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KR101281501B1 - 항인테그린 면역 컨쥬게이트, 방법 및 용도 - Google Patents

항인테그린 면역 컨쥬게이트, 방법 및 용도 Download PDF

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KR101281501B1
KR101281501B1 KR1020077015643A KR20077015643A KR101281501B1 KR 101281501 B1 KR101281501 B1 KR 101281501B1 KR 1020077015643 A KR1020077015643 A KR 1020077015643A KR 20077015643 A KR20077015643 A KR 20077015643A KR 101281501 B1 KR101281501 B1 KR 101281501B1
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모히트 트리카
로버트 제이. 루츠
리타 엠. 스티브스
가드프리 암플레트
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얀센 바이오테크 인코포레이티드
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Abstract

본 발명은 항인테그린 특이 항체와 세포 독성 화합물의 컨쥬게이트, 암치료 또는 세포 증식, 세포 이동, 또는 염증에 의해 매개되고, 병변이 새로운 조직의 혈관 형성 또는 신생 혈관을 포함하는 다른 질환에 사용되는 이러한 컨쥬게이트의 합성, 선택 및 용도에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 치료가 화학 요법, 수술 또는 방사선 치료를 포함하나, 이들에 한정되지 않는 하나 이상의 다른 치료법과 병용하여, 컨쥬게이트의 사용을 포함하는 이러한 질환의 병용 요법에 관한 것이다. 바람직한 컨쥬게이트는 디술파이드 결합에 의해 항체에 결합되는 메이탄시노이드 화합물을 함유하며, 바람직한 화학요법제는 독소루비신, 탁산, 캄프토테신, 포도필로톡신, 뉴클레오시드 유사체, 또는 피리미딘 유사체이다.

Description

항인테그린 면역 컨쥬게이트, 방법 및 용도 {ANTI-INTEGRIN IMMUNOCONJUGATES, METHODS AND USES}
본 발명은 종양 특이성 항체와 세포 독성 화합물의 컨쥬게이트에 관한 것이다. 바람직한 컨쥬게이트는 디술파이드 결합에 의해 항인테그린 항체에 결합되는 메이탄시노이드 화합물을 함유한다.
종양에 대한 표적화 유전자 도입에 의한 약물의 국소 농도를 올리기 위해 종양 관련 항원에 대한 모노클로널 항체 (Mabs)에 이러한 약물을 컨쥬게이트함으로써 항암약의 효능을 향상시키도록 다양한 시도가 이루어져 왔다. 반대로, 항체가 종양 세포를 실제로 파괴하는 퍼텐셜은 수용체에 결합하는 리간드를 블로킹하거나, 수용체 (ErbBl 및 ErbB2)로의 시그널링을 블로킹함으로써 증식 인자 EGF 및 Her-2, 또는 이펙터 기능을 이끌어내는 증식 인자 (ADCC 또는 CDC) 등의 증식 자극의 블로킹에 관한 항체에 한정된다. 따라서, Mab의 특이성과 대사독의 킬링 퍼텐셜 (killing potential)을 조합하는 산물이 시도되어 왔다. 전자의 예로는 독소루비신과 컨쥬게이트된 Mab BR96 (Braslawsky, et al., Cancer Immunol Immunother 33:367-374, 1991) 및 항증식 인자 항체 또는 단편에 융합되는 슈도모나스 엑소톡신 (Kreitment, et al., Internat. J. Immunopharm. 14(3):465-72, 1992)이다.
이러한 시도는 세포 당 외부 결합 부위의 수와 비교하여, 독소의 비교적 높은 세포내 농도의 요건 등의 예측하지 못한 한계와 부닥치게 된다. 암세포 표면 상의 종양 관련 항원 수가 105 분자/세포로 추정되면, 이들 컨쥬게이트에 효과적으로 사용될 수 있는 세포 독성제는 표적 암세포에 대하여 IC50값이 10-10 내지 10-11 M이어야 한다 (Chari, R. V. J. Adv. Drug Delivery Rev. 1998, 31, 89-104). 다음으로, 약물은 표적에 결합할 때에 방출되어, 세포를 침투해야 하거나, 전체의 컨스트럭트 (construct)가 분할되거나 그렇지 않으면 활성화된 세포 및 독소로 운반되어야 한다.
이들 결점 중 몇몇은 내재된 항체에 컨쥬게이트된 매우 강력한 약물을 이용하고, 세포내 조건하에서 불안정성을 향상시킨 화학 결합을 이용하여 크건 작건 간에 어느 정도 해결될 수 있다. 문헌 [참조: Chari et al., Cancer Res. 52:127-131, 1992; Liu et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 93:8618-8623, 1996; U.S. Patent No. 5,208,020]에 따르면, 항체가 디술파이드 결합을 통해 메이탄시노이드에 결합되어 있는 항체 컨쥬게이트를 발견했다.
메이탄시노이드는 식물 유래의 항진균제 및 항암제이다. 메이테누스 오바투스 (Maytenus ovatus) 및 메이테누스 부카나니이 (Maytenus buchananii)의 에탄올 추출물로부터의 3개의 안사 마크롤라이드의 분리는 최초로 에스. 엠. 쿱칸 (S. M. Kupchan) 등에 의해 보고되었으며, ㎍/kg 용량 범위로 뮤린 모델의 항백혈병 효과가 입증됨과 동시에 미국 특허 제3,896,111호의 주제이다. 그러나, 메이탄시노이 드는 중추 및 말초 신경 장애, 및 부작용, 특히 구역질, 구토, 설사, 간기능 검사의 상승, 및 일반적이지는 않지만 쇠약 및 무기력함을 일으키는 허용불가능한 독성을 갖는다. 따라서, 허용가능한 분해 반감기를 갖는 메이탄신-항체 컨쥬게이트를 형성하기 위해 적절한 화학 프로세스와 함께 정확한 표적 부분을 알아내는데 얼마 동안 연구가 집중되어 왔다.
유리 메이탄시노이드의 고 세포 독성과는 대조적으로, 항체 컨쥬게이트는 항원 양성 세포에 비하여, 항원 음성 세포에 대해 현저하게 낮은 독성을 갖는다. 디술파이드 결합에 의한 결합은 고 독성의 유리 약물을 방출하는 세포내 글루타티온에 의해 표적 내에서 용이하게 분해되는 이점을 갖는다. 이러한 접근법은 종양 관련 항원에 대한 항체, 예를 들면 C242-DM1 컨쥬게이트 (Liu et. al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 93:8618-8623, 1996), 및 HuN901-DM1 (Chari et. al., 2000)에 적용되어 왔다. 그러나, 이들 컨쥬게이트의 적용은 각각의 표적 항원의 한정된 발현으로 인해 제한된다.
따라서, 보다 고도로 발현되는 종양 관련 항원, 및 임의로 악성 종양의 증식기 및 전이기 시에 고도로 발현되는 항원에 타겟되는 항체를 사용하여, 가장 악성인 세포에 대한 자연농도의 독소를 고려함으로써, 이러한 접근법을 개선할 필요가 있다.
항인테그린 모노클로널 항체:
무시할 수 없는 증거에 따르면, 연속적인 종양 증식은 혈관 형성, 신생 혈관 형성에 따라, 종양에게 영양소 및 산소를 제공하고, 노폐물을 가져가며, 종양 세포 를 원격 부위로 전이하는 도관으로서 작용한다는 것이다 (Gastl et. al., Oncol.54: 177-184). 최근의 연구에서, 혈관 형성 프로세스에서의 인테그린의 역할을 규정하였다. 혈관 형성시에, 활성화된 내피 세포의 표면에서 발현되는 다수의 인테그린은 세포 이동, 증식 및 분화 등의 상이한 생물학적 사상을 조절하도록 다양한 ECM 단백질과의 중요한 접착 상호작용을 조절한다. 구체적으로, 근연 관계이나 상이한 인테그린 αVβ3 및 αVβ5은 혈관 형성 프로세스에서 비의존성 경로를 조절하는 것으로 알 수 있었다. αVβ3에 대하여 생성된 항체는 염기성 섬유아세포 증식 인자 (bFGF)로 유도되는 혈관 형성을 블록하는 반면, αVβ5에 특이적인 항체는 혈관 내피 증식 인자 (VEGF)로 유도되는 혈관 형성 (Eliceiri, et al., J. Clin. Invest. 103: 1227-1230 (1999); Friedlander et al., Science 270: 1500-1502 (1995))을 억제하였다. 따라서, 인테그린 및 인테그린을 함유하는 알파 V 서브유닛은 안질환 및 종양성 질환 등의 혈관 형성, 특정 세포 종류의 재협착 및 증식 등의 조직 리모델링을 포함하는 질환, 특히 상피세포암 및 편평상피세포암의 상당한 치료 표적이다.
항체 약물 컨쥬게이트:
세포 결합제와 고 세포 독성의 메이탄신과의 컨쥬게이트가 문헌에 기재되어 있다 (U.S. Patent Nos. 5,208,020 and 5,416,064; R. V. J. Chari et al., 1992 Cancer Res. 52:127-131). 단백질 아민기와의 반응에 관한 N-하이드록시숙신이미딜에스테르 (NHS) 등의 특정 시약 또는 반응물은 약물-단백질 컨쥬게이트를 형성하는데 사용하기 위해 개발되었다. 이러한 종류의 시약은 일반적으로 문헌 [참조: Carlsson et al., Biochem J. 173: 723, 1978] 및 미국 특허 제4,149,003호에 기재되어 있다. Mabs 및 다른 단백질에 대한 메이탄신 컨쥬게이션을 위한 니트로-피리딜 링커 시약은 국제 특허 공개 제WO2004/016801호에 개시되어 있다.
상술한 프로세스에 있어서, 세포 결합제는 활성 디술파이드 부분을 도입하도록 N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트 (SPDP) 등의 이작용성 물질에 의해 변형된다. 티올 함유 세포 독성제와의 반응으로, 모노클로널 항체 등의 세포 결합제 및 약물이 디술파이드 결합을 통해 결합되어 있는 컨쥬게이트가 제공된다. C-3 하이드록실 위치가 활성 손실없이 변형될 수 있으며, 실제로 특정 에스테르는 향상된 살세포 효과 (cell killing activity)를 나타내는 것으로 밝혀졌다 (리뷰를 위해, Cassady, et al. Chem Pharm Bull 52(1): 1-26, 2004 참조). 미국 특허 제5,208,020호 및 제5,416,064호에는 구체적으로 N-메틸-N-(3-메틸디티오프로파노일)-1-알라닌의 활성화된 메이탄솔 에스테르의 용도가 개시되어 있다. 상기 반응으로부터 얻어지고, 디술파이드 결합의 환원성 분해 시에 방출되는 메이탄소이드 부분은 DM1 [N2'-데아세틸-N2'-(3-머캅토-1-옥소프로필)-메이탄신, CAS Reg. No. 139504-50-0]으로 명명되어 왔다. 따라서, DM1의 메틸디티올화된 형태를 이용하여 제조된 모든 컨쥬게이트는 컨쥬게이트의 약물측의 디술파이드 결합에 인접하는 비치환된 메틸렌 탄소를 보유한다 (도 1).
이러한 디술파이드 결합의 생체 내 안정성을 향상시키기 위해서는, 이전에 언급된 바와 같이 입체 장애의 디술파이드 결합을 제공하는 것이 중요하다 (Thorpe, et al. Cancer Research 47:5924-31, 1987). 이러한 목적은 디술파이드 결합에 인접하는 탄소 원자 상에 1개 또는 2개의 메틸 치환기를 포함하는 가교제를 사용하거나, 술프히드릴 또는 디술파이드 치환기에 인접하는 알파 탄소 원자 상의 적어도 하나의 치환기를 포함하는 활성화된 약물을 사용함으로써 달성될 수 있다.
현재 표적화 유전자 도입의 문제가 분명히 인식되지만, 항체 특이성 및 친화성, 컨쥬게이션 화학, 및 독소의 적절한 조합이 예측될 수 없다는 것이다. 본 발명의 목적은 항체가 메이탄시노이드의 세포 파괴 용량을 운반하기에 숫적으로 충분한 세포 표면 항원을 향하고, 컨쥬게이트가 대상에게 투여될 때에 치료상 유효한 방출 속도를 제공하도록 적절한 화학 및 생물학적 안정성을 갖는 신규한 항체 메이탄신 컨쥬게이트를 제공하는데 있다.
본 발명의 목적은 항체가 메이탄시노이드의 세포 파괴 용량을 운반하기에 숫적으로 충분한 세포 표면 항원을 향하고, 항체가 표적 항원과 결합한 후에 세포에 의해 내재화되는 것으로 알려진 신규한 항체 메이탄신 컨쥬게이트를 제공하는데 있다. 구체적인 실시형태에 있어서, 컨쥬게이트는 대상에게 투여될 때에 치료상 유효한 방출 속도를 제공하도록 인접하는 메틸렌 탄소의 치환을 통해 엔지니어링된 디술파이드 결합을 포함한다. 구체적인 실시형태에 있어서, 본 발명은 IC50이 10-9 M 이하인 세포 독성제에 컨쥬게이트된 인간 알파V 인테그린 서브유닛에 결합하는 항체를 포함하고, 항체-약물 컨쥬게이트가 알파 V 인테그린 발현 암세포주에 세포 독성 또는 세포 정지 작용을 가하는 항체-약물 컨쥬게이트에 관한 것이다. 본 실시형태에 있어서, 본 발명의 항체는 알파V베타1, 알파V베타3, 알파V베타5, 알파V베타6, 또는 알파V베타8 헤테로 이량체 인테그린 단백질 또는 이의 단편 등의 헤테로 이량체 인테그린 수용체의 적어도 하나의 알파V 서브유닛에 대하여 특이적이다. 바람직한 컨쥬게이트는 디술파이드 결합에 의해 항체에 결합된 메이탄시노이드 화합물을 함유하고, 항체는 비트로넥틴 및 피브로겐을 결합할 수 있다.
한 측면에 있어서, 본 발명의 항체 컨쥬게이트는 식 [C-L]m-A (I) (여기서, A는 인간 알파V 인테그린 서브유닛 특이 항체이고, 항체는 알파V 서브유닛을 발현하는 세포에 의해 내재화될 수 있으며; C는 IC50이 10-9 M 이하인 세포독소이고; L은 항체 및 세포독소를 결합하는 연결기이며, 추가로 세포내 환경의 성분에 의해 분해가능한 결합을 포함하고; m은 항체에 결합되는 세포독소 분자의 평균수를 나타내며, 1 내지 10, 특히 3 내지 4의 정수이다.)으로 나타낸다. 세포독소는 메이탄시노이드, 칼리체아미신 (calicheamicin), 에포틸론 (epothilone), 디스코더몰라이드 (discodermolide), 엘루트롬빈 (eleuthrobin), 돌라스타틴 (dolastatin), 크립토파이신 (cryptophycin), 캄프토테신 (camptothecin), 리족신 (rhizoxin; CAS Reg. No. 90996546), 또는 탁산 (taxane) 유도체 및 10-9 M 이하에서 종양 세포 증식에 대하여 최대 저해율의 반값 (IC50 또는 GI50)을 나타내는 다른 화합물로 구성되는 그룹 중에서 선택될 수 있다.
본 발명의 제 1 목적의 측면에 있어서, 안티 알파V 인테그린 항체-메이탄시노이드 컨쥬게이트는 헤테로 이량체 인간 인테그린 수용체의 알파-V 서브유닛에 결합하기 위해 모노클로널 항체 CNTO 95와 경쟁하는 항체를 포함하는 분자를 포함하는 단백질 또는 펩티드를 포함한다. 일실시형태에 있어서, 항체는 상보성 결정 영역 (CDR)과 함께 항체로 혼입될 수 있는 중쇄 또는 경쇄 가변 영역, 중쇄 또는 경쇄 불변 영역, 프레임워크 영역, 이들의 부분과 결합하여, CNTO 95로 명명된 항체로부터 유도되는 중쇄 또는 경쇄 또는 이들의 리간드 결합 부분의 CDR의 적어도 일부를 포함한다. 본 명세서에 기재된 항체 CNTO 95는 인간 면역 글로불린의 발현에 대한 유전자를 포함하는 트랜스제닉 마우스의 면역 부여로부터 유도되는 인간 안티 알파V 항체이다. 따라서, 일실시형태에 있어서, 본 발명은 CNTO 95 항체로부터 유도되는 적어도 하나의 CDR 영역 또는 가변 영역을 포함하는 항체에 관한 것이다. 바람직한 실시형태에 있어서, 항체는 CNTO 95이다.
본 발명의 또 하나의 측면에 있어서, 항체-메이탄시노이드 컨쥬게이트는 세포내 환경의 성분에 의해 세포독소 C를 링커 L에 연결하는 결합 분해 시에 방출되는 메이탄시놀 에스테르를 포함한다. 일실시형태에 있어서, 메이탄시노이드는 아실기가 보호 술프히드릴기를 포함하고 있는 아실화 아미노산으로 C-3, C-14, C-15, 또는 C-20에서 에스테르화되고, 보호 술프히드릴기에 인접하는 아실기의 탄소 원자는 1개 또는 2개의 치환기를 가지며, 상기 치환기는 CH3, C2H5, 탄소 원자수가 1 내지 10인 직쇄상 알킬 또는 알케닐, 탄소 원자수가 3 내지 10인 분지상 또는 환상 알킬 또는 알케닐, 페닐, 치환된 페닐, 또는 헤테로사이클릭 방향족, 헤테로사이클로알킬 라디칼, 또는 H이고; 아실기는 카보닐 작용기와 황 원자 사이에 적어도 2개의 탄소 원자로 된 직쇄 길이를 갖는다. 바람직한 실시형태에 있어서, 메이탄시노이드는 3-메이탄시놀 에스테르이고, 아실화 아미노산기는 보호 술프히드릴에 인접하는 탄소 원자 상에 0, 1 또는 2개의 메틸기를 포함한다. 바람직한 실시형태에 있어서, 에스테르화된 메이탄시놀은 N2'-데아세틸-N2'-(3-머캅토-1-옥소프로필)-메이탄신 (DM1, CAS Reg. No. 139504-50-0), N2'-데아세틸-N2'-(4-머캅토-1-옥소펜틸)-메이탄신 (DM3), 및 N2'-데아세틸-N2'-(4-메틸-4-머캅토-1-옥소펜틸)-메이탄신 (DM4) 중에서 선택된다.
본 발명의 제 2 목적은 이상 증식으로 인해 발병되고 혈관 신생을 특징으로 하는 인간 증식성 질환의 치료에 유용한 항인테그린 항체-메이탄시노이드 컨쥬게이트 화합물을 제공하는 것이다. 특히 바람직한 실시형태에 있어서, 본 발명의 화합물은 유방암, 결장암, 직장암, 폐암, 전립선암, 신장암, 간암, 췌장암, 식도암, 위암, 자궁 내막염, 난소암, 자궁 경부암, 또는 골육종을 포함하는 암을 치료하는 방법에 사용된다. 본 발명의 화합물은 원발성 암의 예방 또는 치료, 또는 전이성 질환의 예방 또는 치료에 있어서 단독으로 사용되거나 다른 약제와 병용하여 사용될 수 있다.
본 발명의 제 2 목적의 또 하나의 방법은 암 치료 방법에 있어서의 항인테그린 항체 메이탄시노이드 컨쥬게이트 화합물과 화학요법제의 병용에 관한 것이다. 바람직한 컨쥬게이트는 디술파이드 결합에 의해 항체에 결합되는 메이탄시노이드 화합물을 함유하고, 바람직한 화학요법제는 독소루비신, 탁산, 캄프토테신, 포도필로톡신, 뉴클레오시드 유사체, 또는 피리미딘 유사체이다.
본 발명의 제 3 목적에 있어서, 항체-메이탄시노이드 컨쥬게이트는 항체를 N-숙신이미딜-(2-피리딜티오)알카노에이트 등의 이중 특이성 화학 링커 시약과 반응시키고, 이어서 미리 활성화된 메이탄시노이드와 반응시켜서, 디술파이드 교환 반응이 일어나서 항체와 메이탄시노이드 사이에 힌더드 디술파이드 결합이 형성되는 프로세스에서 제조된다.
본 발명의 또 하나의 측면에 있어서, 항체-메이탄시노이드 컨쥬게이트는 아실 부분이 보호 술프히드릴기를 포함하는 메이탄시놀 에스테르를 이용하여 제조된다. 일실시형태에 있어서, 메이탄시노이드는 아실기가 보호 술프히드릴기를 포함하고 있는 아실화 아미노산으로 C-3, C-14, C-15, 또는 C-20에서 에스테르화되며, 보호 술프히드릴기에 인접하는 아실기의 탄소 원자는 1개 또는 2개의 치환기를 가지며, 상기 치환기는 CH3, C2H5, 탄소 원자수가 1 내지 10인 직쇄상 알킬 또는 알케닐, 탄소 원자수가 3 내지 10인 분지상 또는 환상 알킬 또는 알케닐, 페닐, 치환된 페닐, 또는 헤테로사이클릭 아릴 부분, 헤테로사이클로알킬 부분, 또는 H이고; 아실기는 카보닐 작용기와 황 원자 사이에 적어도 2개의 탄소 원자로 된 직쇄 길이를 갖는다. 바람직한 실시형태에 있어서, 메이탄시노이드는 3-메이탄시놀 에스테르이고, 아실화 아미노산기는 보호 술프히드릴에 인접하는 탄소 원자 상에 0, 1 또는 2개의 메틸기를 포함한다. 바람직한 실시형태에 있어서, 에스테르화된 메이탄시놀은 N2'-데아세틸-N2'-(3-머캅토-1-옥소프로필)-메이탄신 (DM1, CAS Reg. No. 139504-50-0), N2'-데아세틸-N2'-(4-머캅토-1-옥소펜틸)-메이탄신 (DM3), 및 N2'-데아세틸-N2'-(4-메틸-4-머캅토-1-옥소펜틸)-메이탄신 (DM4) 중에서 선택된다.
본 발명의 또 하나의 측면에 있어서, 안티 알파 V 인테그린 항체-메이탄시노이드 컨쥬게이트는 실질적으로 반응성 에스테르를 갖는 메이탄시노이드를 미리 화학적으로 활성화되지 않는 항인테그린 항체와 반응시키는 단일 단계에 의해 제조된다. 메이탄시노이드의 반응성 에스테르는 N-숙신이미딜, N-술포숙신이미딜, N-프탈이미딜, N-술포프탈이미딜, 2-니트로페닐, 4-니트로페닐, 2,4-디니트로페닐, 3-술포닐-4-니트로페닐 또는 3-카복시-4-니트로페닐 에스테르일 수 있다.
1. 정의
본 발명을 더욱더 용이하게 이해할 수 있도록, 먼저 특정 용어에 대하여 정의한다. 추가되는 정의는 상세한 설명을 통해 나타낸다. 용어 "알파V 인테그린", "알파V 서브유닛 인테그린", 및 "인테그린을 함유하는 알파V 서브유닛"은 작용성 인테그린 헤테로 이량체의 알파V 막관통 당 단백질 서브유닛을 의미하고, 알파V의 모든 변이체, 이소형 및 종 동족체 (species homolog)을 포함하도록 본 명세서에서 교호적으로 사용된다. 따라서, 본 발명의 항체는 어떤 경우에 있어서는 인간 이외의 다른 종의 알파V, 또는 인간 알파V (예를 들면, 인간 알파V 동족체)에 구조적으로 관련된 다른 단백질과 교차 반응할 수 있다. 다른 경우에 있어서는, 항체는 인간 알파V에 대하여 완전 특이성을 나타내나, 교차 반응성을 지닌 종 또는 다른 종류에 대해서는 특이성을 나타내지 않는다.
본 명세서에 사용된 "항체"는 전체 항체 및 항원 결합 단편 또는 이의 단쇄를 포함한다. 따라서, 항체는 이들에 한정되지 않으나, 본 발명의 항체에 혼입될 수 있는 중쇄 또는 경쇄 또는 이의 리간드 결합 부분, 중쇄 또는 경쇄 가변 영역, 중쇄 또는 경쇄 불변 영역, 프레임워크 (FR) 영역, 또는 이들의 부분의 적어도 하나의 상보성 결정 영역 (CDR), 또는 결합 단백질의 적어도 일부 등의 적어도 일부의 면역 글로불린 분자를 포함하는 단백질 또는 펩티드 함유 분자이다. 항체는 뮤린, 인간, 인간화되거나 키메라일 수 있다.
"항원 결합 단편" 또는 이의 부분은 단쇄 항체 및 이의 단편을 포함한다. 기능성 단편은 포유동물의 알파-V 서브유닛에 결합하는 항원 결합 단편이다. 항체의 용어 "항원 결합 부분" 내에 포함되는 결합 단편의 예로는 (i) Fab 단편, VL, VH, CL 및 CH 도메인으로 구성되는 1가 단편; (ii) F(ab')2 단편, 힌지 영역에서 디술파이드 가교로 결합되는 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편; (iii) VH 및 CH 도메인으로 구성되는 Fd 단편; (iv) 항체의 단일 암의 VL 및 VH 도메인으로 구성되는 Fv 단편; (v) VH 및 VL 도메인이 단일 폴리펩티드 쇄에 발현되나, 지나치게 짤아서 동일 쇄 상의 2개의 도메인 사이를 결합 (pairing)할 수 없으므로, 도메인을 다른 쇄의 상보 도메인과 결합시켜, 2개의 항원 결합 부위를 형성시키는 링커가 사용되는 dAb 단편; 및 (vi) 분리된 상보성 결정 영역 (CDR)을 들 수 있다. 또한, Fv 단편, VL 및 VH 중 2개의 도메인이 분리된 유전자에 의해 코드화되더라도, 이들은 재조합 방법을 이용하여, 이들이 VL 및 VH 영역이 결합하여 1가 분자 (단쇄 (scFv)로서 알려짐)를 형성하는 단일 단백질 쇄로서 형성될 수 있는 합성 링커에 의해 결합될 수 있다. 이러한 단쇄 항체도 항체의 용어 "항원 결합 부분" 내에 포함되도록 사용된다. 이들 항체 단편은 당업계에 공지된 통상적인 기술을 이용하여 얻어지고, 단편은 무상 항체에서와 동일한 방법으로 사용하기 위해 스크린된다. 이러한 단편은 당업계에 공지되고/되거나 본 명세서에 기재된 바와 같이, 효소적 절단, 합성적 기법 또는 재조합 기법으로 제조될 수 있다.
용어 "에피토프"는 항체에 특이적 결합을 할 수 있는 단백질 결정 인자를 의미한다. 에피토프는 통상 아미노산 또는 당 측쇄 등의 분자의 화학적 활성 표면 그룹으로 구성되고, 통상 특이적 삼차원 구조 특성 및 비전하 특성을 갖는다. 입체구조 및 비입체구조 (nonconformational) 에피토프는 후자가 아니라 전자에 대한 결합이 변성 용매의 존재하에 손실된다는 점에서 구별된다. 용어 "미변성 입체구조 (native conformational) 에피토프" 또는 "미변성 단백질 에피토프"는 본 명세서에서 교호적으로 사용되고, 인테그린 분자의 직쇄상 배열의 상이한 부분의 아미노산이 3차원 공간에서 근접하게 모일 때 일어나는 인테그린 분자의 컨포메이셔널 폴딩 (conformational folding)으로 인한 단백질 에피토프를 포함한다. 이러한 입체구조 에피토프는 세포막의 세포외 측부에 분포된다.
본 명세서에 사용된 용어 "인간 항체"는 인간 생식 세포 계열 면역 글로불린 시퀀스로부터 유도되거나 근접하게 매칭하는 가변 및 불변 영역을 갖는 항체를 포함하는 것으로 사용된다. 본 발명의 인간 항체는 인간 생식 세포 계열 면역 글로불린 시퀀스에 의해 코드되는 않는 아미노산 잔기를 포함한다 (예를 들면, 시험관 내에서의 랜덤 또는 부위 특이적 돌연변이 또는 생체 내에서의 체세포 돌연변이에 의해 도입되는 돌연변이). 따라서, 본 명세서에 사용된 용어 "인간 항체"는 실질적으로 단백질의 모든 부분 (예를 들면, CDR, 프레임워크, CL, CH 도메인 (예를 들면, CH1, CH2, CH3), 힌지, (VL, VH))이 실질적으로 인간 생식 세포 계열 항체와 유사한 항체를 말한다. 인간 항체는 이들의 아미노산 서열 유사성에 기초하여 그룹으로 분류되어 있다 (참조: 예를 들면, http://people.cryst.bbk.ac.uk/~ubcg07s/). 따라서, 서열 유사성 서치를 이용하여, 유사한 직쇄상 배열을 갖는 항체가 "인간화 항체"를 생성하는 주형으로서 선택될 수 있다.
"인간화" (리셰이핑 또는 CDR 그라프팅이라고도 칭함)는 현재 이종 소스 (통상 설치류)로부터의 모노클로널 항체 (mAb)의 면역원성을 저하시키고, 이펙터 기능을 향상시키기 위한 기지의 기술이다 (ADCC, 보체 활성화, Clq 결합). 유전자 조합된 mAb는 분자 생물학 기법을 이용하여 유전자 조합되나, 설치류 상보성 결정 영역 (CDRs)의 인간 프레임워크로의 단순한 CDR 그라프팅으로 인해, 종종 원래의 mAb의 결합 친화성 및/또는 특이성의 손실을 가져온다. 항체를 인간화하기 위해, 인간화 항체의 디자인은 CDR의 잔기의 동류 아미노산 치환, 및 설치류 mAb의 잔기의 인간 프레임워크 영역으로의 복귀 치환 (복귀 돌연변이) 등의 변이를 포함한다. 위치는 구조 분석의 서열 비교 또는 가변 영역의 3차원 구조의 호몰로지 모델의 분석에 의해 식별되거나 확인될 수 있다. 친화성 성숙 프로세스는 선택된 위치에서 아미노산을 변화시키도록 가장 최근에 사용된 파아지 라이브러리를 갖는다. 유사하게는, 설치류 CDRs를 그라프트하는 가장 적절한 인간 프레임워크를 선택하기 위해 다수의 접근법이 사용되어 왔다. 항체 구조에 대한 공지의 파라미터의 데이터세트가 증가함에 따라, 이들 기법이 정교화되고 개량된다. 단일 항체의 컨센서스 또는 생식 세포 계열 시퀀스, 또는 다수의 상이한 인간 mAbs의 각각의 경쇄 또는 중쇄 가변 영역 내의 프레임워크 시퀀스의 단편이 사용될 수 있다. 인간화를 위한 또 하나의 접근법은 다만 설치류 시퀀스의 표면 잔기를, 인간 mAb에 발견되는 가장 통상적인 잔기로 변형하는 것으로, "리서피싱 (resurfacing)" 또는 "버니어링 (veneering)"으로 명명되어 왔다. 공지의 인간 Ig 시퀀스가 예를 들면, 각각 본 명세서에 전체로서 참고로 포함되는 www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi; www.ncbi.nih.gov/igblast; www.atcc.org/phage/hdb.html; www.kabatdatabase.com/top.html; www.antibodyresource.com/onlinecomp.html; www.appliedbiosystems.com; www.biodesign.com; antibody.bath.ac.uk; http://www.unizh.ch/~antibody/; www.cryst.bbk.ac.uk/~ubcgO7s; Kabat et al., Sequences of Protein of Immunological Interest, U.S. Dept. Health (1983)에 개시되어 있다.
"키메라 항체"는 상이한 도메인, 통상 the 가변 도메인, 한 종류 및 다른 종류의 잔부를 보유하는 항체; 예를 들면 마우스-인간 키메라이다.
본 명세서에 사용되는 용어 "모노클로널 항체" 또는 "모노클로널 항체 조성물"은 단일 분자 조성물의 항체 분자의 제제를 말한다. 일실시형태에 있어서, 인간 모노클로널 항체는 트랜스제닉 비인간 동물, 예를 들면 불사화 세포에 융합되는 인간 중쇄 트랜스진 및 경쇄 트랜스진을 포함하는 게놈을 갖는 트랜스제닉 마우스로부터 얻어진 B 세포를 포함하는 하이브리도마에 의해 생산된다. 그러나, 일반적으로, 시퀀스를 코드하는 항체는 클론되어, 숙주 세포 또는 생식 세포주로 삽입된다.
본 명세서에 사용된 용어 "재조합 숙주 세포" (또는 간단히 "숙주 세포")는 재조합 발현 벡터가 도입된 세포를 말한다. 이러한 용어는 특정 대상 세포뿐만 아니라, 이러한 세포의 자손을 의미하는 것으로 사용됨은 물론이다. 특정 변형이 돌연변이 또는 환경 영향으로 인해 후세에서 일어날 수 있기 때문에, 이러한 자손은 실제로 친세포와 동일하지 않을 수 있으나, 여전히 본 명세서에 사용된 용어 "숙주 세포"의 범위 내에 포함된다. 재조합 숙주 세포의 예로는 CHO 주 또는 마우스 골수종 SP/O로 유도된 세포주를 들 수 있다.
본 명세서에 사용된 용어 "재조합 인간 항체"는 (a) 인간 면역 글로불린 유전자 또는 이로부터 제조된 하이브리도마의 유전자 도입 또는 트랜스크로모소멀한 (transchromosomal) 동물 (예를 들면, 마우스)로부터 분리된 항체, (b) 항체를 발현하도록 형질전환된 숙주 세포, 예를 들면 트랜스펙토마로부터 분리된 항체, (c) 재조합, 조합 인간 항체 라이브러리로부터 분리된 항체, 및 (d) 다른 DNA 서열에 대한 인간 면역 글로불린 유전자 배열의 스플라이싱 (splicing)을 포함하는 다른 수단에 의해 제조, 발현, 생산 또는 분리되는 항체 등의 재조합 수단에 의해 제조, 발현, 생산 또는 분리되는 모든 인간 또는 인간화 항체를 포함한다.
본 명세서에 사용된 "분리된 항체"는 실질적으로 상이한 항원 특이성을 갖는 다른 항체를 포함하지 않는 항체를 의미하는 것으로 사용된다 (예를 들면, 알파V에 특이적으로 결합하는 분리된 항체는 실질적으로 알파V 이외의 항원에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하지 않는다.). 그러나, 인간 알파V의 에피토프, 이소형 또는 변이체에 특이적으로 결합하는 분리된 항체는 예를 들면, 다른 종 (예를 들면, 알파V 종 동족체)의 다른 관련 항원에 대하여 교차 반응성을 갖는다. 또한, 분리된 항체는 다른 세포 물질 및/또는 화학 물질을 포함하지 않는다.
본 명세서에 사용된 "특이적 결합"은 소정의 항원에 결합하는 항체를 r말한다. 전형적으로, 항체는 10-7 M 이하의 해리상수 (KD)로 결합하고, 소정의 항원 또는 근연 항원 이외의 비특이적 항원 (예를 들면, BSA, 카제인)에 결합하기 위해 이의 KD 보다 적어도 2배 낮은 KD를 갖는 소정의 항원에 결합한다.
본 명세서에 사용된 "이소타입"은 중쇄 불변 영역 유전자에 의해 코드되는 항체 클래스 (예를 들면, IgM 또는 IgG1)를 말한다.
약어:
Abs: 항체, 폴리클로널 또는 모노클로널
aV: 인테그린 서브유닛 알파 V
b3: 인테그린 서브유닛 베타 3
bFGF: 염기성 섬유아세포 증식 인자
HUVEC: 인간 배꼽 정맥 내피
IFN: 인터페론
Ig: 면역 글로불린
IgG: 면역 글로불린 G
Mab: 모노클로널 항체
NPB = N-숙신이미딜-5-니트로-(2-피리딜디티오)부티레이트
SMCC = 숙신이미딜 4-(N-말레이미도메틸)사이클로헥산-1-카복실레이트
SMNP = N-숙신이미딜 4-메틸-4-(5-니트로-2-피리딜디티오)펜타노에이트
SMPT = 4-숙신이미딜옥시카보닐-(2-피리딜디티오)톨루엔
SPDB = N-숙신이미딜-4-(2-피리딜디티오)부티레이트
SPDP = N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트
SPP = N-숙신이미딜-4-(2-피리딜티오)펜타노에이트
SP = N-숙신이미딜 4-(2-피리딜)
SS = 술포숙신이미딜
SSNPP = 술포숙신이미딜-N-숙신이미딜-4-(5-니트로-2-피리딜디티오)펜타노에이트
VEGF: 혈관 내피 증식 인자
2. 조성물
A. 본 발명의 항체 컨쥬게이트
본 발명의 항체 컨쥬게이트는 식 [C-L]m-A (I) (여기서, A는 인간 알파V 인테그린 서브유닛 특이 항체이고, 항체는 알파V 서브유닛을 발현하는 세포에 의해 내재화될 수 있으며; C는 IC50이 10-9 M 이하인 세포독소이고; L은 항체 및 세포독소를 결합하는 연결기이며, 추가로 세포내 환경의 성분에 의해 분해가능한 결합을 포함하고; m은 항체에 결합되는 세포독소 분자의 평균수를 나타내며, 1 내지 5, 바람직하게는 3 내지 4의 정수이다.)으로 나타낸다. 세포독소는 메이탄시노이드, 칼리체아미신, 에포틸론, 디스코더몰라이드, 엘루트롬빈, 돌라스타틴, 크립토파이신, 캄프토테신, 리족신 (CAS Reg. No. 90996546), 또는 탁산 유도체 및 10-9 M 이하에서 종양 세포 증식에 대하여 최대 저해율의 반값 (IC50 또는 GI50)을 나타내는 다른 화합물로 구성되는 그룹 중에서 선택될 수 있다.
세포내에서 절단가능한 결합을 포함하는 링커는 시스-아코니틸 결합 등의 산에 불안정한 결합, 에스테르, 산에 예민한 히드라존 결합, 리소좀 분해성 펩티드 링커, 하이드로라제 분해성 링커, 펩티다제 또는 프로테아제 특이적 링커, 및 디술파이드 (술프히드릴) 링커를 포함한다 (검토를 위해, Dyba, M., et al. 2004 Curr Pharm Design 10:2311-2334 참조). 세포내 조건 대 예를 들면, 순환시에 두드러진 조건하에서 더욱더 신속하거나 선택적인 분해를 행함으로써, 링커는 또한 컨쥬게이트의 전체의 약리학에 추가의 특이성 및 안전성을 부여한다. 디술파이드 결합은 세포내 컴파트먼트 내의 유리한 환원 전위 및 유도성 산화환원효소 활성화 때문에 특히 바람직하다 (Saito, G. et al. Adv. Drug Delivery Rev 2003 55:199-215). 본 발명의 일실시형태에 있어서, 결합은 항체 분자, 예를 들면 시스테인 잔기의 측쇄에 존재하는 황 원자와, 독성 화합물에 존재하는 황 원자 사이이다. 또 하나의 실시형태에 있어서, 결합 부분은 하나 이상의 원자 또는 화학기로 구성된다.
재조합 단백질 등의 생체 분자를 화합물에 화학적으로 결합하는데 있어서의 또 하나의 고려해야 할 주요 사항은 유도체화 화학반응에 의해, 대부분의 경우에 지금까지 알려지지 않은 생물학적 성질을 갖는 신규 화합물을 수득할 것이다. 따라서, 생리학적 분해의 생성물이 생물 활성을 지닌 의도된 유도체를 수득하도록 디자인되는 것을 알 수 있다. 도 1에 나타낸 DM1, DM3, DM4 및 다른 것들을 포함하는 본 발명의 메이탄시노이드는 생물 활성을 보유한다.
본 발명의 안티 알파V 인테그린 항체-메이탄시노이드 컨쥬게이트는 항체의 생물 활성을 크게 감소시키지 않고서 안티 알파V 항체를 메이탄시노이드 분자에 화학적으로 결합하여, 생리조건하에서 방출될 때에 이의 세포 독성 퍼텐셜을 보유하는 메이탄시노이드를 제공함으로써 제조된다. 적절한 메이탄시노이드의 예로는 메이탄시놀 에스테르 및 메이탄시놀 유사체로, 변성 방향족환을 갖는 것 및 C-19, C-20, 또는 C-14, 또는 C-15, 또는 C-4,5 데옥시에서 변형되는 것을 포함하나, 이들에 한정되지 않는다. 바람직한 메이탄시노이드는 메이탄시놀 C-3 에스테르이다. 특히 바람직한 메이탄시노이드는 메이탄시놀의 N-메틸-알라닌 에스테르의 유도체 (N2'-데아세틸-메이탄신)이다. 특히 바람직한 컨쥬게이트는 환원에 의해 분해될 때에 유리 티올을 함유하는 대응하는 메이탄시노이드를 방출하는 디술파이드 결합을 포함한다. 바람직한 종류의 티올 함유 메이탄시노이드는 도 1에 나타낸다: N2'-데아세틸-N2'-(3-머캅토-1-옥소프로필)-메이탄신 (DM1, CAS Reg. No. 139504-50-0), N2'-데아세틸-N2'-(4-머캅토-1-옥소펜틸)-메이탄신 (DM3), 및 N2'-데아세틸-N2'-(4-메틸-4-머캅토-1-옥소펜틸)-메이탄신 (DM4).
본 발명의 항체 분자의 컨쥬게이트 및 독성 화합물은 현재 공지되거나 후에 개발되는 기술을 이용하여 생성될 수 있다. 예를 들면, 세포 독성 화합물은 변형되어 유리 아미노기를 형성한 다음, 산에 불안정한 링커 또는 광해리성 링커를 통해 항체 분자에 결합될 수 있다. 독성 화합물은 펩티드로 축합된 후에, 계속해서 항체 분자에 결합되어, 펩티다제에 불안정한 링커를 생성할 수 있다. 독성 화합물을 처리하여, 일차 하이드록실기를 형성하고, 이를 숙시닐화하고 항체 분자에 결합하여, 유리 약물을 유리시키도록 세포내 에스테라제에 의해 분해될 수 있는 컨쥬게이트를 생성할 수 있다.
항체 A와 세포독소 C 사이에 디술파이드 결합을 형성시키기 위해, 바람직하게는 독성 화합물을 처리하여, 유리 또는 보호 티올기를 형성한 다음에, 하나 이상의 디술파이드 또는 티올 함유 독성 화합물은 디술파이드 결합에 의해 항체 분자에 공유결합된다. 디술파이드 결합은 직접 항체의 유리 티올로 형성될 필요나 없으나, 예를 들면 이작용성 링커를 항체의 유리 아민기에 결합하는 것과 같이, 디술파이드 교환 부위를 도입하도록 항체 내의 반응기의 유도체화에 의해 형성될 수 있다. 예를 들면, 항체 분자는 공지의 방법에 의해 N-숙신이미딜 3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트 (SPDP), A-숙신이미딜-옥시카보닐-a-메틸 a-(2-피리딜디티오)-톨루엔 (SMPT), N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티오)-부티레이트 (SDPB), N-숙신이미딜-4-(2-피리딜디티오) 펜타노에이트 (SPP), N- 숙신이미딜-5-(2-피리딜디티오)펜타노에이트, 2-이미노티올란 (IT) 또는 무수 아세틸숙신산 등의 가교제로 변형될 수 있다.
따라서, 본 발명의 안티 알파V 인테그린 항체-세포독소 컨쥬게이트는 일반식 II로 나타내며, 메이탄시놀은 C-3에서 에스테르화되고, 항체는 안티 알파V 인테그린 서브유닛 항체이며; R1, R2, X1 및 X2는 독립적으로 H, Me, C2H5, 탄소 원자수가 1 내지 10인 직쇄상 알킬 또는 알케닐, 탄소 원자수가 3 내지 10인 분지상 또는 환상 알킬 또는 알케닐, 페닐, 치환된 페닐, 또는 헤테로사이클릭 아릴 부분, 또는 헤테로사이클로알킬 부분을 나타내고; n은 1 내지 5이며; p는 1 내지 5이고; m은 1 내지 10이다.
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바람직한 실시형태에 있어서, 링커 부분은 SPP로부터 유도되는 4-티오펜타노에이트 또는 4-티오펜타노에이트이다. 그 다음에, 이렇게 하여 유도된 유리 또는 보호 티올기기를 포함하는 항체 분자는 디술파이드 함유 또는 티올 함유 독성 화합물과 반응하여, 컨쥬게이트를 생성한다. 컨쥬게이트는 HPLC 또는 겔 여과에 의해 정제될 수 있다.
B. 본 발명의 안티 알파-V 서브유닛 항체
결합 알파V 이외에도, 인간 항체 또는 항원 결합 단편 또는 상술한 것의 부분은 다음과 같은 본 발명의 항체의 다른 기능 특성의 보유를 위해 선택될 수 있다:
1) 인간 알파V를 발현하는 생세포에 결합;
2) 매트릭스 단백질에 대한 생세포 결합을 방지;
3) KD가 10-8 M 이하 (예를 들면, 10-9 M 또는 10-10 M 이하)인 인간 알파V에 결합;
4) 알파V에 대한 칼슘 비의존성 결합을 나타냄;
5) 알파V 상의 특이적 에피토프에 결합하거나, 알파V에 결합하는 항체의 특이적 상보 그룹에 포함;
6) 시험관 내 또는 생체 내에서의 혈관 형성 억제; 또는
7) 생체 내에서의 종양 덩어리 감소 또는 종양 증식의 예방.
본 발명의 또 하나의 측면에 있어서, 본 발명의 인간 안티 알파 V 항체, CNTO 95의 구조 특성은 알파V에 대한 결합 등과 같은 본 발명의 항체의 적어도 하나의 기능 특성을 보유하는 구조적으로 관련된 인간 안티 알파 V 항체를 생성하는데 사용된다. 특히, CNTO 95의 하나 이상의 CDR 영역은 공지의 인간 프레임워크 영역 및 CDRs과 재조합적으로 결합되어, 추가의 재조합 기술에 의해 만들어진 본 발명의 인간 안티 알파 V 항체를 생산한다.
바람직한 실시형태에 있어서, 본 명세서에 기재된 안티 알파V 항체 컨쥬게이트에 사용되는 항체는 인간 면역 글로불린의 발현을 위한 유전자를 포함하는 트랜스제닉 마우스의 면역 부여로부터 유도되는 인간 안티 알파 V 항체이다. 항체의 생산은 본 명세서에 참조로 포함되는 PCT 특허 공개 제WO 02/12501호 및 미국 특허 공개 제2003/040044호에 상세히 기재되어 있다. 항체는 항체로 혼입될 수 있는 중쇄 또는 경쇄 가변 영역, 중쇄 또는 경쇄 불변 영역, 프레임워크 영역, 이들의 부분과 결합하여, "CNTO 95"로 명명된 항체 (PCT 특허 공개 제WO 02/12501호 및 미국 특허 공개 제2003/040044호 참조)로부터 유도되는 중쇄 또는 경쇄 또는 이들의 리간드 결합 부분의 상보성 결정 영역 (CDR)의 적어도 일부를 포함하는 단백질 또는 펩티드 함유 분자를 포함한다.
바람직하게는, 상술한 바와 같은 재조합 기술로 만들어진 항체의 CDR1, 2, 및/또는 3은 본 명세서에 개시된 바와 같은 트랜스제닉 마우스의 면역 부여에 의해 생성된 CNTO 95, GenOlOl, CNTO 95, C371A로 명명되는 완전 인간 Mab의 것과 정확한 아미노산 서열을 포함한다. 그러나, 당업자는 CNTO 95의 정확한 CDR 서열로부터의 약간의 이탈이 가능하고, 알파 V를 효과적으로 결합하는 능력 (예를 들면, 동류 치환)을 여전히 부유할 수 있음을 인지할 것이다. 특정 실시형태에 있어서, 항체 또는 항원-결합 단편은 대응하는 CDRs 1, 2 및/또는 3 (예를 들면, 서열 번호 1, 2, 및/또는 3)의 아미노산 서열을 갖는 적어도 하나의 중쇄 CDR (즉, CDR1, CDR2 및/또는 CDR3)의 적어도 일부를 포함하는 항원-결합 영역을 가질 수 있다. 또 하나의 특정 실시형태에 있어서, 항체 또는 항원 결합 부분 또는 변이체는 CNTO 95의 경쇄의 대응하는 CDRs 1, 2 및/또는 3 (예를 들면, 서열 번호 4, 5, 및/또는 6)의 아미노산 서열을 갖는 적어도 하나의 경쇄 CDR (즉, CDR1, CDR2 및/또는 CDR3)의 적어도 일부를 포함하는 항원-결합 영역을 가질 수 있다. 바람직한 실시형태에 있어서, 항체 또는 항원-결합 단편의 3개의 중쇄 CDRs 및 3개의 경쇄 CDRs는 mAb CNTO 95의 대응하는 CDR의 아미노산 서열을 갖는다. 따라서, 또 하나의 실시형태에 있어서, 재조합 기술로 만들어진 항체는 예를 들면, CNTO 95의 하나 이상의 CDRs와 90%, 95%, 98% 또는 99.5% 동일한 하나 이상의 CDRs로 구성될 수 있다. 본 발명의 안티 알파-V 서브유닛 항체는 이들에 한정되지 않지만, 서열 번호 1, 2, 3, 4, 5, 6 중 적어도 하나의 인접한 아미노산의 5 내지 전체 중에서 선택되는 적어도 부분, 서열 또는 조합을 포함할 수 있다. 안티 알파-V 서브유닛 항체는 또한 임의로 서열 번호 7, 8 중 적어도 하나의 연속한 아미노산의 70 내지 100% 중 적어도 하나의 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 예를 들면, 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 서열 번호 8의 서열과 결합할 수 있거나, 또는 중쇄 CDR3의 아미노산 서열은 서열 번호 7과 비교될 수 있다.
본 명세서에 개시되어 주장된 바와 같이, 서열 번호 1 내지 8에 나타낸 서열은 "컨서버티브 시퀀스 변형 (conservative sequence modifications)", 즉, 뉴클레오티드 서열에 의해 코드되거나 아미노산 서열을 함유하는 항체의 결합 특성에 상당히 영향을 미치거나 이를 변경시키지 않는 아미노산 서열 변형을 포함한다. 이러한 컨서버티브 시퀀스 변형은 아미노산 치환, 첨가 및 결실을 포함한다. 변형은 부위 특이적 돌연변이 유발법 및 PCR 매개 돌연변이 유발법 등의 당업계에 공지된 표준적 방법에 의해 서열 번호 1 내지 8 또는 이들을 코드하는 핵산에 도입될 수 있다. 동류 아미노산 치환 (conservative amino acid substitution)은 아미노산 잔기가 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로 치환되는 것을 포함한다. 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기 패밀리는 당업계에 정의되어 있다. 이들 패밀리는 염기성 측쇄 (예를 들면, 리신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄 (예를 들면, 아스파르트산, 글루탐산), 비전하 극성 측쇄 (예를 들면, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인, 트립토판), 비극성 측쇄 (예를 들면, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌), 베타 측쇄 (예를 들면, 트레오닌, 발린, 이소류신) 및 방향족 측쇄 (예를 들면, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)을 갖는 아미노산을 포함한다. 따라서, 인간 안티 알파 V 항체의 예측된 비필수 아미노산 잔기는 바람직하게는 동일한 측쇄 패밀로부터의 다른 아미노산 잔기로 치환된다.
본 발명의 적어도 하나의 항체는 적어도 하나의 알파V 서브유닛 단백질, 이들의 서브유닛, 단편, 부분 또는 혼합물에 특이적인 적어도 하나의 특정 에피토프에 결합한다. 적어도 하나의 에피토프는 단백질의 적어도 일부를 포함하는 적어도 하나의 항체 결합 영역을 포함할 수 있고, 에피토프는 바람직하게는 단백질의 적어도 하나의 세포외, 가용성, 친수성, 외부 또는 세포질 부분으로 구성된다. 적어도 하나의 특정 에피토프는 적어도 1 내지 3개의 아미노산의 적어도 하나의 아미노산 서열과 서열 번호 9의 인접한 아미노산의 전체 특정 부분의 조합을 포함할 수 있다.
상술한 바와 같이, 본 발명은 또한 항체, 항원 결합 단편, 면역 글로불린 쇄 및 본 명세서에 기재된 아미노산 서열과 실질적으로 동일한 서열의 아미노산을 포함하는 CDRs에 관한 것이다. 바람직하게는, 이러한 항체 또는 항원 결합 단편, 및 이러한 쇄 또는 CDRs를 포함하는 항체는 고 친화성 (예를 들면, 약 10-9 M 이하의 KD)을 지닌 인간 알파-V 서브유닛과 결합할 수 있다. 본 명세서에 기재된 서열과 실질적으로 동일한 아미노산 서열은 아미노산 결실 및/또는 삽입 뿐만 아니라 동류 아미노산 치환도 포함하는 서열을 갖는다.
기능에 필요불가결한 본 발명의 안티 알파-V 서브유닛 항체의 아미노산은 부위 특이적 돌연변이 유발법 또는 알라닌-스케닝 돌연변이 유발법 등의 당업계에 공지된 방법에 의해 동정될 수 있다 (예를 들면, Ausubel, supra, Chapters 8, 15; Cunningham and Wells, Science 244:1081-1085 (1989)). 후자의 방법은 분자의 잔기마다 단일 알라닌 돌연변이를 도입한다. 그 다음에, 얻어진 돌연변이 분자는 이것에 한정되지 않지만, 적어도 하나의 알파-V 서브유닛 중화 활성 등의 생물 활성을 테스트한다. 항체 결합에 중요한 부위도 결정, 핵자기 공명 또는 광친화성 표지 등의 구조 분석에 의해 확인될 수 있다 (Smith, et al., J. Mol. Biol. 224:899-904 (1992) and de Vos, et al., Science 255:306-312 (1992)).
3. 컨쥬게이트의 제조 방법
본 발명에 따라 화합물 DM1, DM3 및 DM4, 및 관련된 활성화된 메이탄시노이드 (도 1)의 생산에 사용된 출발 화합물, 메이탄시놀은 환원성 분해에 의해 자연원으로부터 분리된 메이탄신 천연 C-3 에스테르로부터 제조될 수 있다 (Kupchan et al., J. Amer. Chem. Soc.97, 5294(1975)). -40℃에서의 테트라히드로푸란 중의 시약 리튬 트리메톡시알루미늄 하이드라이드은 이 단계에서 특히 유용하다. 다른 천연 메이탄시노이드 에스테르는 또한 메이탄시놀, 메이타나신, 또는 메이탄시놀 프로피오네이트 등의 C-3 메이탄시놀 에스테르를 생산하도록 엔지니어된 노르카르디아 (Nocardia) 속 (미국 특허 제4,151,042호) 또는 Actinosynnema spp.에 속하는 미생물을 배양액 중에 배양하고, 추가의 정제를 위해 배양액으로부터 화합물을 추출함으로써 유리하게 생산될 수 있다. 예를 들면 디술파이드기, 티오에테르기, 산에 불안정한 기, 광해리성 기, 펩티다제에 불안정한 펩티드 링커, 또는 산에 불안정하거나 에스테라제 분해능을 가질 수 있는 에스테르를 포함하는 항체 메이탄시노이드 컨쥬게이트를 제조하기 위한 당업계에 공지된 연결기가 많다.
미국 특허 제5,208,020호에 개시된 바와 같이, 예를 들면, N-메틸-N-[3-(메틸디티오)-1-옥소프로필]-1-알라닌을 포함하는, 메틸디티오기 또는 다른 보호 티오기를 포함하는 카복실산을 갖는 메이탄시놀 또는 유사체는 대응하는 디술파이드 함유 메이탄시노이드를 생산한다. D- 및 L-아실 측쇄를 포함하는 2개의 디아스테레오머가 생산되는 경우에는, WO03096782에 기재된 바와 같이, 디아스테레오머 메이탄시노이드 에스테르는 당업계에 공지된 방법에 의해 용이하게 분리되고, 덜 바람직한 D-알라닐 유사 이성질체 산물이 감소되어, 메이탄시놀이 회수된다. 디티오트레이톨에 의한 디술파이드기의 환원성 분해에 의해, 대응하는 티올 함유 메이탄시노이드를 생성시키며, 이는 디술파이드 또는 티오에테르 결합을 통해 세포 결합제에 용이하게 결합된다. 티올-메이탄시노이드는 물-아세토니트릴의 그래디언트로 용리하는 역상 모드에서 C18 칼럼을 이용한 HPLC로 정제될 수 있다.
이작용성 커플링 시약:
적어도 하나는 단백질 또는 폴리펩티드를 포함하는 2개의 물질의 컨쥬게이트의 제조시에 컨쥬게이트의 성분, 컨쥬게이션 반응에 통상 사용되는 컨쥬게이트된 분자의 아미노기를 공유결합시키기 위해 이작용성 물질을 사용하는 것으로 알려져 있다. 이작용성 단백질 커플링제는 N-숙신이미딜-(2-피리딜디티오)프로피오네이트 (SPDP), 숙신이미딜-4-(N-말레이미도메틸)사이클로헥산-1-카복실레이트, 이미노티올란 (IT), 디메틸 아디프이미데이트·HCl 등의 이미도에스테르의 이작용성 유도체, 디숙신이미딜 수베레이트 등의 활성 에스테르, 글루타르알데히드 등의 알데히드, 비스(p-디아조늄벤조일)-에틸렌디아민 등의 비스-디아조늄 유도체, 디이소시아네이트 (톨릴렌 2,6-디이소시아네이트), 및 1,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠 등의 비스 활성 플루오르 화합물을 포함한다. SPDP는 이를 위해 가장 흔히 사용되는 사용되는 시약으로, 많은 다른 N-숙신이미딜-(2-피리딜디티오)-, N-숙신이미딜-(5-니트로-2-피리딜디티오)- 또는 N-숙신이미딜-(4-피리딜디티오)-단쇄 알칸산이 유용한 것으로 입증되었다. 도 2는 통상 사용되는 이작용성 링커 및 이의 약성어의 구조를 나타낸다.
티올화된 메이탄시노이드에 대한 활성화된 항체의 컨쥬게이션:
CNTO 95-메이탄시노이드 컨쥬게이트의 제조는 이전에 기재되고 (Chari et al., Cancer Res. 52: 127-131, 1992 및 미국 특허 제5,208,020호), 도 3에 개략적으로 나타낸 방법을 따랐다. 이 방법에 있어서는, 항체는 항체 아미노산 측쇄 상에 디티오피리딜기를 도입하도록 5 내지 10:1의 범위의 링커 대 항체의 비율로 이작용성 링커로 변형된다. 활성화된 항체는 G25 겔 여과 크로마토그래피에 의해 잔류 링커와 분리된다. 정제 후의 링커 항체 비율은 5 내지 10:1 미만이고, 전형적으로 3 내지 5:1이며, 252 nm 및 280 nm에서 흡광도로 측정된다. 활성화된 티올-메이탄시노이드는 측정된 링커의 몰량에 대하여 과잉 몰량으로 가해진다. 컨쥬게이션 후에, 혼합물은 다시 G25 사이즈 배제 크로마토그래피로 정제되어, 벌크 생성물을 얻는다.
다른 방법에서는, 항인테그린 항체 메이탄시노이드 컨쥬게이트는 실질적으로 반응성 에스테르를 함유하는 메이탄시노이드를 미리 화학적으로 활성되지 않은 항인테그린 항체와 반응시키는 단일 단계로 제조된다. 메이탄시노이드의 반응성 에스테르는 N-숙신이미딜, N-술포숙신이미딜, N-프탈이미딜, N-술포프탈이미딜, 2-니트로페닐, 4-니트로페닐, 2,4-디니트로페닐, 3-술포닐-4-니트로페닐 또는 3-카복시-4-니트로페닐 에스테르일 수 있다. 상기 방법은 그 내용이 본 명세서에서 참조로 포함되는 국제 특허 공개 제WO2002098883호에 기재되어 있다.
4. 본 발명의 컨쥬게이트를 사용하는 방법
본 발명의 항체는 암 또는 이의 하나 이상의 증상을 예방, 치료, 처치 또는 개선하도록 이를 필요로 하는 대상에게 투여될 수 있다. 본 발명의 항체는 또한 하나 이상의 다른 치료제, 바람직하게는 암의 예방, 처치 또는 치료에 유용한 치료제 (후술하는 예방제 또는 치료제를 포함하나, 이들에 한정되지 않음)과 병용하여, 암 또는 이의 하나 이상의 증상을 예방, 치료, 처치 또는 개선하도록 이를 필요로 하는 대상에게 투여될 수 있다. 구체적인 실시형태에 있어서, 본 발명은 본 발명의 안티 알파V 항체 컨쥬게이트를 포함하는 제제의 예방적 또는 치료적 유효량의 용량을 이를 필요로 하는 대상에게 투여하는 것을 포함하는, 암 또는 이의 하나 이상의 증상을 예방, 치료, 처치 또는 개선하는 방법을 제공한다. 또 하나의 실시형태에 있어서, 본 발명은 예방적 또는 치료적으로 유효한 하나 이상의 치료제 (예를 들면, 수술, 방사선 치료, 또는 안티 알파V 항체 컨쥬게이트 이외의 치료제 투여)과 병용하여, 본 발명의 안티 알파V 항체 컨쥬게이트의 예방적 또는 치료적 유효량의 용량을 이를 필요로 하는 대상에게 투여하는 것을 포함하는, 암 또는 이의 하나 이상의 증상을 예방, 치료 또는 개선하는 방법을 제공한다. 본 발명의 항체 컨쥬게이트는 1차, 2차, 3차 또는 4차 암치료로서 사용될 수 있다. 본 발명은 대상의 암의 하나 이상의 증상을 치료하거나 개선하기 위한 방법을 제공한. 또한, 본 발명은 본 발명의 안티 알파V 항체 컨쥬게이트를 투여함으로써, 치료되어, 질환 활동성을 지니지 않는 환자의 암의 재발을 예방하는 방법을 제공한다 .
본 발명에 의해 망라된 방법에 의해 치료될 수 있는 암은 신생물, 종양, 전이, 또는 억제되지 않는 세포 증식을 특징으로 하는 질환 또는 장애를 포함하나, 이들에 한정되지 않는다. 암은 원발암 또는 전이암일 수 있다. 암세포는 알파V 서브유닛 인테그린을 발현하거나 발현하지 않을 수도 있다. 바람직한 실시형태에 있어서, 본 발명의 방법에 따라 처치, 치료 또는 개선되는 암은 인테그린 알파V 서브유닛을 발현하는 암이고, 환자 체내의 다른 부위 또는 기관으로 전이되거나, 전위될 가능성이 있다. 본 발명에 의해 망라된 방법에 의해 치료될 수 있는 암의 구체적인 예로는 두부암, 경부암, 안암, 구강암, 인후암, 식도암, 흉부암, 골육종, 폐암, 결장암, 직장암, 위암, 전립선암, 유방암, 난소암, 신장암, 간암, 췌장암, 및 뇌종양을 포함하나, 이들에 한정되지 않는다. 추가의 암으로는 다음을 포함하나, 이들에 한정되지 않는다: 이들에 한정되지 않으나, 급성 백혈병, 급성 림프성 백혈병, 골수아구성 백혈병, 전골수구성 백혈병, 골수단구성 백혈병, 단구성 백혈병, 적백혈병 백혈병 등의 급성 골수성 백혈병 및 골수이형성 증후군, 이들에 한정되지 않으나, 만성 골수성 (과립구성) 백혈병, 만성 림프성 백혈병, 유모 세포 백혈병 등의 만성 백혈병 등의 백혈병; 진성 적혈구 증가증; 이들에 한정되지 않으나, 호지킨병, 비호지킨 림프종 등의 림프종; 다발성 골수종, 비분비성 골수종, 골경화성 골수종, 형질 세포성 골수종, 고립성 형질세포종 및 수외성 형질세포종 등의 골수종; 왈렌스트롬 마크로글로불린혈증; 골육종, 골수종 골질환, 골육종, 연골육종, 유윙 육종, 뼈의 파제트병, 악성 거대세포종, 골섬유육종, 척색종, 골막육종, 연부 조직 육종, 맥관육종 (혈관육종), 섬유육종, 카포시 육종, 평활근육종, 지방육종, 림프관 육종, 신경초종, 횡문근육종, 활막육종 등의 골육종 및 결합 조직 육종; 이들에 한정되지 않으나, 신경교종, 성상세포종, 비신경교종, 천신경초종, 두개인두종, 수아종, 수막종, 송과체세포종, 송과체아세포종, 원발성 뇌림프종 등의 뇌종양; 선암 및 선관뇌암, 및 유두 유방암을 포함하는 유방암; 갈색세포종 및 부신피질암을 포함하는 부신암; 갑상선암; 췌장암; 하수체암; 이들에 한정되지 않으나, 눈 흑색종, 맥락막 흑색종, 모양체 흑색종, 및 망막아종을 포함하는 안암; 질 암; 외음암; 자궁 경관부암; 이들에 한정되지 않으나, 자궁 내막암 및 자궁 육종을 포함하는 자궁암; 난소암; 이들에 한정되지 않으나, 편평상피암, 선암, 점액표피양암, 선편평상피암, 육종, 흑색종, 형질세포종, 우췌상 암, 및 연맥세포 (소세포) 암 등의 식도암 및 다른 두부암 및 경부암; 위암; 결장암; 직장암; 간세포암 및 간아종, 담낭암 등의 간암; 담관암; 비소세포 폐암, 편평상피암 (표피암), 선암, 폐 대세포암 및 소세포 폐암 등의 폐암; 고환암, 융모막암종 (난황낭 종양), 전립선암; 페날 (penal) 암; 이것에 한정되지 않으나, 편평상피암을 포함하는 구강암; 기저세포암; 타액선암; 신세포암 및 다른 신장암; 및 이행세포암을 포함하나, 이것에 한정되지 않는 방광암 (이러한 질환의 검토를 위해, DeVita, V. T., Hellman, S., & Rosenberg, S.A. Cancer: Principles and practice of oncology. Philadelphia: J. B. Lippincott Company; 6th Edition, 2001 참조). 전암 상태는 또한 본 발명의 방법 및 조성물에 의해 처리될 수 있다. 이러한 암은 여포성 림프종, p53 돌연변이를 갖는 암종, 유방, 전립선 및 난소의 호르몬 의존성 종양, 및 가족성 선종성 용종증 등의 전암 병변, 및 골수이형성 증후군을 포함하나, 이들에 한정되지 않는다.
바람직한 실시형태에 있어서, 본 발명의 방법에 따라 예방, 처치, 치료 또는 개선되는 암은 전립선암, 유방암, 골육종, 흑색종, 폐암 및 난소암 중에서 선택된다. 또 하나의 실시형태에 있어서, 본 발명의 방법에 따라 예방, 처치, 치료 또는 개선되는 암은 대상의 뼈에 전이되거나 전이될 수 있는 종양 (비한정적인 예는 뼈에 전이되었거나 전이될 가능성이 있는 전립선암, 유방암 및 폐암이다), 대상의 폐에 전이되거나 전이될 수 있는 종양, 뇌에 전이되었거나 전이될 수 있는 종양, 및 대상의 다른 기관이나 조직에 전이되거나 전이될 수 있는 종양을 포함하나, 이들에 한정되지 않는 전이성 종양 중에서 선택된다.
항암 요법:
암 또는 이의 하나 이상의 증상을 예방, 치료, 처치 또는 개선하는데 유용하다고 알려지거나, 또는 이용되었거나 현재 이용되고 있는 약제 또는 요법 (예를 들면, 화학 요법, 방사선 요법, 호르몬 요법, 및/또는 생물 요법 또는 면역 요법)은 본 명세서에 기재된 발명에 따라 본 발명의 안티 알파V 항체 컨쥬게이트와 병용하여 사용될 수 있다. 치료제 또는 예방제는 펩티드, 폴리펩티드, 단백질, 융합 단백질, 핵산 분자, 소분자, 모방제, 합성 드러그, 무기 분자 및 유기 분자를 포함하나, 이들에 한정되지 않는다. 이러한 약제 (즉, 항암제)는 세포독소, 혈관 형성 저해제, 및 면역조절제 및 통증을 없어지게 하거나 하나 이상의 치료제의 유해 효과를 상쇄하는데 사용되는 약제 (예를 들면, 글루코코르티코이드의 고칼슘혈증 영향을 줄이도록 비스포스포네이트 사용)를 포함하나, 이들에 한정되지 않는다.
생물학적 면역조절제는 다음을 포함한다: 안티 CD3 항체 등의 안티 T 세포 수용체 항체 (예를 들면, 누비온 (Nuvion) (Protein Design Labs), OKT3 (Johnson & Johnson), 또는 안티 CD20 항체 리툭산 (Rituxan) (IDEC)), 안티 CD52 항체 (예를 들면, CAMPATH 1H (Ilex)), 안티 CD1 1a 항체 (예를 들면, 자넬림 (Xanelim) (Genentech)); 항사이토카인 또는 항사이토카인 수용체 항체 및 안티 IL-2 수용체 항체 등의 길항제 (Zenapax (Protein Design Labs)), 안티 IL-6 수용체 항체 (예를 들면, MRA (Chugai)), 및 안티 IL-12 항체 (CNTO 1275 (Centocor)), 안티 TNF 알파 항체 (Remicade (Centocor)) 또는 TNF 수용체 길항제 (Enbrel (Immunex)), 안티 IL-6 항체 (BE8 (Diaclone) 및 CNTO 328 (Centocor)), 및 종양 관련 항원에 면역 특이적으로 결합하는 항체 (예를 들면, 트라스투지맙 (trastuzimab) (Genentech)).
혈관 형성 저해제 (즉, 혈관 형성 저해제)는 안지오스타틴 (플라스미노겐 단편); 항혈관형성 안티트롬빈 III; 안지오자임 (angiozyme)을 포함하나, 이들에 한정되지 않는다. 비스포스포네이트는 알레드로네이트, 클로드로네이트, 에티드로네이트, 이반드로네이트, 파미드로네이트, 리세드로네이트, 틸루드로네이트, 및 졸레드로네이트를 포함하나, 이들에 한정되지 않는다.
본 발명의 방법에 따라 사용될 수 있는 항암제의 구체적인 예로는 5-플루오르우라실; 아시비신; 알데스루킨; 알트레타민; 아미노글루테티미드; 암사크린; 아나스트로졸; 안트라마이신; 아스파라기나제; 아자시티딘; 아제테파; 아조토마이신; 바티마스타트; 비칼루타미드; 블레오마이신 술페이트; 브레퀴나르 나트륨; 브로피리민; 부술판; 카보플라틴; 카르무스틴; 카루비신 하이드로클로라이드; 카르젤레신; 세데핀골; 클로람부실; 시롤레마이신; 시스플라틴; 클라드리빈; 크리스나톨 메실레이트; 사이클로포스파미드; 시타라빈; 다카르바진; 닥티노마이신; 다우노루비신 하이드로클로라이드; 데시타빈; 덱소르마플라틴; 데자구아닌; 데자구아닌 메실레이트; 디아지쿠온; 도세탁셀; 독소루비신; 독소루비신 하이드로클로라이드; 드롤록시펜; 드롤록시펜 시트레이트; 드로모스타놀론 프로피오네이트; 두아조마이신; 에다트렉세이트; 에플로르니틴 하이드로클로라이드; 엔로플라틴; 엔프로메이트; 에피프로피딘; 에피루비신 하이드로클로라이드; 에르불로졸; 에소루비신 하이드로클로라이드; 에스트리무스틴; 에스트리무스틴 인산나트륨; 에타니다졸; 에토포시드; 에토포시드 포스페이트; 파자라빈; 펜레티니드; 플록스우리딘; 플루다라빈 포스페이트; 플루오로우라실; 플루로시타빈; 포스퀴돈; 포스트리에신 나트륨; 겜시타빈; 겜시타빈 하이드로클로라이드; 하이드록시우레아; 이다루비신 하이드로클로라이드; 이포스파미드; 일모포신; 인터루킨 II (재조합 인터루킨 II, 또는 rIL2) , 인터페론 알파-2a; 인터페론 알파-2b; 인터페론 알파-m; 인터페론 알파-n3; 인터페론 베타-Ia; 인터페론 감마-Ib; 이프로플라틴; 이리노테칸 하이드로클로라이드; 란레오티드 아세테이트; 레트로졸; 루프롤리드 아세테이트; 리아로졸 하이드로클로라이드; 로메트렉솔 나트륨; 로무스틴; 로속산트론 하이드로클로라이드; 마소프로콜; 메클로레타민 하이드로클로라이드; 메게스트롤 아세테이트; 멜렌게스트롤 아세테이트; 멜팔란; 메노가릴; 머캅토푸린; 메토트렉세이트; 메토트렉세이트 나트륨; 메토프린; 메투레데파; 미토마이신; 미토스페르; 미토탄; 미톡산트론 하이드로클로라이드; 미코페놀산; 노코다졸; 오르마플라틴; 파클리탁셀; 페가스파르가제; 포르프로마이신; 프레드니무스틴; 프로카르바진 하이드로클로라이드; 푸로마이신; 로글레티미드; 사핀골 하이드로클로라이드; 세무스틴; 심트라젠; 스파르포세이트 나트륨; 스파르소마이신; 스피로무스틴; 스피로플라틴; 스트렙토니그린; 스트렙토조신; 술로페누르; 탈리소마이신; 테가푸르; 텔록산트론 하이드로클로라이드; 테모포르핀; 테니포시드; 테록시론; 테스토락톤; 티아미프린; 티오구아닌; 티오테파; 티아조푸린; 티라파자민; 토포테칸; 트리메트렉세이트; 트리메트렉세이트 글루쿠로네이트; 트립토렐린; 우라실 머스타드; 우레데파; 바프레오티트; 베르테포르프; 빈블라스틴 술페이트; 빈크리스틴 술페이트; 빈데신; 빈데신 술페이트; 비네피딘 술페이트; 빈글리시네이트 술페이트; 빈레우로신 술페이트; 비노렐빈 타르트레이트; 빈로시딘 술페이트; 빈졸리딘 술페이트; 보로졸; 제니플라틴; 지노스타틴; 조루비신 하이드로클로라이드를 포함하나, 이들에 한정되지 않는다.
본 발명은 또한 암세포를 파괴하도록 X선, 감마선 및 다른 방사선원의 사용을 포함하는 방사선 치료와 병용하여, 항체를 투여하는 것을 포함한다. 바람직한 실시형태에 있어서, 방사선 치료는 방사선이 원격광원으로부터 나오는 외조사요법 또는 원격요법으로서 투여된다. 다른 바람직한 실시형태에 있어서, 방사선 치료는 방사선원이 암세포 또는 종양 덩어리에 근접한 체내에 위치하는 내과 치료 또는 소선원 요법으로서 투여된다.
구체적인 실시형태에 있어서, 유방암에 걸린 환자에게는 독소루비신, 에피루비신, 독소루비신과 사이클로포스파미드의 혼합물 (AC), 사이클로포스파미드, 독소루비신 및 5-플루오로우라실의 혼합물 (CAP), 사이클로포스파미드, 에피루비신 및 5-플루오로우라실의 혼합물 (CEF), 또는 헤르셉틴, 타목시펜, 파클리탁셀 또는 탁소테레 등의 다른 약제를 포함하나, 이들에 한정되지 않는 유방암 치료에 유용한 하나 이상의 다른 약제의 예방적 또는 치료적 유효량의 투여와 병용하여, 본 발명의 안티 알파V 항체 컨쥬게이트의 예방적 또는 치료적 유효량이 투여된다.
구체적인 실시형태에 있어서, 전립선암에 걸린 환자에게는 외조사 요법; 방사성 동위원소, 즉, 레늄, 팔라듐, 또는 이리듐; 루프롤리드 또는 다른 LHRH 작용제의 벽내 착상; 비스테로이드성 항안드로겐제 (플루타미드, 닐루타미드, 비칼루타미드), 스테로이드성 항안드로겐제 (시프로테론 아세테이트), 루프롤리드와 플루타미드의 혼합물, DES, 에티닐 에스트라디올 등의 에스트로겐; 저용량 프레드니손, 또는 증상의 주관적 개선 및 PSA 레벨 저하를 제공하도록 보고된 다른 화학 요법을 포함하나, 이들에 한정되지 않는 전립선암 치료에 유용한 하나 이상의 다른 약제의 예방적 또는 치료적 유효량의 투여와 병용하여, 본 발명의 안티 알파V 항체 컨쥬게이트의 예방적 또는 치료적 유효량이 투여된다.
구체적인 실시형태에 있어서, 난소암에 걸린 환자에게는 32P 요법 등의 복강내 방사선 치료; 전체 복부 및 골반 방사선 요법, 시스플라틴, 파클리탁셀 (탁솔) 또는 도세탁셀 (탁소테레) 및 시스플라틴 또는 카보플라틴의 혼합물, 사이클로포스파미드와 시스플라틴의 혼합물, 사이클로포스파미드와 카보플라틴의 혼합물, 5-FU와 루보코보린의 혼합물, 에토포시드, 리포솜 독소루비신, 겜시타빈, 이포스파미드, 헥사메틸멜라민 (HMM), 또는 토포테칸을 포함하나, 이들에 한정되지 않는 난소암 치료에 유용한 하나 이상의 다른 약제의 예방적 또는 치료적 유효량과 병용하여, 본 발명의 안티 알파V 항체 컨쥬게이트의 예방적 또는 치료적 유효량이 투여된다.
구체적인 실시형태에 있어서, 뼈에 전이되는 종양을 갖는 환자에게는 뼈에 전이되는 전립선암 또는 유방암의 호르몬 저해제 등의 원래의 악성 종양의 치료시에 사용되는 약제 또는 요법, 금속 (스트론튬-89 및 사마륨-153), 및 비스포스포네이트 (예를 들면, 팔미드로네이트 또는 알레드로네이트)의 골 집적 방사성 동위원소를 이용한 방사선 요법 또는 화학 방사선 요법을 포함하나, 이들에 한정되지 않는 골 전이성 종양 치료에 유용한 하나 이상의 다른 약제의 예방적 또는 치료적 유효량과 병용하여, 본 발명의 안티 알파V 항체 컨쥬게이트의 예방적 또는 치료적 유효량이 투여된다.
암치료제 및 이들의 용량, 투여 경로 및 추천 용법은 당업계에 공지되어 있고, 문헌 [참조: PDR® Electronic Library, Thomson Micromedex, Greenwood Village, Colorado (Edition 2004)]의 구독에 의해 인터넷을 통해 얻을 수 있는 Physician's Desk Reference (57th ed., 2003)로서 이러한 문헌에 기재되어 있다.
염증성 질환 치료:
본 발명의 안티 알파V 항체 컨쥬게이트는 염증성 질환 또는 이의 하나 이상의 증상을 예방, 처치, 치료 또는 개선하도록 이를 필요로 하는 대상에게 투여될 수 있다. 본 발명의 항체는 또한 하나 이상의 다른 치료제, 바람직하게는 염증성 질환의 예방, 처치, 치료 또는 개선에 유용한 치료제 (이하에 기재된 예방제 또는 치료제를 포함하나, 이들에 한정되지 않음)과 병용하여, 염증성 질환 또는 이의 하나 이상의 증상을 예방, 처치, 치료 또는 개선하도록 이를 필요로 하는 대상에게 투여될 수 있다.
본 발명에 의해 망라된 방법에 의해 치료될 수 있는 염증성 질환은 천식, 뇌염, 염증성 장질환, 만성 폐색성 폐질환 (COPD), 알레르기성 질환, 폐혈성 쇼크, 폐섬유증, 미분화 척추관절염, 미분화 관절염, 관절염, 골관절염, 척추관절증 (예를 들면, 건선성 관절염, 강직성 척추염, 라이터 증후군 (반응성 관절염), 염증성 골용해증, 윌슨 병, 및 만성 바이러스 또는 세균 감염으로 인한 만성 염증을 포함하나, 이들에 한정되지 않는다. 또한, 자기면역질환은 염증성 병변과 관련되어 있다.
항염증 요법:
본 발명은 본 발명의 안티 알파V 항체 컨쥬게이트, 및 하나 이상의 치료제 (예를 들면, 알파V 인테그린에 면역 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체 단편 이외의 예방제 또는 치료제)를 이를 필요로 하는 대상에게 투여하는 것을 포함하는, 염증성 질환 또는 이의 하나 이상의 증상을 예방, 처치, 치료 또는 개선하는 방법을 제공한다. 염증성 질환 또는 이의 하나 이상의 증상을 예방, 처치, 치료 또는 개선하는데 유용하다고 알려지거나, 또는 이용되었거나 현재 이용되고 있는 약제 또는 요법은 본 명세서에 기재된 발명에 따라 본 발명의 안티 알파V 항체 컨쥬게이트와 병용하여 사용될 수 있다. 이러한 약제의 예로는 면역조절제, 혈관 형성 저해제, 항염증제 및 TNF 알파 길항제를 포함하나, 이들에 한정되지 않는다.
염증성 질환에 걸린 대상에게 본 발명의 안티 알파V 항체 컨쥬게이트와 병용하여 투여될 수 있는 면역조절제의 구체적인 예로는 메토트렉세이트, 레플루노미드, 사이클로포스파미드, 사이톡산, 누란, 사이클로스포린 A, 미노사이클린, 아자티오프린, 항생물질 (예를 들면 FK506 (타크롤리무스)), 메틸프레드니솔론(MP), 코르티코스테로이드, 스테로이드, 미코페놀레이트 모페틸, 라파마이신 (시롤리무스), 레플루나미드, 안티 T 세포 수용체 항체 (예를 들면, 오르토클론 (Orthoclone) OKT3 (Johnson & Johnson), 뉴비온 (Nuvion) (Protein Design Labs), 안티 CD20 항체 (Rituxan (IDEC)), 안티 CD52 항체 (예를 들면 CAMPATH 1H (Ilex)), 안티 IL-2 수용체 항체 (예를 들면 제나팍스 (Zenapax) (Protein Design Labs)), 안티 IL6 (CNTO 328, Centocor) 또는 안티 IL-6 수용체 항체 (MRA, Chugai), 및 안티 IL-12 항체 (CNTO 1275, Centocor), 안티 IFN 항체, 안티 TNF 항체, 안티 IL-1 항체 및 IL-1 알파/베타 길항제를 들 수 있다.
염증성 질환에 걸린 대상에게 본 발명의 안티 알파V 항체 컨쥬게이트와 병용하여 투여될 수 있는 TNF 알파 길항제의 예로는 단백질, 폴리펩티드, 펩티드, 융합 단백질, TNF 알파에 면역 특이적으로 결합하는 항체 등의 항체 (및 이의 항원 결합 단편), 핵산 분자 (예를 들면, 안티센스 분자 또는 트리플 헬릭스), 유기 분자, 무기 분자, 및 TNF 알파의 기능, 활성 및/또는 발현을 블록, 저하, 억제 또는 중화하는 소분자를 들 수 있다. TNF 알파 길항제의 예로는 인플릭시맙 (REMICADE; Centocor), D2E7 (HUMARA; Abbott Laboratories/Knoll Pharmaceuticals Co., Mt. Olive, N. J.), 또한 HUMICADE 및 CDP-870 (양쪽 모 두Celltech/Pharmacia 제, Slough, U.K.)로도 공지된 CDP571, TNF-R1 (Amgen), 에타네르셉트 (ENBREL; Immunex), 및 수용체의 TNFR 슈퍼패밀리의 다른 멤버의 저해제를 들 수 있다. 본 발명에 의해 망라되는 다른 TNF 길항제로는 TNF 알파 생산을 블록하는 것으로 알려진 IL-10 및 안티 p38 MAPK제를 포함하나, 이들에 한정되지 않는다.
염증성 질환에 걸린 대상에게 본 발명의 안티 알파V 항체 컨쥬게이트와 병용하여 투여될 수 있는 항염증제의 비한정적인 예로는 비스테로이드계 항염증약 (NSAID), 스테로이드계 항염증약, 베타 작용제, 항콜린제, 및 메틸크산틴을 들 수 있다. NSAID의 예로는 아스피린, 이부프로펜, 셀레콕십 (CELEBREX), 디클로페낙 (VOLTAREN), 에토돌락 (IODINE), 페노프로펜 (NALFON), 인돌메타신 (INDOCIN), 케토랄락 (TORADOL), 옥사프로진 (DAYPRO), 나부멘톤 (RELAFEN), 술린닥 (CLINORIL), 톨멘틴 (TOLECTIN), 로페콕십 (VIOXX), 나프록센 (ALEVE, NAPROSYN), 케토프로펜 (ACTRON) 및 나부메톤 (RELAFEN)을 들 수 있으나, 이들에 한정되지 않는다. 이러한 NSAID는 사이클로옥시게나제 효소 (예를 들면, COX-1 및/또는 COX-2)를 억제함으로써 작용한다. 스테로이드계 항염증약의 예로는 글루코코르티코이드, 덱사메타손 (DECADRON), 코르티손, 히드로코르티손, 프레드니손 (DELTASONE), 프레드니솔론, 및 트리암시놀론을 들 수 있으나, 이들에 한정되지 않는다.
구체적인 실시형태에 있어서, 골관절염에 걸린 환자에게는 아세트아미노펜, 페나세틴 및 트라마돌 등의 진통제; 아스피린, 디플루니살, 디클로페낙, 에토돌락, 페나메이트, 페노프로펜, 플루르비프로펜, 이부프로펜, 인돌메타신, 케토프로펜, 메틸살리실레이트, 네부메톤, 나프록신, 옥사프라진, 페닐부타존, 피록시캄, 술린닥, 및 톨메틴 등의 NSAID; 셀레콕십 및 로페콕십 등의 사이클로옥시게나제 (Cox)-2 특이적 저해제 (CSI); 데포 제제, 예를 들면 글루코코르티코이드 또는 생물 약제의 관절내 또는 관절주위 주사, 및 히알루론산의 관절내 주사를 포함하나, 이들에 한정되지 않는 골관절염의 예방, 치료, 처치 또는 개선에 유용한 다른 약제 또는 요법과 병용하여, 본 발명의 안티 알파V 항체 컨쥬게이트의 예방적 또는 치료적 유효량이 투여된다. 본 발명의 안티 알파V 항체 컨쥬게이트는 또한 골관절염 관절의 자극, 관절 로딩의 저하; 환부 관절의 가온 및 냉각; 캅사이신 크림; 운동 및 다른 물리 요법, 및 인공관절치환술을 포함하나, 이들에 한정되지 않는 골관절염의 예방, 치료, 처치 및 개선에서 다른 약물 이외의 방법과 병용하여 사용될 수 있다.
구체적인 실시형태에 있어서, 류머티스 관절염에 걸린 환자에게는 골관절염에 개시된 NSAID, 진통제, 및 CSI를 포함하는, 류머티스 관절염의 예방, 치료, 처치 및 개선에 유용한 다른 약제 또는 요법과 병용하여, 본 발명의 안티 알파V 항체 컨쥬게이트의 예방적 또는 치료적 유효량이 투여된다. 또한, 고용량 글루코코르티코이드, 또는 관절내 글루코코르티코이드; 메토트렉세이트, 금 화합물 (예를 들면, 오라노핀), D-페니실라민, 항말라리아약 (예를 들면, 클로로퀸), 및 술파살라진을 포함하는 질환 변형성 항류머티스제 (disease-modifying antirheumatic drug) (DMARD); 에타네르셉트 및 인플릭시맙 등의 TNF 알파 중화제; 아자티오프린, 레플루노미드, 사이클로스포린, 및 사이클로포스파미드에 한정되지 않는 면역억제제 및 세포 독성제; 및 관절형성술, 관절전치환술, 수부재건외과, 오픈 또는 관절경하 활액막 절제술, 및 수관절의 조기 건활액막 절제술 등의 외과적 개입; 각종 교정 장치 및 보조 기구, 및 다른 물리 요법 등의 외부 개입: 및 증가된 섭취량의 오메가 3 지방산 (아이코사펜타엔산 등) 등의 건강보조식품의 매월 펄스 요법과 같은 다른 요법이 본 발명의 안티 알파V 항체의 투여와 동시에, 이러한 투여 이전에, 또는 투여에 이어서 이용될 수 있다.
구체적인 실시형태에 있어서, 만성 폐색성 폐질환 (COPD)에 걸린 환자에게는 알부테롤, 피르부테롤, 테르부탈린, 및 메타프로테레놀, 경구용 지속 방출형 알부테롤 및 흡입 살메테롤 등의 단기간 및 장기간 작용형 베타 아드레날린 작용제; 이프라트로퓸 브로마이드, 및 테오필린 및 이의 유도체 등의 항콜린작용약; 글루코코르티코이드; 산소; 폐이식술; 폐용적 감소술; 기관내 삽관, 환기 지지; 매년 인플루엔자 백신 및 페염구군의 예방접종; 운동; 및 금연 등을 포함하나, 이들에 한정되지 않는 기관지 확장약을 포함하나, 이것에 한정되지 않는 COPD의 예방, 치료, 처치 및 개선에 유용한 다른 약제 또는 요법과 병용하여, 본 발명의 안티 알파V 항체 컨쥬게이트의 예방적 또는 치료적 유효량이 투여된다.
구체적인 실시형태에 있어서, 폐섬유증에 걸린 환자에게는 산소; 코르티코스테로이드; 세포 독성제 (사이클로포스파미드 또는 아자티오프린); 기관지 확장약 e 단기간 및 장기간 작용형 베타 아드레날린 작용제, 항콜린작용약, 및 테오필린 및 이의 유도체); 및 항히스타민제 (디펜히드라민 및 독실라민)을 포함하나 이들에 한정되지 않는 폐섬유증에 유용한 하나 이상의 다른 약제의 유효량과 병용하여, 본 발명의 안티 알파V 항체 컨쥬게이트의 예방적 또는 치료적 유효량이 투여된다.
구체적인 실시형태에 있어서, 천식에 걸린 환자에게는 아드레날린 자극제 (예로는 카테콜라민, 예를 들면 에피네프린, 이소프로테레놀, 및 이소에타린; 레소르시놀, 예를 들면 메타프로테레놀, 테르부탈린, 및 페노테롤; 및 살리게닌, 예를 들면 살부타몰을 들 수 있으나, 이들에 한정되지 않음); 테오필린 및 이의 각종 염을 포함하는 메틸크산틴; 아트로핀 술페이트, 아코핀 메틸니트레이트, 및 이프라트로퓸 브로마이드을 포함하는 항콜린작용약; 글루코코르티코이드; 크로몰린 나트륨 및 네도크로밀 나트륨을 포함하는 비만세포 안정화제; 질루톤, 자피르루카스트 및 몬테텔루카스트를 포함하는 류코트리엔 변형제; 메토트렉세이트를 포함하는 면역억제제; 및 아세틸시스테인을 포함하나, 이들에 한정되지 않는 천식 치료에 유용한 하나 이상의 다른 약제의 유효량과 병용하여, 본 발명의 안티 알파V 항체 컨쥬게이트의 예방적 또는 치료적 유효량이 투여된다.
구체적인 실시형태에 있어서, 알레르기 환자는 크로몰린; 항히스타민제; 교감 신경 흥분제 (알파 아드레날린 작용제 및 베타 아드레날린 작용제); 테오필린 및 이의 유도체; 글루코코르티코이드; 및 알레르겐 주사를 이용한 면역 탈감작 치료를 포함하나, 이들에 한정되지 않는 알레르기에 유용한 하나 이상의 다른 약제의 유효량과 병용하여, 본 발명의 안티 알파V 항체 컨쥬게이트의 예방적 또는 치료적 유효량이 투여된다.
자기면역질환 치료:
본 발명의 안티 알파V 항체 컨쥬게이트는 자기면역질환 또는 이의 하나 이상의 증상을 예방, 처치, 치료 또는 개선하도록 이를 필요로 하는 대상에게 투여될 수 있다. 본 발명의 안티 알파V 항체 컨쥬게이트는 또한 하나 이상의 다른 요법, 바람직하게는 자기면역질환의 예방, 처치 또는 치료에 유용한 요법 (이하에 기재된 예방제 또는 치료제를 포함하나, 이들에 한정되지 않음)과 병용하여, 자기면역질환 또는 이의 하나 이상의 증상을 예방, 처치, 치료 또는 개선하도록 이를 필요로 하는 대상에게 투여될 수 있다. 구체적인 실시형태에 있어서, 본 발명은 본 발명의 액체 제제의 예방적 또는 치료적 유효량의 용량을 이를 필요로 하는 대상에게 투여하는 것을 포함하는, 자기면역질환 또는 이의 하나 이상의 증상을 예방, 처치, 치료 또는 개선하는 방법을 제공한다. 또 하나의 실시형태에 있어서, 본 발명은 본 발명의 액체 제제의 예방적 또는 치료적 유효량의 용량 및 알파V 인테그린에 면역 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체 단편 이외의 하나 이상의 치료제 (예를 들면, 예방제 또는 치료제)의 예방적 또는 치료적 유효량의 용량을 이를 필요로 하는 대상에게 투여하는 것을 포함하는, 자기면역질환 또는 이의 하나 이상의 증상을 예방, 처치, 치료 또는 개선하는 방법을 제공한다.
본 발명은 자기면역질환의 통상적인 요법으로는 효과가 없는 대상에게, 본 발명의 항체의 예방적 또는 치료적 유효량의 용량을 투여하는 것을 포함하는, 이러한 대상의 자기면역질환 또는 이의 하나 이상의 증상을 처치, 치료 또는 개선하는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 자기면역질환에 대하여 현행 단일 제제 요법으로는 효과가 없는 대상에게, 본 발명의 안티 알파V 항체 컨쥬게이트의 예방적 또는 치료적 유효량의 용량 및 알파V 인테그린에 면역 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체 단편 이외의 하나 이상의 치료제 (예를 들면, 예방제 또는 치료제)의 예방적 또는 치료적 유효량의 용량을 투여하는 것을 포함하는, 이러한 대상의 자기면역질환 또는 이의 하나 이상의 증상을 처치, 치료 또는 개선하는 방법을 제공한다. 본 발명은 특정 치료에 반응하지 않는 것으로 입증되거나 이러한 치료를 더 이상 받지 않는 환자에게 다른 치료와 병용하여, 본 발명의 안티 알파V 항체 컨쥬게이트를 투여함으로써 자기면역질환 또는 이의 하나 이상의 증상을 처치, 치료 또는 개선하는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 치료할 환자에게 어느 하나의 치료가 지나치게 독성을 나타내는 것으로 입증되거나 입증될 수 있는, 즉 허용불가능하거나 견딜 수 없는 부작용을 가져오는 자기면역질환을 처치 또는 치료하는 대체 방법을 제공한다.
특히, 본 발명은 환자가 다른 요법으로는 효과가 없는 자기면역질환의 처치 또는 치료하기 위한 대체 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 본 발명의 안티 알파V 항체 컨쥬게이트를 투여함으로써 치료되어, 질환 활동성을 지니지 않는 환자의 자기면역질환의 재발을 방지하기 위한 방법을 제공한다.
자기면역질환에 있어서, 면역계는 저항할 이물이 없고 신체의 통상적으로 보호하는 면역계가 잘못하여 자신을 공격함으로써 자체의 조직에게 손상을 일으키는 면역 반응을 유발한다. 여러 가지 방법으로 신체에 영향을 미치는 다양한 자기면역질환이 있다. 예를 들면, 다발성 경화증에 걸린 개인의 뇌가 감염되고, 크론병에 걸린 개인의 소화기관이 감염되며, 류머티스 관절염에 걸린 개인의 각종 관절활액막, 뼈 및 연골이 감염된다. 자기면역질환이 진행됨에 따라, 하나 이상의 체내 조직의 파괴, 혈관 신생을 수반하는 기관의 이상 증식, 또는 장기 기능 변화가 일어날 수 있다. 자기면역질환은 단 하나의 기관 또는 조직 종류에만 영향을 주거나, 다수의 기관 및 조직에 영향을 미칠 수 있다. 자기면역질환에 의해 통상적으로 영향을 받는 기관 및 조직은 적혈구, 혈관, 결합 조직, 내분비선 (예를 들면, 갑상선 또는 췌장), 근육, 관절, 및 피부를 포함한다. 본 발명의 방법에 의해 치료될 수 있는 자기면역질환은 원형 탈모, 강직성 척추염, 항인지질 증후군, 자기면역 아디슨병, 부신 자기면역질환, 자기면역성 용혈성 빈혈,자기면역성 간염, 자기면역성 난소염 및 고환염, 자기면역성 혈소판 감소증, 베체트병, 수포성 유천포창, 심근증, 실리악 스프루 피부염 (celiac sprue-dermatitis), 만성 피로 면역 기능 장애 증후군 (CFIDS), 만성 염증성 탈수초성 다발성 신경병증, 처그-스트라우스 증후군, 반흔성 유천포창, 크레스트 (CREST) 증후군, 한냉응집소증, 크론병, 원판상 루푸스, 본태성 혼합형 크리오글로불린혈증, 섬유근통 섬유근염, 사구체 신염, 그레이브스병, 길랑-바레 증후군, 하시모토 갑상선염, 특발성 폐섬유증, 특발성 혈소판 감소성 자반증 (ITP), IgA 신경장애, 소아관절염, 편평태선, 홍반성 낭창, 메니에르병, 혼합성 결합조직병, 다발성 경화증, 타입 1 또는 면역매개성 당뇨병, 중증 근무력증, 심상성 천포창, 악성 빈혈, 결절성 다발동맥염, 다발성 연골염, 다선 증후군, 류머티스 다발성 근통, 다발성근염-피부근염, 원발성 무감마글로불린혈증, 원발성 담즙성 간경변, 건선, 건선성 관절염, 레이노 현상, 라이터 증후군, 류머티스 관절염, 사르코이도시스, 경피증, 쇼그렌 증후군, 근강직 증후군, 전신성 홍반성 낭창, 홍반성 낭창, 다카야스 동맥염, 측두 동맥염/거대세포 동맥염, 궤양성 대장염, 포도막염, 포진상 피부염 혈관염 등의 혈관염, 백반, 및 베게너 육아종증을 포함하나, 이들에 한정되지 않는다.
자기면역 치료제 및 이들의 용량, 투여 경로 및 추천 용법은 당업계에 공지되어 있으며, Physician's Desk Refererce (56th ed., 2002 and 57th ed., 2003)로서 이러한 문헌에 기재되어 있다.
본 발명은 본 발명의 안티 알파V 항체 컨쥬게이트, 및 알파V 인테그린에 면역 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체 단편 이외의 하나 이상의 치료제 (예를 들면, 예방제 또는 치료제)를 이를 필요로 하는 대상에게 투여하는 것을 포함하는, 자기면역질환 또는 이의 하나 이상의 증상을 예방, 처치, 치료 또는 개선하는 방법을 제공한다. 자기면역질환 또는 이의 하나 이상의 증상을 예방, 처치, 치료 또는 개선하는데 유용하다고 알려지거나, 또는 이용되었거나 현재 이용되고 있는 약제 또는 요법은 본 명세서에 기재된 발명에 따라 본 발명의 안티 알파V 항체 컨쥬게이트와 병용하여 사용될 수 있다. 이러한 약제의 예로는 면역조절제, 항염증제 및 TNF 알파 길항제를 들 수 있으나, 이들에 한정되지 않는다. 자기면역질환의 예방, 처치, 치료 또는 개선을 위해 본 발명의 안티 알파V 항체 컨쥬게이트와 병용하여 사용될 수 있는 면역조절제, 항염증제 및 TNF 알파 길항제의 구체적인 예는 상기에 기재되어 있다.
구체적인 실시형태에 있어서, 다발성 경화증 (MS)에 걸린 환자에게는 IFN-베타1b (Betaseron) 및 IFN-알파2a (Avonex); 글라티라머 아세테이트 (Copaxone); 미톡산트론; 메토트렉세이트; 사이클로포스파미드; 정맥주사 면역 글로불린; 글루코코르티코이드; 메틸프레드니솔론; 2-클로로데옥시아데노신 (클라드리빈); 바클로펜 (유치 카테터를 통해 경구 또는 수강내로); 사이클로엔자프린 하이드로클로라이드; 클로나제팜; 클로니딘 하이드로클로라이드; 카르바마제핀; 가바펜틴; 아미트리프틸린; 프리미돈; 온단세트론; 이소니아지드; 옥시부티닌; 톨테로딘; 프로판텔린; 베타네콜; 테라조신 하이드로클로라이드; 실데나필 시트레이트; 아만타딘; 페몰린; 고용량 비타민; 칼슘 오로테이트; 간사이클로비르; 항생물질; 및 혈장 교환을 포함하나, 이들에 한정되지 않는 MS의 예방, 치료, 처치 및 개선에 유용한 다른 약제 또는 요법과 병용하여, 본 발명의 안티 알파 V 항체 컨쥬게이트의 예방적 또는 치료적 유효량이 투여된다.
구체적인 실시형태에 있어서, 건선에 걸린 환자에게는 국소성 스테로이드 함유 제제; 타르 (에스타르 (Estar), 소리겔 (Psorigel), 포토타르 (Fototar) 크림); 칼시포트리엔 연고 등의 국소성 비타민 D 유사체; 소랄렌을 사용하거나 사용하지 않은 자외선; 메토트렉세이트; 사이클로스포린; 술파살라진; 및 합성 레티노이드를 포함하는 건선의 예방, 치료, 처치 및 개선에 유용한 다른 약제 또는 요법과 병용하여, 본 발명의 안티 알파 V 항체 컨쥬게이트의 예방적 또는 치료적 유효량이 투여된다.
구체적인 실시형태에 있어서, 크론병에 걸린 환자에게는 지사제 (로페라미드, 아트로핀을 함유하는 디페녹실레이트, 콜레스티라민 또는 콜레스티폴); 진경제 (프로판텔린, 디사이클로민, 또는 히오시아민); 5-아미노살리실산제 (술파살라진, 메살라민 (Asacol) 및 이의 서방성 제제 (Pentasa); 코르티코스테로이드; 류머티스성 질환에 유용한 면역조절약제 - 아자티오프린, 머캅토푸린, 사이클로스포린, 및 메토트렉세이트; 항생물질; 엔테라셉트 및 인플릭스맙을 포함하는 TNF 저해제; 타크롤리무스, 미코페놀레이트 모페틸, 및 탈리도미드를 포함하는 면역억제제; 영양 요법; 기본식을 이용한 경장 요법 (예를 들면, 4 주간 비보넥스 (Vivonex)); 및 완전 비경구 영양법을 포함하나, 이들에 한정되지 않는 크론병의 예방, 치료, 처치 및 개선에 유용한 다른 약제 또는 요법과 병용하여, 본 발명의 안티 알파 V 항체의 예방적 또는 치료적 유효량이 투여된다.
구체적인 실시형태에 있어서, 홍반성 낭창에 걸린 환자에게는 항말라리아약 (하이드록시클로로퀸을 포함하나, 이것에 한정되지 않음); 글루코코르티코이드 (예를 들면, 저용량, 고용량, 또는 고용량 정맥내 펄스 요법이 사용될 수 있음); 사이클로포스파미드, 클로람부실, 및 아잔티오프린, 메토트렉세이트 및 미코페놀레이트 모페틸을 포함하는 면역억제제 및 면역조절제; 안드로겐성 스테로이드 (다나졸을 포함하나, 이것에 한정되지 않음); 및 항응고제 (와르파린을 포함하나, 이것에 한정되지 않음)를 포함하나, 이들에 한정되지 않는 홍반성 낭창의 예방, 치료, 처치 및 개선에 유용한 다른 약제 또는 요법과 병용하여, 본 발명의 안티 알파 V 항체의 예방적 또는 치료적 유효량이 투여된다.
비악성 또는 면역학적으로 관련된 세포-증식성 질환:
본 발명의 컨쥬게이트는 또한 비악성 증식성 질환, 특히 혈관 형성을 포함하는 비악성 증식성 질환을 치료하는데 유용하다. 혈관 형성은 종양이 증식 및 전이되는 능력, 망막증을 포함한 안질환, 및 건선 및 카포시 육종을 포함한 피부 질환이외에도 병적 상태 수의 요인인 것으로 알려져 있다. 이러한 비종양 형성성 혈관 형성 의존성 질환의 대표예로는 각막 신생혈관, 비후성 반흔 및 켈로이드, 증식성 당뇨병 망막증, 류머티스 관절염, 동정맥 기형 (상술함), 동맥경화성 플라크 및 허혈성 심질환, 창상 치유 지연, 혈우병성 관절, 골절 불유합, 오슬러-웨버 증후군, 건선, 심상성 천포창, 베체트 증후군, 급성 호흡 곤란 증후군 (ARDS), 화농성 육아종, 경피증, 트라코마, 월경과다 (상술함) 및 혈관 부착을 들 수 있다.
4. 약제학적 제제
본 발명은 약제학적으로 허용가능한 제제 중에 적어도 하나의 안티 알파V-메이탄시노이드 컨쥬게이트를 포함하는, 안티 알파V-메이탄시노이드 컨쥬게이트의 안정한 제제, 바람직하게는 수용성 인산 완충 생리식염수 또는 혼합 염용액, 보존액, 방부제를 함유하는 제제 및 약제학적 또는 수의 용도에 적합한 다목적 보존제를 제공한다.
바람직한 방부제로는 페놀, m-크레졸, p-크레졸, o-크레졸, 클로로크레졸, 벤질 알콜, 알킬파라벤 (메틸, 에틸, 프로필, 부틸 등), 벤잘코늄 클로라이드, 벤제토늄 클로라이드, 데히드로아세트산나트륨, 티메로살, 또는 이들의 혼합물로 구성되는 그룹 중에서 선택되는 것들을 들 수 있다.
본 명세서에 기재된 안정한 제제, 보존제 또는 보존액 중의 적어도 하나의 안티 알파V-메이탄시노이드 컨쥬게이트는 SC 또는 IM 주사를 포함하는 다양한 전달 방법; 경피, 폐, 경점막, 임플란트, 삼투압 펌프, 카트리지, 마이크로펌프, 당업계에 공지된 것으로서 당업자가 평가하는 다른 수단을 통해 본 발명에 따라 환자에게 투여될 수 있다.
4. 약제학적 제제
CNTO 95-메이탄시노이드를 투여하는 바람직한 방법에 있어서, 약제 원료는 미리 설치된 수액 백을 갖춘 카테터로부터 정맥내로 투여된다. CNTO 95-메르탄신은 20 ml 일회용 바이알 (ImmunoGen, Inc. 제, Cambridge, MA)로 공급된다. 각 바이알은 실질적으로 정제수, USP 중에 인산이수소칼륨 (0.57 mg/ml), 인산이수소나트륨 일수화물 (0.20 mg/ml), 제2인산나트륨 (0.555 mg/ml), 및 염화나트륨 (8.16 mg/ml)을 포함하는 완충액 (pH 6.5 ± 0.5)에 0.05 내지 약 2.0 mg/ml의 농도로 단백질을 포함한다. 제제는 저 단백질 결합 5 ㎛ 필터를 통과시킴으로써 용량 체적을 수액 백에 주입하면서 2회 미리 여과되어, 조제한 후 8 시간 이내에 인라인 0.22 ㎛ 필터를 통해 환자에게 투여된다. 주입 후, 정맥내 주입로는 전체 약물 투약량의 전달을 확실하게 하도록 유체로 플러시되어여 한다.
점적법에 의해 Mab-메이탄소이드 컨쥬게이트가 투여된 인간 환자에 대한 이전의 경험에 의거하여, 22 내지 295 mg/M2의 용량이 3주마다 투여될 수 있다 (J Clin Oncol. 21:211-222, 2003).
6. 제품
본 발명은 안티 알파V-메이탄시노이드 컨쥬게이트, 용기 및 용기와 결합된 라벨 또는 패키지 인서트를 포함하는, 상술한 질환의 치료에 유용한 물질을 함유하는 제품을 포함한다. 제품은 바람직하게는 임의로 희석액 중의 규정된 완충제 및/또는 방부제를 함유하는 적어도 하나의 안티 알파V-메이탄시노이드 컨쥬게이트의 용액을 포함하는 적어도 하나의 바이알을 포함하며, 패키지 재료는 이러한 용액이 어느 기간에 걸쳐서 유지될 수 있는 가를 나타내는 라벨을 포함한다. 본 발명은 패키지 재료, 동결건조된 적어도 하나의 안티 알파 V-메이탄시노이드 컨쥬게이트를 포함하는 제 1 바이알, 및 규정된 완충제 또는 방부제의 희석액을 포함하는 제 2 바이알을 포함하는 제품을 포함하며, 상기 패키지 재료는 의사 또는 환자가 용액을 형성하도록 적어도 하나의 안티 알파V-메이탄시노이드 컨쥬게이트를 희석액 중에 어떻게 용해시키는가에 대하여 지시하는 라벨을 포함한다.
적절한 용기의 예로는 바틀, 바이알, 주사기 등을 들 수 있다. 용기는 유리 도는 플라스틱 등의 각종 재료로 제조될 수 있다. 용기는 멸균 액세스 포트 (예를 들면, 용기는 정맥 주사용 용액 백 또는 피하주사용 바늘에 의해 관통가능한 스토퍼를 갖는 바이알일 수 있다)를 가질 수 있다.
조성물 중의 적어도 하나의 활성제는 안티 알파V 항체-메이탄시노이드 컨쥬게이트이다. 라벨 또는 패키지 인서트는 조성물이 암 등의 선택 상태를 치료하는데 사용됨을 나타낸다. 본 명세서에 기재된 패키지 인서트는 항체 또는 조성물이 특정 질환 및 진단에 대한 본 명세서에 개요된 주의 기준을 이용한 치료에 대하여 반응하지 않거나, 불충분하게 반응하는 암을 치료하는데 사용되는 것을 나타낸다. 다른 실시형태에 있어서, 패키지 인서트는 항체-메이탄시노이드 컨쥬게이트 또는 조성물도 전이암, 전립선암, 유방암 또는 결장직장암을 치료하는데 사용될 수 있음을 나타낼 수 있다.
도 1은 DM1, DM3 및 DM4로 나타낸 바람직한 종류를 갖는 티올화된 메이탄신의 화학 구조를 도시한다.
도 2는 본 발명의 바람직한 이작용성 링커 시약의 화학 구조 및 이들의 화학 약성어를 나타낸다.
도 3은 본 발명의 항체-메이탄시노이드 컨쥬게이트를 제조하는 합성법을 도식적으로 나타낸다.
도 4는 누드 마우스의 인간 흑색종 종양의 시간에 대한 체적 변화 및 CNTO 95의 투여 효과를 나타내는 그래프이다. 마우스에 A375.S2 세포 (3×1O6)를 피하 접종하고, CNTO 95 또는 대조 화합물의 투여는 3일 후에 개시되었다. 마우스는 주 당 3회로 10 mg/kg의 용량으로 CNTO 95 또는 비히클을 복강내 투여하여 처리되었 다. 각 데이터 포인트는 10개의 종양을 지닌 동물의 평균 종양 체적이다 (± SEM). 주 당 3회로 주어진 CNTO 95는 26일째에 대조 화합물로 처리된 동물과 비교하여, 종양 증식을 상당히 억제하였다 (P = 0.0005).
도 5는 누드 래트의 인간 흑색종 종양의 시간에 대한 체적 변화 및 CNTO 95의 투여 효과를 나타내는 그래프이다. 래트에 A375.S2 세포 (3×1O6)를 피하 접종하고, CNTO 95 또는 대조 화합물을 이용한 치료는 3일 후에 개시되었다. 래트는 주 당 1회로 10 mg/kg의 용량으로 CNTO 95 또는 비히클을 정맥내 투여하여 처리되었다. 각 데이터 포인트는 9개의 종양을 지닌 동물의 평균 종양 체적이다 (± SEM).
도 6는 누드 마우스의 시간에 대한 A375.S2 인간 흑색종 세포의 증식을 나타내는 그래프이다. 종양 체적은 평균 +/- SEM (n = 9 또는 10)으로 나타낸다. 화살표는 정맥내 약물 주사를 나타낸다. 별표는 이의 종양 체적이 1500 mm3 이상이기 때문에, 한 마리의 무응답 동물이 죽은 것을 나타낸다.
도 7은 무흉선 누드 래트의 인간 A375.S2 흑색종 세포의 증식을 나타내는 그래프이다. 14일째에, 평균 종양 체적이 250 mm3에 이르렀을 때, 동물은 랜덤하게 그룹을 이루며, 첫번째 용량이 투여되었다. 모든 동물이 35일째에 죽었다. 종양 체적은 평균 +/- SEM (n = 9 또는 10)으로 나타내었다. 화살표는 정맥내 약물 주사의 일수를 나타낸다.
도 8은 3, 6, 또는 10 mg/kg CNTO 364를 종양 이식 후 7일째에 주입하고, 게 다가 7일마다 5회 주입하며; 7일 및 14일째에 25 mg/kg CNTO 364 또는 F105-DM1을 주입하고, 7, 14 및 35일째에 15 mg/kg CNTO 364를 주입한 종양을 지닌 마우스의 시간에 대한 전체 체중 변화를 나타내는 그래프이다.
도 9는 도 8에서와 동일한 동물의 시간에 대한 종양 체적 변화를 나타내는 그래프이다.
도 10은 도 8에 기재된 그룹의 모든 동물에 대한 개개의 종양 체적을 나타내는 그래프이다.
도 11은 인간 A549 인간 폐암 피하 종양을 지니고, CNTO 364로 15 mg/kg으로 처리되거나, 또는 대조 화합물로 처리된 누드 래트의 시간에 대한 평균 체중 +/- SEM (n= 6)을 나타내는 그래프이다. 화살표는 정맥내 약물 주사의 횟수를 나타낸다.
도 12는 암컷 무흉선 래트의 인간 A549 인간 폐암 종양의 증식을 나타낸다. CNTO 364 (15 mg/kg) 처리는 기존의 암컷 무흉선 래트의 A549 인간 폐암 종양을 소실시켰다.
도 13은 15 mg/kg CNTO 364 또는 대조 물질로 처리된 암컷 무흉선 래트의 인간 A549 인간 폐암 종양의 증식 연구의 종료시에 각각의 종양 중량을 나타내는 산포도이다. 횡선은 각 연구 그룹의 중앙값을 나타낸다.
도 14a 및 도 14b는 HT29 인간 결장 종양 세포를 지니고, CNTO 364 (CNTO 95-SPP-DM1), CNTO 365 (CNTO 95-SSNPB-DM4) 및 CNTO 366 (CNTO 95-SSNPP-DM4)로 처리된 래트의 시간에 대한 평균 종양 체적 변화를 나타내는 그래프이다. 도 14a 는 PBS 대조군과, 동일한 프로세스 및 시약을 이용하고, 7일 및 21일째에 10 mg/kg으로 투여된 티올화된 메이탄신에 컨쥬게이트된 무관련 항체를 나타내고, 도 14b는 PBS 대조군과, 7일째에 단회 투여된 CNTO 365 그룹을 제외하고는 7일 및 21일째에 20 mg/kg으로 투여된 상술한 컨쥬게이트된 항체를 나타낸다.
도 15a 및 도 15b는 도 14에 나타낸 HT29 종양을 지닌 래트의 체중의 평균적 변화를 나타내는 그래프이다.
본 발명을 일반적으로 기술하였지만, 본 발명의 실시형태는 또한 하기 실시예에 개시될 것이다.
실시예 1:
모노클로널 항체 CNTO 95의 제조 및 특성:
안티 알파 V 인테그린 항체 CNTO 95의 제법은 본 명세서에 참조로 포함되는 PCT 특허 공개 제WO 02/12501호 및 미국 특허 공개 제2003/040044호에 기재되어 있다. 구체적으로, F2 하이브리드 마우스에게 인간 태반으로부터 정제된 αvβ3 인테그린으로 면역성을 부여함으로써 (CBA/J x C57/BL6/J, GenPharm International) 인간 Mab CNTO 95를 생성시켰다. 항체는 인간 가변 및 IgG1 카파 불변 영역으로 구성된다. CNTO 95의 제조 방법 및 바람직한 특성은 WO0212501 및 문헌 [Trikha, et al. 2004, Int. J. Cancer 110 (3): 326-335]에 이미 기술되어 있다.
트랜스제닉 마우스 (GenPharm International)는 인간 면역 글로불린을 발현하나, 마우스 IgM 또는 Igκ를 사용하였다. 이들 마우스는 인간 시퀀스 면역 글로 불린의 레퍼토리를 형성하도록 V(D)J 결합을 행하는 인간 시퀀스 트랜스진, 중쇄 클래스 스위칭 및 체세포 돌연변이를 포함한다 (Taylor et al., International Immunology 6: 579-591 (1993)). 경쇄 트랜스진은 생식 세포 계열 인간 Vκ 영역의 거의 절반을 포함하는 효모 인공 염색체 클론으로부터 부분적으로 유도된다. 다수의 VH 유전자 이외에도, 중쇄 (HC) 트랜스진은 인간 μ 및 인간 γ1 (Lonberg et al., Nature 368:856-859 (1994)) 및/또는 γ3 불변 영역을 코드한다. HC012 유전자형 계통으로부터 유도된 마우스를 면역 부여 및 융합 프로세스에 사용하여, 본 발명의 컨쥬게이트의 제조시에 사용되는 안티 알파V 모노클로널 항체를 생성시켰다.
인간 태반 (미트 그라인더를 이용하여 분쇄됨) 또는 αvβ3 인테그린을 발현하는 M21 인간 흑색종 세포를, 상술한 (WO0212501) 완충 식염수 중의 OTG (옥틸티오글루코시드, Pierce)로 추출하였다. 이들 제제를 동일한 용적의 완전 프로인트 애쥬번트로 에멀젼화하여, 0 및 14일째에 생후 15 내지 17주령의 수술로 거세된 수컷 마우스 (GenPharm, Foster City, CA)에게 면역성을 주는데 사용하였으며, 불완전 프로인트로는 28일, 48일 및 56일째에 이루어졌다. 3일 후에, 고상 EIA 포맷을 이용하여 알파 V베타3에 대하여 1 : 1280의 타이터를 나타내는 마우수로부터 비장 세포를 얻었다. 뮤린 골수종 세포 (SP2/0) 대 생존 비장 세포의 1:1 비율로 융합을 행하였다. 하이브리도마 상청액을, EIA 마이크로플레이드 분석 또는 EIA 캡쳐 분석을 이용하여 스크린하고, 선택된 항체 생산 라인을 확장하여, 원하는 특성을 리테스트하였다.
ELISA 분석에 의해, 하이브리도마, C371 A (Mab CNTO 95으로도 불리움) 및 C372A로부터의 정제된 항체가 농도 의존성 방식으로 알파V베타3에 결합하는 것을 확인하였다. 각각, C372A 및 CNTO 95에 대하여, 0.07 및 0.7 ㎍/mL에서 50% 결합이 달성된다. 동일한 분석에 있어서, 안티 알파II베타3 항체, c7E3 IgG가 0.07 ㎍/mL에서 50% 최대 결합을 나타내는 것으로 입증되었다.
CNTO 95의 고유한 특이성을 확인하기 위해, 경쟁 결합 (또는 상보성) 분석을 하기 뮤린 항체를 사용하여 행하였다: m7E3 IgG, 안티 알파 V베타3 (클론 LM609, Chemicon), 안티 알파 V베타 5 (클론 P1F6, Gibco), 안티 베타3 (Chemicon, AMAC), 또는 안티 알파V (클론 VNR139, Gibco) 항체. 이들 결과로부터, CNTO 95가 테트트된 다른 항체에 의해 공유되지 않는 에피토프와 결합하는 것이 입증되었다.
정제된 인테그린에 대한 결합 친화성 값을, 125-I CNTO 95를 이용한 각종 세포주에 발현된 수용체에 대한 결합력과 비교하였다. A375S2 및 M21 세포는 αvβ3 및 αvβ5를 발현한다. HT-29 세포는 αvβ5를 발현한다. 비교하기 위해, 인테그린을 결합할 수 있는 다른 Mab를 사용하였다. 항체의 멀티플 로트의 머티플 레플리케이트를 이용하여 각 경우에 Kd를 포화결합곡선으로부터 계산하였다. αvβ3로 코트된 플레이트의 CNTO 95 평균 KD는 2.1 ± 1.33 x 10-10 M이고; 평균 압식시맙 Kd는 2.5 ± 1.46 x 10-10 M이었다. αvβ5로 코트된 플레이트의 CNTO 95 평균 KD는 2.5 ± 1.04 x 10-11 M이었다. αvβ5로 코트된 플레이트에서는 압식시맙은 결합을 나타내지고, 용량 반응을 나타내지 않았다.
도 4에 도시된 바와 같이, CNTO 95를 이용한 투약은 누드 마우스의 인간 흑색종의 증식을 억제하였다. 26일째에, 대조 화합물로 처리된 동물의 종양과 비교하여, CNTO 95는 종양 증식을 약 80%로 억제시켰다. 이러한 모델에 있어서, CNTO 95는 마우스 인테그린과 결합하지 않기 때문에, 숙주 혈관신생 혈관과 상호작용하지 않으며, 이는 인간 종양으로 발현된 인테그린의 차단만으로도 항혈관신생 효과와는 관계없이 마우스의 종양 증식을 억제할 수 있음을 제시한다.
래트 연구에 있어서는, 생후 6 내지 7 주령의 암컷 누드 래트 (Harlan 제)를 얻었다. 20 마리의 래트의 옆구리 부분에 A375.S2 세포 (3 x 106)를 피하 접종하였다 (1 일간). 4일째에, 래트를 랜덤하게 2개의 그룹으로 배정하였다. 한 그룹에게는 CNTO 95 (PBS 중의 10 mg/kg)로 정맥내로 주사한 반면에, 다른 그룹에게는 이소타입으로 매칭된 (isotype-matched) 대조 화합물 IgG (10 mg/kg)를 투여하였다. 그 후에, 46일에 이를 때까지 매주 투약을 계속하였다 (전체 6개의 투약량). 종양을 캘리퍼스로 주당 2회 측정하여, 종양 체적을 식 (길이 x 폭2)/2로 계산하였다. 체중도 매주 기록하였다.
래트에 있어서, CNTO 95는 래트 혈관신생 인테그린 및 인간 종양 세포로 발현되는 인테그린을 블록할 수 있다. 종양을 갖는 누드 래트를 10 mg/kg의 CNTO 95 로 매주 처리한 바, 이소타입으로 매칭된 인간 IgG 대조 화합물 MAb와 비교하여, 종양 증식이 감소되었다 (도 5). 46일에는, CNTO 95로 처리한 바, 대조 화합물로 처리된 누드 래트와 비교하여, 최종 종양 사이즈가 상당히 감소되었다 (p = 0.0007).
요약하면, CNTO 95는 시험관 내 및 생체 내에서 인테그린 수용체 알파 V베타3 및 알파V베타5의 생물학적 효과를 중화하는 것을 나타내는 것으로 다수의 기능 분석에 의해 입증된 바와 같이, 고유한 특이성, 친화성 및 활성을 갖는 인테그린의 알파V 패밀리의 멤버와 결합하는 완전 인간 MAb이다. CNTO 95는 시험관 내에서 종양 세포 및 내피 세포의 접착, 이동, 증식 및 침입을 억제하고, 다중 알파V 인테그린 수용체를 결합하고 블로킹하는 것이 단일 인테그린 단독의 블로킹보다 훨씬 더 효과적인 것으로 입증되었다. 또한, CNTO 95는 생체 내에서 혈관 형성 및 종양 증식을 억제하였다. 인간 흑색종의 증식은 마우스 모델의 종양 세포 인테그린의 폐색 또는 종양 세포와 숙주 혈관신생 인테그린의 결합 폐색에 의해 상당히 감소되었으며, 이는 항종양효과를 위한 다수의 세포내 표적을 타겟하는 잠재적 중요성을 강조한다.
시험관 내 모델에서의 결과로부터, CNTO 95가 내피 세포 접착, 증식, 이동 및 모세관 스프라우팅 (capillary sprouting)을 억제하는 강력한 항혈관형성 특성을 갖는다. 또한, CNTO 95는 래트 마트리겔 모델의 bFGF 및 M21 흑색종 세포 및 영장류 혈관 형성 모델의 bFGF에 의해 자극되는 혈관 형성을 블록한다. CNTO 95는 설치류 모델 및 시노물구스 (cynomulgus) 원숭이의 신규한 인간 이외의 영장류 모 델에서 강력한 항혈관신생 효과를 나타냈다.
혈관형성 내피세포의 인테그린 블로킹 이외에도, 종양 세포 자체에 대한 인테그린 기능을 억제하는 능력은 종양 증식을 감소시켰다. 다수의 알파V 인테그린은 종양 세포 생물학에서 중요한 역할을 하는 것으로 제안되어 있다. CNTO 95가 숙주 인테그린과 교차 반응하지 않는 마우스 이종 이식 모델에 있어서, CNTO 95로 처리한 바, v3/5 양성 멜라노마 종양의 증식을 상당히 억제하였다.
CNTO 95의 가장 중요한 특성 중의 하나는 완전 인간 성질을 나타낸다는 것이다. 완전 인간 성질을 나타내기 때문에, CNTO 95는 환자에 있어서 면역 반응을 덜 일으키기 쉬울 것이다. 또한, CNTO 95가 알파 V베타3 및 알파 V베타5 뿐만 아니라, 알파V베타6 및 알파V베타1 등의 다른 알파V 인테그린에도 결합할 수 있기 때문에, 다수의 인테그린 매개 이벤트를 억제할 가능성이 있다.
실시예 2: CNTO 95-메이탄신 컨쥬게이트의 제조
상술한 이작용성 링커를 이용하여 개시하는 생물학적 시험을 위해, 티올화된 메이탄신의 항체 컨쥬게이트를 제조하였다.
CNTO 95 항체를 컨쥬게이션을 취해 공급하였다 (Centocor). CNTO 95를 전체 약 20 mg/ml (260 mg)로 공급하였다. 항체를 완충제 A (50 mM KPi, 50 mM NaCl, 2 mM EDTA pH 6.5)로 투석한 다음, 95% 완충제 A, 5% ETOH 중의 8 mg/ml로 주어졌다. 항체를 SPP의 6.5 배 과잉량의 몰량으로 변형시켜, S-Py가 2-머캅토피리딘인 CNTO 95-SS-Py를 형성하는 약물 컨쥬게이션을 위해 링크를 도입하였다. 잔여 SPP를 G25 겔 여과 크로마토그래피로 제거하였다. 링커 대 Ab 비가 4.7로 측정되었다. 3.2/mlin 97% 완충제 A, 3% 디메틸아세트아미드의 항체 농도를 이용하여, Ab-SS-Py 컨쥬게이트를 링커에 대하여 DM1 (MW = 737.5 g/몰)의 1.7배 과잉량의 몰량으로 변형시켰다. 컨쥬게이션 후에, 컨쥬게이트를 완충제로서 PBS, pH 6.5를 사용하여 G25 상에서 다시 크로마토그래피로 분석하였다. 얻어진 컨쥬게이트는 CNTO 95 몰 당 DM1 3.2 몰을 함유하였다: [Ab] = 2.59 mg/ml, [DM1] = 38.3 ㎍/ml. 여과물의 252 및 280 nm에서 흡광도 측정값을 기초로 하고, 소광 계수: 280 nm에서의 Ab = 224,000 M-1cm-1, 280 nm에서의 DM1 = 5700 M-1cm-1, 252 nm에서의 Ab = 82,880 M-1cm-1 및 252 nm에서의 DM1 = 26,790 M-1cm-1.
생성물을 비환원성 SDS-PAGE, SEC HPLC, 및 ELISA에 의한 알파 V베타3 및 알파V베타5 단백질에 대한 결합 친화성에 의해 분석하였다. PAGE에 의하면, 생성물은 주로 흐릿한 저분자량을 갖는 약 160 kDa의 밴드이면서 뚜렷하였다. SEC HPLC 분석에 의하면, 모노머 (18.8')를 용리하는 컨쥬게이트의 분획은 96%이고, 컨쥬게이트의 약 4%가 고분자량 종류 (16.2')로서 용리되었다. 알파 V베타5 상의 CNTO 95에 관해서는 3.0 e-11 M의 겉보기 Kd, 컨쥬게이트에 관해서는 3.5 e-11 M의 겉보기 Kd를 나타내는 흡광도 대 농도를 그래프로 나타내어 결합 친화성을 계산하였다. 두 종류는 알파 V베타3 상에서 약 3.0 e-9의 겉보기 Kd를 나타냈다.
유사하게 컨쥬게이트된, DM4 및 비인간 항원, F105을 타겟하는 무관련 항체에 컨쥬게이트된 CNTO 95-SPP-DM1 및 CNTO 95의 다른 배취를 도 2에 도시되고 도 3에 개요된 이작용성 링커를 사용하여 유사한 방법으로 제조하였다. 이들 제제의 특성은 하기에 주어진다:
CNTO 95-SPP-DM1 (CNTO 364)의 제조:
모노클로널 항체 CNTO 95를 다음과 같이 SPP 링커를 사용하여 메이탄시노이드 DM1에 컨쥬게이트하였다: CNTO 95 270.6 mg을 DM1 3.7 mg에 컨쥬게이트하여, 얻어진 컨쥬게이트 98 ml를 pH 6.5의 PBS 중에 2.74 mg/mL로 2℃ 내지 8℃로 저장하였다. DM1 농도는 흡광도에 의해 37.6 ㎍/mL로 측정되었다. 따라서, CNTO 95 몰당 DM1의 비는 2.98 (DM1 1 ㎍은 컨쥬게이트된 CNTO 95 항체 68.9 ㎍에 상당한다)이다. HPLC에 의하면, 제제는 0.59% 유리 약물을 함유하는 96.3% 모노머이었다.
CNTO 95-SPP-DM1 (CNTO 364)의 제조:
모노클로널 항체 CNTO 95를 다음과 같이 SPP 링커를 사용하여 메이탄시노이드 DM1에 컨쥬게이트하였다: CNTO 95 104 mg을 DM1 1.82 mg에 컨쥬게이트하여, 얻어진 컨쥬게이트 26 ml를 pH 6.5의 PBS 중에 컨쥬게이트된 CNTO 95-SPP-DM1 항체 3.65 mg/mL로 2℃ 내지 8℃로 저장하였다. DM1 농도는 흡광도에 의해 70.07 ㎍/mL로 측정되었다. 따라서, 제제는 CNTO 95 몰당 DM1 3.80 몰의 비를 포함한다 (DM1 1 ㎍은 컨쥬게이트된 CNTO 95 항체 57.2 ㎍에 상당한다). HPLC에 의하면, 제제는 1.61% 유리 약물을 함유하는 93.4% 모노머이었다.
CNTO 95-SPP-DM1 (CNTO 364)의 제조:
모노클로널 항체 CNTO 95를 다음과 같이 SPP 링커를 사용하여 메이탄시노이드 DM1에 컨쥬게이트하였다: CNTO 95 228 mg을 DM1 4.13 mg에 컨쥬게이트하여, 얻어진 컨쥬게이트 102 ml를 pH 6.5의 PBS 중에 컨쥬게이트된 CNTO 95-SPP-DM1 항체 2.24 mg/mL로 2℃ 내지 8℃로 저장하였다. DM1 농도는 흡광도에 의해 40.53 ㎍/mL로 측정되었다. 따라서, 제제는 CNTO 95 몰당 DM1 3.93 몰의 비를 포함한다 (DM1 1 ㎍은 컨쥬게이트된 CNTO 95 항체 55.3 ㎍에 상당한다). HPLC에 의하면, 제제는 1.00% 유리 약물을 함유하는 94.7% 모노머이었다.
CNTO 95-SSNPB-DM4 (CNTO 365)의 제조:
모노클로널 항체 CNTO 95를 다음과 같이 SSNPB 링커를 사용하여 메이탄시노이드 DM4에 컨쥬게이트하였다: CNTO 95 121 mg을 DM4 2.18 mg에 컨쥬게이트하여, 얻어진 컨쥬게이트 34 ml를 pH 6.5의 PBS 중에 3.25 mg/mL로 2℃ 내지 8℃로 저장하였다. DM4 농도는 흡광도에 의해 64.11 ㎍/mL로 측정되었다. 따라서, 항체 몰당 DM4의 비는 3.57 (DM4 1 ㎍은 컨쥬게이트된 CNTO 95 항체 55.6 ㎍에 상당한다)이다. HPLC에 의하면, 제제는 3.23% 유리 약물을 함유하는 95.4% 모노머이었다.
CNTO 95-SSNPP-DM4 (CNTO 366)의 제조:
모노클로널 항체 CNTO 95를 다음과 같이 SSNPP 링커를 사용하여 메이탄시노이드 DM4에 컨쥬게이트하였다: CNTO 95 101 mg을 DM4 1.45 mg에 컨쥬게이트하여, 얻어진 컨쥬게이트 30 ml를 pH 6.5의 PBS 중에 3.07 mg/mL 항체로 2℃ 내지 8℃로 저장하였다. DM4 농도는 흡광도에 의해 48.39 ㎍/mL로 측정되었다. 따라서, 제제는 CNTO 95 몰당 DM4 2.95 몰을 갖는다 (DM4 1 ㎍은 컨쥬게이트된 CNTO 95 항체 69.5 ㎍에 상당한다). HPLC에 의하면, 제제는 1.18% 유리 약물을 함유하는 85.9% 모노머이었다.
CNTO 95-SPDB-DM4 (CNTO 365)의 제조:
모노클로널 항체 CNTO 95를 다음과 같이 SPDB 링커를 사용하여 메이탄시노이드 DM4에 컨쥬게이트하였다: CNTO 95 228.5 mg을 DM4 4.37 mg에 컨쥬게이트하여, 얻어진 컨쥬게이트 104.5 ml를 pH 6.5의 PBS 중에 컨쥬게이트된 CNTO 95-SPDB-DM4 항체 2.19 mg/mL로 2℃ 내지 8℃로 저장하였다. DM4 농도는 흡광도에 의해 41.84 ㎍/mL로 측정되었다. 따라서, 제제는 CNTO 95 몰당 DM4 3.92 몰을 갖는다 (DM4 1 ㎍은 컨쥬게이트된 CNTO 95 항체 52.3 ㎍에 상당한다). HPLC에 의하면, 제제는 0.55% 유리 약물을 함유하는 93.6% 모노머이었다.
CNTO 95-SPDB-DM4 (CNTO 365)의 제조:
모노클로널 항체 CNTO 95를 다음과 같이 SPDB 링커를 사용하여 메이탄시노이드 DM4에 컨쥬게이트하였다: CNTO 95 309 mg을 DM4 5.4 mg에 컨쥬게이트하여, 얻어진 컨쥬게이트 130.7 ml를 pH 6.5의 PBS 중에 컨쥬게이트된 CNTO 95-SPDB-DM4 항체 2.36 mg/mL로 2℃ 내지 8℃로 저장하였다. DM4 농도는 흡광도에 의해 41.2 ㎍/mL로 측정되었다. 따라서, 제제는 CNTO 95 몰당 DM4 3.57 몰을 갖는다 (DM4 1 ㎍은 컨쥬게이트된 CNTO 95 항체 57.5 ㎍에 상당한다). HPLC에 의하면, 제제는 0.40% 유리 약물을 함유하는 93.8% 모노머이었다.
CNTO 95-SPP-DM1 (CNTO 364)의 제조:
모노클로널 항체 CNTO 95를 다음과 같이 SPP 링커를 사용하여 메이탄시노이드 DM1에 컨쥬게이트하였다: CNTO 95 270.6 mg을 DM1 3.7 mg에 컨쥬게이트하여, 얻어진 컨쥬게이트를 pH 6.5의 PBS 중에 2.74 mg/mL로 2℃ 내지 8℃로 저장하였다. DM1 농도는 흡광도에 의해 37.6 ㎍/mL로 측정되었다. 따라서, 제제는 CNTO 95 몰 당 DM1 2.98 몰의 비율을 포함한다 (DM1 1 ㎍은 컨쥬게이트된 CNTO 95 항체 68.9 ㎍에 상당한다). HPLC에 의하면, 제제는 0.59% 유리 약물을 함유하는 96.3% 모노머이었다.
CNTO 95-SPP-DM1 (CNTO 364)의 제조:
모노클로널 항체 CNTO 95를 다음과 같이 SPP 링커를 사용하여 메이탄시노이드 DM1에 컨쥬게이트하였다: F105 245 mg을 DM1 4.28 mg에 컨쥬게이트하여, 얻어진 컨쥬게이트 91.5 ml를 pH 6.5의 PBS 중에 컨쥬게이트된 F105-SPP-DM1 항체 2.68 mg/mL로 2℃ 내지 8℃로 저장하였다. DM1 농도는 흡광도에 의해 46.76 ㎍/mL로 측정되었다. 따라서, 제제는 F105 몰당 DM1 3.79 몰의 비율을 포함한다 (DM1 1 ㎍은 컨쥬게이트된 F105 항체 57.3 ㎍에 상당한다). HPLC에 의하면, 제제는 2.44% 유리 약물을 함유하는 90.3% 모노머이었다.
CNTO 95-SPP-DM4 (CNTO 366)의 제조:
모노클로널 항체 CNTO95를 다음과 같이 SPP 링커를 사용하여 메이탄시노이드 DM4에 컨쥬게이트하였다: CNTO 95 76.7 mg을 DM4 1.10 mg에 컨쥬게이트하여, 얻어진 컨쥬게이트 35 ml를 pH 6.5의 PBS 중에 컨쥬게이트된 CNTO 95-SPP-DM4 항체 2.19 mg/mL로 2℃ 내지 8℃로 저장하였다. DM4 농도는 흡광도에 의해 31.5 ㎍/mL로 측정되었다. 따라서, 제제는 CNTO 95 몰당 DM4 2.96 몰의 비율을 포함한다 (DM4 1 ㎍은 컨쥬게이트된 CNTO 95 항체 69.4 ㎍에 상당한다). HPLC에 의하면, 제제는 1.14% 유리 약물을 함유하는 97.3% 모노머이었다.
F105-SSNPB-DM4의 제조:
모노클로널 항체 F105를 다음과 같이 SSNPB 링커를 사용하여 메이탄시노이드 DM4에 컨쥬게이트하였다: F105 106 mg을 DM4 1.84 mg에 컨쥬게이트하여, 얻어진 컨쥬게이트 25 ml를 pH 6.5의 PBS 중에 3.85 mg/mL로 2℃ 내지 8℃로 저장하였다. DM4 농도는 흡광도에 의해 73.45 ㎍/mL로 측정되었다. 따라서, 항체의 몰당 DM4의 비는 3.57 (DM4 1 ㎍은 컨쥬게이트된 F105 항체 57.5 ㎍에 상당한다)이다. HPLC에 의하면, 제제는 1.92% 유리 약물을 함유하는 85.1% 모노머이었다.
F105-SSNPB-DM4의 제조:
모노클로널 항체 F105를 다음과 같이 SSNPB 링커를 사용하여 메이탄시노이드 DM4에 컨쥬게이트하였다: F105 106 mg을 DM4 1.84 mg에 컨쥬게이트하여, 얻어진 컨쥬게이트 30 ml를 pH 6.5의 PBS 중에 3.46 mg/mL로 2℃ 내지 8℃로 저장하였다. DM4 농도는 흡광도에 의해 57.93 ㎍/mL로 측정되었다. 따라서, 항체의 몰당 DM4의 비는 3.32 (DM4 1 ㎍은 컨쥬게이트된 F105 항체 65.4 ㎍에 상당한다)이다. HPLC에 의하면, 제제는 1.85% 유리 약물을 함유하는 88.8% 모노머이었다.
F105-SSNPP-DM4의 제조:
모노클로널 항체 F105를 다음과 같이 SSNPP 링커를 사용하여 메이탄시노이드 DM4에 컨쥬게이트하였다: F105 105 mg을 DM4 1.76 mg에 컨쥬게이트하여, 얻어진 컨쥬게이트 28 ml를 pH 6.5의 PBS 중에 3.41 mg/mL로 2℃ 내지 8℃로 저장하였다. DM4 농도는 흡광도에 의해 62.87 ㎍/mL로 측정되었다. 따라서, 제제는 F105 몰당 DM4 3.45 몰을 함유한다 (DM4 1 ㎍은 컨쥬게이트된 F105 항체 59.4 ㎍에 상당한다). HPLC에 의하면, 제제는 3.75% 유리 약물을 함유하는 85.9% 모노머이었다.
F105-SPDB-DM4의 제조:
모노클로널 항체 F105를 다음과 같이 SPDP 링커를 사용하여 메이탄시노이드 DM4에 컨쥬게이트하였다: F105 230.5 mg을 DM4 4.12 mg에 컨쥬게이트하여, 얻어진 컨쥬게이트 104.5 ml를 pH 6.5의 PBS 중에 2.21 mg/mL로 2℃ 내지 8℃로 저장하였다. DM4 농도는 흡광도에 의해 39.41 ㎍/mL로 측정되었다. 따라서, 제제는 F105 몰당 DM4 3.66 몰을 함유한다 (DM4 1 ㎍은 컨쥬게이트된 F105 항체 56.0 ㎍에 상당한다). HPLC에 의하면, 제제는 0.65% 유리 약물을 함유하는 89.2% 모노머이었다.
요약하면, 하기 종류를 추가의 분석을 위해 합성하였다 (표 6).
(표 6)
화합물 약물 메이탄시놀
활성화제		 Mab 활성화제 생성물 중의
디술파이에 인접하는 메틸기
(Mab측:약물측)
CNTO 364 DM1 N-메틸, N-(1-디티오메틸-3-카복시-프로필)알라닌 SPP 또는 SSNPP 1:0
CNTO 365 DM4 N-메틸, N-(1-디티오메틸-2-메틸-4-카복시-n-부틸)알라닌 SPDB 또는 SSNPB 0:2
CNTO 366 DM4 N-메틸, N-(1-디티오메틸-2-메틸-4-카복시-n-부틸)알라닌 SPP 또는 SSNPP 1:2
F105-DM1 DM1 N-메틸, N-(1-디티오메틸-3-카복시-프로필)알라닌 SPP 또는 SSNPP 1:0
F105-DM4 DM4 N-메틸, N-(1-디티오메틸-2-메틸-4-카복시-n-부틸)알라닌 SPDB 또는 SSNPB 0:2
F105-DM4 DM4 N-메틸, N-(1-디티오메틸-2-메틸-4-카복시-n-부틸)알라닌 SPP 또는 SSNPP 1:2
실시예 3: 종양 세포에 결합하는 CNTO 95-메이탄신 컨쥬게이트
생세포에 결합하는 CNTO 95-메이탄시노이드 컨쥬게이트 결합의 능력 및 친화성을 테스트하였다.
재료 및 방법: PBS 중의 CNTO 95 (Centocor 로트 번호 95-VF30A03-1) 20 mg/ml; CNTO 364 (CNTO 95-SPP-DM1) (ImmunoGen 로트 번호 1806-164) DM1 37.6 mg/ml, 컨쥬게이트된 항체 2.74 mg/ml, 엔도톡신 레벨 < 0.1 EU/mg; CNTO 365 (CNTO 95-SPDB-DM4) (ImmunoGen 로트 번호 2020-78), DM4 41.2 mg/ml, 컨쥬게이트된 항체 2.36 mg/ml, 엔도톡신 레벨 < 0.1 EU/mg; CNTO 366 (CNTO 95-SPP-DM4) (ImmunoGen 로트 번호 2020-48), DM4 31.5 mg/ml, 컨쥬게이트된 항체 2.19 mg/ml, 엔도톡신 레벨 < 0.1 EU/mg.
세포: HT29 인간 결장암 세포 및 A549 인간 폐암 세포를 ATCC로부터 얻어, 10% 소태아 혈청 (FBS)이 보충된 알파MEM에 유지하였다. A2780 인간 난소암 세포를 내셔널 캔서 인스티튜트 (National Cancer Institute)로부터 얻었다. A2780 세포를 10% FBS를 함유하는 RPMI 1640 배지에 배양하였다. 세포를 포획하여, 린스하고, 무혈청 DMEM에 현탁시키고, 계속해서 연속 희석된 CNTO 95, CNTO 364, CNTO 365 및 CNTO 366 및 FITC로 표지된 항 인간 항체 (10 mg/ml)로 얼음 상에서 60분간 배양하였다. 일차 항체 부재 또는 일차 항체의 이소타입으로 매칭된 항체의 치환을 음성 대조군으로서 작용한다. 세포를 즉시 FACS 스캔 II 플로 사이토미터 (Becton Dickinson, Mountain View, CA)로 분석하였다. 데이터를 비선형 회귀를 이용하여 GraphPad 프리즘 소프트웨어로 분석하여, 50% 최대 결합에서의 농도를 측정하였다 (표 7). 대부분의 경우에는 유효 결합 상수가 2배 미만으로 변화하였다.
(표 7)
EC50 (mg/ml)
화합물 HT29 A549 A2780
CNTO 95 0.14 0.18 0.17
CNTO 364 0.19 0.27 0.27
CNTO 365 0.21 0.34 0.27
CNTO 366 0.29 0.42 0.30
실시예 4: 종양 세포에 대한 CNTO 95-메이탄신 컨쥬게이트의 세포독성
시간에 대한 종양 세포를 살멸시키는 CNTO 95-메이탄시노이드 컨쥬게이트의 능력을 시험관 내에서 테스트하였다.
CNTO 364 (CNTO 95-SPP-DM1) (ImmunoGen 로트 번호 1806-164), DM1 37.6 ㎍/ml, 컨쥬게이트된 항체 2.74 mg/ml, 엔도톡신 레벨 < 0.1 EU/mg. CNTO 365 (CNTO 95-SPDB-DM4) (ImmunoGen 로트 번호 2020-78), DM4 41.2 ㎍/ml, 컨쥬게이트된 항체 2.36 mg/ml, 엔도톡신 레벨 < 0.1 EU/mg. CNTO 366 (CNTO 95-SPP-DM4) ( ImmunoGen 로트 번호 2020-48), DM4 31.5 ㎍/ml, 컨쥬게이트된 항체 2.19 mg/ml, 엔도톡신 레벨 < 0.1 EU/mg.
인간 HT29 인간 결장암 세포 및 인간 비소세포 폐암 세포 A549 (ATCC)를 5% CO2의 존재하에 37℃에서 10% FBS가 보충된 αMEM에서 배양하였다. 세포를 배지 중에서 백색 96 웰 조직 배양 플레이트 (5000 세포/웰)에 파종하여, 16 시간 배양하였다. 면역 컨쥬게이트의 연속 희석물을 각각의 적절한 웰 (0 내지 20 ㎍/ml)에 가하였다. 조직 배양 플레이트를 37℃에서 96 시간 배양하였다. 제조업자의 사용설명서에 따라 ATPLIte 분석을 행하였다. 데이터를 비선형 회귀를 이용하여 GraphPad 프리즘 소프트웨어로 분석하여, 광도에 의해 측정된 최대 세포수의 반값 에서의 농도를 측정하였다 (표 8). 대부분의 경우에는 유효 결합 상수가 2배 미만으로 변화하였다.
(표 8)
EC50 (㎍/ml)
면역 컨쥬게이트 HT29 A549
CNTO 364 1.0 1.2
CNTO 365 0.24 0.3
CNTO 366 1.0 1.5
실시예 5: 인간 흑색종으로 유도된 종양을 갖는 래트의 CNTO 95-DM1 치료
진행성 피하 A375.S2 인간 흑색종 세포에 대하여, CNTO 95와 비교하여 CNTO 364의 효능을 조사하였다.
CNTO 95-DM1을 준비하였다 (ImmunoGen, Inc. 로트 번호 1716-74B, 스톡 농도: 2.59 mg/ml. CNTO 95-DM1 5 mg/kg은 DM1 74 ㎍/kg에 상당한다. CNTO 95를 센토코 (Centocor, 로트 번호 5380-027, 스톡 농도 = 20 mg/ml)로부터 얻었다. 인간 IgG-DM1: ChromPure 인간 IgG를 잭슨 이뮤노리서치 라보러토리즈 (Jackson ImmunoResearch Laboratories)로부터 얻었다. 인간 IgG-DM1을 ImmunoGen (로트 번호 1762-50, 스톡 농도 2.8 mg/ml)부터 얻었다. 이러한 컨쥬게이트 5 mg/kg은 DM1 76 ㎍/kg에 상당한다. 메이탄신: ImmunoGen, 로트 번호 1710-121, 스톡 농도 = PBS, pH 6.5 중에서 16.38 ㎍/ml. 메이탄신 원액을 PBS로 15 및 7.5 ㎍/ml로 희석하였다. PBS: ImmunoGen, pH 6.5. A375.S2 인간 흑색종 세포를 ATCC로부터 얻어, 센토코 셀 바이올러지 서비스 (Centocor Cell Biology Services)의 동결 앨리코트 (aliquot)에 서브패시지되어 저장되었다.
생후 9 주령의 무흉선 누드 래트에게 A375.S2 인간 흑색종 세포를 피하 접종하였다. 14일째에, 평균 종양 체적이 250 내지 300 mm3에 이르면, 동물을 무작위로 9/10개의 그룹으로 나누어, 치료를 개시하였다. CNTO 95-DM1 및 적절한 대조 화합물을 정맥내 주사하였다 (첫주에는 하루 걸러서 3회 주사한 다음, 2 주간은 11, 14, 16, 21 및 28일째에 주당 1회 주사하였다). 종양 사이즈 및 체중을 기록하였다. 도 6은 누드 마우스의 인간 흑색종에 관한 시간에 대한 종양 체적 변화를 나타낸다. 종양 체적은 평균 +/- SEM (n = 9 또는 10)으로 나타낸다. 화살표는 정맥내 약물 주사를 나타낸다. 별표는 이의 종양 체적이 1500 mm3 이상이기 때문에, 한 마리의 무응답 동물이 죽은 것을 나타낸다. 모든 동물이 35일째에 죽었다. 종양 체적은 평균 +/- SEM (n = 9 또는 10)으로 나타내었다. 화살표는 정맥내 약물 주사의 일수를 나타낸다. 본 실험에서, 5 mg/kg의 CNTO 95-DM1은 종양 증식을 블록하여, 평균 종양 체적을 감소시킨데 반해, 10 mg/kg의 CNTO 95은 효과가 없었다.
래트에서의 제 2 실험에 있어서, 평균 종양 체적은 14일째에 250 mm3에 이르렀다. 동물을 무작위로 그룹으로 나눈 다음에, 제 1 투여량을 14일째에 정맥내 투여하였다. 후속 주사를 같은 주의 16일째 및 18일째에 행한 다음에, 23일째 31일째에 주당 1회 행하였다. 모든 동물이 35일째에 죽었다. CNTO 95-DM1 5 mg/kg은 암컷 무흉선 래트에서 A375.S2 인간 멜라노마이종 이식편의 완전 소실을 일으켰다 (도 7). PBS, 유리 CNTO 95, 무관련 항체-DM1 컨쥬게이트, 유리 메이탄신, 및 유리 CNTO 95 + 유리 메이탄신을 포함하는 대조 화합물은 큰 효과를 나타내지 않았 다.
실시예 6: 인간 결장암으로 유발된 종양을 지닌 래트의 CNTO 95-DM1 치료
진행성 피하 HT29 인간 결장암에 대하여, CNTO 95와 비교하여 CNTO 364의 효능을 조사하였다.
CNTO 364, ImmunoGen 로트 번호 1806-50, 단백질 농도 2.53 mg/ml, DM1 농도 41.8 mg/ml, CNTO 95에 대한 DM1의 비 CNTO 95 몰당 DM1 3.6 몰. PBS 또는 항체 F105-DM1을 대조군으로서 사용하였다. F105-DM1; ImmunoGen 로트 번호 1806-44, 단백질 농도 2.2 mg/ml, DM1 농도 38.3 mg/ml, F105에 대한 DM1의 비 F105의 몰당 DM1 3.8 몰. 모든 피험물질에 대하여, 엔도톡신 오염을 테스트하고, LAL 값은 1.0 EU/mg 이하이다. αvβ3, avb5, 및 avb6 인테그린을 발현하는 HT29 인간 결장암 세포주를 얻었다 (Centocor's cell bank). 이 세포주는 마이코플라즈마 및 세균물질을 함유하지 않는 것으로 측정되었다. 세포를 37℃에서 5% CO2의 존재하에 10% FBS, 1% 피루베이트, 및 1% MEM 비필수 아미노산이 보충된 αMEM에서 배양하였다.
70 마리의 암컷 무흉선 래트 (Harlan Laboratories (Indianapolis, IN))를 본 연구에 사용하였다. 래트의 뒤 옆구리 부분 (배면, 후단에서 맨끝의 늑골까지 약 0.5 인치, 척추에서 0.5 인치)에, 5 x 106 HT29 세포를 피하 주사하였다 (25 x lO6 세포/ml의 0.2 ml). 모든 래트를 촉지가능한 종양에 대하여 매일 (평일) 모니터하였다. 동물을 개별 종양 체적에 의해 각각 9 마리의 동물을 포함하는 7개의 그룹으로 층으로 배열하였다 (표 9). 모든 그룹에 대한 평균 개시 종양 체적은 250 내지 260 mm3이었다.
(표 9)
그룹 N CNTO 364
(mg/kg)		 투여일
1) PBS 9 0 7, 14, 21, 28 및 35
2) F105-DM1 9 25 7 및 14
3) CNTO 364 9 3 7, 14, 21, 28 및 35
4) CNTO 364 9 6 7, 14, 21, 28 및 35
5) CNTO 364 9 10 7, 14, 21, 28 및 35
6) CNTO 364 9 15 7, 14 및 35
7) CNTO 364 9 25 7 및 14
그룹으로 나눈 날에 (0 일), 동물의 체중을 달아, 25 mg/kg의 대조 항체 F105-DM1 또는 3, 6, 10, 15 또는 25 mg/kg의 CNTO 364로 정맥 내 주사하였다. ㅁ모든 피검물질 및 대조물질은 1 ml/체중 100 g의 체적으로 주어졌다. 3, 6, 및 10 mg/kg 그룹의 CNTO 364을 q7dx5 스케쥴에 따라 정맥내 투여하였다. 15 mg/kg의 CNTO 364를 7, 14, 및 35일째에 투약하였다. 25 mg/kg의 CNTO 364 및 25 mg/kg의F105-DM1을 7 및 14일째에 투약하였다. 후자의 두 그룹은 체중이 상당히 손실되었기 때문에 (0일째에 10% 이상) 기관의 IACUC 가이드라인에 따라 안락사시켰다 (도 8).
종양 체적 측정값을 매주 2회 기록하였다. 종양을 밀리미터 (mm)로 2차원 (길이 및 폭)으로 캘리퍼스를 사용하여 측정하였다. 종양 체적 (mm3)을 식 V = (길이 x 폭 x 폭)/2을 이용하여 계산하였다. 대응이 없는 t-검정을 이용한 GraphPad 프리즘 소프트웨어로 통계를 내었다.
CNTO 364는 용량 의존적으로 기존의 결장 종양 증식을 억제하였다 (도 9). q7dx5 투약 스케쥴에 있어서의 10 mg/kg의 CNTO 364은 9 마리의 동물 중 3 마리의 완전 종양 소실과, 2 마리의 부분 종양 소실을 가져왔다 (도 10). 7, 14 및 35일째에 15 mg/kg의 CNTO 364으로 처리한 바, 종양을 지닌 9 마리의 동물 중에서 4 마리의 종양 완전 소실과, 4 마리의 부분 소실을 가져왔다. PBS 대조군은 35일째에 후 종양 세포 이식 (평균 종양 체적 5000 mm3 이상)이 종료되었다. 그 때, 10 mg/kg 및 15 mg/kg의 CNTO 364로 처리된 그룹 대 PBS 대조군 사이의 종양 체적 차는 양측 대응이 없는 t-검정을 이용하여 측정한 바, P 값이 < 0.0001이었다.
25 mg/kg의 CNTO 364 및 25 mg/kg의 F105-DM1의 2개의 연속 투여는 독성을 나타내고, 허용불가능한 체중 손실을 가져왔다 (도 8). 그러나, 25 mg/kg의 CNTO 364의 단회 투여로, 4000 mm3 이상의 평균 종양 체적을 갖는 진행성 HT29 인간 결장암 종양이 완전히 소실되었다 (도시되지 않음).
실시예 7: 인간 폐암으로 유발된 종양을 지니는 래트의 CNTO 95-DM1 처리
본 연구를 A549 인간 폐암을 지니는 암컷 무흉선 래트에 있어서의 CNTO 95-DM1 컨쥬게이트의 생체 내 효능을 평가하기 위해 행하였다. CNTO 95를 준비하여 (Centocor, (Malvern, PA)), DM1의 컨쥬게이션을 ImmunoGen (Cambridge, MA)에 의해 행하였다. CNTO 364 (CNTO 95-SPP-DM1)은 실시예 1에 기재된 바와 같았다.
인간 폐암 세포주 A549 (ATCC)를 10% FBS를 함유하는 MEM알파에서 배양하고, 세포를 무흉선 래트에서의 피하 이식을 위해 무혈청 αMEM에서 준비하였다. 암컷 무흉선 래트 (생후 6 주령, Harlan Laboratory, Indianapolis, IN)의 뒤 옆구리 부분 (배면, 후단에서 맨끝의 늑골까지 약 0.5 인치, 척추에서 0.5 인치)에, 5 x 106 세포를 피하 이식하였다 (25 x lO6 세포/ml의 0.2 ml). 평균 종양 체적이 250 mm3에 이를 때, 동물을 유사한 평균 종양 체적을 갖는 투약 그룹으로 층으로 배열하고 (표 10), 종양 세포 주입 후 17일째 및 29일째에 정맥 내로 투여하였다.
(표 10)
그룹 약물 17일째 및 29일째의 투약량
1 PBS 사용되지 않음
2 F105-DM1 15 mg/kg
3 CNTO 364 15 mg/kg
4 CNTO 95 단독 15 mg/kg
5 CNTO 95 + 메이탄신 15 mg/kg + 260 ㎍/kg
6 메이탄신 단독 260 ㎍/kg
종양 체적 측정값을 매주 2회 기록하였다. 종양을 밀리미터 (mm)로 2차원 (길이 및 폭)으로 전자 버니어 (Vernier) 캘리퍼스를 사용하여 측정하였다. 종양 체적 (mm3)을 식 V = (길이 x 폭 x 폭)/2을 이용하여 계산하였다. 종양 체적 (mm3)을 평균 +/-SEM (n = 6)으로 나타낸다. 이들 결과를 시간에 대하여 플롯하며, 도 12에서 화살표는 정맥 내 약물 주사 시간을 나타낸다. 내성 인디케이터로서 체중을 이용하면 (도 11), 동물은 본 연구에 사용된 CNTO 364 투약 스케쥴에 대하여 내성을 나타내며, 제 1 투약 후의 초기 체중에 있어서 다만 3%의 일시적인 체중 손실을 가져온다.
본페로니 테스트 (Bonferroni test)를 이용한 일원배치분산분석 (ANOVA)을, 95% 신뢰 구간을 이용하는 GraphPad 프리즘 4 소프트웨어 (GraphPad Software, Inc., San Diego, CA)로 행하였다. 도 12를 참조한다: 그룹 1, PBS; 그룹 2, 15 mg/kg의 F105-DM1; 그룹 3, 15 mg/kg의 CNTO 364; 그룹 4, 15 mg/kg의 CNTO95 단독; 그룹 5, 15 mg/kg의 CNTO 95 + 260 mg/kg의 메이탄신; 그룹 6, 260 mg/kg의 메이탄신 단독. P값을 다중 비교를 위해 본페로니 테스트를 이용한 일원배치분산분석 (ANOVA)에 의해 측정하였다. *P<0.05, CNTO 364 대 F105-DM1, CNTO 95 + 메이탄신 또는 메이탄신 단독; **P<0.01, CNTO 364 대 CNTO 95 단독; ***P<0.001, CNTO 364 대 PBS.
CNTO 95에 대한 DM1의 컨쥬게이션, 거대 분자는 생체 내에서의 DM1의 반감기를 연장함으로써 DM1의 약물속도론적 특성을 변화시킬 것이다. 이러한 가능성을 배제하기 위해, 무관련 항체 F105-DM1 면역 컨쥬게이트를 본 연구에 포함시켜, CNTO 95-DM1 컨쥬게이트의 활성이 CNTO 95 의존성을 나타내는지의 여부를 결정하였다. CNTO 95가 항혈관형성/항종양 화합물이고, DM1은 세포 독성제이기 때문에, 항종양 활성이 유리 CNTO 95 및 유리 DM1의 단순한 상가작용으로 인한 것으로 여겨진다. 따라서, 유리 CNTO 95, 유리 CNTO 95 + 유리 메이탄신, 및 유리 메이탄신이 투여된 그룹은 대조군으로서 포함되었다. 도 13에 도시된 바와 같이, 15 mg/kg의 CNTO 364는 qxl2dx2 투약 스케쥴에 따라 6개의 종양 A549 폐 종양 이종 이식편 중 6개를 제거하였다. F105-DM1 그룹에서의 하나의 완전 종양 소실 및 CNTO 95 + 메이탄신 그룹에서의 2개의 하나의 완전 종양 소실을 관찰하였다. 이러한 결과로부터, A549 폐 종양 소실에 있어서, CNTO 95-DM1 면역 컨쥬게이트, CNTO 364의 우위 성이 입증된다. 이러한 투여 처방에서 CNTO 364로 처리된 동물은 명백한 강한 독성의 징후없이, 일시적인 피부 독성 및 체중 손실을 나타냈다.
실시예 8: 인간 결장암 종양 모델에서의 컨쥬게이트 구조의 비교
면역력이 약화된 래트의 피하 이식된 HT29 인간 결장 종양으로 유도된 세포를 이용하는 진행성 종양 모델을 선택하여, CNTO 95의 면역 컨쥬게이트를 제조하는데 사용되는 여러가지 결합의 내성 및 효력을 조사하였다.
CNTO 95-SPP-DM1 (CNTO 364), CNTO 95-SSNPB-DM4 (CNTO 365), CNTO 95-SSNPP-DM4 (CNTO 366), 및 이들의 Mab F105 등가물을 ImmunoGen (Cambridge, MA)로 제조하였다. 100 마리의 암컷 무흉선 래트 (생후 4 내지 6 주령)을 얻었다 (Harlan Laboratories).
인간 HT29 (ATCC)을 5% CO2의 존재하에 37℃에서 10% FBS가 보충된 αMEM에서 배양하였다. 세포를 접종을 위해 무혈청 αMEM의 ml 당 25 x lO6 세포의 농도로 준비하였다. 암컷 무흉선 래트의 뒤 옆구리 부분 (배면, 후단에서 맨끝의 늑골까지 약 0.5 인치, 척추에서 0.5 인치)에, 5 x 106 HT29 세포를 피하 이식하였다 (25 x lO6 세포/ml의 0.2 ml). 모든 래트를 종양 외관에 대하여 주당 2회 모니터하였다. 동물을 약 250 mm3의 각 그룹의 평균 종양 체적에 의거하여, 그룹 당 6 마리로 된 13개의 그룹으로 층으로 배열하였다. 그룹으로 나눈 날에 (7일), 각 그룹은 표 11에 나타낸 초기 투약량을 취하였다. 면역 컨쥬게이트의 용량을 각 컨쥬게이트에 서 DM1 또는 DM4 함량에 의거하여 계산하였다. L 및 H는 각각 DM1 또는 DM4의 175 및 350 ㎍/kg을 나타낸다. 모든 피험물질은 1 ml/체중 100 gm의 체적으로 나타내었다. 7일째에 단 하나의 용량을 취한 그룹 11을 제외하고는, 모든 다른 그룹에 대해서는 7일째 및 21일째에 투약되었다. 종양 체적 변화를 효능의 인티케이터로서 사용하고 (도 14a 및 도 14b), 체중 변화를 내성을 모니터하는데 사용하였다 (도 15a 및 도 15b). 모든 측정값을 그룹 평균 +/- SEM (n= 6)으로 나타낸다.
(표 11)
그룹 번호 투여된 Ab 컨쥬게이트
(mg/kg)		 DMx의 용량
㎍/kg
1. PBS 0 0
2. F105-SPP-DM1 11.5 DM1: 175
3. F105-SPP-DM1 23 DM1: 350
4. F105-SSNPB-DM4 10 DM4: 175
5. F105-SSNPB-DM4 20 DM4: 350
6. F105-SSNPP-DM4 10.5 DM4: 175
7. F105-SSNPP-DM4 21 DM4: 350
8. CNTO 364 10 DM1: 175
9. CNTO 364 20 DM1: 350
10. CNTO 365 10 DM4: 175
11. CNTO 365 20 DM4: 350
12. CNTO 366 12 DM4: 175
13. CNTO 366 24 DM4: 350
도 14b에 도시된 바와 같이, CNTO 365, 및 DM4가 350 ㎍/kg인 F105-SSNPB-DM4가 주사된 동물은 제 1 투약 후에 원래 체중의 10% 이상이 손실되었다. 따라서, 1회의 주사 후의 2개의 그룹에는 투약을 중지하였다. > 10% 체중 손실은 일시적이고, 치료 중지 후 10일 이내에 동물을 회수하였다. 나머지 그룹에 대하여, 7일째 및 21일째에 투약한 바, 동물이 10% 이상의 체중을 손실한 고용량 CNTO 364 그룹을 제외하고는 큰 체중 손실이 관찰되지 않았다. 이러한 투약 스케쥴에 따라 CNTO 364를 이용한 다른 실험에서는 큰 체중 손실을 나타내지 않았다. 도 14b에 도시된 바와 같이, 고용량의 CNTO 365의 단회 투여로, 6 마리의 동물 중에서 4 마리가 기존의 피하 인간 HT29 결장암의 완전 소실을 나타냈다. 고용량의 CNTO 364 (DM1 350 ㎍/kg) 및 저용량의 CNTO 365 (DM4 175 ㎍/kg)에 의해서도 결장 종양이 소실되거나 (각각, 각 그룹에서 6 마리의 동물 중 2 마리), HT29 결장 종양 증식을 상당히 억제시켰다. 그러나, 저용량의 CNTO 364 (DM1 175 ㎍/kg)와, 저용량 및 고용량의 CNTO 366는 종양 사이즈에 대하여 크게 영향을 미치지 않았다. 이러한 결과는 이러한 종양 이식 모델에서 q14dx2 스케쥴에 따라 정맥 내 투여되는 경우, CNTO 365가 CNTO 364 및 CNTO 366 보다 효력 및 효능이 우수하다는 것을 제시한다.
본 발명은 상술한 설명 및 실시예에서 특별히 기재된 것과는 다르게 실시될 수 있음은 명백할 것이다.
본 발명의 여러가지 변형 및 변경이 상술한 설명을 고려하여 가능하므로, 첨부된 청구의 범위의 범위 내에 포함된다.
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Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Val Ile Ser Phe Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Glu Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Val Asn Ile Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Ala Arg Gly Ser Tyr Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Met Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 8 <211> 108 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Pro 85 90 95 Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys 100 105 <210> 9 <211> 1048 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9 Met Ala Phe Pro Pro Arg Arg Arg Leu Arg Leu Gly Pro Arg Gly Leu 1 5 10 15 Pro Leu Leu Leu Ser Gly Leu Leu Leu Pro Leu Cys Arg Ala Phe Asn 20 25 30 Leu Asp Val Asp Ser Pro Ala Glu Tyr Ser Gly Pro Glu Gly Ser Tyr 35 40 45 Phe Gly Phe Ala Val Asp Phe Phe Val Pro Ser Ala Ser Ser Arg Met 50 55 60 Phe Leu Leu Val Gly Ala Pro Lys Ala Asn Thr Thr Gln Pro Gly Ile 65 70 75 80 Val Glu Gly Gly Gln Val Leu Lys Cys Asp Trp Ser Ser Thr Arg Arg 85 90 95 Cys Gln Pro Ile Glu Phe Asp Ala Thr Gly Asn Arg Asp Tyr Ala Lys 100 105 110 Asp Asp Pro Leu Glu Phe Lys Ser His Gln Trp Phe Gly Ala Ser Val 115 120 125 Arg Ser Lys Gln Asp Lys Ile Leu Ala Cys Ala Pro Leu Tyr His Trp 130 135 140 Arg Thr Glu Met Lys Gln Glu Arg Glu Pro Val Gly Thr Cys Phe Leu 145 150 155 160 Gln Asp Gly Thr Lys Thr Val Glu Tyr Ala Pro Cys Arg Ser Gln Asp 165 170 175 Ile Asp Ala Asp Gly Gln Gly Phe Cys Gln Gly Gly Phe Ser Ile Asp 180 185 190 Phe Thr Lys Ala Asp Arg Val Leu Leu Gly Gly Pro Gly Ser Phe Tyr 195 200 205 Trp Gln Gly Gln Leu Ile Ser Asp Gln Val Ala Glu Ile Val Ser Lys 210 215 220 Tyr Asp Pro Asn Val Tyr Ser Ile Lys Tyr Asn Asn Gln Leu Ala Thr 225 230 235 240 Arg Thr Ala Gln Ala Ile Phe Asp Asp Ser Tyr Leu Gly Tyr Ser Val 245 250 255 Ala Val Gly Asp Phe Asn Gly Asp Gly Ile Asp Asp Phe Val Ser Gly 260 265 270 Val Pro Arg Ala Ala Arg Thr Leu Gly Met Val Tyr Ile Tyr Asp Gly 275 280 285 Lys Asn Met Ser Ser Leu Tyr Asn Phe Thr Gly Glu Gln Met Ala Ala 290 295 300 Tyr Phe Gly Phe Ser Val Ala Ala Thr Asp Ile Asn Gly Asp Asp Tyr 305 310 315 320 Ala Asp Val Phe Ile Gly Ala Pro Leu Phe Met Asp Arg Gly Ser Asp 325 330 335 Gly Lys Leu Gln Glu Val Gly Gln Val Ser Val Ser Leu Gln Arg Ala 340 345 350 Ser Gly Asp Phe Gln Thr Thr Lys Leu Asn Gly Phe Glu Val Phe Ala 355 360 365 Arg Phe Gly Ser Ala Ile Ala Pro Leu Gly Asp Leu Asp Gln Asp Gly 370 375 380 Phe Asn Asp Ile Ala Ile Ala Ala Pro Tyr Gly Gly Glu Asp Lys Lys 385 390 395 400 Gly Ile Val Tyr Ile Phe Asn Gly Arg Ser Thr Gly Leu Asn Ala Val 405 410 415 Pro Ser Gln Ile Leu Glu Gly Gln Trp Ala Ala Arg Ser Met Pro Pro 420 425 430 Ser Phe Gly Tyr Ser Met Lys Gly Ala Thr Asp Ile Asp Lys Asn Gly 435 440 445 Tyr Pro Asp Leu Ile Val Gly Ala Phe Gly Val Asp Arg Ala Ile Leu 450 455 460 Tyr Arg Ala Arg Pro Val Ile Thr Val Asn Ala Gly Leu Glu Val Tyr 465 470 475 480 Pro Ser Ile Leu Asn Gln Asp Asn Lys Thr Cys Ser Leu Pro Gly Thr 485 490 495 Ala Leu Lys Val Ser Cys Phe Asn Val Arg Phe Cys Leu Lys Ala Asp 500 505 510 Gly Lys Gly Val Leu Pro Arg Lys Leu Asn Phe Gln Val Glu Leu Leu 515 520 525 Leu Asp Lys Leu Lys Gln Lys Gly Ala Ile Arg Arg Ala Leu Phe Leu 530 535 540 Tyr Ser Arg Ser Pro Ser His Ser Lys Asn Met Thr Ile Ser Arg Gly 545 550 555 560 Gly Leu Met Gln Cys Glu Glu Leu Ile Ala Tyr Leu Arg Asp Glu Ser 565 570 575 Glu Phe Arg Asp Lys Leu Thr Pro Ile Thr Ile Phe Met Glu Tyr Arg 580 585 590 Leu Asp Tyr Arg Thr Ala Ala Asp Thr Thr Gly Leu Gln Pro Ile Leu 595 600 605 Asn Gln Phe Thr Pro Ala Asn Ile Ser Arg Gln Ala His Ile Leu Leu 610 615 620 Asp Cys Gly Glu Asp Asn Val Cys Lys Pro Lys Leu Glu Val Ser Val 625 630 635 640 Asp Ser Asp Gln Lys Lys Ile Tyr Ile Gly Asp Asp Asn Pro Leu Thr 645 650 655 Leu Ile Val Lys Ala Gln Asn Gln Gly Glu Gly Ala Tyr Glu Ala Glu 660 665 670 Leu Ile Val Ser Ile Pro Leu Gln Ala Asp Phe Ile Gly Val Val Arg 675 680 685 Asn Asn Glu Ala Leu Ala Arg Leu Ser Cys Ala Phe Lys Thr Glu Asn 690 695 700 Gln Thr Arg Gln Val Val Cys Asp Leu Gly Asn Pro Met Lys Ala Gly 705 710 715 720 Thr Gln Leu Leu Ala Gly Leu Arg Phe Ser Val His Gln Gln Ser Glu 725 730 735 Met Asp Thr Ser Val Lys Phe Asp Leu Gln Ile Gln Ser Ser Asn Leu 740 745 750 Phe Asp Lys Val Ser Pro Val Val Ser His Lys Val Asp Leu Ala Val 755 760 765 Leu Ala Ala Val Glu Ile Arg Gly Val Ser Ser Pro Asp His Ile Phe 770 775 780 Leu Pro Ile Pro Asn Trp Glu His Lys Glu Asn Pro Glu Thr Glu Glu 785 790 795 800 Asp Val Gly Pro Val Val Gln His Ile Tyr Glu Leu Arg Asn Asn Gly 805 810 815 Pro Ser Ser Phe Ser Lys Ala Met Leu His Leu Gln Trp Pro Tyr Lys 820 825 830 Tyr Asn Asn Asn Thr Leu Leu Tyr Ile Leu His Tyr Asp Ile Asp Gly 835 840 845 Pro Met Asn Cys Thr Ser Asp Met Glu Ile Asn Pro Leu Arg Ile Lys 850 855 860 Ile Ser Ser Leu Gln Thr Thr Glu Lys Asn Asp Thr Val Ala Gly Gln 865 870 875 880 Gly Glu Arg Asp His Leu Ile Thr Lys Arg Asp Leu Ala Leu Ser Glu 885 890 895 Gly Asp Ile His Thr Leu Gly Cys Gly Val Ala Gln Cys Leu Lys Ile 900 905 910 Val Cys Gln Val Gly Arg Leu Asp Arg Gly Lys Ser Ala Ile Leu Tyr 915 920 925 Val Lys Ser Leu Leu Trp Thr Glu Thr Phe Met Asn Lys Glu Asn Gln 930 935 940 Asn His Ser Tyr Ser Leu Lys Ser Ser Ala Ser Phe Asn Val Ile Glu 945 950 955 960 Phe Pro Tyr Lys Asn Leu Pro Ile Glu Asp Ile Thr Asn Ser Thr Leu 965 970 975 Val Thr Thr Asn Val Thr Trp Gly Ile Gln Pro Ala Pro Met Pro Val 980 985 990 Pro Val Trp Val Ile Ile Leu Ala Val Leu Ala Gly Leu Leu Leu Leu 995 1000 1005 Ala Val Leu Val Phe Val Met Tyr Arg Met Gly Phe Phe Lys Arg 1010 1015 1020 Val Arg Pro Pro Gln Glu Glu Gln Glu Arg Glu Gln Leu Gln Pro 1025 1030 1035 His Glu Asn Gly Glu Gly Asn Ser Glu Thr 1040 1045

Claims (36)

  1. 하기 화학식의 항체-약물 컨쥬게이트, 및 이의 약제학적으로 허용가능한 염 및 에스테르:
    Figure 112012087825535-pct00020
    상기 식에서,
    항체는 인간 알파V 인테그린 서브유닛 특이적인 항체로서, 상기 알파V 인테그린 서브유닛을 발현하는 세포에 의해 내재화될 수 있으며, (i) 서열번호 1, 2 및 3에 기재된 CNTO 95 항체의 모든 중쇄 상보성 결정 영역(CDR) 아미노산 서열, 및 (ii) 서열번호 4, 5 및 6에 기재된 CNTO 95 항체의 모든 경쇄 CDR 아미노산 서열을 포함하고;
    메이탄시놀은 C-3에서 에스테르화되고;
    R1 및 R2는 각각 Me이고;
    X1 및 X2는 각각 H이며;
    n은 2이고;
    p는 1 내지 5이며;
    m은 1 내지 10이다.
  2. 제1항에 있어서, 항체가 인간 알파V 인테그린으로의 결합에 대하여 모노클로널 항체 CNTO 95 또는 이의 단편과 경쟁하는 것을 특징으로 하는 항체-약물 컨쥬게이트.
  3. 제1항에 있어서, 항체가 모노클로널 항체 CNTO 95인 것을 특징으로 하는 항체-약물 컨쥬게이트.
  4. 제2항에 있어서, 항체가 인간 알파V베타3 인테그린을 발현하는 생세포로의 결합에 대하여 CNTO 95와 경쟁하는 것을 특징으로 하는 항체-약물 컨쥬게이트.
  5. 제1항에 있어서, 항체가 서열번호 9의 아미노산 서열 내의 에피토프에 특이적인 것을 특징으로 하는 항체-약물 컨쥬게이트.
  6. 제1항에 있어서, 항체가 인간, 인간화 항체 또는 키메라 항체인 것을 특징으로 하는 항체-약물 컨쥬게이트.
  7. 제1항에 있어서, m이 3 또는 4인 것을 특징으로 하는 항체-약물 컨쥬게이트.
  8. 제1항에 있어서, X1 및 X2가 각각 H이고, p가 2인 것을 특징으로 하는 항체-약물 컨쥬게이트.
  9. 제8항에 있어서, 항체가 모노클로널 항체 CNTO 95인 것을 특징으로 하는 항체-약물 컨쥬게이트.
  10. (a) 인간 알파V 인테그린 서브유닛 특이적인 항체를 하기 구조식 중 어느 하나로 표현되는 이작용성 커플링 시약으로 처리함으로써 상기 항체에 하나 이상의 유리 또는 보호 티올기를 도입하여 활성화된 항체를 형성하는 단계;
    Figure 112012087825535-pct00021
    (SPDP),
    Figure 112012087825535-pct00022
    (SPDB), 또는
    Figure 112012087825535-pct00023
    (SSNPB)
    (b) 상기 활성화된 항체를 DM4와 반응시켜 항체-약물 컨쥬게이트를 형성하는 단계; 및
    (c) 상기 항체-약물 컨쥬게이트를 회수하는 단계를 포함하는,
    제1항의 항체-약물 컨쥬게이트를 제조하는 방법.
  11. 제10항에 있어서, 이작용성 커플링 시약이 (2-피리딜)-3-디티오프로판산 N-하이드록시 숙신이미드 에스테르(SPDP), 또는 (2-피리딜)-4-디티오부탄산 N-하이드록시 숙신이미드 에스테르(SPDB)인 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 항체-약물 컨쥬게이트, 및 약제학적으로 허용가능한 담체, 희석제 또는 부형제를 포함하는, 암 치료용 약제학적 조성물.
  13. 암 치료용 약제학적 조성물의 제조를 위해 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 항체-약물 컨쥬게이트를 사용하는 방법.
  14. 제1항의 항체-약물 컨쥬게이트의 치료적 유효량을 포함하는, 유방 선암, 폐 선암, 췌장 선암, 결장 선암, 신장 세포암, 또는 위 선암 중에서 선택된 암 치료용 약제.
  15. 제14항에 있어서, 암이 두경부 편평상피암, 식도 편평상피암, 폐 편평상피암, 피부 편평상피암, 또는 자궁경부 편평상피암인 것을 특징으로 하는 약제.
  16. 제1항의 항체-약물 컨쥬게이트의 치료적 유효량을 포함하는, 암의 전이 확산 치료 또는 예방용 약제.
  17. 인간 알파V베타3 인테그린을 발현하는 생세포에 대한 CNTO 95의 결합을 방지하는 제1항의 항체-약물 컨쥬게이트를 암 세포 증식을 억제하는데 유효한 양으로 포함하는, 암 세포 증식 억제용 약제.
  18. 제17항에 있어서, 약제가 정맥내로 투여되는 것을 특징으로 하는 약제.
  19. 제18항에 있어서, 항체-약물 컨쥬게이트가 0.05 mg/체중 kg 내지 12.0 mg/체중 kg의 양으로 투여되는 것을 특징으로 하는 약제.
  20. 인간 알파V베타3 인테그린을 발현하는 생세포에 대한 CNTO 95의 결합을 방지하는 제1항의 항체-약물 컨쥬게이트를 혈관신생을 억제하는데 유효한 양으로 포함하는,
    암 전이, 혈관종, 혈관섬유종, 당뇨병성 망막증, 미숙아 망막증, 혈관 신생 녹내장, 혈관 형성에 의해 유발되는 각막 질환, 퇴행기 황반, 황반 변성, 익상편, 망막 변성, 수정체후 섬유증식증, 과립성 결막염, 건선, 모세혈관 확장증, 화농성 육아종, 지루성 피부염, 좌창 및 관절염으로 구성되는 그룹 중에서 선택되는 혈관 신생 의존성 질환에 걸린 포유동물의 혈관신생 억제용 약제.
  21. 인간 알파V베타3 인테그린을 발현하는 생세포에 대한 CNTO 95의 결합을 방지하는 제1항의 항체-약물 컨쥬게이트를 염증성 질환을 개선하는데 유효한 양으로 포함하는, 류머티스 관절염, 황반 변성, 건선 및 당뇨병성 망막증으로 구성되는 그룹 중에서 선택되는 염증성 질환 개선용 약제.
  22. 제20항에 있어서, 항체-약물 컨쥬게이트가 건선, 정맥성 궤양, 좌창, 주사, 사마귀, 습진, 혈관종, 및 림프관 형성으로 구성되는 그룹 중에서 선택되는 혈관신생 피부 질환을 치료하는 것을 특징으로 하는 약제.
  23. 제20항에 있어서, 항체-약물 컨쥬게이트가 각막 또는 망막 신생혈관을 수반하는 질환을 치료하는 것을 특징으로 하는 약제.
  24. 제14항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 항체-약물 컨쥬게이트가 제2의 치료제 또는 예방제 또는 모댈러티(modality)와 병용하여 투여되는 것을 특징으로 하는 약제.
  25. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 항체-약물 컨쥬게이트 및 용기(container)를 포함하고, 추가로 상기 항체-약물 컨쥬게이트가 알파V 인테그린 서브유닛을 발현하는 세포를 특징으로 하는 질환을 치료하는데 사용될 수 있음을 표시하는 패키지 인서트 또는 라벨을 포함하는 제품.
  26. 제25항에 있어서, 패키지 인서트가, 상기 항체-약물 컨쥬게이트가 암을 치료하는데 사용될 수 있음을 표시하는 것을 특징으로 하는 제품.
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