KR101317417B1 - 돼지열병바이러스의 탐지용 항원, 이를 이용한 항체 검출 방법, 및 이를 포함하는 탐지키트 - Google Patents

Abstract

본 발명은 돼지열병바이러스에 대한 항체에 특이적인 융합 펩타이드, 이를 포함하는 돼지열병바이러스 감염의 탐지 키트에 관한 것으로, 본 발명은 돼지열병바이러스, 특히 상기 바이러스의 ERNS 단백질에 대한 항체에 특이적인 융합 펩타이드 및 이를 포함하는 탐지키트를 제공하고, 또한 상기 융합 펩타이드 및/또는 상기 탐지키트를 이용하여 돼지열병바이러스 감염여부 및 돼지열병바이러스에 대한 특이적인 항체를 검출하는 방법뿐만 아니라, 나아가 용이하게 순화 생독 백신주 및 유전자 제조합 마커 백신주나 야외주를 감별하는 방법을 제공함으로써, 신속하고 간단하며 높은 특이도와 민감도로 돼지열병바이러스 감염여부 및 항체생성여부 등을 비롯하여 돼지열병바이러스의 백신주 및 야외주의 감별 진단이 가능하며, 또한 돼지열병 바이러스의 모든 유전형에 관계없이 진단이 가능하여 매우 유용하게 사용될 수 있다. 이에 따라 본 발명은 돼지열병바이러스의 조기진단, 예방 및 치료에 효율적으로 기여할 수 있다.

Description

돼지열병바이러스의 탐지용 항원, 이를 이용한 항체 검출 방법, 및 이를 포함하는 탐지키트{ANTIGEN FOR DETECTING OF CLASSICAL SWINE FEVER VIRUS, ANTIBODY DETECTING METHOD AND TEST KIT USING THEREOF}

본 발명은 돼지열병바이러스에 대한 항체에 특이적인 융합 펩타이드, 이를 포함하는 돼지열병바이러스 감염의 탐지 키트에 관한 것이다.

돼지열병바이러스(Classical Swine Fever Virus, CSFV)는 Flaviviridae과, Pestivirus속에 속하는 RNA 바이러스로 size는 약 40~50nm이며, 돼지열병바이러스 유전자는 positive sense single strand RNA로 크기는 12.3 kb 정도 되며 한 개의 단백질 암호코드로 약 3900 아미노산을 합성하며 바이러스 구조 단백질을 구성한다. 돼지열병바이러스의 단백질은 Npro, Capsid, Erns, E1, E2, p7, NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A 및 NS5B로 구성되어 있다. 돼지열병바이러스는 5’NCR(non-coding region), E2, 및 NS5B유전자 sequence를 비교하여 3가지의 유전자형으로 분류하고 있다.

돼지열병바이러스에 감염된 돼지들은 ERNS, E2, NS3에 대한 항체를 발달시킨다. 이들 바이러스 단백질중 E2 단백질은 CSFV의 외피를 구성하며 바이러스를 강하게 중화하는 항체를 생성하는데 관여하는 주요한 방어 항원으로 알려져 있다. 돼지열병바이러스는 감염돼지의 분변, 오줌, 눈물, 콧물에 배출되는 바이러스로 감염되나 사람이나 신발, 의복 및 기구 같은 기계적인 매개체로도 감염된다. 야생 맷돼지에서도 바이러스가 발견되므로 맷돼지 출몰지역은 발병 위험이 있고, 감염시 급성형일 경우 고열, 피부발적, 식욕결핍, 변비, 설사, 백혈구 감소, 후구마비, 폐사 등의 증상이 나타난다. 특히, 임신한 모돈 감염시 태반을 통해 태아에게 감염되며 일령에 따라 재흡수, 유산, 사산 등이 나타나고 분만되는 경우도 분만 수일 후 죽거나 위축돈이 된다. 잠복기는 주로 6-11일이나 20-30일(국제수역기구에 의하면 최대 40일)의 잠복기를 거치기도 하므로 임상증상이 나타나기 전 이동 시 전국으로 확산 가능하므로 조기에 진단하여 확산 방지가 중요하다.

2009년 현재 미국, 일본 등 선진 축산국의 경우 철저한 방역으로 돼지열병이 발생하지 않아 국제수역사무국으로부터 청정지역으로 선정되어 있지만 우리나라를 포함한 중국 등의 아시아 국가와 불가리아, 루마니아, 헝가리 등 일부 유럽에서도 발생하고 있다. 가축돈에서 돼지열병 감염이 발견되지 않은 일부 유럽 국가에도 야생 맷돼지에서 감염이 발견되는 등 돼지열병에 안전하지 않은 상태로 신속 진단도구가 필요하다.

현재 우리나라의 경우 돼지열병 순화 생독 바이러스인 LOM 균주를 생독 백신으로서 예방접종을 실시하고 있으나 외국에서는 이미 제한적인 상황에서 ERNS항원이 없는 마커백신의 사용이 권장되고 있다. 이에 백신 항체와 야외강독 바이러스 감별키트가 2개社(CEDI사 및 CHECKIT사)에서 개발되어 사용되고 있으나 바이러스 유전형에 따라 일정하지 않은 검사결과를 나타내는 것으로 보고되어 있어 다양한 유전형에 높은 민감도를 나타내는 키트의 개발이 요구된다.

현재 우리나라는 돼지열병 순화 생독 바이러스인 LOM주로 제작한 생독백신을 예방접종하고 있으나 돼지열병 근절을 위해 ERNS 단백질을 이용한 유전자 재조합 마커백신을 상용화할 계획이다. 그러나 유전자 재조합 마커백신을 사용시 백신과 야외감염 항체를 감별할 수 있는 검사법이 수립되지 않아 예찰검사에 어려움이 예상되고 있다.

이에 본 발명은 상기 종래기술의 문제점을 해결하기 위하여 안출된 것으로서 돼지열병바이러스, 특히 상기 바이러스의 ERNS 단백질에 대한 항체에 특이적인 항원 펩타이드 및 이를 포함하는 탐지키트를 제공하며, 또한 상기 항원 펩타이드 및/또는 상기 탐지키트를 이용하여 돼지열병바이러스 감염여부 및 돼지열병바이러스에 대한 특이적인 항체를 검출하는 방법뿐만 아니라, 나아가 용이하고 정확하게 순화 생독 백신주 및 유전자 재조합 마커 백신주나 야외주를 감별하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기와 같은 과제를 해결하기 위하여 본 발명자들이 돼지열병바이러스(Classical Swine Fever Virus, CSFV)의 예방을 위해 투여된 백신주에 대한 ERNS항체를 검출하는 방법으로 순화 생독 백신주, 유전자 재조합 마커백신주, 또는 야외주에 대한 감별을 정확하게 판별할수 있는 방법을 확립하고자 연구 노력한 결과, 돼지열병바이러스의 감염에 의해 유도되는 항체 중 하나인 ERNS 항체에 대해 특이적으로 결합하는 항원 단백질 및 이를 포함하는 신속 탐지키트를 개발하여 본 발명을 완성하게 되었다. 이에 따라 돼지열병바이러스의 백신주 및 야외주 감별 진단뿐만 아니라 돼지열병 바이러스의 모든 유전형에 관계없이 진단이 가능하게 되었다.

이에 본 발명은 돼지열병바이러스의 ERNS 단백질내 존재하는 면역우성의 항원결정부위(immunodominant epitope)인 항원 유래 펩타이드를 제공한다.

또한 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열 중 N-말단으로부터 414 내지 421번째에 위치한 서열번호 20, 423 내지 437번째에 위치한 서열번호 21, 및 463 내지 471번째에 위치한 서열번호 22의 아미노산 서열을 필수적으로 포함하여 연속적인 아미노산 58개 내지 68개로 이루어진 항원 유래 펩타이드를 직렬적으로 2회 이상 반복하여 포함하는, 돼지열병바이러스에 대한 항체에 특이적인 융합 펩타이드를 제공한다.

또한 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열 중 N-말단으로부터 414 내지 421번째에 위치한 서열번호 20, 423 내지 437번째에 위치한 서열번호 21, 및 463 내지 471번째에 위치한 서열번호 22의 아미노산 서열을 필수적으로 포함하여 연속적인 아미노산 58개 내지 68개로 이루어진 항원 유래 펩타이드, 또는 상기 펩타이드를 직렬적으로 2회 이상 반복하여 포함하는, 돼지열병바이러스 감염 탐지용 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 상기 돼지열병바이러스 감염 탐지용 조성물을 포함하는 돼지열병바이러스 감염의 탐지키트를 제공한다.

또한 본 발명은 상기 돼지열병바이러스 감염 탐지용 조성물 또는 상기 탐지키트를 이용하여 돼지열병바이러스의 백신주 또는 야외주를 감별하는 방법을 제공한다.

또한 본 발명은

검체를 준비하는 단계;

상기 검체에 서열번호 1의 아미노산 서열 중 N-말단으로부터 414 내지 421번째에 위치한 서열번호 20, 423 내지 437번째에 위치한 서열번호 21, 및 463 내지 471번째에 위치한 서열번호 22의 아미노산 서열을 필수적으로 포함하여 연속적인 아미노산 58개 내지 68개로 이루어진 항원 유래 펩타이드, 또는 상기 펩타이드를 직렬적으로 2회 이상 반복하여 포함하는 융합 펩타이드를 적용하는 단계; 및

상기 검체와 상기 융합 펩타이드의 항원-항체 반응을 검사하는 단계

를 포함하는, 돼지열병바이러스에 대한 항체 검출 방법을 제공한다.

또한 본 발명은 상기 돼지열병바이러스 감염 탐지용 조성물 또는 상기 탐지키트를 이용하여 돼지열병바이러스의 감염여부 또는 백신 처방 여부를 판단하는 진단방법을 제공한다.

이하 본 발명을 보다 상세히 설명한다.

돼지열병바이러스에 감염된 돼지들은 구조 단백질인 ERNS와 E2, 그리고 비구조 단백질인 NS3에 대한 항체를 만들어낸다. 막 당단백질인 E2단백질은 돼지열병바이러스의 대표적인 면역원성 단백질이고, 또 다른 막 당단백질인 ERNS 는 RNase 활성을 가지고 있으며, 이러한 ERNS의 RNase 활성은 바이러스의 복제와 감염숙주내에서 바이러스의 지속적인 감염에 대한 중요한 역할을 한다 (Edwards et al., 1991; Vet. Microbiol. 29:101-108, Weiland et al., 1992; J. Virol. 66:3677-3682, Hulst et al., 1998; J. Virol. 72(1):151-157).

우리나라의 경우 돼지열병 순화 생독 바이러스인 LOM 균주를 생독 백신으로서 예방접종을 실시하고 있으나, 생독 바이이러스의 경우 접종 돼지들에서 백신주의 변이로 바이러스가 활성화되는 부작용이 발생하고 있다. 이러한 이유로 외국에서는 이미 제한적인 상황에서 E2 사백신이나ERNS항원이 없는 마커백신의 사용이 권장되고 있다. 현재 가장 널리 사용되는 사백신으로는 정제된E2단백질을 면역원으로 사용하는 소단위체 백신 (subunit vaccine)이 대표적이다 (Bouma et al., 1999; Vet. Microbiol. 66:101-114). 그러나 이러한 사백신은 하나의 단백질에 대한 면역성을 나타내기 때문에, 생백신주에 비해 열병바이러스의 감염으로부터 접종 돼지들을 보호하는 면역 방응력이 약할수 있다는 단점이 있다 (Hulst et al., 1993; J. Virol. 67:5435-5442, Meyers et al., 1996; J. Virol. 70:1588-1595, Ruggli et al., 1996; J. Virol. 70:3478-3487). 이를 보완하고자 유전자 재조합 마커 백신이 출현했으며, 그 예로 ERNS 구조 단백질의 일부분이 결절된 돌연변이 백신주를 만들거나 이종의 ERNS를 치환하는 방법을 통하여 백신으로서의 기능은 유지하도록 하면서 부작용으로 나타나는 감염력을 억제하는 백신들이 사용되고 있다 (Widjojoatmodjo et al., 2000; J. Virol. 74:2973-2980, Song et al., 대한민국 공개특허 10-2010-0121288).

본 발명자들은 돼지열병바이러스의 ERNS 구조단백질로부터 중요한 유효항원의 재조합 단백질을 제작하기 위해 바이오인포매틱스 분석 기술을 기반으로 표적 유전자의 핵산 염기 서열 및 아미노산 서열을 분석하여 최적의 유효 항원의 표적을 선정함으로써 돼지열병바이러스의 ERNS 단백질내 존재하는 면역우성의 항원결정부위(immunodominant epitope)를 디자인하였다.

이에 본 발명은 돼지열병바이러스의 ERNS 단백질내 존재하는 면역우성의 항원결정부위(immunodominant epitope)인 ERNS 항원 유래 펩타이드를 제공한다.

상기 항원 유래 펩타이드는 돼지열병바이러스의 백신주 및 야외주 감별 진단뿐만 아니라 돼지열병 바이러스의 모든 유전형에 관계없이 진단이 가능하도록 디자인된 것으로서, 바람직하게는 서열번호 1의 돼지열병바이러스의 아미노산 서열 중 N-말단으로부터 414 내지 421번째에 위치한 서열번호 20, 423 내지 437번째에 위치한 서열번호 21 및 463 내지 471번째에 위치한 서열번호 22의 아미노산 서열을 필수적으로 포함하여 연속적인 아미노산 58개 내지 68개로 이루어진 것일 수 있다.

상기 항원 유래 펩타이드에 필수적으로 포함되는 서열번호 20, 21 및 22의 아미노산 서열은 서열번호 1의 돼지열병바이러스의 아미노산 서열 중 N-말단으로부터 268 내지 494번째에 위치한 ERNS 구조 단백질내에 존재하는 유효 타깃 항원 도메인으로서, 상기 항원 유래 펩타이드의 아미노산 서열 중 상기 필수적인 아미노산 서열들 이외의 아미노산들은 치환이 가능하다.

상기 항원유래 펩타이드는 바람직하게는 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하여 연속적인 아미노산 58개 내지 68개, 더욱 바람직하게는 58개 내지 62개로 구성된 것일 수 있다.

가장 바람직하게는 상기 항원유래 펩타이드는 서열번호 2의 아미노산 서열로 구성된 펩타이드(ERNS-F1)일 수 있다.

상기 서열번호 2의 아미노산 서열은 서열번호 3의 염기서열에 의해 암호화되는 것일 수 있다.

본 발명은 또한 상기 ERNS 항원유래 펩타이드를 반복적으로 포함하는 융합 펩타이드로서, 구체적으로는 서열번호 1의 돼지열병바이러스의 아미노산 서열 중 N-말단으로부터 414 내지 421번째에 위치한 서열번호 20, 423 내지 437번째에 위치한 서열번호 21 및 463 내지 471번째에 위치한 서열번호 22의 아미노산 서열을 필수적으로 포함하여 연속적인 아미노산 58개 내지 68개로 이루어진 항원 유래 펩타이드를 직렬적으로 2회 이상, 바람직하게는 2회 내지 5회 반복하여 포함하는, 돼지열병바이러스에 대한 항체에 특이적인 융합 펩타이드를 제공한다.

상기 항원유래 펩타이드가 직렬적으로 2회 이상 반복하여 포함되는, 돼지열병바이러스에 대한 항체에 특이적인 융합 펩타이드는 바람직하게는 상기 항원유래 펩타이드가 직렬적으로 2회 반복하여 포함된 서열번호 4 의 아미노산 서열(아미노산 118개)로 구성되는 융합 펩타이드(ERNS-F2), 또는 상기 항원유래 펩타이드가 직렬적으로 3회 반복하여 포함된 서열번호 6의 아미노산 서열(아미노산 178개)로 구성되는 융합 펩타이드(ERNS-F3)일 수 있다.

상기 서열번호 4의 아미노산 서열은 서열번호 5의 염기서열에 의해 암호화되는 것일 수 있으며, 상기 서열번호 6의 아미노산 서열은 서열번호 7의 염기서열에 의해 암호화되는 것일 수 있다.

상기 융합 펩타이드는 바람직하게는 상기 항원유래 펩타이드를 사용하여 재조합 방법으로 제조한 재조합 융합 펩타이드일 수 있으며, 상기 ERNS 항원유래 펩타이드 ERNS-F1, ERNS-F2, 및 ERNS-F3는 바람직하게는 직접 합성하거나, 또는 중합효소연쇄반응 (PCR) 방법등을 사용하여 게놈 유전자로부터 제조할 수도 있다. 구체적인 일예에서, ERNS-F1의 유전자확보를 위해 주형 게놈유전자로부터 특정 프라이머쌍을 사용하여 PCR법을 통해 ERNS-F1 유전자의 표적 프래그먼트를 증폭하여 완전한 항원 단백질 유전자를 제조할 수 있다.

상기 항원 단백질의 유전자 제조 방법은 증폭하고자 하는 핵산의 상보적 말단과 오버랩되는 서열을 갖는 일련의 올리고뉴클레오타이드를 합성하는 것을 포함한다. 상기 올리고뉴클레오타이드는 발현 벡터로 클로닝하기 위한 여러 종류의 제한효소 부위를 함유 하는 것일 수 있다. 가열냉각시에, 상기 말단은 상보적 가닥의 증폭을 위한 프라이머로 사용되며, 증폭 산물들은 여분의 외부프라이머들에 의해 증폭된다.

상기 융합 펩타이드는 돼지열병바이러스의 ERNS 단백질내 존재하는 면역우성의 항원결정부위(immunodominant epitope)가 연속 또는 불연속적으로 직렬적으로 융합된 재조합 형태로써 ERNS 항체만을 포획하며, 이를 사용하여 제조된 분석 스트립은 신속 면역트로마토그라피법에 의해 검체에서 CSFV 야외주나 생백신주 또는 E2 사백신 으로부터 유래되는 ERNS 항체의 존재 유무를 감별적으로 검출할 수 있다.

따라서 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열 중 N-말단으로부터 414 내지 421번째에 위치한 서열번호 20, 423 내지 437번째에 위치한 서열번호 21, 및 463 내지 471번째에 위치한 서열번호 22의 아미노산 서열을 필수적으로 포함하여 연속적인 아미노산 58개 내지 68개로 이루어진 항원 유래 펩타이드, 또는 상기 펩타이드를 직렬적으로 2회 이상, 바람직하게는 2회 내지 5회 반복하여 포함하는, 돼지열병바이러스 감염 탐지용 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 상기 돼지열병바이러스 감염 탐지용 조성물을 포함하는 ERNS 항체 검출용 분석 스트립을 제공한다.

본 발명은 또한 상기 돼지열병바이러스 감염 탐지용 조성물을 포함하는 돼지열병바이러스 감염의 탐지키트를 제공한다.

상기 감염 탐지용 조성물 및/또는 상기 탐지키트를 이용하여 돼지열병바이러스 감염여부 및 돼지열병바이러스에 대한 특이적인 항체를 검출할 수 있으며, 나아가 용이하게 순화 생독 백신주 및 유전자 제조합 마커 백신주나 야외주를 감별할 수 있어, 신속하고 간단하며 높은 특이도와 민감도로 돼지열병바이러스 감염여부 및 항체생성 등을 확인 할 수 있으며, 이에 따라 돼지열병바이러스의 조기진단, 예방 및 치료에 효율적으로 사용될 수 있다.

상세하게는 상기 탐지키트는 검체에 존재하는 ERNS항원에 대한 항체의 존재유무를 검출함으로써, 양성은 돼열병바이러스 감염 및/또는 생독백신에 의한 것으로 판정하고, 음성은 마커백신에 의한 것으로 판단할수 있다.

상기 키트는 바람직하게는 검체와, 상기 감염 탐지용 조성물 즉, 상기 항원 유래 펩타이드 또는 상기 융합펩타이드와의 항원-항체 반응을 이용하여 돼지열병바이러스의 감염에 대한 ERNS 항체를 탐지하는 것일 수 있으며, 나아가 돼지열병바이러스의 백신 감별을 탐지할 수 있는 면역키트일 수 있다.

상기 검체는 바람직하게는 진단 대상인 돼지의 체액 예컨대, 혈액, 혈청, 혈장, 림프액, 조직액 등, 또는 체외로 분비되는 분비물인 소변, 눈물, 침, 젖, 구토물, 분변 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다.

상기 키트의 형태는 바람직하게는 효소면역 측정법 키트(ELISA), 블롯팅 키트(Blotting), 면역침전법 키트, 면역형광검사 키트 또는 면역 스트립 형태일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.

상기 키트는 검체를 흡수하는 검체 패드와 검출 결과를 나타내는 멤브레인 및 검체 전개액을 흡수하는 흡수 패드를 포함하는 분석 스트립을 하나 이상 포함하는 것일 수 있으며, 상기 분석 스트립은 바람직하게는 단변의 폭과 장변의 길이를 가지는 형태일 수 있다.

상기 면역 스트립 형태의 탐지키트는 바람직하게는 2 이상의 분석 스트립을 가지는 것으로서, 상기 분석 스트립 중 어느 하나는 돼지열병바이러스나 백신주의 ERNS 항체에 특이적으로 결합할 수 있는 상기 융합 펩타이드가 고정된 멤브레인을 포함하고, 다른 분석 스트립은 추가의 항원 또는 항체가 고정된 멤브레인을 포함하는 것일 수 있다.

상기 탐지키트는 상기 분석 스트립의 일면을 지지하는 하부 케이스; 및 상기 하부 케이스에 결합되어 상기 분석 스트립의 다른 일면을 덮으며, 상기 검체 패드에 대응하는 검체 투입구와 상기 멤브레인에 대응하는 결과 표시창 및 상기 흡수 패드에 대응하는 문자 표시구를 포함하는 상부 케이스를 추가로 포함하는 것일 수 있다(도 3 내지 6 참조).

면역크로마토그라피법으로 돼지열병바이러스를 검출하기 위해서는 니트로셀룰로오스 멤브레인에 돼지열병바이러스 항원 단백질 ERNS-F1, 또는 ERNS-F2 또는 -F3 재조합 융합 항원을 검출할 수 있는 원료물질을 정해진 위치에 흡착시키고 금입자에 각각에 대한 항체 또는 항원을 접합시켜 패드에 건조시킬 수 있다. 또한 건조된 금(골드) 접합체 패드와 검체를 적용하는 패드를 중첩하여 니트로셀룰로오스 멤브레인 위에 덮고 반대편 위치에 흡습용 흡수패드를 포함할 수 있다(도 5 및 도 6).

상기 분석 스트립의 제조에 사용할 수 있는 멤브레인은 통상의 진단 스트립의 재료로 사용되는 것들을 이용할 수 있으며, 예를 들어 니트로셀룰로오스, 셀룰로오스, 셀룰로오스 아세테이트, 폴리에틸렌 등의 각종 합성 중합체에서 선택되는 1종이 될 수 있다.

또한 상기 키트는 추가로 상기 항체와 혼성화되는 검체를 탐지하기 위한 검출 시약을 포함할 수 있으며, 검출시약은 검사하고자 하는 표적물질(analyte)의 존재를 육안 또는 기타 기구를 통해 외부에서 식별이 가능하도록 해 주는 소정의 표지 시약(labeled reagent), 보조적 특이결합부재, 및/또는 신호발생 시스템의 구성 성분이 구비된다.

상기 표지 시약 즉, 표지된 검출시약은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 잘 알려져 있는 것을 사용할 수 있으며, 상기 표지는 예컨대 촉매, 효소(예를 들어, 포스파타제, 퍼옥시다제 등, 보다 구체적인 예로는 효소 기질과 결합하여 함께 사용되는 염기성 포스퍼타제와 양고추 퍼옥시다제 등), 효소기질(예를 들어, 니트로블루테트라졸리움, 3,5',5,5'-테트라니트로벤지딘, 4-메톡시1나프톨, 4클로로1나프톨, 5-브로모-4-클로로-3-인돌일포스페이트, 화학발광 효소기질로는 디옥세탄, 및 유도페와 이들의 유사체), 형광화합물(예를 들면, 플로우레세인(fluorescein), 피코빌리프로틴(phycobiliprotein), 로다민(rhodamine)등과 이들 유도체 및 유사체), 화학발광화합물, 금속졸(Metal sol), 염료졸(Dye sol), 미립자 라텍스(Particulate latex), 칼라인디케이터(Color Indicator), 리포좀에 포함된 색재료(Color matter), 화학발광화합물, 금속졸(Metal sol), 염료졸(Dye sol), 미립자 라텍스(Particulate latex), 칼라인디케이터(Color Indicator), 리포좀에 포함된 색재료(Color matter), 탄소졸 및 셀레늄과 같은 비금속졸 등에서 선택된 1종 이상일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.

대조시약에 포함될 수 있는 표지 시약은 위 검출시약에서의 표지를 동일하게 적용할 수 있다.

보조적 특이결합부재의 예로는 특별한 한정을 요하는 것은 아니나, 예를 들면, 아비딘, 바이오틴, FITC, 항FITC 항체, 마우스 면역 글로불린, 항 마우스 면역 글로불린항체에서 선택되는 1종이 될 수 있다.

상기 키트는 도 4를 참조하여 설명하면, 돼지열병바이러스로부터 유래된 항체 또는 헵텐 중에서 선택되는 적어도 하나 이상의 고정상을 갖는 검사선(221) 및 정상동작여부를 판단하기 위한 대조선(222)이 멤브레인(22)상의 소정영역에 구비된 분석 스트립(2); 상기 분석 스트립(2)을 각종 오염물질로부터 보호하며, 적어도 검체를 투입하기 위한 검체투입구(41) 및 분석 스트립상의 검사선(221)과 대조선(222)에서의 반응결과를 관찰하기 위한 결과 표시창(42)이 구비된 면역분석장치(1)을 포함하는 것으로서 돼지열병바이러스 백신 감별 진단을 위해 사용되는 것일 수 있다.

상기 키트는 돼지열병 바이러스 LOM주 순화 생독 백신주 및 유전자 제조합 마커 백신주뿐만 아니라 야외주 감별을 용이하게 한다. 따라서 본 발명을 통한 돼지열병 예방 백신 및 야외주의 혈청학적 감별을 통해 돼지열병을 예방 및 치료하는데 효율적으로 사용될수 있다.

도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 면역분석장치의 분해 사시도이다. 도 4를 참조하면, 면역분석장치(1)는 검체를 흡수하여 검출 결과를 표시하는 분석 스트립(2), 서로 결합되어 분석 스트립(2)을 내장하는 하부 케이스(3)와 상부 케이스(4)를 포함한다.

하부 케이스와 상부 케이스는 하나의 분석 스트립을 내장하여 1회에 1가지 질병에 대한 검사만을 가능하게 할 수 있다(미도시). 또한 하부 케이스와 상부 케이스는 3개 이상의 분석 스트립을 내장하여 다수의 질병에 대한 검사가 가능하도록 구성될 수도 있다(미도시).

바람직하게는 하부 케이스(3)와 상부 케이스(4)는 1쌍의 분석 스트립(2)을 내장하여 1회에 2가지 질병에 대한 검사를 가능하게 한다. 또한 편의상, 도면에서는 1쌍의 분석 스트립(2)을 내장하는 구조를 예시하고, 전체적인 설명에서는 중복을 피하기 위하여 1개의 분석 스트립(2)에 대하여 주로 설명한다.

1쌍의 분석 스트립(2)에 대하여 간략히 설명하면, 하부 케이스(3)는 분석 스트립(2) 쌍을 지지하는 제1 스트립 지지부(3A)와 제2 스트립 지지부(3B)를 포함한다. 이에 따라, 상부 케이스(4)는 분석 스트립(2) 쌍, 즉 제1 스트립 지지부(3A)와 제2 스트립 지지부(3B) 각각에 대응하는 제1 스트립 대응부(4A)와 제2 스트립대응부(4B)를 포함한다.

제1 스트립 지지부(3A)와 제1 스트립 대응부(4A)는 하나의 분석 스트립(2)의 양면(도 4에서 하면과 상면)을 지지하여 내장한다. 제2 스트립 지지부(3B)와 제2 스트립 대응부(4B)는 다른 하나의 분석 스트립(2)의 양면(도 4에서 하면과 상면)을 지지하여 내장한다.

분석 스트립(2)은 검체를 흡수하는 검체 패드(21)와 검출 결과를 나타내는 멤브레인(22) 및 검체의 전개 액을 흡수하는 흡수 패드(23)를 포함한다. 멤브레인(22)은 검체에 의하여 반응하는 검사선(221)과, 검사선을 비교하여 질병 분석의 기준이 되는 대조선(222)을 구비한다.

또한 분석 스트립(2)은 스트립 지지부(3A)와 스트립 대응부(4A) 사이에 고정될 수 있도록 단변(24)의 폭(W24)과 장변(25)의 길이(L25)를 가진다(편의상, 제1 스트립 지지부(3A)와 제1 스트립 대응부(4A)로 설명한다).

검체 전개용액을 추가적으로 적하(예컨대 40㎕ (1 drop))하며 검체 중에 존재하는 돼지열병바이러스 ERNS 항체가 금입자에 부착된 각각의 항체 또는 항원과 반응을 하면서 니트로셀룰로오스 멤브레인(22) 위를 모세관 현상에 의해서 전개된다. 멤브레인의 검사선(221)에 돼지열병바이러스 ERNS 항체를 검출할 수 있는 특이적인ERNS 재조합 항원을 일정한 위치에 흡착시켜 놓아 해당 감염체의 감염 항체가 검체중에 존재하는 경우에는 골드입자에 접합된 항원 또는 항체에 반응한 바이러스 항체가 멤브레인에 흡착된 항원과 다시 반응하여 해당 위치에 골드입자 색에 의한 보라색(붉은색) 밴드를 형성한다. 대조선(222) 위치에는 항-마우스 IgG를 흡착시켜 마우스 IgG가 흡착된 골드입자가 검체중의 바이러스 항원의 존재여부에 관계없이 항상 반응하여 보라색 (붉은색) 밴드를 나타내게 하였다 (도 4 및 5). 반응하지 않은 내용물은 흡수패드에 스며들어 검사창의 멤브레인은 깨끗한 흰색으로 나타나 형성된 밴드를 쉽게 판독할 수 있다. 또한 검체 중에 돼지열병바이러스 ERNS 특이항체가 존재하지 않으면 스트립의 대조선 부위에만 보라색 또는 붉은색 밴드가 형성된다 (도 3).

하부 케이스(3)는 내장되는 분석 스트립(2)의 일면, 예를 들면, 하면을 지지하도록 형성된다. 상부 케이스(4)는 하부 케이스(3)에 결합되어 내장되는 분석 스트립(2)의 다른 일면, 예를 들면, 상면을 덮도록 형성된다.

상부 케이스(4)는 검체 패드(21)에 대응하여 형성되는 검체 투입구(41)와, 멤브레인(22)에 대응하여 형성되는 결과 표시창(42), 및 흡수 패드(23)에 대응하여 형성되는 문자 표시구(43)를 포함한다.

본 발명은 상기 탐지키트를 이용하여 돼지열병바이러스의 백신주 또는 야외주를 감별하는 방법을 제공한다.

상기 백신주는 바람직하게는 순화 생독 백신주 또는 유전자 재조합 마커 백신주일 수 있으나 이에 제한되지 않고 돼지열병바이러스의 ERNS 항체를 생산하지 아니하는 모든 종류의 돼지열병 백신에 적용 될수 있다.

또한 본 발명은 검체를 준비하는 단계; 상기 검체에 상기 돼지열병바이러스에 대한 항체에 특이적인 융합 펩타이드를 적용하는 단계; 및 상기 검체와 상기 융합 펩타이드의 항원-항체 반응을 검사하는 단계를 포함하는, 돼지열병바이러스에 대한 항체 검출 방법을 제공한다.

또한 본 발명은 본 발명의 돼지열병바이러스 감염 탐지용 조성물 또는 탐지키트를 이용하여 돼지열병바이러스의 감염여부 또는 백신 처방 여부를 판단하는 진단방법을 제공한다.

상기 진단방법은 바람직하게는 (1) 검체를 분석 스트립의 접정영역에 일정량 투입하는 단계; (2) 소정의 표지가 구비된 검출시약[금(골드) 접합체] 과 상기 검체 중의 분석물을 결합시켜 복합체를 형성하는 단계; (3) 상기 복합체를 멤브레인에 전개하는 단계; 및 (4) 상기 멤브레인 상의 소정 영역에 돼지열병바이러스 감염이나 백신으로부터 면역반응을 통해 얻어질 수 있는 항체 또는 헵텐 중에서 선택되는 적어도 하나 이상의 고정상을 갖는 반응부의 외관 변화를 관찰하여 돼지열병바이러스 감염이나 백신 처방 여부를 판단하는 단계를 포함할 수 있다.

상기 진단방법은 샌드위치법(sandwich assay) 또는 경쟁법 (competition assay)을 포함한다. 예를 들면, 본 발명의 면역분석법에서는, 면역 스트립내 멤브레인에 본 발명에 따른 유합 펩타이드를 고정하고, 동물의 혈청으로부터 온 검체를 반응시킨 후에, 검체에 포함된 항체에 대한 표지된 2차 항체를 반응한 샌드위치법으로 분석할 수도 있다.

상술한 바와 같은 본 발명의 항원 유래 펩타이드, 융합 펩타이드, 탐지키트, 이를 이용한 돼지열병바이러스의 백신주 또는 야외주를 감별하는 방법 및 돼지열병바이러스에 대한 항체 검출 방법 등을 통하여 돼지군에서 ERNS 단백질에 대한 항체의 모니터링 검사와 ERNS가 결손된 마커백신 접종 돼지군에서 감염항체의 감별 검사가 가능하다. 이러한 결과는 돼지열병 근절사업에 일조할 것으로 기대된다.

본 발명은 돼지열병바이러스, 특히 상기 바이러스의 ERNS 단백질에 대한 항체에 특이적인 융합 펩타이드 및 이를 포함하는 탐지키트를 제공하고, 또한 상기 융합 펩타이드 및/또는 상기 탐지키트를 이용하여 돼지열병바이러스 감염여부 및 돼지열병바이러스에 대한 특이적인 항체를 검출하는 방법뿐만 아니라, 나아가 용이하게 순화 생독 백신주 및 유전자 제조합 마커 백신주나 야외주를 감별하는 방법을 제공함으로써, 신속하고 간단하며 높은 특이도와 민감도로 돼지열병바이러스 감염여부 및 항체생성여부 등을 비롯하여 돼지열병바이러스의 백신주 및 야외주의 감별 진단이 가능하며, 또한 돼지열병 바이러스의 모든 유전형에 관계없이 진단이 가능하여 매우 유용하게 사용될 수 있다. 이에 따라 본 발명은 돼지열병바이러스의 조기진단, 예방 및 치료에 효율적으로 기여할 수 있다.

도 1는 본 발명의 일 실시예에 따른 재조합 ERNS-F2/-F3 항원 단백질의 dot-Immunoassay를 통한 항원성 검사 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 재조합 ERNS-F2/-F3 항원 단백질의 직접 효소면역 측정법을 통한 항원성 검사 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 돼지열병바이러스 감염의 탐지키트의 검체 적용 후의 반응 결과 예를 촬영한 사진이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 돼지열병바이러스 감염의 탐지키트의 분해 사시도를 개략적으로 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 돼지열병바이러스 감염의 탐지키트를 구성하는 스트립의 구조를 개략적으로 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 돼지열병바이러스 감염의 탐지키트를 촬영한 사진이다.
도 7은 ERNS 의 Predicted transmembrane segments for sequence 결과를 나타낸 그래프이다.
도 8은 막투과 절편 부위를 배제한 성숙 ERNS 단백질의 친수성(도 8a)/소수성(도 8b)파라미터에 관한 그래프이다.
도 9a 내지 도 9c는 각각 BVDV(KD26-1)(도 9a), CSFV LOM주(도 9b), 및 CSFV SW03주(도 9c)의 ERNS 유효항원성 부위의 항원 펩타이드(antigenic peptide)를 나타낸 것이다.
도 10a 및 도 10b는 각각 ERNS-F2에 대한 FPLC 결과 그래프(도 10a) 및 ERNS-F2의 정제된 전기영동사진(도 10b: 상기 도 10a 에서 붉은색 네모로 표시된 부분)이다.
도 11a 및 도 11b는 각각 ERNS-F3에 대한 FPLC 결과 그래프(도 11a) 및 ERNS-F2의 정제된 전기영동사진(도 11b: 상기 도 11a 에서 붉은색 네모로 표시된 부분)이다.
도 12는 BVDV KD26-1, CSFV LOM, CSFV SW03 주의 ERNS 유효항원성 부위의 항원 펩타이드(antigenic peptides) 및 유효 타깃 항원 도메인(domain)(candidate 1, candidate 2, 및 candidate 3)(붉은색 네모 부분)을 나타낸 것이다.
<도면의 주요 부분에 대한 부호의 설명>
1 : 면역분석장치
2 : 분석 스트립
21 : 검체 패드 22 : 멤브레인
221 : 검사선 222 : 대조선
23 : 흡수 패드 24 : 단변
25 : 장변
3 : 하부 케이스
3A, 3B : 제1, 제2 스트립 지지부
31 : 단변 고정부
32 : 장변 고정부 33 : 하부 차단부
4 : 상부 케이스
4A, 4B : 제1, 제2 스트립 대응부
41 : 검체 투입구 42 : 결과 표시창
43 : 문자 표시구

이하 실시예를 통해 본 발명에 따르는 돼지열병진단시스템 및 그 제조방법에 대하여 보다 상세하게 설명한다. 다만 이들 실시예는 본 발명의 내용을 이해하기 위해 제시되는 것일 뿐 본 발명의 권리범위가 이들 실시예에 한정되는 의도는 아니다.

실시예1 : 돼지열병바이러스 백신항체 감별진단을 위한 ERNS -F2 및 ERNS -F3항원의 준비

A. 재조합 ERNS -F1 항원 단백질 설계 및 유전자 제조

(a) 타겟 ERNS 구조 단백질의 분석 및 선정.

돼지열병바이러스의ERNS 구조단백질로부터 중요한 유효항원의 재조합 단백질을 제작하기위해 항원의 특이 항원성 및 수용성 단백질 확보를 바이오인포매틱스 분석 기술을 기반으로 표적 유전자의 핵산 염기 서열 및 아미노산 서열을 분석하여 최적의 유효 항원의 표적을 선정하였다.

유효항원 분석을 위한 ERNS 항원 단백질에 대한 아미노산 시퀀스는 국립수의과학검역원으로부터 제공받은 플래비비리데 페스티바이러스 (Flaviviridae , Pestivirus)에 속하는 소 바이러스성 설사증 바이러스 (Bovine viral diarrhea virus, KD26-1)와 돼지열병바이러스 백신용 LOM 주, 그리고 SW03주를 사용하였다.

타겟 유전자의 번역(translation) 산물의 막투과 절편 (transmembrane segment) 존재여부의 분석을 통해 막투과 절편 부위의 배제을 위해 아미노산 서열을 분석한 결과 돼지열병바이러스의 ERNS항원 단백질의 경우 1-26번째까지의 총 26개의 아미노산이 막투과 단백질로 분석되었다. Predicted transmembrane segments for sequence 결과 그래프를 도 7에 나타냈다.

타켓 유전자의 번역(translation) 산물에서 막투과 절편 부위를 배제하고 ERNS 타겟 단백질을 구성하고 있는 아미노산 서열의 친수성 및 소수성 부위를 결정하기 위해 분석하였다. 막투과 절편을 배제한 ERNS 단백질의 친수성/소수성파라미터에 관한 그래프를 도 8(친수성 파라미터: 도 8a/ 소수성 파라미터: 도 8b)에 나타냈다.

타겟 유전자의 번역(translation) 산물에서 유효 항원성 분위를 결정하기 위해 ERNS의 antigenic peptide를 분석한 결과 소 바이러스성 설사병 바이러스의 ERNS는 유효항원성 부위의 항원 펩타이드(antigenic peptide)가 11개, 돼지열병바이러스 LOM 주의 ERNS는 유효항원성 부위의 항원 펩타이드가 11개, 그리고 돼지열병바이러스 SW03주의 ERNS는 유효항원성 부위의 항원 펩타이드가 10개로 분석되었으며, 각각 도 9a, 9b, 및 도 9c에 나타냈다.

상기 결과를 토대로 ERNS의 유효항원의 설계는 막투과 절편을 제외하고 상기 3 종의 바이러스 주로부터 공통으로 존재하는 항원 펩타이드(antigenic peptide)와 아미노산 서열의 프로파일(profile)을 분석하여 유효 타깃 항원 도메인(domain)(도 12의 candidate 1(서열번호 20), 2(서열번호 21), 및 3(서열번호 22))을 부분적으로 채택하여 단백질의 항원성 및 용해성(수용성)을 극대화 할 수 있도록 최종적으로 설계 하였다.

상기 유효 타깃 항원 도메인(서열번호 20 내지 22)을 포함하도록 디자인된 ERNS-F1의 유전자확보를 위해 174bp의 올리고뉴클레오타이드(서열번호 3)를 바이오닉스 (Bionics, Korea)에서 합성하였다. 상기 합성된 올리고뉴클레오타이드(서열번호 3)는 제한효소 BamHI(NEB)과 EcoRI(NEB)를 사용하여 발현 벡터 pET23a (Novagen)내 다중 클로닝 사이트 BamHI과 EcoRI 사이에 삽입시켰으며, 이를 pET23a(+) ERNS-F1이라 명명하고, 상기 BamHI과 EcoRI 제한효소 부위, 및 서열번호 3의 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 염기서열과 아미노산 서열을 각각 서열번호 8 및 서열번호 9에 나타냈다.

상기 디자인된 ERNS-F1은 상기 돼지열병바이러스 LOM 주 및 상기 돼지열병바이러스 SW03주에 공통되는 ERNS 유효항원성 부위의 항원 펩타이드(antigenic peptide)인 유효 타깃 항원 도메인을 포함하므로 돼지열병바이러스의 모든 유전형에 관계없이 진단이 가능할 것으로 기대된다.

B. 재조합 ERNS -F2/-F3 항원 단백질 발현 벡터의 제조

(a) 실험재료 준비 및 중합효소연쇄반응 방법

pET23a(+) ERNS-F2/-F3 항원 단백질 발현벡터는 상기 제조된 pET23a(+) ERNS-F1(서열번호 8)을 주형으로 사용하고, 유전자 증폭을 위한 올리고뉴클레오타이드는 바이오닉스 (Bionics, Korea.)에서 합성 하였다(표 1).

ERNS 항원 제조에 사용된 올리고뉴클레오타이드

SEQ ID No.	Name	Sequence (5`→3`)	Other
10	ERNS-F2 sense	cg gAATTC GCAGGTACAGTTATAGAG	EcoRl
11	ERNS-F2 anti-sense	c aAGCTT GAGCCAAGATGTTACCCT	Hindlll
12	ERNS-F3 sense	ccc aAGCTT GCAGGTACAGTTATAGAG	Hindlll
13	ERNS-F3 anti-sense	cc cTCGAG GAGCCAAGATGTTACCCT	Xhol

상기 올리고뉴클레오타이드는 발현벡터 pET23a(+)로 클로닝하기 위한 제한 부위를 함유 하는 것으로 제조하였다.

중합효소연쇄반응 (50 ul volume)은 다음과 같이 설정하였다. Pfu DNA 중합효소 (1U)(Promega) 및 1X 버퍼, 더불어 25 uM씩 각각의 dNTP(dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP)(Promega), 10 pmol씩 각각의 올리고뉴클레오티드 Sense primer (서열번호 10 및 12)와 Anti-Sense primer (서열번호 11 및 13). 상기 반응은 95℃에서 5분간 배양된 후, 95℃에서 15초, 58℃에서 30초 및 72℃에서 40초씩을 27번 순환하여 증폭 시킨 후, 72℃에서 2분간 방치하였다. 중합효소연쇄-산물은 10% 아가로즈 젤에 로딩후 최종 산물의 사이즈가 일치 하는 것을 확인후 젤로부터 분리하였다.

(b) pET23a(+) ERNS-F2 항원 단백질 발현 벡터의 제조

ERNS-F2 재조합 항원 단백질을 발현하는 벡터를 제조하기 위해 주형인 pET23a(+) ERNS-F1(서열번호 8)에서 외부 프라이머 ERNS-F2 sense(서열번호10) 및 ERNS-F2 anti-sense (서열번호 11)를 사용하여, 중합효소연쇄반응 방법을 통하여 전체길이 174 bp(서열번호 3)(58개 아미노산: 서열번호 2)의 ERNS-F1 항원 유래 핵산(PCR-ERNS-F2, 서열번호 14)을 증폭시켰다. 이후 상기 실시예 1A(a)에서 제조된 발현벡터 pET23a(+) ERNS-F1 내에, 삽입된 서열번호 3의 올리고뉴클레오타이드의 3’ 말단 부위의 다중 클로닝 사이트인 EcoRI과, 이에 이웃한 다중 클로닝 사이트인 HindIII 사이에 상기 증폭된 중합효소연쇄반응 생산물을 제한효소 EcoRI(NEB)과 HindIII(NEB)를 사용하여 삽입시켜 ERNS-F1 항원 단백질이 2회 반복하여 포함된 ERNS-F2 항원 단백질 발현벡터를 제조하고, 이를 pET23a(+) ERNS-F2 이라 명명하였다. 상기 각 제한효소 부위와, 증폭된 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 염기서열과 아미노산 서열을 각각 서열번호 15 및 서열번호 16에 나타냈다.

(c) pET23a(+) ERNS-F3 항원 단백질 발현 벡터의 제조

ERNS-F3 재조합 항원 단백질을 발현하는 벡터를 제조하기 위해 주형인 pET23a(+) ERNS-F1(서열번호 8)에서 외부 프라이머 ERNS-F3 sense (서열번호12) 및 ERNS-F3 anti-sense (서열번호 13)를 사용하여, 중합효소연쇄반응 방법을 통하여 전체길이 174 bp(서열번호 3)(58개 아미노산: 서열번호 2)의 ERNS-F1 항원 유래 핵산(PCR-ERNS-F3, 서열번호 17)을 증폭시켰다. 이후 상기 실시예 1A(b)에서 제조된 발현벡터 pET23a(+) ERNS-F2 내에, 삽입된 서열번호 3의 올리고뉴클레오타이드의 3’ 말단 부위의 다중 클로닝 사이트인 HindIII와, 이에 이웃한 다중 클로닝 사이트인 XhoI 사이에 상기 증폭된 중합효소연쇄반응 생산물을 제한효소 HindIII(NEB)와 XhoI (NEB)를 사용하여 삽입시켜 ERNS-F1 항원 단백질이 3회 반복하여 포함된 ERNS-F3 항원 단백질 발현벡터를 제조하고, 이를 pET23a(+) ERNS-F3 이라 명명하였다. 상기 각 제한효소 부위와, 증폭된 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 염기서열과 아미노산 서열을 각각 서열번호 18 및 서열번호 19에 나타냈다.

(d) 중합효소연쇄반응 산물의 클로닝

구체적으로, 상기에 언급된 방법으로 pET23a(+) ERNS-F1에 중합효소연쇄반응 산물의 도입을 위해 증폭된 중합효소연쇄반응 산물들을 각각 제한 핵산 내부가수분해효소 (restriction endonucleases) EcoRI+ HindIII(NEB) 및 HindIII + XohI(NEB)로 분해하고 겔-분리되어진 벡터 pET23a(+) ERNS-F1로 직렬적으로 연결하였다.

상기 직렬적으로 연결된 결합 산물인 pET23a(+) ERNS-F2 및 pET23a(+) ERNS-F3은 대장균 DH5-alpha 수용세포(Invitrogen)들을 형질전환하는 데 사용된다. 상기 형질전환된 세포들은 100 ug/ml의 엠피실린이 첨가된 LB 배지(MPbio)에서 37℃의 진탕배양기(shaking orbital incubator)에 밤새 배양하였다. 미니프랩을 위한 DNA들은 콜로니 배지로부터 밤새 배양시켜 얻었으며 BamHI + HindIII(NEB)(pET23a(+) ERNS-F2(서열번호 15), 354 염기) 및 BamHI + XhoI(NEB)(pET23a(+) ERNS-F3(서열번호 18), 534염기)로 분해하여 소정의 클론들을 선별하였다. 또한 염기서열 분석을 통해서 정확한 상기 클로닝 산물들의 시퀀스를 확인하였다 (미도시).

C. 재조합 ERNS -F2/-F3 항원 단백질 발현 벡터를 갖는 대장균 균주의 성장 및 발현 유도

상기 실시예 1B에서 선별된 각 대장균 클론의 종균들을 100㎍/ml 의 엠피실린이 첨가된 50ml의 살균 LB배지(MPbio)에서 37℃의 진탕배양기(shaking orbital incubator)에 밤새 배양하였다. 50ml의 접종물을 종균으로부터 100㎍/ml의 앰피실린이 첨가된 0.5L의 무균 LB(MPbio)를 포함한 플라스크로 옮겨서, 이들이 중-대수증식 할 때까지 (OD값 약 0.7) 37℃로 배양하고, pET23a(+) ERNS-F2경우에는 0.5mM IPTG(isopropylthiogalactoside)로 25℃에서 밤새 배양하여 유도하였고, pET23a(+) ERNS-F3 경우에는 0.5mM IPTG(isopropylthiogalactoside)로 37℃에 4시간 배양하여 유도하였다. 상기 유도기 후에, 세포들을 원심분리기에서 펠렛화(7000 rpm, 10 min)하고 표준 절차에 따라 수거하였다. 펠렛화된 세포들은 다음 단계까지 -70℃에서 보관하였다. 가용성 및 불용성 단백질 발현을 분석하기 위해 융합 단백질의 경우 Lysis-Equilibration buffer (50mM NaH₂PO₄, 300mM NaCl, 1mM Immidazole, pH8.0)와 첨가하여 재부유하고, 상기 세포들은 초음파처리(ultrasonication)에 의해 분쇄하였다. 세포-용해질의 원심분리(13,000rpm, 30분)를 통해 수용성 용해질과 불용성 용해질로 분리하여 각각 15%의 SDS-PAGE에서 분석하여 가용성 단백질 여부를 확인한 결과 모두 불용해성 단백질이었다.

D. 재조합 ERNS -F2 /-F3 항원의 제조

상기 실시예 1C로부터 얻어진 결빙 세포들을 각각의 POLYHISTIDINE-TAGGED단백질 정제 표준절차에 따라 제조하였다.

각각의 표준절차는 다음과 같다.

발현을 확인한 세포들이 모두 불용해성 단백질로 발현되어 변성(denaturate)을 시킨 다음 다시 재접힘(refolding)하는 방식으로 실험을 진행하였다. ERNS-F2와 ERNS-F3단백질을 Lysis-Equilibration buffer (LEW, 50mM NaH₂PO₄, 300mM NaCl, 1mM Immidazole, pH8.0)를 첨가하여 재부유하고, lysozyme(MERCK)을 총 농도에 1mg/ml이 되도록 첨가하여 얼음에 30분동안 배양(incubation)했다. 그 후, 상기 세포들은 초음파처리(Ultrasonication)에 의해 분쇄하고 세포-용해질의 원심분리(13,000rpm, 30분)를 통해 펠렛부분만 남겼다. 그 후 다시 Lysis-Equilibration buffer로 펠렛을 lysis 시킨 후 원심분리(13,000rpm, 30분)를 하여 펠렛을 씻었다. 이후 Lysis buffer(8M Urea, 50mM NaH₂PO₄, 300mM NaCl, 5mM Immidazole, pH8.0)를 펠렛에 넣고 단백질을 변성시켰다. 펠렛이 잘 부유되도록 약간의 초음파처리를 하고 상온에서 30분간 배양(incubation)을 한 후 세포-용해질의 원심분리(13,000rpm, 30분)를 통해 수용성 단백질을 제조하였고, 0.45㎛의 주입필터(syringe filter, Sartorius)로 여과 시켰다.

융합 펩타이드를 용출 하기 위해 FPLC (Bio-Rad, BioLogic DuoFlow Standard System) 장비를 이용하였다. 친화성 크로마토그래피(Affinity chromatography)방법 중에 하나인 Ni-NTA His bind resin (Bio-Rad)을 사용하여 두 종류의 buffer(buffer A : 8M Urea, 50mM NaH₂PO₄, 300mM NaCl, 5mM Immidazole, pH8.0, buffer B : 8M Urea, 50mM NaH₂PO₄, 300mM NaCl, 250mM Immidazole,pH8.0)를 gradient 방법을 사용하여 융합 펩타이드를 용출하였다. (도 10a 및 도 11a).

상기 용출 단편은 15% SDS-PAGE에서 분석하였다. 정제된 융합 펩타이드는 재접힘(refolding)을 하기 위해 Urea를 버퍼 치환 방법을 통해서 서서히 제거하는 방법을 선택하였고, 최종 2mM 보레이트 (Sodium Tetraborate, pH9.0)에 밤새 버퍼를 치환하여, 0.2㎛ 필터를 통과시켜 냉장 보관하였다.

상기 재조합 ERNS-F2및 ERNS-F3 항원 단백질인 융합 펩타이드의 정제된 전기영동사진을 도 10b와 도 11b에 나타냈다.

실시예 2. 재조합 ERNS -F2 및 -F3 항원 단백질의 선별

A.재조합 ERNS -F2 및 -F3 항원 단백질의 dot - immunoassay 를 통한 선별

상기 ERNS-F2 및 -F3재조합 항원의 항원성 분석을 위해 상기 실시예 1D에서 정제된 항원을 이용하여 특이적으로 반응하는 항원을 도트 면역검정법(Dot Immunoassay)으로 재선별하고 진단용 항원으로 사용하였다 (도 1).

도트 면역검정법은 다음과 같은 과정에 따라 이루어졌다.

재조합 ERNS-F2 및 -F3 항원 단백질을 나이트로셀룰로우즈 멤브레인에 96공 도트 매니폴드(96-well hybrid-dot manifold, GibcoBRL, Gaitherburg, MO)를 이용하여 흡착시켰다. 그 후 blocking solution (5 % nonfatmilk-PBS solution)으로 상온에서 1 시간이상 blocking을 수행 비특이 반응을 억제시켰다. 2 % BSA-PBS solution에 1/50 비율로 희석한 돼지열병바이러스 항체 양성 표준검체를 상온에서 2 시간 동안 천천히 shaking하여 반응시켰다. 검체가 반응한 멤브레인은 TBST buffer (20 mM Tris pH 8.0, 137 mM NaCl, 0.05% Tween-20) 또는 PBST (1X PBS, 0.05% Tween-20) 으로 10 분씩 3번 membrane을 씻어 비특이적으로 결합한 검체내 물질을 제거한 뒤, HRP (houseradish peroxidase)-conjugated anti-swine IgG secondary antibody(5% nonfatmilk-TBST로 1/2000 배율로 희석)(Santa Cruze)를 상온에서 1 시간 shaking 하면서 반응시킨 후, TBST buffer로 10분씩 5회 membrane을 씻어주었다. 최종적으로 membrane은 Chemiluminescence Luminol reagent (GE Heathcare)와 상온에서 1분간 반응시킨 후 X-ray film (FUJIFILM )에 30 초~4 분간 감광시켰다 (도 1).

B. 재조합 ERNS -F2 및 -F3 항원 단백질의 직접 효소면역 측정법( direct ELISA)을 통한 선별

상기 ERNS-F2 및 -F3항원 단백질의 항원성 분석을 위해 상기 실시예 1D에서 정제된 항원을 각각 coating buffer(KOMA BIOTECH INC, K0331021)에 0, 100, 250, 500, 1000 (ng/ml)농도로 희석하여 well 당 100 ㎕씩 첨가 하고 4℃에서 overnight incubation하여 코팅시켰다. 코팅된 플레이트는 PBS를 이용하여 3회 반복하여 세척하고 Blocking solution (1% BSA/PBS)을 well 당 250 ㎕씩 첨가 후 상온에서 1시간 동안 반응하여 blocking을 수행하였다. blocking된 플레이트는 다시 PBS 세척용액을 이용하여 5회 반복하여 세척하고 1:50으로 희석된 돼지열병바이러스 항체 양성 검체를 웰당 200 ㎕씩 첨가 후 상온에서 1시간 동안 반응하였다. 시료의 반응이 완료된 플레이트는 PBS 세척용액을 이용하여 3회 반복하여 세척하고 anti-swine IgG HRP(1:5,000, Antibody Incorporated, USA)을 well 당 100 ㎕씩 첨가 후 상온에서 1시간 동안 반응하고 washing과정을 거친 후 TMB Substrate kit (KOMA BIOTECH INC, K0331060)로 발색반응을 유도하고 stop solution (2 M, H₂SO₄)으로 반응을 정지한 후 ELISA reader(TECAN) 450nm 파장 흡광도로 측정하여 분석하였다(도 2).

C. 결과

상기 실시예 2A 및 2B의 결과 본 발명의 실시예 1의 2개 재조합 항원은 돼지열병바이러스 감염 양성 검체 1 내지 3 (Specimen 1-3)에 모두 반응하는 것을 확인 하였으나 검체의 특성에 따라 그 항원성이 차별화됨을 확인하였다 (도 1 및 도2). 또한 2개의 재조합 항원 중 특히 ERNS-F2 융합 펩타이드가 모든 검체에서 반응성이 ERNS-F3 융합 펩타이드에 비해 더욱 높게 나타나 상대적으로 높은 항원성을 가짐을 확인할 수 있었다.

따라서 서열번호 4의 서열을 포함하는 재조합 항원 및 서열 번호 6의 서열을 포함하는 재조합 항원의 효능이 증명되었으며, 이와 같은 반응성을 나타내는 재조합 항원을 본 발명에 따르는 진단 키트의 제작에 사용하였다.

실시예 3. 돼지열병진단시스템 진단 스트립 및 진단 키트의 제조

A. 돼지열병바이러스 ERNS 항원이 코팅된 멤브레인(membrane)의 준비

2mM sodium tetraborate에 보존되어 있는 상기 재조합 단백질 ERNS-F2(서열번호 4) 및 ERNS-F3(서열번호 6)를 2 ㎎/㎖ 농도로 맞추어 검사선으로 사용하고, 대조선은 염소 항-마우스 이뮤노글로블린 G(Goat anti-mouse IgG)(Santa Cruze)를 사용하였다. 상기 검사선의 재조합 항원 및 대조선의 대조 용액은 디스펜싱 기구(KINAMETICS, USA)를 사용하여 니트로 셀룰로오스 막에 코팅하였다. 이후 낮은 습도의 실험실에서 밤새 건조하거나 적어도 5시간 이상 팬에서 건조시켰다. 상기 제조된 막의 플레이트는 건조제와 함께 밀봉된 컨테이너 또는 낮은 습도의 실험실에서 보관하였다.

B. 돼지열병바이러스 ERNS 항원 금 ( Gold ) 접합체 제조

상기 돼지열병바이러스 ERNS-F2/-F3 항원 또는 protein A(Sigma)를 최종 농도가 200㎍/㎖가 되도록 교반하면서 금 용액에 한 방울씩 첨가한 후, 이 용액을 다시 15분간 교반하였다. 그 후, 금 입자 부유 물에 10%의 BSA 용액을 첨가하였다. 다시 15분간 교반한 후, 결합된 금용액을 원심분리하여, 결합되지 않은 재조합 단백질를 제거하기 위해서 상등액은 버리고, 결합된 금 용액 펠렛에, 펠렛용량의 3배의 0.1%의 Casein과 1%의 BSA가 첨가된 5 mM 소디움 보레이트 (Sodium Tetraborate, pH7.2)을 첨가한 후 상기 펠렛을 재부유하였다. 상기 부유물을 다시 원심분리하고, 최종 펠렛을 0.1%의 Casein과 1%의 BSA가 첨가된 5 mM 소디움 테트라보레이트 (Sodium Tetraborate, pH7.2)에 스펙트로포토메타 530nm에서 흡광도가 10±1이 되게 조정하여 돼지열병바이러스 ERNS 항원 금 (Gold) 접합체를 제조하였다.

C. 마우스 이뮤노글로블린 G-금 접합체(( Mouse IgG - Gold Conjugate )의 준비: 항체 진단시스템의 대조 지표

항체 진단시스템의 대조선을 위한 금 접합를 준비하기 위해 아리스타(Arista, USA) 사에서 구입한 마우스 IgG를 최종 농도가 4 내지 20㎍/㎖가 되도록 교반하면서 금 용액에 한 방울씩 첨가한 후, 이 용액을 다시 15분간 교반하였다. 그 후, 금 입자 부유 물에 10%의 BSA 용액(Promega)을 첨가하였다. 다시 15분간 교반한 후, 결합된 금용액을 원심분리하여, 결합되지 않은 재조합 단백질를 제거하기 위해서 상등액은 버리고, 결합된 금 용액 펠렛에, 펠렛용량의 3배의 1%의 BSA가 첨가된 5 mM 보레이트 (Sodium Tetraborate, pH7.2)을 첨가한 후 상기 펠렛을 재부유하였다. 상기 부유물을 다시 원심분리하고, 최종 펠렛을 1%의 BSA가 첨가된 5 mM 보레이트 (Sodium Tetraborate, pH7.2)에 스펙트로포토메타 530nm에서 흡광도가 10+/-1이 되게 조정하여 제조하였다

D. 금 접합체 처리 패드의 준비

상기 실시예 3B 및 3C에서 제조된 금 접합체는 5% 트레할로스 (Trehalose)를 첨가하여 다음과 같이 제조하였다.

돼지열병바이러스 ERNS 항체 분석 스트립(strip)을 위해 0.5 x 20 cm 유리섬유에 상기 실시예 3B에서 제조된 돼지열병바이러스 ERNS 항원 금 접합체 또는 protein A 금 접합체가 최종농도 0.5 내지 2.5 OD (Optical Density)가 되도록, 그리고 상기 실시예 3C에서 제조된 마우스 IgG-금 접합체가 최종농도 0.5 OD가 되게 제조하였다.

E. 흡수 패드 및 검체패드 제조

흡수패드 및 검체패드는 반응용액이 잘 흡수될 수 있도록 건조하여 제조하였다.

F. 디바이스 조립

상기에서 제조된 1종의 진단제품을 선택하여 각각의 멤브레인 및 패드들을, 오른쪽부터 검체패드, 골드패드(금 접합체 처리 패드), 니트로셀룰로오스 멤브레인, 마지막으로 흡수패드를 각각 중첩되게 결합하고 면역분석장치(디바이스)에 크기에 맞는 스트립 크기로 절단하였다. 이렇게 절단된 스트립을 최종적으로 단독 면역분석장치 (싱글 디바이스)의 하판에 넣고 상판을 덮어 진단용 키트를 제조하였다(도 3).

G. 제품 구성

상기에서 설명된 면역분석장치와 검체 전개액 (PBS, 0.5% BSA, 0.1% NaN3)을 최종 제품으로 구성되도록 하였다(도 3).

서열목록 전자파일 첨부

Claims (18)

1. 서열번호 1의 아미노산 서열 중 N-말단으로부터 414 내지 421번째에 위치한 서열번호 20, 423 내지 437번째에 위치한 서열번호 21, 및 463 내지 471번째에 위치한 서열번호 22의 아미노산 서열을 필수적으로 포함하여 연속적인 아미노산 58개 내지 68개로 이루어진 항원 유래 펩타이드를 직렬적으로 2회 내지 5회 반복하여 포함하는,
   돼지열병바이러스에 대한 항체에 특이적인 융합 펩타이드.
2. 제1항에 있어서,
   상기 항원 유래 펩타이드는 서열번호 2의 아미노산 서열로 구성된 것인 융합 펩타이드.
3. 제2항에 있어서, 상기 서열번호 2의 아미노산 서열은 서열번호 3의 염기서열에 의해 암호화되는 것인 융합 펩타이드.
4. 제1항에 있어서,
   상기 융합 펩타이드는 서열번호 4 또는 서열번호 6의 아미노산 서열로 구성되는 것인 융합 펩타이드.
5. 제4항에 있어서, 상기 서열번호 4의 아미노산 서열은 서열번호 5의 염기서열에 의해 암호화되는 것인 융합 펩타이드.
6. 제4항에 있어서, 상기 서열번호 6의 아미노산 서열은 서열번호 7의 염기서열에 의해 암호화되는 것인 융합 펩타이드.
7. 서열번호 1의 아미노산 서열 중 N-말단으로부터 414 내지 421번째에 위치한 서열번호 20, 423 내지 437번째에 위치한 서열번호 21, 및 463 내지 471번째에 위치한 서열번호 22의 아미노산 서열을 필수적으로 포함하여 연속적인 아미노산 58개 내지 68개로 이루어진 항원 유래 펩타이드, 또는 상기 펩타이드를 직렬적으로 2회 내지 5회 반복하여 포함하는,
   돼지열병바이러스 감염 탐지용 조성물.
8. 제7항의 돼지열병바이러스 감염 탐지용 조성물을 포함하는, 돼지열병바이러스 감염 탐지키트.
9. 제8항에 있어서, 상기 키트는 촉매, 효소, 효소기질, 형광화합물, 화학발광화합물, 금속졸(Metal sol), 염료졸(Dye sol), 미립자 라텍스(Particulate latex), 칼라인디케이터(Color Indicator), 리포좀에 포함된 색재료(Color matter), 탄소졸 및 셀레늄졸로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 표지시약을 추가로 포함하는 탐지키트.
10. 제8항에 있어서, 상기 키트는 검체와 상기 감염 탐지용 조성물간의 항원-항체반응을 이용하여 돼지열병바이러스의 감염에 대한 ERNS 항체를 탐지하는 것인 탐지키트.
11. 제10항에 있어서, 상기 검체는 혈액, 혈청, 혈장, 림프액, 조직액, 소변, 눈물, 침, 젖, 구토물, 또는 분변인 탐지키트.
12. 제8항에 있어서, 상기 키트는 효소면역 측정법(ELISA) 키트, 블롯팅(Blotting) 키트, 면역침전법 키트, 면역형광검사 키트 또는 면역 스트립 형태인 탐지키트.
13. 제12항에 있어서, 상기 면역 스트립 형태의 탐지키트는
    검체를 흡수하는 검체 패드;
    검출 결과를 나타내는 멤브레인; 및
    검체 전개액을 흡수하는 흡수 패드를 포함하는 분석 스트립을 하나 이상 포함하는 것인 탐지키트.
14. 제13항에 있어서,
    상기 면역 스트립 형태의 탐지키트는 2 이상의 분석 스트립을 가지며,
    상기 분석 스트립 중 어느 하나는 서열번호 1의 아미노산 서열 중 N-말단으로부터 414 내지 421번째에 위치한 서열번호 20, 423 내지 437번째에 위치한 서열번호 21, 및 463 내지 471번째에 위치한 서열번호 22의 아미노산 서열을 필수적으로 포함하여 연속적인 아미노산 58개 내지 68개로 이루어진 항원 유래 펩타이드, 또는 상기 펩타이드를 직렬적으로 2회 내지 5회 반복하여 포함하는 융합 펩타이드가 고정된 멤브레인을 포함하고,
    다른 분석 스트립은 추가의 항원 또는 항체가 고정된 멤브레인을 포함하는 것인 탐지키트.
15. 제13항에 있어서, 상기 면역 스트립 형태의 탐지키트는
    상기 분석 스트립의 일면을 지지하는 하부 케이스; 및
    상기 하부 케이스에 결합되어 상기 분석 스트립의 다른 일면을 덮으며, 상기 검체 패드에 대응하는 검체 투입구와 상기 멤브레인에 대응하는 결과 표시창 및 상기 흡수 패드에 대응하는 문자 표시구를 포함하는 상부 케이스
    를 추가로 포함하는 것인 탐지키트.
16. 제7항의 돼지열병바이러스 감염 탐지용 조성물 또는 제8항의 탐지키트를 이용하여 돼지열병바이러스의 백신주와 야외주를 분별하는 방법.
17. 제16항에 있어서,
    상기 백신주는 순화 생독 백신주 또는 유전자 재조합 마커 백신주인 방법.
18. 검체를 준비하는 단계;
    상기 검체에 서열번호 1의 아미노산 서열 중 N-말단으로부터 414 내지 421번째에 위치한 서열번호 20, 423 내지 437번째에 위치한 서열번호 21, 및 463 내지 471번째에 위치한 서열번호 22의 아미노산 서열을 필수적으로 포함하여 연속적인 아미노산 58개 내지 68개로 이루어진 항원 유래 펩타이드, 또는 상기 펩타이드를 직렬적으로 2회 내지 5회 반복하여 포함하는 융합 펩타이드를 적용하는 단계; 및
    상기 검체와, 상기 항원 유래 펩타이드 또는 상기 융합 펩타이드간의 항원-항체 반응을 검사하는 단계
    를 포함하는, 돼지열병바이러스에 대한 항체 검출 방법.
    

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