KR101389165B1 - 이치환된 프탈라진 헤지호그 （ｈｅｄｇｅｈｏｇ） 경로 길항제 - Google Patents

Abstract

본 발명은 암의 치료에 유용한 헤지호그 (Hedgehog) 경로 길항제인 신규한 하기 화학식 (I)의 1,4-이치환된 프탈라진을 제공한다.
<화학식 I>

Description

이치환된 프탈라진 헤지호그 （ＨＥＤＧＥＨＯＧ） 경로 길항제 {DISUBSTITUTED PHTHALAZINE HEDGEHOG PATHWAY ANTAGONISTS}

본 발명은 헤지호그 (Hedgehog) 경로 길항제 및 보다 구체적으로, 신규한 1,4-이치환된 프탈라진 및 그의 치료적 용도에 관한 것이다. 헤지호그 (Hh) 신호전달 경로는 세포 분화 및 증식을 지시함으로써 배아 패턴 형성 및 성인 조직 유지에서 중요한 역할을 한다. 소닉 (Sonic) 헤지호그 (Shh), 인디언 (Indian) 헤지호그 (Ihh) 및 데저트 (Desert) 헤지호그 (Dhh)를 포함하는 헤지호그 (Hh) 단백질 족은 자가촉매적 절단 및 아미노-말단 펩티드에의 콜레스테롤의 커플링을 포함하는 번역 후 변형을 거쳐 신호전달 활성을 보유하는 단편을 형성하는 분비되는 글리코단백질이다. Hh는 12-통과 (twelve-pass) 막횡단 단백질 Ptch (Ptch1 및 Ptch2)에 결합하고, 따라서 스무슨드 (Smoothened) (Smo)의 Ptch-매개된 억제를 경감시킨다. Smo 활성화는 Gli 전사 인자 (Gli1, Gli2 및 Gli3)의 안정화 및 세포 증식, 세포 생존, 혈관신생 및 침윤의 원인이 되는 Gli-의존적 유전자의 발현으로 이어지는 일련의 세포내 사건을 촉발시킨다.

Hh 신호전달은 최근에 Shh 신호전달의 이상 활성화가 다양한 종양, 예를 들면 췌장암, 수모세포종, 기저 세포 암종, 소세포 폐암 및 전립선암의 형성으로 이어진다는 발견을 기반으로 상당한 관심을 끌었다. WO2005033288은 헤지호그 길항제라고 주장되는 특정 1,4-이치환된 프탈라진 화합물을 개시한다. 유사하게, WO2008110611은 헤지호그 경로에 관련된 병적이상의 진단 및 치료에 관련된 특정 1,4-이치환된 프탈라진 화합물을 개시한다. WO2009002469는 부적합한 헤지호그 신호전달에 의해 야기되는 모든 종양에 대한 치료 옵션이라고 주장되는 특정 1,4-이치환된 프탈라진 화합물을 개시한다.

강력한 헤지호그 경로 억제제, 특히 원하는 독성학 프로파일을 갖는 헤지호그 경로 억제제에 대한 필요성이 여전히 존재한다. 본 발명은 상기 경로의 강력한 길항제인 신규한 1,4-이치환된 프탈라진을 제공한다. 본 발명의 특정 화합물은 가역 및/또는 메카니즘-기반 비가역 CYP3A4 억제 잠재력에 대한 바람직한 약물-약물 상호작용 및 관련된 안정성 프로파일을 제공한다.

본 발명은 하기 화학식 I의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염을 제공한다.

<화학식 I>

상기 식에서, R¹은 수소 또는 메틸이고; R²는 수소 또는 메틸이고; R³, R⁴, R⁵, R⁶ 또는 R⁷은 독립적으로 수소, 플루오로, 클로로, 시아노, 트리플루오로메틸, 트리플루오로메톡시, 디플루오로메톡시, 메틸술포닐 또는 트리플루오로메틸술포닐이되, 단 R³, R⁴, R⁵, R⁶ 및 R⁷ 중 3개 이상이 수소이다.

본 발명은 또한 화학식 I의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염을 제약상 허용되는 부형제, 담체 또는 희석제와 함께 포함하는 제약 조성물을 제공한다.

본 발명은 또한 유효량의 화학식 I의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염을 포유동물에게 투여하는 것을 포함하는, 포유동물에서의 뇌암, 기저 세포 암종, 식도암, 위암 (stomach cancer), 위암 (gastric cancer), 췌장암, 담관암, 전립선암, 유방암, 소-세포 폐암, 비-소세포 폐암, B-세포 림프종, 다발성 골수종, 난소암, 결장직장암, 간암, 신장암, 흑색종, 머리 및 목의 암, 중피종, 연질 조직 육종, 골 육종, 백혈병 및 고환암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 암의 치료 방법을 제공한다.

추가로, 본 발명은 요법에서의 사용을 위한 화학식 I의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염을 제공한다. 또한, 본 발명은 암의 치료에서 사용하기 위한 화학식 I의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염을 제공한다. 특히, 암은 뇌암, 기저 세포 암종, 식도암, 위암 (stomach cancer), 위암 (gastric cancer), 췌장암, 담관암, 전립선암, 유방암, 소세포 폐암, 비-소세포 폐암, B-세포 림프종, 다발성 골수종, 난소암, 결장직장암, 간암, 신장암, 흑색종, 머리 및 목의 암, 중피종, 연질 조직 육종, 골 육종, 백혈병 및 고환암으로 이루어진 군으로부터 선택된다.

본 발명은 또한 요법에서의 화학식 I의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염의 용도를 제공한다. 추가로, 본 발명은 암의 치료용 의약의 제조를 위한 화학식 I의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염의 용도를 제공한다. 특히, 암은 뇌암, 기저 세포 암종, 식도암, 위암 (stomach cancer), 위암 (gastric cancer), 췌장암, 담관암, 전립선암, 유방암, 소세포 폐암, 비-소세포 폐암, B-세포 림프종, 다발성 골수종, 난소암, 결장직장암, 간암, 신장암, 흑색종, 머리 및 목의 암, 중피종, 연질 조직 육종, 골 육종, 백혈병 및 고환암으로 이루어진 군으로부터 선택된다.

추가로, 본 발명은 활성 성분으로서 화학식 I의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염을 포함하는, 뇌암, 기저 세포 암종, 식도암, 위암 (stomach cancer), 위암 (gastric cancer), 췌장암, 담관암, 전립선암, 유방암, 소세포 폐암, 비-소세포 폐암, B-세포 림프종, 다발성 골수종, 난소암, 결장직장암, 간암, 신장암, 흑색종, 머리 및 목의 암, 중피종, 연질 조직 육종, 골 육종, 백혈병 및 고환암으로 이루어진 군으로부터 선택된 암의 치료를 위한 제약 조성물을 제공한다.

화학식 I의 특정 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염은,

(a) R¹은 메틸이고;

(b) R²는 메틸이고;

(c) R³, R⁴, R⁵, R⁶ 또는 R⁷은 독립적으로 수소, 플루오로, 클로로, 트리플루오로메틸 또는 메틸술포닐이고;

(d) R³, R⁴, R⁵, R⁶ 또는 R⁷은 독립적으로 수소, 플루오로 또는 트리플루오로메틸이고;

(e) R³, R⁴, R⁵, R⁶ 및 R⁷ 중 2개 이상은 독립적으로 플루오로, 클로로, 트리플루오로메틸 또는 메틸술포닐이되, 단 R³ 및 R⁷은 동시에 수소가 아니고;

(f) R³, R⁴, R⁵, R⁶ 및 R⁷ 중 2개 이상은 독립적으로 플루오로 또는 트리플루오로메틸이되, 단 R³ 및 R⁷은 동시에 수소가 아니고;

(g) R⁴, R⁶ 및 R⁷은 수소이고;

(h) R³ 및 R⁵는 독립적으로 플루오로, 클로로, 트리플루오로메틸 또는 메틸술포닐이고; R⁴, R⁶ 및 R⁷은 수소이고;

(i) R³ 및 R⁵는 독립적으로 플루오로 또는 트리플루오로메틸이고; R⁴, R⁶ 및 R⁷은 수소이고;

(j) R¹은 메틸이고; R²는 메틸이고;

(k) R¹은 메틸이고; R²는 메틸이고; R³, R⁴, R⁵, R⁶ 또는 R⁷은 독립적으로 수소, 플루오로, 클로로, 트리플루오로메틸 또는 메틸술포닐이고;

(l) R¹은 메틸이고; R²는 메틸이고; R³, R⁴, R⁵, R⁶ 또는 R⁷은 독립적으로 수소, 플루오로 또는 트리플루오로메틸이고;

(m) R¹은 메틸이고; R²는 메틸이고; R³, R⁴, R⁵, R⁶ 및 R⁷ 중 2개 이상은 독립적으로 플루오로, 클로로, 트리플루오로메틸 또는 메틸술포닐이되, 단 R³ 및 R⁷은 동시에 수소가 아니고;

(n) R¹은 메틸이고; R²는 메틸이고; R³, R⁴, R⁵, R⁶ 및 R⁷ 중 2개 이상은 독립적으로 플루오로 또는 트리플루오로메틸이되, 단 R³ 및 R⁷은 동시에 수소가 아니고;

(o) R¹은 메틸이고; R²는 메틸이고; R⁴, R⁶ 및 R⁷은 수소이고;

(p) R¹은 메틸이고; R²는 메틸이고; R³ 및 R⁵는 독립적으로 플루오로, 클로로, 트리플루오로메틸 또는 메틸술포닐이고; R⁴, R⁶ 및 R⁷은 수소이고;

(q) R¹은 메틸이고; R²는 메틸이고; R³ 및 R⁵는 독립적으로 플루오로 또는 트리플루오로메틸이고; R⁴, R⁶ 및 R⁷은 수소인 것들이다.

상기 사용된 바와 같이, 그리고 본 발명의 설명에 걸쳐, 다음 용어는 달리 언급하지 않는 한, 다음 의미를 갖는 것으로 이해될 것이다:

"제약상 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제"는 포유동물, 예를 들면 인간에게 생물학적 활성 제제를 전달하기 위한, 당업계에서 일반적으로 인정되는 매질이다.

"제약상 허용되는 염"은 본 발명의 화합물의 상대적으로 비독성 무기 및 유기 염을 가리킨다.

"치료 유효량" 또는 "유효량"은 연구자, 수의사, 의사 또는 다른 임상의에게 관심이 되는 조직, 시스템, 동물, 포유동물 또는 인간에서 생물학적 또는 의학적 반응, 또는 원하는 치료적 효과를 야기하는 본 발명의 화학식 I의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염, 또는 본 발명의 화학식 I의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염을 함유하는 제약 조성물의 양을 의미한다.

용어 "치료," "치료하다," "치료하는" 등은 장애의 진행을 늦추거나 또는 반전시키는 것을 포함하는 의미이다. 이들 용어는 또한, 비록 장애 또는 상태가 실제로 제거되지 않을지라도, 그리고 비록 장애 또는 상태의 진행 자체가 늦추어지거나 또는 반전되지 않을지라도 장애 또는 상태의 하나 이상의 증상을 경감, 완화, 약화, 제거 또는 감소시키는 것을 포함한다.

본원에 걸쳐 사용된 표준 명명법하에, 지정된 측쇄의 말단 부분이 먼저 기재되고, 이어서 부착 지점을 향해 인접한 관능기가 기재된다. 예를 들면, 메틸술포닐 치환기는 CH₃-SO₂-와 등가이다.

본 발명의 화합물은 예를 들면, 제약상 허용되는 산 부가염을 형성하기 위해 수많은 무기 및 유기산과 반응할 수 있다. 상기 제약상 허용되는 염 및 이들을 제조하기 위한 일반적인 방법은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들면, 문헌 [P. Stahl, et al., HANDBOOK OF PHARMACEUTICAL SALTS: PROPERTIES, SELECTION AND USE, (VCHA/Wiley-VCH, 2002)]; 문헌 [S.M. Berge, et al., "Pharmaceutical Salts," Journal of Pharmaceutical Sciences, Vol 66, No. 1, January 1977]을 참조한다.

본 발명의 화합물은 바람직하게는 제약상 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제를 사용하여 제약 조성물로서 제제화되고, 다양한 경로를 통해 투여된다. 바람직하게는, 상기 조성물은 경구 또는 정맥내 투여를 위한 것이다. 상기 제약 조성물 및 이들의 제조 방법은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들면, 문헌 [REMINGTON: THE SCIENCE AND PRACTICE OF PHARMACY (A. Gennaro, et al., eds., 19^th ed., Mack Publishing Co., 1995)]을 참조한다.

실제로 투여되는 화합물은 치료되어야 하는 상태, 선택된 투여 경로, 실제로 투여된 화합물 또는 화합물들, 개별 환자의 연령, 몸무게 및 반응, 및 환자의 증상의 중증도를 포함하는 관련된 상황하에 전문의에 의해 결정될 것이다. 일일 투여량은 보통 체중 1 kg 당 약 0.1 내지 약 10 mg의 범위 내에 포함된다. 일부 경우에는, 상기 언급된 범위의 하한 미만의 투여량 수준이 충분히 많은 것일 수 있고, 다른 경우에는 보다 큰 투여량이 사용될 수 있다.

화학식 I의 화합물 또는 그의 염은 당업계에 공지된 다양한 방법 및 하기 반응식, 제조예 및 실시예에 기재된 방법에 의해 제조될 수 있다. 기재된 각각의 경로에 대한 특정 합성 단계는 화학식 I의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염을 제조하기 위해 여러 방식으로 조합될 수 있다.

치환기는 달리 언급하지 않는 한, 상기 정의된 바와 같다. 시약 및 출발 물질은 일반적으로 당업자가 쉽게 구할 수 있다. 다른 것들은 유기 및 헤테로시클릭 화학의 표준 기술, 공지된 구조적으로 유사한 화합물의 합성과 유사한 기술 및 임의의 신규한 방법을 포함하는 하기 제조예 및 실시예에 기재된 방법에 의해 제조될 수 있다. 다음 제조예 및 실시예의 명명은 켐드로 (ChemDraw)(등록상표) 울트라 (Ultra) 10.0의 스트럭트=네임 (Struct=Name) 명명 특징을 사용하여 수행된다.

본원에 사용된 바와 같이, 다음 용어는 나타난 의미를 갖는다: "Et₂O"는 디에틸 에테르를 가리키고; "DMF"는 디메틸포름아미드를 가리키고; "DMSO"는 디메틸술폭시드를 가리키고; "DMAC"는 N,N-디메틸아세트아미드를 가리키고; "NMP"는 N-메틸피롤리딘을 가리키고; "MeOH"는 메탄올을 가리키고; "boc" 또는 "t-boc"는 tert-부톡시카르보닐을 가리키고; "IC₅₀"은 제제에 대해 가능한 최대 억제 반응의 50%를 생성하는 제제의 농도를 가리킨다.

<반응식>

화학식 I의 화합물은 반응식에 나타난 바와 같은 반응에 따라 제조될 수 있다.

단계 1에서, 디할로 치환된 프탈라진 (1) (X = Cl 또는 Br)은 4-아미노 boc 보호된 피페리딘 (2)과 친핵성 방향족 치환 (SNAr)으로 반응하여 화학식 (3)의 할로 피페리딜 프탈라진을 제공한다. 반응은 유기 또는 무기 염기의 존재하에 2극성 비양성자성 용매, 예를 들면 DMF, DMAC 또는 NMP 중에서 진행된다. 바람직하게는, 반응은 탄산칼륨의 존재하에 NMP 중에서 50 내지 140℃의 온도에서 수행된다.

단계 2에서, 화학식 (3)의 할로 피페리딜 프탈라진은 피라졸 보론 에스테르 또는 산 (4)과 스즈끼 (Suzuki) 교차-커플링 반응을 거친다. 예를 들면, 할로 피페리딜 프탈라진 (3)은 팔라듐 촉매, 예를 들면 테트라키스(트리페닐포스핀)팔라듐 및 무기 염기, 예를 들면 중탄산나트륨의 존재하에 1-메틸-1H-피라졸-5-보론산 피나콜 에스테르와 합해진다. 반응은 톨루엔/에탄올/물의 용매 혼합물 중에서 진행되어 화학식 (5)의 피라졸릴 프탈라진을 제공한다.

단계 3은 산성 조건, 예를 들면 디에틸 에테르 또는 디옥산 중의 HCl하에 달성되어 화학식 (6)의 아미노피페리디닐 프탈라진을 제공하는 단순 boc 탈보호이다. 질소 및 산소 보호기를 도입 및 제거하는 방법은 당업계에 공지되어 있다 (예를 들면, 문헌 [Greene and Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, 3^rd Ed., John Wiley and Sons, New York, (1999)] 참조).

단계 4에서, 화학식 (6)의 아미노피페리디닐 프탈라진은 아실화되어 화학식 I의 피페리디닐 아미드를 제공한다. 한 방법에서, 아민은 불활성 용매, 예를 들면 디클로로메탄 중에서 유기 염기, 예를 들면 트리에틸아민 또는 디이소프로필에틸아민의 존재하에 적절하게 치환된 벤조일 클로라이드와 반응한다. 별법으로, 아미드는 적절하게 치환된 벤조산을 사용하여 형성된다. 활성 에스테르는 펜타플루오로페닐 디페닐포스피네이트의 사용에 이어서 아민과의 반응에 의해 형성된다. 반응은 DMF/DMSO의 용매 혼합물 중에서 약 -10 내지 100℃의 온도에서 유기 염기, 예를 들면 트리에틸아민 또는 디이소프로필에틸아민의 존재하에 진행된다.

제조예 1

tert-부틸 1-(4-클로로프탈라진-1-일)피페리딘-4-일(메틸)카르바메이트

N-메틸피롤리딘 (200 mL) 중의 탄산칼륨 (21.23 g, 153.6 mmol), 1,4-디클로로프탈라진 (26 g, 128 mmol) 및 메틸-피페리딘-4-일 카밤산 tert-부틸 에스테르 (30.01 g, 134.4 mmol)의 혼합물을 80℃에서 밤새 가열하였다. 반응 혼합물을 물에 붓고, 디클로로메탄으로 추출하고, Na₂SO₄ 상에서 건조시키고, 감압하에 농축시켰다. 디에틸에테르를 첨가하고, 생성된 고체 (출발 물질 불순물로부터의 4-클로로프탈라진-1-올)를 여과하였다. 여과물을 농축시켰다. 생성된 잔류물을 플래쉬 실리카겔 크로마토그래피 (헥산:에틸 아세테이트 = 2:1)에 의해 정제하여 표제 화합물을 백색 고체 (17.66 g, 37%)로서 수득하였다. ES/MS m/z (³⁷Cl) 377.0 (M+1).

제조예 2

tert-부틸 1-(4-클로로프탈라진-1-일)피페리딘-4-일카르바메이트

본질적으로 제조예 1에 기재된 방법에 따라서, 피페리딘-4-일-카밤산 tert-부틸 에스테르를 사용하여 표제 화합물을 제조하였다. 반응 혼합물을 냉각시키고, 물 (500 mL)에 부었다. 에틸 아세테이트로 추출하고, 물로 세척하고, Na₂SO₄ 상에서 건조시키고, 용매를 감압하에 제거하여 표제 화합물을 황색 고체 (36 g, 97%)로서 수득하였다. ES/MS m/z 363.0 (M+1).

제조예 3

tert-부틸 메틸(1-(4-(1-메틸-1H-피라졸-5-일)프탈라진-1-일)피페리딘-4-일)카르바메이트

탄산나트륨 (3.82 g, 36.09 mmol), tert-부틸 1-(4-클로로프탈라진-1-일) 피페리딘-4-일(메틸)카르바메이트 (6.8 g, 18.04 mmol) 및 1-메틸-1H-피라졸-5-보론산 피나콜 에스테르 (5.63 g, 27.1 mmol)를 플라스크 중에 톨루엔 (50 mL), 에탄올 (17 mL) 및 물 (17 mL)의 혼합물과 함께 넣었다. 혼합물을 질소 가스를 사용하여 10분 동안 탈가스화 하였다. 테트라키스(트리페닐포스핀)팔라듐 (0.4 g, 0.35 mmol)을 첨가하고, 혼합물을 74℃에서 밤새 가열하였다. 혼합물을 주위 온도로 냉각시키고, 디클로로메탄으로 희석하였다. 유기 부분을 염수로 세척하고, Na₂SO₄ 상에서 건조시키고, 감압하에 농축시켰다. 생성된 잔류물을 플래쉬 실리카겔 크로마토그래피 (헥산:에틸 아세테이트:MeOH 중의 2M NH₃ = 20:5:1)에 의해 정제하여 표제 화합물을 황색 발포물 (5.33 g, 70%)로서 수득하였다. ES/MS m/z 423.2 (M+1).

tert-부틸 메틸(1-(4-(1-메틸-1H-피라졸-5-일)프탈라진-1-일)피페리딘-4-일)카르바메이트의 제조를 위한 대안 방법: 제조예 4 - 6

제조예 4

1,4-디브로모프탈라진

인 펜타브로마이드 (24.5 g, 54.1 mmol) 및 2,3-디히드로-프탈라진-1,4-디온 (5.00 g, 30.8 mmol)으로 압력관을 채웠다. 관을 밀봉하고 140℃에서 6-7시간 동안 가열하였다. 밤새 냉각되도록 하였다. 압력으로 인해 조심스럽게 관을 열었다. 고체를 끌로 꺼내고, 얼음물에 부었다. 얼음물 중에 교반되도록 하고, 생성된 고체를 진공 여과에 의해 수집하였다. 진공 오븐에서 건조시켜 최종 생성물 (8.31 g, 93%)을 수득하였다. ES/MS (⁷⁹Br, ⁸¹Br) m/z 288.8 (M+). 참조: 문헌 [Can. J. Chem. 1965, 43, 2708]

제조예 5

tert-부틸 1-(4-브로모프탈라진-1-일)피페리딘-4-일(메틸)카르바메이트

1,4-디브로모프탈라진 (0.70 g, 2.38 mmol), N-메틸피롤리돈 (7.0 mL), 탄산칼륨 (395 mg, 2.86 mmol) 및 메틸-피페리딘-4-일-카밤산 tert-부틸 에스테르 (532 mg, 2.38 mmol)를 합하였다. 80℃에서 밤새 가열하였다. 냉각시키고 물에 부었다. 고체를 수집하고 진공 오븐에서 주위 온도에서 밤새 건조시켜 최종 생성물 (0.96 g, 95%)을 수득하였다. ES/MS m/z (⁸¹Br) 421.0 (M+1).

제조예 6

tert-부틸 메틸 (1-(4-(1-메틸-1H-피라졸-5-일)프탈라진-1-일)피페리딘-4-일)카르바메이트

반응 관을 tert-부틸 1-(4-브로모프탈라진-1-일)피페리딘-4-일(메틸)카르바메이트 (500 mg, 1.2 mmol), 1-메틸-1H-피라졸-5-보론산 피나콜 에스테르 (370 mg, 1.8 mmol), 탄산나트륨 (252 mg, 2.4 mmol), 톨루엔 (3.75 mL), 에탄올 (1.25 mL) 및 물 (1.25 mL)로 채웠다. 반응 혼합물을 질소를 사용하여 10분 동안 탈가스화 하였다. 테트라키스 (트리페닐포스핀) 팔라듐 (137.1 mg, 118.7 μmol)을 첨가하였다. 질소를 반응 혼합물에 추가의 10분 동안 버블링하였다. 반응 바이알을 덮고, 90℃에서 밤새 가열하였다. 반응을 냉각시키고, 5% MeOH:CH₂Cl₂로 용출하는 실리카겔 패드를 통해 여과하였다. 분획을 감압하에 농축시켰다. 생성된 잔류물을 실리카겔 크로마토그래피 (MeOH 중의 2% 2N NH₃:CH₂Cl₂)를 사용하여 정제하여 최종 생성물 (345.6 mg, 69%)을 수득하였다. ES/MS m/z 423.2 (M+1).

제조예 7

tert-부틸 1-(4-(1H-피라졸-5-일)프탈라진-1-일)피페리딘-4-일(메틸)카르바메이트

본질적으로 제조예 3에 기재된 방법에 따라서, tert-부틸 1-(4-클로로프탈라진-1-일)피페리딘-4-일(메틸)카르바메이트 및 1H-피라졸-3-보론산 피나콜 에스테르를 사용하여 표제 화합물을 제조하여 580 mg, (67%)를 수득하였다. ES/MS m/z 409.2 (M+1).

제조예 8

tert-부틸 1-(4-(1-메틸-1H-피라졸-5-일)프탈라진-1-일)피페리딘-4-일카르바메이트

본질적으로 제조예 3에 기재된 방법에 따라서, tert-부틸 1-(4-클로로프탈라진-1-일)피페리딘-4-일카르바메이트를 사용하여 표제 화합물을 제조하여 5.92 g (94%)을 수득하였다. ES/MS m/z 308.8 (M⁺).

제조예 9

N-메틸-1-(4-(1-메틸-1H-피라졸-5-일)프탈라진-1-일)피페리딘-4-아민

tert-부틸 메틸(1-(4-(1-메틸-1H-피라졸-5-일)프탈라진-1-일)피페리딘-4-일)카르바메이트 (7.77 g, 18.39 mmol)를 디클로로메탄 (100 mL) 중에 용해시켰다. 디에틸 에테르 (20 mL, 80 mmol) 중의 과량의 1M 염화수소를 용액에 첨가하고, 주위 온도에서 2시간 동안 교반하였다. 감압하에 농축시켰다. 생성된 잔류물을 플래쉬 실리카겔 크로마토그래피 (디클로로메탄:MeOH 중의 2M NH₃ = 10:1)에 의해 정제하여 표제 화합물을 황색 발포물 (5.83 g, 98%)로서 수득하였다. ES/MS m/z 323.2 (M+1).

적절한 t-Boc 보호된 아민이 디옥산 중의 4M HCl을 사용하여 탈보호된 것을 제외하고, 본질적으로 제조예 9에 기재된 방법에 따라서 하기 표의 중간체를 제조하였다.

실시예 1

4-플루오로-N-메틸-N-(1-(4-(1-메틸-1H-피라졸-5-일)프탈라진-1-일)피페리딘-4-일)-2-(트리플루오로메틸)벤즈아미드

CH₂Cl₂ (30 mL) 중의 N-메틸-1-(4-(1-메틸-1H-피라졸-5-일)프탈라진-1-일)피페리딘-4-아민 (2.8 g, 8.68 mmol) 및 트리에틸아민 (3.36 mL, 26.1 mmol)의 용액을 4-플루오로-2-(트리플루오로메틸)벤조일 클로라이드 (2.14 mL, 10.42 mmol)로 처리하였다. 3시간 동안 주위 온도에서 교반하였다. 반응 혼합물을 감압하에 농축시켰다. 생성된 잔류물을 플래쉬 실리카겔 크로마토그래피 (헥산:에틸 아세테이트:MeOH 중의 2M NH₃ = 20:5:1)에 의해 정제하여 유리 염기를 황색 발포물 (3.83 g, 86%)로서 수득하였다. ES/MS m/z 513.0 (M+1).

실시예 1a

4-플루오로-N-메틸-N-(1-(4-(1-메틸-1H-피라졸-5-일)프탈라진-1-일)피페리딘-4-일)-2-(트리플루오로메틸)벤즈아미드 히드로클로라이드

4-플루오로-N-메틸-N-(1-(4-(1-메틸-1H-피라졸-5-일)프탈라진-1-일)피페리딘-4-일)-2-(트리플루오로메틸)벤즈아미드 (7.13 g, 13.91 mmol)를 디클로로메탄 (100 mL) 중에 용해시키고, 디에틸 에테르 (30 mL, 30 mmol) 중의 과량의 1N HCl을 첨가하였다. 용매를 감압하에 제거하여 표제 화합물 (7.05 g, 92%)을 수득하였다. ES/MS m/z 513.0 (M+1). NMR은 아미드 회전이성질체의 2:1 혼합물을 나타냈다.

본질적으로 실시예 1 및 1a에 기재된 방법에 따라서, 적절한 피페리디닐프탈라진 및 치환된 벤조일 클로라이드를 사용하여 하기 표의 아미드를 제조하였다.

실시예 14

4-클로로-N-메틸-N-(1-(4-(1-메틸-1H-피라졸-5-일)프탈라진-1-일)피페리딘-4-일)-2-(메틸술포닐)벤즈아미드 히드로클로라이드

N-메틸-1-(4-(1-메틸-1H-피라졸-5-일)프탈라진-1-일)피페리딘-4-아민 (100 mg, 0.31 mmol), 4-클로로-2-(메틸술포닐)벤조산 (87 mg, 0.37 mmol) 및 디이소프로필에틸아민 (0.26 mL, 1.5 mmol)을 DMF:DMSO = 4:1 (2 mL) 중에 60℃에서 용해시켰다. 0℃로 냉각시키고, DMF:DMSO = 1:1 (1 mL) 중의 펜타플루오로페닐 디페닐포스피네이트 (250 mg, 0.65 mmol)를 용액에 첨가하였다. 혼합물을 60℃에서 밤새 교반하였다. 반응 혼합물을 주위 온도로 냉각시키고, CH₂Cl₂로 희석하고, 염수로 세척하고, Na₂SO₄ 상에서 건조시키고, 감압하에 농축시켰다. 생성된 잔류물을 플래쉬 실리카겔 크로마토그래피 (헥산:에틸 아세테이트:MeOH 중의 2M NH₃ = 20:5:1)에 의해 정제하여 생성물을 수득하였다. 디에틸 에테르 (1 mL, 10 mmol) 중의 과량의 1N HCl을 단리된 생성물에 첨가하고, 용매를 제거하여 표제 화합물 (150 mg, 84%)을 수득하였다. ES/MS m/z 539.0 (M+1).

본질적으로 실시예 14에 기재된 방법에 따라서, 적절한 피페리디닐프탈라진 및 치환된 벤조산을 사용하여 하기 표의 아미드를 제조하였다.

헤지호그는 다음 암에 대한 생존 인자로서 관련되었음이 제시되었다: 기저 세포 암종; 상위장관 암 (식도, 위, 췌장 및 담관); 전립선암; 유방암; 소세포 폐암; 비-소세포 폐암; B-세포 림프종; 다발성 골수종; 위암; 난소암; 결장직장암; 간암; 흑색종; 머리 및 목의 암; 중피종; 연질 조직 육종; 골 육종; 백혈병; 고환암; 신장암; 및 뇌암.

헤지호그 경로의 요소는 암의 치료를 위한 잠재적인 약물 표적이라고 주장되어 왔다. 수모세포종 종양 (ATCC, HTB-186)으로부터 확립된 Daoy 세포주는 Hh 리간드에 대해 반응성이 있다. 이들 세포가 외인적으로 첨가된 Shh-조건화 배지로 처리된 경우, Hh 신호전달 경로는 활성화되고, Gli1의 증가된 발현을 야기한다. 익시아 (corn lily) 베라트룸 캘리포르니쿰 (Veratrum californicum)으로부터 단리된 알칼로이드인 시클로파민은 약한 헤지호그 길항제이고, Shh 자극에 대한 반응에 의해 Gli1의 발현을 억제하는 것으로 나타났다. 최근의 연구는 시클로파민이 배양된 수모세포종 세포의 성장 및 동종이식을 억제하는 것을 제시한다. 이 Daoy 세포 모델 시스템을 사용하여, 헤지호그 신호전달 경로의 강력한 억제제가 확인될 수 있다. 본 발명의 화합물은 헤지호그 길항제이므로, 상기 종양 유형의 치료를 위해 적합하다.

생물학적 활성 IC ₅₀ 의 결정: Daoy 세포에서의 Gli1 의 억제를 측정하기 위한 기능적 검정

다음 검정 프로토콜 및 그의 결과는 본발명의 화합물 및 방법의 이용 및 효능을 추가로 나타낸다. 기능적 검정은 본 발명의 화합물이 Shh 신호전달을 억제하는 능력을 나타낸다는 것에 대한 증거를 제공한다. 다음 검정에서 사용된 모든 리간드, 용매 및 시약은 상업적 공급원으로부터 쉽게 구할 수 있거나 또는 당업자에 의해 쉽게 제조될 수 있다.

생물학적 활성은 Daoy 신경암 세포에서 기능적 검정을 사용하여 결정되고, bDNA (분지 데옥시리보핵산) 검정 시스템 (파토믹스, 인크. (Panomics, Inc.), 프레몬트, 캘리포니아 (Fremont, CA))을 통해 Gli1 리보핵산의 수준을 측정한다. Gli1은 교아세포종 세포주에서 최초에 발견되었고, Shh 신호전달에 의해 활성화되는 아연 핑거 (finger) 단백질을 코딩한다. 최대 반응은 조건화 배지 함유 Daoy 세포 (인간 배아 신장, 재조합 Shh를 안정적으로 발현하는 HEK-293 세포)에서 Gli1 전사를 24시간 동안 유도하고, 이어서 자극된 Gli1 전사체의 양을 측정함으로써 수득된다. 최소 반응은 조건화 배지로 24시간 동안 자극된 Daoy 세포 (인간 배아 신장, 재조합 Shh를 안정적으로 발현하는 HEK-293 세포)에서 대조군 화합물로 억제된 Gli1 전사체의 양이다.

bDNA 검정 시스템은 표적 리보핵산 (전사체)이 증폭되도록 분지쇄 DNA의 기술을 이용한다. 기술은 혼성화 신호를 증폭하기 위해 표적 전사체와 복합체로서 혼성화되는 표적 전사체의 특이성을 결정하는, 3가지 유형의 합성 혼성 짧은 Gli1-특이적인 cDNA 프로브 [포획 연장제 (CE), 표지 연장제 (LE) 및 차단제 (BL)]를 사용한다. 증폭 단계 중 화학루미제닉 (chemilumigenic) 기질의 첨가는 발광을 사용한 검출을 가능하게 한다.

Daoy 세포를 조직 배양 T225-플라스크에서 최소 필수 배지 (MEM) 및 0.1 nM 비-필수 아미노산 및 1 mM 나트륨 피루베이트 함유 10% 소 태아 혈청 (FBS) 함유 Daoy 성장 배지 중에서 전면성장으로 성장시켰다. 세포를 트립신 에틸렌디아민테트라아세트산 (EDTA)을 사용하여 T225-플라스크로부터 제거하고, 원심분리하고, 배지 중에 재현탁시키고, 이어서 계수하였다.

Daoy 세포를 이어서 코스타 (Costar) 96 웰 맑은 조직 배양 플레이트에서 성장 배지 중에 웰 당 50,000 세포로 시딩 (seed)하고, 5% 이산화탄소 (CO₂) 하에 밤새 37℃에서 인큐베이션되도록 하였다. 세포를 포스페이트 완충된 염수 (PBS) 중에서 1회 세척하고, 이어서 Gli1 발현의 수준을 자극하기 위해 100 μL의 Shh 조건화 배지 (Shh-CM)를 첨가하였다. 최대 자극을 달성하기 위해 조절 성장 배지 - 0.1% FBS/DMEM (둘베코스 변형된 이글 배지 (Dulbeccos Modified Eagle Medium))를 사용하여 Shh-CM을 희석하였다. Shh-CM으로 처리된 Daoy 세포를 이어서 대략 1 μM 내지 0.1 nM의 범위의 다양한 농도의 헤지호그 억제제로 처리하였다. 시험 화합물을 24시간 동안 37℃에서 5% CO₂하에 인큐베이션되도록 하였다.

제조자 (파노믹스, 인크.)에 의해 설명된 바와 같이 퀀티진 (Quantigene) 2.0 Gli1 검정을 사용하여 Gli1 전사체의 측정을 수행하였다. 프로테이나제 K를 포함하는 희석된 용균 혼합물 (DLM) 완충제를 제조하였다. 화합물과 함께 24시간 인큐베이션 후, 세포를 PBS로 1회 세척하고, 180 μL의 DLM을 세포에 첨가하였다. 용균 완충제를 함유하는 세포 플레이트를 밀봉하고 55℃에서 30 내지 45분 동안 놓아두었다. 생성된 세포 용해물을 이어서 5회 연화처리하였다. 제조자의 지시에 따라 DLM 중에 프로브를 희석함으로써 Gli1 프로브를 함유하는 작용 프로브 세트를 만들고, 이어서 20 μL의 작용 프로브 세트를 80 μL의 Daoy 용해물과 함께 bDNA 검정 플레이트에 첨가하였다. 플레이트를 밀봉하고 밤새 55℃에서 인큐베이션하였다. bDNA 플레이트를 이어서 제조자의 지시에 따라 처리하였다. 발광을 검출하는 퍼킨 엘머 엔비젼 리더 (Perkin Elmer Envision reader) 상에서 플레이트를 판독함으로써 신호를 정량하였다. 발광 신호는 샘플에 존재하는 표적 전사체의 양에 정비례한다.

기능적 검정으로부터의 발광 신호 데이터를 사용하여 시험관내 검정에 대한 IC₅₀을 계산하였다. 데이터를 최대 대조군 값 (Shh-CM으로 처리된 Daoy 세포) 및 최소 대조군 값 (Shh-CM 및 억제 농도의 대조군 화합물, 1 μM의 N-(3-(1H-벤조[d]이미다졸-2-일)-4-클로로페닐)-3,5-디메톡시벤즈아미드로 처리된 Daoy 세포)을 기반으로 하여 계산하였다. 활성염기 (ActivityBase) 소프트웨어 프로그램 버전 5.3, 식 205 (검정 지침 설명서 (Assay Guidance Manual) 버젼 5.0, 2008, 일라이 릴리 앤드 캄파니 (Eli Lilly and Company) 및 NIH 케미칼 지노믹스 센터 (NIH Chemical Genomics Center))를 사용하여 4 파라미터 로지스틱 곡선 그래프를 사용하여 IC₅₀ 값을 생성하였다.

기재된 프로토콜에 따라, 본원에 예시된 화합물은 40 nM 미만의 IC₅₀을 나타냈다. 예를 들면, 실시예 1a의 화합물은 상기 기재된 검정에서 대략 2.4 nM의 IC₅₀을 갖고, 표준 오차는 0.5 (n=7, 기하 평균 및 기하 표준 오차로서 계산됨)이다. 이들 결과는 본 발명의 화합물이 강력한 헤지호그 길항제이고, 따라서 항암제로서 유용하다는 증거를 제공한다.

CYP3A4 억제 검정

인큐베이션 샘플을 인간 간 마이크로좀 제제를 시험 억제제 (최종 농도 0.05 mg/mL 단백질, 10 μM 억제제 (100 mM NaPO₄ 중), pH 7.4 완충제)에 첨가하고 혼합함으로써 제조하였다. 샘플을 대략 5분 동안 37℃에서 예비-인큐베이션하였다. 예비-인큐베이션 기간에 이어서, NADPH 및 미다졸람 함유 용액을 효소 기질로서 첨가함으로써 반응을 개시하였다 (최종 농도 1 mM NADPH, 5 μM 미다졸람). NADPH 용액의 첨가 후, 샘플을 3분 동안 대략 37℃에서 인큐베이션하였다. 인큐베이션 기간에 이어서, 50 μL의 메탄올 (크로마토그래피에 대한 내부 기준임)의 첨가에 의해 반응물을 켄칭 (quench)하고, 샘플을 잘 혼합하였다. 반응을 켄칭한 후, 혼합물을 대략 4000 rpm으로 15분 동안 대략 5℃에서 원심분리하고, LC/MS 분석에 의해 분석하였다.

짧은 통상의 C18 컬럼 (로딩 이동상 - 95/5 밀리-큐 (Milli-Q)(등록상표) 1% 아세트산 함유 H₂O/메탄올 (v/v). 이동상 B - 80/20 밀리-큐 (등록상표) 1% 아세트산 함유 H₂O/메탄올 (v/v). 이동상 C - 5/95 밀리-큐 (등록상표) 1% 아세트산 함유 H₂O/메탄올 (v/v). 세정 이동상 - 75/25 밀리-큐 (등록상표) H₂O/아세토니트릴 (v/v)) 상의 구배 용출을 갖는 HPLC/MS를 사용하여 샘플을 분석하였다.

샘플을 선택 이온 관찰 (Selected Ion Monitoring (SIM))을 위해 342.1 (1-OH-미다졸람) 및 346.1 (α-히드록시미다졸람-d4 내부 기준)의 질량으로 터보이온 스프레이 (TurboIon Spray)를 사용하여 양성 조건하에 질량 스펙트럼 분석기 (Mass Spectral Analyzer)에 주사하였다. 데이터를 10 μM의 억제제 농도의 존재하에 1-OH-미다졸람의 형성의 % 억제로서 보고하였다.

기재된 프로토콜에 따라, 실시예 1a는 13.5% CYP3A4 억제를 나타냈다. 낮은 가역 CYP3A4 억제 잠재력을 나타내는 화합물, 예를 들면 실시예 1a는 약물 투여량 변화 또는 환자에서 약물 치료를 중단할 필요를 야기할 수 있는 다른 약물과의 음성 상호작용에 대한 감소된 가능성을 갖는다. 따라서, 상기 화합물은 바람직하고, 개선된 안전성 프로파일을 갖는다.

CYP3A 의 시험관내 메카니즘 -기반 억제

실시예 1a의 화합물은 이 상호작용에 대해 K_불활성화 및 K_I의 운동 상수를 수득하는 것을 목적으로 하는 CYP3A의 메카니즘-기반 억제제로서 평가되었다. (K_불활성화는 불활성 효소 복합체 형성의 최대 속도 상수이다. K_I는 최대 불활성화의 반에서의 농도이다). 화합물을 인간 간 마이크로좀 (CYP3A4 활성의 높은 발현의 인간 간 마이크로좀의 풀 (pool))과 함께 2 단계 시험관내 인큐베이션 (억제제가 효소를 불활성화시킬 수 있도록 하는 불활성화 반응 및 프로브로서 미다졸람의 1'-히드록실화를 사용하여 마이크로좀 단백질의 남아있는 활성을 평가하는 활성 검정)으로 인큐베이션 하였다.

1 mM NADPH (니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 포스페이트, 환원됨)의 부재 또는 존재하에 100 mM 나트륨 포스페이트 완충제 (pH 7.4), 1 mM EDTA (에틸렌디아민테트라아세트산)를 함유하는 불활성화 반응물 (100 μL의 최종 부피)을 0.75 μM 내지 24 μM의 범위 농도의 시험 화합물과 함께 3분 동안 37℃에서 3벌로 예비인큐베이션하였다. 불활성화 반응을 높은 CYP3A 활성 마이크로좀 풀 (쎌즈다이렉트 (CellzDirect), 오스틴 텍사스 (Austin TX), 0.5 mg/mL)의 첨가에 의해 개시하였다. 여러 시점 (0, 2.5, 5, 10 및 30분)에서, 불활성화 반응 혼합물의 5 μL 분취액을 채취하고, 1 mM NADPH 및 미다졸람 (100 μM) 함유 예비가온된 (37℃) CYP3A4 활성 검정 인큐베이션 시스템 (95 μL)으로 1/20으로 희석하였다. 0.025 mg/mL의 최종 단백질 농도 및 1/20의 억제제 농도에서 상기 활성 검정 혼합물을, 50 μL의 MeOH의 첨가에 의해 반응을 중단시키기 전에 추가의 1분 동안 인큐베이션하였다 (37℃). 샘플을 혼합하고, 변성 단백질을 4000 rpm에서 10분 동안 원심분리함으로써 제거하였다.

1'-OH 미다졸람의 형성을 페노메넥스 시너지 4μ 히드로-RP (Phenomenex Synergi 4μ Hydro-RP) 컬럼 (이동상 A - 95/5 밀리-큐 (등록상표) 5 mM 암모늄 아세테이트 함유 H₂O/메탄올 (v/v), 이동상 B - 5/95 밀리-큐 (등록상표) 5 mM 암모늄 아세테이트 함유 H₂O/메탄올 (v/v), 니들 워시 용매 (Needle Wash Solvent) A - 90/10 아세토니트릴/밀리-큐 (등록상표) H₂O (v/v) 중의 0.4% 트리플루오로아세트산, 니들 워시 용매 B - 50/50 밀리-큐 (등록상표) H₂O/메탄올 (v/v)) 상의 구배 용출을 갖는 LC/MS/MS에 의해 분석하였다. 샘플을 선택 반응 관찰 (Selected Reaction Monitoring)을 위해 342.0 (1-OH-미다졸람) 및 347.0 (α-히드록시미다졸람-d3 내부 기준)의 질량으로 사이엑스 (Sciex) API 4000에 터보이온 스프레이를 사용하여 양성 조건하에 주사하였다.

마이크로좀 인큐베이션에서의 1'-OH 미다졸람 형성 (CYP3A4 활성)의 손실을 각각의 시험 화합물 농도에 대한 로그 퍼센트 잔여 CYP3A4 활성 대 예비인큐베이션 시간의 함수로서 그래프로 나타냈다. 하기 식을 데이터에 맞추기 위해 불활성화에 대한 운동 파라미터를 윈논린 프로페셔널 (WinNonlin Professional)을 사용하여 결정하였다:

실시예 1a의 화합물에 대한 활성의 손실은 11% 내지 22%의 범위였고, 농도 의존적이 아니었다. 따라서, 식 2로부터의 k_불활성화 및 K_I에 대한 값을 결정할 수 없었다. 이들 데이터를 기반으로 하여, 실시예 1a의 화합물은 CYP3A4의 메카니즘 기반 억제제가 아니다. 메카니즘-기반 비가역 CYP3A4 억제 잠재력을 전혀 나타내지 않거나 낮게 나타내는 화합물, 예를 들면 실시예 1a는 약물 투여량 변화 또는 환자에서 약물 치료를 중단할 필요를 야기할 수 있는 다른 약물과의 음성 상호작용에 대한 감소된 가능성을 갖는다. 따라서, 상기 화합물은 바람직하고, 개선된 안전성 프로파일을 갖는다.

Claims (12)

1. 하기 화학식의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염.
   

   

   
   상기 식에서,
   R¹은 수소 또는 메틸이고;
   R²는 수소 또는 메틸이고;
   R³, R⁴, R⁵, R⁶ 또는 R⁷은 독립적으로 수소, 플루오로, 클로로, 시아노, 트리플루오로메틸, 트리플루오로메톡시, 디플루오로메톡시, 메틸술포닐 또는 트리플루오로메틸술포닐이되, 단 R³, R⁴, R⁵, R⁶ 및 R⁷ 중 3개 이상이 수소이다.
2. 제1항에 있어서, R¹이 메틸인 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염.
3. 제2항에 있어서, R²가 메틸인 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염.
4. 제3항에 있어서, R³, R⁴, R⁵, R⁶ 및 R⁷이 독립적으로 수소, 플루오로, 클로로, 트리플루오로메틸 또는 메틸술포닐인 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염.
5. 제4항에 있어서, R³, R⁴, R⁵, R⁶ 및 R⁷이 독립적으로 수소, 플루오로 또는 트리플루오로메틸인 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염.
6. 제5항에 있어서, R⁴, R⁶ 및 R⁷이 수소인 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염.
7. 제6항에 있어서, 4-플루오로-N-메틸-N-(1-(4-(1-메틸-1H-피라졸-5-일)프탈라진-1-일)피페리딘-4-일)-2-(트리플루오로메틸)벤즈아미드인 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염.
8. 제7항에 있어서, 4-플루오로-N-메틸-N-(1-(4-(1-메틸-1H-피라졸-5-일)프탈라진-1-일)피페리딘-4-일)-2-(트리플루오로메틸)벤즈아미드 히드로클로라이드인 화합물.
9. 삭제
10. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염을 포함하는, 암의 치료를 위한 제약 조성물.
11. 삭제
12. 삭제