KR101320059B1

KR101320059B1 - 재조합 벡터, 상기 벡터를 포함하는 재조합 효모 및 상기 효모를 이용한 글루코스 옥시다아제의 대량 생산 방법

Info

Publication number: KR101320059B1
Application number: KR1020110106598A
Authority: KR
Inventors: 조형래; 문승배; 김기영; 김주완; 임종민; 라채훈; 신현동; 구세광; 손재학; 신동건
Original assignee: 주식회사 글루칸
Priority date: 2011-10-18
Filing date: 2011-10-18
Publication date: 2013-10-18
Also published as: KR20130042346A; WO2013058516A1

Abstract

본 발명은 재조합 벡터와 재조합 효모를 이용한 글루코스 옥시다아제의 대량 생산에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 변형된 글루코스 옥시다아제 유전자를 포함하는 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터로 형질전환된 재조합 효모, 상기 재조합 효모에서 박테리아 헤모글로빈 유전자를 추가로 포함하는 재조합 효모, 및 상기 재조합 효모를 이용한 글루코스 옥시다아제의 제조 방법에 관한 것이다. 상기에서 제조된 글루코스 옥시다아제는 유기산 칼슘을 제조하는 데 사용될 수 있으며, 상기 유기산 칼슘은 골다공증 또는 관절염을 포함하는 골대사 질환의 예방 및 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

재조합 벡터, 상기 벡터를 포함하는 재조합 효모 및 상기 효모를 이용한 글루코스 옥시다아제의 대량 생산 방법 {Recombinant vector, recombinant yeast containing the vector, and mass-producing method of glucose oxidase using the yeast}

칼슘은 단순한 뼈의 구성요소만이 아니라 뼈에 작용하는 각종 호르몬과 신진대사를 조절하는 매우 중요한 무기물로서 성장기 청소년 및 성인들의 골다공증 예방 및 치료에 중요한 미네랄이다. 또한, 유기 칼슘제가 무기 칼슘보다 높은 용해도로 체내에 흡수되기 때문에, 글루콘산 칼슘 등의 유기 칼슘제를 중심으로 골다공증 관련 시장이 빠르게 재편 및 확대되고 있으며, 이러한 골다공증 관련 세계시장은 2015년까지 연 6.0% 이상 성장하고 2050년에는 1,060억불 규모에 이를 것으로 예측되고 있다.

종래에 유기산 칼슘의 제조법으로 화학적 산화법, 전기분해법, 발효법 및 효소법 등이 알려져 있기는 하나, 이중 화학적 산화법과 전기분해법은 낮은 수율, 산업폐수의 야기 및 기술적인 문제로 인하여 현재는 거의 사용하지 않고 있으며, 발효법에 의하여 글루콘산 칼슘을 생산할 경우 원료를 전처리하여야 하고 발효균주의 보존과 복잡한 정제과정 등이 문제가 되고 있는 실정이다.

따라서, 미생물 대신 효소를 이용함으로써 제조 공정을 간단히 하고자 하는 시도가 있으며, 유기산 칼슘의 제조에 사용될 수 있는 효소로 글루코스 옥시다아제를 들 수 있다.

글루코스 옥시다아제(glucose oxidase)는 β-D-글루코스를 글루코노-δ-락톤으로 산화하고 동시에 산소 분자를 과산화수소로 환원하는 반응을 촉매하는 효소로, 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger)의 세포액에서 처음으로 발견되었다 (Biochem. Z. 199;136-170, 1928). 또한, 글루코스 옥시다아제는 포도당으로부터 글루콘산 칼슘 등의 유기산 칼슘을 제조하는 과정을 촉매하므로, 유기산 칼슘의 제조에 사용될 수 있다.

글루코스 옥시다아제의 상업적 생산은 주로 아스퍼질러스속이나 페니실리움속 균주를 이용하여 이루어지고 있는데, 생산 균주의 종류가 제한되어 있어 산업적 이용에 어려움이 있다. 따라서, 글루코스 옥시다아제의 생산성 향상을 위해서 유전자 재조합 후 다시 아스퍼질러스속 또는 효모에 도입하여 제조하기도 한다.

예로서, 유럽공개특허 제0665291호는 아스퍼질러스 퍼티더스의 글루코스 옥시다아제 유전자를 글루코아밀라제의 프로모터와 재조합시켜 아스퍼질러스 퍼티더스에 도입하는 기술을 제공하고 있으며, 미국등록특허 제 5,266,688호는 아스퍼질러스 나이거의 글루코스 옥시다아제 유전자를 ADH2/GAP 프로모터와 효모의 알파인자 신호서열에 연결시킨 후 효모 발현 벡터에 도입하여 효모에 형질전환하는 기술을 제공하고 있으며, 국내등록특허 제10-0328639호는 아스퍼질러스 나이거의 글루코스 옥시다제의 신호서열과 그 구조유전자로 구성되는 발현 플라스미드에 GAL10 프로모터와 GAL7 터미네이터를 연결시켜 벡터를 제조하고 효모에 형질전환하는 기술을 제공하고 있다.

그러나, 종래 기술들은 여전히 글루코스 옥시다아제의 산업적 이용을 위한 생산 수율에는 미치지 못하고 있으며, 글루코스 옥시다아제의 생산 수율을 더욱 높일 수 있는 유전자 재조합 기술의 개발이 요구되고 있다.

이에, 본 발명자들은 종래의 유전자 재조합적 발현에서 주로 사용되던 아스퍼질러스 나이거의 글루코스 옥시다아제 유전자를 변형하여 효모에서의 발현에 적합한 새로운 글루코스 옥시다아제 유전자 염기서열을 고안하였고, 상기 유전자에 신호서열을 연결하여 효모에서 외부로 글루코스 옥시다아제를 분비하는 효율을 높일 수 있는 새로운 재조합 벡터 및 재조합 균주를 개발하였다. 나아가, 본 발명자들은 상기 재조합 균주에 박테리아 헤모글로빈 유전자를 추가로 도입함으로써, 재조합 균주를 산업용 균주로 개량하는 기술을 완성하였으며, 산업적 생산에 이용하기 위한 최적의 배양조건을 확립하였다.

본 발명의 하나의 목적은 서열번호 1의 글루코스 옥시다아제 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 하나의 목적은 상기 서열번호 1의 글루코스 옥시다아제 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 재조합 효모를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 하나의 목적은 상기 재조합 벡터로 형질전환되며, 박테리아 헤모글로빈 유전자를 추가로 포함하는 재조합 효모를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 하나의 목적은 상기 재조합 효모를 배양하는 단계를 포함하는 글루코스 옥시다아제를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 하나의 목적은 상기 제조된 글루코스 옥시다아제를 이용하여 유기산 칼슘을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 하나의 목적은 상기 제조된 유기산 칼슘을 포함하는 골대사 질환의 예방 및 치료용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 하나의 목적은 상기 제조된 유기산 칼슘을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 골대사 질환의 치료방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 서열번호 1의 글루코스 옥시다아제 유전자를 포함하는 재조합 벡터에 관한 것이다.

본 발명에서 용어, "글루코스 옥시다아제(glucose oxidase, GOx)" 는 β-D-글루코스를 글루코노-δ-락톤으로 산화하고 동시에 산소 분자를 과산화수소로 환원하는 반응을 촉매하는 효소를 말한다. 종래에 유전자 재조합적 발현에 주로 사용되던 글루코스 옥시다아제는 아스퍼질러스 나이거의 글루코스 옥시다아제로서, 분자량은 150~180 kDa이고 두 분자의 FAD (flavin adenine dinucleotide)와 매우 견고하게 결합되어 있는 당단백질이며, 각 2개의 동일한 서브유닛 (각 70-80kDa)로 이루어져 있다.

본 발명에서는 효모 내에서 글루코스 옥시다아제의 발현율을 향상시키기 위하여, 효모(Saccharomyces cerevisiae)의 코돈 선호도에 맞게 아스퍼질러스 나이거의 글루코스 옥시다아제 유전자를 변형시킨 새로운 유전자 염기서열을 고안하여 사용하였다. 상기 본 발명에서 새로 합성한 글루코스 옥시다아제 유전자는 서열번호 1의 염기서열을 가지는 것으로서, 신호 서열을 제외한 성숙 글루코스 옥시다아제 유전자(mature GOx)로 구성되어 있다. 상기 염기서열은 아스퍼질러스 나이거의 유전자 염기서열(GenBank: J05242.1)과 76%의 상동성을 보이며, CAI(Codon Adaptation Index)가 0.86이고, GC 함량이 53% 이다.

본 발명의 재조합 벡터는 프로모터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널, 인핸서 같은 발현 조절 엘리먼트, 또는 막 표적화 또는 분비를 위한 신호 서열을 추가로 포함할 수 있다.

바람직한 양태로서, 본 발명의 재조합 벡터는 효모 내에서 글루코스 옥시다아제의 발현율을 향상시키기 위한 최적의 벡터 구성으로서, GPD(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase) 프로모터, MFα(alpha-mating factor) 신호 서열 및 GPD 터미네이터를 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 구체적인 실시예에서 사용한 MFα 신호 서열을 서열번호 2, GPD 프로모터를 서열번호 3, 및 GPD 터미네이터의 서열을 서열번호 4에 각각 나타내었다.

바람직한 양태로서, 본 발명의 재조합 벡터는 형질 전환시 효모의 염색체 DNA에 삽입되어 안정적으로 유지시키는 벡터를 기본 벡터로 사용할 수 있으며, 예컨대, Takara사의 pAUR101를 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

바람직하게, 본 발명의 재조합 벡터는 도 1의 개열지도를 가지는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 서열번호 1의 글루코스 옥시다아제 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 재조합 효모에 관한 것이다. 바람직하게, 상기 효모는 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)이다. 본 발명의 구체적인 실시예에서는, 모균주로서 사카로마이세스 세레비지애 ByGx 를 사용하였다. 상기 모균주 ByGx는 기탁번호 ATCC 4003219 의 균주로, 유전형(Genotype)이 "MATa his3Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0" 으로 알려진 균주이다.

본 발명의 구체적인 실시예에서는, 상기 도 1의 재조합 벡터로 형질전환시킨 효모(Saccharomyces cerevisiae)들이 모두 모균주에 비하여 1.4 배 이상의 글루코스 옥시다아제 활성 증가를 나타내며, 가장 많게는 2.08 배의 글루코스 옥시다아제 활성 증가를 나타낸다는 것을 확인하였다 (표 1 참조). 상기 글루코스 옥시다아제 활성 증가가 가장 높게 나타난 균주를 사카로마이세스 세레비지애 DG-5 로 명명하였다.

또 하나의 바람직한 양태로서, 본 발명의 재조합 효모는 상기 서열번호 1의 염기서열을 포함하는 재조합 벡터로 형질전환되며, 박테리아 헤모글로빈 유전자를 추가로 포함하는 재조합 효모에 관한 것이다.

본 발명에서는 상기 서열번호 1의 글루코스 옥시다아제 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 효모에, 추가적으로 박테리아 헤모글로빈 유전자를 도입시켜 글루코스 옥시다아제의 생산성을 극대화시키고자 하였다.

바람직하게, 상기 박테리아 헤모글로빈은 비트리오실라의 헤모글로빈(Vitreoscilla hemoglobin)일 수 있다. 본 발명의 구체적인 실시예에서 사용한 비트리오실라의 헤모글로빈 유전자의 염기서열을 서열번호 5에 나타내었다.

바람직하게, 본 발명의 재조합 효모는 비트리오실라의 헤모글로빈 유전자가 효모 염색체 상의 pmt1 유전자 부위에 삽입되어 있는 것일 수 있다.

본 발명의 구체적인 실시예에서는, 상기에서 미리 제조한 사카로마이세스 세레비지애 DG-5 균주에, 추가적으로 비트리오실라의 헤모글로빈 유전자를 도입한 새로운 재조합 효모를 제조하였으며, 이를 사카로마이세스 세레비지애 DGVh 로 명명하였다. DGVh 균주는, 모균주인 DG-5 균주보다 약 2배 이상의 글루코스 옥시다아제 활성을 나타내었으며, 이는 DG-5 의 모균주에 해당하는 ByGx 균주의 약 4배 이상에 해당하는 놀라운 수율 향상을 나타내는 것이다 (표 2 참조). 이에, 본 발명자들은 상기 사카로마이세스 세레비지애 DGVh 균주를 2011년 9월 20일자로 KCTC(Korean Colletion for Type Cultures, 대전광역시 유성구 과학로 111번지 생명공학연구소 유전자원센터)에 기탁하여 수탁번호 KCTC12020BP 를 부여받았다.

따라서, 바람직하게, 본 발명의 재조합 효모는 수탁번호 KCTC12020BP 의 균주일 수 있다.

또한 바람직하게, 본 발명의 재조합 효모는 비트리오실라의 헤모글로빈을 포함하는 재조합 벡터가 추가로 형질전환됨으로써 비트리오실라의 헤모글로빈 유전자를 포함하는 것일 수 있다.

보다 바람직하게, 상기 비트리오실라의 헤모글로빈을 포함하는 재조합 벡터는 TEF1 프로모터, 비트리오실라의 헤모글로빈 유전자 및 CYC1TT 전사 터미네이터로 구성된 카세트를 포함할 수 있다. 본 발명의 구체적인 실시예에서는, 상기 TEF1 프로모터, 비트리오실라의 헤모글로빈 유전자 및 CYC1TT 전사 터미네이터로 구성된 카세트를 synTVHb (또는 TVHb)로 명명하고, 그 염기서열을 서열번호 6에 나타내었다.

보다 바람직하게, 상기 비트리오실라의 헤모글로빈을 포함하는 재조합 벡터는, 비트리오실라의 헤모글로빈 유전자를 효모의 염색체 내 pmt1 유전자 부위에 상동 재조합에 의하여 안정적으로 삽입시키기 위한 구성으로서, pmt1 유전자와 상동인 제1영역, TEF1 프로모터, 비트리오실라의 헤모글로빈 유전자, CYC1TT 전사 터미네이터, 선별마커 유전자, 및 pmt1 유전자와 상동인 제2영역을 포함할 수 있다. 상기 선별마커 유전자는 바람직하게는 URA3 유전자일 수 있다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 재조합 효모를 배양하는 단계를 포함하는 글루코스 옥시다아제를 제조하는 방법에 관한 것이다. 배지와 배양조건은 숙주 세포에 따라 관용되는 것을 적당히 선택하여 이용할 수 있다. 배양 시 세포의 생육과 단백질의 대량 생산에 적합하도록 온도, 배지의 pH 및 배양시간 등의 조건들을 적절하게 조절할 수 있다.

바람직하게, 본 발명은 상기 재조합 효모들을 산업적 생산에 이용하기 위한 최적의 배양조건을 확립하였다. 상기 재조합 효모를 배양하는 단계는 다음 중 어느 하나의 배양 조건을 포함할 수 있다:

(a) 초기 균 접종 농도가 10 내지 20%,

(b) 탄소원으로 수크로스를 20 내지 40 g/l 로 포함,

(c) 질소원으로 효모 추출물을 20 내지 40 g/l 로 포함,

(d) 발효기 내 교반속도가 200 내지 400 rpm,

(e) 배양 중 산소 공급량이 1.0 내지 1.6 vvm, 또는

(f) pH 6 내지 7, 및 온도 20 내지 50 ℃.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 글루코스 옥시다아제를 이용하여 유기산 칼슘을 제조하는 방법에 관한 것이다. 바람직하게, 상기 유기산 칼슘은 글루콘산 칼슘이다. 글루코스 옥시다아제는 포도당으로부터 글루콘산 칼슘 등의 유기산 칼슘을 제조하는 과정을 촉매하므로, 유기산 칼슘의 제조에 사용될 수 있다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 제조된 유기산 칼슘을 포함하는 골대사 질환의 예방 및 치료용 조성물에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 상기 제조된 유기산 칼슘을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 골대사 질환의 치료방법에 관한 것이다.

바람직하게, 상기 골대사 질환은 골다공증 또는 관절염을 포함한다.

본 발명의 골대사 질환의 예방 및 치료용 조성물은 공지의 골대사 질환 치료제를 추가로 포함할 수 있다. 바람직하게는, 베타 글루칸(β-glucan)을 추가로 포함할 수 있다. 베타 글루칸은 미생물, 곡물, 버섯, 해초, 효모 등에서 추출되는 글루코스(glucose)의 폴리머를 말한다. 베타 글루칸은 골절 및 염증 등 골대사 질환의 치료제로 알려져 있으므로 본 발명에서 수득된 유기산 칼슘과 함께 골대사 질환의 치료 및 예방용 조성물에 포함될 수 있다.

또한, 상기 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체를 추가적으로 포함하여 제제화될 수 있으며, 예컨대 약학적으로 허용 가능한 담체로 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 또는 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액 및 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 또는 정제로 제제화 할 수 있다.

본 발명의 재조합 벡터를 포함하는 재조합 효모는 글루코스 옥시다아제의 생산 수율이 모균주에 비하여 월등히 우수하므로, 글루코스 옥시다아제의 생산비를 절감하여 산업적으로 유용하게 활용될 수 있다. 또한, 본 발명에서 제조된 글루코스 옥시다아제는 유기산 칼슘의 제조에 이용되어 골다골증 또는 관절염을 포함하는 각종 골대사 질환의 치료제를 제공하는 데 이용될 수 있다.

도 1은 글루코스 옥시다아제(이하, GOx) 유전자 발현을 위한 재조합 플라스미드의 제조 과정을 나타낸 것이다.
도 2는 S. cerevisiae BY4741, S. cerevisiae ByGx 및 S. cerevisiae DG-5 의 GOx 생산량을 SDS-PAGE 로 확인한 결과를 나타낸다.
도 3은 효모 염색체 상의 pmt1 유전자에 비트리오실라의 헤모글로빈 유전자(VHb)를도입하기 위한 VHb 발현 카세트의 제조 과정을 나타낸 것이다.
도 4의 (a) 는 TVHb, Pmt1U 및 URA 각각의 DNA 단편이 PCR 로 증폭되었음을 확인한 전기영동 결과를 나타내고, (b) 는 TVHb-URA 의 DNA 단편이 PCR 로 증폭되었음을 확인한 전기영동 결과를 나타내고, (c) 는 Pmt1U- TVHb-URA 의 DNA 단편이 PCR 로 증폭되었음을 확인한 전기영동 결과를 나타내고, (d) 는 형질전환 효모 균주 내에 Pmt1U- TVHb-URA 가 존재하는 것을 확인한 전기영동 결과를 나타낸다.
도 5는 S. cerevisiae BY4741, S. cerevisiae ByGx, S. cerevisiae DG-5 및 S. cerevisiae DGVh 에서 생산된 GOx 의 분자량을 비교한 결과를 나타낸다.
도 6은 환 크기를 이용한 효소 활성 테스트 결과를 나타낸다.
도 7은 pH 및 온도에 따른 GOx 활성을 나타낸다.
도 8은 초기 균 접종 농도에 따른 균체의 생장 및 GOx 활성을 나타낸다.
도 9는 배지 내 탄소원의 종류에 따른 균체의 생장 및 GOx 활성을 나타낸다.
도 10은 배지 내 질소원의 농도에 따른 균체의 생장 및 GOx 활성을 나타낸다.
도 11은 교반 속도에 따른 균체의 생장 및 GOx 활성을 나타낸다.
도 12는 통기량에 따른 균체의 생장 및 GOx 활성을 나타낸다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 염색체 삽입형 글루코스 옥시다아제 유전자 발현 재조합 균주의 제조

1-1. 글루코스 옥시다아제 유전자 합성

본 발명자들은 효모 내에서 글루코스 옥시다아제(이하, GOx)의 발현율을 높이기 위하여 GOx 유전자의 염기서열을 발현 숙주인 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)의 코돈 선호도(codon usage)에 맞게 변형하여 인공적으로 합성하였다. 본 발명에서 새로이 합성한 GOx 유전자는 신호 서열을 제외한 성숙 GOx (mature GOx)부분으로 구성되어 있으며, 그 염기서열을 서열번호 1에 나타내었다. 상기 합성된 GOx 유전자의 염기서열은 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger) 의 유전자 염기서열(GenBank: J05242.1)과 76%의 상동성을 보였으며 CAI(Codon Adaptation Index)가 0.86이고, GC 함량이 53%였다.

상기 성숙 GOx 유전자의 증폭을 위해 사용한 프라이머 세트는 다음과 같다.

mGOX-F: 5' -TTG CCA CAC TAC ATC AGA TCT AAC G (서열번호 7)

mGOX-R: 5'- ATT CAC GCT AGC TCA TCT CCG CCT GCG ACG CGA TCC TCT TTG CAT AGA AGC GTA GTC TTC CAA G (서열번호 8)

PCR은 Agilent사의 PfuUltra II Fusion HS DNA 중합효소를 사용하 였으며, PCR 용액은 5~30ng 주형 DNA, 0.2 uM 각 프라이머 DNA, 1mM dNTP mixture 및 1uL DNA 중합효소/50uL 의 조성으로 혼합하였으며, DNA 변성(denaturation)을 위해 95℃, DNA 합성(extension) 을 위해 72℃로 조정하였으며, 어닐링(annealing) 온도는 각 PCR 프라이머의 Tm을 고려하여 Tm-2~3℃로 조정하였다. 합성 시간(extension time)은 15~30 초/kb DNA를 기준으로 각 PCR의 조건에 맞게 조절하였다. 증폭된 DNA는 0.8%(w/v) 아가로스 젤에 로딩한 후 전기영동하여 확인하였다.

1-2. 분비 시그널 펩타이드의 유전자 합성

인공 합성된 GOx 유전자로부터 생산될 GOx의 균체 외 분비를 도모하기 위하여 효모의 대표적인 분비 시그널 펩타이드로 알려진 MFα (alpha-mating factor)의 시그널 펩타이드를 사용하였다. MFα 의 유전자의 염기서열은 서열번호 2에 나타내었다.

인공 합성된 MFα는 GOx 유전자의 업스트림 부분인 리보솜 결합 부위 등(51bp)이 포함된 인공 합성된 전방향 프라이머와 성숙 GOx의 N-말단 부분(26bp)이 포함된 역방향 프라이머를 이용하여 PCR을 통해 증폭한 후, 실시예 1에서 증폭시킨 성숙 GOx 유전자와 overlapped PCR 법을 이용하여 융합하였다.

이 때 MFα 시그널 펩타이드 유전자의 증폭을 위해 사용한 프라이머 세트는 다음과 같다.

UpGMA-F: 5'- ACT AGT GAT CAG CAA CCA GCC TTT CCT CTC TCA TTC CCT CAT CTG CCC ATC ATG AGA TTT CCT TCA ATT TTT ACT GCA (서열번호 9)

mGMA-R: 5'- CCG TTA GAT CTG ATG TAG TGT GGC AAA TGC CAA GCT TCA GCC TCT CTT TTA (서열번호 10)

1-3. 프로모터 유전자의 합성

인공 합성된 GOx 유전자를 발현하기 위한 프로모터로서, 효모의 대표적인 구성적 발현을 유도하는 GPD (glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase) 프로모터를 선정하였다. 프로모터의 합성은 PCR법으로 효모의 염색체 DNA (genomic DNA)로부터 증폭하여 얻었다. GPD 프로모터의 염기서열은 서열번호 3에 나타내었다.

이때 사용한 프라이머 세트는 다음과 같다. 특히, GPD-R 프라이머에는 GOx 유전자의 업스트림 부분인 리보솜 결합 부위 등이 포함되어 있어 Overlapped PCR를 통해 MFα 및 성숙 GOx 융합체와 쉽게 융합할 수 있다.

GPD-F: 5'-ACG TAC GAG CTC TCG AGT TTA TCA TTA TCA ATA CTC GC (서열번호 11)

GPD-R: 5'-GAG AGG AAA GGC TGG TTG CTG ATC ACT AGT GCA CTG TCG AAA CTA AGT TCT TGG TGT TTT AAA (서열번호 12)

1-4. 터미네이터 유전자의 합성

인공합성된 GOx 유전자 발현시 mRNA합성을 종료하기 위한 전사종료 DNA 로서, GPD (glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase) 터미네이터를 선정하였다. 터미네이터의 합성은 PCR법으로 효모의 염색체 DNA (genomic DNA)로부터 증폭하여 얻었다. GPD 터미네이터의 염기서열은 서열번호 4에 나타내었다.

이때 사용한 프라이머 세트는 다음과 같다. 특히, GPDT-F 프라이머에는 GOx 유전자의 C-말단 부분이 포함되어 있어 Overlapped PCR를 통해 MFα 및 성숙 GOx 융합체와 쉽게 융합할 수 있다.

GPDT-F: 5'- GGA TCG CGT CGC AGG CGG AGA TGA GCT AGC GTG AAT TTA CTT TAA ATC TTG CAT TTA A (서열번호 13)

GPDT-R: 5'- CAC TAC GCA TGC GCC AAA GAT TAC TCC TGT AGA ATT TG (서열번호 14)

1-5. 재조합 벡터의 제조 및 재조합 효모의 제조

인공 합성된 GOx 유전자를 효모 내로 도입하기 위한 벡터로서, 형질 전환시 효모의 염색체 DNA에 삽입되어 안정적으로 유지하는 것으로 알려진 Takara사의 pAUR101를 사용하였다. pAUR101 벡터는 항생제인 아우레오바시딘 A(Aureobasidin A) 에 대한 저항성을 선별 마커로 사용하기 때문에, 복합 배지에서 형질 전환체를 용이하게 선별할 수 있다.

상기 실시예 1-1 내지 1-4에서 준비한 각 DNA 단편들은 overlapped PCR법을 이용하여 GPD 프로모터-MFα 시그널 펩타이드-성숙 GOx-GPD 터미네이터의 순서로 융합하여 하나의 DNA 컨스트럭트로 만든 후, pAUR101 벡터의 SmaI 과 SphI 부위 사이에 삽입하였다. GOx 유전자 발현을 위한 재조합 플라스미드의 전체적인 제조과정은 도 1에 나타내었다.

이렇게 제조된 재조합 플라스미드를 pAURGOX 로 명명하고, 후 E. coli JM109 에 형질전환하여 대량으로 증폭한 후, 화학 형질전환법으로 효모(S. cerevisiae ByGx, ATCC 4003219) 내로 도입하여 효모의 염색체 DNA에 삽입되게 하여 GOx 유전자를 함유한 재조합 효모를 구축하였다.

실시예 2. 재조합 효모의 GOx 활성 측정

2-1. GOx 활성 측정

GOx 에 의한 산화 반응 시 1 mole 글루코스 당 동량(1mole)의 H₂O₂가 생성 되기 때문에, 상기 실시예 1에서 제조한 재조합 효모의 GOx의 활성을 측정하기 위하여 H₂O₂의 농도 변화를 이용하였다. 멸균된 배지 (1M KPO₄, 9.5mM glucose, agarose 0.7%)에 크로모겐(chromogen)인 0.2 mM o-디아니시딘과 HRP (Horse Radish Peroxidase; 250 U/mg) 10 u/ml를 첨가하여 아가 플레이트를 제조한 후 재조합 효모균을 접종하였다. 이 효모균을 1일간 30 ℃ 에서 배양한 후, 페트리디쉬 플레이트의 아가 배지 상에서 콜로니 주위의 갈색의 환(halo)이 선명하고 넓게 나타난 10여 콜로니를 선별하였다. 선별된 콜로니들은 각각 YPD 액체 배지에 접종하여 30도에서 250rpm으로 2일 동안 진탕배양 하였다. 각각의 배양액을 5000rpm으로 10분 동안 원심분리하여 상등액을 취한 후, 각 상등액의 GOx 활성을 측정하였고, 모균주(S. cerevisiae ByGx)의 GOx 활성과 비교하였다.

하기 표 1은 그 결과를 정리한 것이다. 표 1에서 나타난 바와 같이, 모든 균주가 모균주인 ByGx 보다 1.4 배 이상의 놀라운 효소 활성 증가를 나타내었다. 특히, DG-5로 명명한 균주가 가장 높은 GOx 활성을 보였으며 이는 모균주 보다 2 배 이상 향상된 결과이다. 또한 DG-5 균주는 균체량도 모균주에 비해 약 1.6배 많은 결과를 보여 이는 이 변이주가 모 균주보다 높은 균체 성장으로 인해 GOx 의 생산량이 많아진 것으로 판단되었다.

균주	균체량(OD600)	GOx 활성, U/ml	증가율(배)
모균주(ByGx)	9.73	10.13±0.15	1.00
DG-1	16.16	17.70±0.25	1.75
DG-3	14.18	11.70±0.17	1.56
DG -5	16.14	21.08±0.21	2.08
DG-6	14.18	17.70±0.23	1.75
DG-9	16.32	15.08±0.18	1.49
DG-10	12.03	14.17±0.11	1.40
DG-12	16.74	16.20±0.15	1.60
DG-13	14.75	16.95±0.17	1.67
DG-14	16.86	16.96±0.25	1.68
DG-15	14.18	17.62±0.19	1.74
DG-18	14.27	15.37±0.23	1.52
DG-22	11.30	14.32±0.09	1.42
DG-23	13.79	16.35±0.15	1.61
DG-25	17.50	15.60±0.18	1.54

2-2. GOx 의 생산량 확인

실시예 2-1에서 가장 높은 효소 활성을 나타낸 DG-5 균주에서 GOx 의 생산량을 확인하기 위하여, 클로닝 숙주(cloning host)인 S. cerevisiae BY4741, GOx 생산 재조합 균주인 S. cerevisiae ByGx 및 DG-5 의 배양 상등액을 10배 농축한 후 각 5ul 씩 Bio-Rad 사의 Any kD PAGE 젤에 로딩한 후 전기영동하여 상등액에 포함된 GOx 단백질량을 비교하여 보았다.

그 결과 도 2에 나타난 바와 같이, DG-5의 단백질 밴드의 강도 및 선명도가 높음을 알 수 있었으며, 이는 DG-5가 모균주보다 많은 양의 GOx 단백질을 생산하는 것을 알 수 있다.

실시예 3. 박테리아 헤모글로빈 도입을 통한 GOx 생산성 향상 균주의 제조

3-1. VHb ( Vitreoscilla hemoglobin ) 발현 카세트의 제조

실시예 1에서 제조한 GOx 유전자가 도입된 재조합 효모 균주의 GOx 생산성을 더욱 향상시키기 위하여, 박테리아 헤모글로빈을 추가로 도입하고자 하였다.

VHb의 아미노산 서열(GenBank: AY278220.1)을 확보하고 이를 JAVA Codon Adaptation Tool (http://www.jcat.de/)을 이용하여 S. cerevisiae 에 최적화된 DNA 염기 서열을 얻었으며, 이를 서열번호 5에 나타내었다. 또한 이를 S. cerevisiae TEF1 프로모터(GenBank: EF210199)의 염기서열 및 pYES2.1 벡터의 CYC1TT 전사종결서열과 결합시켜, VHb 발현 카세트의 전체 염기서열을 완성하였다. 완성된 염기서열은 434 bp의 TEF1 프로모터와 273 bp의 CYC1TT 터미네이터에 의해 VHb 유전자의 발현이 조절되도록 설계되어 있다. 인공 합성된 DNA의 길이는 1148bp 이며, 서열번호 6에 나타내었다.

완성된 염기서열은 바이오니아 사에 의뢰하여 DNA 단편으로 제작하고, 이를 synTVHb (또는 TVHb)로 명명하였다.

3-2. 효모 염색체의 pmt1 유전자 부위에 삽입하기 위한 VHb 발현 카세트의 제조

상기 실시예 3-1에서 제조한 VHb 발현 카세트를 효모 염색체 상의 pmt1 유전자 부위에 삽입하기 위하여, Pmt1 유전자의 일부 및 선별 마커로서 URA3 유전자를 각각 PCR 을 이용하여 제조하고, 각각의 단편을 overlapped PCR을 이용하여 VHb 발현 카세트의 양 말단에 연결시켰다 (도 3).

실시예 1에서 제조한 재조합 균주 S. cerevisiae DG5 는 URA3 결손 변이주이므로, URA3 유전자가 삽입될 경우 우라실이 결핍된 합성 배지에서도 생존하게 되어 성공적으로 균체 성장을 이루게 된다. 따라서 VHb 유전자가 삽입된 균주를 쉽게 얻을 수 있다.

1) Pmt1U DNA 단편의 합성

S. cerevisiae DG5 의 염색체 DNA(genomic DNA)를 Zymo Research사의 Bacterial/Fungal Genomic DNA 키트를 이용하여 분리하고 이를 주형 DNA로 사용하였다. 또한 Pmt1U DNA 증폭을 위하여 프라이머 Pmt-UF (ATG TCG GAA GAG AAA ACG TAC AAA CG, 서열번호 15) 및 Pmt-UR(GGT AGA GAG ATG ACG CAA GCT GAT A, 서열번호 16)를 제작하여 사용하였다. DNA 증폭을 위한 PCR은 Bio-Rad사의 iProof HF DNA 중합효소를 사용하였다.

PCR 조성물로 주형 DNA(Genomic DNA, x10 diluted) 1.0 uL, 프라이머 Pmt-UF (0.5 uM) 및 Pmt-UR(0.5 uM) 각 1.0uL, dNTP mix(200 uM each) 0.4 uL, 5x iProof HF 버퍼 4.0 uL, Sterile HPLCwater 12.4 uL 및 iProof HF DNA 중합효소(0.02U/uL final) 0.2 uL을 사용하였다.

PCR 조건으로 98℃ 에서 5분 수행하고, 98℃에서 30초, 60℃에서 30초 및 72℃에서 20초로 30사이클 수행한 후, 72℃에서 5분 수행하였다.

상기 제조된 1020 bp의 Pmt1U DNA단편은 아가로스 젤 상에서 전기영동으로 확인하였다. 아가로스 젤 상에서 확인한 DNA는 gel extraction kit를 이용하여 분리 회수하고, 각 DNA의 농도를 다시 아가로스 젤 상에서 다시 전기영동하여 분리한 후 NEB사의 1kb DNA ladder와 비교하여 결정하였다 (도 4a).

2) TVHb DNA 의 합성

실시예 3-1 에서 제조한 synTVHb 카세트에 Pmt1 유전자의 일부분을 연결하기 위하여, 실시예 3-1 에서 제조한 synTVHb 카세트 DNA 를 주형 DNA로 사용하였다. 또한 상기 DNA의 증폭을 위하여 프라이머 VHb-F(CGG CAT TGG CTC CAT TAT CAG CTT GCG TCA TCT CTC TAC CAC ACC TGT TGT AAT CGA GCT CAT AG, 서열번호 17) 및 VHb-R(CCC TTT TTT CTA CTT TTA AAA TGT TAG CTC CCT CCT CTT CGG CCG CAG CTT GCA AAT TAA AGCC, 서열번호 18)를 제작하여 사용하였다. DNA 증폭을 위한 PCR은 Bio-Rad사의 iProof HF DNA 중합효소를 사용하였으며, PCR 조건은 다음과 같다.

PCR 조성물로 주형 DNA(SynTVHb DNA, x100 diluted) 1.0 uL, 프라이머 VHb-F (0.5 uM) 및 VHb-R(0.5 uM) 각 1.0 uL, dNTP mix(200 uM each) 0.4 uL, 5x iProof HF 버퍼 4.0 uL, Sterile HPLCwater 12.4 uL 및 iProof HF DNA 중합효소(0.02U/uL final) 0.2 uL을 사용하였다.

상기 제조된 1228bp 의 synTVHb DNA단편은 아가로스 젤 상에서 전기영동으로 확인하였다. 아가로스 젤 상에서 확인한 DNA는 gel extraction kit를 이용하여 분리 회수하고, 각 DNA의 농도를 다시 아가로스 젤 상에서 다시 전기영동하여 분리한 후 NEB사의 1kb DNA ladder와 비교하여 결정하였다. (도 4a).

3) URA3 DNA 의 합성

URA3 유전자에 Pmt1 유전자의 일부분을 연결하기 위하여, ATCC로부터 구입한 S. cerevisiae 발현 벡터인 p426GPD를 주형 DNA로 사용하였다. 또한 상기 DNA의 증폭을 위하여 프라이머 URA-F (GAA GAG GAG GGA GCT AAC ATT TTA AAA GTA GAA AAA AGG GGG GTA ATA ACT GAT ATA ATT AAA TTG AA, 서열번호 19) 및 URA-R(CAA CAT TTT TTT GAC AAC TTC TGG ATC TAG TTC ATT ACC TTC TGT GTC GAT TCG GTA ATC TCC GAA CAG AAG G, 서열번호 20)를 제작하여 사용하였다. DNA 증폭을 위한 PCR은 Bio-Rad사의 iProof HF DNA 중합효소를 사용하였으며, PCR 조건은 다음과 같다.

PCR 조성물로 주형 DNA(p426GPD DNA, x100 diluted) 1.0 uL, 프라이머 URA-F(0.5 uM) 및 URA-R(0.5 uM) 각 1.0 uL, dNTP mix(200 uM each) 0.4 uL, 5x iProof HF 버퍼 4.0 uL, Sterile HPLCwater 12.4 uL 및 iProof HF DNA 중합효소(0.02U/uL final) 0.2 uL 을 사용하였다.

상기 제조된 1126bp URA DNA 단편은 아가로스 젤 상에서 전기영동으로 확인하였다. 아가로스 젤 상에서 확인한 DNA는 gel extraction kit를 이용하여 분리 회수하고, 각 DNA의 농도를 다시 아가로스 젤 상에서 다시 전기영동하여 분리한 후 NEB사의 1kb DNA ladder와 비교하여 결정하였다. (도 4a).

4) TVHb - URA DNA 단편의 연결

상기 PCR로부터 얻어진 TVHb 및 URA DNA 단편이 1:1 molar ratio가 되도록 혼합한 후 멸균 HPLC water로 100배 희석하여, 이를 두 DNA 단편을 결합을 위한 overlapped PCR를 위한 주형 DNA로 사용하였다. 이 때 사용한 DNA량은 약 1~5 ng이었으며, 다음과 같은 2 단계로 나누어진 PCR를 각각 수행함으로써 TVHb-URA DNA 단편을 연결하였다..

PCR 1단계에서는 1:1 molar ratio로 혼합된 TVHb와 URA DNA를 프라이머 첨가 없이 PCR 조성물과 혼합하여 PCR 반응을 수행하였다. PCR 조성물로 PCR 조성물로 주형 DNA(TVHb & URA DNAs, x100 diluted) 1.0 uL, dNTP mix(200uM each) 0.2 uL, 5x iProof HF 버퍼 4.0 uL, Sterile HPLCwater 14.6 uL 및 iProof HF DNA 중합효소(0.02U/uL final) 0.2 uL 을 사용하였다. PCR 조건으로 98℃ 에서 5분 수행하고, 98℃에서 30초, 50℃에서 30초 및 72℃에서 20초로 15사이클 수행한 후, 72℃에서 5분 수행하였다.

다음으로, PCR 2단계에서는 상기 1단계의 PCR 조성물에 추가로 다음의 PCR 조성물을 혼합하여 최종 부피가 40 uL 되게 한 후 PCR 반응을 수행하였다. PCR 조성물로 프라이머 VHb-F(0.5 uM) 및 URA-R(0.5 uM) 각 1.0 uL, dNTP mix(200 uM each) 0.2 uL, 5x iProof HF 버퍼 4.0 uL, Sterile HPLCwater 13.6 uL 및 iProof HF DNA 중합효소(0.02U/uL final) 0.2 uL을 사용하였다. PCR 조건으로 98℃ 에서 5분 수행하고, 98℃에서 30초, 55℃에서 45초 및 72℃에서 20초로 30사이클 수행한 후, 72℃에서 5분 수행하였다.

상기 두 단계의 PCR을 통하여 TVHb-URA DNA 단편이 결합된 2314 bp 길이의 DNA를 증폭 및 제조할 수 있었으며(도 4b), 증폭된 DNA는 아가로스 젤에서 전기영동하여 분리한 후 Zymo Research사의 Gel Extraction Kit를 이용하여 2314 bp 길이의 DNA를 정제하였다. 정제된 DNA는 Pmt1U DNA와의 결합을 위한 overlapped PCR의 주형 DNA로 사용하였다.

5) Pmt1U - TVHb - URA DNA 단편의 연결

상기 PCR로부터 얻어진 TVHb-URA DNA 단편과, Pmt1U DNA 단편을 1:1 molar ratio가 되도록 혼합한 후 멸균 HPLC water로 100배 희석하여, 이를 두 DNA 단편을 결합을 위한 overlapped PCR를 위한 주형 DNA로 사용하였다. 이 때 사용한 DNA량은 약 1~5 ng이었으며, 다음과 같은 2 단계로 나누어진 PCR를 각각 수행함으로써 Pmt1U-TVHb-URA DNA 단편을 연결하였다.

PCR 1단계에서는 1:1 molar ratio로 혼합된 TVHb-URA DNA 단편 및 Pmt1U DNA 단편을 프라이머 첨가 없이 PCR 조성물과 혼합하여 PCR 반응을 수행하였다. PCR 조성물로 PCR 조성물로 주형 DNA(Pmt1U + TVHb-URA, x100 diluted) 1.0 uL, dNTP mix(200 uM each) 0.2 uL, 5x iProof HF 버퍼 4.0 uL, Sterile HPLCwater 14.6 uL 및 iProof HF DNA 중합효소(0.02U/uL final) 0.2 uL 을 사용하였다. PCR 조건으로 98℃ 에서 5분 수행하고, 98℃에서 30초, 50℃에서 30초 및 72℃에서20초로 15사이클 수행한 후, 72℃에서 5분 수행하였다.

다음으로, PCR 2단계에서는 상기 1단계의 PCR 조성물에 추가로 다음의 PCR 조성물을 혼합하여 최종 부피가 40 uL 되게 한 후 PCR 반응을 수행하였다. PCR 조성물로 프라이머 Pmt-UF (0.5 uM) 및 URA-R(0.5 uM) 각 1.0 uL, dNTP mix(200 uM each) 0.2 uL, 5x iProof HF 버퍼 4.0 uL, Sterile HPLCwater 13.6 uL 및 iProof HF DNA 중합효소(0.02U/uL final) 0.2 uL을 사용하였다. PCR 조건으로 98℃ 에서 5분 수행하고, 98℃에서 30초, 55℃에서 45초 및 72℃에서20초로 30사이클 수행한 후, 72℃에서 5분 수행하였다.

상기 두 단계의 PCR을 통하여 Pmt1U-TVHb-URA DNA 단편이 결합된 3294 bp 길이의 DNA를 증폭 및 제조할 수 있었으며(도 4c), 증폭된 DNA는 아가로스 젤에서 전기영동하여 분리한 후 Zymo Research사의 Gel Extraction Kit를 이용하여 3294 bp 길이의 DNA를 정제하였다. 정제된 DNA는 S. cerevisiae DG5 균주의 염색체 내 Pmt1 유전자 부위에 삽입을 위한 DNA로 사용하였다.

여기서 얻어진 DNA는 아가로스 젤로부터 분리 정제한 후 S. cerevisiae DG5로 직접 형질전환시켰다. Pmt1U-TVHb-URA DNA단편은 형질전환 전에 각각의 DNA 단편들이 존재하는 지 확인하기 위하여 재료 및 방법에서 언급한 각각의 프라이머 세트를 이용하여 PCR를 통해 세 부분의 DNA 단편 들이 증폭되는지를 확인하였다.

3-3. VHb 발현 카세트가 pmt1 염색체 부위에 삽입된 재조합 효모의 제조

상기 실시예 3-2에서 제조한 Pmt1U-TVHb-URA DNA 단편 200 ng을 S. cerevisiae DG5에 형질전환하였다. 이때 형질전환은 Zymo Research사의 Yeast Transformation Kit를 사용하였다. 형질전환한 균체는 우라실이 결핍된 Yeat Synthetic medium agar plate에 도말하여 30도에서 4일간 정치 배양하여 콜로니 생성을 유도하였다.

실시예 1에서 제조한 재조합 균주 S. cerevisiae DG5 는 URA3 결손 변이주이므로, URA3 유전자가 삽입될 경우 우라실이 결핍된 합성 배지에서도 생존하게 되어 성공적으로 균체 성장을 이루게 된다. 따라서, 상기 생성된 콜로니들은 Pmt1U-TVHb-URA DNA가 S. cerevisiae DG5 내로 도입되어 염색체 내 pmt1 유전자와 상동 재조합이 일어나 URA3 유전자의 형질을 획득함으로써 균체 성장이 가능한 경우로 보았다.

상기 수득한 콜로니에서 genomic DNA를 분리하고 이를 주형 DNA로 사용하여 PCR를 통하여 Pmt1U-TVHb-URA DNA가 형질전환 균주에 존재하는 것을 확인하였다 (도 4d).

실시예 4. 형질전환 균주의 GOX 발현량

4-1. GOx 재조합 균주의 활성 측정(정성분석)

GOx 에 의한 산화 반응 시 1 mole 글루코스 당 동량(1mole)의 H₂O₂가 생성 되기 때문에, H₂O₂의 농도 변화를 이용하여 재조합 균주의 GOx 활성을 측정하였다. 멸균된 배지 (1M KPO₄, 9.5mM glucose, agarose 0.7%)에 0.2 mM o-디아니시딘과 HRP (250 U/mg) 10u/ml를 첨가하여 아가 플레이트를 제조한 후 재조합 효모균을 접종하였다. 이 효모균을 1일간 30 ℃ 에서 배양한 후, 페트리디쉬 플레이트 상에서 콜로니 주위의 갈색의 환(halo)이 선명하고 넓게 나타난 콜로니를 선별하였다(도 6).

선별된 콜로니들은 Aureobasdin A를 함유한 YPD 액체배지에 각각 접종한 후 30도에서 250rpm으로 2일 동안 진탕배양 하였다. 각각의 배양액을 5000rpm으로 10분 동안 원심분리하여 상등액을 취한 후, 각 상등액의 GOx 활성을 측정하였다. GOx 활성이 가장 많이 증가된 콜로니를 선별하여 S. cerevisiae DGVh로 명명하고, 2011년 9월 20일자로 KCTC(Korean Colletion for Type Cultures, 대전광역시 유성구 과학로 111번지 생명공학연구소 유전자원센터)에 기탁하여 수탁번호 KCTC12020BP 를 부여받았다.

하기 표 2는 S. cerevisiae DGVh 균주와 이의 모균주(S. cerevisiae DG5)의 GOx 활성과 비교한 것이다. 표 2에서 나타난 바와 같이, S. cerevisiae DGVh 의 GOx 활성은 형질전환 전의 균주인 S. cerevisiae DG-5보다 약 2배 이상인 것으로 측정되었다. 또한 균체 농도도 다른 균주들 보다 20%이상 더 높은 것으로 나타났다.

이는 S. cerevisiae DGVh 에 도입된 VHb 유전자가 성공적으로 발현되고, 이로 인해 세포로의 산소공급이 보다 원활하게 이루어져 전체적인 대사과정이 활성화되고 균체 성장의 촉진과 아울러 외래 단백질인 GOx의 생합성도 향상되어 높은 활성을 보인 것으로 생각된다. 따라서, S. cerevisiae DGVh 는 통기량 조절 및 유가식 배양법을 이용한 고농도 배양을 통한 GOx의 대량 생산에 유용하게 사용될 수 있다.

균주	균체량(OD600)	GOx 활성, U/ml
S. cerevisiae BY4741	9.78±0.07	Not detectable
S. cerevisiae ByGx	13.24±0.17	10.13±0.15
S. cerevisiae DG5	16.14±0.09	21.08±0.21
S. cerevisiae DGVh	26.19±0.13	41.18±0.34

4-2. GOx 의 분자량 및 글리코실화 ( glycosylation ) 확인

S. cerevisiae DGVh로부터 생산된 GOx의 분자량을 알아보고자 SDS-PAGE를 실시하였다. 그 결과 도 5에서 보는 바와 같이, S. cerevisiae DGVh의 GOx 분자량이 약 100kD로 측정되어 이는 앞서 구축한 균주들로부터 생산된 GOx의 분자량인 약 110kD 보다 10% 정도 감소한 것으로 나타났다.

따라서, S. cerevisiae DGVh는 도입된 DNA 단편이 pmt1 유전자 부위에 삽입되었기 때문에 본래의 pmt1 유전자가 결손된 결과, pmt1 유전자의 결손에 의한 글리코실화가 다소 감소한 것으로 추정된다.

4-3. GOx 재조합 균주의 활성 측정 (정량분석)

GOx의 정량분석을 위하여, 0.2mM O-디아니시딘(분자량: 317.21)이 녹아 있는 3차 증류수 0.8ml, 10ug의 HRP (250U/mg), 9.5mM D-글루코스를 각각 혼합하였다. 그리고 여러 농도의 GOx (0, 50, 100, 250, 500, 1000, 2000 ng/0.1ml)를 첨가하여 20분 동안 발색 반응을 유지하며, 효소 반응 정지는 4N H₂SO₄ 0.1ml을 첨가하여 종료하였다. 그 후 흡광도 400nm에서 발색 정도를 통해 효소 활성에 대한 검량선을 작성하였다. 그 결과를 표 3에 나타내었다.

GOx 농도 (ng/0.1ml)	흡광도(400nm)
0	0
50	0.137
100	0.331
250	0.75
500	1.2
1000	1.88
2000	3.22

실시예 5. GOx 재조합 균주의 산업적 생산을 위한 최적의 조건 확립

5-1. 초기 균 접종 농도 최적화

GOx 의 생산을 위한 최적 균주 접종 농도를 조사하기 위하여 기본 배지 YPD(10g/L Yeast Extract, 20g/L Peptone, 20g/L Glucose)에 각각 1%, 5%, 10%, 15%의 접종 농도를 가지고 배양하였다. 초기 pH 5.6, 200rpm, 30 ℃에서 7일간 배양한 결과, 배양액 내의 접종 농도가 1%일 때 최종 효소활성이 4.0 U/ml으로 나타났으며, 이는 접종 농도가 10% 는 효소활성이 30.3 U/ml으로 나타났다. 이는 초기 접종 농도가 최종 효소 활성에 중요한 영향을 미치는 것을 알 수 있었다(도 8). 따라서 최적 균주 접종 농도를 10 내지 20%, 바람직하게는 10%로 선택하였다.

5-2. 배지 조성 확립 및 최적화

S. cerevisiae DGVh 생산 균주를 이용한 GOx 대량 생산을 위한 최적 배지 조성을 확인하기 위하여, 기존의 복합배지인 YPD 배지를 Aerobic Baker's Yeast Fermentation에서 널리 사용하는 Semi-defined 배지조성으로 변경하였으며, Semi-defined medium를 본 발명 균주에 맞게 수정 보완을 하기 위해 탄소원, 질소원, yeast extract 등 특정 영양성분에 대해 종류 및 농도에 따른 배지 조성을 최적화하였으며, 그 결과를 표 4에 나타내었다.

성분	Batch medium (per l)
KH₂PO₄	1 g
NaNO₃	3.0 g
MgSO₄ ·7H₂O	0.25 g
Yeast extract	20 g
수크로스	30 g

5-3. 탄소원 종류 및 농도의 최적화

Semi-defined medium에 탄소원을 글루코스, 수크로스, 프럭토스 및 말토오스 등으로 탄소원 종류와 농도를 달리하여 균체 성장 및 GOx 함량에 대하여 영향을 살펴보았다. 초기 pH 5.6, 200rpm, 30 ℃에서 7일간 배양한 결과 먼저 탄소원의 종류에 따른 영향은 수크로스의 첨가가 균체 성장과 GOx 활성이 26.4U/ml가장 높게 나타나 수크로스를 최적 탄소원으로 선정하였다 (도 9).

다음으로, 수크로스의 최적 농도를 조사하기 위하여 Semi-defined medium에 각각 10 g/l, 30 g/l, 50 g/l의 수크로스 농도로 배양하였다. 초기 pH 5.6, 200 rpm, 30 ℃의 조건에서 배양한 결과 30 g/l의 수크로스를 첨가했을 때 균체 성장 속도 및 효소 활성이 가장 높았고 최종 효소 활성은 38.3 U/ml를 생산하였다. 수크로스를 1% 첨가하였을 때는 최종 효소량이 31.4 U/ml로 효소 활성이 감소하는 것으로 관찰되었다. 또한 50 g/l의 수크로스를 첨가했을 때는 최종 효소량이 28.9 U/ml로 나타났으며, 이는 탄소원의 농도가 증가 할수록 대수증식기 때 급격한 pH의 감소와 저해물질(에탄올)의 증가로 인해 효소 생산이 저해를 받는 것이 관찰되었다. 따라서 최적 수크로스 농도는 20 내지 40 g/l, 바람직하게는 30 g/l로 결정하였다.

5-4. 질소원 농도의 최적화

최적 수크로스 농도 30 g/l 를 기준으로 질소원의 최적 농도를 조사하기 위하여 Semi-defined medium에 각각 10 g/l, 20 g/l, 30 g/l, 40 g/l의 yeast extract 농도로 배양하였다. 초기 pH 5.6, 200 rpm, 30 ℃의 조건에서 배양한 결과 20 g/l의 yeast extract를 첨가했을 때 균체 성장 속도 및 효소 활성이 가장 높았고 최종 효소활성은 43.6 U/ml를 생산하였다. Yeast extract를 저농도로 첨가하였을 때는 효소 생산이 감소하는 것으로 관찰 되었으며, 40 g/l의 yeast extract를 첨가했을 때는 최종 효소량이 42.8 U/ml로 나타났다. 즉 20g/l의 질소원 농도에 대해 30 g/l과 40 g/l의 효소 활성을 비교하였을 때 최종 균체 성장이나 효소활성에서 큰 차이가 나타나지 않았기 때문에 최적 yeast extract의 농도는 20 내지 40 g/l, 바람직하게는 20 g/l로 결정하였다(도 10).

5-5. 5L- Fermentor 를 통한 배양 조건 확립( 교반 속도)

배양 중 교반 속도가 미치는 영향을 관찰하기 위해 탄소원(수크로스 농도 30 g/l) 및 질소원(yeast extract 30 g/l)의 최적조건에서 교반 속도를 달리하여(100 rpm, 200 rpm, 300 rpm, 400 rpm) 30℃, 1 vvm의 조건으로 배양을 실시하였다. 그 결과, 200rpm 과 300rpm의 흡광도와 최종 효소활성을 비교하였을 때 균체성장에서는 큰 차이가 없었으나, 최종 효소활성은 200rpm에서 42.8 U/ml로 300rpm의 40.1 U/ml 보다 높음을 확인하였다. 그러나 400rpm의 교반 속도에서는 높은 shear stress와 cell demage로 인해 효소활성이 오히려 감소하였다. 그러므로 가장 최적의 교반 속도로 200 내지 400 rpm, 바람직하게는 200 rpm으로 결정하였다 (도 11).

5-6. 통기량(Aeration)의 최적화

배양 중 통기량이 미치는 영향을 살펴보기 위해, 탄소원(수크로스 농도 30 g/l) 및 질소원(yeast extract 30 g/l)의 최적조건에서 통기량을 달리하여(0.5 vvm, 1.0 vvm, 1.5 vvm) 배양을 실시하였다. 그 결과, 1.0 vvm과 1.5 vvm에서 효소활성을 비교하였을 때 최종 효소활성이 44.8 U/ml 과 45.2 U/ml로 최종효소활성이 비슷하게 나타났다. 이는 세포 농도가 높을 경우 산소 소모가 공급 속도를 초과하기 때문에 성장의 제한이 일어났으며, 1.0 vvm과 1.5 vvm에서 균체 성장이 거의 비슷하기 때문에 통기량은 큰 차이가 없는 것으로 판단된다. 그러므로 최적 산소공급량 1.0 내지 1.6 vvm, 바람직하게는 1.0 vvm 으로 결정하였다 (도 12).

한국생명공학연구원

KCTC12020BP

20110920

서열목록 전자파일 첨부

Claims

서열번호 1의 글루코스 옥시다아제 유전자를 포함하는 재조합 벡터.
제1항에 있어서, GPD(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase) 프로모터, MFα (alpha-mating factor) 신호 서열 및 GPD 터미네이터를 추가로 포함하는 재조합 벡터.
제1항에 있어서, 도 1의 개열지도를 가지는 재조합 벡터.
서열번호 1의 글루코스 옥시다아제 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 재조합 효모.
제4항에 있어서, 상기 재조합 벡터는 GPD 프로모터, MFα (alpha-mating factor) 신호 서열 및 GPD 터미네이터를 추가로 포함하는 것인 재조합 효모.
제4항에 있어서, 상기 재조합 벡터는 도 1의 개열지도를 가지는 것인 재조합 효모.
제4항에 있어서, 박테리아 헤모글로빈 유전자를 추가로 포함하는 재조합 효모.
제7항에 있어서, 상기 박테리아 헤모글로빈은 비트리오실라의 헤모글로빈(Vitreoscilla hemoglobin)인 재조합 효모.
제8항에 있어서, 비트리오실라의 헤모글로빈 유전자가 효모 염색체 상의 pmt1 유전자 부위에 삽입되어 있는 것인 재조합 효모.
제7항에 있어서, 비트리오실라의 헤모글로빈을 포함하는 재조합 벡터로 추가로 형질전환된 것인 재조합 효모.
제10항에 있어서, 상기 비트리오실라의 헤모글로빈을 포함하는 재조합 벡터는 TEF1 프로모터, 비트리오실라의 헤모글로빈 유전자 및 CYC1TT 터미네이터로 구성된 카세트를 포함하는 것인 재조합 효모.
제10항에 있어서, 상기 비트리오실라의 헤모글로빈을 포함하는 재조합 벡터는 pmt1 유전자와 상동인 제1영역, TEF1 프로모터, 비트리오실라의 헤모글로빈 유전자, CYC1TT 터미네이터, 선별마커 유전자, 및 pmt1 유전자와 상동인 제2영역을 포함하는 것인 재조합 효모.
제7항에 있어서, 상기 재조합 효모는 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) KCTC12020BP 인 재조합 효모.
제4항 내지 제13항 중 어느 한 항의 재조합 효모를 배양하는 단계를 포함하는 글루코스 옥시다아제를 제조하는 방법.
제14항에 있어서, 다음 중 어느 하나의 배양 조건 하에서 재조합 효모를 배양하는 것인, 글루코스 옥시다아제를 제조하는 방법:
(a) 초기 균 접종 농도가 10 내지 20%,
(b) 탄소원으로 수크로스를 20 내지 40 g/l 로 포함,
(c) 질소원으로 효모 추출물을 20 내지 40 g/l 로 포함,
(d) 발효기 내 교반속도가 200 내지 400 rpm,
(e) 배양 중 산소 공급량이 1.0 내지 1.6 vvm, 또는
(f) pH 6 내지 7, 및 온도 20 내지 50 ℃.
제14항에 의해 제조된 글루코스 옥시다아제를 이용하여 유기산 칼슘을 제조하는 방법.
제16항에 의해 제조된 유기산 칼슘을 포함하는 골대사 질환의 예방 및 치료용 조성물.
제17항에 있어서, 상기 골대사 질환은 골다공증 또는 관절염인 조성물.
제17항에 있어서, 베타 글루칸을 추가로 포함하는 골대사 질환의 예방 및 치료용 조성물.