KR101287384B1

KR101287384B1 - Led 광파장의 혼합을 이용한 미세조류의 성장 및 지질함량 향상 방법

Info

Publication number: KR101287384B1
Application number: KR1020130042496A
Authority: KR
Inventors: 이수연
Original assignee: 이수연
Priority date: 2013-04-17
Filing date: 2013-04-17
Publication date: 2013-07-23

Abstract

본 발명은 특정 광조건, 구체적으로 LED를 이용한 특정 광조건에서 미세조류를 배양하는 방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로 본 발명은 적색빛(Red)을 조사하는 LED 및 파란빛(Blue)을 조사하는 LED를 5:1의 비율로 혼합한 LED 조명을 이용하여 빛을 조사하는 광조건에서 보트리오코커스 브라우니(Botryococcus braunii)를 배양하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 미세조류 배양방법에 관한 것이다.
본 발명의 제조방법에 의하면 생장률의 한계로 인해 산업적으로 적용이 제한되었던 보트리오코커스 브라우니의 자체 생장뿐만 아니라 보트리오코커스 브라우니에 의해 생산되어 내부에 축적되는 지질함량도 현저하게 증가시킬 수 있으므로, 산업적 효과 및 환경적 효과가 매우 크다 할 것이다.

Description

LED 광파장의 혼합을 이용한 미세조류의 성장 및 지질함량 향상 방법{METHOD FOR INCREASING GROWHT AND LIPID CONTENT OF MICROALGAE USING MIXTURE OF LED LIGHT}

본 발명은 LED를 이용한 미세조류의 배양방법에 관한 것이다.

화석연료에 의한 에너지 비용 상승뿐만 아니라 이산화탄소 발생 증가가 지구온난화의 원인으로 주목되면서, 화석연료를 대체하기 위한 에너지원으로 바이오에너지가 각광받고 있다.

그러나, 옥수수 등과 관련된 바이오에너지의 연구는 전세계적인 식량부족 등의 문제로 인해 개발이 제한되고 있는 실정이다. 이러한 식량자원으로 활용가능한 육상식물과 달리 식량으로 이용되지 않으므로, 연구의 제한이 없는 미세조류가 최근 바이오연료 연구의 주요대상 물질로 각광을 받고 있다.

상기 미세조류는 이산화탄소와 물, 그리고 태양에너지를 이용하여 에너지원인 유기물을 합성하고 산소를 생산하는 광합성 생물이다.

상기 미세조류는 이산화탄소를 고정화시킬 수 있고, 단백질 및 지질함량이 높으므로, 식품, 사료 또는 연료 생산용 바이오 매스(biomass)를 활용될 수 있다. 구체적으로, 상기 미세조류의 1차 대사산물인 지질, 당질 또는 단백질 등은 바이오디젤, 바이오에탄올 또는 바이오가스와 같은 다양한 바이오연료의 공급원으로 사용될 수 있고, 상기 미세조류의 2차 대사산물인 비타민, 카로테노이드, 다당류 등의 고부가 유용 물질은 기능성식품, 천연색소, 의약용물질, 동물사료, 수산양식용 사료 등으로 이용될 수 있다.

이러한 점에서 상기 미세조류는 이산화탄소의 저감 효과와 우수하고, 식량자원과 관련된 정치사회적 문제도 발생되지 않으며, 생산수율도 높아, 육상식물과 달리 바이오에너지를 위한 최적의 재료로 받아들여지고 있다.

일 예로, 미세조류를 이용한 바이오디젤 제조시, 1MJ의 에너지당 이산화탄소 발생량이 -75.29인 반면, 육상식물인 콩 기반의 바이오디젤 제조의 경우 이산화탄소 발생량이 -71.73이다. 한편, 기존의 디젤의 경우, 이산화탄소 배출량은 17.24이다. 즉, 미세조류는 광합성을 통해 바이오매스를 생산하므로, 생산과정에서 이산화탄소를 흡수하여, 미세조류를 이용한 바이오연료는 실제적으로 이산화탄소를 저감하는 효과가 있으며, 특히 미세조류를 이용한 바이오디젤 제조공정은 온실가스 감소 측면에서 콩 기반의 바이오디젤에 비해 약 5% 정도 더 우수한 효과를 보이는 것으로 보고되어 있다.

상기와 같이 우수한 효과를 갖는 미세조류를 이용한 바이오연료 생산공정과 관련하여, 다양한 미세조류가 관심을 받고 있으며, 이 중 담수 녹조류인 Botryococcus braunii가 관심을 받고 있다.

상기 담수산의 녹조류에 해당하는 미세조류인 Botryococcus braunii는 광합성에 의해 세포당 건조중량을 기준으로 약 25% 내지 75%의 오일함량을 가지고 있어, 상기 Botryococcus braunii의 바이오매스는 원유(crude oil)로 추출가능하며, 타 미세조류에 비해 지질함량이 높을 뿐 아니라 생성되는 지질 및 탄화수소의 질적 측면에서도 바이오디젤을 제조하는데 매우 경쟁력이 강한 종으로 알려져 있다. 그러나, Botryococcus braunii는 다른 미세조류에 비하여 생장률이 낮아 물질 생산수율이 높지 않는 문제점으로 인해 산업화에 어려움이 있다.

이러한 문제점을 해결하고, 미세조류를 이용한 에너지 개발 등의 산업화를 위해, 미세조류를 이용한 바이오에너지 또는 고부가가치 물질 생산을 위한 바이오리파이너리 관련 경쟁력 확보차원에서 미세조류의 고농도 배양 및 지질생산성 향상의 필요성이 증가되고 있다. 일 예로, 미세조류 배양을 위한 최적 조건, 구체적으로 광파장이나 광도와 같은 광조건, 이산화탄소 농도, 가스 공급속도, 배지의 공급, 교반속도, 온도 또는 pH 등에 대한 연구가 진행되고 있으며, 특히 효율적인 광파장 조건을 찾고자 하는 많은 연구들이 진행되고 있다.

KR

2013-0019752

A

따라서, 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 상기와 같은 종래 기술의 단점을 극복하여, 미세조류의 고농도 배양이 가능하도록, 배양효율이 개선되고, 지질생산성이 향상된 미세조류 배양방법을 제공하는 것이다.

상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 LED 조명을 이용하여 미세조류를 배양하는 단계를 포함하는 미세조류 배양방법을 제공한다.

구체적으로, 본 발명은 적색빛(Red)을 조사하는 LED 및 파란빛(Blue)을 조사하는 LED를 5:1의 비율로 혼합한 LED 조명을 이용하여 빛을 조사하는 광조건에서 보트리오코커스 브라우니(Botryococcus braunii)를 배양하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 미세조류 배양방법에 관한 것이다.

보다 구체적으로, 본 발명은 640nm 파장대의 적색빛(Red)을 조사하는 LED 및 460nm 파장대의 파란빛(Blue)을 조사하는 LED를 5:1의 비율로 혼합한 LED 조명을 이용하여 빛을 조사하는 광조건에서 보트리오코커스 브라우니(Botryococcus braunii)를 배양하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 미세조류 배양방법에 관한 것이다.

상기 보트리오코커스 브라우니를 배양하는 단계의 광조건은 상기 LED 조명을 이용하여 400 Lux 내지 436 Lux의 조도로 14시간 내지 18시간 동안 빛을 조사하는 광조건인 것을 특징으로 하는 미세조류 배양방법일 수 있다.

또한, 상기 보트리오코커스 브라우니를 배양하는 단계는 20 ℃ 내지 24 ℃의 온도 조건 및 pH 6.5 내지 pH 8.5의 pH 조건에서 수행하는 것을 특징으로 하는 미세조류 배양방법일 수 있다.

본 발명의 발명자는 기존 연구결과, 미세조류의 종류에 따라 광파장이나 광도와 같은 광조건이 미세조류의 생장률 및 지질생산능에 미치는 영향에 대해 연구하던 중, 지질생산능이 우수하나 생장률이 떨어져 산업적 이용이 제한적인 보트리오코커스 브라우니(Botryococcus braunii)를 640nm 파장대의 적색빛(Red)을 조사하는 LED 및 460nm 파장대의 파란빛(Blue)을 조사하는 LED를 5:1의 비율로 혼합한 LED 조명을 이용하여 400 Lux 내지 436 Lux의 조도로 빛을 조사하는 광조건에서 배양하는 경우, 기존 배양법에 비하여 생장률을 현저히 개선할 수 있을 뿐만 아니라, 지질생산능도 향상시킬 수 있다는 것을 확인하여, 본 발명을 완성하였다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명에 있어서, 미세조류(microalgae)란 광합성 색소, 일 예로 엽록체를 가지고 선택적으로 광합성을 수행할 수 있는 진핵 미생물 유기체 또는 원행 미생물 유기체, 구체적으로 단세포생물들에 대한 통칭으로, 우리 눈에 보이지 않은 아주 작은 조류를 의미한다. 상기 미세조류는 에너지로서 고정된 탄소원을 대사할 수 없는 완전 광독립영양생물을 포함할 뿐만 아니라, 고정된 탄소원 만으로 살아갈 수 있는 종속영양 생물을 포함한다.

본 발명에 있어서, 보트리오코커스 브라우니(Botryococcus braunii)는 담수에서 생육하는 녹조류에 해당하는 미세조류로, 타 미세조류에 비해 지질함량이 높을 뿐 아니라 생성되는 지질 및 탄화수소의 질적 측면에서도 바이오디젤을 제조하는데 매우 경쟁력이 강한 종으로 알려져 있으나, 다른 미세조류에 비하여 생장률이 낮아 물질 생산수율이 높지 않는 문제점이 있다.

본 발명에 있어서, 난노클로롭시스 오세아니카(Nannochloropsis oceanica) 는 해수에서 생육하는 미세조류로 지방, 단백질 및 비타민 등의 영양적 가치가 우수하므로, 치어 양식에서 사용되는 먹이 생물인 동물성 플랑크톤, 구체적으로 로티퍼(rotifer)의 먹이 즉, 상기 로티퍼의 먹이인 식물성 플랑크톤 등의 대체먹이생물로 사용된다.

본 발명에 있어서, LED(Light Emitting Diode)는 발광다이오드로, 갈륨, 인, 비소 등을 재료로 한 다이오드로 전류를 흘려 빛을 발산하는 반도체소자를 의미한다. 상기 LED는 텅스텐전구나 네온램프 등 다른 발광 소자와 비교해서 전기로부터 빛의 변환효율이 양호하여 열을 발하지 않고 소형 경량이기 때문에 수명이 긴 장점이 있다. 발광색(발광파장)과 관련하여, 적색 LED 및 녹색 LED에 비해서 청색 LED의 발광휘도가 낮으며 제품가격도 비싸고, 적색 LED가 가장 휘도가 높다.

본 발명에 있어서, 조도(illumination)는 어떤 면에 투사되는 광속을 면의 면적으로 나눈 것을 의미한다. 즉, 조도는 조사되는 면의 생각하고 있는 점에서의 광속밀도이다. 조도의 단위는 룩스(LUX, lx)로, 1 LUX는 1 촉광(candle-power)의 광원으로부터 1 m 떨어진 곳이며, 그 빛에도 직각인 면의 밝기를 말한다.

본 발명에 있어서, 광생물 반응기란 반응실 또는 반응용기에 해당하는 광배양기를 포함하는 반응기로, 구체적으로 미세조류 및 배양액이 유입되는 투입구, 공기 주입구 및 배기구가 구비되며 내부에서 미세조류가 배양될 수 있는 광배양기 및 상기 광배양기 내부로 상기 광배양기에 구비된 공기 주입구를 통하여 공기, 일 예로 이산화탄소를 공급할 수 있는 공기 공급장치, 구체적으로 이산화탄소 공급장치를 포함할 수 있고, 상기 광배양기는 용기(container)의 적어도 일부가 적어도 부분적으로 투명하거나 부분적으로 개방되어서, 광이 통과할 수 있으며, 그 안에서 하나 이상의 미세조류 세포가 배양되는 용기를 의미한다. 상기 광배양기는 비닐 재질, 구체적으로 폴리에틸렌(polyethylene) 또는 폴리프로필렌(polyprophylene) 재질로 제작될 수 있고, 엘렌메이어 플라스크 내에 자폐될 수 있으며, 상기 공기 주입구 및 배기구는 유리관으로 제작될 수 있고, 미세조류의 배양에 필요한 광원을 추가로 포함하거나 태양광을 모아 광원부로 전달하는 장치를 더욱 포함할 수 있다.

본 발명에 있어서, 바이오매스(biomass)는 세포의 성장 및/또는 분열에 의해 생성된 물질을 의미하며 세포 및/또는 세포 내 물질뿐만 아니라 세포 외 물질을 포함할 수 있다. 상기 세포 외 물질은 세포에 의해 분리된 화합물을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 본 발명에 있어서 바이오디젤(Biodiesel)은 디젤 엔진의 연료를 사용하기에 적합한 생물학적으로 생성된 지방산 알킬 에스테르를 의미한다.

본 발명은 적색빛(Red)을 조사하는 LED 및 파란빛(Blue)을 조사하는 LED를 혼합한 LED 조명을 이용하여 빛을 조사하는 광조건에서 보트리오코커스 브라우니(Botryococcus braunii)를 배양하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 미세조류 배양방법에 관한 것이다.

상기 미세조류는 일 예로 남조류, 녹조류, 홍조류, 은편도조식물문, 클로라라크니오조식물문, 작편보조류, 유클레나식물문, 부등편모조식물문 및 규조류 등일 수 있다.

상기 광조건은 적색빛(Red)을 조사하는 LED 및 파란빛(Blue)을 조사하는 LED를 5:1의 비율로 혼합한 LED 조명 즉, 적색빛을 조사하는 LED의 면적 및 파란빛을 조사하는 LED의 면적의 비율이 5:1의 비율로 혼합한 LED 조명, 더욱 구체적으로는 적색빛을 조사하는 LED 소자의 면적 및 파란빛을 조사하는 LED 소자의 면적의 비율이 5:1의 비율로 혼합한 LED 조명을 이용하여 빛을 조사하는 조건일 수 있다. 일 실시예에 의하면, 상기 광조건은 상기 보트리오코커스 브라우니를 배양하는 배양액의 외부 또는 내부에 위치한 광원, 일 예로 판형 광원에 의해 유도된 것 또는 상기 광원을 포함하는 광생물 반응기에 의해 유도된 것일 수 있다. 상기 판형 광원은 판 형상의 기판의 일 측면 또는 타 측면에 다수의 LED 소자(Light Emitting Diode Chip)이 장착된 것일 수 있고, 상기 LED 소자는 등간격으로 장착되어 이루어 질 수 있다. 상기 판형 광원은 적색빛을 조사하는 LED 소자 및 파란빛을 조사하는 LED 소자가 각 소자의 면적의 비율이 5:1의 비율로 혼합되어 이루어진 것일 수 있고, 일 예로 상기 LED 소자는 도 2의 Red:Blue(5:1)과 같이 배치될 수 있다.

상기 적색빛(Red)을 조사하는 LED는 바람직하게는 600nm 내지 680nm, 더욱 바람직하게는 620nm 내지 660nm, 더더욱 바람직하게는 640nm 파장대의 빛을 조사하는 LED일 수 있고, 상기 파란빛(Blue)을 조사하는 LED는 바람직하게는 420nm 내지 500nm, 더욱 바람직하게는 440nm 내지 480nm, 더더욱 바람직하게는 460nm 파장대의 빛을 조사하는 LED일 수 있다.

상기 광조건은 바람직하게는 적색빛(Red)를 조사하는 LED 및 파란빛(Blue)을 조사하는 LED를 5:1 의 비율로 혼합한 LED 조명을 이용하여 400 Lux 내지 436 Lux, 바람직하게는 410 Lux 내지 426 Lux, 더욱 바람직하게는 414 Lux 내지 422 Lux, 더더욱 바람직하게는 418 Lux의 조도로 빛을 조사하는 광조건일 수 있다.

또한, 상기 미세조류 배양방법은 상기 적색빛을 조사하는 LED 및 파란빛을 조사하는 LED를 5:1의 비율로 혼합한 LED 조명을 이용하여 상기 조건의 400 Lux 내지 436 Lux의 조도로 10시간 내지 22시간, 바람직하게는 12시간 내지 20시간, 더욱 바람직하게는 14시간 내지 18시간, 더더욱 바람직하게는 16시간 동안 빛을 조사하는 광조건으로 미세조류를 배양하는 방법일 수 있다.

상기 미세조류는 보트리오코커스 속(Botryococcus sp.) 조류일 수 있고, 바람직하게는 보트리오코커스 브라우니(Botryococcus braunii) 조류일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 기탁번호 KMMCC-1681를 갖는 보트리오코커스 브라우니 (Botryococcus braunii, KMMCC-1681)일 수 있다.

본 발명의 미세조류 배양방법은 15℃ 내지 25℃, 바람직하게는 18℃ 내지 22℃, 더욱 바람직하게는 20℃ 내지 24℃, 더더욱 바람직하게는 21℃ 내지 22℃의 온도 조건에서 수행할 수 있다. 또한, 본 발명의 미세조류 배양방법은 pH 6 내지 pH 9, 바람직하게는 pH 6.5 내지 pH 8.5, 더욱 바람직하게는 pH 7 내지 pH 8, 더더욱 바람직하게는 pH 7.5의 pH 조건에서 수행하는 것을 특징으로 하는 미세조류 배양방법일 수 있다.

상기 배양 조건에서 광주기 조건은 24시간 중에 광원을 통하여 빛을 조사하는 명반응기 및 빛이 조사되지 않는 암반응기의 기간의 비율은 13 : 11(명반응(Light, L) : 암반응(Darkness, D)) 내지 19 : 5, 바람직하게는 14 : 10 내지 18 : 6, 더욱 바람직하게는 15 : 9 내지 17 : 7, 더더욱 바람직하게는 16 : 8일 수 있다.

상기 보트리오코커스 브라우니는 액체 배지에서 배양될 수 있다. 상기 액체 배지는 광생물 반응기 내에 함유될 수 있다. 또한, 상기 보트리오코커스 브라우니는 고정 탄소원을 함유하고 광이 세포에 가해지도록 제조된 광생물 반응기에서 배양될 수 있다. 일 예로, 상기 광생물 배양기는 벤치-탑(bench-top)을 응용한 것일 수 있고, 공업 발효 공정에 사용되는 발효 탱크일 수 있다.

상기 광생물 배양기는 예를 들어 광도와 같은 광조건을 조절할 수 있는 광원 또는 상기 광원과 광-확산 구조체, 반응 온도 및/또는 pH를 조절할 수 있는 조절부위, 통기 정도를 조절할 수 있는 조절부위 또는 자력 교반기(magnetic stirrer)와 같이 교반 속도를 조절할 수 있는 조절부위가 포함된 것일 수 있다.

상기 보트리오코커스 브라우니를 배양하기 위한 배양배지는 영양소, 일 예로, 고정 질소원이나 아연, 붕소, 코발트, 구리, 망간 등의 미량 영양소를 포함할 수 있고, 선택적으로 pH를 유지하기 위한 완충액이나 인산염과 같은 구성 성분을 포함할 수 있다. 또한, 상기 배양배지는 아세트산염이나 글루코오스와 같은 고정 탄소원이나 염화나트륨과 같은 염을 포함할 수 있다.

상기 고정 탄소원은 굴루코오스, 프룩토오스, 수크로오소, 갈락토오스, 자일로오스, 만노오스, 람노오스, 글리세롤, N-아세틸글루코사민, 글리세롤 또는 글루쿠론산일 수 있다. 상기 고정 질소원은 단백질, 대두박(soybean meal), 옥수수 침지액(cornsteep liquor), 암모니아, 니트레이트 또는 질산염 등일 수 있다. 상기 미량 영양소는 무기염류, 일 예로 K₂HPO₄, K₂SO₄, NaCl, MgSO₄, CaCl₂, H₃BO₃, MnSO₄, ZnSO₄, FeSO₄, Na₂MoO₄ 및 CuSO₄로 이루어진 군 중에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 상기 배양 배지는 경우에 따라서, 탄소원이 제외된(free C-source) 배지 또는 탄소원이 제외되고 질소원이 포함된 배지일 수도 있다.

본 발명의 제조방법은 보트리오코커스 브라우니의 배양에 있어서, 적색빛(Red)을 조사하는 LED와 파란빛(Blue)을 조사하는 LED를 5:1의 비율로 혼합한 LED 조명을 이용하여 418 Lux의 조도로 16시간 동안 빛을 조사하는 광조건으로 배양하는 경우, 상기 보트리오코커스 브라우니의 생장률을 현저히 개선시킬 수 있을 뿐만 아니라 지질생산능을 개선시킬 수 있다는 것을 확인하여 완성한 것으로, 지질생산능이 우수한 보트리오코커스 브라우니의 지질생산능을 개선할 뿐만 아니라 기존에 산업적 이용에서 문제로 지적된 생장률을 현저히 개선할 수 있으므로, 산업적으로 우수한 효과가 인정된다.

상기에서 기술한 바와 같이, 기존 지질 및 탄화수소 생산량이 우수하나 미세조류 생장률 자체가 낮아 산업적으로 적용이 어려운 여러 미세조류의 경우, 이의 산업적 이용을 위해서는 생장률이 향상될 수 있는 배양조건을 확립하는 것이 중요하다.

본 발명은 각각의 균주가 균주 특이적으로 광조건에 따라 생장률이나 지질생산능이 상이하게 변화될 수 있다는 점과, 보트리오코커스 브라우니의 경우, 적색빛(Red)을 조사하는 LED와 파란빛(Blue)을 조사하는 LED를 5:1의 비율로 혼합한 LED 조명을 이용하는 경우, 미세조류 자체의 생장률뿐만 아니라 지질생산능도 현저하게 개선될 수 있다는 것을 확인하여 완성한 것이므로, 본 발명의 제조방법에 의해 보트리오코커스 브라우니를 배양할 경우, 보트리오코커스 브라우니 자체의 생장뿐만 아니라 보트리오코커스 브라우니에 의해 생산되어 내부에 축적되는 지질함량도 현저하게 증가할 수 있으므로, 기존 자체 생장률의 한계로 인해 산업적으로 적용이 제한되었던 보트리오코커스 브라우니의 산업적 활용가능성을 개척한 것이므로, 바이오에너지 및 고부가가치 다당류 등의 바이오리파이너리 관련 생산에 우수한 효과가 인정되어, 에너지 생산 뿐만 아니라 이산화탄소 저감 효과 등의 측면에서 산업적 효과 및 환경적 효과가 매우 크다 할 것이다.

도 1 및 도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 광조건에 따른 미세조류의 배양 결과를 확인하기 위한 실험도구로, 도 1a는 특정 광조건에서 배양할 수 있는 실험장치를 촬영한 사진이고, 도 1b는 LED 종류에 따른 7가지 광조건에 따른 미세조류의 배양도구를 촬영한 사진이며, 도 2는 LED 배치(pattern)에 따른 광파장 조건을 나타낸 도표이다.
도 3 및 도 4는 본 발명의 일 실시예에 따라 광조건에 따른 Botryococcus braunii의 배양결과를 확인한 것으로, 도 3은 광조건에 따른 미세 조류의 성장 정도를 확인하기 위하여, 배양 기간에 따른 680nm에서 측정된 배지의 O.D.값(A ₆₈₀ )을 나타낸 그래프로, 상기 그래프의 가로축은 도 2에 따른 LED의 종류에 따른 광조건 및 접종일로부터 경과된 배양일 수를 각각 나타낸 것이고, 도 4는 광조건에 따른 미세 조류의 지질생산성 향상 정도를 확인하기 위하여, 배양 기간에 따라 측정된 형광값을 나타낸 그래프로, 상기 그래프의 가로축은 도 2에 따른 LED의 종류에 따른 광조건 및 접종일로부터 경과된 배양일 수를 각각 나타낸 것이다.
도 5 및 도 6은 본 발명의 일 실시예에 따라 광조건에 따른 Nannochloropsis oceanica의 배양결과를 확인한 것으로, 도 5는 광조건에 따른 미세 조류의 성장 정도를 확인하기 위하여, 배양 기간에 따른 680nm에서 측정된 배지의 O.D.값(A ₆₈₀ )을 나타낸 그래프로, 상기 그래프의 가로축은 도 2에 따른 LED의 종류에 따른 광조건 및 접종일로부터 경과된 배양일 수를 각각 나타낸 것이고, 도 6은 광조건에 따른 미세 조류의 지질생산성 향상 정도를 확인하기 위하여, 배양 기간에 따라 측정된 형광값을 나타낸 그래프로, 상기 그래프의 가로축은 도 2에 따른 LED의 종류에 따른 광조건 및 접종일로부터 경과된 배양일 수를 각각 나타낸 것이다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 >

실시예 1: 미세조류 및 미세조류의 배양

본 실시예에서 사용한 담수 녹조류에 해당하는 미세 조류인 Botryococcus braunii(KMMCC-1681) 및 해수 녹조류에 해당하는 미세 조류인 Nannochloropsis oceanica(KMMCC-13)는 한국미세조류은행(KMMCC)로부터 분양받아 사용하였다.

상기 Botryococcus braunii 균주의 배양을 위한 배지는 Chu 13 medium powder(MBcell, 대한민국)를 3차 증류수 1 L 당 0.76 g을 첨가하고 녹인 후, 1N KOH 용액을 이용하여, pH를 pH 7.5로 조절한 후, 121℃에서 15분간 멸균시킨 것을 사용하였다. 상기 Nannochloropsis oceanic 균주의 배양은 f/2 배지를 사용하였다.

상기 균주의 배양은 도 1에 나타낸 바와 같은 LED를 이용한 광생물 반응기, 구체적으로 광배양 장치에서 수행하였다. 구체적으로, 상기 균주의 배양은 250 mL 플라스크(flask)를 이용하여 배양하였고, 배양액의 부피(working volume) 200 mL이었으며, 미세조류의 접종은 680 nm의 조건에서 측정한 상기 배양액의 OD(Optical Density, OD₆₈₀) 값이 0.05가 되도록 상기 배양액에 초기 배양액(seed culture) 10 ㎖를 접종하는 방법으로 수행하였다.

상기 미세조류 접종 후, 에어필터가 연결된 에어호스를 각각의 플라스크에 넣고 배양하여, 호기조건에서 배양하였으며, 16 : 8(명반응(Light, L) : 암반응(Darkness, D))의 광주기 조건 및 22 ± 1℃의 온도조건에서 배양하였다. 상기 명반응은 도 2에 나타낸 바와 같이 구성된 LED 소자가 배치된 광원을 이용하여 배양액에 조사함으로써 수행하였다. 상기 광반응에도 불구하고 온도조건이 일정하게 유지되도록, 상기 광배양 장치, 구체적으로 LED 소자로 구성된 광원이 설치되고, 배양액이 든 플라스크에 설치된 상자(box) 내에 공기가 순환되도록 공기 순환 장치(선풍기)를 설치하였다.

실시예 2: 최적 배양 조건( 광조건 )의 확립

상기 담수 미세 조류인 Botryococcus braunii(KMMCC-1681) 및 해수 미세 조류인 Nannochloropsis oceanica (KMMCC-13)의 최적 배양 광조건을 확인하기 위하여, 도 2와 같이 구성된 LED 장치로 이루어진 광원으로 광을 공급하며 배양을 수행하였다. 하기 최적 조건 측정을 위한 각 실험은 5회 반복으로 그 정확성을 확립하였고, 각각의 측정 값은 상기 5회 반복하여 측정된 결과의 평균값을 기재하였다.

2-1. 생장률과 관련된 최적 배양 조건의 측정

상기 Botryococcus braunii(KMMCC-1681) 및 Nannochloropsis oceanica (KMMCC-13)의 최적 배양 광조건을 확인하기 위하여, 초기 pH 7.5 및 21℃ 내지 23℃의 조건에서, 광원의 종류를 도 2에 나타낸 바와 같이 달리하면 8일 동안 배양하였다. 상기 도 2에 나타낸 바와 같이, LED의 종류는 White, Green(520 nm), Red(640 nm), Blue(460 nm) 및 Red와 Blue를 각각 5 : 1(Red : Blue), 3 : 1(Red : Blue) 및 1 : 1(Red : Blue)로 혼합한 7종류를 사용하였고, 각각의 LED 광원의 조도(Lux) 는 White의 경우 3935 Lux, Green의 경우1235 Lux, Red의 경우522 Lux, 5:1의 경우418 Lux, 3:1의 경우381 Lux, 1:1의 경우315 Lux 및 Blue의 경우84.5 Lux이었다.

상기 배양기간 동안 2일마다 미세조류의 균체량을 통해 생장정도를 측정하였으며, 상기 균체량 측정을 위한 O.D.값은 UV/Vis spectrophotometer(Smartspec 3000, BioRad, USA)를 이용하여 680nm에서 측정하였고, Blank는 상기 방법으로 제조된 Chu 13 배지 1 ml를 측정하여 조절하였으며, 측정 Sample의 채취는 배양액 중 10 ml를 채취하고, 상기 채취한 10 ml만큼 멸균된 Chu 13 배지를 공급하는 방법으로 수행하였다.

상기 측정 결과를 도 3 및 도 5에 나타내었다. 상기 도 3에 나타낸 바와 같이, Botryococcus braunii(KMMCC-1681)의 경우에는 4일째 측정한 결과부터 5 : 1(Red : Blue) LED 광원이 가장 우수한 것으로 확인하였고, Blue LED가 증가한 3 : 1(Red : Blue) LED 광원 또는 Red 광원 보다 더 우수한 것으로 확인되었으며, 이러한 경향은 6일째도 유사하게 진행되었으며, 8일째에는 White 광원이 높은 성장을 나타내기는 하였으나, 가장 높은 생장률을 나타낸 것은 5 : 1(Red : Blue) LED 광원으로 확인되었다. 상기 결과로부터 녹조류인 Botryococcus braunii를 고려할 때, Green LED 광원 또는 White LED 광원보다 5 : 1(Red : Blue) LED 광원으로 Botryococcus braunii를 배양하는 것이 생장률이 현저하게 개선될 수 있다는 것이 예상되어, 기존 생장률이 낮아 산업적 이용이 문제되었던 Botryococcus braunii의 산업적 활용을 위한 단서를 제공한 것으로 평가되었다.

한편, 상기 도 5에 나타낸 바와 같이, Nannochloropsis oceanica의 경우에는 4일째 측정한 결과부터 5 : 1(Red : Blue) LED 광원이 가장 우수한 것으로 확인하였고, Blue LED가 증가한 1 : 1(Red : Blue) LED 광원이나 3 : 1(Red : Blue) LED 광원 또는 Red LED가 증가한 Red 광원 보다 더 우수한 것으로 확인되었으나, 6일째부터는 Red LED가 증가한 Red 광원의 생장률이 높아져, 8일째에는 Red 광원의 생장률이 가장 높은 것으로 확인되었다. 상기 결과로부터 Nannochloropsis oceanica의 경우, Blue LED 광원 또는 White LED 광원보다 Red LED 광원으로 배양하는 것이 생장률이 우수한 것으로 확인되었고, Green LED 광원의 경우, 다른 광원에 비하여 성장률이 약 10% 정도로 매우 낮은 것으로 확인되었다.

2-2. 지질생산능과 관련된 최적 배양 조건의 측정

상기 배양된 미세조류의 지질생산능을 측정하기 위하여 형광측정기(GloMax-Multi Detection System, Promega, USA)를 이용하여 입력값 490 nm, 출력값 510 nm 내지 570 nm에서, 지질함량(lipid content)을 측정하였으며, 그 결과를 도 4 및 도 6에 나타내었다.

상기 지질함량 측정은 Nile red를 이용한 방법(오목희 외, Rapid method for the determination of lipid from the green alga Botryococcus braunii(1988))을 응용하여 사용하였다. 구체적으로, Botryococcus braunii의 지질함량을 측정하기 위하여 아세톤에 Nile Red Powder을 2.5 mg/ 10 ml의 농도로 녹여 제조한 염색약 360 μl과 상기 실시예 2-1에서 제조된 Chu 13 배지 45 ml를 섞은 후, 상기 염색약이 혼합된 배지 5 ml와 2일마다 측정된 각각의 배양액 5 mL를 혼합한 후, 형광정도를 측정하였다. Nannochloropsis oceanica의 지질함량을 측정하기 위하여 f/2배지를 사용하여 상기와 같은 방법으로 측정하였다. 상기 측정값에 따른 지질 함량값은 하기 계산식 1에 대입하여 계산하였으며, 그 결과를 도 4 및 도 6에 나타내었다.

[계산식1]

지질함량값 = (염색된 미세균주 배양액 형광값 - 염색전 미세균주 배양액 형광값) - (염색된 Chu 13 배지 형광값 - 염색전 Chu 13 배지 형광값)

상기 도 4에 나타낸 바와 같이, Botryococcus braunii(KMMCC-1681)의 지질함량은 6일째 측정한 결과부터 5 : 1(Red : Blue) LED 광원이 가장 우수한 것으로 확인하였고, Blue LED가 증가한 3 : 1(Red : Blue) LED 광원 또는 Red LED가 증가한 Red 광원 보다 더 우수한 것으로 확인되었으며, 이러한 경향은 8일째도 유사하게 진행되었으며, 8일째에는 White 광원이 높은 성장을 나타내기는 하였으나, 가장 높은 지질함량을 나타낸 것은 5 : 1(Red : Blue) LED 광원으로 확인되었다. 상기 5 : 1(Red : Blue) LED 광원으로 배양하는 것이 2번째로 높은 White 광원으로 배양하는 것보다 약 18% 높은 것으로 확인되어 지질생산능이 현저히 우수한 것으로 확인되었고, 상기 형광값을 상기 실시예 2-1에서 측정한 생장률 즉, OD값으로 나눈 1 OD 당 절대 지질함량에서도 5 : 1(Red : Blue) LED 광원으로 배양하는 것이 가장 우수한 것으로 확인되었다.

상기 결과로부터 녹조류인 Botryococcus braunii의 지질생산능 향상의 측면에서도 생장률과 같이 5 : 1(Red : Blue) LED 광원으로 배양하는 것이 바람직한 것으로 확인되었다.

또한, 상기 도 6에 나타낸 바와 같이, Nannochloropsis oceanica의 지질함량은 6일째 측정한 결과부터 Blue LED 광원이 가장 우수한 것으로 확인하였고, 그 후로 1 : 1(Red : Blue) LED 광원, 5 : 1(Red : Blue) LED 광원 순으로 확인되었으며, 8일째에는 5 : 1(Red : Blue) LED 광원이 가장 우수한 것으로 확인되었고, 그 후, Blue LED 광원, 3 : 1(Red : Blue) LED 광원, Red LED 광원 순으로 확인되었다.

상기 Nannochloropsis oceanica의 경우에는 생장률이 가장 우수한 Red LED 광원의 경우 지질생산능은 떨어지는 것으로 확인되었고, 지질생산능이 우수한 5 : 1(Red : Blue) LED 광원의 경우 생장률이 떨어져, 지질생산능과 생장률 모두를 만족시키는 광원조건은 확인되지 못하였다.

상기 결과로부터, 생장능 및 지질생산능을 모두 향상시키는 광원은 미세조류의 종류에 따라 상이한 것으로 확인되었고, 일정한 경향성을 나타내는 것은 아니었으며, 조도가 강한지 여부에 의해 결정되는 것도 아닌 것으로 확인되었다. 따라서, 상기 결과로부터 미세조류를 이용한 바이오에너지 생산 등의 산업적 활용을 위해서는 각각의 미세조류에 따른 최적 생산 조건을 확인하는 것이 필요로 한 것으로 확인되었으며, 지질생산능이 우수한 것으로 알려진 담수성 녹조류인 Botryococcus braunii의 경우 생장률과 지질생산능 향상을 위한 최적 광원조건은 5 : 1(Red : Blue) LED 광원인 것으로 확인되었다.

Claims

640nm 파장대의 적색빛(Red)을 조사하는 LED 및 460nm 파장대의 파란빛(Blue)을 조사하는 LED를 5:1의 비율로 혼합한 LED 조명을 이용하여 빛을 조사하는 광조건에서 보트리오코커스 브라우니(Botryococcus braunii)를 배양하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 미세조류 배양방법.
제1항에 있어서,
상기 보트리오코커스 브라우니를 배양하는 단계의 광조건은 상기 LED 조명을 이용하여 410 Lux 내지 426 Lux의 조도로 14시간 내지 18시간 동안 빛을 조사하는 광조건인 것을 특징으로 하는 미세조류 배양방법.
제1항에 있어서,
상기 보트리오코커스 브라우니를 배양하는 단계는 20 ℃ 내지 24 ℃의 온도 조건 및 pH 6.5 내지 pH 8.5의 pH 조건에서 수행하는 것을 특징으로 하는 미세조류 배양방법.