액은 항-HAd5 항체를 함유하는 것으로 나타났다. NSCLC 세포주 NCI-H2172를 1 x 106 세포의 용량으로 꼬리 정맥내에 접종하였다. 미처리(naive) 마우스 및 면역화 마우스에 종양 접종후 7, 9 및 11 일에 Ad-LK8, Ad H5/S19_8DS 또는 Ad H5_8DS를 1 x 109 pfu의 주사 용량으로 3회 정맥내 주사하였다. 6 주째에, 폐를 마우스로부터 절제하였다(도 13). 폐에서 생성된 종양을 계수하고 크기별 군으로 나누었다: x ≤ 0.5 cm, 0.5 cm < x ≤ 0.7 cm, 및 0.7 cm < x ≤ 1 cm로 이들은 각각 5, 7 및 10 점을 부여하였다. 폐에서 생성된 종양은 PBS-투여한 음성 대조군에서 평균 18.6개 및 Ad-LK8-투여군에서 11.2개로 계수된 것으로 나타났다. Ad H5/S19_8DS를 투여한 군의 경우, 이들은 HAd5로 면역화 또는 비면역화시 각각 평균 5.6개 및 5.4개의 종양을 갖는 것으로 나타났다. 다른 한편으로, Ad H5_8DS를 투여한 군의 마우스는 면역화 또는 미처리 마우스의 폐에서 평균 10.8개 및 6.2개의 종양을 갖는 것으로 나타났다. 그러므로, Ad H5_8DS는 면역화와 무관하게 거의 동일한 역가를 나타내었지만, Ad H5_8DS는 항-HAd5 항체에 의해 상당히 감소된 효능을 나타내었다. 평균 폐 부피는 정상 마우스에서 274 mm3으로, PBS-투여군에서는 570 mm3으로 및 Ad-LK8-투여군에서는 480 mm3으로 측정되었다. 그러나, Ad H5/S19_8DS를 주사한 마우스 군은 면역화 또는 비면역화시 각각 370 mm3의 폐 및 360 mm3의 폐를 갖는 것으로 나타났다. 이들 사이에 폐 부피에는 별 차이가 없었다. Ad H5_8DS를 투여한 군에서, 평균 폐 부피는 면역화 또는 비면역화시 각각 410 mm3 및 350 mm3이었다. 폐의 평균 중량은 정상 마우스에서 170 mg, PBS-투여군에서 376 mg 및 Ad-LK8-투여군에서 278 mg인 것으로 측정되었다. Ad H5/S19_8DS를 주사한 경우, 면역화 또는 비면역화 마우스 군 둘 다의 평균 폐 중량은 218 mg으로 측정된 반면, Ad H5_8DS-투여군의 평균 폐 중량은 면역화시 240 mg 및 비면역화시 230 mg이었다. 종양 크기에 따라 수득된 점수에 의하면, 이들은 평균적으로 PBS-투여군에서 107.8 및 Ad-LK8-투여군에서 60.8로 측정되었다. Ad H5/S19_8DS를 주사한 경우, 면역화군 및 비면역화군은 각각 28점 및 27점을 수득하였다. 다른 한편으로, Ad H5_8DS를 주사한 경우, 면역화군 및 비면역화군은 각각 57.2 및 32.6을 수득하였다(도 14). 모두 합쳐서, 이들 데이터는 HAd5에 의한 면역화와 무관하게 Ad H5/S19_8DS는 정맥내 주사한 경우에도 항-종양 활성을 부여할 수 있음을 시사한다.
본 발명을 상기 특정 양태들에 관하여 기술하였지만, 첨부된 특허청구범위에 의해 한정되는 바와 같은 본 발명의 범위에 또한 포함되는 다양한 수정 및 변형이 당해 분야에 숙련된 자에 의해 본 발명에 이루어질 수 있음을 인지해야 한다.
<110> Mogam Biotechnology Research Institute <120> HEXON ISOLATED FROM SIMIAN ADENOVIRUS SEROTYPE 19, HYPERVARIABLE REGION THEREOF AND CHIMERIC ADENOVIRUS USING THE SAME <130> FPL/201210-0067 <160> 21 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hexon F primer (Mfe I) <400> 1 ggcaattgat ggccacccca tcgatg 26 <210> 2 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hexon R primer (Mfe I) <400> 2 ggcaattgtt aggtggtggc gttgcc 26 <210> 3 <211> 2799 <212> DNA <213> Simian Adenovirus Serotype 19 <400> 3 atggccaccc catcgatgat gccgcagtgg tcttacatgc acatcgccgg gcaggacgcc 60 tcggagtacc tgagccccgg cctcgtgcag tttgcccgcg ccaccgacac ctacttcagc 120 ttgggaaaca agtttagaaa ccccaccgtg gcccccacgc acgatgtgac cacggaccgc 180 tcgcagagac tgaccctgcg ctttgtgccc gtagaccggg aggacaccgc ttactcgtac 240 aaagtgcgct tcaccctagc agtaggggac aaccgtgtgt tggacatggc cagtacctat 300 tttgacatcc ggggcacgct agaccgcggt cccagcttca agccttattc tggcacagct 360 tacaacgcgc tggcccctaa 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Thr His Asp Val Thr Thr Asp Arg Ser Gln Arg Leu 50 55 60 Thr Leu Arg Phe Val Pro Val Asp Arg Glu Asp Thr Ala Tyr Ser Tyr 65 70 75 80 Lys Val Arg Phe Thr Leu Ala Val Gly Asp Asn Arg Val Leu Asp Met 85 90 95 Ala Ser Thr Tyr Phe Asp Ile Arg Gly Val Leu Asp Arg Gly Pro Ser 100 105 110 Phe Lys Pro Tyr Ser Gly Thr Ala Tyr Asn Ser Leu Ala Pro Lys Thr 115 120 125 Ala Pro Asn Pro Cys Glu Trp Lys Asp Asn Asn Lys Ile Lys Val Arg 130 135 140 Gly Gln Ala Pro Phe Ile Gly Thr Asn Ile Asn Lys Asp Asn Gly Ile 145 150 155 160 Gln Ile Gly Thr Asp Thr Thr Asn Gln Pro Ile Tyr Ala Asp Lys Thr 165 170 175 Tyr Gln Pro Glu Pro Gln Val Gly Gln Thr Gln Trp Asn Ser Glu Val 180 185 190 Gly Ala Ala Gln Lys Val Ala Gly Arg Val Leu Lys Asp Thr Thr Pro 195 200 205 Met Leu Pro Cys Tyr Gly Ser Tyr Ala Lys Pro Thr Asn Glu Lys Gly 210 215 220 Gly Gln Ala Ser Leu Ile Thr Asn Gly Thr Asp Gln Thr Leu Thr Ser 225 230 235 240 Asp Val Asn Leu Gln Phe Phe Ala Leu Pro Ser Thr Pro Asn Glu Pro 245 250 255 Lys Ala Val Leu Tyr Ala Glu Asn Val Ser Ile Glu Ala Pro Asp Thr 260 265 270 His Leu Val Tyr Lys Pro Asp Val Ala Gln Gly Thr Ile Ser Ser Ala 275 280 285 Asp Leu Leu Thr Gln Gln Ala Ala Pro Asn Arg Pro Asn Tyr Ile Gly 290 295 300 Phe Arg Asp Asn Phe Ile Gly Leu Met Tyr Tyr Asn Ser Thr Gly Asn 305 310 315 320 Met Gly Val Leu Ala Gly Gln Ala Ser Gln Leu Asn Ala Val Val Asp 325 330 335 Leu Gln Asp Arg Asn Thr Glu Leu Ser Tyr Gln Leu Met Leu Asp Ala 340 345 350 Leu Gly Asp Arg Ser Arg Tyr Phe Ser Met Trp Asn Gln Ala Val Asp 355 360 365 Ser Tyr Asp Pro Asp Val Arg Ile Ile Glu Asn His Gly Val Glu Asp 370 375 380 Glu Leu Pro Asn Tyr Cys Phe Pro Leu Gly Gly Ser Ala Ala Thr Asp 385 390 395 400 Thr Tyr Ser Gly Ile Lys Ala Asn Gly Gln Thr Trp Thr Ala Asp Asp 405 410 415 Asn Tyr Ala Asp Arg Gly Ala Glu Ile Glu Ser Gly Asn Ile Phe Ala 420 425 430 Met Glu Ile Asn Leu Ala Ala Asn Leu Trp Arg Ser Phe Leu Tyr Ser 435 440 445 Asn Val Ala Leu Tyr Leu Pro Asp Ser Tyr Lys Ile Thr Pro Asp Asn 450 455 460 Ile Thr Leu Pro Glu Asn Lys Asn Thr Tyr Ala Tyr Met Asn Gly Arg 465 470 475 480 Val Ala Val Pro Ser Ala Leu Asp Thr Tyr Val Asn Ile Gly Ala Arg 485 490 495 Trp Ser Pro Asp Pro Met Asp Asn Val Asn Pro Phe Asn His His Arg 500 505 510 Asn Ala Gly Leu Arg Tyr Arg Ser Met Leu Leu Gly Asn Gly Arg Tyr 515 520 525 Val Pro Phe His Ile Gln Val Pro Gln Lys Phe Phe Ala Ile Lys Asn 530 535 540 Leu Leu Leu Leu Pro Gly Ser Tyr Thr Tyr Glu Trp Asn Phe Arg Lys 545 550 555 560 Asp Val Asn Met Ile Leu Gln Ser Ser Leu Gly Asn Asp Leu Arg Val 565 570 575 Asp Gly Ala Ser Val Arg Phe Asp Ser Ile Asn Leu Tyr Ala Asn Phe 580 585 590 Phe Pro Met Ala His Asn Thr Ala Ser Thr Leu Glu Ala Met Leu Arg 595 600 605 Asn Asp Thr Asn Asp Gln Ser Phe Asn Asp Tyr Leu Cys Ala Ala Asn 610 615 620 Met Leu Tyr Pro Ile Pro Ser Asn Ala Thr Ser Val Pro Ile Ser Ile 625 630 635 640 Pro Ser Arg Asn Trp Ala Ala Phe Arg Gly Trp Ser Phe Thr Arg Leu 645 650 655 Lys Thr Lys Glu Thr Pro Ser Leu Gly Ser Gly Phe Asp Pro Tyr Phe 660 665 670 Thr Tyr Ser Gly Ser Val Pro Tyr Leu Asp Gly Thr Phe Tyr Leu Asn 675 680 685 His Thr Phe Lys Lys Val Ser Ile Met Phe Asp Ser Ser Val Ser Trp 690 695 700 Pro Gly Asn Asp Arg Leu Leu Thr Pro Asn Glu Phe Glu Ile Lys Arg 705 710 715 720 Thr Val Asp Gly Glu Gly Tyr Asn Val Ala Gln Cys Asn Met Thr Lys 725 730 735 Asp Trp Phe Leu Ile Gln Met Leu Ser His Tyr Asn Ile Gly Tyr Gln 740 745 750 Gly Phe Tyr Val Pro Glu Ser Tyr Lys Asp Arg Met Tyr Ser Phe Phe 755 760 765 Arg Asn Phe Gln Pro Met Ser Arg Gln Val Val Asn Thr Thr Thr Tyr 770 775 780 Lys Glu Tyr Gln Asn Val Thr Leu Pro Phe Gln His Asn Asn Ser Gly 785 790 795 800 Phe Val Gly Tyr Met Gly Pro Thr Met Arg Glu Gly Gln Ala Tyr Pro 805 810 815 Ala Asn Tyr Pro Tyr Pro Leu Ile Gly Gln Thr Ala Val Pro Ser Leu 820 825 830 Thr Gln Lys Lys Phe Leu Cys Asp Arg Thr Met Trp Arg Ile Pro Phe 835 840 845 Ser Ser Asn Phe Met Ser Met Gly Ala Leu Thr Asp Leu Gly Gln Asn 850 855 860 Met Leu Tyr Ala Asn Ser Ala His Ala Leu Asp Met Thr Phe Glu Val 865 870 875 880 Asp Pro Met Asp Glu Pro Thr Leu Leu Tyr Val Leu Phe Glu Val Phe 885 890 895 Asp Val Val Arg Ile His Gln Pro His Arg Gly Val Ile Glu Ala Val 900 905 910 Tyr Leu Arg Thr Pro Phe Ser Ala Gly Asn Ala Thr Thr 915 920 925 <210> 19 <211> 964 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Consensus sequence among Ad5, Ad41 and SAd19 Hexons <220> <221> SITE <222> (128)..(473) <223> HVR region <400> 19 Met Ala Thr Pro Ser Met Met Pro Gln Trp Ser Tyr Met His Ile Ala 1 5 10 15 Gly Gln Asp Ala Ser Glu Tyr Leu Ser Pro Gly Leu Val Gln Phe Ala 20 25 30 Arg Ala Thr Asp Thr Tyr Phe Ser Leu *** Asn Lys Phe Arg Asn Pro 35 40 45 Thr Val Ala Pro Thr His Asp Val Thr Thr Asp Arg Ser Gln Arg Leu 50 55 60 Thr Leu Arg Phe Ile Pro Val Asp Arg Glu Asp Thr Ala Tyr Ser Tyr 65 70 75 80 Lys *** Arg Phe Thr Leu Ala Val Gly Asp Asn Arg Val Leu Asp Met 85 90 95 Ala Ser Thr Tyr Phe Asp Ile Arg Gly *** Leu Asp Arg Gly Pro Ser 100 105 110 Phe Lys Pro Tyr Ser Gly Thr Ala Tyr Asn Ala Leu Ala Pro Lys *** 115 120 125 Ala Pro Asn *** Cys *** Trp *** *** *** *** *** *** *** *** *** 130 135 140 *** *** *** *** *** *** *** *** *** *** *** *** *** *** *** *** 145 150 155 160 *** *** *** *** Lys *** *** *** *** Ala Gln Ala Pro *** *** Gly 165 170 175 *** *** Ile *** *** *** *** *** *** *** *** *** *** *** *** *** 180 185 190 *** *** *** *** *** Asn *** Pro *** Tyr Ala Asp Lys Thr Phe Gln 195 200 205 Pro Glu Pro Gln Ile Gly *** Ser *** Trp *** *** *** *** *** *** 210 215 220 *** *** *** *** Ala Gly Arg Ile Leu Lys *** *** Thr Pro Met *** 225 230 235 240 Pro Cys Tyr Gly Ser Tyr Ala Lys Pro Thr Asn Glu *** Gly Gly Gln 245 250 255 Ala *** Leu Ile *** Asn *** *** *** *** *** *** *** *** *** Val 260 265 270 *** Leu Asn Phe Phe *** *** *** *** *** *** *** *** *** *** *** 275 280 285 *** *** *** Pro Lys *** Val Leu Tyr Ala Glu *** Val *** Ile Glu 290 295 300 *** Pro Asp Thr His Ile *** Tyr *** Pro *** *** *** *** *** *** 305 310 315 320 *** *** Ala *** *** Leu Leu *** *** Gln Ala *** Pro Asn Arg Pro 325 330 335 Asn Tyr Ile Ala Phe Arg Asp Asn Phe Ile Gly Leu Met Tyr Tyr Asn 340 345 350 Ser Thr Gly Asn Met Gly Val Leu Ala Gly Gln Ala Ser Gln Leu Asn 355 360 365 Ala Val Val Asp Leu Gln Asp Arg Asn Thr Glu Leu Ser Tyr Gln Leu 370 375 380 Leu Leu Asp Ala Ile Gly Asp Arg Ser Arg Tyr Phe Ser Met Trp Asn 385 390 395 400 Gln Ala Val Asp Ser Tyr Asp Pro Asp Val Arg Ile Ile Glu Asn His 405 410 415 Gly *** Glu Asp Glu Leu Pro Asn Tyr Cys Phe Pro Leu *** Ala *** 420 425 430 *** *** *** *** Thr *** *** *** Ile Lys *** *** *** *** *** *** 435 440 445 *** *** Trp *** *** Asp *** *** *** *** *** *** *** *** Glu Ile 450 455 460 *** *** Gly Asn *** Phe Ala *** Glu Ile Asn Leu *** Ala Asn Leu 465 470 475 480 Trp Arg *** Phe Leu Tyr Ser Asn Ile Ala Leu Tyr Leu Pro Asp *** 485 490 495 *** Lys *** Ser Pro *** Asn Ile *** Ile *** Asp Asn *** Asn Thr 500 505 510 Tyr *** Tyr Ile Asn *** Arg Val *** *** Pro Ala *** Leu Asp *** 515 520 525 Tyr Ile Asn Ile Gly Ala Arg Trp Ser *** Asp *** Met Asp Asn Val 530 535 540 Asn Pro Phe Asn His His Arg Asn Ala Gly Leu Arg Tyr Arg Ser Met 545 550 555 560 Leu Leu Gly Asn Gly Arg Tyr Val Pro Phe His Ile Gln Val Pro Gln 565 570 575 Lys Phe Phe Ala Ile Lys Asn Leu Leu Leu Leu Pro Gly Ser Tyr Thr 580 585 590 Tyr Glu Trp Asn Phe Arg Lys Asp Val Asn Met Ile Leu Gln Ser Ser 595 600 605 Leu Gly Asn Asp Leu Arg Val Asp Gly Ala Ser Ile Lys Phe Asp Ser 610 615 620 Ile *** Leu Tyr Ala *** Phe Phe Pro Met Ala His Asn Thr Ala Ser 625 630 635 640 Thr Leu Glu Ala Met Leu Arg Asn Asp Thr Asn Asp Gln Ser Phe Asn 645 650 655 Asp Tyr Leu *** Ala Ala Asn Met Leu Tyr Pro Ile Pro Ala Asn Ala 660 665 670 Thr *** Val Pro Ile Ser Ile Pro Ser Arg Asn Trp Ala Ala Phe Arg 675 680 685 Gly Trp Ala Phe Thr Arg Leu Lys Thr Lys Glu Thr Pro Ser Leu Gly 690 695 700 Ser Gly Phe Asp Pro Tyr Phe *** Tyr Ser Gly Ser Ile Pro Tyr Leu 705 710 715 720 Asp Gly Thr Phe Tyr Leu Asn His Thr Phe Lys Lys Val Ala Ile *** 725 730 735 Phe Asp Ser Ser Val Ser Trp Pro Gly Asn Asp Arg Leu Leu Thr Pro 740 745 750 Asn Glu Phe Glu Ile Lys Arg Ser Val Asp Gly Glu Gly Tyr Asn Val 755 760 765 Ala Gln *** Asn Met Thr Lys Asp Trp Phe Leu Ile Gln Met Leu Ala 770 775 780 *** Tyr Asn Ile Gly Tyr Gln Gly Phe Tyr Ile Pro Glu Ser Tyr Lys 785 790 795 800 Asp Arg Met Tyr Ser Phe Phe Arg Asn Phe Gln Pro Met Ser Arg Gln 805 810 815 Val Val *** *** *** *** Tyr *** *** Tyr *** *** Val *** Ile *** 820 825 830 *** Gln His Asn Asn Ser Gly Phe Val Gly Tyr Leu Ala Pro Thr Met 835 840 845 Arg Glu Gly Gln Ala Tyr Pro Ala Asn Phe Pro Tyr Pro Leu Ile Gly 850 855 860 *** Thr Ala Val *** Ser Ile Thr Gln Lys Lys Phe Leu Cys Asp Arg 865 870 875 880 *** Leu Trp Arg Ile Pro Phe Ser Ser Asn Phe Met Ser Met Gly Ala 885 890 895 Leu Thr Asp Leu Gly Gln Asn Leu Leu Tyr Ala Asn Ser Ala His Ala 900 905 910 Leu Asp Met Thr Phe Glu Val Asp Pro Met Asp Glu Pro Thr Leu Leu 915 920 925 Tyr Val Leu Phe Glu Val Phe Asp Val Val Arg Ile His *** Pro His 930 935 940 Arg Gly Val Ile Glu *** Val Tyr Leu Arg Thr Pro Phe Ser Ala Gly 945 950 955 960 Asn Ala Thr Thr <210> 20 <211> 942 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HVR of SAd19 Hexon <400> 20 ggcgctccga atgcttgtca gtggacaacc acgaatgggg gtaacaaaac taattcattt 60 gctcaggccc cagtaatcgg cctaagtatt gacgccacca acgggctaaa agtaggggag 120 gagatacctg ccactggagg ggcaaatacg cccgtgtacg ccgacaaaac attccagcct 180 gaacctcaag taggagaaac aaaatggaat tctaacccta ctgagaatgc agctggaaga 240 attttaaagc caaacacacc tatgcagccc tgctacggat cgtacgctcg accaacaaac 300 gaaaaaggag gacaggcaaa gctagttact aacggtcaag acaatcaaac aacgccagac 360 gttagtttaa acttttttac tactgcgtca gaaaccacaa cattcacgcc gaaagttgtt 420 ctgtatagcg aaaacgtcaa cttggaagct ccagatacgc atctagtata caagccagac 480 ggcactgacg gaatcaccaa cgccgaaact ctcttaggac ttcagtcagc tccgaacaga 540 ccaaattaca ttggttttcg agataacttt ataggcctaa tgtattacaa ctccactgga 600 aatatggggg ttctggccgg acaggcttcg caattaaacg cagtggttga tttgcaagac 660 agaaacacag aattgtcata ccaacttatg ctggatgccc tgggagaccg cagtaggtac 720 ttctccatgt ggaatcaggc tgtggacagc tatgatcctg atgttaggat aatagaaaac 780 catggcgtag aagacgaatt gcctaactac tgctttccac ttaatgcgca aggtgtagcc 840 aacacttacc agggcgttaa aaatggctcg ggaaactggt cgaaagacac taacgttggc 900 acggcaaatg aaatcgggat aggtaacatt tttgctttcg aa 942 <210> 21 <211> 314 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HVR of SAd19 Hexon <400> 21 Gly Ala Pro Asn Ala Cys Gln Trp Thr Thr Thr Asn Gly Gly Asn Lys 1 5 10 15 Thr Asn Ser Phe Ala Gln Ala Pro Val Ile Gly Leu Ser Ile Asp Ala 20 25 30 Thr Asn Gly Leu Lys Val Gly Glu Glu Ile Pro Ala Thr Gly Gly Ala 35 40 45 Asn Thr Pro Val Tyr Ala Asp Lys Thr Phe Gln Pro Glu Pro Gln Val 50 55 60 Gly Glu Thr Lys Trp Asn Ser Asn Pro Thr Glu Asn Ala Ala Gly Arg 65 70 75 80 Ile Leu Lys Pro Asn Thr Pro Met Gln Pro Cys Tyr Gly Ser Tyr Ala 85 90 95 Arg Pro Thr Asn Glu Lys Gly Gly Gln Ala Lys Leu Val Thr Asn Gly 100 105 110 Gln Asp Asn Gln Thr Thr Pro Asp Val Ser Leu Asn Phe Phe Thr Thr 115 120 125 Ala Ser Glu Thr Thr Thr Phe Thr Pro Lys Val Val Leu Tyr Ser Glu 130 135 140 Asn Val Asn Leu Glu Ala Pro Asp Thr His Leu Val Tyr Lys Pro Asp 145 150 155 160 Gly Thr Asp Gly Ile Thr Asn Ala Glu Thr Leu Leu Gly Leu Gln Ser 165 170 175 Ala Pro Asn Arg Pro Asn Tyr Ile Gly Phe Arg Asp Asn Phe Ile Gly 180 185 190 Leu Met Tyr Tyr Asn Ser Thr Gly Asn Met Gly Val Leu Ala Gly Gln 195 200 205 Ala Ser Gln Leu Asn Ala Val Val Asp Leu Gln Asp Arg Asn Thr Glu 210 215 220 Leu Ser Tyr Gln Leu Met Leu Asp Ala Leu Gly Asp Arg Ser Arg Tyr 225 230 235 240 Phe Ser Met Trp Asn Gln Ala Val Asp Ser Tyr Asp Pro Asp Val Arg 245 250 255 Ile Ile Glu Asn His Gly Val Glu Asp Glu Leu Pro Asn Tyr Cys Phe 260 265 270 Pro Leu Asn Ala Gln Gly Val Ala Asn Thr Tyr Gln Gly Val Lys Asn 275 280 285 Gly Ser Gly Asn Trp Ser Lys Asp Thr Asn Val Gly Thr Ala Asn Glu 290 295 300 Ile Gly Ile Gly Asn Ile Phe Ala Phe Glu 305 310

Claims (20)

  1. 서열번호: 16의 아미노산 서열을 갖는, 원숭이 아데노바이러스 혈청형 19로부터 분리된 헥손.
  2. 제 1 항의 헥손을 암호화하는 DNA.
  3. 제 2 항에 있어서,
    서열번호: 3의 뉴클레오티드 서열을 갖는 DNA.
  4. 원숭이 아데노바이러스 혈청형 19로부터 분리된, 서열번호: 21의 아미노산 서열을 갖는 초가변 영역(HVR) 또는 그의 단편으로서,
    상기 단편은 서열번호: 21의 아미노산 잔기 11 내지 41; 서열번호: 21의 아미노산 잔기 46 내지 52; 서열번호: 21의 아미노산 잔기 69 내지 78; 서열번호: 21의 아미노산 잔기 106 내지 119; 서열번호: 21의 아미노산 잔기 126 내지 138; 서열번호: 21의 아미노산 잔기 160 내지 173; 및 서열번호: 21의 아미노산 잔기 275 내지 303으로 이루어진 군에서 선택된 것인, HVR 또는 그의 단편.
  5. 제 4 항의 HVR 또는 그의 단편을 암호화하는 DNA.
  6. 제 5 항에 있어서,
    서열번호: 20의 뉴클레오티드 서열을 갖는 DNA.
  7. 헥손에 비천연 아미노산 서열을 갖는 키메라 아데노바이러스로서,
    상기 비천연 아미노산 서열은 (i) 서열번호: 16의 아미노산 서열을 갖는 단백질, (ii) 서열번호: 21의 아미노산 서열을 갖는 HVR, 또는 (iii) 서열번호: 21의 아미노산 잔기 11 내지 41; 서열번호: 21의 아미노산 잔기 46 내지 52; 서열번호: 21의 아미노산 잔기 69 내지 78; 서열번호: 21의 아미노산 잔기 106 내지 119; 서열번호: 21의 아미노산 잔기 126 내지 138; 서열번호: 21의 아미노산 잔기 160 내지 173; 및 서열번호: 21의 아미노산 잔기 275 내지 303으로 이루어진 군에서 선택된 HVR의 단편인, 키메라 아데노바이러스.
  8. 삭제
  9. 삭제
  10. 제 7 항에 있어서,
    인간 아데노바이러스인 키메라 아데노바이러스.
  11. 제 10 항에 있어서,
    인간 아데노바이러스가 인간 아데노바이러스 혈청형 2, 3, 5, 11, 24, 26, 30, 34, 35, 36, 41, 48, 49 및 50으로 이루어진 군에서 선택된 키메라 아데노바이러스.
  12. 제 7 항에 있어서,
    치료용 전이유전자를 추가로 포함하는 키메라 아데노바이러스.
  13. 제 12 항에 있어서,
    치료용 전이유전자가 종양 억제인자 유전자, 항원성 유전자, 세포독성 유전자, 세포증식억제 유전자, 자살 유전자, 항-혈관신생 유전자 및 면역-조절 유전자로 이루어진 군에서 선택된 키메라 아데노바이러스.
  14. 제 13 항에 있어서,
    종양 억제인자 유전자가 p53 유전자, APC 유전자, DPC-4/Smad-4 유전자, BRCA-1 유전자, BRCA-2 유전자, WT-1 유전자, 망막아세포종 유전자, MMAC-1 유전자, 선종성 용종증 코일 단백질, DCC(deleted in colorectal cancer, 결장암에서 결실된) 유전자, MMSC-2 유전자, NF-1 유전자, NF-2 유전자, MTS1 유전자, CDK4 유전자 및 VHL 유전자로 이루어진 군에서 선택되고;
    항원성 유전자가 암태아성 항원(CEA), CD3, CD133, CD44 또는 p53이고;
    세포독성 유전자가 슈도모나스 외독소, 리신 독소 및 디프테리아 독소를 암호화하는 유전자로 이루어진 군에서 선택되고;
    세포증식억제 유전자가 p21, 망막아세포종 유전자, E2F-Rb 융합 단백질 유전자, 사이클린-의존성 키나제 억제제를 암호화하는 유전자 및 성장 정지 특이성 호메오박스(GAX) 유전자로 이루어진 군에서 선택되고;
    자살 유전자가 단순 포진 바이러스 티미딘 키나제, 수두 티미딘 키나제, 사이토신 디아미나제, 퓨린 뉴클레오시드 포스포릴라제, 베타-락타나제, 카복시펩티다제 G2, 사이토크롬 P450-2B1, 니트로리덕타제, 베타-글루쿠로니다제 및 TRAIL(TNF 관련 세포자멸-유도 리간드)를 암호화하는 유전자로 이루어진 군에서 선택되고;
    항-혈관신생 유전자가 혈관 내피 성장 인자(VEGF), 가용성 VEGF 수용체, 안지오스타틴, 엔도스타틴 및 아포리포단백질(a) 크링글 영역(LK8)을 암호화하는 유전자로 이루어진 군에서 선택되고;
    면역-조절 유전자가 CD16, CTLA-4, IL24 및 GM-CSF를 암호화하는 유전자로 이루어진 군에서 선택되는 키메라 아데노바이러스.
  15. 제 7 항의 키메라 아데노바이러스를 포함하는, 유전자 전달용 조성물.
  16. 삭제
  17. 제 12 항의 키메라 아데노바이러스를 포함하는, 암 치료용 조성물.
  18. 인간 아데노바이러스의 헥손 중 7개 이상의 아미노산 잔기를 (i) 서열번호: 16의 아미노산 서열을 갖는 단백질, (ii) 서열번호: 21의 아미노산 서열을 갖는 HVR, 또는 (iii) 서열번호: 21의 아미노산 잔기 11 내지 41; 서열번호: 21의 아미노산 잔기 46 내지 52; 서열번호: 21의 아미노산 잔기 69 내지 78; 서열번호: 21의 아미노산 잔기 106 내지 119; 서열번호: 21의 아미노산 잔기 126 내지 138; 서열번호: 21의 아미노산 잔기 160 내지 173; 및 서열번호: 21의 아미노산 잔기 275 내지 303으로 이루어진 군에서 선택된 HVR의 단편으로 치환하는 것을 포함하는, 유전자 치료용 아데노바이러스 벡터의 제조 방법.
  19. 제 7 항의 키메라 아데노바이러스를 포함하는 분리된 숙주 세포.
  20. 제 19 항에 있어서,
    인간 세포인 분리된 숙주 세포.
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