KR101419711B1

KR101419711B1 - 항원제시세포의 활성화 처리방법

Info

Publication number: KR101419711B1
Application number: KR1020087007237A
Authority: KR
Inventors: 미에 니에다; 마나미 이소가이; 마사시 타카하라; 앤드류 니콜
Original assignee: 가부시키가이샤 메디넷
Priority date: 2005-09-08
Filing date: 2006-09-05
Publication date: 2014-07-17
Also published as: ES2391573T3; EP1930414A4; AU2006288348B2; AU2006288348A1; EP1930414B1; US20090104161A1; US8609410B2; EP1930414A1; KR20080059166A; WO2007029689A1; JP5384827B2; DK1930414T3; JP5307944B2; CN101258238A; CN101258238B; JP2013150609A; JPWO2007029689A1; US20140073050A1

Abstract

본 발명은, 질병 항원 특이적 CD8+CTL 및/또는 γδT세포를 함유하는 면역담당세포를 in vivo 및/또는 in vitro에 있어서 효율적으로 유도시킬 수가 있는 활성화 항원제시세포, 상기 활성화 항원제시세포를 함유하는 의약, 상기 활성화 항원제시세포를 사용한 치료·예방 방법, 상기 활성화 항원제시세포를 사용하여 유도된 질병 항원 특이적 CTL 및/또는 γδT세포를 함유하는 면역담당세포의 유도 방법, 이 방법에 의해 유도된 면역담당세포, 이 면역담당세포를 함유하는 의약, 및 이 면역담당세포를 사용한 치료·예방 방법을 제공한다. 항원제시세포를 질병 항원으로 감작시키고, 또한, 비스포스포네이트(bisphosphonates)로 공동감작시키는 것에 의해, 비스포스포네이트로 공동감작시키지 않는 경우와 비교하여, 질병 항원 특이적 CD8+CTL 및/또는 γδT세포의 비율 및 세포수를 증가시킬 수가 있다.

항원제시세포, 면역담당세포, 수지상세포

Description

항원제시세포의 활성화 처리방법{METHOD FOR ACTIVATION TREATMENT OF ANTIGEN-PRESENTING CELL}

본 발명은 비스포스포네이트와 질병 항원으로 공동감작(共同感作)하는 항원제시세포에 관한 것이다. 또 본 발명은, 상기 항원제시세포를 함유하는 의약, 이 수지상세포(樹枝狀細胞)를 사용한 치료·예방 방법, 상기 항원제시세포를 사용한 면역담당세포의 유도 방법에 관한 것이다. 또한 본 발명은, 상기의 유도 방법에 의해 유도된 면역담당세포, 상기 면역담당세포를 함유하는 의약, 상기 면역담당세포를 사용한 치료·예방 방법에 관한 것이다.

암의 치료 방법으로서는 수술에 의한 절제, 방사선, 항암제를 사용하는 화학요법이 실시되고 있다. 최근에는 이들 요법 이외에도 여러가지 치료 방법이 연구되어 실용화되고 있다. 그 중 하나로 면역세포를 이용한 면역세포요법이 있다.

면역세포요법에는, 임파구를 체외에서 림포카인에 의해 활성화시켜 체내로 되돌리는 LAK(Lymphokine Activated Killer)요법, 병변(病變)을 특이적으로 인식·상해하는 세포 상해성 T세포(Cytotoxic T Lymphocyte, 이하, CTL로 기재한다)를 사용한 CTL 요법, 및 수지상세포요법 등이 포함된다.

상기 수지상세포요법은, 질병의 항원을 직접 또는 세포내에서 프로세싱한 후 에 MHC(Major Histocompatibility antigen Complex; 주요 조직적합 항원 복합체)에 제시시킨 수지상세포를 사용하여, 체내에서 병원을 선택적으로 공격하는 질병 항원 특이적 CTL을 유도하여, 치료를 실시하는 요법이다. 제시시키는 상기 질병의 항원에는, 예를 들면, 암 항원 단백 또는 펩티드, 감염증 항원 단백 또는 펩티드, 또는 그 일부가 포함된다(예를 들면, 비특허문헌1, 비특허문헌2 참조).

질병 항원으로 감작(感作)한 수지상세포와 임파구를 혼합배양하여 수지상세포로 임파구를 자극하는 것에 의해 in vitro(체외)에서 질병 항원 특이적 CTL을 유도할 수가 있다. 예를 들면, 암 항원 단백 또는 펩티드 또는 감염증 항원 단백 또는 펩티드를 감작시킨 수지상세포를 사용하는 경우, 1회의 혼합배양으로 유도되는 질병 항원 CTL의 증가는, 상기 수지상세포를 사용하지 않는 경우에 비하여 5~20배이다.

암 항원 단백 또는 펩티드 또는 감염증 항원 단백 또는 펩티드를 감작시킨 수지상세포를 사용한 수지상세포요법에 있어서는, in vivo(체내)의 질병 항원 특이적 CTL의 유도효율, 즉, 전체 임파구에서 차지하는 CTL의 비율이, 2~14배까지 상승한다는 것이 알려져 있다.

수지상세포에 의한 질병 항원 특이적 CTL의 유도효율을 향상시키는 것에 의해 수지상세포요법의 효과를 한층 더 양호하게 하기 위하여, 현재, 주로 2개의 방법이 실시되고 있다.

하나는, 수지상세포를 질병 항원으로 감작시키는 것에 추가하여, 다시 수지상세포상의 톨 유사 수용체(Toll-like receptor, 이하 TLR로 기재한다)와 반응하는 약제 등을 수지상세포에 반응시켜서 수지상세포의 항원제시능력을 향상시키는 것에 의해, 직접적으로 질병 항원 특이적 CTL의 유도효율을 향상시키는 방법이다(TLR에 의한 애쥬번트(Adjuvant)효과, 예를 들면, 비특허문헌3, 비특허문헌4 참조). 다른 하나는, 수지상세포를 질병 항원으로 감작시키는 것에 추가하여, 수지상세포상의 MHC분자 이외의 항원제시분자, 예를 들면, CD1d(Cluster Differ entiation 1d) 분자상에 당지질 등과 같은 것을 제시시켜서 질병 항원 특이적 CTL 이외의 iNKT(invariant Natural Killer T cells) 등을 함유하는 면역담당세포를 활성화시키고, 이 활성화된 면역담당세포에 의해 간접적으로 질병 항원 특이적 CTL의 유도효율을 향상시키는 방법이다(질병 항원 특이적 CTL 이외의 면역담당세포에 의한 에쥬번트 효과, 예를 들면, 비특허문헌5, 비특허문헌6 참조).

그러나, 상기의 TLR에 의한 직접적인 에쥬번트 효과, 또는 질병 항원 특이적 CTL 이외의 면역담당세포에 의한 간접적인 에쥬번트 효과에 의한 질병 항원 특이적 CTL유도의 상승은, 이들 에쥬번트를 사용하지 않는 경우에 비하여 4배~6배 정도이다(in vitro). 따라서, 더욱 효율적으로 질병 항원 특이적 CTL을 유도할 수 있는 기술의 개발이 요망되고 있다.

비특허문헌1 : Blood 2004, 103, 383-389

비특허문헌2 : Proc Natl Acad Sci U S A. 2001, 98, 8809-8814

비특허문헌3 : Nat Rev Immunol. 2004, 4, 449-511

비특허문헌4 : Cancer Res. 2004, 64, 5461-5470

비특허문헌5 : J Clin Invest. 2004, 114, 1800-1811

비특허문헌6 : J Exp Med. 2002, 195, 617-624

본 발명은 상기와 같은 사정을 감안하여 이루어진 것으로서, 질병 항원 특이적 CD8+CTL 및/또는 γδT세포를 우위적으로 함유하는 면역담당세포를 in vivo 및/또는 in vitro에 있어서 효율적으로 유도시키기 위한 항원제시세포(예를 들면, 수지상세포 등)의 활성화 처리방법, 상기 활성화 항원제시세포를 함유하는 의약, 상기 활성화 항원제시세포를 사용한 치료·예방 방법, 상기 활성화 항원제시세포를 사용한 질병 항원 특이적 CD8+CTL 및/또는 γδT세포를 함유하는 면역담당세포의 유도 방법, 상기 방법에 의해 유도된 면역담당세포, 상기 면역담당세포를 함유하는 의약, 및 상기 면역담당세포를 사용한 치료·예방 방법을 제공한다.

본 발명자들은 상기의 과제를 해결하기 위하여 연구를 실시하였다. 그 결과, 수지상세포를 질병 항원으로 감작시키는 것에 추가하여 비스포스포네이트로 공동감작시키면, 비스포스포네이트를 첨가하지 않는 경우와 비교할 때, 질병 항원 특이적 CTL 및 γδT세포의 전체 임파구에서 차지하는 비율 및 세포수가 현저하게 증가한다는 것을 발견하고, 본 발명을 완성하였다. 예를 들면, 비스포스포네이트를 첨가하는 것에 의해, 첨가하지 않는 경우에 비하여 전체 임파구에서 차지하는 질병 항원 특이적 CTL의 비율이 약 100배, 또, γδT세포의 비율이 약 3배 높아지고, 세포수로서 질병 항원 특이적 CTL이 약 90배, γδT세포가 약 6배로 증가할 수가 있다. 단, 본 발명은, 이들 수치에 한정되는 것이 아니다. 본 발명에 의하면, 질병 항원 특이적 CD8+CTL 및/또는 γδT세포를 유도하여 암 및/또는 감염증을 치료·예방하는 면역세포요법을 더욱 발전시킬 것이다.

즉, 본 발명은 이하와 같다.

(1) 항원제시세포의 활성화 처리방법에 있어서, 비스포스포네이트와 질병 항원으로 상기 항원제시세포를 공동감작시키는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 항원제시세포의 활성화 처리방법.

(2) 상기 항원제시세포가, 수지상세포, 미성숙 수지상세포, 인공 항원제시세포로 이루어지는 군으로부터 선택되는 상기 (1) 기재의 항원제시세포의 활성화 처리방법.

(3) 상기 비스포스포네이트가 하기의 일반식 (1)로 나타내는 화합물, 그 염, 및 그들의 수화물에 있어서,

상기 식(I) 중, R은, 수소원자 또는 저급 알킬기이며, R₁과 R₂는, 각각 독립적으로, 수소원자, 할로겐원자, 하이드록실기, 아미노기, 티올기, 아릴기 또는 치환된 아릴기, 알킬기 또는 치환된 알킬기, 저급 알킬아미노기, 아랄킬기, 시클로알킬기 및 복소환식기로 이루어지는 군으로부터 선택되며, 또는 R₁과 R₂는 동일한 환형상 구조의 일부를 형성하고,

상기 R₁과 R₂에 있어서의 치환기로서는, 할로겐원자, 저급 알킬기, 하이드록실기, 티올기, 아미노기, 알콕시기, 아릴기, 아릴티오기, 아릴옥시기, 알킬티오기, 시클로알킬기, 복소환식기 등으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 상기 (1) 또는 (2) 기재의 항원제시세포의 활성화 처리방법.

(4) 상기 비스포스포네이트가, 졸레드론산, 파미드론산, 알렌드론산, 리세드론산, 이반드론산, 인카드론산, 에티드론산, 그들의 염, 및 그들 수화물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 상기 (1)~(3) 중 어느 하나에 기재된 항원제시세포의 활성화 처리방법.

(5) 상기 공동감작에 있어서의 상기 비스포스포네이트의 농도가, 0.001~20μM인 상기 (1)~(4) 중 어느 하나에 기재된 항원제시세포의 활성화 처리방법.

(6) 상기 공동감작에 있어서의 상기 비스포스포네이트의 농도가, 0.001~5μM인 상기 (5)에 기재된 항원제시세포의 활성화 처리방법.

(7) 상기 질병 항원이, 암 항원 또는 감염증 항원 단백, 그 펩티드, 암세포 또는 감염증 세포의 세포 융해물, 아포토시스세포, 네크로시스세포, 및 그들의 열처리물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 상기 (1)~(6) 중 어느 하나에 기재된 항원제시세포의 활성화 처리방법.

(8) 상기 공동감작에 있어서의 상기 질병 항원의 농도가, 0.01~20㎍/mL인 상기 (1)~(7) 중 어느 하나에 기재된 항원제시세포의 활성화 처리방법.

(9) 상기 공동감작에 있어서의 상기 질병 항원의 농도가, 0.1~2㎍/mL인 상기 (8) 기재의 항원제시세포의 활성화 처리방법.

(10) 활성화 항원제시세포의 생산방법에 있어서, 상기 (1)~(9) 중 어느 하나에 기재된 활성화 처리방법으로 항원제시세포를 처리하는 것을 포함하는 활성화 항원제시세포의 생산방법.

(11) 상기 (10)에 기재된 생산방법에 의해 생산된 활성화 항원제시세포.

(12) 암 및/또는 감염증을 위한 의약조성물에 있어서, 상기 (11) 기재의 활성화 항원제시세포를 함유하는 의약조성물.

(13) 상기 항원제시세포가, 자기 유래 또는 사람백혈구항원(HLA)을 같이 하는 타가(他家) 유래인 상기 (12) 기재의 의약조성물.

(14) 암 및/또는 감염증의 예방·치료 방법에 있어서, 상기 (11) 기재의 활성화 항원제시세포를 투여하는 것을 포함하는 예방·치료 방법.

(15) 상기 항원제시세포가, 자기 유래 또는 HLA를 같이 하는 타가 유래인 상기 (14) 기재의 예방·치료 방법.

(16) 면역담당세포의 유도 방법에 있어서, 하기 공정 (i) 및 (ii)를 포함하는 것을 특징으로 하는 면역담당세포의 유도 방법;

(i) 비스포스포네이트와 질병 항원으로 항원제시세포를 공동감작시키는 공정,

(ii) 상기 공동감작과 동시 또는 그 후에, 상기 항원제시세포와 임파구를 혼합배양하는 공정,

(17) 유도되는 면역담당세포가, 질병 항원 특이적 CD8+CTL 및 γδT세포의 적어도 한쪽을 포함하는 상기 (16) 기재의 면역담당세포의 유도 방법.

(18) 상기 항원제시세포가, 수지상세포, 미성숙 수지상세포, 인공 항원제시세포로 이루어지는 군으로부터 선택되는 상기 (16) 또는 (17)에 기재된 면역담당세포의 유도 방법.

(19) 상기 비스포스포네이트가 하기의 일반식(I)로 나타내는 화합물, 그 염, 및 그들의 수화물에 있어서,

상기 R₁과 R₂에 있어서의 치환기로서는, 할로겐원자, 저급 알킬기, 하이드록실기, 티올기, 아미노기, 알콕시기, 아릴기, 아릴티오기, 아릴옥시기, 알킬티오기, 시클로알킬기, 복소환식기로 이루어지는 군으로부터 선택되는 상기 (16)~(18) 중 어느 하나에 기재된 면역담당세포의 유도 방법.

(20) 상기 비스포스포네이트가, 졸레드론산, 파미드론산, 알렌드론산, 리세드론산, 이반드론산, 인카드론산, 에티드론산, 그들 염, 및 그들의 수화물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 상기 (16)~(19) 중 어느 하나에 기재된 면역담당세포의 유도 방법.

(21) 상기 공동감작에 있어서의 상기 비스포스포네이트의 농도가, 0.001~20μM인 상기 (16)~(20) 중 어느 하나에 기재된 면역담당세포의 유도 방법.

(22) 상기 공동감작에 있어서의 상기 비스포스포네이트의 농도가, 0.001~5μM인 상기 (21)에 기재된 면역담당세포의 유도 방법.

(23) 상기 질병 항원이, 암 항원 또는 감염증 항원 단백, 그 펩티드, 암세포 또는 감염증 세포의 세포 융해물, 아포토시스세포, 네크로시스세포, 및 그들의 열처리물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 상기 (16)~(22) 중 어느 하나에 기재된 면역담당세포의 유도 방법.

(24) 상기 공동감작에 있어서의 상기 질병 항원의 농도가, 0.01~20㎍/mL인 상기 (16)~(23) 중 어느 하나에 기재된 면역담당세포의 유도 방법.

(25) 상기 공동감작에 있어서의 상기 질병 항원의 농도가, 0.1~2㎍/mL인 상기 (24) 기재의 면역담당세포의 유도 방법.

(26) 면역담당세포의 생산방법에 있어서, 상기 (16)~(25) 중 어느 하나에 기재된 유도 방법에 의해 면역담당세포를 유도하는 것을 포함하는 면역담당세포의 생산방법.

(27) 상기 (26)에 기재된 생산방법에 의해 생산된 면역담당세포.

(28) 암 및/또는 감염증을 위한 의약조성물에 있어서, 상기 (27) 기재의 면역담당세포를 함유하는 의약조성물.

(29) 상기 항원제시세포가, 자기 유래 또는 HLA를 같이 하는 타가 유래인 상기 (28) 기재의 암 및/또는 감염증을 위한 의약조성물.

(30) 암 및/또는 감염증의 예방·치료 방법에 있어서, 상기 (27) 기재의 면역담당세포를 투여하는 것을 포함하는 예방·치료 방법.

(31) 상기 항원제시세포가, 자기 유래 또는 HLA를 같이 하는 타가 유래인 상기 (30) 기재의 암 및/또는 감염증의 예방·치료 방법.

(32) 비스포스포네이트를 유효성분으로서 함유하는 질병 항원으로 감작할 때의 항원제시세포의 활성화 촉진제.

(33) 상기 항원제시세포가, 수지상세포, 미성숙 수지상세포, 인공 항원제시세포로 이루어지는 군으로부터 선택되는 상기 (32) 기재의 질병 항원으로 감작할 때의 항원제시세포의 활성화 촉진제.

(34) 상기 비스포스포네이트가 하기 일반식(I)로 표시되는 화합물, 그 염, 및 그들의 수화물에 있어서,

상기 식(I) 중, R은, 수소원자 또는 저급 알킬기이며, R₁과 R₂는, 각각 독립적으로, 수소원자, 할로겐원자, 하이드록실기, 아미노기, 티올기, 아릴기 또는 치환된 아릴기, 알킬기 또는 치환된 알킬기, 저급 알킬아미노기, 아랄킬기, 시클로알킬기 및 복소환식기로 이루어지는 군으로부터 선택되며, 또는 R₁과 R₂는 동일한 환형상 구조의 일부를 형성하며,

상기 R₁과 R₂에 있어서의 치환기로서는, 할로겐원자, 저급 알킬기, 하이드록실기, 티올기, 아미노기, 알콕시기, 아릴기, 아릴티오기, 아릴옥시기, 알킬티오기, 시클로알킬기, 복소환식기로 이루어지는 군으로부터 선택되는 상기 (32) 또는 (33) 기재의 질병 항원으로 감작할 때의 항원제시세포의 활성화 촉진제.

(35) 상기 비스포스포네이트가, 졸레드론산, 파미드론산, 알렌드론산, 리세드론산, 이반드론산, 인카드론산, 에티드론산, 그들 염, 및 그들 수화물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 상기 (32)~(34) 중 어느 하나에 기재된 질병 항원으로 감작할 때의 항원제시세포의 활성화 촉진제.

도 1은, A27L 특이적 CD8+CTL의 비율을 측정한 결과의 일례를 나타내는 그래 프.

제1실시형태 : 활성화 항원제시세포의 제작

우선, 본 발명의 활성화 항원제시세포에 대하여 설명한다.

본 발명의 활성화 항원제시세포란 비스포스포네이트 및 질병 항원으로 공동감작시킨 항원제시세포이다.

본 발명에서 사용하는 상기 항원제시세포는, 특별히 제한되지 않으며, 예를 들면, 미성숙 수지상세포, 성숙 수지상세포, 그 밖의 항원제시세포, 인공 항원제시세포 및 그들의 혼합물 중 어느 것을 사용하여도 좋다. 그 중에서도, 미성숙 수지상세포 및 성숙 수지상세포가 바람직하며, 미성숙 수지상세포가 보다 바람직하다. 비스포스포네이트와 질병 항원으로 공동감작시킨 경우에는 미성숙 수지상세포 쪽이 보다 적절하게 질병 항원 특이적 CTL 및/또는 γδT세포를 유도시킬 수가 있기 때문이다. 또, 상기 인공 항원제시세포란, 인위적으로 제작한 항원제시세포로서, 예를 들면, 적어도 주요 조직적합 항원(MHC) 클래스I 및 보조자극분자(예를 들면, CD80, CD86 등)를 발현시키도록 유전자 공학적으로 제작한 세포를 들 수가 있다. 또한, 상기 인공 항원제시세포는, 종양 유래의 세포주를 상술한 바와 같이 MHC 클래스I 및 보조자극분자를 발현하도록 개변한 것이라도 좋다. 상기 세포주의 예로서는, 유방암 유래의 MDA-MB-231(클래스I 항원 HLA-A*0201), 신장암 유래의 TUHR10TKB(클래스I 항원 HLA-A*0201/A*2402), 위암 유래의 JR-st주(클래스I 항원 HLA-A*2402) 등을 들 수가 있다. 이들 세포주는, 예를 들면, ATCC나 RIKEN BioResource Center 등으로부터 입수할 수가 있다. 상기 인공 항원제시세포의 제작에 대해서는, 미국 공개공보 US-2005-0048646-A1에 개시되어 있으며, 이 인용에 의해 그 내용의 전체가 본 발명에 포함된다.

본 발명에 있어서, 비스포스포네이트란, 특별히 제한되지 않으며, 피롤린산의 아날로그로서, 피롤린산 골격의 P-O-P의 O(산소원자)를 C(탄소원자)로 치환한 화합물을 말한다. 본 발명에서 사용하는 비스포스포네이트는, 예를 들면, 하기 일반식(I)로 표시되는 화합물, 그 염, 및 그들 수화물을 들 수가 있다.

상기 식(I) 중, R은, 수소원자 또는 저급 알킬기이며, R₁과 R₂는, 각각 독립적으로, 수소원자, 할로겐원자, 하이드록실기, 아미노기, 티올기, 치환되어 있어도 좋은 아릴기, 치환되어 있어도 좋은 알킬기, 저급 알킬아미노기, 아랄킬기, 시클로알킬기 및 복소환식기로 이루어지는 군으로부터 선택되며, 또 R₁과 R₂는 동일한 환형상 구조의 일부를 형성하여도 좋다.

상기 R₁과 R₂에 있어서의 치환기로서는, 예를 들면, 할로겐원자, 저급 알킬기, 하이드록실기, 티올기, 아미노기, 알콕시기, 아릴기, 아릴티오기, 아릴옥시기, 알킬티오기, 시클로알킬기, 복소환식기 등으로 이루어지는 군으로부터 선택된다.

본 명세서에 있어서, 할로겐원자로서는, 예를 들면, 플루오로원자, 클로로원자, 브롬원자 등; 알킬기로서는, 예를 들면, 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 부틸, 펜틸, 헵틸, 옥틸, 펜타데카닐기 등의 직쇄 또는 분지사슬 C₁-C₃₀알킬기 등; 저급 알킬기로서는, 예를 들면, 직쇄 또는 분지사슬 C₁-C₁₀알킬기 등; 아릴기로서는, 예를 들면, 페닐, 나프틸기 등; 아랄킬기로서는, 예를 들면, 아릴-저급 알킬기 등; 시클로알킬기로서는, 예를 들면, 시클로옥틸, 아다만틸 등의 C₁-C₁₀시클로알킬기 등; 복소환식기로서는, 피리딜, 푸릴, 피롤리디닐, 이미다졸릴, 퀴놀릴, 이소퀴놀릴기 등을 각각 들 수 있다.

또, 본 발명에 있어서, 비스포스포네이트는, 약학적으로 허용되는 것이 바람직하며, 예를 들면, 골흡수 억제작용을 가져서 일반적으로 골다공증 치료약으로서 사용되는 것을 들 수가 있다. 그 예로서, 졸레드론산, 그 염 및/또는 그들 수화물(예를 들면, 졸레드론산 나트륨 수화물(Zometa(상품명), Novartis Pharma사 제품), 파미드론산, 그 염 및/또는 그들 수화물(예를 들면, 파미드론산 2나트륨·5수화물(Aredia(상품명), Norvatis Pharma사 제품), 알렌드론산, 그 염 및/또는 그들 수화물(예를 들면, 알렌드론산 나트륨 3수화물(Onclast(상품명), 반유세이야쿠), 리세드론산, 그 염 및/또는 그들 수화물(예를 들면, 리세드론산 나트륨 수화물), 이반드론산, 그 염 및/또는 그들 수화물(예를 들면, 이반드론산 나트륨), 인카드론산, 그 염 및/또는 그들 수화물(예를 들면, 인카드론산 2나트륨), 에티드론산, 그 염 및/또는 그들 수화물(예를 들면, 에티드론산 2나트륨) 등을 들 수가 있다. 그 가운데에서, 특히 졸레드론산, 파미드론산, 알렌드론산, 그들 염 및/또는 그들의 수화물이 바람직하다.

본 발명에서 사용하는 질병 항원에 있어서, 상기 「질병」이란, 특별히 제한되지 않으나, 예를 들면, 암이나 감염증 등이다. 상기 암으로서는, 특별히 제한되지 않고 모든 암을 포함하며, 예를 들면, 치료가 곤란한 암(전암상태를 포함함) 등을 들 수가 있다. 상기 감염증으로서는, 특별히 제한되지 않으며, 예를 들면, 에이즈, B형·C형 간염 등의 바이러스 감염증이나, 세포감염, 세균감염, 진균감염, 또는, 원충에 의한 감염증 등을 들 수가 있다. 본 발명에 있어서 사용하는 질병 항원의 형태는 특별히 제한되지 않으며, 예를 들면, 암 항원 또는 감염증 항원 단백 및 그 펩티드를 들 수가 있다. 또, 상기 질병 항원으로서는, 예를 들면, 암세포 또는 감염증세포의 세포 융해물, 아포토시스세포, 네크로시스세포, 및 그들 열처리물을 사용할 수가 있다.

상기 질병의 항원이 암 항원인 경우, 그 암 항원의 암의 종류에 상관없이, 어떤 항원도 사용할 수가 있다. 예를 들면, 전립선암, 간암, 췌장암 등의 어떤 암 항원이라도 이용할 수가 있다. 상기 암 항원으로서는, 예를 들면, MAGE1, MAGE3, GAGE, BAGE 및 RAGE 등의 MAGE 유전자 패밀리에 코드되는 것을 들 수가 있다. 다른 암 항원으로서는, 예를 들면, p53, K-ras, CDK4 및 bcl-c-abl 유전자산물 등의 변위에 의해 발생하는 암 항원, c-erb2(neu) 단백 등의 암세포에서 과잉으로 발현되는 암 항원, 및, HPV-16의 E7 단백 등의 발암 바이러스 항원 등을 들 수가 있다. 또한, 암 태아 항원(CEA)이나 α-페토프로테인(AFP) 등의 종양 태아 항원, 및, 전립선 특이적 항원이나, 백혈병 및 임파종의 B세포에서 발현하는 CD-10(CALLA 항원) 등의 분화 항원도 사용할 수가 있다.

또, 감염증 항원의 감염증의 종류도, 특별히 제한되지 않으며, 예를 들면, 에이즈나 B형·C형 간염, 엡스타인-바 바이러스(Epstein-Barr virus; EBV) 감염증, HPV감염증 등의 바이러스성 감염증 중에서도 난치성 질환도 들 수가 있다. 또, 말라리아원충의 스포로조이드(sporogonic) 주위 단백과 같은 기생충의 항원도 사용할 수가 있다.

또, 본 발명에서는 상기 질병 항원 펩티드로서 합성 펩티드를 사용할 수가 있다. 이에 의해, 자기의 암조직 등으로부터 채취한 암 항원을 사용하는 경우와 비교하여 환자의 부담을 경감시킬 수가 있다. 상기 암 항원 단백 또는 펩티드로서는, 예를 들면, 하기 표 1~3에 기재된 것을 사용할 수가 있으며, 이들은, 당해 분야의 당업자가 용이하게 입수 또는 합성할 수가 있다.

항원명	암의 종류	항원명	암의 종류	항원명	암의 종류
AARS	태반	BMS1L	골수종	DUSP12	태반종
ABL1	섬유아세포종	BMX	전립선암 외	DYH1B	간암
ACADVL	태반종	BRD2	T임파종	EBP	간암
ACLT7B	뇌종양	BTG3	자궁암	EBV-BMLF1	B임파종 외
ACP2	임파종	C21ORF2	폐암 외	EBV-EBNA-2,3,4,6	B임파종 외
ACVR2B	뇌종양	CALU	케라티노사이토마	EDF-1	췌장암
ADPRT	섬유아세포종	CARHSP1	태반종	EEF1G	간암 외
ADSL	뇌종양	CASP-8	편평상피암	EEF2	난소암
AF6	골수종	CCN1	뇌종양	EF1D	피부암 외
AFP	폐암	CCT8	골수종	EGLN1	편도암
AGPAT2	신장암	CD43	신장암	EIF3S6IP	뇌종양, 자궁경암 외
AIBP	신장암	CDC27	멜라노마	EIF4EBP3	임파종
AIM1	간암	CDC2L5	글리오블라스토마	EIF4G2	태반종 외
AKAP9	뇌종양	CDIPT	고환	ela2	급성 임파구성 백혈병
ALDA	섬유아세포종	CDK4	멜라노마	EMS1	유방암
ALDOA	섬유아세포종	CEA	대장암 외	EPHB2	위암 외
ALOX12B	뇌종양 외	CENF	유방암	ETV6-AML1	급성 단구성 백혈병
ALPHA NAC	뇌종양	CENPB	자궁암	FBLN1	뇌종양
AMHR2	고환	CHD3	흉선종	FBXO7	췌장암
ANT3	뇌종양, 폐암 외	CKAP1	골수종	FDFT1	간암
ANXA11	기형암종	CLIC6	소화기암	FH	뇌종양
ANXA2	각종 암	CLK3	자궁경암	FKSG11	유방암
AP1G2	간암	CLN6	폐암	FNBP3	피부암
AP1M1	간암	CNTF	폐암 외	FXYD5	골수종
AP2M1	골수종	COG8	자궁암	GAGE3,4,5,6,7B	멜라노마, 각종 암
AP3D1	육종 외	COPB2	폐암	GCC2	임파종
APC	대장암 외	CORO1A	뇌종양 외	GDF11	뇌종양
APEXL2	폐암 외	COTL1	태반 외	GLIPR1	신경교종(글리오마)
ARL1	방광암	CSDA	태반	GNB3	뇌종양
ARL6IP	골수종	CTAG1	멜라노마	GNG4	뇌종양
ARNTL1	뇌종양	CTAG2	멜라노마	GOA4	위암
ASNA1	자궁암	CTAGE-1	고환	GOLGA1	자궁경암, 고환
ATF3	육종	CTNNA1	대장암 외	GOT1	간암
ATIC	간암	CUL5	고환	gp100	멜라노마
ATP5B	태반	DAD1	뇌종양	GRB7	폐암 외
ATRX	각종 암	DCTN1	뇌종양	GTF2H2	피부암 외
BAG5	뇌종양	DDX5	육종	GTF2I	자궁경암
BAGE	멜라노마, 각종 암	DKFZP434N0735	뇌종양	GUCY2D	망막종
BASP1	뇌종양	DKFZP434P112	고환	H2AFY	폐암 외
BAZ1A	자궁경암	DKFZP564C236	뇌종양	HC58	간암
BAZ2A	고환	DLG5	뇌종양	HDAC5	대장, 직장암 외
bcr-abl	만성 골수성 백혈병	DNAJA1	태반	HER2/neu	유방암, 난소암, 위암
BIRC2	간암	DNAJA2	피부암	HKF1	뇌종양
BIRC3	간암	DNAJB1	태반종	HMGA2	간암
BMAL2	뇌종양	DSP	피부암	HMGN1	골수종

항원명	암의 종류	항원명	암의 종류	항원명	암의 종류
HMMR	유방암	LDHB	방광암, 육종 외	NME1	폐암 외
HNRPAB	태반종 외	LGALS1	폐암	NME2	망막종
HPV16-E6	자궁경암 외	LGALS4	위암	NOTCH2	유방암 외
HPV16-E7	자궁경암 외	LIMS1	골수종	NRIP1	유방암
HPV18-E6	자궁경암 외	LMNA	폐암, 신장암	NUDT4	태반종
HPV18-E7	자궁경암 외	LRP130	간암	NUPL1	뇌종양, 태반종
HRASLS3	간암 외	LYST	폐암 외	NY-CO-10	대장, 직장암
HSP60	간암, 자궁암	MAGE-1	멜라노마, 각종 암	NY-CO-33	대장암
HSP90A	각종 암	MAGE-2	멜라노마, 각종 암	NY-CO-7	대장, 직장암
HSPA4	임파종	MAGE-3	멜라노마, 각종 암	NY-CO-8	대장, 직장암
HSPCA	태반종	MAGE-4	멜라노마, 각종 암	NY-ESO-1	고환
HSPE1	자궁암	MAGE-6	멜라노마, 각종 암	OCLN	대장암
HSPH1	골수성 백혈병	MAGED2	유방암, 각종 암	OGFR	피부암 외
HTLV-1 tax	성인 T세포 백혈병	MAN2C1	고환 외	p53	편평상피암 외
ID4	자궁암	MAP1B	뇌종양	PAD3	신장암
IDH2	심장, 대장암	MAPK1	폐암 외	PAF1	간암
IFI16	T세포성 백혈병	MARK4	뇌종양	PAP	전립선암
IGBP1	B임파종 외	MART-1	멜라노마	PDAP1	각종 암
IKBKAP	자궁경암	MAZ	췌장암 외	PDI	대장암, 폐암 외
ILF3	T임파세포종, 자궁경암	MBD2	임파종	PDXK	난소암
INPP1	대장암	MCM3	자궁경암, 췌장암	PECI	간암
JPHL1	골수종	MED6	폐암 외	PFAS	뇌종양
JUN	각종 암	MESDC2	골수종	PFKFB3	뇌종양 외
KCNAB3	뇌종양	MIF	뇌종양 외	PFN1	대장, 폐, 췌장암
KIAA0117	골수종, 폐암	MJD1	뇌종양	PFN2	뇌종양
KIAA0175	골수성 백혈병	MK167	각종 암	PHF11	적아세포종
KIAA0291	뇌종양 외	MLF1	방광암 외	PHF3	신경교종 외
KIAA0570	뇌종양	MLH1	췌장암, 방광암	PHKG2	간암 외
KIAA0619	뇌종양	MRPS26	피부암	PI3	피부암
KIAA0801	뇌종양	MSLN	자궁암	PIAS1	B세포성 백혈병
KIAA0909	뇌종양	MUC-1무친	유방암, 난소암, 췌장암 외	PICALM	골수종
KIAA0975	뇌종양	MUM-1	멜라노마	PKCB1	T세포종
KIAA0989	뇌종양	MVP	망막종	PKD1	신장암
KIF22	임파아종	MYH10	육종	PMSCL1	임파아종
KIF9	고환 외	MYH9	골수종	POLR2E	폐암
KLHL2	뇌종양	MYO9B	간암	PPM1B	간암
KNS2	뇌종양 외	NAF1	임파종	PPP2R5C	골수종 외
KRT13	췌장암	NAP	고환	PPP4C	태반종, 골수종
KRT14	췌장암	NAP1L1	멜라노마	PRC1	신장암
KRT18	자궁경암	NASP	고환	PRDM5	각종 암
KRT7	태반종	NBC4	고환	PRDX1	방광암
KRT8	대장암 외	NCOR2	뇌종양	PRKWNK2	대장암
KTN1	임파종	NDUFV3	뇌종양	proteinase3	급성 골수성 백혈병
LB1	B임파종 외	NEDD9	임파종	PSA	전립선암
LDHA	육종	NFE2L2	멜라노마	PSMD4	뇌종양

항원명	암의 종류	항원명	암의 종류	항원명	암의 종류
PSMD9	육종	SLC25A2	고환	TMF1	자궁경암, 췌장암
PSME3	폐암 외	SLC25A27	뇌종양	TNKS2	유방암
PTMS	신장암	SLX13	뇌종양	TNNT1	육종
PTTG	뇌종양	SMTN	대장암	TOP2B	각종 암
QPRT	뇌종양, 뇌, 신장, 육종 외	SNN	뇌종양	TP53BP2	각종 암
RAB5C	폐암 외	SNT-1	자궁암	TPD52	유방암
RAGE	신장암	SNX6	각종 암	TPI1	간암
RAN	뇌종양	SOX1	뇌종양	TPM1	간암
ras	췌장암, 대장암, 간암 외	SOX2	뇌종양	TRAPPC1	자궁암
RASSF1	췌장암	SPN	신장암 외	TRP1,2	멜라노마
RBM10	폐암, 골수종	SR+89	폐암	TSTA3	폐암
RBM6	폐암	SRP19	간암 외	TTC12	임파종
RGS19IP1	폐암 외	SSA1	흉선종 외	TXNRD1	췌장암 외
RNF12	신장암	SSA2	피부암	tyrosinase	멜라노마
RNPC2	간암	SSNA1	고환	U2AF1L1	뇌종양
RPA2	신장암 외	SSP1	간암 외	U2AF1L2	뇌종양
RPL10	유방암	SSSCA1	자궁암	UBE1	태반
RPL10A	피부암	SSX1	섬유아세포종	UBE2D2	고환
RPL21	대장암	SSX4	방광암 외	UBQLN2	폐암
RPL27A	대장암	ST13	대장암	UE3A	케라티노사이토마
RPL3	대장암	STARD10	대장암	UN1	유방암, 폐암, 위암 외
RPL30	유방암	STARD7	자궁암 외	USH1C	대장암
RPL32	신장암	STIP1	폐암	USP1	고환
RPL34	자궁암	STK11	간암 외	USP10	골수종
RPL37A	뇌종양	STM	뇌종양	USP16	고환
RPS15A	대장암	STX4A	각종 암	USP19	뇌종양
RPS18	태반종	SUCLA2	간암 외	USP32	뇌종양
RSN	단구성 백혈병	SULT1A3	뇌종양 외	USP4	뇌종양
RUVBL1	대장, 직장암	SURF5	폐암, 피부암 외	VCL	자궁암
SART-1	각종 암	SYCP1	고환	VEGFB	섬유아세포종
SATB1	폐암	TADA3L	각종 암	VESPR	피부암
SBDS	자궁암	TAF10	간암 외	VPS45A	뇌종양
SCNN1A	신장암 외	TAF7	피부암	WT1	각종 백혈병, 각종 암
SCP1	고환	TBC1D1	뇌종양 외	YARS	폐암 외
SCP2	간암	TBC1D4	뇌종양	YWHAE	간암 외
SCR3	폐암	TBC1D5	골수종	ZFP36L2	T세포성 백혈병
SDBCAG84	유방암	TCE1	신장암	ZIC2	뇌종양
SEC14L1	폐암 외	TCEB3	폐암	ZNF202	고환
1-Sep	유방암	TCF4	흉선종	ZNF232	적아구
SFRS5	대장암	TDRD3	태반종	ZNF282	T임파구성 백혈병
SGPL1	뇌종양	TEL-AML1	급성 단구성 백혈병	ZNF292	태반종
SIN3A	뇌종양	TGFBI	신장암	β-카테닌	멜라노마
SK-Br-3	유방암	TIAF1	유방암	항체이디오타이프	B임파종
SLC22A17	뇌종양	TIMP3	신장암
SLC25A11	뇌종양	TKT	간암

본 발명에 있어서, 항원제시세포를 어떤 물질로 감작(感作)시킨다는 것은, 항원제시세포를 그 물질과 반응시키는 것을 말하며, 바람직하게는, 상기 물질을 항원제시세포의 표면상에 직접적, 또는 간접적으로 제시시키는 것을 말한다. 또, 항원제시세포를 공동감작시킨다는 것은, 동시, 연속적, 또는 계속적으로 2 이상의 물질로 항원제시세포를 감작시키는 것을 말한다. 상기 물질은, 바람직하게는, 비스포스포네이트 및/또는 질병 항원이다.

이어서, 본 발명의 항원제시세포의 활성화 처리방법, 및, 본 발명의 활성화 항원제시세포의 생산방법을, 수지상세포를 항원제시세포로서 사용한 하기의 일례에 기초하여 상세하게 설명한다. 본 발명에 있어서, 항원제시세포의 활성화 처리란, 상술한 바와 같이, 항원제시세포를 비스포스포네이트 및 질병 항원으로 공동감작시키는 것을 포함하는 처리를 말한다.

우선, 항원제시세포(이 예에서는, 수지상세포)의 조제에 대하여 설명한다. 수지상세포의 조제는, 수지상세포의 전구세포를 얻기 위한 시료를 취득하는 것부터 시작한다. 상기 시료로서는 말초혈, 골수액, 제대혈 등을 이용할 수가 있다. 입수의 용이성과 환자에 대한 부담이 적다는 점을 고려하면 말초혈을 이용하는 것이 바람직하다. 채혈량은 제공자에게 부담이 되지 않는 정도의 양을 채혈하는 것이 바람직하다. 채혈하는 방법으로서는, 진공 채혈관, 채혈백 등에 의한 전혈 채취를 이용할 수가 있다. 또, 다량의 세포를 확보할 필요가 있는 경우에는, 성분채혈장치를 사용하여 단핵구 성분을 채취하는 방법을 이용하면, 직접 말초혈 단핵구를 입수할 수가 있다. 상기에서 채취한 혈액에는 응고가 일어나지 않도록 헤파린이나 구연산을 첨가하여도 좋다.

이어서, 채취한 혈액으로부터 수지상세포의 전구세포를 함유하는 단핵 세포를 분리한다. 분리하는 방법으로서는, 유핵세포를 적혈구로부터 분리하는 모든 방법을 사용할 수가 있다. 예를 들면, 피콜(Ficoll) 분핵, 즉 피콜 파크(Ficoll-Paque) 밀도 균배 또는 용출을 이용하는 방법이 일반적으로 사용된다. 또한, 회수한 세포는 혈소판 등을 제거하기 위하여 배지, 생리식염수, 인산 완충 생리식염수(이하, PBS라고 한다) 등을 사용하여 수회 세정하는 것이 바람직하다.

이어서, 회수한 단핵세포로부터, 수지상세포의 전구세포인 단구(CD14 양성 세포)를 분리한다. CD14는 수지상세포의 전구세포인 단구에 발현하고 있는 마커로서 알려져 있다. 그 때문에, 항 CD14 항체 마그네트비즈를 사용한 Magnetic Cell Sorting(Miltenyi Biotec, 이하, MACS로 표시한다)을 이용하여 단구를 단리·회수할 수가 있다. 이 방법은, 간단하면서도 단구세포의 회수율이 높기 때문에 바람직하다. 또는, 회수한 단핵 세포를 배양 플라스크로 이식시켜, 34℃~38℃, 보다 바람직하게는 37℃, 2%~10%, 보다 바람직하게는 5% CO₂의 조건하에서 1시간 이상 배양하여, 부착세포를 수지상세포의 전구세포로서 이용하는 방법 등을 사용하여도 좋다.

그 후, 얻어진 수지상세포의 전구세포로부터 미성숙 수지상세포 또는 성숙 수지상세포로의 분화 유도를 실시한다. 배양을 위한 배지로서 AIM-V배지(인비트로젠社)를 사용한다. 또 AIM-V배지 외에, RPMI-1640배지(인비트로젠社), 둘베코 변형 이글 배지(Dulbecco's modified eagle medium)(인비트로젠社, 이하, DMEM으로 기재한다), TIL(주식회사 면역생물연구소), 표피각화세포배지(코진바이오 주식회사, 이하, KBM으로 기재한다), 이스코브배지(인비트로젠社, 이하, IMEM으로 기재한다) 등, 세포배양에 사용되고 있는 시판의 배지를 사용할 수가 있다. 또, 필요에 따라서 0.5~20%의 우혈청, 우태아혈청(이하, FBS로 기재한다), 인간혈청, 인간혈장 등을 첨가할 수가 있다.

미성숙 수지상세포를 얻는 경우, 배양배지에 분화 유도인자를 첨가하여 수지상세포의 전구세포를 배양하는 것에 의해 미성숙 수지상세포를 얻는다. 분화 유도인자로서는 사이토카인류 중 어느 하나를 사용할 수도 있다. 예를 들면, 과립구 마크로파지 콜로니 자극인자(이하, GM-CSF로 표기한다), 인타로이킨4(이하, IL-4로 표기한다. 다른 인타로이킨에 대해서도 동일하게 표기한다), 스템 셀 팩터(이하, SCF로 표기한다), IL-13, 종양괴사인자α(이하, TNF-α로 표기한다) 등이, 효율적으로 미성숙 수지상세포를 유도할 수가 있다. 또, 필요에 따라서 IL-1, IL-2, IL-3 등을 첨가하는 것이 바람직하다. 보다 바람직하게는 GM-CSF와 IL-4와의 조합물을 사용하면 효율적으로 유도할 수가 있다. 배양은, 34℃~38℃, 바람직하게는 37℃, 2%~10%, 바람직하게는 5% CO₂조건하에서 실시하고, 배양기간은 5~7일간이 바람직하다.

또, 성숙 수지상세포를 얻는 경우에는, 배양개시 후 5~7일째에 분화유도인자를 더 첨가하여 다시 배양한다. 분화유도인자로서는 사이토카인류 중 어느 하나를 사용할 수도 있으나, 예를 들면, GM-CSF, IL-4, SCF, IL-1β, IL-6, IL-13, TNF-α, 프로스타글란딘E₂(이하, PGE₂로 표기한다) 등으로 효율적으로 성숙 수지상세포를 유도하는 것이 바람직하다. 필요에 따라서 IL-1, IL-2, IL-3 등을 첨가하는 것이 바람직하다. 보다 바람직하게는 GM-CSF, IL-4, IL-6, IL-1β, PGE₂ 및 TNF-α의 조합물을 사용하면 효율적으로 유도할 수가 있다. 배양은, 34℃~38℃, 바람직하게는 37℃, 2%~10%, 바람직하게는 5% CO₂ 조건하에서 실시하고, 배양시간은 24~48시간이 바람직하다.

또, 수지상세포의 전구세포로서 조혈간세포(CD34 양성 세포)를 회수하고, GM-CSF, TNF-α와 flt-3 리간드(FL), c-kit 리간드(SCF), 또는 트롬보포이에틴(Thrombopoietin; TPO)를 단독, 또는 이들을 조합하여 첨가하고, 미성숙 수지상세포 또는 성숙 수지상세포를 얻는 방법이나, 혈액 또는 말초혈 단핵구를 분리한 것으로부터 퍼콜(Percoll) 등의 비중액을 사용하여 직접 수지상세포의 분획을 회수하는 방법도 이용할 수가 있다.

이어서, 얻어진 항원제시세포(이 예에서는, 상기 미성숙 수지상세포 또는 성숙 수지상세포를 비스포스포네이트와 질병 항원으로 공동감작시킨다.

비스포스포네이트의 농도는 통상의 세포가 비스포스포네이트에 의해 감작하는 농도면 좋으며, 특별히 한정되지는 않으나, 예를 들면, 문헌[The Journal of Immunology, 2001, Vol.166, 5508-5514, 또는, Blood, 2001, Vol. 98, No. 5, 1616-1618]에 기재되어 있는 바와 같이 0.001μM~20μM인 것이 바람직하며, 또, 0.001μM~5μM인 것이 더욱 바람직하다.

질병 항원의 농도는, 통상의 수지상세포를 질병 항원에 의해 감작시키는 농도면 좋으며, 특별히 한정되지는 않는다. 예를 들면, 상술한 바와 같은 질병 항원 단백 또는 펩티드의 경우, 문헌 [Cancer Research, 1999, Vol.59, 2167-2173, The Journal of Immunology, 1995, Vol.154, 2257-2265, 또는, The Journal of Immunology, 1994, 153, 996-1003]에 기재되어 있는 바와 같이, 0.01~20㎍/mL인 것이 바람직하며, 0.1~2㎍/mL인 것이 더욱 바람직하다.

또, 질병 항원으로서 아포토시스세포 및/또는 네크로시스세포를 함유하는 세포군으로 수지상세포를 감작시키는 경우, 상기 세포군의 조제방법으로서, 예를 들면, 1) 암세포 또는 암세포주를 배양하여 자연발생적으로 형성시킨다. 2) 암세포 또는 암세포주에 대하여 UV조사(1J/㎠·sec를 2분간)하여 형성시킨다. 3) 암세포 또는 암세포주를 85℃, 10분간 열처리하여 형성시키는 방법 등을 들 수가 있다.

이와 같은 본 발명의 활성화 처리방법에 의해 조제(생산)된 본 발명의 활성화 항원제시세포(이 예에서는, 활성화 수지상세포)는, 질병 항원 특이적 CD8+CTL 및/또는 γδT세포를 우위적으로 함유하는 면역담당세포를 효율적으로 유도할 수가 있다. 예를 들면, in vitro 및 in vivo 중 어느 경우라도, 본 발명의 활성화 항원제시세포는, 질병 항원 특이적 CTL 및/또는 γδT세포를 우위적으로 함유하는 면역담당세포를 유도할 수가 있는 의약으로서 사용할 수가 있다. 특히, 의약으로서는, 암 및/또는 감염증의 치료·예방제로서의 용도가 바람직하다. 본 발명에 있어서, 면역담당세포란, T세포, iNKT세포, NK세포(Natural Killer Cell), B세포, 단구, 수지상세포, 마크로파지 등을 함유하는, 항원의 특이성을 인식하거나 및/또는 특이적 면역반응에 관계하는 등의 능력이 있는 세포, 또는, 이들의 1종류 또는 2종류 이상을 함유하는 세포군을 말한다. 또, 본 발명에 있어서, 질병 항원 특이적 CD8+CTL 및/또는 γδT세포를 우위적으로 함유한다는 것은, 자극하기 전과 비교하여 질병 항원 특이적 CD8+CTL 및/또는 γδT세포의 비율 및/또는 세포수가 증가한다는 것을 말한다. 본 발명의 활성화 항원제시세포는, in vitro에서 사용하는 경우, 질병 항원 특이적 CD8+CTL 및/또는 γδT세포를 우위적으로 함유하는 면역담당세포를 유도시킬 수가 있는 조성물로서 이용할 수가 있게 된다. 또, 본 발명의 활성화 항원제시세포는, in vivo에서 사용하는 경우, 유리 비스포스포네이트 및 질병 항원을 세정, 제거한 후, 질병 항원 특이적 CD8+CTL 및/또는 γδT세포를 우위적으로 함유하는 면역담당세포를 유도시킬 수가 있는 수지상세포 백신 등의 백신으로서 사용할 수가 있다. 또, 본 발명의 활성화 항원제시세포를 in vitro 또는 in vivo에서 사용하는 어떤 경우에도, 필요에 따라서, 예를 들면, 사이토카인(예를 들면, IL-2)이나 그 밖의 단백(예를 들면, 알부민) 등을 병용하여도 좋다.

제2실시형태 : 본 발명의 활성화 항원제시세포를 함유하는 의약

다음에, 본 발명의 활성화 항원제시세포를 사용한 의약에 대하여, 상술한 바와 같이, 수지상세포를 항원제시세포로서 사용한 일례에 기초하여 설명한다.

우선, 상술한 제1실시형태에서 얻어진 활성화 항원제시세포(활성화 수지상세포)를 원심분리법 등에 의해 회수한다. 이어서, 회수한 상기 세포를 세정한다. 세정하는 액체로서는 등장(等張)이며, 의약품으로 사용할 수가 있는 액체라면 어떤 것이든 사용할 수가 있다. 그 후, 환자에게 투여하는 것을 감안하여, 생리식염수, PBS 등을 이용하는 것이 바람직하다. 그리고, 회수된 수지상세포는 생리식염수에 현탁되는 것에 의해 의약으로서 사용할 수가 있게 된다. 또, 필요에 따라서 알부민 등의 혈청성분이나 사이토카인을 첨가할 수가 있다. 특히, 당해 의약으로서는 암 및/또는 감염증의 치료·예방제로서의 용도인 것이 바람직하다. 따라서, 관련되는 실시형태로서, 본 발명은, 암 및/또는 감염증 예방·치료를 위한 의약을 제조하기 위하여 본 발명의 활성화 항원제시세포의 사용을 포함한다.

제3실시형태 : 본 발명의 활성화 항원제시세포를 사용한 치료·예방 방법

다음에, 본 발명의 수지상세포를 사용한 치료·예방 방법에 대하여, 상술한 바와 같이, 수지상세포를 항원제시세포로서 사용한 실시예에 기초하여 설명한다.

상술한 제1실시형태에서 얻어진 본 발명의 활성화 항원제시세포(활성화 수지상세포), 또는, 제2실시형태에 의해 얻어진 본 발명의 의약을 투여하는 것에 의해, 암 및/또는 감염증에 대한 치료·예방을 실시할 수가 있다.

투여할 세포수로서는, 투여방법, 환자의 상태에 따라서 적절히 선택할 수가 있으며, 특별히 제한되지 않는다. 통상적으로, 1회의 투여수는 10⁶~10⁸개/인으로 하는 것이 바람직하며, 보다 바람직하게는 10⁷개/인 이상이다. 투여 횟수는 환자의 상태에 따라서 다르나, 통상적으로, 4~6회를 1쿠르(kur)로 하여 투여한다. 투여의 간격은 투여할 수지상세포수에 의존하며, 특별히 제한되지 않는다. 통상적으로, 1주간~1개월에 1회인 것이 바람직하고, 또 투여할 수지상세포의 수가 5×10⁶개인 경우에는 2주간에 1회, 2×10⁷ 이상인 경우에는 1개월에 1회 투여하는 것이 바람직하다. 투여하는 방법은 특별히 제한되지 않으나, 정맥, 피하, 피부 내 등에 주사에 의해 주입할 수도 있고, 소속 임파절에 직접 주입할 수도 있으며, 직접 병변부에 주입할 수도 있으며, 점적으로서 전신에 투여할 수도 있다. 혹은, 병변부 근방의 동맥으로부터 주입할 수도 있다.

이와 같이 하여, 본 발명의 활성화 항원제시세포를 투여하는 것에 의해 환자의 체내에서 질병 항원 특이적 CD8+CTL뿐만 아니라 γδT세포를 활성화하여 증식시킬 수가 있다.

이들 병원 항원 특이적 CTL 및/또는 γδT세포는, 직접적으로 암세포나 감염세포를 살상할 뿐만 아니라, 인터페론γ(이하, IFNγ로 표기한다) 등의 사이토카인에 의해 간접적으로 이들 세포를 상해할 수가 있기 때문에, 예를 들면, 암이나 감염증 등, 여러가지 치료·예방에 유효하게 사용할 수가 있다. 본 발명이 활성화 항원제시세포를 백신으로서 사용하는 경우의 이점으로서는, 이하의 것을 들 수가 있다. 즉, 종래의 질병 항원만으로 감작시킨 수지상세포를 백신으로서는, 질병 항원 특이적 CD8+CTL만이 활성화된다. 이에 대하여, 본 발명의 활성화 항원제시세포의 백신은, 질병 항원 특이적 CD8+CTL의 활성화뿐 아니라, γδT세포를 활성화시킬 수도 있다. 또한, 이들 질병 항원 특이적 CD8+CTL 및/또는 γδT세포로부터 유도된 사이토카인은, 헬퍼 T세포, NK세포나 iNKT세포(invariant Natural Killer T Cell) 및 B세포를 활성시킬 수가 있다. 이에 의해, 생체내 전체의 액성 및 세포성 면역계가 활성화되고, 그 결과, 치료·예방효과를 향상시킬 수가 있다. 또, 활성화 처리에 사용하는 항원제시세포는, 환자의 자기 유래 또는 HLA를 같이 하는 타가 유래인 것이 바람직하다. 환자에게 투여되었을 때에 환자 자신의 면역에 의해 배제되지 않고, 그 기능을 발휘할 수 있게 되기 때문이다.

제4실시형태 : 질병 항원 특이적 CD8 + CTL 및/또는 γδT세포를 우위적으로 함유하는 면역담당세포의 유도 방법

다음에, 본 발명의 면역담당세포의 유도 방법에 대하여 설명한다. 본 발명의 면역담당세포의 유도 방법은, 질병 항원 특이적 CD8+CTL 및/또는 γδT세포를 우위적으로 함유하는 면역담당세포를 유도하는 방법으로서, 보다 구체적으로 설명하면, 비스포스포네이트와 질병 항원으로 항원제시세포를 공동감작시키는 공정(i), 및, 상기 공동감작과 동시 또는 그 후에, 상기 항원제시세포와 임파구를 혼합배양하는 공정(ii)을 포함하는 유도 방법이다. 여기서, 면역담당세포란, 상술한 바와 같이, T세포, iNKT세포, NK세포, B세포, 단구, 수지상세포, 마크로파지 등을 함유하며, 항원의 특이성을 인식하거나 및/또는 특이적 면역반응에 관계하는 등의 능력이 있는 세포, 또는 이들의 1종류 또는 2종류 이상을 함유하는 세포군을 말한다.

우선, 제1실시형태와 마찬가지로 항원제시세포(예를 들면, 수지상세포)의 활성화 처리를 실시한다(공정(i)). 그리고, 상기 공동감작과 동시 또는 그 후에, 상기 항원제시세포와 반응세포를 배양용기에 파종하여 혼합배양한다(공정(ii)). 이에 의해, 상기 활성화 처리된 항원제시세포로부터의 질병 항원 특이적 자극을 받아서, 상기 반응세포 중의 질병 항원 특이적 CD8+CTL이 활성화될 수가 있다. 또, 비스포스포네이트의 감작에 의한 항원제시세포의 대사계 저해에 의해 항원제시세포의 표면상에 제시된 IPP(Isopentenyl diphosphate, 이소펜테닐2인산)와 같은 분자로부터의 자극을 받아서, 상기 반응세포 중의 γδT세포가 활성화될 수가 있다. γδT세포로부터 산생된 IFNγ는, 상기 질병 항원 특이적 CD8+CTL의 활성화와 증식을 도울 수가 있다. 또한, 여기서 말하는 반응세포란, 예를 들면, 인간 임파구이며, 말초혈 유래의 단핵구 등이 바람직하다. 이 반응세포는, 자기 유래 또는 HLA를 같이 하는 타가 유래인 것이 바람직하다.

상기 배양용기는 특별히 한정되는 것은 아니며, 통상적으로, 당해 분야에서 사용되는 배양용 플레이트, 샬레, 플라스크, 백 등을 이용할 수가 있다. 각각의 세포군을 파종하는 농도는 실시하는 상황에 따라서 자유롭게 설정할 수가 있다.

상기 항원제시세포가 수지상세포인 경우, 수지상세포와 반응세포와의 혼합배양에는, 예를 들면, AIM-V 배지를 사용하여 배양할 수가 있다. 또, AIM-V배지 외에, RPMI-1640 배지, DMEM, TIL, KBM, IMEM 등, 세포의 배양에 사용되고 있는 시판의 배지를 이용할 수가 있다. 또한 필요에 따라서 5%~20%의 우혈청, FBS, 인간 혈장 등의 혈청, 사이토카인 등을 첨가하여도 좋다. 배양은, 예를 들면, 34℃~38℃, 바람직하게는 37℃에서, 예를 들면, 2%~10%, 바람직하게는 5%의 CO₂ 조건하에서 실시한다. 배양기간으로서는 특별히 제한되지 않으나, 5~21일간이 바람직하며, 또 7~14일간이 더욱 바람직하다. 파종하는 수지상세포 및 반응세포의 수는 파종하는 용기 및 용도에 따라서 설정할 수가 있다. 또, 수지상세포와 반응세포를 혼합하는 비율은 상황에 따라서 적절히 설정할 수가 있으며, 특별히 제한되지 않는다. 반응세포 중의 질병 항원 특이적 CD8+CTL 및/또는 γδT세포의 비율을 증가시키는 것을 목적으로 하는 것이므로, 반응세포와 수지상세포의 비율은 20:1~2:1이 바람직하다.

이와 같은 본 발명의 유도 방법에 의해, 질병 항원 특이적 CD8+CTL 및/또는 γδT세포를 우위적으로 함유하는 본 발명의 면역담당세포를 조제(산생)할 수가 있다. 또, 이와 같이 하여 얻어진 본 발명의 면역담당세포는, 그대로 또는 본 발명의 활성화 항원제시세포로 반복하여 자극하는 것에 의해, 보다 높은 비율로 질병 항원 특이적 CD8+CTL 및/또는 γδT세포를 함유하는 면역담당세포로서 면역세포요법에 사용할 수가 있으며, 암이나 감염증에 대하여 보다 높은 치료·예방효과를 기대할 수가 있다.

in vitro에서 본 발명의 면역담당세포를 조제하는 것의 이점으로서는, 본 발명의 활성화 항원제시세포로 반응세포를 반복하여 자극하는 것에 의해, 암세포나 감염증 세포를 직접적으로 살상할 수 있는 다량의 면역담당세포를 간단하게 조제할 수가 있다는 것을 들 수가 있다.

제5실시형태 : 본 발명의 면역담당세포를 함유하는 의약

다음에, 본 발명의 면역담당세포를 함유하는 의약에 대하여 설명한다.

우선, 상술한 제4실시형태에서 얻어진 질병 항원 특이적 CD8+CTL 및/또는 γδT 세포를 우위적으로 함유하는 본 발명의 면역담당세포를 원심분리법 등에 의해 회수한다. 이어서, 회수한 세포를 세정한다. 세정하는 액체는, 등장이며, 의약품으로서 사용할 수가 있는 액체라면 어떤 것이든 사용할 수가 있다. 그 후, 환자에게 투여하는 것을 고려해서 생리식염수, PBS 등을 이용하는 것이 바람직하다. 그리고, 회수된 질병 항원 특이적 CD8+CTL 및/또는 γδT세포를 우위적으로 함유하는 면역담당세포는, 생리식염수에 현탁되는 것에 의해 의약으로서 사용할 수가 있게 된다. 또, 필요에 따라서 사이토카인 등을 첨가할 수가 있다. 당해 의약으로서는 특히, 암 및/또는 감염증의 치료·예방제로서의 용도가 바람직하다. 따라서, 관련되는 실시형태로서, 본 발명은 암 및/또는 감염증을 위한 의약을 제조하기 위한 본 발명의 활성화 항원제시세포의 사용을 포함한다.

제6실시형태 : 본 발명의 면역담당세포를 사용한 치료·예방 방법

다음에, 본 발명의 면역담당세포를 사용한 치료·예방 방법에 대하여 설명한다.

상술한 제4실시형태에서 얻어진 본 발명의 면역담당세포, 또는, 제5실시형태에 의해 얻어진 본 발명의 의약을 투여하는 것에 의해, 암 및/또는 감염증에 대한 치료·예방을 실시할 수가 있다.

투여할 세포수로서는, 투여방법, 환자의 상태에 따라서 적당히 선택할 수가 있으며, 특별히 제한되지 않는다. 통상적으로, 1회의 투여수는 10⁸~10¹²개/인으로 하는 것이 바람직하며, 보다 바람직하게는 10⁹개/인 이상이다. 투여 횟수는 환자의 상태에 따라 다르나, 통상적으로, 4-6회를 1쿠르로 하여 투여한다. 투여간격은 특별히 제한되지 않으나, 예를 들면, 2주간에 1회 또는 1개월에 1회 투여하는 것이 바람직하다. 투여 방법은 특별히 제한되지 않으나, 정맥, 피하, 피부 내 등으로의 주사에 의해 주입할 수도 있고, 소속 임파절에 직접 주입할 수도 있으며, 직접 병변부에 주입할 수도 있고, 점적으로서 전신에 투여할 수도 있다. 또는, 병변부 근방의 동맥을 통해서 주입할 수도 있다. 또, 본 발명의 면역담당세포는, 환자의 자기 유래 또는 HLA를 같이 하는 타가 유래인 것이 바람직하다. 환자에게 투여되었을 때에, 환자 자신의 면역계에 의해 배제되지 않고, 그 기능을 발휘할 수 있게 되기 때문이다.

제7실시형태 : 질병 항원으로 감작할 때의 항원제시세포의 활성화 촉진제

다음에, 본 발명의 질병 항원으로 감작할 때의 항원제시세포의 활성화 촉진제에 대하여 설명한다.

본 발명의 질병 항원으로 감작할 때의 항원제시세포의 활성화 촉진제는, 비스포스포네이트를 유효성분으로서 함유한다. 상기 활성화 촉진제는, 또한, 약학적으로 허용할 수 있는 부형약 및/또는 케리어를 함유하여도 좋다. 상기 활성화 촉진제는, 생체내 및/또는 생체외에 있어서 항원제시세포를 질병 항원으로 감작시킬 때, 즉, 질병 항원으로 감작하기 전, 질병 항원으로 감작시키는 것과 동시 및/또는 질병 항원으로 감작시킨 후에 첨가할 수가 있다. 본 발명은, 그 밖의 형태로서, 질병 항원으로 감작할 때의 항원제시세포의 활성화 촉진제의 제조를 위한 비스포스포네이트를 사용할 수가 있다. 본 발명은, 또한, 그 밖의 형태로서, 비스포스포네이트를 사용한 암 및/또는 감염증에 대한 치료·예방 방법이다.

이하, 실시예를 참조하여 본 발명을 상세하게 설명한다. 단, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.

실시예1

<실시예1-1 : 수지상세포의 채취 및 조제>

건강한 사람인 도너(HLA-A*0201)로부터 말초혈 30mL를 채혈하였다. 이 건강인의 말초혈로부터 단핵 세포를 취득하였다. 이때, 혈구 분리용 비중액을 사용하여 단핵 세포층을 회수하였다. 회수한 세포로부터 혈소판 등을 제거하기 위하여 10% FBS를 첨가한 AIM-V로 수회 세정한 후, MACS에 의해 단구 성분으로서 D14 양성 세포를 단리하였다.

얻어진 수지상세포의 전구세포로부터 수지상세포에로의 분화 유도를 실시하였다. 배지는 10% FBS 또는 AB 혈청을 첨가한 AIM-V를 사용하고, 이것에 500U/mL GM-CSF(IMMUNEX)와 500U/mL IL-4(Osteogenetics GmbH)를 첨가하였다. 배양개시 후 5~7일째에 미성숙 수지상세포를 얻었다.

또, 배양개시 후 5~7일째에 100U/mL 또는 10ng/mL IL-6(R&D systems), 10ng/mL IL-1β(CHEMICON), 10ng/mL TNFα(PHARMINGEN), 및 1㎍/mL PGE₂(SIGMA)를 첨가하여 다시 배양하여, 24~48시간 후의 세포를 성숙 수지상세포로 하였다.

<실시예1-2 : 수지상세포의 상태의 확인>

조제하여 얻어진 수지상세포의 표면 항원의 검출을 플로우 사이토메터(Flow cytometers; Epics XL-MCL, Beckman Coulter)를 사용하여 실시하였다.

측정할 세포를 PBS에 현탁시킨 것에 목적으로 하는 항체를 첨가하고, 차광상태에서 4℃, 15분간 염색하였다. 항체는 PE표지된 항 CD14항체, 항 CD83항체, 항 HLA-DR항체(Beckman Coulter)를 사용하였다. 네가티브 컨트롤로서 각각의 항체의 아이소타이프를 사용하였다. 염색한 세포를 PBS로 세정한 후, Epics XL·MCL로 측정하였다.

그 결과, GM-CSF, IL-4로 배양한 세포는 CD14, CD83 음성, HLA-DR은 양성을 나타내고 있으며, 미성숙 수지상세포집단인 것을 확인하였다. 또, GM-CSF, IL-4, IL-6, IL-1β, TNFα, PGE₂로 배양한 세포에 있어서는, CD14 이외는 양성을 나타내고, 성숙 수지상세포집단인 것을 확인하였다.

<실시예1-3 : Zometa(상품명) 및 질병 항원 펩티드로 공동감작시킨 수지상세포의 조제 및 반응세포의 조제>

상술한 바와 같이 조제한 말초혈 유래의 미성숙 수지상세포 또는 성숙 수지상세포의 현탁액에, 아미노비스포스포네이트제인 Zometa(Novartis사 제)를 졸레드론산으로서 0.01μM이 되도록 첨가하고, 및/또는, 질병 항원 펩티드로서 MART-1 항원 펩티드 A27L(ELAGILTV)(이하, A27L로 표기한다)을 최종 농도 2㎍/mL이 되도록 첨가하고, 37℃, 5% CO₂의 조건하에서 약 12시간 배양하였다. 네가티브 컨트롤에는, Zometa와 항원 펩티드를 첨가하지 않고 배양한 수지상세포를 사용하였다.

약 12시간의 배양 후, Zometa 및 항원 펩티드로 공동감작한 활성화 수지상세포의 일부를 15mL의 튜브(BD Falcon)에 회수하고, 1500rpm, 5분간 원심분리하였다. 펠릿이 된 수지상세포를, 10% FBS를 함유하는 AIM-V배지 10mL에 현탁시키고, 1500rpm으로 5분간 원심분리한 후, 세정하였다. 세정작업을 2회 반복하여 실시하였다. 이에 의해 회수된 수지상세포를 자극세포로 하였다. 즉, 비스포스포네이트 및 질병 항원펩티드로 공동감작한 활성화 수지상세포, 또는 그 중 어느 하나로 감작한 수지상세포, 및, 어느 것으로도 감작시키지 않은 수지상세포를 자극세포로 하였다. 또, 반응세포로서, 수지상세포를 조제하기 위하여 CD14 양성세포를 단리한 후의 나머지 세포(CD14 음성세포집단, 주로 T세포집단)로서, 10% FBS, 10% 디메틸술폭시드(DMSO)를 첨가한 AIM-V배지에 현탁시켜 동결보존된 세포를 해동, 세정하여 사용하였다.

<실시예1-4 : Zometa 및 질병 항원 펩티드로 공동감작시킨 수지상세포에 의해 유도된 면역담당세포의 성상의 해석>

상술한 바와 같이 하여 얻어진 자극세포(수지상세포) 2×10⁵개를 각각, 전체 양을 1mL로 하여 24well plate(SUMILON)에서 반응세포 2×10⁶개와 혼합배양을 실시하였다(반응세포:수지상세포=10:1). 배양은 약 37℃, 5% CO₂ 조건하에서 7일간 실시하였다. 이 혼합배양 용액중에 20U/mL IL-2를 첨가하면, 보다 양호한 세포증식이 인정되었다. 세포의 증식이 빠른 경우에는, 4~6일째에 40U/mL IL-2, 10% FBS를 함유하는 AIM-V 배지를 1mL 첨가하였다. 수지상세포와 반응세포의 혼합배양 개시일로부터 7일 후에 표지항체와 항원 특이적 테트라머(tetramer)를 사용하여 플로우 사이토메터로 전체 세포 중에서 차지하는 A27L 특이적 CD8+CTL(질병 항원 특이적 CD8+CTL)의 비율을 측정하였다.

HLA-A*0201 A27L 테트라머 양성, CD8 양성 세포가 차지하는 비율을 산출하는 수순으로서, 우선 PE표지된 A27L 테트라머(MBL)를 배양한 후 PBS로 세정한 세포에 첨가하였다. 차광상태의 실온에서 15분간 염색한 후, FITC표지된 항 CD8 항체(BD Pharmingen)를 첨가하고, 차광상태에서 4℃, 15분간 염색하였다. 컨트롤에는 각 항체의 아이소타이프를 이용하였다. 세포의 측정은 Epics XL·MCL을 사용하고, 측정결과의 해석에는 Epics32를 사용하였다.

그 결과를 하기의 표4a에 나타낸다. 동 표에 나타내는 바와 같이, Zometa 0.01μM과 A27L 2㎍/mL로 공동감작된 활성화 수지상세포는 항원 특이적 CD8+CTL을 유도하는 것이 확인되었다. 또, 이 활성화 수지상세포를 사용한 경우, 펩티드만으로 감작시킨 수지상세포가 유도하는 CTL의 비율과 비교하면, 약 4배가 높아지는 것이 확인되었다.

또, 표 4b 및 도 1은 동일한 실험을 피실험수를 늘려서 실시하고, t검정을 실시한 결과이다. A27L과 Zometa로 공동감작시킨 수지상세포를 사용하여 얻어진 CD8+CTL의 비율은 A27L만으로 감작시킨 수지상세포를 사용하여 얻어진 CD8+CTL의 비율보다 높고, 양자의 사이에는 의미있는 차이가 있다는 것이 명백해졌다.

실시예2

<실시예2-1 : Zometa(상품명) 및 A27L의 존재하에서 공동감작되어 있는 수지상세포와 반응세포를 혼합배양하여 유도된 면역담당세포의 성상의 해석>

실시예1에서 조제한 말초혈 유래의 미성숙 수지상세포, 또는 성숙 수지상세포를 각각 1×10⁵개, 전체 양을 1mL로 하여 24well plate(SUMILON)에 파종하였다. 또한, 아미노비스포스포네이트제인 Zometa를 0.01μM이 되도록 첨가하고, 및/또는, A27L을 최종 농도 2㎍/mL이 되도록 첨가하여, 37℃, 5% CO₂ 조건하에서 약 24시간 배양하였다. 네가티브 컨트롤에는, Zometa와 항원 펩티드를 첨가하지 않고 배양한 수지상세포를 사용하였다. 그리고, 이 감작을 일으키고 있는 상태의 수지상세포를 자극세포로 하여, 12시간 배양한 후, 다시 반응세포 2×10⁶개를 파종하고, 혼합배양을 실시하였다(반응세포:자극세포=20:1). 배양은 약 37℃, 5% CO₂ 조건하에서 7일 또는 14일간 실시하였다. 혼합배양액 중에, 세포의 증식에 따라서 1~100U/mL의 IL-2를 첨가하였다.

혼합배양개시일로부터 7일과 14일 후에 증식해 오는 전체 세포수와 표지 항체와 항원 특이적 테트라머를 사용하여 플로우 사이토메터로 상기 전체 세포중에서 차지하는 항원 특이적 CD8+T세포와 γδT세포의 비율을 측정하였다. PE표지된 A27L tetramer(MBL)를 혼합배양이 종료된 후 PBS로 세정한 세포에 첨가하여, 차광상태의 실온에서 15분간 염색하였다. 그 후, FITC표지된 항CD8 항체(BD Pharmingen)를 첨가하고, 차광상태에서 4℃, 15분간 염색하였다. γδT세포가 차지하는 비율의 산출에는 FITC표지된 항TCR Vγ9 항체, PE표지된 항TCR panα/β 항체, 및 PC5표지된 항CD3 항체(모두 Beckman Coulter)를 사용하였다. 이들 항체를 배양한 후의 세포를 PBS로 세정한 것에 첨가하고, 차광상태에서 4℃, 15분간 염색하였다. 네가티브 컨트롤에는 각 항체의 아이소타이프를 이용하였다. 세포의 측정은 Epics XL·MCL을 사용하고, 측정 결과의 해석에는 Epics32를 사용하였다.

그 결과를 하기의 표 5 및 표 6에 나타낸다. 하기 표 5에 나타내는 바와 같이, 0.01μM의 Zometa와 2㎍/mL의 A27L 존재하에서 수지상세포와 임파구를 혼합배양하면, A27L만의 존재하에서 수지상세포와 임파구를 혼합배양한 경우와 비교하여, 질병 항원 특이적 CD8+CTL의 유도의 상승이 관찰되었다. 이 결과는, Zometa의 질병 항원 특이적 CD8+CTL 유도의 에쥬번트효과를 시사하고 있다. 또, 이 에쥬번트효과는 미성숙 수지상세포에서 보다 강하다는 것이 확인되었다.

또한, 하기 표 6에 나타내는 바와 같이, 0.01μM의 Zometa 및 A27L의 존재하에서 공동감작되어 있는 수지상세포와 임파구를 혼합배양하는 것에 의해 γδT세포 유도의 상승도 확인되었다.

<실시예2-2 : Zometa 및 A27L의 존재하에서 공동감작되어 있는 수지상세포와 반응세포를 혼합배양하여 유도된 면역담당세포의 IFNγ 산생능의 해석>

이어서, 상술한 혼합배양에 의해 유도된 면역담당세포의 IFNγ 산생능을 이하와 같이 하여 해석하였다.

MultiScreen 플레이트(MILLIPORE)의 각 well에 70% 에탄올을 첨가하고, 2분 이내에 제거하였다. 상기 플레이트의 각 well을 200μL의 PBS로 5회 세정하였다. 코팅용 항IFN-γ 항체(클론:1-D1K, MABTECH ELISpot for Human Interferon-γ kit)를 15μL/mL이 되도록 PBS로 희석하여 상기 플레이트에 100μL/well 첨가하였다. 이 플레이트를 4℃에서 하룻밤 정치(靜置)하였다. 이 플레이트를 200μL/well의 PBS로 4회 세정하였다. 10% FBS를 함유하는 AIM-V배지를 200μL/well 첨가하고, 30분간 이상 실온에서 블로킹을 실시하였다. 블로킹배지를 제거하고, 플레이트를 200μL/well의 PBS로 4회 세정하였다. 상술한 혼합배양과 동일한 방법으로 얻어진 각 조건에서의 혼합배양 세포군을 원심분리에 의해 회수하고, AIM-V에 의해 2회 세정하였다.

회수한 혼합배양세포 2500개에 실시예1에서 얻어진 미성숙 수지상세포 500개 및 A27L을 재자극을 위해 첨가하고, 37℃, 5% CO₂ 조건하에서 2시간의 전배양을 실시하였다. 세포수는 에세이 플레이트 1well당 수를 나타낸다. 동시에 혼합배양세포만의 전배양, 수지상세포와 A27L만의 전배양도 실시하였다. 또, 배양용량은 1well당 100μL이 되도록 조정하였다. 각 배양조건에 대해서는 3well분, 300μL의 배양을 실시하였다. 블로킹 후 PBS로 세정한 플레이트에, 각 조건에서의 전배양을 완료한 세포를 100μL/well, 3well에 파종하고, 37℃, 5% CO₂ 조건하에서 하룻밤 배양하였다. well로부터 배양세포를 제거하고, 200μL/well의 PBS로 5회 세정하였다. 검출용 비오틴표지 항IFN-γ 항체(클론:7-B6-1, MABTECH ELISpot for Human Interferon-γ kit)를, 0.5% FBS를 함유하는 PBS로 1㎍/mL에 희석하고, 100μL/well 첨가하였다. 플레이트를 실온에서 2시간 정치하였다. 플레이트를 200μL/well의 PBS로 5회 세정하였다. 알칼리포스파타제를 결합한 스트렙트아비딘(streptavidin; MABTECH ELISpot for Human Interferon-γ kit)를, 0.5% FBS를 함유하는 PBS로 1:1000으로 희석하고, 100μL/well 첨가하였다. 플레이트를 실온에서 1시간 정치하였다. 그리고, 플레이트를 200μL/well의 PBS로 5회 세정하였다. BCIP/NBTplus 기질액(Wako사 제)을 100μL/well 첨가하고, 암소에서 스폿이 확인될때까지 정치하였다. 육안으로 스폿이 확인되면 증류수로 충분히 세정하였다. 플레이트의 멤브렌이 건조된 것을 확인한 후, ELISpot 리더(AID Autoimmun Diagnostika GmbH)를 사용하여 스폿의 수를 측정하고, 데이터를 AID software version 3.1(AID)로 해석하였다.

그 결과를 하기의 표 7에 나타낸다. 동 표에 나타내는 바와 같이, Zometa 0.01μM 및 A27L 2㎍/mL로 공동감작시킨 수지상세포와 임파구의 혼합배양세포군을, A27L로 감작시킨 수지상세포를 사용하여 재자극한 경우에, IFNγ 산생세포를 나타내는 스폿의 수가 가장 많이 증가하였다. 이 결과는 실시예1에서 나타낸 A27L 테트라머 양성세포의 비율(%)(표 4 참조)과도 상관이 있었다.

실시예3

건강인 도너로부터 말초혈 200mL를 채혈하였다. 건강인 말초혈로부터 단핵세포를 취득하였다. 이때, 혈구분리용 비중액을 사용하여 단핵세포층을 회수하였다. 회수한 세포로부터 혈소판 등을 제거하기 위하여 수회 세정한 후, MACS에 의해 단구성분으로서 CD14 양성세포를 단리하였다. 얻어진 수지상세포 전구세포로부터 수지상세포로의 분화 유도를 실시하였다. 배지는 10% FBS를 첨가한 AIM-V를 사용하고, 이것에 500U/mL GM-CSF(IMMUNEX)와 500U/mL IL-4(Osteogenetics GmbH)를 첨가하였다. 배양개시일로부터 5~7일째에 미성숙 수지상세포를 얻었다.

MART-1 양성의 멜라노마 유래의 암세포주를 15mL 튜브(BD Falcon)에 회수하고, 1500rpm, 5분간 원심분리하였다. 펠릿이 된 세포주를 AIM-V배지 10mL에 현탁시키고, 1500rpm, 5분간 원심분리하고, 세정하였다. 세정작업을 2회 반복하여 실시하였다. 이에 의해 회수된 세포주를 1×10⁶개/mL이 되도록 AIM-V로 다시 부유(浮遊)시켰다. 세포부유액에 캠토테신(sigma) 10μM 첨가하여 37℃, 5% CO₂ 조건하에서 24시간 배양하였다. 배양 후의 세포를 15mL의 튜브에 회수하고, 1500rpm, 5분간 원심분리하였다. 펠릿이 된 세포주를 AIM-V배지 10mL에 현탁시키고, 1500rpm, 5분간 원심분리하고, 세정하였다. 세정작업을 2회 반복하여 실시하였다. 원심, 세정하여 얻어진 세포를 아포토시스세포로 하였다.

미성숙 수지상세포의 현탁액에 아미노 비스포스포네이트제인 Zometa를 0.01μM이 되도록 첨가하고, 및/또는, 수지상세포와 동일한 양의 아포토시스세포를 함유하는 암세포주를 첨가하고, 약 24시간 혼합배양하였다. 컨트롤에는 아포토시스세포하고만 약 24시간 배양한 수지상세포, 및, Zometa와 아포토시스세포를 모두 첨가하지 않고 배양한 수지상세포를 사용하였다. 약 24시간 배양한 미성숙 수지상세포에 100U/mL IL-6, 10ng/mL IL-1β, 10ng/mL TNFα, 1㎍/mL PGE₂를 첨가하여 다시 배양하고, 48시간 후의 세포를 성숙 수지상세포로 하였다.

여기서 얻어진 성숙 수지상세포를 자극세포로 하였다. 이 자극세포 1×10⁵개를 각각, 반응세포 2×10⁶개와, 전체 양을 1mL로 하여 24well plate(SUMILON)에서 혼합배양을 실시하였다(반응세포:자극세포=20:1). 반응세포로서, 수지상세포의 조제를 위하여 CD14 양성세포를 단리한 후의 나머지 세포(CD14 음성세포집단, 주로 T세포집단)에 있어서, 10% FBS, 10% 디메틸술폭시드(DMSO)를 첨가한 AIM-V배지에 현탁하여 동결보존된 세포를 해동, 세정하여 사용하였다. 배양은, 약 37℃, 5% CO₂ 조건하에서 실시하였다. 이 혼합배양용액 중에 20U/mL IL-2를 첨가하였다. 세포의 증식이 빠른 경우에는 4~6일째에 40U/mL IL-2, 10% FBS를 함유하는 AIM-V배지를 1mL 첨가하였다.

혼합배양의 개시일로부터 7, 11, 14일 후에 증식해 오는 전체 임파구의 수와, 표지 항체와 항원 특이적 테트라머를 사용하여 플로우 사이토메터로 상기 전체 임파구 중에 차지하는 항원 특이적 CD8+CTL의 비율을 측정하였다. 상세하게는, PE표지된 A27L tetramer(MBL)를 배양 후의 세포를 PBS로 세정한 것에 첨가하고, 차광상태의 실온에서 15분간 염색하였다. 그 후, FITC표지된 항CD8 항체(BD Pharmingen)를 첨가하고, 차광상태에서 4℃, 15분간 염색하였다. 네가티브 컨트롤에는 각 항체의 아이소타이프를 이용하였다. 세포의 측정은 Epics XL·MCL을 사용하고, 측정결과의 해석에는 Epics32를 사용하였다.

그 결과를 하기 표 8에 나타낸다. 동 표에 나타내는 바와 같이, 아포토시스세포를 함유하는 세포주로 감작시킨 경우, 배양 11일째에 0.01%의 테트라머 양성세포가 확인되었다. 또, Zometa를 첨가하는 것에 의해 0.14%로 약 15배 증가하는 것을 확인할 수 있었다.

실시예4

실시예1에서 조제한 말초혈 유래의 미성숙 수지상세포를 48well plate에 1×10⁵개/well이 되도록 파종하였다. 각 well에 질병 항원 펩티드로서 MART1 항원 펩티드 A27L(ELAGIGILTV)을 최종 농도가 2㎍/mL이 되도록 첨가하였다. 동시에 아미노 비스포스포네이트제인 Zometa(Novartis사 제)를 졸레드론산으로서 0.01μM이 되도록 첨가한 것과 첨가하지 않은 것을 준비하였다. 동일한 도너의 임파구를 1×10⁶개/well이 되도록 첨가하고, 37℃, 5% CO₂ 조건하에서 수지상세포와의 혼합배양을 실시하였다.

혼합배양 개시 후 13~17일째의 임파구를 회수하였다. HLA-A*0201 양성, MART1 양성의 인간 멜라노마 세포주 JCOCB를 PKH-26(Sigma)로 표지하여, 타깃세포로 하였다. 회수한 임파구를 이펙터세포로 하고, 이펙터세포:타깃세포가 5:1, 또는 20:1이 되도록 혼합하여 24well plate에 파종하였다. 4시간 37℃, 5% CO₂의 조건하에서 배양을 실시하였다.

혼합배양 후의 세포를 회수하고, 빙냉시켜 둔 PBS로 세정하였다. 원심분리 후의 세포를 Annexin V Binding Buffer(BD PerMingen)에 현탁시키고, Annexin V와 7AAD(모두 Beckman Coulter)를 첨가하였다. 빙상에서 15분간 반응시킨 후, Annexin V Binding Buffer를 400~500μL씩 첨가하고, Flow Cytometry(Beckman Coulter)로 아포토시스세포(Annexin V 양성세포)의 비율(% of cytotoxicity)을 측정하였다.

하기 표 9에, 도너 2명에 대하여, A27L 및 Zometa로 공동감작시킨 활성화 수지상세포에 의해 유도된 A27L 항원 특이적 CD8+CTL의 비율(%), 테트라머 양성세포가 검출되는 평균 형광강도(Mean Fluorescence Intensity; MFI) 및 아포토시스 세포의 비율(%)을 측정한 결과를 나타낸다. 동 표에 나타내는 바와 같이, 도너1 및 2의 쌍방에 있어서, A27L 및 Zometa로 공동감작시킨 활성화 수지상세포를 사용하여 자극한 임파구는, A27L만으로 감작시킨 수지상세포로 자극한 임파구보다 높은 비율로 테트라머 양성세포가 확인되었다. 또, 이때의 테트라머 양성세포가 검출되는 평균 형광강도도, A27L 및 Zometa로 공동감작시킨 경우의 쪽이 높은 값을 나타내었다. 또, 배양 개시 후 13~17일 후의 임파구를 이펙터세포(E)로 하고, MART-1 양성, HLA-A*0201 양성의 인간 멜라노마 세포주를 타깃세포(T)로 하여 혼합배양한 결과, 이펙터세포:타깃세포의 비가 5:1, 20:1 중 어느 경우에 있어서도, A27L 및 Zometa로 공동감작시킨 활성화 수지상세포를 사용하여 자극한 임파구는, A27L만으로 감작시킨 수지상세포를 이용하여 자극한 임파구보다 높은 표적세포의 상해성을 나타내었다.

실시예5

실시예1에서 조제한 말초혈 유래의 미성숙 수지상세포, 또는 성숙 수지상세포의 현탁액에 아미노 비스포스포네이트제인 Zometa(Novartis)를 졸레드론산으로서 0~20μM이 되도록 첨가하고, 동시에 질병 항원 펩티드로서 EBV 항원 펩티드 BMLF1(GLCTLVAML)(이하, BMLF1로 표기한다)을 최종 농도가 2㎍/mL이 되도록 첨가하고, 37℃, 5% CO₂ 조건하에서 약 12시간 배양하여 활성화 처리를 실시하였다. 네가티브 컨트롤에는, Zometa와 항원 펩티드를 첨가하지 않고 배양한 수지상세포를 사용하였다.

약 12시간의 배양 후, Zometa와 항원 펩티드를 공동감작시킨 활성화 수지상세포의 일부를 15mL의 튜브(BD falcon)에 회수하고, 1500rpm, 5분간 원심분리하였다. 펠릿이 된 수지상세포를, 10% FBS를 함유하는 AIM-V 배지 10mL에 현탁시키고, 1500rpm, 5분간 원심분리하고, 세정하였다. 세정작업을 2회 반복하여 실시하였다. 이에 의해 회수된 수지상세포를 자극세포로 하였다. 즉, 비스포스포네이트 및 질병 항원 펩티드로 공동감작시킨 활성화 수지상세포, 그 중 어느 하나로 감작시킨 수지상세포, 및, 어느 것으로도 감작하지 않은 수지상세포를 자극세포로 하였다. 또, 반응세포로서, 수지상세포를 조제하기 위하여 CD14 양성세포를 단리한 후의 나머지 세포(CD14 음성세포집단, 주로 T세포집단)에 있어서, 10% FBS, 10% 디메틸술폭시드(DMSO)를 첨가한 AIM-V 배지에 현탁시켜 동결 보존된 세포를 해동, 세정하여 사용하였다. 얻어진 자극세포(수지상세포) 1×10⁵개를 각각, 반응세포 1×10⁶개와, 전체 양을 1mL로 하여 48well plate(CORNING)에서 혼합배양을 실시하였다(반응세포:수지상세포=10:1). 배양은, 약 37℃, 5% CO₂ 조건하에서 7일간 실시하였다. 이 혼합배양 용액중에 20U/mL IL-2를 첨가하면, 보다 좋은 세포증식이 인정되었다. 세포의 증식이 빠른 경우에는, 4~6일째에 40U/mL IL-2, 10% FBS를 함유하는 AIM-V배지를 1mL 첨가하였다. 수지상세포 및 반응세포의 혼합배양 개시일로부터 7일 후에 표지항체와 항원 특이적 테트라머를 사용하여 플로우 사이토메터로 전체 세포 중에서 차지하는 BMLF1 특이적 CD8+CTL(질병 항원 특이적 CD8+CTL)의 비율을 측정하였다.

HLA-A*0201 BMLF1 테트라머 양성, CD8 양성세포가 차지하는 비율을 산출하는 수순으로서, 우선 PE표지된 BMLF1 테트라머(MBL)를 배양한 후 PBS로 세정한 세포에 첨가하였다. 차광상태의 실온에서 15분간 염색한 후, FITC표지된 항CD8 항체(BD Pharmingen)를 첨가하고, 차광상태에서 4℃, 15분간 염색하였다. 컨트롤에는 각 항체의 아이소타이프를 이용하였다. 세포의 측정은 Epics XL·MCL을 사용하고, 측정결과의 해석에는 Epics32를 사용하였다.

그 결과를 하기의 표 10에 나타낸다. 동 표에 나타내는 바와 같이, Zometa 0~20μM과 BMLF1로 공동감작시킨 활성화 수지상세포는 항원 특이적 CD8+CTL을 유도하는 것을 확인할 수가 있었다. 또, 펩티드만으로 감작된 수지상세포가 유도하는 CTL의 비율과 비교할 때 약 3.2배 높아지는 것이 확인되었다.

실시예6

<실시예6-1 : 인공 항원제시세포의 제작>

MHC 클래스I 분자를 발현하는 유방암 유래의 세포주: MDA-MB-231(클래스I 항원 HLA-A*0201)에, 보조자극분자인 인간 CD80유전자를 리포펙션(lipofection)법에 의해 트랜스펙션하고, MDA-MB-231세포로 인간 CD80을 안정적으로 항상적으로 발현하는 세포주 MDA-MB/CD80을 수립하였다. 미국 공개공보 US-2005-0048646-A1에 개시되어 있는 바와 같이, 이 MDA-MB/CD80 세포주의 세포는, 항원제시세포로서 기능하며, CTL을 유도할 수가 있다.

<실시예6-2 : Zometa 및 질병 항원 펩티드로 공동감작시킨 인공 항원제시세포에 의해 유도된 면역담당세포의 성상의 해석>

상술한 바와 같이 제조한 인공 항원제시세포 MDA-MB/CD80의 현탁액에 아미노 비스포스포네이트제인 Zometa(Novartis)를 졸레드론산으로서 0.01μM 또는 1μM이 되도록 첨가하고, 동시에 질병 항원 펩티드로서 MART-1 항원 펩티드 A27L(ELAGIGILTV)을 최종 농도 2㎍/mL이 되도록 첨가하고, 37℃, 5% CO₂ 조건하에서 약 12시간 배양하였다. 네가티브 컨트롤에는, Zometa와 항원 펩티드를 첨가하지 않고 배양한 MDA-MB/CD80 세포를 사용하였다.

약 12시간의 배양 후, Zometa와 항원 펩티드를 공동감작한 활성화 MDA-MB/CD80 세포의 일부를 15mL의 튜브(BD falcon)에 회수하고, 1500rpm, 5분간 원심분리하였다. 펠릿이 된 MDA-MB/CD80 세포를, 10% FBS를 함유하는 AIM-V 배지 10mL에 현탁시키고, 1500rpm, 5분간 원심분리하고, 세정하였다. 세정작업을 2회 반복하여 실시하였다. 이에 의해 회수된 MDA-MB/CD80 세포를 자극세포로 하였다. 즉, 비스포스포네이트 및 질병 항원 펩티드로 공동감작한 활성화 MDA-MB/CD80 세포, 그 중 어느 하나로 감작시킨 MDA-MB/CD80 세포, 및, 어느 것으로도 감작하지 않은 MDA-MB/CD80 세포를 자극세포로 하였다. 또, 반응세포로서, 상술한 바와 같이 수지상세포를 조제하기 위하여 CD14 양성세포를 단리한 후의 나머지 세포(CD14 음성세포집단, 주로 T세포집단, HLA-A*0201)에 있어서, 10% FBS, 10% 디메틸술폭시드(DMSO)를 첨가한 AIM-V 배지에 현탁시켜 동결보존되어 있던 세포를 해동, 세정하여 사용하였다.

상술한 바와 같이 하여 얻어진 자극세포(MDA-MB/CD80 세포) 2×10⁵개를 각각, 반응세포 2×10⁶개와, 전체 양을 1mL로 하여 24well plate(SUMILON)에서 혼합 배양하였다(반응세포:자극세포=10:1). 배양은 약 37℃, 5% CO₂의 조건하에서 7일간 실시하였다. 이 혼합배양 용액중에 20U/mL IL-2를 첨가하면, 보다 좋은 세포증식이 인정되었다. 세포의 증식이 빠른 경우에는, 4~6일째에 40U/mL IL-2, 10% FBS를 함유하는 AIM-V 배지를 1mL 첨가하였다. MDA-MB/CD80 세포와 반응세포의 혼합배양 개시일로부터 7일 후에 표지 항체와 항원 특이적 테트라머를 사용하여 플로우 사이토메터로 전체 세포 중에서 차지하는 A27L 특이적 CD8+CTL(질병 항원 특이적 CD8+CTL)의 비율을, 상술한 바와 같이 측정하였다.

그 결과를 하기의 표 11에 나타낸다. 동 표에 나타내는 바와 같이, Zometa 0.01μM 또는 1μM과, A27L 2㎍/mL로 공동감작된 활성화 MDA-MB/CD80 세포는 항원 특이적 CD8+CTL을 유도하는 것이 확인되었다. 또, 이 활성화 MDA-MB/CD80 세포를 사용한 경우, 펩티드만으로 감작된 MDA-MB/CD80 세포가 유도하는 CTL의 비율과 비교할 때, 약 6배 높아지는 것을 확인할 수가 있었다.

이상 설명한 바와 같이, 본 발명의 활성화 항원제시세포는, 질병 항원 특이적 CD8+CTL을, 종래의 펩티드만으로 감작시킨 수지상세포와 비교할 때, 상당히 효 율적으로 유도할 수가 있으며, 또한 γδT세포를 유도할 수가 있다. 그 때문에 투여용 조성물로서 환자에게 투여하는 것에 의해 in vivo에 있어서 질병 항원 특이적 CD8+CTL 및/또는 γδT세포를 유도하고, 암이나 감염증에 대한 치료·예방 효과를 기대할 수가 있다. 또한, in vitro에서는 질병 항원 특이적 CD8+CTL 및/또는 γδT세포를 유도하기 위한 조성물로서 이용할 수가 있다.

Claims

항원제시세포의 활성화 처리방법에 있어서, 인비트로에서 아미노비스포스포네이트와 질병 항원으로 상기 항원제시세포를 공동감작시키는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하고,

상기 항원제시세포가 성숙 수지상세포 및 미성숙 수지상세포로 이루어지는 군으로부터 선택되는 항원제시세포의 활성화 처리방법.
삭제
제1항에 있어서,

상기 아미노비스포스포네이트가 하기 일반식 (I)로 나타내는 화합물, 그 염, 및 그들의 수화물에 있어서,

상기 식(I) 중, R은, 수소원자 또는 탄소수 1-10의 알킬기이며, R₁과 R₂는, 각각 독립적으로, 수소원자, 할로겐원자, 하이드록실기, 아미노기, 티올기, 아릴기 또는 치환된 아릴기, 알킬기 또는 치환된 알킬기, 탄소수 1-10의 알킬아미노기, 아랄킬기, 시클로알킬기 및 복소환식기로 이루어지는 군으로부터 선택되며, 또는 R₁과 R₂는 동일한 환형상 구조의 일부를 형성하고,

상기 R₁과 R₂에 있어서의 치환기로서는, 할로겐원자, 탄소수 1-10의 알킬기, 하이드록실기, 티올기, 아미노기, 알콕시기, 아릴기, 아릴티오기, 아릴옥시기, 알킬티오기, 시클로알킬기, 복소환식기로 이루어지는 군으로부터 선택되며,

상기 R₁과 R₂, 및 상기 R₁과 R₂의 치환기에 있어서, 상기 알킬은 탄소수 1~30의 알킬이고, 상기 아릴은 페닐 또는 나프틸이며, 상기 아랄킬은 아릴-탄소수 1~10의 알킬로서, 상기 아릴은 페닐 또는 나프틸이고, 상기 시클로알킬은 탄소수 3~10의 시클로알킬이며, 상기 복소환식기는 피리딜, 푸릴, 피롤리디닐, 이미다졸릴, 퀴놀릴 또는 이소퀴놀릴기이고,

상기 R₁과 R₂의 적어도 한쪽이 아미노기를 포함하는 항원제시세포의 활성화 처리방법.
제1항에 있어서,

상기 아미노비스포스포네이트가, 졸레드론산, 파미드론산, 알렌드론산, 리세드론산, 이반드론산, 인카드론산, 에티드론산, 그들의 염, 및 그들 수화물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 항원제시세포의 활성화 처리방법.
제1항에 있어서,

상기 공동감작에 있어서의 상기 아미노비스포스포네이트의 농도가, 0.001~20μM인 항원제시세포의 활성화 처리방법.
제5항에 있어서,

상기 공동감작에 있어서의 상기 아미노비스포스포네이트의 농도가, 0.001~5μM인 항원제시세포의 활성화 처리방법.
제1항에 있어서,

상기 질병 항원이, 암 항원 또는 감염증 항원 단백, 그 펩티드, 암세포 또는 감염증 세포의 세포 융해물, 아포토시스세포, 네크로시스세포, 및 그들의 열처리물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 항원제시세포의 활성화 처리방법.
제1항에 있어서,

상기 공동감작에 있어서의 상기 질병 항원의 농도가, 0.01~20㎍/mL인 항원제시세포의 활성화 처리방법.
제8항에 있어서,

상기 공동감작에 있어서의 상기 질병 항원의 농도가, 0.1~2㎍/mL인 항원제시세포의 활성화 처리방법.
활성화 항원제시세포의 생산방법에 있어서, 상기 제1항 및 제3항 내지 제9항 중 어느 한 항에 기재된 활성화 처리방법으로 항원제시세포를 처리하는 것을 포함하는 활성화 항원제시세포의 생산방법.
상기 제10항에 기재된 생산방법에 의해 생산된 활성화 항원제시세포.
암 및 감염증에서 선택되는 적어도 하나를 위한 의약조성물에 있어서, 상기 제11항에 기재된 활성화 항원제시세포를 함유하는 의약조성물.
제12항에 있어서,

상기 항원제시세포가, 자기 유래 또는 사람백혈구항원(HLA)을 같이 하는 타가(他家) 유래인 의약조성물.
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면역담당세포의 유도 방법에 있어서, 하기 공정 (i) 및 (ii)를 포함하는 것을 특징으로 하는 면역담당세포의 유도 방법.

(i) 인비트로에서 아미노비스포스포네이트와 질병 항원으로, 성숙 수지상세포 및 미성숙 수지상세포로 이루어지는 군으로부터 선택되는 항원제시세포를 공동감작시키는 공정.

(ii) 상기 공동감작과 동시 또는 그 후에, 상기 항원제시세포와 임파구를 혼합배양하는 공정.
제16항에 있어서,

유도되는 면역담당세포가, 질병 항원 특이적 CD8+CTL 및 γδT세포의 적어도 한쪽을 포함하는 면역담당세포의 유도 방법.
제16항에 있어서,

상기 항원제시세포가, 수지상세포, 미성숙 수지상세포, 인공 항원제시세포로 이루어지는 군으로부터 선택되는 면역담당세포의 유도 방법.
제16항에 있어서,

상기 아미노비스포스포네이트가 하기의 일반식(I)로 나타내는 화합물, 그 염, 및 그들의 수화물에 있어서,

상기 식(I) 중, R은, 수소원자 또는 탄소수 1~10의 알킬기이며, R₁과 R₂는, 각각 독립적으로, 수소원자, 할로겐원자, 하이드록실기, 아미노기, 티올기, 아릴기 또는 치환된 아릴기, 알킬기 또는 치환된 알킬기, 탄소수 1~10의 알킬아미노기, 아랄킬기, 시클로알킬기 및 복소환식기로 이루어지는 군으로부터 선택되며, 또는 R₁과 R₂는 동일한 환형상 구조의 일부를 형성하고,

상기 R₁과 R₂에 있어서의 치환기로서는, 할로겐원자, 탄소수 1~10의 알킬기, 하이드록실기, 티올기, 아미노기, 알콕시기, 아릴기, 아릴티오기, 아릴옥시기, 알킬티오기, 시클로알킬기, 복소환식기로 이루어지는 군으로부터 선택되며,

상기 R₁과 R₂, 및 상기 R₁과 R₂의 치환기에 있어서, 상기 알킬은 탄소수 1~30의 알킬이고, 상기 아릴은 페닐 또는 나프틸이며, 상기 아랄킬은 아릴-탄소수 1~10의 알킬로서, 상기 아릴은 페닐 또는 나프틸이고, 상기 시클로알킬은 탄소수 3~10의 시클로알킬이며, 상기 복소환식기는 피리딜, 푸릴, 피롤리디닐, 이미다졸릴, 퀴놀릴 또는 이소퀴놀릴기이고,

상기 R₁과 R₂의 적어도 한쪽이 아미노기를 포함하는 면역담당세포의 유도 방법.
제16항에 있어서,

상기 아미노비스포스포네이트가, 졸레드론산, 파미드론산, 알렌드론산, 리세드론산, 이반드론산, 인카드론산, 에티드론산, 그들 염, 및 그들의 수화물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 면역담당세포의 유도 방법.
제16항에 있어서,

상기 공동감작에 있어서의 상기 아미노비스포스포네이트의 농도가, 0.001~20μM인 면역담당세포의 유도 방법.
제21항에 있어서,

상기 공동감작에 있어서의 상기 아미노비스포스포네이트의 농도가, 0.001~5μM인 면역담당세포의 유도 방법.
제16항에 있어서,

상기 질병 항원이, 암 항원 또는 감염증 항원 단백, 그 펩티드, 암세포 또는 감염증 세포의 세포 융해물, 아포토시스세포, 네크로시스세포, 및 그들의 열처리물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 면역담당세포의 유도 방법.
제16항에 있어서,

상기 공동감작에 있어서의 상기 질병 항원의 농도가, 0.01~20㎍/mL인 면역담당세포의 유도 방법.
제24항에 있어서,

상기 공동감작에 있어서의 상기 질병 항원의 농도가, 0.1~2㎍/mL인 면역담당세포의 유도 방법.
면역담당세포의 생산방법에 있어서, 상기 제16항 내지 제25항 중 어느 한 항에 기재된 유도 방법에 의해 면역담당세포를 유도하는 것을 포함하는 면역담당세포의 생산방법.
상기 제26항에 기재된 생산방법에 의해 생산된 면역담당세포.
암 및 감염증에서 선택되는 적어도 하나를 위한 의약조성물에 있어서, 상기 제27항에 기재된 면역담당세포를 함유하는 의약조성물.
제28항에 있어서,

상기 면역담당세포가, 자기 유래 또는 사람백혈구항원(HLA)을 같이 하는 타가 유래인 암 및 감염증에서 선택되는 적어도 하나를 위한 의약조성물.
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인비트로에서 질병 항원에 맞추어 공동감작에 이용하는 아미노비스포스포네이트를 유효성분으로서 함유하는, 인비트로에서 질병 항원으로 감작(感作)시킬 때의 항원제시세포의 활성화 촉진제로서,

상기 항원제시세포가 성숙 수지상세포 및 미성숙 수지상세포로 이루어지는 군으로부터 선택되는, 인비트로에서 질병 항원으로 감작(感作)시킬 때의 항원제시세포의 활성화 촉진제.
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제32항에 있어서,

상기 아미노비스포스포네이트가, 하기 일반식(I)로 표시되는 화합물, 그 염, 및 그들의 수화물에 있어서,

상기 식(I) 중, R은, 수소원자 또는 탄소수 1~10의 알킬기이며, R₁과 R₂는, 각각 독립적으로, 수소원자, 할로겐원자, 하이드록실기, 아미노기, 티올기, 아릴기 또는 치환된 아릴기, 알킬기 또는 치환된 알킬기, 탄소수 1~10의 알킬아미노기, 아랄킬기, 시클로알킬기 및 복소환식기로 이루어지는 군으로부터 선택되며, 또는 R₁과 R₂는 동일한 환형상 구조의 일부를 형성하며,

상기 R₁과 R₂에 있어서의 치환기로서는, 할로겐원자, 탄소수 1~10의 알킬기, 하이드록실기, 티올기, 아미노기, 알콕시기, 아릴기, 아릴티오기, 아릴옥시기, 알킬티오기, 시클로알킬기, 복소환식기로 이루어지는 군으로부터 선택되고,

상기 R₁과 R₂, 및 상기 R₁과 R₂의 치환기에 있어서, 상기 알킬은 탄소수 1~30의 알킬이고, 상기 아릴은 페닐 또는 나프틸이며, 상기 아랄킬은 아릴-탄소수 1~10의 알킬로서, 상기 아릴은 페닐 또는 나프틸이고, 상기 시클로알킬은 탄소수 3~10의 시클로알킬이며, 상기 복소환식기는 피리딜, 푸릴, 피롤리디닐, 이미다졸릴, 퀴놀릴 또는 이소퀴놀릴기이고,

상기 R₁과 R₂의 적어도 한쪽이 아미노기를 포함하는 질병 항원으로 감작할 때의 항원제시세포의 활성화 촉진제.
제32항에 있어서,

상기 아미노비스포스포네이트가, 졸레드론산, 파미드론산, 알렌드론산, 리세드론산, 이반드론산, 인카드론산, 에티드론산, 그들 염, 및 그들 수화물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 질병 항원으로 감작할 때의 항원제시세포의 활성화 촉진제.