KR101412155B1

KR101412155B1 - 3차원 세포 배양 용구 및 이를 이용한 세포의 3차원 배양 방법

Info

Publication number: KR101412155B1
Application number: KR1020120050142A
Authority: KR
Inventors: 박태현; 김정아; 박정극
Original assignee: 동국대학교 산학협력단; 서울대학교산학협력단
Priority date: 2011-09-27
Filing date: 2012-05-11
Publication date: 2014-06-27
Also published as: KR20130033938A

Abstract

본 발명은 3차원 세포 배양 용구 및 이를 이용한 세포의 3차원 배양 방법 에 관한 것이다.
본 발명의 3차원 세포 배양 장치 및 이를 이용한 3차원 세포 배양 방법은 나노 입자가 포함된 배양액에서 세포를 기초 배양하여, 자성 나노 입자를 세포 내 또는 세포막에 도입시키고, 상기 자성 나노 입자가 도입된 세포에 자성을 인가하여 별도의 표면 처리 없이, 배양액 내의 부유 상태에서 스페로이드를 형성할 수 있는 효과를 나타낸다.

Description

3차원 세포 배양 용구 및 이를 이용한 세포의 3차원 배양 방법{3 dimensional cell culture tool and cell culture method using the same}

본 발명은 3차원 세포 배양 용구 및 이를 이용한 세포의 3차원 배양 방법 에 관한 것이다.

오늘날 창약(創藥)의 개발에 있어서, 세포배양기술에 의해 배양한 세포가 약제의 약리활성평가나 독성시험의 시뮬레이터에 이용되고 있다.

그러나, 종래의 세포배양기술로 배양한 세포는 세포가 2차원 방향으로 퍼진 단층세포이기 때문에, 생체 내와 동등한 3차원 조직을 구축할 수 없고, 세포가 체내에서 갖고 있는 특이적인 기능을 장시간 유지할 수 없으며, 이에 따라 시뮬레이션의 정밀도가 보장되지 않는 문제가 있다.

최근에는 이와 같은 문제점을 해결하기 위하여 생체 내와 동등한 기능을 갖는 세포의 3차원 조직인 스페로이드의 배양이 주목을 받고 있다. 특히, 줄기 세포 기술이 발전함에 따라 배아줄기세포를 3차원으로 스페로이드 배양하여 각종 분화 기전의 연구에 응용하기 위한 여러가지 방법이 시도되고 있다.

예를 들어, 바닥면이 깔대기 형상인 웰에 복수의 단일세포를 파종하고, 바닥면에서 이 단일세포를 응집 및 분열시켜서 스페로이드를 배양하는 것(일본 특개평6-327462호 공보(단락번호 0016, 도 1))이나, 소정의 폴리머 혼합물의 캐스트액 표면에 물을 결로시키고, 이 결로에 의해 생긴 미소한 물방울을 증발시킴으로써 얻어지는 허니콤 구조체 상에서 스페로이드를 배양하는 것(일본 특개2002-335949호 공보(p3, 도 1))이 있다.

그러나, 일본 특개평6-327462호 공보에 의하면, 배양에 의해 생기는 스페로이드의 터전이 없고, 세포배양구조체 또는 세포배양용기에 스페로이드가 고정되기 어렵다. 그렇기 때문에, 배지교환 시에, 스페로이드가 배지와 함께 없어지거나 배지 교환 작업이 상당히 번잡해져서 양호한 배양환경을 유지하는 것이 어려워지는 문제가 있었다. 또한, 복수의 세포가 응집하여 스페로이드를 형성하고 있기 때문에, 암세포의 동태를 시뮬레이션하려고 해도, 생체 내에서 하나의 암세포로부터 분열되어 형성된 종양의 성질과 스페로이드의 성질이 엄밀하게 다르기 때문에, 시뮬레이션의 정밀도가 떨어지는 문제가 있었다.

또한, 허니콤 구조의 크기를 정밀하게 제어할 수 없으며, 구조를 평면 방향의 형상이 원형인 허니콤 구조 이외의 형상으로 하는 것이 어려운 등의 문제가 있었다. 또한, 허니콤 구조를 제작하는데 상당히 시간이 많이 걸리는 것 외에, 비용이 비싸고, 대량생산에 적합하지 않다는 문제가 있었다.

세포의 3차원 스페로이드 배양 방법 중 또 다른 방법으로서, 현적 배양법(hanging drop culture)이 있다.

도 2는, 현적 배양법(hanging drop culture)을 통해 세포를 3차원 배양하는 일반적인 방법을 보여주는 개념도이다. 현적 배양법(hanging drop culture)을 통해 세포를 3차원 배양하는 방법은 먼저, 도 2(a)와 같이 수거한 세포의 수를 센 후 약 300~500여개의 세포를 피펫 등을 이용하여 일반 배양용기(100)의 덮개(11) 부분에 방울 형태로 분주하여 거꾸로 부착시켜 배양한다. 이후, 도 1(b)에 도시된 바와 같이, 매달려 있는 세포가 중력에 의해 방울의 끝부분에 모이면서 배아 형태의 세포괴를 형성하게 되는데 이를 일반적으로 배상체라 한다.

도 3의 A, B 는 3d biomatrix 가 개발한 이러한 현적 배양법의 또 다른 형태로서, 일정 크기의 구멍이 형성된 커버플레이트를 이용하여, 상기 커버플레이트에 세포 배양액을 수용하고, 중력에 의하여 상기 구멍으로부터 세포가 3차원 배양되는 형태를 나타낸다.

그러나, 이러한 현적 배양법(hanging drop culture)의 경우 피펫 등의 도구를 이용하여 배양 용기의 덮개 부분에 세포를 분주하기 때문에 이와 같이 옮기는 과정에서 세포에 물리적인 손상이 발생하거나, 미생물에 의한 오염으로 심각한 문제가 초래될 염려가 있었다.

본 발명은 이와 같은 종래 세포의 3차원 스페로이드 배양 기술의 문제점을 해결할 수 있는 세포의 3차원 배양을 위한 3차원 세포 배양 용구를 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명은 또한, 상기 3차원 세포 배양 용구를 이용하여 세포를 3차원 배양하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명은 상기와 같은 과제를 해결하기 위하여

세포를 배양하기 위한 웰을 포함하는 배양 플레이트부;

상기 배양 플레이트부를 덮는 커버부; 및

상기 커버부의 상기 배양 플레이트부와 접하는 표면으로부터 상기 배양 플레이트부의 상기 웰 내부로 향하여 연장된 돌출부;를 포함하는 3차원 세포 배양 용구를 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 돌출부는 자성을 나타내는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 있어서, 상기 돌출부가 자성을 나타내도록 하는 방법은 특별히 제한되지 않으며, 본 발명의 일 실시예에서 상기 돌출부는 영구 자석 재질로 제조되는 것이 가능하다.

본 발명에 있어서, 상기 돌출부는 전자석을 포함하고, 상기 전자석에 공급되는 전류의 크기와 공급 시간을 제어하는 제어부 및 상기 제어부에 의하여 상기 전자석에 정해진 시간 동안 정해진 크기의 전원을 공급하는 전원부를 더 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 있어서, 상기 돌출부의 길이는 상기 웰의 깊이의 1/20 내지 9/10 인 것을 특징으로 한다.

본 발명에 있어서, 상기 배양 플레이트부는 상기 세포를 배양하기 위한 웰을 복수개 포함하고, 상기 돌출부는 상기 세포를 배양하기 위한 웰 당 1개씩 포함되도록 형성되는 것을 특징으로 한다. 본 발명에 있어서, 상기 돌출부는 상기 세포를 배양하기 위한 웰 당 복수개 포함되도록 형성되는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 있어서, 상기 돌출부의 말단은 그 형상이 특별히 제한되지 않으나, 뾰족하게 형성되는 것이 자성을 집중시켜서 세포를 3차원으로 효율적으로 배양하기 위해 바람직하다.

본 발명은 또한,

나노 입자가 포함된 배양액에서 스페로이드 형태로 배양하기를 원하는 세포를 기초 배양하는 단계;

상기 배양된 세포와 배양액을 배양 플레이트부의 웰에 수용하는 단계;

상기 돌출부를 포함하는 커버부로 상기 배양 플레이트부의 표면을 커버하여, 상기 돌출부가 상기 웰의 내부에 위치하도록 하는 단계; 및

상기 돌출부의 자성에 의하여 상기 세포가 스페로이드를 형성하면서 3차원 배양되는 단계를 포함하는 본 발명의 3차원 세포 배양 용구를 이용한 세포의 3차원 배양 방법을 제공한다.

본 발명에서는 스페로이드 형태로 배양하기를 원하는 세포를 먼저 나노 입자가 포함된 배양액에서 기초 배양되는 것을 특징으로 한다. 본 발명에 있어서 기초 배양 방법은 특별히 제한되지 않으며, 진탕 배양 또는 기타 다른 방법에 의해 기초 배양될 수 있다.

나노 입자가 포함된 배양액에서 기초 배양된 세포는 상기 나노 입자가 세포 내부에 수용되거나, 세포막에 나노 입자가 부착되거나, 기타 다른 메커니즘에 의해 자성 나노 입자가 세포에 부착되어 외부 자성에 의해 세포의 이동이 유도되게 된다.

자성 나노입자는 각종 생의학적 용도로 사용될 것이 제안되었는데, 이러한 용도에는 자기 공명 영상화, 악성 세포의 고열처리, 및 약물 전달이 포함되며, 최근에는 나노 입자를 혼합한 배양액에서 세포를 배양하여 나노 입자가 세포 내로 도입되게 하고, 자성 입자가 도입된 세포를 원하는 위치에 고정하는 기술이 개발되고 있다.

본 발명에 있어서, 상기 나노 입자란, 전형적으로는 직경이 작게는 1 나노미터에서부터 크게는 수백 마이크로미터까지 이르는 매우 작은 입자를 말한다. 작은 크기 때문에 염료 및 안료; 심미적 또는 기능적 코팅; 생물학적 연구, 의학적 영상화 및 치료를 위한 도구; 자기 기록 매체; 양자점(quantum dots); 및 고르고 일정한 나노크기 반도체 등과 같은 각종 제품을 제조하는데 이용될 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 상기 자성 나노 입자는 마그네타이트, Fe₃O₄, γ-Fe₂O₃, 망간 페라이트, 코발트 페라이트 및 니켈 페라이트로 이루어진 그룹에서 선택되는 1개 또는 복수개인 것을 특징으로 한다.

본 발명에 있어서, 상기 배양된 세포와 배양액을 배양 플레이트부의 웰에 수용하는 단계에서는 상기 배양된 세포와 배양액이 상기 돌출부와 접촉하지 않도록 수용하는 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명에 있어서, 상기 배양된 세포를 포함하는 배양액을 상기 배양 플레이트부의 웰에 수용하는 단계에서는 상기 돌출부의 말단이 상기 배양된 세포와 배양액과 접촉하도록 수용하는 것을 특징으로 한다. 이 경우 상기 돌출부의 표면에 적절한 처리를 함으로써, 돌출부 주변에 3차원 배양된 세포를 돌출부로부터 분리시키는 것이 가능하다.

본 발명에 있어서, 상기 나노 입자가 포함된 배양액에서 스페로이드 형태로 배양하기를 원하는 세포를 기초 배양하는 단계에서는 상기 스페로이드 형태로 배양하기를 원하는 세포의 종류가 복수개이고, 상기 복수개 종류의 스페로이드 형태로 배양하기를 원하는 세포가 상기 나노 입자가 포함된 배양액에서 혼합되어 동시에 기초 배양되는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 3차원 배양 용구를 이용한 세포의 3차원 배양 방법은 또한, 스페로이드 형태로 배양하기를 원하는 제 1 세포, 제 2 세포를 나노 입자가 포함된 각각의 배양액에서 별도로 기초 배양하는 단계;

상기 배양된 제 1 세포를 포함하는 배양액을 배양 플레이트부의 웰에 수용하는 단계;

상기 돌출부를 포함하는 커버부로 상기 배양 플레이트부의 표면을 커버하여 상기 돌출부가 상기 웰의 내부에 위치하도록 하는 단계;

상기 돌출부의 자성에 의하여 상기 제 1 세포가 스페로이드를 형성하면서 배양되는 단계;

상기 배양된 제 2 세포를 포함하는 배양액을 상기 제 1 세포 스페로이드 형성된 배양 플레이트부의 웰에 공급하는 단계; 및

상기 돌출부의 자성에 의하여 상기 제 1 세포 스페로이드를 코어부로 하고, 상기 제 2 세포가 쉘부로 하는 스페로이드를 형성하면서 배양되는 단계;를 포함한다.

본 발명의 3차원 배양 용구를 이용한 세포의 3차원 배양 방법은 또한, 스페로이드 형태로 배양하기를 원하는 복수 종류의 세포를 나노 입자가 포함된 각각의 배양액에서 별도로 기초 배양하는 단계;

상기 배양된 복수 종류의 세포를 포함하는 배양액을 별도의 배양 플레이트부의 웰에 수용하는 단계;

상기 복수 종류의 세포가 상기 돌출부의 자성에 의하여 각각 1차 스페로이드를 형성하면서 배양되는 단계;

상기 배양된 각각의 복수 종류 세포의1차 스페로이드를 혼합하는 단계 ; 및

상기 혼합된 복수 종류 세포의 1차 스페로이드가 상기 돌출부의 자성에 의하여 응집되면서 2차 스페로이드를 형성하면서 배양되는 단계;를 포함한다.

이하에서는 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.

도 4는 본 발명에 따른 3차원 세포 배양 용구의 모식도를 나타낸다.

도 4에서 보는 바와 같이 본 발명에 의한 3차원 세포 배양 용구는 세포를 배양하기 위한 복수 이상의 웰(30)을 포함하는 배양 플레이트부(10); 상기 배양 플레이트부를 덮는 커버부(20); 및 상기 커버부의 상기 배양 플레이트와 접하는 표면으로부터 상기 배양 플레이트의 웰 내부로 향하여 연장된 하나 이상의 돌출부(50)를 포함한다.

본 발명의 3차원 세포 배양 용구에 있어서, 상기 돌출부는 자성을 나타내는 것을 특징으로 하며, 이를 위한 방법이 한정되지는 않는다. 구체적으로 상기 돌출부는 영구 자석 재질로 만들어지거나, 전자석 재질로 만들어지는 것이 가능하다.

도 4에서는 돌출부 전체가 영구 자석 재질로 만들어진 경우(51), 말단에 영구 자석을 장착한 경우(52)를 나타내었다.

도 5의 경우 돌출부가 전자석 재질로 만들어지는 경우의 모식도를 나타내었다. 도 5에서 보는 바와 같이 본 발명의 3차원 세포 배양 용구가 전자석 돌출부를 포함하는 경우, 배양 플레이트(110), 상기 배양 플레이트에 포함된 복수개의 웰(130), 상기 배양 플레이트를 커버하기 위한 커버부(120) 및 상기 커버부의 상기 배양 플레이트와 접하는 표면으로부터 상기 배양 플레이트의 각각의 웰 내부로 향하여 연장된 전자석 재질의 돌출부를 포함하며, 상기 전자석 재질의 돌출부의 자성을 조절하기 위하여 각각의 팁에 연결된 외부 전원부(160) 및 제어부(170)를 포함한다. 본 발명에 있어서, 상기 제어부(170)에 의하여 상기 외부 전원부(160)에 인가되는 전원의 인가 여부 및 인가 세기, 인가 시간 등이 조절되며, 그에 따라 상기 전자석 재질의 돌출부에 발생되는 자성을 조절할 수 있게 된다. 이에 의하여 다양한 형태의 세포 배양이 가능하다. 즉, 세포를 배양하는 과정에서 자성을 주기적으로 인가하거나, 세포가 응집될 때까지만 자성을 인가하고, 이후에는 자성을 인가하지 않는 것과 같은 다양한 방법으로 세포를 배양하는 것이 가능하게 된다.

상기 배양 플레이트(10)의 전체적인 형상 및 상기 웰 형상이 특별히 제한되지 않으며, 구체적으로는 둥근 바닥 플라스크 뿐 만 아니라, 당업계에서 일반적으로 세포를 배양하기 위해 사용되는6 웰, 96 웰 플레이트 등이 세포 배양 목적에 따라 적절히 선택할 수 있다. 본 발명의 바람직한 실시예로서 상기 배양 플레이트가 멀티웰 형상인 경우를 도 6에, 원형 플레이트 형상인 경우를 도 7에 나타내었다.

본 발명의 3차원 세포 배양 용구에 있어서, 상기 팁의 형상 및 개수는 상기 세포를 배양하기 위한 웰의 용량에 의해 적절히 선택될 수 있고, 특별히 제한되지 않으며, 도 6에서와 같이 상기 배양 플레이트(10)가 세포 배양을 위한 웰(30)을 복수개 포함하는 경우, 상기 돌출부는 상기 세포를 배양하기 위한 웰(30) 당 1개씩 포함되도록 형성되는 것이 가능하다.

또한, 상기 도 7에서와 같이 세포를 배양하기 위한 웰 내에 복수개의 돌출부를 포함하는 것이 가능하다. 이와 같이 하나의 세포를 배양하기 위한 웰 내에 수개의 팁을 설치하는 경우 세포를 배양하기 위한 웰 내에서 돌출부가 위치하는 부분마다 동일한 형질의 스페로이드가 동시 다발적으로 형성될 수 있으며, 이후 3차원 배양된 세포를 더욱 성장시키는 경우 배양액을 교체하거나 한꺼번에 분리할 경우에도 효과적이다.

본 발명의 3차원 세포 배양 용구에 있어서, 상기 돌출부의 길이는 특별히 제한되지는 않으며, 상기 웰의 깊이의 1/20 내지 9/10 인 것이 바람직하다. 상기 돌출부의 길이가 웰의 깊이에 비해 너무 길면 돌출부에 접촉하는 세포의 수가 증가하며 3차원 배양의 효율이 감소하며, 돌출부의 길이가 웰의 깊이에 비해 너무 짧으면 자성이 미치는 범위가 작아 3차원 배양의 효율이 떨어지게 된다.

본 발명에 있어서, 상기 팁은 상기 웰 내의 세포 배양액과 접촉하지 않은 상태에서도 세포를 3차원 배양하는 것이 가능하며, 접촉한 상태 에서도 세포를 3차원 배양하는 것이 가능하다. 접촉한 상태에서 세포를 배양하는 경우 자성이 좀 더 직접적으로 작용하기 때문에 바람직하지만, 돌출부 표면에 세포가 달라붙게 되므로, 돌출부 표면을 적절한 표면 처리를 수행하는 것이 바람직하다. 이 때 돌출부 표면 처리로는 세포부착에 방해가 되는 고분자 물질 (PEG 같은 고 발수성 물질)을 코팅하거나 세포와 직접적 접촉을 막는 물질을 덧씌우는 방법 등을 이용할 수 있다.

도 8에 본 발명에 따른 3차원 세포 배양 용구를 이용한 3차원 세포 배양 방법을 나타내었다. 본 발명의 3차원 세포 배양 용구를 이용한 3차원 세포 배양 방법은 i) 나노 입자가 포함된 배양액에서 스페로이드 형태로 배양하기를 원하는 세포를 기초 배양하는 단계; ii) 상기 배양된 세포를 포함하는 배양액을 배양 플레이트부의 웰에 수용하는 단계; iii) 상기 돌출부를 포함하는 커버부로 상기 배양 플레이트부의 표면을 커버하여 상기 돌출부가 상기 웰의 내부에 위치하도록 하는 단계; iv) 상기 돌출부의 자성에 의하여 상기 세포가 스페로이드를 형성하면서 3차원 배양되는 단계; 를 포함하는 것으로 구성된다.

본 발명의 3차원 세포 배양 방법에 있어서, 나노 입자가 포함된 배양액에서 스페로이드 형태로 배양하기를 원하는 세포를 기초 배양한다.

이와 같이 나노 입자가 포함된 배양액에서 세포를 기초 배양함으로써 세포 내로 자성 나노 입자를 도입시키거나, 또는 상기 나노 입자를 표면 개질함으로써 세포의 세포막에 부착시킬 수 있다.

세포 내로 자성 나노 입자를 도입하는 방법은 당업자가 일반적으로 사용하는 방법을 사용할 수 있으며, 상기 자성 나노 입자를 세포 배양 배지 내에 바람직하게는 10 pg 에서 1000 pg/ cell 농도로 포함시키고, 자성 나노 입자가 포함된 배지내에서 세포를 배양함으로써 세포 내에 자성 나노 입자가 도입되도록 한다.

본 발명에 있어서 상기 자성 나노 입자로는 초상자성 또는 강자성 철 산화물 나노입자를 이용한다. 바람직하게는, 상기 나노입자에 포함된 산화물은 페로-(ferro-) 또는 페리마그네틱 화합물(ferrimagnetic compounds), 예컨대, 마그네타이트, Fe₃O₄, γ-Fe₂O₃, 망간 페라이트, 코발트 페라이트 및 니켈 페라이트를 포함한다. 보다 바람직하게는, 본 발명에 이용하는 초상자성 나노입자에 포함된 철-산화물은 Fe₃O₄ 또는 γ-Fe₂O₃ 이고, 가장 바람직하게는 Fe₃O₄이다.

이후, 본 발명의 3차원 세포 배양 용구의 세포를 배양하기 위한 웰의 크기 및 원하는 스페로이드 크기를 고려하여 상기 기초 배양된 세포를 포함하는 배양액의 부피 및 세포농도를 조절하여 상기 세포를 배양하기 위한 웰에 수용하고, 상기 커버부로 커버하여 상기 커버부의 표면에 형성된 돌출부가 상기 배양 플레이트의 웰 내부에 위치하도록 한다.

이와 같이 하고 세포를 배양하면 상기 커버부의 돌출부의 자성에 의해 상기 자성 나노 입자를 포함하는 세포가 팁 가까이 모여들게 되고, 결과적으로 세포가 상호 응집된 형태의 3차원 세포 배양이 가능하게 된다.

이후 단계에서는 일단 응집된 세포들은 그 상태를 유지하면서 계속 배양하여 3차원 세포 배양된 스페로이드 내의 세포의 수를 증가시켜, 스페로이드의 크기를 더욱 성장시키는 것이 가능하다.

본 발명에 있어서, 상기 기초 배양시 세포 종류를 조절하거나, 기초 배양후 스페로이드 형성 단계에서 여러가지 형태로 융합 스페로이드로 배양하는 것이 가능하다.

본 발명에 있어서, 가능한 융합 스페로이드 제조 방법을 도 20 에 모식적으로 나타내었다.

구체적으로, A)무작위 혼합 스페로이드 형태, 즉 기초 배양시 세포 종류를 복수개 사용하여, 상기 복수 종류의 세포가 상호 응집되면서 무작위 혼합으로 스페로이드를 형성하는 방법,

B) 순차적 세포 도입으로 형성된 코어-쉘 (core-shell) 형태의 스페로이드, 즉, 제 1세포로 스페로이드를 형성한 후, 제 2 세포가 상기 제 1 세포 스페로이드를 코어부로 하여 쉘부를 형성하는 방법,

C) 스페로이드 간의 융합(fusion), 즉, 제 1 세포 스페로이드, 제 2 세포 스페로이드를 기초로 하여 스페로이드를 형성하는 등 다양한 형태의 스페로이드를 형성하는 것이 가능하다.

상기 A 방법에서는 기초 배양하는 단계에서 상기 스페로이드 배양하기를 원하는 세포의 종류를 복수개로 하고, 상기 복수개 종류의 스페로이드 배양하기를 원하는 세포가 상기 나노 입자가 포함된 배양액에서 혼합되어 동시에 기초 배양되어 상기 복수 종류의 세포가 상호 응집되면서 무작위 혼합으로 스페로이드를 형성하게 된다.

상기 B 방법에서는 스페로이드 배양하기를 원하는 세포를 제 1 세포, 제 2 세포 복수개 선정하고, 상기 각각의 세포를 나노 입자가 포함된 각각의 배양액에서 별도로 기초 배양한 후, 먼저 상기 배양된 제 1 세포를 포함하는 배양액을 배양 플레이트부의 웰에 수용한다.

상기 돌출부를 포함하는 커버부로 상기 배양 플레이트부의 표면을 커버하여 상기 돌출부가 상기 웰의 내부에 위치하도록 하여, 상기 돌출부의 자성에 의하여 상기 제 1 세포가 스페로이드를 형성하면서 배양한다. 이후, 상기 제 1 세포 스페로이드 형성된 배양 플레이트부의 웰에 상기 배양된 제 2 세포를 포함하는 배양액을 공급하고, 상기 돌출부의 자성에 의하여 상기 제 2 세포가, 상기 제 1 세포 스페로이드를 코어부로 하고, 쉘부를 형성하는 스페로이드를 형성하면서 배양된다.

상기 C 방법에서는 스페로이드 형태로 배양하기를 원하는 복수 종류의 세포를 나노 입자가 포함된 각각의 배양액에서 별도로 기초 배양하고, 상기 배양된 복수 종류의 세포를 포함하는 배양액을 별도의 배양 플레이트부의 웰에 수용한다.

상기 돌출부를 포함하는 커버부로 상기 배양 플레이트부의 표면을 커버하여 상기 돌출부가 상기 웰의 내부에 위치하도록 하고, 상기 복수 종류의 세포가 상기 돌출부의 자성에 의하여 각각 1차 스페로이드를 형성하면서 배양한다.

이렇게 형성된 상기 배양된 각각의 복수 종류 세포의 1차 스페로이드를 혼합하고, 상기 혼합된 복수 종류 세포의 1차 스페로이드가 상기 돌출부의 자성에 의하여 2차 스페로이드를 형성하면서 배양한다.

본 발명의 3차원 세포 배양 장치 및 이를 이용한 3차원 세포 배양 방법은 자성 나노 입자를 세포 내에 도입시키고, 상기 자성을 나타내는 돌출부를 사용하여 자성을 인가하면서 세포를 배양함으로써, 커버부에 세포를 접종하는 등의 별도의 처리없이도, 세포가 기초 배양된 배양액 내의 부유 상태에서 스페로이드를 형성할 수 있는 효과를 나타낸다.

도 1은 종래 세포의 3차원 배양을 위해 사용되는 플레이트 바닥부의 형상을 나타낸다.
도 2, 도 3은 종래 세포의 3차원 배양을 위해 사용되는 현적 배양법의 과정 및 장치를 나타낸다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 3차원 세포 배양 장치의 단면도를 나타낸다.
도 5, 도 6은 본 발명의 다른 일 실시예에 따른 전자석을 이용한 3차원 세포 배양 장치를 나타낸다.
도 7은 본 발명의 다른 일 실시예에 따른 3차원 세포 배양 장치의 단면도를 나타낸다.
도 8은 본 발명의 3차원 세포 배양 방법에 의하여 세포를 3차원 배양하는 방법을 나타낸다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 3차원 세포 배양 장치의 커버부 사진을 나타낸다.
도 10 내지 도 12는 본 발명의 3차원 세포 배양 용구를 사용하여 세포를 배양하고, 세포에 형광물질을 도입한 후 형광 현미경으로 관찰한 결과를 나타내었다
도 13 은 본 발명의 3차원 세포 배양 용구를 사용하여 배양한 세포의 viability 를 측정한 결과를 나타낸다.
도 14 는 본 발명의 일 실시예에 세포 배양 웰이 복수개의 돌출부를 포함하는 경우의 세포 배양 용구에서 형성된 3차원 배양된 세포를 무작위로 추출하여 각각의 세포에 대한 상태를 나타낸다.
도 15 는 본 발명의 일 실시예의 3차원 배양 용구를 사용하여 세포를 배양한 경우와 2차원 배양된 비교예에 있어서, 세포 내부의 골격에 관여하는 단백질의 분포를 측정한 결과를 나타낸다.
도 16 은 본 발명의 일 실시예의 3차원 배양 용구를 사용하여 세포를 배양한 경우와 2차원 배양된 비교예에 있어서, 각각의 세포의 독성 물질에 대한 반응을 나타낸다.
도 17 내지 19는 본 발명의 일 실시예의 3차원 배양 용구를 사용하여 융합 스페로이드가 형성되는 과정을 측정한 결과를 나타낸다.
도 20 은 본 발명에 있어서, 가능한 융합 스페로이드 제조 방법을 모식적으로 나타내었다.

이하에서는 본 발명을 아래 실시예에 의하여 상세히 설명한다. 그러나, 본 발명이 아래 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1>

< 실시예 1-1> 세포 배양 웰 당 1개의 돌출부를 포함하는 3차원 세포 배양 장치 제조

상기 배양 플레이트로 96 웰 플레이트를 사용하고, 영구 자석 재질인 NdFeB 로 팁 모양의 돌출부를 제조한 후, 상기 96 웰 플레이트의 커버에 부착하여 3차원 세포 배양 장치를 제조하였다. 제조된 세포 배양 장치의 커버부를 도 9에 나타내었다.

< 실시예 1-2> 기초 배양

세포주로서 HeLa 세포를 자성 나노 입자로서 Fe₃O₄ 가포함된 배지에서 세포를 배양하여, 세포 내에 800 pg 의 입자가 도입되도록 배양하였다.

< 실시예 1-3> 3차원 세포 배양

상기 실시예 1-2에서 배양된 800 pg 세포를 상기 실시예 1에서 제조된 3차원 세포 배양 장치 각각의 웰당 500개의 세포가 포함되도록 분양시켰다. 세포는 관찰이 용이하도록 세포의 핵 (Hoechst)을 염색시키는 물질을 도입하였다.

상기 도 9에 나타난 커버부로 상기 배양 플레이트를 커버한 후 5분간 배양하면서 시간 변화에 따른 세포의 3차원 응집 과정을 형광 현미경으로 시간에 따라 측정하고, 그 결과를 도 10에 나타내었다.

도 10에서 보는 바와 같이 팁 형태의 돌출부를 포함하는 커버로 커버한지 5분 뒤에 세포가 응집되어 3차원 배양되는 것을 확인할 수 있다.

< 실시예 1-4> 배양 농도에 따른 3차원 세포 배양

상기 실시예 1-1에서 제조된 배양 플레이트의 웰당, 상기 실시예 1-2에서 기초 배양된 세포를 각각 상기 125개 내지 1000 개의 세포가 포함되도록 분양시키고, 5분이 지난 후, 공초점 현미경으로 z-axis스캐닝한 후 3차원 이미지로 재구성한 것으로, 세포의 3차원 배양 여부를 확인한 결과 및 3차원 이미지로 확인한 결과를 도 11 에 나타내었다.

도 11에서 보는 바와 같이 각 웰당 최초 분양되는 세포 숫자가 증가할 수록 3차원으로 배양되는 세포 자체의 크기가 증가하는 것을 확인할 수 있다.

< 실시예 1-5> 기초 배양시 사용되는 자성 나노 입자의 농도에 따른 3차원 세포 배양

상기 실시예 1-2에서 기초 배양시 세포 내로 도입되는 자성 나노 입자의 농도를 200-800 pg/cell 범위에서 변화시키면서 상기 HeLa 세포를 기초 배양하고, 상기 실시예 1-1에서 제조된 배양 플레이트의 웰에 1000 cells/well 이 되도록 이동시키고, 커버를 장착하고 5분간 세포를 3차원 배양시켰다.

도 12에서 각각의 농도별 세포 배양 정도를 확인할 수 있다. 배양 플레이트 내의 각 웰당 자성 나노 입자의 농도에 따라서는 생성되는 3차원 세포인 스페로이드의 크기 차이가 크게 나지 않는 것을 확인할 수 있다.

< 실험예 1> 3차원 배양된 세포의 viability 확인

상기 실시예 1-5 에서 3차원 배양된 세포를 이후 5일간 연속 배양하면서 Live/DEAD viability kit를 사용하여 viability를 형광 관찰로 확인하고 그 결과를 도 13에 나타내었다.

Live/DEAD viability kit를 사용할 경우 배양 후에 세포에 Calcein AM (2 μM), EthD-1 soultion (4 μM) 을 혼합해 주면 살아 있는 세포는 녹색으로 죽은 세포는 붉은색 형광을 띤다. 도 13에서 보는 바와 같이 5일째까지 세포 사멸은 관찰되지 않았으며, 세포가 증식하면서 3차원 배양됨을 확인할 수 있었다.

< 실시예 2> 세포 배양 웰이 복수개의 돌출부를 포함하는 경우

< 실시예 2-1> 3차원 세포 배양 장치 제조

세포를 배양하기 위한 웰 내에 복수개의 돌출부를 포함하는 경우 3차원 세포 배양 여부를 확인하기 위해, 배양 플레이트로서 원형 플레이트를 사용하고, 상기 원형 플레이트의 커버에 팁 형태의 자석을 일정 간격을 두고 복수개 부착하여 도 7과 같은 형태의 3차원 세포 배양 장치를 제조하였다.

< 실시예 2-2> 3차원 세포 배양

상기 실시예 1-2에서 기초 배양된 800 pg 세포를 상기 실시예 2-1에서 제조된 배양 플레이트 각각의 웰당 500개의 세포가 포함되도록 분양시켰다.

제조된 3차원 세포 배양 장치에 상기 실시예 2-1 에서 제조된 자성 입자가 도입된 세포를 도입한 후, 커버를 장착하여 세포가 3차원으로 배양되게 하고, 배양된 3차원 배양된 세포를 무작위로 추출하여 각각의 세포에 대한 상태를 도 14에 나타내었다.

1개의 웰에 복수개의 돌출부를 포함하는 경우 돌출부가 형성된 위치에서 3차원으로 형성된 생물학적 성질과 상태가 동일한 여러 개의 스페로이드를 한꺼번에 얻을 수 있다는 것을 알 수 있다.

< 비교예 > 2차원 배양

96 웰 플레이트에 HeLa세포와 중간엽줄기세포를 배양액과 함께 각각 현탁 분주한 후 일정시간 두어 세포가 플레이트 바닥부에 가라 앉도록 하고 인큐베이터에서 일반적인 배양 방법에 의하여 세포를 배양하였다.

< 실험예 2> 액틴 염색 및 공초점 현미경 비교

상기 실시예 1의 방법으로 HeLa와 중간엽줄기세포의 두 종류를 각각 3차원 스페로이드로 배양한 후 배양된 스페로이드에서의 단백질 분포와 상기 비교예의 2차원 배양된 세포가 나타내는 단백질 분포를 비교하기 위해서 Alexa 488-conjugated phalloidin 으로 액틴을 염색하고 공초점 현미경으로 비교 관찰하였으며, 그 결과를 도 15 에 나타내었다.

도 15 에서 보는 바와 같이 상기 실시예 1 의 3차원 세포 배양 된 스페로이드와 상기 비교예의 2차원 배양된 세포는 서로 다른 단백질 분포를 나타내며, 상기 실시예 1 의 3차원 세포 배양 된 스페로이드에서는 세포 간의 유기적인 영향으로 액틴의 유기적인 결합과 함께 단백질의 분포가 바깥쪽으로 치우치는 경향을 나타낸다.

< 실험예 3> 스타우로스포린 ( staurosporine )에 대한 세포 독성 비교

상기 실시예 1 의 3차원 세포 배양 된 스페로이드와 상기 비교예의 2차원 배양된 세포에 대해 독성물질인 스타우로스포린(staurosporine) 500 uM을 6시간 처리한 후, Live/DEAD viability kit를 사용하여 viability 를 형광 관찰로 확인하고 그 결과를 도 16 에 나타내었다.

도 16 에서 붉은색 형광은 죽은 세포를 의미한다. 도 16 에서 보는 바와 같이 본 발명의 상기 실시예 1 의 3차원 세포 배양 된 스페로이드의 경우 독성 약물에 대한 반응이 스페로이드의 바깥쪽부터 나타나는 것을 확인할 수 있으며, 이는 3차원 배양된 세포의 특징을 보여준다.

< 실시예 3-1> 스페로이드 간의 융합( fusion ) 스페로이드 형성

중간엽 줄기 세포를 사용하여 1차 스페로이드로 2개 배양한 후, 상기 배양된2개의 줄기 세포 스페로이드를 혼합해서 상기 실시예 1에서 제조된 세포 배양 용구에서 2차 스페로이드 배양하였다.

배양 시간에 따라 2차 스페로이드가 형성하는 과정을 도 17 에 나타내었다. 2 개의 1차 스페로이드 중 하나의 스페로이드를 형성하는 세포는 지질막 염색으로 붉은색으로 나타나도록 하고, 나머지 하나의 스페로이드를 형성하는 세포는 핵 염색으로 푸른색으로 나타내도록 하였다. 도 17 에서 시간이 지날수록 2개의 1차 스페로이드가 융합되어 새로운 2차 융합 스페로이드를 형성하는 것을 확인할 수 있다.

< 실시예 3-2> 코어-쉘 타입 스페로이드 형성

형광 단백질을 띠는 HEK-293 세포를 기초 배양한 후, 1차로 스페로이드 배양하고, 배양된 스페로이드를 GFP 녹색을 띠는 HeLa세포를 포함하는 배지에서 2차로 스페로이드 배양하여 코어-쉘 타입 스페로이드로 배양하고, 그 결과를 도 18에 나타내었다. 도 18에서 코어 쉘 구조의 스페로이드가 형성됨을 확인할 수 있다.

< 실시예 3-3> 무작위 혼합 타입 스페로이드 형성

GFP 형광을 띠는 HeLa 세포와 Red 형광 단백질을 갖는 HEK-293 세포를 각각 기초 배양한 후, 이를 각각 떼어내어 혼합한 후 스페로이드를 형성하고, 그 결과를 도 19에 나타내었다. 도 19에서 혼합된 세포가 스페로이드를 형성하는 것을 확인할 수 있다.

Claims

세포를 배양하기 위한 웰을 포함하는 배양 플레이트부;
상기 배양 플레이트부를 덮는 커버부; 및
상기 커버부의 상기 배양 플레이트부와 접하는 표면으로부터 상기 배양 플레이트부의 상게 웰 내부로 향하여 연장된 돌출부를 포함하고, 상기 돌출부는 자성을 나타내는 것을 특징으로 하는 3차원 세포 배양 용구.
삭제
제 1 항에 있어서,
상기 돌출부는 영구 자석을 포함하는 것을 특징으로 하는 3차원 세포 배양 용구
제 1 항에 있어서,
상기 돌출부는 전자석을 포함하는 것을 특징으로 하는 3차원 세포 배양 용구
제 4 항에 있어서,
상기 전자석에 공급되는 전류의 크기와 공급 시간을 제어하는 제어부 및 상기 제어부에 의하여 정해진 시간 동안 상기 전자석에 전원을 공급하는 전원부를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 3차원 세포 배양 용구
제 1 항에 있어서,
상기 돌출부의 길이는 상기 웰의 깊이의 1/20 내지 9/10 인 것을 특징으로 하는 3차원 세포 배양 용구.
제 1 항에 있어서,
상기 돌출부는 상기 세포를 배양하기 위한 웰 당 1개씩 포함되도록 형성되는 것을 특징으로 하는 3차원 세포 배양 용구.
제 1 항에 있어서,
상기 돌출부는 상기 세포를 배양하기 위한 웰 당 복수개 포함되도록 형성되는 것을 특징으로 하는 3차원 세포 배양 용구.
제 1 항에 있어서,
상기 돌출부의 말단이 뾰족하게 형성되는 것을 특징으로 하는 3차원 세포 배양 용구.
나노 입자가 포함된 배양액에서 스페로이드 형태로 배양하기를 원하는 세포를 기초 배양하는 단계;
상기 배양된 세포를 포함하는 배양액을 배양 플레이트부의 웰에 수용하는 단계;
돌출부를 포함하는 커버부로 상기 배양 플레이트부의 표면을 커버하여 상기 돌출부가 상기 웰의 내부에 위치하도록 하는 단계; 및
상기 돌출부의 자성에 의하여 상기 세포가 스페로이드를 형성하면서 배양되는 단계;를 포함하는 제 1 항 및 제 3 항 내지 제 8 항 중 어느 하나의 3차원 세포 배양 용구를 이용한 세포의 3차원 배양 방법.
제 10 항에 있어서,
상기 배양된 세포를 포함하는 배양액을 상기 배양 플레이트부의 웰에 수용하는 단계에서는 상기 돌출부의 말단이 상기 배양된 세포와 배양액과 접촉하지 않도록 수용하는 것을 특징으로 하는 3차원 세포 배양 용구를 이용한 세포의 3차원 배양 방법.
제 10 항에 있어서,
상기 배양된 세포를 포함하는 배양액을 상기 배양 플레이트부의 웰에 수용하는 단계에서는 상기 돌출부의 말단이 상기 배양된 세포와 배양액과 접촉하도록 수용하는 것을 특징으로 하는 3차원 세포 배양 용구를 이용한 세포의 3차원 배양 방법.
제 10 항에 있어서,
상기 나노 입자가 포함된 배양액에서 스페로이드 형태로 배양하기를 원하는 세포를 기초 배양하는 단계에서는
상기 스페로이드 형태로 배양하기를 원하는 세포의 종류가 복수개이고, 상기 복수개 종류의 스페로이드 형태로 배양하기를 원하는 세포가 상기 나노 입자가 포함된 배양액에서 혼합되어 동시에 기초 배양되는 것을 특징으로 하는 3차원 배양 용구를 이용한 세포의 3차원 배양 방법.
제 10 항에 있어서,
스페로이드 형태로 배양하기를 원하는 제 1 세포, 제 2 세포를 나노 입자가 포함된 각각의 배양액에서 별도로 기초 배양하는 단계;
상기 배양된 제 1 세포를 포함하는 배양액을 배양 플레이트부의 웰에 수용하는 단계;
상기 돌출부를 포함하는 커버부로 상기 배양 플레이트부의 표면을 커버하여 상기 돌출부가 상기 웰의 내부에 위치하도록 하는 단계;
상기 돌출부의 자성에 의하여 상기 제 1 세포가 스페로이드를 형성하면서 배양되는 단계;
상기 배양된 제 2 세포를 포함하는 배양액을 상기 제 1 세포 스페로이드 형성된 배양 플레이트부의 웰에 공급하는 단계; 및
상기 돌출부의 자성에 의하여 상기 제 2 세포가, 상기 제 1 세포 스페로이드를 코어부로 하고, 쉘부를 형성하는 스페로이드를 형성하면서 배양되는 단계;를 포함하는 3차원 배양 용구를 이용한 세포의 3차원 배양 방법.
제 10 항에 있어서,
스페로이드 형태로 배양하기를 원하는 복수 종류의 세포를 나노 입자가 포함된 각각의 배양액에서 별도로 기초 배양하는 단계;
상기 배양된 복수 종류의 세포를 포함하는 배양액을 별도의 배양 플레이트부의 웰에 수용하는 단계;
상기 돌출부를 포함하는 커버부로 상기 배양 플레이트부의 표면을 커버하여 상기 돌출부가 상기 웰의 내부에 위치하도록 하는 단계;
상기 복수 종류의 세포가 상기 돌출부의 자성에 의하여 각각 1차 스페로이드를 형성하면서 배양되는 단계;
상기 배양된 각각의 복수 종류 세포의 스페로이드를 혼합하는 단계 ; 및
상기 혼합된 복수 종류 세포의 1차 스페로이드가 상기 돌출부의 자성에 의하여 2차 스페로이드를 형성하면서 배양되는 단계;를 포함하는 3차원 배양 용구를 이용한 세포의 3차원 배양 방법.
제 10 항에 있어서,
상기 자성 나노 입자는 마그네타이트, Fe₃O₄, γ-Fe₂O₃, 망간 페라이트, 코발트 페라이트 및 니켈 페라이트로 이루어진 그룹에서 선택되는 1개 또는 복수개인 것을 특징으로 하는 3차원 배양 용구를 이용한 세포의 3차원 배양 방법.