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KR101281098B1 - Ｂ형 간염 바이러스 표면 항원상의 에피토프 및 이의 용도 - Google Patents

Ｂ형 간염 바이러스 표면 항원상의 에피토프 및 이의 용도 Download PDF

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KR101281098B1
KR101281098B1 KR1020110064671A KR20110064671A KR101281098B1 KR 101281098 B1 KR101281098 B1 KR 101281098B1 KR 1020110064671 A KR1020110064671 A KR 1020110064671A KR 20110064671 A KR20110064671 A KR 20110064671A KR 101281098 B1 KR101281098 B1 KR 101281098B1
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Abstract

본 발명은 B형 간염 바이러스(HBV)에 특이적인 에피토프 및 이의 용도에 대한 것으로, 본 발명에서 제공되는 에피토프는 돌연변이에 의한 변형이 일어나지 않는 보존적 부위이기 때문에, 상기 에피토프에 대한 항체를 포함하는 조성물 또는 상기 에피토프를 포함하는 백신 조성물은 HBV의 돌연변이에 의한 치료효과 저하가 일어날 가능성이 낮아 HBV 치료에 매우 유용하게 이용가능하다.

Description

Ｂ형 간염 바이러스 표면 항원상의 에피토프 및 이의 용도{Epitope and it's use of Hepatitis B virus surface antigen}
본 발명은 B형 간염 바이러스(Hepatitis B virus, 이하 'HBV'라 함)에 특이적인 에피토프 및 이의 용도에 대한 것으로, 본 발명에서 제공되는 에피토프는 돌연변이에 의한 변형이 일어나지 않는 보존적 부위이기 때문에, 상기 에피토프에 대한 항체를 포함하는 조성물 또는 상기 에피토프를 포함하는 백신 조성물은 HBV의 돌연변이에 의한 치료효과의 저하가 일어날 가능성이 낮아 HBV 치료에 매우 유용하게 이용가능하다.
또한 본 발명은 상기 에피토프에 특이적인 항체를 생산하는 방법에 대한 것으로, 본 발명에 따라 생산된 상기 에피토프에 특이적인 항체는 체내에 투여시 높은 특이성을 가지는 것을 특징으로 한다.
HBV는 헤파드나바이러스(Hepadnaviridae) 패밀리에 속하는 DNA 게놈을 갖는 바이러스로서, 급성 및 만성 간염을 유발한다. HBV는 서로 유전자 염기서열이 약 8% 이상 다른 8개의 유전자형으로 분류되거나 HBV 표면 항원(HBsAg) 두 곳의 항원결정부위 (d/y, w/r)를 중심으로 9종의 혈청형(adw, adr, ayw, ayr 등)으로 구분된다. 전 세계 인구 중의 약 3.5억 명이 HBV 만성 감염자이며, 특히 한국 및 중국은 만성 감염자가 약 5~8%에 이르며, HBV 감염은 이 지역의 간질환 및 간암의 주원인이다. 현재는 백신의 개발로 어느 정도 예방이 가능해졌지만 아직도 B형 간염 바이러스에 의한 만성 간염 환자가 상당수 존재하고 있는 현실이다. HBV의 만성 감염은 간염, 간경변 뿐만 아니라 간암을 유발하며 만성 감염자가 비감염자에 비해 간암 발생빈도가 약 300배 높게 나타나는데, WHO의 조사에 따르면 약 80%의 간암은 만성 B형 간염이 원인이라고 한다.
현재 개발되어 시판중인 B형 간염 치료제는 뉴클레오사이드 유사체(nucleoside analogue)인 라미부딘(lamivudine)과 아데포비어(adefovir dipivoxil) 등이 있으며, 이들은 HBV 중합효소(HBV polymerase)의 역전사효소(reverse transcriptase)를 저해함으로써 HBV의 DNA 복제를 저해한다. 하지만, 3년 투약시 약 75%의 환자에서 내성 바이러스가 발생하여 치료 효과가 저하되는 문제점이 있어, 산모에서 태아로의 수직감염이나 간이식 후 감염을 예방하기 위해 B형 간염 항체 제제를 함께 사용하고 있다.
지금까지 사용되어 온 B형 간염 항체 제제는 항체를 보유하고 있는 사람의 혈액을 수거하여 이로부터 고도의 정제기술과 바이러스 불활화 기술을 사용하여 생산하고 있으나 원료혈장의 구입이 어렵고 그 비용이 타 혈액제제에 비해 상당히 비싸기 때문에 증가하는 수요에 탄력적으로 대처할 수 없는 문제가 있으며, 사람 혈장 유래의 바이러스로부터의 오염을 제거하는데 많은 시간과 비용이 소요된다는 단점도 있다.
또한 현재 사용되고 있는 백신을 통해 체내에서 형성되는 항체는 대부분 HBV의 ‘a’ 에피토프(epitope) 부위를 인식하는 항체들이 형성되는 것으로 알려져 있다. 하지만 최근에 이러한 항체들을 회피할 수 있는 돌연변이들, 예를 들어 HBV의 표면 단백질의 145번 글리신(glycine)이 아르기닌(arginine)으로 치환된 돌연변이체 등이 보고되고 있으며 이외에도 다양한 회피형 돌연변이들이 나타나고 있어, 기존의 HBV 치료제로는 만족스러운 치료효과를 거두기 어렵다. 따라서, HBV의 복제 등에 관여하는 HBV의 생존에 필수적인 부위에 해당되어 돌연변이가 일어나지 않는 에피토프에 특이적으로 결합함으로써, 돌연변이에 의한 치료효과의 저하가 발생하지 않는 HBV 치료용 항체 또는 HBV 백신에 대한 수요는 지속적으로 증가하고 있는 실정이다.
상기와 같은 문제를 해결하고자 본 발명은 RFLWE(서열번호 4) 또는 KFLWE(서열번호 5)을 포함하는 B형 간염바이러스(HBV) 특이적 에피토프를 제공하며, 특히 FARFLWEWASVRFSW(서열번호 6) 또는 FGKFLWEWASARFSW(서열번호 7)의 아미노산 서열을 가지며 HBV의 생존에 필수적인 부위에 해당되기 때문에 돌연변이가 일어나지 않는 보존적 부위에 해당하는 에피토프를 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 또한 상기 에피토프를 생산하는 방법 및 상기 에피토프를 포함하는 HBV 백신용 조성물 또는 백신, 상기 에피토프를 이용하여 상기 에피토프에 특이적으로 결합하는 특성을 가지는 항체를 생산하는 방법 및 그러한 방법으로 생산된 항체를 포함하는 HBV 치료용 조성물 또는 치료제를 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 추가적으로 상기 에피토프 또는 상기 에피토프를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 HBV 검출용 조성물 또는 키트를 제공하는 것을 또 다른 목적으로 한다.
본 발명에서는 HBV 표면 항원에 특이적으로 결합하는 인간 항체(PCT/KR2010/004445 참조, 이하 ‘이 건 항체’라 함)의 에피토프가 RFLWE(서열번호 4) 또는 KFLWE(서열번호 5)를 포함하는 서열, 특히 FARFLWEWASVRFSW(서열번호 6) 또는 FGKFLWEWASARFSW(서열번호 7)에 따른 서열 또는 이의 일부에 해당함을 확인하고, 이 에피토프 부위가 매우 보존적이며 HBV에 복제에 있어 매우 중요한 부위여서, HBV 생존에 필수적인 부위임을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다. 상기 에피토프 중, 서열번호 4 및 서열번호 6에 따른 에피토프는 HBV의 adr 아형(서열번호 1 참조)에서의 에피토프이며, 서열번호 5 및 서열번호 7에 따른 에피토프는 HBV의 ayw 아형(서열번호 2 참조)에서의 에피토프에 해당된다.
상기 서열번호 4 내지 서열번호 7 중 어느 하나에 따른 HBV 특이적 에피토프는 그 3차원 구조를 유지하거나, 백신 등의 조성물로 이용시 효율을 제고하기 위하여 담체(carrier)와 결합된 형태로 이용가능하다. 본 발명에 따른 담체는 생체에 적합하며 본 발명에서 목적하는 효과를 거둘 수 있는 것이라면 모두 사용가능한데, 펩타이드, 혈청 알부민, 면역 글로불린, 헤모시아닌 및 다당체 등에서 선택됨이 바람직하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 서열번호 4 내지 서열번호 7 중 어느 하나에 따른 HBV 특이적 에피토프 자체 또는 담체와 결합된 형태의 복합체는 HBV 치료용 백신 조성물로 이용가능하다. 이때 상기 백신 조성물에는 약학적으로 허용가능한 면역보조제(adjuvant) 또는 부형제가 추가적으로 포함될 수 있다. 면역보조제로는 체내에 주입시 항체 형성을 증진시키는 역할을 하여 본 발명에서의 목적 달성이 가능한 것이라면 어떤 것이라도 사용가능하며, 특히 알루미늄염(Al(OH)3, ALPO4), 스쿠알렌(squalene), 소르비탄 (sorbitane), 폴리소르베이트 80(polysorbate 80), CpG, 리포좀, 콜레스테롤, MPL(monophosphoryl lipid A) 및 GLA(glucopyranosyl lipid A)에서 선택된 하나 이상이 바람직하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서 제공되는 상기 서열번호 4 내지 서열번호 7 중 어느 하나에 따른 HBV 특이적 에피토프를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는 그 자체로 유전자 백신 형태로 이용가능하다. 이때, 상기 폴리뉴클레오티드는 전달체 없이 그 자체로 이용가능할 수도 있으며, 바이러스성 또는 비바이러스성 전달체에 담지되어 체내로 전달될 수 있다. 바이러스성 또는 비바이러스성 전달체는 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상적으로 이용가능하다고 알려진 것이면 어떤 것이라도 이용가능하다. 구체적으로 바이러스성 전달체는 아데노바이러스(adenovirus), 아데노-연관 바이러스(adeno-associated virus), 렌티바이러스(lentivirus), 레트로바이러스(letrovirus) 등이 바람직하며, 비바이러스성 벡터로는 양이온성 폴리머, 비이온성 폴리머, 리포좀, 지질, 인지질, 친수성 폴리머, 소수성 폴리머 및 이들 중에서 선택된 하나 이상의 복합체 등이 이용가능하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명은 상기 서열번호 4 내지 서열번호 7 중 어느 하나에 따른 HBV 특이적 에피토프를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터 이를 포함하는 숙주세포, 그리고 상기 재조합 벡터 또는 숙주세포를 이용하여 본 발명에 따른 서열번호 4 내지 서열번호 7 중 어느 하나에 따른 HBV 특이적 에피토프를 생산하는 방법을 제공한다.
본 발명에서 "재조합 벡터"란 적당한 숙주세포에서 목적 단백질을 발현할 수 있는 발현 벡터로서, 유전자 삽입물이 발현되도록 작동가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 작제물을 말한다. 본 발명에서 "작동가능하게 연결된 (operably linked)"는 일반적 기능을 수행하도록 핵산 발현조절 서열과 목적하는 단백질을 코딩하는 핵산 서열이 기능적으로 연결되어 있는 것을 말한다. 재조합 벡터와의 작동적 연결은 본 발명이 속하는 기술분야에서 잘 알려진 유전자 재조합 기술을 이용하여 수행될 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 일반적으로 알려진 효소 등을 사용하여 용이하게 수행할 수 있다
본 발명에서 사용될 수 있는 적합한 발현 벡터는 프로모터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널 및 인핸서 같은 발현 조절 엘리먼트 외에도 막 표적화 또는 분비를 위한 시그널 서열을 포함할 수 있다. 개시 코돈 및 종결 코돈은 일반적으로 면역원성 표적 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 일부로 간주되며, 유전자 작제물이 투여되었을 때 개체에서 반드시 작용을 나타내야 하며 코딩 서열과 인프레임(in frame)에 있어야 한다. 일반 프로모터는 구성적 또는 유도성일 수 있다. 원핵 세포에는 lac, tac, T3 및 T7 프로모터가 있으나 이로 제한되지는 않는다. 진핵세포에는 원숭이 바이러스 40(SV40), 마우스 유방 종양 바이러스(MMTV) 프로모터, 사람 면역 결핍 바이러스(HIV), 예를 들면 HIV의 긴 말단 반복부(LTR) 프로모터, 몰로니 바이러스, 시토메갈로바이러스(CMV), 엡스타인 바 바이러스(EBV), 로우스 사코마 바이러스(RSV) 프로모터 뿐만 아니라, β-액틴 프로모터, 사람 헤로글로빈, 사람 근육 크레아틴, 사람 메탈로티오네인 유래의 프로모터가 있으나 이에 제한되지는 않는다.
상기 발현 벡터는 벡터를 함유하는 숙주 세포를 선택하기 위한 선택 마커(selection marker)를 포함할 수 있다. 선택 마커는 벡터로 형질전환된 세포를 선별하기 위한 것으로, 약물 내성, 영양 요구성, 세포 독성제에 대한 내성 또는 표면 단백질의 발현과 같은 선택가능 표현형을 부여하는 마커들이 사용될 수 있다. 선택제(selective agent)가 처리된 환경에서 선별 마커를 발현하는 세포만 생존하므로 형질전환된 세포가 선별 가능하다. 또한, 벡터는 복제가능한 발현벡터인 경우, 복제가 개시되는 특정 핵산 서열인 복제원점(replication origin)을 포함할 수 있다. 재조합 발현 벡터로는 플라스미드, 바이러스, 코즈미드 등 다양한 형태의 벡터가 사용될 수 있다. 재조합 벡터의 종류는 원핵세포 및 진핵세포의 각종 숙주세포에서 원하는 유전자를 발현하고 원하는 단백질을 생산하는 기능을 하는 한 특별히 한정되지는 않지만, 강력한 활성을 나타내는 프로모터와 강한 발현력을 보유하면서 자연 상태와 유사한 형태의 외래 단백질을 대량으로 생산할 수 있는 벡터가 바람직하다.
특히 본 발명에 따른 서열번호 4 내지 서열번호 7 중 어느 하나에 따른 HBV 특이적 에피토프를 발현시키기 위해 다양한 발현 숙주/벡터 조합이 이용될 수 있다. 진핵숙주에 적합한 발현 벡터로는 SV40, 소 유두종바이러스, 아네노바이러스, 아데노-연관 바이러스(adeno-associated virus), 시토메갈로바이러스, 렌티바이러스 및 레트로바이러스로부터 유래된 발현 조절 서열 등이 사용될 수 있지만 이에 한정되는 것은 아니다. 세균 숙주에 사용할 수 있는 발현 벡터에는 pET, pRSET, pBluescript, pGEX2T, pUC벡터, col E1, pCR1, pBR322, pMB9 및 이들의 유도체와 같이 대장균(Escherichia coli)에서 얻어지는 세균성 플라스미드, RP4와 같이 보다 넓은 숙주 범위를 갖는 플라스미드, λgt10과 λgt11, NM989와 같은 매우 다양한 파지 람다(phage lambda) 유도체로 예시될 수 있는 파지 DNA, 및 M13과 필라멘트성 단일가닥의 DNA 파지와 같은 기타 다른 DNA 파지가 포함된다. 곤충 세포에 유용한 벡터는 pVL941이다.
상기 재조합 벡터는 숙주세포에 삽입되어 형질전환체를 형성하는데, 적합한 숙주세포는 대장균, 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.), 슈도모나스 속(Pseudomonas sp.), 프로테우스 미라빌리스(Proteus mirabilis) 또는 스타필로코쿠스 속(Staphylococcus sp.)과 같은 원핵 세포, 아스페르길러스 속(Aspergillus sp.)과 같은 진균, 피치아 파스토리스(Pichia pastoris), 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae), 쉬조사카로마세스 속(Schizosaccharomyces sp.) 및 뉴로스포라 크라사(Neurospora crassa)와 같은 효모, 그 밖의 하등진핵 세포, 및 곤충으로부터의 세포와 같은 고등 진핵생물의 세포와 같은 진핵 세포일 수 있다. 또한 상기 숙주세포는 바람직하게는 식물, 포유동물로부터 유래할 수 있는데, 원숭이 신장 세포7(COS7 : monkey kidney cells) 세포, NSO 세포, SP2/0, 차이니즈 햄스터 난소(CHO : chinese hamster ovary) 세포, W138, 어린 햄스터 신장(BHK : baby hamster kidney)세포, MDCK, 골수종 세포주, HuT 78 세포 및 HEK293 세포 등이 이용가능하며, 이에 한정되지 않는다. 특히 바람직하게는 CHO 세포이다.
본 발명에서 숙주세포로의형질 전환"은 핵산을 유기체, 세포, 조직 또는 기관에 도입하는 어떤 방법도 포함되며 당 분야에서 공지된 바와 같이 숙주 세포에 따라 적합한 표준 기술을 선택하여 수행할 수 있다. 이런 방법에는 전기충격유전자전달법(electroporation), 원형질 융합, 인산 칼슘(CaPO4) 침전, 염화 칼슘(CaCl2) 침전, 실리콘 카바이드 섬유를 이용한 교반, 아그로 박테리아 매개된 형질전환, PEG, 덱스트란 설페이트, 리포펙타민 및 건조/억제 매개된 형질전환 방법 등이 포함되나 이에 제한되지 않는다. 재조합 벡터가 발현되는 형질전환체를 영양배지에서 배양함으로써 본 발명에 따른 서열번호 4 내지 서열번호 7 중 어느 하나에 따른 HBV 특이적 에피토프를 대량으로 생산할 수 있으며, 배지와 배양조건은 숙주 세포에 따라 관용되는 것을 적당히 선택 이용할 수 있다. 배양시 세포의 생육과 단백질의 대량 생산에 적합하도록 온도, 배지의 pH 및 배양시간 등의 조건들을 적절하게 조절할 수 있다. 상기와 같이 재조합적으로 서열번호 4 내지 서열번호 7 중 어느 하나에 따른 HBV 특이적 에피토프는 배지 또는 세포 분해물로부터 회수될 수 있으며, 통상적인 생화학 분리 기술에 의해서 분리, 정제가 가능하다(Sambrook et al., Molecular Cloning: A laborarory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989); Deuscher, M., Guide to Protein Purification Methods Enzymology, Vol. 182. Academic Press. Inc., San Diego, CA(1990)). 이에는 전기영동, 원심분리, 겔여과, 침전, 투석, 크로마토그래피(이온교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 면역흡착 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피 등), 등전점 포커싱 및 이의 다양한 변화 및 복합 방법 등이 이용가능하지만 이에 한정되지 않는다.
본 발명은 상기 서열번호 4 내지 서열번호 7 중 어느 하나에 따른 HBV 특이적 에피토프를 미생물 또는 바이러스 표면에 발현하는 방법을 제공한다. 이때 유도하는 프로모터 또는 신호 단백질을 코딩하는 서열을 포함함을 특징으로 하는 재조합 벡터 및 상기 재조합 벡터를 포함하는 다양한 미생물 또는 바이러스가 사용될 수 있으며, 특히 적합한 미생물 또는 바이러스는 재조합 대장균, 재조합 효모 및 재조합 박테리오 파지 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 미생물 또는 바이러스 표면에 상기 서열번호 4 내지 서열번호 7 중 어느 하나에 따른 HBV 특이적 에피토프를 미생물 또는 바이러스 표면에 발현시키기 위해서는 본 발명이 속하는 기술분야에 잘 알려진 디스플레이(display) 기술이 이용될 수 있으며, 특히 미생물 세포 또는 바이러스 표면에 발현되도록 유도하는 프로모터 또는 신호 단백질을 인코딩하는 서열에 상기 서열번호 4 내지 서열번호 7 중 어느 하나에 따른 HBV 특이적 에피토프를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 결합시켜 발현하거나, 원래 표면에 발현되는 단백질을 인코딩하는 유전자 부위의 일부를 결손시키고 이에 상기 서열번호 4 내지 서열번호 7 중 어느 하나에 따른 HBV 특이적 에피토프를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 삽입하는 방법 등이 이용가능하지만 이에 한정되는 것은 아니다. 이러한 방법으로 미생물 또는 바이러스 표면에 발현된 상기 서열번호 4 내지 서열번호 7 중 어느 하나에 따른 HBV 특이적 에피토프는 그 자체로 분리, 정제되어 본 발명에 따른 특정한 용도로 사용할 수 있으며, 표면에 발현된 상태로 상기 서열번호 4 내지 서열번호 7 중 어느 하나에 따른 HBV 특이적 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체를 선별하여 수득하는 용도로도 이용가능하다.
본 발명은 또한 서열번호 4 내지 서열번호 7 중 어느 하나에 따른 HBV 특이적 에피토프, 상기 에피토프를 포함하는 복합체 또는 상기 에피토프를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 이용한 서열번호 4 내지 서열번호 7 중 어느 하나에 따른 HBV 특이적 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체, 또는 그러한 항체의 단편을 생산하는 방법을 제공한다. 이러한 항체는 다클론 항체(polyclonal antibody) 또는 단클론 항체(monoclonal antibody) 일 수 있으며, 상기 항체의 단편도 서열번호 4 내지 서열번호 7 중 어느 하나에 따른 HBV 특이적 에피토프에 결합하는 특성을 보유하는 한, 본 발명의 권리범위에 포함된다. 특히 본 발명에서의 항체 또는 항체의 단편은 서열번호 4 내지 서열번호 7 중 어느 하나에 따른 HBV 특이적 에피토프에 대한 결합 기능을 보유한 단쇄 항체, 디아바디, 트리아바디, 테트라바디, Fab 단편, F(ab’)2 단편, Fd, scFv, 도메인 항체, 이중특이항체들, 미니바디, 스캡, IgD 항체, IgE 항체, IgM 항체, IgG1 항체, IgG2 항체, IgG3 항체, IgG4 항체, 항체 불변영역의 유도체들, 단백질 스캐폴드(protein scaffolds)에 기초한 인공항체 등이 모두 포함되나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한 본 발명의 항체의 특성이 유지되는 한, 가변영역 내에서의 변이가 일어난 항체도 본 발명의 권리범위에 포함된다. 그러한 예로서 가변영역에서의 아미노산의 보존적 치환(conservative substitution)을 들 수 있다. 보존적 치환은 원래의 아미노산 서열과 유사한 특성을 가지는 다른 아미노산 잔기로의 치환을 의미하는데, 예를 들어 라이신, 아르기닌, 히스티딘은 염기 곁사슬을 가지고 있어 유사한 특성을 가지고, 아스파라틱산과 글루타믹산은 산 곁사슬을 가진다는 점에서 유사한 특성을 가진다. 또한, 글라이신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인, 트립토판은 비전하 극성 곁사슬을 가진다는 점에서 특성이 유사하며, 알라닌, 발린, 루신, 트레오닌, 아이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌은 비극성 곁사슬을 가지고 있다는 점에서, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘은 방향족 곁사슬을 가지고 있다는 점에서 유사한 특성을 가진다. 따라서, 상기와 같이 유사한 특성을 가지는 그룹 내에서의 아미노산 치환이 일어나더라도 별다른 특성 변화를 보이지 않을 것이라는 점은 통상의 기술자에게는 자명한 것이므로, 본 발명에 따른 항체의 특성이 유지되는 한, 가변영역 내에서의 보존적 치환에 의한 변이가 일어난 항체를 생산하는 방법도 본 발명의 권리범위에 포함된다.
본 발명에 따른 서열번호 4 내지 서열번호 7 중 어느 하나에 따른 HBV 특이적 에피토프에 결합하는 항체는 본 발명이 속하는 기술분야에 잘 알려져 있는 방법을 이용하여 제조할 수 있다. 구체적으로는 서열번호 4 내지 서열번호 7 중 어느 하나에 따른 HBV 특이적 에피토프, 상기 에피토프를 포함하는 복합체 또는 상기 에피토프를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 동물에 접종하고, 접종된 동물로부터 서열번호 4 내지 서열번호 7 중 어느 하나에 따른 HBV 특이적 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체를 생산하여, 선별함으로써 수득할 수 있다.
이때, 상기 동물은 인간 유래 서열과 동일한 항체를 생산할 수 있도록 형질전환된 동물, 특히 형질전환된 쥐인 것이 바람직한데, 형질전환된 쥐를 이용한 면역원성이 저하된 소위 인간항체(fully human antibody)는 미국등록특허 제5,569,825호, 미국등록특허 제5,633,425호, 미국등록특허 제7,501,552호등에 기재된 방법을 이용하여 제조할 수 있다. 만약 상기 동물이 인간 유래 서열과 동일한 항체를 생산할 수 있도록 형질전환된 것이 아니라면, 상기 동물로부터 수득된 항체를 이용하여 미국등록특허 제5,225,539호, 미국등록특허 제5,859,205호, 미국등록특허 제6,632,927호, 미국등록특허 제 5,693,762호, 미국등록특허 제6,054,297호, 미국등록특허 제6,407,213호, 국제공개특허 제1998/52976호에 기재된 방법과 같이 추가적으로 인간화(humanization) 단계 또는 탈면역화(deimmunization) 단계를 수행하여, 체내에 치료용으로 적합하도록 할 수 있다. 구체적으로 상기 인간화 또는 탈면역화는 인간 항체의 FR(framework)에 동물로부터 생산된 항체의 CDR 서열을 이식(grafting)하는 CDR-이식(CDR grafting) 단계 및 추가적으로 친화도(affinity)를 높이거나, 면역원성(immunogenecity)을 저하시키기 위해, 하나 이상의 아미노산 서열을 치환, 삽입, 결실하는 CDR-워킹(CDR-walking) 단계를 포함할 수 있다.
만약 서열번호 4 내지 서열번호 7 중 어느 하나에 따른 HBV 특이적 에피토프, 상기 에피토프를 포함하는 복합체 또는 상기 에피토프를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드가 아닌 HBV 전체를 면역원으로 이용하는 경우에는 HBV에 대한 결합능을 가지는 항체를 우선적으로 선별하는 단계 및 1 차로 선별된 항체 중에서 서열번호 4 내지 서열번호 7 중 어느 하나에 따른 HBV 특이적 에피토프를 특이적으로 인식하는 항체를 선별하는 방법을 이용할 수도 있다. 이때, 서열번호 4 내지 서열번호 7 중 어느 하나에 따른 HBV 특이적 에피토프의 중요한 결합부위에 돌연변이를 유발하여, 1 차로 선별된 HBV에 결합하는 항체들 중에서 서열번호 4 내지 서열번호 7 중 어느 하나에 따른 HBV 특이적 에피토프의 중요한 결합부위에 돌연변이가 일어난 HBV에 결합능이 결여되거나 저하된 항체를 선별하는 방법도 이용가능하다.
또한 본 발명이 속하는 기술분야에서 잘 알려진 디스플레이(display) 기술을 이용하여 서열번호 4 내지 서열번호 7 중 어느 하나에 따른 HBV 특이적 에피토프에 결합하는 인간 항체를 생산, 선별할 수 있다. 상기 디스플레이 기술은 파지 디스플레이(phage display), 박테리아 디스플레이(bacteria display), 또는 리보좀 디스플레이(ribosome display) 중에서 선택된 어느 하나인 것이 바람직하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 라이브러리의 제조 및 디스플레이는 미국등록특허 제5,733,743호, 미국등록특허 제7063943호, 미국등록특허 제6172197호 미국등록특허 제6,348,315호, 미국등록특허 제6,589,741호 등에 기재된 바에 따라 용이하게 실시할 수 있다. 특히 상기 디스플레이에 사용되는 라이브러리(library)는 인간 유래 항체의 서열을 갖도록 설계된 것이 바람직하다. 구체적으로 상기 방법은 서열번호 4 내지 서열번호 7 중 어느 하나에 따른 HBV 특이적 에피토프 또는 상기 에피토프를 포함하는 복합체를 이용하여 서열번호 4 내지 서열번호 7 중 어느 하나에 따른 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체만을 선별(panning)하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.
마지막으로 본 발명은 서열번호 4 내지 서열번호 7 중 어느 하나에 따른 에피토프, 상기 에피토프를 포함하는 복합체 또는 상기 에피토프를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 HBV 검출용 조성물 및 키트를 제공한다. 본 발명에 따른 HBV 검출용 조성물 또는 키트는 HBV의 돌연변이에 큰 영향을 받지 않고, HBV의 감염 여부를 신속하고 정확하게 진단 가능한 장점이 있다. 본 발명의 서열번호 4 내지 서열번호 7 중 어느 하나에 따른 에피토프, 상기 에피토프를 포함하는 복합체 또는 상기 에피토프를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 HBV 검출용 키트는 통상적인 효소 면역 흡착분석법(ELISA), 형광-활성 세포 선별 측정방법(FACS) 등의 다양한 방법을 이용하는 형태로 제조될 수 있으며, 본 발명의 에피토프를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 이용할 경우, 통상의 혼성화(hybridization) 기법을 이용하여 혼성화 여부를 검출하는 방법이 이용될 수 있다.
본 발명에서 제공되는 HBV 특이적 에피토프는 돌연변이에 의한 변형이 일어나지 않는 보존적 부위로서 상기 에피토프에 대한 항체를 포함하는 조성물 또는 상기 에피토프를 포함하는 백신 조성물은 HBV의 돌연변이에 의한 치료효과의 저하가 일어날 가능성이 낮아 HBV 치료 및 진단에 매우 유용하게 이용가능하다.
본 발명에 따른 HBV 특이적 에피토프는 돌연변이에 의한 변형이 일어나지 않는 보존적 부위로서 상기 에피토프에 대한 항체를 포함하는 조성물 또는 상기 에피토프를 포함하는 백신 조성물은 HBV의 돌연변이에 의한 치료효과의 저하가 일어날 가능성이 낮아 HBV 치료 및 진단에 매우 유용하게 이용가능하다.
도 1은 이 건 항체의 에피토프를 규명하기 위해 HBV 표면항원 단백질 돌연변이체에 대한 이 건 항체의 결합능 변화를 분석한 결과를 나타내는 도면.
도 2는 본 발명에 따른 에피토프를 포함하는 HBV 표면 항원 단백질 내의 루프 구조를 나타내는 도면.
도 3은 HBV 게놈 구조에 대한 도면으로, 표면항원 단백질을 코딩하는 게놈(S ORF)과 폴리머라제를 코딩하는 게놈(P ORF)이 일부 중복(overlapping)됨을 나타내는 도면.
도 4는 HBV 폴리머라제의 돌연변이체 제조 방법을 나타내는 도면.
도 5는 HBV Pol 결여 레플리콘과 HBV 폴리머라제 돌연변이체를 동시에 HepG2 세포에 감염시키는 보족성(complementation) 시험 과정을 나타내는 도면.
도 6은 서던 블랏(Southern blot) 분석방법을 이용한 각 HBV 폴리머라제 돌연변이체들의 HBV 복제 능력을 시험한 결과를 나타내는 도면 (HBV DNA 복제 중간체인 RC, DL, SS DNA가 오른쪽을 비교하여 도시).
도 7은 RNase 보호 분석(protection assay) 방법을 이용한 각 HBV 폴리머라제 돌연변이체들의 프리지노믹 RNA 패키징(pregenomic RNA packaging)에 미치는 영향을 시험한 결과를 나타내는 도면.
도 8은 HBV 바이러스 파티클을 생성하기 위한 유체역학 주입법(hydrodynamic injection)에 사용되는 HBV 유전자 벡터의 개열지도를 나타내는 도면.
이하 본 발명을 실시예와 첨부된 도면을 참조하여 상세히 설명한다. 그러나 이들은 본 발명을 보다 상세하게 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 권리범위가 하기의 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
[실시예 1] 이 건 항체의 에피토프 규명
이 건 항체의 에피토프를 규명하기 위하여, HBV adr 아형의 표면항원 단백질(서열번호 1 참조) 내에 무작위 돌연변이(random mutagenesis)를 유발시키고, 각 돌연변이체들에 대한 이 건 항체의 결합능력을 조사하였다. 이때 돌연변이체의 제조 및 이 건 항체의 결합능력 분석은 미국의 인테그랄 몰레큘라(Integral Molecular) 사의 샷건 돌연변이법(shotgun mutagenesis, J Am Chem Soc. 2009; 131(20): 6952~6954 등 참조)을 이용하였다. 에피토프 규명을 위해 사용된 돌연변이 라이브러리의 특성은 하기 표 1과 같다. 상기 라이브러리를 포함하는 클론을 HEK-293T 세포에 감염시키고, 이 건 항체의 결합능을 면역형광분석법(immunofluorescence assay)을 이용하여 분석하였다.
이 건 항체의 결합능은 3회 반복 실험한 결과를 평균하였으며, 야생형 HBV 표면항원 단백질에 대한 결합능을 이용하여 표준화(normalization)하였다. 이때, HBV 표면항원 단백질에 대한 토끼 폴리클로날 항체를 이용하여, 돌연변이된 표면항원 단백질의 발현 여부 및 이에 대한 이 건 항체의 결합능을 조사하였다.
Figure 112011050185926-pat00001
그 결과, HBV 표면항원 단백질 내의 3개의 아미노산 잔기에서의 돌연변이가 일어난 8개의 클론에 대한 이 건 항체의 결합능이 상실된 것을 확인할 수 있었다(도 1 참조). 즉, 도 1에 표시된 8개의 클론은 토끼 폴리클로날 항체는 결합능이 나타나 돌연변이된 HBV 표면항원 단백질은 정상적으로 발현되었으나, 이 건 항체는 결합하지 못하는 것으로 확인되었다.
상기 8개의 클론을 분석한 결과, 160R(160R은 160번째 위치의 아미노산 R을 의미한다. 이하 동일하다), 163W 및 164E 위치(서열번호 1 참조)에서의 하나 이상의 돌연변이를 포함하고 있는 것으로 확인되었다. 즉, 상기 서열이 이 건 항체의 에피토프에 해당되는 위치라고 볼 수 있다. 이러한 결과로부터 이 건 항체의 에피토프는 RFLWE(서열번호 4)을 포함하는 것으로 확인되었으며, 이 건 항체가 역시 결합능을 보이는 HBV의 ayw 아형에서의 에피토프는 KFLWE(서열번호 5)를 포함하는 것으로 확인되었다.
특히, 서열번호 4 또는 서열번호 5에 따른 서열을 포함하는 에피토프는 상기 에피토프를 포함하는 HBV 표면 부위의 두개의 루프(loop) 중 마이너 루프(minor loop)에 해당되는 FARFLWEWASVRFSW(서열번호 6) 또는 FGKFLWEWASARFSW(서열번호 7)이다(도 2 참조).
[실시예 2] 이 건 항체 에피토프의 특성 규명
(1) HBV 폴리머라제(PBV Pol) 돌연변이체의 제조
이 건 항체의 에피토프는 HBV ayw 아형의 표면항원 ORF(S ORF)의 160K, 163W, 164E(서열번호 2 참조)를 포함하고 있는데, 상기 에피토프를 인코딩하는 HBV 표면항원의 ORF 서열은 HBV 폴리머라제를 인코딩하는 HBV P ORF의 서열과 중첩(overlapping)된다. 구체적으로는 HBV 폴리머라제(polymerase)의 504I, 506M, 507G, 508V(서열번호 3 참조)가 상기 에피토프를 코딩하는 OFR 내 유전자에 의해 인코딩되는 부위에 해당한다(도 3 참조). 즉, HBV S ORF 내의 상기 부위에서의 돌연변이는 HBV P ORF의 돌연변이를 수반한다.
HBV 폴리머라제는 다른 바이러스의 폴리머라제들과는 다른 매우 특징적인 기능을 갖고 있다. 첫째는 프리지노믹 RNA(pregenomic RNA: pgRNA)로부터 자신의 DNA를 합성하는 역전사효소 활성(reverse transcriptase activity)을 가진다는 점이고, 둘째는 역전사 개시(reverse transcription initiation)시에 자기 자신을 프라이머(primer)로 하여 단백질-프라이밍(protein-priming)을 수행한다는 것이다. 셋째는 아직 정확한 메카니즘은 규명되지 않았지만, 복제과정에서 프라이머 전좌(primer translocation) 그리고 주형 스위칭(template switching)을 한다는 점이다.
한편 상기 살핀 바와 같이 HBV를 중화하는 이 건 항체의 에피토프 부위, 즉HBV의 표면항원 내 이 건 항체의 에피토프 부위를 코딩하는 개방해독틀(Open Reading Frame: ORF)은 HBV 폴리머라제를 인코딩하는 ORF의 부위와 중첩되고 있으므로, 이러한 이 건 항체의 에피토프를 인코딩하는 ORF와 중첩되는 HBV P ORF에 의해 인코딩되는 HBV 폴리머라제 부위가 HBV 바이러스 복제에 미치는 영향을 조사하여 상기 에피토프의 돌연변이 가능성 여부를 확인하였다.
이를 위해 HBV P ORF 내에서 이 건 항체의 에피토프와 중첩되는 부위의 아미노산을 알라닌(alanine)으로 치환되도록 조작한 돌연변이를 제조하여 이러한 돌연변이가 HBV 폴리머라제(Polymerase: HBV Pol)의 역전사 활성에 미치는 영향을 조사하였다. 먼저, HBV 폴리머라제의 503K, 504I, 506M, 507G, 508V가 알라닌으로 치환된 돌연변이체인 K503A(K503A는 503번째 위치의 아미노산 K가 A로 변형된 것을 의미한다. 이하 동일하다), I504A, M506A, G507A, V508A와 자연적으로 생성되는 돌연변이체인 V508L을 도 4와 같이 제작하였다. 이후, 보족성(complementation) 실험을 통해 상기 에피토프 부위에 돌연변이를 갖는 HBV 폴리머라제의 게놈 복제기능 변화를 조사하였다. 구체적으로 HBV P ORF에 프래임 쉬프트 돌연변이(fame-shift mutation)가 유발되어 HBV 폴리머라제가 제대로 기능하지 못하는 HBV 돌연변이체인 HBV Pol 결여 레플리콘(HBV Pol-null replicon)과 상기와 같이 돌연변이가 유발된 HBV 폴리머라제를 발현하는 플라스미드를 HepG2 세포에 함께 감염시킨 후(도 5 참조), HBV 게놈 복제 여부를 서던 블랏 분석(Southern blot analysis) 및 RNase 보호 분석(RNase protection assay: RPA) 방법을 이용하여 분석하였다.
(2) 서던 블랏 분석
HepG2 세포에 상기와 같이 HBV 폴리머라제에 돌연변이를 유발한 돌연변이체와 HBV Pol 결여 레플리콘을 동시에 감염시킨 후 4일 뒤에 복제된 바이러스 DNA를 회수하여 HBV DNA의 복제 정도를 측정하였다.
그 결과 K503A 돌연변이체는 야생형(wild type) 대비 약 17% 정도만 바이러스 DNA가 복제되었다. 이는 HBV 폴리머라제에서 503K가 바이러스 DNA 복제 메카니즘에 깊이 관여하고 있음을 의미한다. M506A와 G507A 돌연변이체는 바이러스 DNA 복제가 거의 이루어지지 않았다. 이는 506M과 507G가 HBV 폴리머라제의 바이러스 DNA 복제 메카니즘에서 매우 필수적인 부위임을 의미한다. I504A, V508A와 V508L 돌연변이체들은 각각 야생형 대비 약 65%, 70% 그리고 82% 정도 바이러스 DNA 복제가 되어 야생형과 거의 유사한 바이러스 DNA 복제가 이루어진 것으로 나타나, 비교적 HBV DNA 복제에 대한 관여도가 높지 않은 것으로 판단된다(도 6 참조).
(3) RPA ( RNase protection assay ) 결과
DNA 복제의 전 단계인 프리지노믹 RNA(pregenomic RNA: pgRNA)의 단백질막 형성(encapsidation)을 RPA 방법을 이용하여 측정하였다(Kim et al, 2009, J. Virol. 83: 8032~8040 참조).
HepG2 세포에 상기와 같이 HBV 폴리머라제에 돌연변이를 유발한 돌연변이체와 HBV Pol 결여 레플리콘을 동시에 감염시킨 후 3일 뒤에 HBV DNA 복제 주형으로 사용되는 pgRNA의 패키징(packaging) 정도를 바이러스의 코어(core)와 세포 내 총 pgRNA를 회수하여 정량적으로 분석하였다.
그 결과 K503A와 G507A 돌연변이체는 야생형 대비 약 25%의 pgRNA가 패키징되었다. 이는 503K와 507G가 pgRNA가 바이러스의 코어 파티클(core particle) 내로의 패키징에 깊이 관여하고 있음을 의미한다. M506A 돌연변이체는 야생형 대비 약 71%의 pgRNA가 패키징되었다. 즉, 506M의 pgRNA 패키징에의 관여도는 비교적 낮음을 확인할 수 있었다. 나머지 I504A, V508A 그리고 V508L 돌연변이체는 야생형과 동등하게 pgRNA가 패키징되었다. 따라서 상기 부위는 pgRNA 패키징에 거의 관여하고 있지 않다고 판단된다(도 7 참조).
(4) HBV 폴리머라제 돌연변이체들의 HBV 복제에 미치는 영향에 대한 종합 검토
HBV 폴리머라제의 K503A 돌연변이체의 경우, 야생형 대비 pgRNA 패키징이 25%밖에 이루어지지 않았으며, 바이러스 복제의 최종 산물인 바이러스 DNA를 정량해 본 결과 pgRNA가 패키징된만큼만 복제가 이루어졌다. 따라서, 503K 부위는 초기 pgRNA 패키징에 주로 관여하는 것으로 판단된다(표 2 참조). 하지만, HBV 폴리머라제의 M506A 돌연변이체는 야생형 대비 pgRNA 패키징이 71% 정도로 유사하지만, 바이러스 복제의 최종 산물인 바이러스 DNA를 정량해 본 결과 복제가 전혀 이루어지지 않고 있는 것으로 확인되었다. 이는 HBV 폴리머라제에서 M506이 pgRNA 패키징에는 관여하지 않지만 pgRNA를 주형으로 (-)-스트랜드(strand) DNA를 합성하는 바이러스 DNA 복제 메카니즘인 프로테인 프라이밍 혹은 프라이머 전좌와 같은 역전사 메카니즘에는 깊이 관여하고 있음을 의미한다.
HBV 폴리머라제의 G507A 돌연변이체는 pgRNA 패키징이 야생형 대비 24% 밖에 이루어지지 않았으며, 바이러스 DNA도 복제가 거의 이루어지지 않고 있어 M507부위가 폴리머라제의 pgRNA 결합(binding) 뿐 아니라 역전사(reverse transcription)에도 중요한 기능을 하는 것이라고 판단된다. 이외에도 단백질막 형성(encapsidation) 과정에서 숙주 인자(host factor)인 Hsp90 같은 단백질, HBV의 코어 단백질(core protein)과의 상호작용(interaction)에 중요할 역할을 할 가능성도 있다.
한편, 나머지 HBV 폴리머라제의 I504A, V508A, V508L 돌연변이체에서는 야생형과 유사한 정도의 pgRNA 패키징 및 바이러스 DNA 복제가 이루어지고 있다. 따라서 이 건 항체의 에피토프로 밝혀진 HBV 표면항원 단백질 160K, 163W, 164E 부위를 인코딩하는 HBV S ORF와 중첩되는 HBV P ORF에 의해 코딩되는 HBV 폴리머라제의 서열 중에서 바이러스 복제와 깊이 연관된 부위는 160K와 163W 부위로, 이 부분에서의 돌연변이가 일어나면 바이러스 복제가 되지 않기 때문에 매우 보존적인 중요한 부위라 할 수 있다. 따라서 이 두 부위의 돌연변이체는 존재하지 않을 것이므로, 이러한 부위에 특이적으로 결합하는 항체는 자연적이거나 항 바이러스제제에 의해 내성을 나타내는 돌연변이체에도 치료효과를 나타낼 수 있다.
Figure 112011050185926-pat00002

[실시예 3] 에피토프 돌연변이체에 대한 이 건 항체의 결합능 및 중화 효과
(1) 돌연변이체의 제조
이 건 항체의 에피토프인 HBV 표면항원 단백질(HBsAg)의 163W, 164E(서열번호 1 참조) 중 하나 이상을 알라닌으로 치환한 돌연변이체를 제작하였다. 160K에서의 돌연변이체는 혈청형과 연관되어 있어 변이가 일어나기 어렵기 때문에 제외하였다. 또한 최근 164E가 164D로 변이된 돌연변이체가 보고된 바 있어, E164D의 돌연변이체 또한 제작하여 사용하였다. 상기와 같은 돌연변이체를 제작함에 따라 상기 돌연변이를 인코딩하는 HBV S ORF와 중첩되는 HBV P ORF에 의해 인코딩되는 HBV 폴리머라제의 506M, 507G, 508V(서열번호 2 참조)에서도 돌연변이가 유발된다. 이때, 상기 HBV 표면항원 단백질의 163W 및 164E의 변이체 코돈에 따라 동일한 아미노산 변이가 일어난 경우에도 HBV 폴리머라제의 변이체는 다른 아미노산 서열을 가지게 된다(표 3 참조).
Figure 112011050185926-pat00003

(2) 급성 B형 간염 유도 마우스를 이용한 in vivo 효력시험 확인
유체역학 주입법(Hydrodynamic injection)으로 HBV DNA를 주입하여 급성 B형 간염과 유사한 징후를 나타내도록 만든 C57BL6 마우스를 이용하여, 상기와 같이 에피토프에 돌연변이를 유발한 경우의 마우스 혈액 내에서 이 건 항체의 결합능 HBV에 대한 결합능 및 HBV 중화능을 조사하였다. 사용된 C57BL6 마우스는 찰스 리버 래보라토리(Charles Liver Laboratory, 미국)로부터 20 g 내외의 6주령 암컷을 구입하여 사용하였으며, 표 4에서와 같이 5마리씩 총 12군으로 나누어 실험에 이용하였다.
Figure 112011050185926-pat00004
모든 마우스는 pcDNA3.1(인비트로겐, 미국)에 HBV DNA 염기서열이 삽입된 pHBV-MBRI 벡터(Shin et al., Virus Research 119, 146-153, 2006; 도 8 참조) 20 μg을 체중의 9.5% 부피비로 마우스 꼬리 정맥을 통해 0.3 mL/min의 속도로 주사하여 급성 B형 간염을 유발하였으며, 48시간 후 표 4에 기재된 바와 같이 이 건 항체 0.2 mL을 마우스의 꼬리정맥을 통해 주사하였다. 이 건 항체 주사 전(24시간, 48시간), 주사 후(72시간 및 96시간)에 혈청을 분리하였으며 염소 혈청(goat serum)으로 10배 희석한 후 제네디아 HBsAg 엘라이자(Genedia HBsAg ELISA) 3.0(녹십자 MS, 한국)을 이용하여 혈중 HBV 표면 항원 단백질(HBsAg) 농도를 측정하였다. 또한 HBV DNA를 이 건 항체 주사 전(48시간)과 주사 후(72시간) 혈액을 분리하여 혈중 HBV DNA를 정량할 수 있는 실시간(real time) PCR 법을 통해 분석하여 이 건 항체에 의한 HBV 중화능을 비교 측정하였다.
제네디아 HBsAg 엘라이자 3.0을 이용하여 혈중 HBsAg를 검출한 결과, 10개의 변이체를 삽입한 경우 모두 HBsAg가 잘 발현되고 있음이 확인되었다. 또한 10개의 변이형 HBsAg에 이 건 항체가 결합하는지 확인한 결과 163W와 164E가 함께 알라닌으로 치환된 변이형 HBsAg에는 이 건 항체가 전혀 결합하지 못했고, 163W만이 알라닌으로 치환된 변이형 HBsAg에는 야생형 대비 70%이상의 결합능이 있는 것으로 확인되었으며, 164E이 알라닌으로 치환된 변이형 HBsAg에서는 야생형 대비 30% 정도의 결합능이 있는 것으로 확인되었다. 그리고 E164D 변이체의 경우, 야생형과 유사한 결합특성을 나타내었다(표 5 참조).
HBsAg에서의 변이는 상기 살핀 바와 같이 HBV 폴리머라제의 서열에도 영향을 주기 때문에 HBsAg의 일부 아미노산 잔기를 알라닌으로 치환될 경우 발생할 수 있는 폴리머라제 변이형이 HBV DNA 복제에 어떤 영향을 주는 지를 확인하였다. 그 결과 163W와 164E가 모두 변이될 경우 HBV DNA 복제가 전혀 되고 있지 않음을 확인할 수 있었다. 특히, 163W와 164E를 각각 알라닌으로 치환했을 때의 HBV DNA 복제를 확인한 결과 164E의 변이형의 경우에는 HBV DNA 복제가 30%에서 70% 정도로 일어나지만 163W의 변이형일 경우에는 복제가 전혀 되지 않아 163W 부위에 대응되는 폴리머라제 내의 아미노산 부위가 복제에 매우 중요한 부위임을 확인하였다.
HBsAg 발현과 HBV DNA 복제가 된 164E의 변이형들에서 이 건 항체의 HBV 중화 능을 확인한 결과 이 건 항체가 야생형에 비해서 약 70% 감소한 결합력을 가지고 있어 HBV 중화능이 상당히 감소됨을 확인하였다. 하지만 현재까지 알려진 자연적인 변이형인 164D 변이형에 대해서는 야생형과 유사한 결합력을 가지고 있었다.
Figure 112011050185926-pat00005
이상 살핀 바와 같이 이 건 항체의 에피토프는 HBsAg에서 160K(ayw) 또는 160R(adr), 163W 그리고 164E 이며 특히 이 건 항체와의 결합에 가장 많이 영향을 미치는 부위는 알라닌 치환 변이형을 통한 실험을 통해 164E 부위임을 확인할 수 있었으며, 이 부위는 현재까지 164D로만 변이되고 있는 것으로 알려져 있는데, 이 변이형도 이 건 항체가 중화능이 있음을 확인할 수 있었다. 163W 부위는 이 건 항체와의 결합에는 크게 관여를 하고 있지는 않지만 이 부분에서의 변이는 HBV DNA 복제에 영향을 주는 복제에 매우 중요한 기능을 하는 폴리머라제 서열의 변이를 초래하므로, 매우 보존적인 부위 즉 변이가 일어나기 어려운 부위라고 판단되며, 실제로 현재까지 보고된 변이가 없음을 확인하였다. 마지막으로 160K(ayw 아형의 경우) 또는 160R(adr 아형의 경우)의 경우는 혈청형 아형을 결정하는 아미노산 부위이고 기능 분석 결과 HBV 복제와도 밀접한 관련이 있기 때문에 변이가 일어나기 어려운 매우 보존적인 부위이다.
서열목록 전자파일 첨부

Claims (29)

  1. RFLWE(서열번호 4), KFLWE(서열번호 5), FARFLWEWASVRFSW(서열번호 6) 및 FGKFLWEWASARFSW(서열번호 7) 중 어느 하나에 따른 B형 간염 바이러스(HBV) 특이적 에피토프.
  2. 삭제
  3. 제1항에 따른 HBV 특이적 에피토프와 담체(carrier)가 결합된 복합체.
  4. 제3항에 있어서, 담체는 펩타이드, 혈청 알부민, 면역 글로불린, 헤모시아닌 및 다당체에서 선택된 하나 이상임을 특징으로 하는 복합체.
  5. 제1항의 HBV 특이적 에피토프를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드.
  6. 제5항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터.
  7. 제6항에 있어서, HBV 특이적 에피토프가 미생물 세포 또는 바이러스 표면에 발현되도록 유도하는 프로모터 또는 신호 단백질을 코딩하는 서열을 포함함을 특징으로 하는 재조합 벡터.
  8. 제5항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 재조합 미생물 또는 바이러스.
  9. 제8항에 있어서, 상기 형질전환된 재조합 미생물 또는 바이러스는 재조합 대장균, 재조합 효모, 재조합 박테리오 파지에서 선택됨을 특징으로 하는 재조합 미생물 또는 바이러스.
  10. 제8항의 재조합 미생물 또는 바이러스를 배양하는 단계를 포함하는 서열번호 4 내지 서열번호 7 중 어느 하나에 따른 HBV 특이적 에피토프를 생산하는 방법.
  11. 서열번호 4 내지 서열번호 7 중 어느 하나에 따른 HBV 특이적 에피토프, 상기 에피토프를 포함하는 복합체, 또는 상기 에피토프를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 백신 조성물.
  12. 제11항에 있어서, 체내에 주입시 항체 형성을 증진시키는 역할을 하는 약학적으로 허용가능한 면역보조제(adjuvant)를 추가로 포함함을 특징으로 하는 백신 조성물.
  13. 제12항에 있어서, 면역보조제는 알루미늄염(Al(OH)3, ALPO4), 스쿠알렌(squalene), 소르비탄(sorbitane), 폴리소르베이트 80(polysorbate 80), CpG, 리포좀, 콜레스테롤, MPL(monophosphoryl lipid A), GLA(glucopyranosyl lipid A)에서 선택된 하나 이상임을 특징으로 하는 백신 조성물.
  14. 제11항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 약학적으로 허용가능한 전달체에 포함된 형태임을 특징으로 하는 백신 조성물.
  15. 제14항에 있어서, 상기 약학적으로 허용가능한 전달체는 바이러스성 전달체 또는 비바이러스성 전달체임을 특징으로 하는 백신 조성물.
  16. 서열번호 4 내지 서열번호 7 중 어느 하나에 따른 HBV 특이적 에피토프, 상기 에피토프를 포함하는 복합체, 또는 상기 에피토프를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 이용한 서열번호 4 내지 서열번호 7 중 어느 하나에 따른 HBV 특이적 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체, 또는 그러한 항체의 단편을 생산하는 방법.
  17. 제16항에 있어서, 상기 항체는 다클론 항체(polyclonal antibody), 또는 단클론 항체(monoclonal antibody) 임을 특징으로 하는 방법.
  18. 제16항에 있어서, 서열번호 4 내지 서열번호 7 중 어느 하나에 따른 HBV 특이적 에피토프, 상기 에피토프를 포함하는 복합체, 또는 상기 에피토프를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 동물에 접종하고, 접종된 동물로부터 서열번호 4 내지 서열번호 7 중 어느 하나에 따른 HBV 특이적 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체를 선별하여 생산함을 특징으로 하는 방법.
  19. 제18항에 있어서, 인간화(humanization) 단계 또는 탈면역화(deimmunization) 단계를 추가적으로 포함함을 특징으로 하는 방법.
  20. 제19항에 있어서, 상기 인간화 단계는 인간 항체의 FR에 동물로부터 생산된 항체의 CDR 서열을 이식(grafting)하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  21. 제20항에 있어서, 친화도(affinity)를 높이거나, 면역원성(immunogenecity)을 저하시키기 위해, 하나 이상의 아미노산 서열을 치환, 삽입, 결실하는 단계를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  22. 제18항에 있어서, 상기 동물은 인간 유래 서열과 동일한 항체를 생산할 수 있도록 형질전환된 동물임을 특징으로 하는 방법.
  23. 제22항에 있어서, 상기 형질전환된 동물은 형질전환된 쥐임을 특징으로 하는 방법.
  24. 제16항에 있어서, 디스플레이(display) 기술을 이용함을 특징으로 하는 방법.
  25. 제24항에 있어서, 상기 디스플레이 기술은 파지 디스플레이(phage display), 박테리아 디스플레이(bacteria display), 또는 리보좀 디스플레이(ribosome display) 중에서 선택된 어느 하나임을 특징으로 하는 방법.
  26. 제24항에 있어서, 상기 디스플레이에 사용되는 라이브러리(library)는 인간 유래 항체의 서열을 갖도록 설계된 것임을 특징으로 하는 방법.
  27. 제24항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 4 내지 서열번호 7 중 어느 하나에 따른 HBV 특이적 에피토프 또는 상기 에피토프를 포함하는 복합체를 이용하여 서열번호 4 내지 서열번호 7 중 어느 하나에 따른 HBV 특이적 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체만을 선별(panning)하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  28. 서열번호 4 내지 서열번호 7 중 어느 하나에 따른 HBV 특이적 에피토프, 상기 에피토프를 포함하는 복합체, 또는 상기 에피토프를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 HBV 검출용 조성물.
  29. 서열번호 4 내지 서열번호 7 중 어느 하나에 따른 HBV 특이적 에피토프, 상기 에피토프를 포함하는 복합체, 또는 상기 에피토프를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 HBV 검출용 키트.
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