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KR101270692B1 - 폴리시알산 유도체 - Google Patents

폴리시알산 유도체 Download PDF

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KR101270692B1
KR101270692B1 KR1020067002875A KR20067002875A KR101270692B1 KR 101270692 B1 KR101270692 B1 KR 101270692B1 KR 1020067002875 A KR1020067002875 A KR 1020067002875A KR 20067002875 A KR20067002875 A KR 20067002875A KR 101270692 B1 KR101270692 B1 KR 101270692B1
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산자이 자인
피터 라잉
그레고리 그레고리아디스
이아온니스 파파이오안노우
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리폭센 테크놀로지즈 리미티드
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Abstract

폴리시알산 화합물은 약제, 약제 전달 시스템, 단백질 또는 펩티드 내의 시스테인 유니트의 측쇄와 같은 설프히드릴 기에 부위-특이적 컨쥬게이트를 위한 펜던트 작용기를 도입하기 위하여 헤테로-이작용기 시약과 반응된다. 작용기는 예를 들어 N-말레이미드기이다.
폴리시알산, 헤테로-이작용기 시약, N-말레이미드, 부위-특이적 컨쥬게이트

Description

폴리시알산 유도체 {POLYSIALIC ACID DERIVATIVES}
본 발명은 약제, 단백질 및 펩티드 또는 설프히드릴기를 갖는 리포솜과 같은 약제 전달 시스템과의 컨쥬게이트에 유용한 폴리시알산 유도체에 관한 것이고, 또한 이 유도체 및 컨쥬게이트의 합성을 위한 컨쥬게이트된 생성물 제조 방법 및 신규한 합성 중간체에 관한 것이다.
혈관계 내 또는 혈관 외 용도에 있어서 약제의 광범위한 존재는 종종 그들의 최적의 사용에 있어서 예비-필요조건이다. 예를 들면 수많은 항생 물질 및 세포증식억제제, 뿐만 아니라 다양한 치료상의 펩티드 및 단백질, 및 리포솜들은 표적 조직 내의 유효 농도가 얻어지기 전에 성급하게 순환으로부터 제거된다. 수많은 단생 단백질(예를 들면, 효소, 시토카인, 등)의 반감기는 이들을 폴리(에틸렌 글리콜)에 컨쥬게이트함에 따라 증가되어왔다. 이는 PEG 분자가 단백질 및 입자의 표면 근처에 구름을 형성함으로써 이들의 순환을 지연시키고, 따라서 이들을 정화시킬 인자들과의 상호작용을 입체적으로 방해하는 것 같다. 그러나 PEG는 분해되지 않고 PEG화된 단백질의 세포 내에서의 축적은 특히 장기간의 사용에서는 바람직하지 않을 수 있다 [Bendele, A., Seely, J., Richey, C., Sennello, G., Shopp, G,. Renal tubular vacuolation in animals treated with polyethylene-glycol conjugated proteins, Toxicological sciences, 42 (1998) 152-157; Convers, C, D., Lejeune, L., Shum, K., Gilbert, C., Shorr, R.G.L, Physiological effect of polyethylene glycol conjugation on stroma-free bovine hemoglobin in the conscious dog after partial exchange transfusion, Artificial organ, 21 (1997) 369-378].
본 발명자들은 단백질의 반감기를 증가시키고, 그들의 면역원성/항원성을 감소시키거나 다양한 단백질의 안정성을 증가시키기 위해 단백질에 컨쥬게이트된 2→8 및/또는 2→9 (예, 교차의 2→8 및 2→9)로 연결된 시알산 유니트를 포함하는 다당류의 컨쥬게이션을 기술했다. WO 92/22331에서, 폴리시알산은 약제 모형과 반응하여 마우스의 순환에서 반감기가 연장된 것으로 나타난다. Cell. Mol. Life Sci. 57(2000) 1964~1969 및 Biotechnol. Genet. Eng. Rev. 16(1999) 203~215에서, Gregoriadis 등은 폴리시알산의 아스파라기나아제 및 카탈라아제에의 컨쥬게이션을 기술하고, 효소 활성이 유지되는 동안 순환으로부터 정화 속도가 감소되는 것을 나타낸다. 본 발명자들은 또한 인슐린을 폴리시알화하여(Biochim. Biophys. Acta 1622 (2003) 42-49), 이것이 활성을 갖게 되는 것을 밝혔다. 본 발명자는 또한 인터페론을 폴리시알화했다(AAPS Annual meeting 2002, Toronto, Canada, M1056). 본 발명자들은 또한 항체 분절Fab을 폴리시알화 했다(Epenetos, A. et al., Proceedings of ASCO (Clinical Pharmacy) 21 (2002) 2186).
상기 문헌들 모두에서, 폴리시알산은 과요오드산 나트륨으로 7,8-인접 디올 모이어티를 산화하여 비-환원성 단부에서 알데히드기를 생성시켜 반응성을 갖도록 했다. 그 다음 알데히드기는 일반적으로 단백질의 라이신 모이어티의 ε-아미노기 또는 N-말단 아민기로 여겨지는 단백질의 1차 아민 기와 반응되었다. 이 반응은 시아노보로히드리드에 의해 2차 아민으로 환원된 쉬프 염기(Schiff base)를 형성한다.
WO-A-01/87922에서, 본 발명자들은 또한 다른 분자와의 유도체화가 변성제의 존재하에서 실시되어 유도체화 수준을 증가시킬 수 있다는 사실을 제시한다. 다른 유도체화제들의 예는 폴리에틸렌 글리콜 화합물이다. 트레실-PEG 및 PEG의 숙신이미딜 숙시네이트 에스터와 같은 활성화된 PEG 화합물이 언급되었다. 숙신이미딜 숙시네이트 활성화된 PEG를 사용한 실시예는 아민기와 반응하는 것으로 믿어진다.
티올기에 커플링하기 위한 작용기를 갖는 PEG 유도체는 상업적으로 구할 수 있다. 작용기는 말레이미드, 비닐 술폰, 요오도아세트아미드 또는 오르토피리딜 다이설파이드기 일 수 있다. 이들 시약이 시스테인과 특이적으로 결합하고, 그리고 단백질이 라이신기보다 표면상에 더 적은 시스테인을 가지기 때문에, 유도체화가 더 제어 가능하다. 또한, 천연 단백질에 유리 시스테인이 부재시, 하나 이상의 유리 시스테인은 유전공학에 의해 첨가될 수 있다. 이러한 접근의 장점은 생물학적 활성의 손실을 최소화할 수 있는 단백질 상의 영역에서 부위-특이적 유도체화를 가능하게 한다는 것이다.
PEG화된 단백질은 혈액 순환내에서 컨쥬게이트의 체류 시간에 영향을 줄 수 있는 항 PEG 항체를 생성하는 것으로 발견되었다(Cheung T, Wu,M., Wu,P., Chern, J, Roffer, SR., Accelerated clearance of polyethylene glycol modified proteins by anti-polyethylene glycol lgM. Bioconjugate chemistry, 10 (1999) 520-528). 그럼에도 불구하고, 치료제에 컨쥬게이트된 비경구적으로 투여된 폴리머로서 PEG의 확립된 역사, 면역독성학, 약리학 및 대사에 대한 더 많은 이해가 요구될 것이다(Hunter, A. C, Moghimi, S. M., Therapeutic synthetic polymers: a game of Russian Roulette. Drug Discovery Today, 7 (2002) 998-1001; Brocchini, S., Polymers in medicine: a game of chess. Drug Discovery Today, 8, (2003) 111-112).
이는 티올(설프히드릴)기 쪽으로 표적화될 폴리시알산에 의한 변성에 유용할 것이다. 이것은 또한 활성 폴리시알산의 높은 과량을 요구하는 상기 언급된 종래의 기술에서 설명된 방법인 증가될 시알산에 의한 유도체화의 효능에도 바람직할 것이다. 이는 또한 시아노 보로히드리드의 사용을 막기 위해서도 바람직하다.
본 발명에 따르면, N-말레이미도 기, 비닐술폰 기, N-요오도아세트아미드 기 및 오르토피리딜 다이설파이드로부터 선택된 작용기를 포함하는 하나 또는 각 말단 유니트에 연결된 모이어티를 갖는 다당류를 포함하는 신규의 화합물이 제공된다.
모이어티가 연결된 말단 유니트는 폴리시알산의 비-환원성 단부 또는 폴리시알산의 환원성 단부가 될 수 있다. 일반적으로 말단 시알산 유니트는 말레이미드기함유 시약이 연결될 수 있는 유용한 작용기를 생성하기 위해 예비적인 화학반응을 겪었다. 본 발명자들은 본 발명자들의 이전 문헌에서 개시된 말레이미드 모이어티를 통해 연결될 수 있는 작용기를 생성하기 위한 예비 단계로서, 알데히드가 제조되는 화학을 사용하는 것이 편리하다는 것을 발견하였다.
상기한 본 발명자들의 이전의 문헌에서, 이것은 탄소 7-알데히드 화합물을 형성하는 것이 과요오드산 나트륨으로 7,8-인접 디올 모이어티를 산화함으로써 알데히드 모이어티로 전환되는 비-환원성 말단 유니트이다. 이는 본 발명을 위한 적절한 반응이다.
대안으로, 환원성 말단 유니트에서 알데히드 모이어티가 제공될 수 있다. 이 경우, 예비 산화 및 환원 단계에 의하여 비-환원성 단부가 불활성화되는 예비 단계를 실행하는 것이 바람직하다(그러나 필수적이지는 않다). 첫번째 환원단계는 환원 단부에서 케탈 유니트를 인접한 디올을 갖는 개방된 형태의 환원된 고리로 전환시킨다. 인접 디올은 연속하여 과요오드산 나트륨을 사용하여 산화되어, 환원 말단 유니트의 7-탄소를 미리 형성하여 탄소 원자에서 알데히드 모이어티를 형성한다. 비-환원성 말단 글리코실(보통 시알산)이 예비 산화 단계에 의해 불활성화되지 않을때, 동시에 말단 유니트가 활성화될 것이다.
본 발명에서, 작용기를 포함하는 모이어티는 폴리시알산 유니트에 직접적으로 연결될 수 있거나 또는, 보다 편리하게는, 알칸디일 기, 아릴렌 기 또는 올리고(알킬렌옥시)알칸 기, 또는 대안으로 올리고 펩티딜 기와 같은 이작용기 유기성 기를 통해 연결될 수 있다. 폴리시알산(작용기를 포함하는 모이어티 또는 링커로부터)로의 연결은 2차 아민, 히드라존, 알킬 히드라진, 에스터 또는 펩티딜 기일 수 있다. 이 모이어티는 폴리시알산 기질과 헤테로-이작용성 시약과의 반응에 의해 생성될 수 있다. 이 방법은 본 발명의 추가적인 측면을 제시한다.
선택된 작용기를 도입하기에 유용한 시약들은 상업적으로 구할 수 있다. 어떠한 추가적인 링커 모이어티를 도입함 없이 말레이미드기를 아민 모이어티 상에 도입할 화합물은 N-메톡시-카보닐-말레이미드이다. 일반적으로 시약은 상기한 알데히드 기가 될 수 있는 폴리시알산의 기, 또는 아민 기와 반응하기 위한 제 2 작용기를 포함한다. 적절한 제 2 작용기는 N-히드록시 숙신이미드 에스터 및 그들의 술포숙시미드 유사체 및 히드라지드를 포함한다. 바람직하기는 상기 화합물이 N-말레이미도-알카노산 히드라지드 또는 N-말레이미도 아릴알카노산 히드라지드 즉, 다음의 일반식을 갖는 화합물인 것이다:
X-R-Y:
상기식에서, X는 N-말레이미도, N-요오도아세트아미도, S-비닐술포닐 또는 S-오르토피리딜 다이설파이드기이고,
R은 알칸-디일, 아릴렌 또는 아랄킬렌 알카릴렌, 알킬렌-옥사알킬렌, 또는 알킬렌-올리고옥사-알킬렌 또는 알킬-올리고펩티딜-알킬기이고; 그리고
Y는 히드라지드, 아민 또는 N-히드록시숙신이미드 기이다.
바람직하기는 R은 C1 - 6알칸디일, C2 -3-알킬-옥사-C2 -3-알킬렌, C2 -3-알킬-올리고(옥사-C2-3알킬렌), 또는 C2 - 6알킬렌 페닐이다.
바람직하기는 X는 N-말레이미도 또는 오르토피리딜다이설파이드이다.
바람직하기는 Y는 히드라지드 또는 히드록실 숙신이미드이다.
알데히드기와 반응할 수 있고, 링커 모이어티를 포함하고, 말레이미드 기를도입시킬 수 있는 화합물은, N-[β-말레이미도프로피온산]히드라지드 및 4-(4-N-말레이미도페닐)부티르산 히드라지드를 포함한다. 히드라지드 기는 안정한 히드라존 기를 형성하기 위해 알데히드와 반응한다. 올리고(에틸렌옥시)에틸렌 기를 포함하는 적절한 헤테로-이작용성 화합물은 한쪽 단부에는 N-히드록시 숙신이미드(NHS)기를 그리고 다른 쪽의 단부에는 작용기를 갖는 폴리에틸렌 글리콜 (폴리(에틸렌옥시))기를 포함하는 화합물이다. NHS 기는 안정한 아미드 결합을 형성하기 위해 아민 기와 반응한다. 한쪽 단부에서는 NHS를 갖는 헤테로-이작용성 폴리에틸렌글리콜, 그리고 다른 쪽의 단부는 비닐술폰 또는 말레이미드가 가능하다. 헤테로-이작용성 시약의 다른 예로는 3-(2-피리딜디티오)프로피오닐 히드라지드, N-숙신이미딜-3-[2-피리딜디티오]프로피오네이트, 숙신이미딜-H-[N-말레이미도메틸]시클로헥산-1-카르복실레이트), m-말레이미도벤조일-N-히드록시숙신이미드 에스터, N-숙신이미딜-[4-요오도아세틸]아미노 벤조에이트, N-[감마-말레이미도부티릴옥시]숙신이미드 에스터, N-[엡실론-말레이미도카프로일옥시]숙신이미드 에스터 및 N-숙신이미딜 요오도아세테이트를 포함한다. 다른 시약은 Pierce Biotechnology and Shearwater Corporation 사(폴리에틸렌 글리콜 기저)로부터 얻을 수 있다.
시알산(또한 노눌로손 산으로로 알려짐)은 9 이상의 탄소 원자를 함유하는 당을 갖는 아미노과의 성분이다. 가장 중요한 시알산은 N-아세틸뉴라민산 (5-(아세틸아미노)-3,5-디데옥시-D-글리세로-D-칼락토-노눌로손, 락타민 산 및 O-시알산이라고도 알려짐)이고, 다음과 같은 식을 갖는다:
Figure 112006010012914-pct00011
폴리시알산은 보통 α-배열에서, 2→8 및/또는 2→9로 연결될 수 있다. 어떤 폴리시알산에서는 연결이 2→8 및 2→9로 교차된다. 본 발명은 또한 시알산 유니트 이외의 글리코실 유니트를 포함하는 헤테로중합성 다당류에 유용하다.
폴리시알산은 일반적으로 비-독성, 실질적으로 비-면역원성인 것으로 발견된다. 추가로 생분해성 유니트인, 시알산은 독성이 없다고 알려져 있고, 실제로 시알산은 혈액 세포 및 순환 단백질을 포함하는 동물 단백질 및 세포 내에서 널리 발견된다.
수많은 시알산 유니트를 함유하는 다당류 화합물은 대장균( Escherichia coli), 모라젤라 논리퀴파시엔 ( Moraxella nonliquifaciens ), 파스퇴렐라 에로기노시스(Pasteurella aeroginosis ) 및 수막염균 ( Nesseria meningitidis ) 또는 그들의 유도체에 의해 제조되는 다당류이다. 예를 들면 E. coli K1로부터 유래된 콜로민산(가수분해에 의해 사슬 길이가 짧아진)은 α 2→8로 연결된 시알산 유니트를 포함한다. 균주 E. coli K92로부터 얻은 다당류는 교차적으로 2→8 및 2→9로 연결된 시알산 유니트를 포함한다. 수막염균(N. meningitidis) 그룹 C의 다당류 C는 2→9 연결된 시알산 유니트를 갖는다.
본 발명에서 특히 유용하다고 발견된 다당류 화합물의 한 그룹은 B 그룹 다당류이다. 이들 화합물은 N. meningitidis, M. nonliquifaciens, P. aeroginosis A2 및 E. coli K1에 의해 생성된다. 이들 화합물은 시알산 잔기 및 인지질 성분을 포함하는 다당류 성분을 포함한다. 시알산 잔기는 α 2→8로 연결되고, 약 200 잔기로 이루어진 천연적으로 발생한 폴리머이다. 당 지질 분자 중 일부, 특히 고 분자량 화합물은 다당류 성분의 환원성 단부에서 공유적으로 부착된 인지질을 갖는 것 같다.
생산하는 동안 편의를 위해 비-병원성이 되기 위하여 다당류 화합물이 세균으로부터 유도되는 것이 바람직하다. 그러므로 다당류는 E. coli K92 또는 바람직하기는, 비-면역원성인 E. coli K1과 같은 E. coli의 비-병원성 균주로부터 유도되는 것이 특히 적절하다. E. coli K92 및 K1 분리주는 잘 알려져 있고 이러한 균주의 어떤 종류는 적절한 다당류의 공급원으로서 사용될 수 있다. 바람직하기는 폴리시알산은 적어도 2개, 바람직하기는 적어도 5개, 더욱 바람직하기는 적어도 10개, 예를 들면 50개의 시알산 유니트를 가져야만 한다.
본 발명에 따르면 또한 단백질의 컨쥬게이트 및 신규의 활성화된 다당류가 제공된다. 신규의 화합물은 적어도 하나 이상의 시스테인 유니트를 갖는 단백질 및, 시스테인 유니트의 측쇄에 티오에테르 결합을 통해 연결된 폴리시알산의 하나 또는 두개의 말단 유니트에 결합된 모이어티를 통한 폴리시알산을 포함한다.
폴리시알산의 유도체가 N-말레이미도인 경우, 모이어티는 α-탄소 원자에 연결된 티오에스터를 갖는 N-숙신이미딜 기를 포함할 것이다. 바람직하기는 모이어티는 또한 2차 아민, 히드라존 또는 아미드 결합을 포함한다.
본 발명에서는 또한 폴리시알산이 설프히드릴 기와 반응하기 위한 제 1 작용기 및 제 1 작용기와는 다른 제 2 작용기를 갖는 헤테로-이작용성 시약과 반응하고, 상기 제 2 작용기가 공유 결합을 형성하기 위해 폴리시알산의 말단 유니트와 반응하고, 설프히드릴기 작용성 폴리시알산과 반응할 수 있다.
하나의 구현예에서, 제 2 작용기는 친핵성 기이고, 바람직하기는 히드라진이다. 이것은 폴리시알산이 그것의 카르보닐 기가 친핵성 기에 의해 공격당하는 말단 유니트에서 알데히드 기를 포함하는 경우, 특히 유용하다.
본 방법의 다른 구현예에서, 제 2 작용기는 N-히드록시숙신이미드 에스터 또는 술포숙신이미드 에스터, N-알콕실 카르보닐-이미드, 또는 카르보디이미드와 같은 친전자성 기이다. 이러한 경우에서 말단 기는 바람직하기는 아민과 같은 친핵성 기이다.
본 방법에서, 시약은 첫번째 및 두번째 작용기를 연결하는 이작용기 유기성기를 포함하는 것이 바람직하다. 바람직하기는 이작용기 유기성기는 C2 -18-알칸디일 기, 아릴렌 기, 올리고 펩티드 및 올리고(알콕시)알킬 기로부터 선택된다.
적절한 시약의 예는 상기에 주어져 있다.
가장 유용하게는 본 방법은 작용성 폴리시알산이 적어도 하나의 유리된 그리고 보호되지 않은 Cys 유니트를 갖는 단백질 또는 폴리펩티드와 반응하는 연속적 단계를 수반하는데, 상기 작용기는 폴리시알화된 폴리펩티드 또는 단백질을 형성하기 위해 Cys 유니트의 티올 기를 갖는 티오에테르 결합을 형성한다. 본 방법은 단백질이 위치-제어된 유도체화가 얻어지는 단일 Cys 유니트를 포함할 때 특히 적절하다.
본 발명은 이하의 실시예에서 설명된다.
실시예 1
Figure 112006010012330-pct00002
1.1 합성
3개의 개별적인 제조가 다음과 같이 실행되었다:
WO-A-9222331에 따라 제조된 콜로민산 알데히드(CAO)(100mg, 4.4×10-6 몰)을 0.1M의 아세트산 나트륨 500㎕에 용해시키고, 이것에 5 몰 당량의 N-[β-말레이미도프로피온산]히드라지드 (6.5mg, 2.2×10-5 몰)을 첨가하였다. 이 혼합물을 볼텍 스 혼합하고 호일로 감싼 뒤 회전 믹서에서 2시간 동안 37℃에서 배양하도록 했다. 그 다음 폴리머에 2 부피(1.0ml)의 에탄올을 첨가하여 침전시켰다. 침전물을 벤치 탑 미세원심분리기(bench top microcentrifuge)에서 원심분리하여(13,000 rpm, 2분) 수집하였다. 상청액을 버리고 펠렛을 0.1M의 아세테이트 500μml에 용해시켰다. 이 방법을 추가로 2회 반복했고 최종 펠렛을 탈이온수에서 용해시키고 밤새도록 동결건조시켰다.
1.2 말레이미드 함량 분석
이 분석에서 시스테인은, 방향족 고리에 인접하지 않은 티올로 치환될 때 짙은 노란색을 띠는 다이설파이드를 함유하는 Ellman 시약(5,5'-디티오비스(2-니트로벤조산))으로 추가 반응을 방지시켜, 폴리머의 말레이미드와 반응된다. 따라서 말레이미드 함량은 시스테인과 Ellman 시약 분석 간의 반응의 억제를 측정함에 의해 계산될 수 있다.
먼저, 12×10-3M(0.145mg/ml)의 시스테인의 초기 스톡(stock)이 PBS 내에서 제조되었다. 깨끗한 미세적정 플레이트(microtitre plate)에서 12×10-3M에서 0.375×10-3M로 100㎕ 부피의 2배 희석은 B열에서 H열까지 만들어졌다. A열에서 PBS 100㎕가 영점 표준으로 사용되었다. CA 및 CA-말레이미드(CAM)의 시료들은 시스테인 희석물의 이중 컬럼에 첨가된 개개의 시료의 5 또는 10mg/ml 및 100㎕에서 제조되었다. 한 셋트에서, CA가 없는 PBS 100㎕는 대조로서 첨가되었다. 플레이트를 덮고 1시간 동안 37℃에서 배양되도록 했다. 한 시간 후, Ellman 시약(4mg/ml) 20㎕가 각각의 웰에 첨가되었고 플레이트는 어둠 속에서 실온으로 15분간 배양되었다. 405nm에서 웰의 흡광도가 측정되었다. 표준 곡선은 시료를 위해 플롯팅되었고, 존재하는 말레이미드의 양은 신호의 억제로부터 계산되었다.
1.4 FAb 의 티올화 및 CAM 으로의 컨쥬게이트
첫번째 단계에서 티올기는 라이신의 아민의 티올화에 의해 모델 단백질로 도입되었다.
양의 FAb(항 데시프라민/노리티프탈린(Norityrptaline), 4mg, 7.2×10-8 몰)은 PBS 0.25ml + 10mM의 EDTA에 용해되었고, 이것에 같은 버퍼 0.25ml 중 0.498mg의 2-이미노티올란 (2-lT, Traut 시약 50 몰 당량 3.6×10-6 몰)이 첨가되었다. 이 튜브를 호일로 감싼 뒤, 1시간 동안 37℃에서 교반하에 배양되도록 남겨졌다.
Figure 112006010012330-pct00003
티올화된 Fab는 겔 여과(PD-10)에 의해 유리된 2-lT (Traut 시약)으로부터 정제되었고 0.5ml 분획은 단백질의 존재하에서 분석되거나(BCA 분석) 또는 티올 존재하에서 분석(Ellman 분석)되었다. 둘 다를 포함하는 첫번째 용출 피크는 풀(pool) 되었고 단백질 및 티올은 정량화되었다.
1.5 CAM 으로의 Fab - 티올 컨쥬게이트
PBS/EDTA의 2ml 중 티올화된 FAb(3.6mg, 6.6×10-8 몰)에 CAM 22.5mg(9×10-7 몰, 10 몰당량)이 첨가되었다. 상기 튜브는 봉해졌고 서서히 교반하는 동안 37℃에서 1시간 동안 배양되도록 했다. 얻어진 컨쥬게이트는 유리 CAM을 제거하기 위해 허용된 프로토콜에 따라 정제되었다. CA 및 단백질 둘 다의 함량은 컨쥬게이트 비율을 계산하기 위해 상기 컨쥬게이트 상에서 분석되었다.
대조 반응은 음성 대조로서 CA로 실행되었다.
CAM-Fab의 다수의 뱃치(batch)는 다양한 티올화도로 제조되었지만, 그러나 CAM:Fab의 비율을 15:1로 유지하면서 제조되었다. 결과는 하기의 표 1에 나타낸다:
표 1
FAb 당 티올 컨쥬게이트 비율 (CA:Fab)
1 0.53:1
2 0.9:1
5 (3중반응) 1.925:1 +/- 0.19: 1 Fab
10 3.51:1
도 1은 삼중 시료의 SDS-PAGE 겔 및 관련된 대조를 나타낸다.
1.6 결론
결과는 모든 대조 웰 (티올화된 FAb의 시료들)에서 컨쥬게이트를 행하는 동안 FAb 분자의 교차 연결이 없다는 것을 나타내면서 시료의 이동이 후레쉬(fresh) FAb(50 kDa 마커의 것 아래)과 유사하다는 것을 나타낸다. 복제 레인에서 전형적으로 폴리시알화된 생성물의 지표인 양적 증가를 나타내는 98과 250KDa 마커사이에 최대 강도를 갖는 상당한 밴드 팽창이 있었다.
1.7 베타 갈락토시다아제로의 CAM 의 컨쥬게이트
PBS의 1ml 중 E.coli β-갈락토시다아제 (β-gal: 5.0mg, 4.3×10-8 몰)로 15mg의 CAM이 첨가되었다(6.59×10-7 몰, 15 몰당량). 튜브는 봉해지고, 호일로 감싸고, 서서히 교반하면서 1시간 동안 실온에서 배양되도록 했다. 얻어진 컨쥬게이트는 SDS page에 의해 분석된 다음 유리 CAM을 제거하기 위해 허용된 프로토콜에 따라 정제되었다. 시료들은 설명한 바와 같이 폴리머 및 단백질 함량을 위해 분석되었다.
대조 반응은 음성 대조로서 CA로 실행되었다.
1.8 효소 활성 분석
후레쉬 β-갈락토시다제의 60㎍/ml ~ 3.75㎍/ml의 표준은 PBS 내에서 제조되었다. CAM-β-gal의 시료는 동일한 버퍼 내에서 60㎍/ml로 희석되었다. 컨쥬게이트의 효소활성은 다음과 같이 측정되었다: 미세적정 플레이트에서, 시료 또는 표준품 100㎕에 올-인-원 β-gal 기질(Pierce) 100㎕이 첨가되었다. 플레이트를 37℃에서 30분간 배양시키고 405nm에서 흡광도를 읽었다. 눈금 곡선은 표준품으로부터 작성 되고, 시료의 활성이 곡선의 선형회귀를 위한 방정식으로부터 계산되었다.
1.9 결과
단백질 및 폴리머 분석으로부터 컨쥬게이트 비율은 1.23 CAM : 1 β-gal인 것으로 결정되었다. 또한 시료의 SDS page로부터 명확한 분자 질량의 상응하는 증가도 있었다(도 2). 정제된 시료 내의 효소 활성은 유리 효소와 비교할 때 100.4%인 것으로 계산되었다.
실시예 2
합경 경로 2
단계 1 CA-알데히드 (CHO)의 아민화
Figure 112006010012330-pct00004
단계 2 말레이미드 링의 도입
Figure 112006010012330-pct00005
합성
2.1 단계 1 산화된 CA 의 아민화
10~100mg/ml에서 산화된 콜로민 산(CAO)은 50ml의 튜브에서 300-배 몰 과량의 NH4Cl을 갖는 탈이온수 2ml로 용해되었고, 5mg/ml의 최종 농도에서 NaCNBH3 (1N NaOH(수용액) 내의 5M 스톡)이 첨가되었다. 혼합물을 실온에서 5일간 배양시켰다. 대조 반응은 또한 CAO 대신에 콜로민산(A)으로 준비되었다. 생성물인 콜로민산 아민 유도체는 5ml의 빙-냉 에탄올의 첨가에 의해 침전되었다. 침전물은 벤치탑 원심분리기에서 4000rpm으로 30분간 실온에서 원심분리함에 의해 회수되었다. 펠렛은 유지되었고 2ml의 탈이온수에서 재현탁되었고 10ml의 초원심분리기 튜브에서 5ml의 빙-냉 에탄올로 다시 침전되었다. 침전물은 30000rpm으로 30분간 실온에서 원심분리함에 의해 수집되었다. 펠렛은 다시 2ml의 탈이온수에서 재현탁되었고 동결-건조되었다.
2.2. 아민 함량의 분석
TNBS (피크릴술폰산 또는 2,4,6-트리-니트로-벤젠술폰산)분석은 생성물 내에 존재하는 아민 기의 양을 결정하기 위해 사용되었다.
미세적정 플레이트의 웰에서 TNBS(15mM TNBS 0.5㎕)는 pH 9.5 0.1M 붕산염 버퍼 90㎕에 첨가되었다. 여기에 50mg/ml의 CA-아미드 용액 10㎕를 첨가하였고 405nm에서 흡광도를 읽기 전에 플레이트를 실온에서 20분간 정치시켰다. 글리신이 0.1~1mM의 농도 범위에서 표준품으로서 사용되었다. TNBS는 1차 아민 기를 트리니트로 페닐화하였다. 아민의 TNP 부가 생성물이 검출되었다.
TNBS 분석을 이용한 이중의 냉-에탄올 침전으로 정제된 생성물의 검사는 90%에 가까운 전환율을 보였다.
2.3 CA - 아민의 말레이미드화
CA-아민 (17mg)을 탈이온수 1ml에 용해시켰고, 이것에 메톡시-카르보닐-말레이미드(MCM) 6mg을 첨가했다. 혼합물을 실온에서 30분간 반응하도록 방치하였다. 시료에 물 100㎕ 및 아세토니트릴 200㎕을 첨가한 다음 실온에서 4시간 동안 배양하였고, 그 다음 CHCl3 300㎕가 교반되는 튜브에 첨가되고 수성 분획이 수집되었다. 그 다음 이 분획이 작은 분자를 제거하기 위해 PD-10 컬럼에서 정제되었다. 용출물은 동결 건조되었고 말레이미드 함량을 위해 분석되었다. 말레이미드의 몰 농도는 44몰%였다.
실시예 3: 콜로민 산( CAl )의 요오도 아세테이트 유도체의 제조
Figure 112006010012330-pct00006
3.1 합성
pH 7.4의 PBS 1ml에 콜로민산 아민(85 몰% 아민) 40mg을 용해시킨 것에(실시예 2.1에 기술된 대로) N-숙신이미딜 요오도아세테이트(SIA) 5mg을 첨가했다. 혼합물은 37℃에서 1시간 동안 반응하도록 방치하고, 그 다음 과량의 SIA가 PBS 0.5ml로 용출된 5ml의 HightrapTM Desalting column(AP Bioscience)에서 겔 여과에 의해 제거된 후 분획은 컬럼으로부터 수집되어 각 분획으로부터 샘플의 콜로민산 함량(레조르시놀 분석) 및 시스테인 지시 요오드와의 반응성(Ellman 분석)이 시험되었다. 요오드 및 CA 둘다 양성인 분획은 풀되었다.
3.2 β- 갈락토시다아제로의 CAI 의 컨쥬게이트
PBS 1ml 내의 E. coli β-갈락토시다아제 (5.0 mg, 4.3×10- 8몰)에 CAl(6.59 ×10-7몰, 15 몰당량) 15mg 을 첨가했다. 튜브를 봉한 뒤 호일로 감쌌고, 서서히 교반하면서 실온에서 1시간 동안 배양되도록 했다. 얻어진 컨쥬게이트는 SDS page에 의해 분석되었고 유리 CAl을 제거하기 위해 허용된 프로토콜에 따라 정제되었다. 시료는 설명된 바와 같이 폴리머 및 단백질 함량을 위해 분석되었다.
대조 반응은 음성 대조로써 CA로 실행되었다.
모든 시료는 상기 실시예 1.8과 같이 β-gal 활성을 분석하였다.
3.3 결론
분획 3-6은 폴리머 및 요오도 아세테이트 모두가 양성이었고 풀되었다. SDS page(4-12% 비스/트리스 겔; 도 2)는 요오도 아세트아미드 유도체로 배양된, 그러나 대조 폴리머로는 배양되지 않은 시료의 몰 질량의 뚜렷한 증가를 나타냈다. 단백질 및 폴리머 분석으로부터 컨쥬게이트 비율은 1.63 CAl: 1 β-gal인 것으로 결정되었다. β-gal활성은 유리효소와 비교할 때 컨쥬게이트된 샘플이 100.9%로 계산되었다.
실시예 4
4.1 합성: 4(4-N-말레이미도페닐)부티르산 히드라지드 ( CA - MBPH ) 및 3-(2- 피 리딜디티오)프로피오닐 히드라지드 ( CA - PDPH ) 으로 비-환원성 단부 활성화
제조는 다음과 같이 이루어진다:
WO-A-9222331에 따라 제조된 (MBPH 73mg, 튜브 A; PDPH 99.3mg, 튜브 B) 콜로민산 알데히드 (CAO; 22.7kDa, Camida, Ireland)는 개별적으로 0.1M의 아세트산 나트륨(pH 5.5) 800㎕에 용해되었다. 튜브 A에 DMSO 200㎕에 용해된 MBPH를 첨가하였다. 튜브 B에는 DMSO 200㎕에 용해된 PDPH 15mg(링커:CA의 비가 15:1)을 첨가하였다. pH는 각 반응 용기의 각각의 경우에서 5.5로 맞춰졌다. 그 다음 이들 혼합물들은 볼텍스 혼합되었고 호일로 감싼 다음, 오비탈 혼합기에서 2시간 동안 37℃에서 배양되도록 했다. 각 폴리머 용액은 pH 7.4 PBS로 용출되는 겔 여과 (PD 10 칼럼)에 의해 정제되었고 (레조르시놀 분석에 의한)CA를 함유하는 1ml 분획이 수집되었다. 이들 시료는 밤새도록 동결 건조되었고 실시예 1.2에서 기술한 것처럼 말레이미드 함량을 위해 분석되었다.
4.2 합성: 4(4-N-말레이미도페닐)부티르산 히드라지드 ( MBPH - CA ), (2-피리딜디티오)프로피오닐 히드라지드 ( PDPH - CA ) 및 N-β- 말레이미도프로피온산 히드라지 드)히드라지드(BMPH-CA)로 환원성 단부 활성화
제조는 링커:CA 몰비가 25:1에서 다음과 같이 실행되었다:
콜로민산(CA; 22.7kDa; MBPH 73mg, 튜브 A; PDPH 99.3mg, 튜브 B 및 BMPH 76.6mg; 튜브 C)을 0.1M의 아세트산 나트륨(pH 5.5) 800㎕에 개별적으로 용해시켰다. 튜브 A에, MBPH (DMSO 200㎕에 용해된) 25mg을, 튜브 B에 PDPH (DMSO 200㎕에서 용해된) 25mg을, 그리고 튜브 C에 BMPH (아세트산 나트륨 버퍼 200㎕에서 용해된) 25mg을 첨가했다. 반응 혼합물의 pH는 5.5로 맞춰졌다. 이들 혼합물은 볼텍스 혼합되었고, 호일로 감싼 뒤 오비탈 혼합기에서 72시간 동안 37℃에서 배양되도록 했다. 각 폴리머 용액은 pH 7.4에 PBS로 용출되는 겔 여과 (PD 10 칼럼)에 의해 정제되었고 (레조르시놀 분석에 의한)CA를 함유하는 1ml 분획이 수집되었다. 이들 시료는 밤새도록 동결 건조되었고 실시예 1.2에서 기술한 것처럼 말레이미드 함량을 위해 분석되었다.
4.3 결과
비-환원성(높은 반응성) 단부에서 MBPH 및 PDPH 말레이미도의 몰 농도는 각각 49.0몰% 및 35.0몰%였다. 환원성(낮은 반응성)단부에 MBPH, PDPH 및 BMPH 말레이미도의 몰 농도는 각각 41.5, 32.5 및 48.3몰%였다. 환원성 단부의 값은 각 경우 두 값의 평균이다.
4.4 말레이미드 활성화 콜로민산(환원 단부 및 비-환원 단부)으로 활성화된 말레 이미드로의 β- 갈락토시다아제(β-gal)의 컨쥬게이트
개별적인 튜브의 β-gal(1.0mg; PBS 중 1ml)에, 각각의 말레이미드 활성화 CA(상기 실시예들로부터, 비-환원성 또는 환원성 단부 상의 MBPH, PDPH 및 BMPH) 15몰 과량이 별개로 첨가되었다. 각 튜브는 봉해졌고 서서히 교반하면서 37℃에서 한시간 동안 배양되도록 했다. 얻어진 컨쥬게이트는 유리 활성화된 폴리머를 제거하기 위해 허용된 프로토콜에 따라 정제되었다. 모든 시료는 실시예1.8에서와 같이 β-gal 활성을 위해 SDS page에 의해 분석되었다.
4.5 결과
결과(도 3)는 모든 대조 웰(β-gal을 갖는)내에서 시료의 이동이 후레쉬 β-gal의 그것과 유사하다는 것을 나타낸다. 컨쥬게이트 레인에서 전형적으로 폴리시알화된-β-gal의 지표인 양적 증가를 나타내는 98 과 250KDa 마커사이에 최대 강도의 상당한 밴드 팽창이 있다. β-gal 활성은 컨쥬게이트된 시료에 대해 91.0-106% 인 것으로 계산되었다.

Claims (33)

  1. 둘 이상의 시알산 유니트가 각각 서로에 결합되어 있으며, N-말레이미드기, 비닐술폰기, N-요오도아세트아미드기, 및 오르토피리딜 다이설파이드기로부터 선택되는 작용기를 포함하는 시알산 유니트로부터 유도된 하나 이상의 말단 유니트에 결합된 펜던트 모이어티를 갖는 다당류를 포함하고,
    상기 펜던트 모이어티는 (i) 알칸디일 기, 아릴렌기, 또는 알칸디일 기 및 아릴렌기, 또는 (ii) 임의로 옥사알킬렌 또는 올리고옥사알킬렌 기와 연결된 2차 아민 결합, 히드라존, 알킬 히드라지드 결합을 포함하는 것을 특징으로 하며, 하기 화학식으로 표시되는 화합물:
    Figure 112012088223044-pct00013
    상기 식에서, 하기 정의 그룹 중 하나가 적용된다;
    i) R1은 -CHOHCH2OH이고, R2는 OH이고, R3는 -CH2CHR4R5 또는 -CH(CH2OH)CHR4R5이고, 여기서 R4 및 R5는 모두 =N-NR6이거나, 또는 R4는 H이고 R5는 -NR6R7이며, 여기서 R6는 N-말레이미드기, 비닐술폰기, N-요오도아세트아미드기 및 오르토피리딜 다이설파이드기로부터 선택되는 작용기를 포함하는 유기성 기이거나 H이고 R7은 H이고, 또는 R6 및 R7은 모두 1,3-부트-2-엔디오일기이며;
    ii) R1 및 R2는 모두 =N-NR6이거나, 또는 R1은 H이고 R2는 -NR6R7이고, 여기서 R6는 N-말레이미드기, 비닐술폰기, N-요오도아세트아미드기 및 오르토피리딜 다이설파이드기로부터 선택되는 작용기를 포함하는 유기 기이거나 H이고 R7은 H이고, 또는 R6 및 R7은 모두 1,3-부트-2-엔디오일기이며; R3는 H이고;
    Gly-O는 시알산 유니트이고;
    n은 0 또는 그 이상이고; 그리고
    Ac는 아세틸이다.
  2. 제1항에 있어서, 상기 펜던트 모이어티는 다당류의 환원 말단 유니트에 결합된 화합물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 펜던트 모이어티는 다당류의 비-환원 말단 유니트에 결합된 화합물.
  4. 삭제
  5. 제1항에 있어서, 상기 작용기는 N-말레이미도인 화합물.
  6. 제1항에 있어서, 상기 다당류는 폴리시알산인 화합물.
  7. 제6항에 있어서, 상기 다당류는 시알산 유니트만으로 이루어진 화합물.
  8. 삭제
  9. 삭제
  10. 하나 이상의 유리 시스테인 유니트를 가지는 단백질을 포함하고, 그리고 폴리시알산의 한쪽 또는 각 말단 유니트에 연결된 모이어티를 통하여 시스테인 유니트의 측쇄에 티오에스터 결합을 통하여 결합된 폴리시알산을 가지며,
    상기 모이어티는 2차 아민, 히드라존 또는 아미드 결합을 포함하는 것을 특징으로 하는 화합물.
  11. 제1항에 있어서, 상기 다당류는 10 이상의 당류 유니트를 갖는 화합물.
  12. 제11항에 있어서, 상기 다당류는 50 이상의 당류 유니트를 갖는 화합물.
  13. 제11항에 있어서, 상기 당류 유니트는 서로에 2,8 연결된 시알산 유니트, 또는 2,9 연결된 시알산 유니트, 또는 2,8 및 2,9 연결된 시알산 유니트인 화합물.
  14. 둘 이상의 시알산 유니트가 각각 서로에 결합되어 있으며, 시알산 유니트로부터 유도된 하나 이상의 말단 유니트를 포함하는 다당류를, N-말레이미도기, 비닐술폰기, N-요오도 아세트아미드기 및 오르토피리딜 다이설파이드기로부터 선택되는 제1 작용기 및 제1 작용기와 다른 제2 작용기를 갖는 헤테로 이작용기 시약과 반응시키는 방법으로서, 상기 제2 작용기는 말단 시알산 유도체 유니트와 반응하여 함께 공유 결합을 형성하고, 티올 기에 선택적으로 컨쥬게이트될 수 있는 작용성 다당류를 형성하며,
    상기 제2 작용기는 친핵성기 또는 친전자성기이고, 상기 친핵성기는 히드라진이고, 상기 친전자성기는 N-알콕시카보닐이미드 또는 카보디이미드 모이어티인 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 삭제
  16. 삭제
  17. 제14항에 있어서, 상기 다당류의 말단 유니트는 상기 친핵성기와 반응하는 카보닐기를 갖는 방법.
  18. 삭제
  19. 삭제
  20. 제14항에 있어서, 상기 다당류의 말단 유니트는 친전자성기와 반응하는 아민기를 가지는 방법.
  21. 제20항에 있어서, 펩티드 또는 우레탄 결합이 형성되는 방법.
  22. 제14항에 있어서, 상기 시약은 제1 및 제2 작용기를 연결하는 이작용기 유기성 기를 포함하는 방법.
  23. 제22항에 있어서, 상기 이작용기 유기성 기는 C2-18-알칸디일기, 아릴렌기, 올리고 펩티드 및 올리고(알콕시)알킬기로부터 선택되는 방법.
  24. 제14항에 있어서, 상기 제1 작용기는 N-말레이미드기인 방법.
  25. 제14항에 있어서, 상기 시약은 하기 일반식을 갖는 방법:
    X-R-Y
    상기 식에서, X는 N-말레이미도, N-요오도아세트아미도, S-비닐술포닐, 또는 S-오르토피리딜 다이설파이드기이고,
    R은 알칸-디일, 아릴렌, 또는 아랄킬렌 알카릴렌, 알킬렌-옥사알킬렌, 또는 알킬렌-올리고옥사-알킬렌 또는 알킬-올리고펩티딜-알킬기이고; 그리고,
    Y는 히드라지드, 아민, 또는 N-히드록시숙신이미드기임.
  26. 제14항에 있어서, 상기 다당류는 10 이상의 시알산 유니트를 갖는 방법.
  27. 제26항에 있어서, 상기 다당류는 50 이상의 시알산 유니트를 갖는 방법.
  28. 제26항에 있어서, 상기 시알산 유니트는 서로 2,8 연결된 시알산 유니트, 또는 2,9 연결된 시알산 유니트, 또는 2,8 및 2,9 연결된 시알산 유니트인 방법.
  29. 제14항에 있어서, 상기 말레이미도-작용기 폴리시알산은 하나 이상의 유리되고 보호되지 않은 Cys 유니트를 갖는 단백질 또는 폴리펩티드와 반응하고, 상기 말레이미드기는 Cys 유니트의 티올기와 티올에테르 결합을 형성하여 폴리시알화된 폴리펩티드 또는 단백질을 형성하는 방법.
  30. 제1항에 따른 화합물을 하나 이상의 유리되고 보호되지 않은 Cys 유니트를 갖는 단백질 또는 폴리펩티드와 반응시키는 방법으로서, N-말레이미드기, 비닐술폰기, N-요오도아세트아미드기, 및 오르토피리딜 다이설파이드기로부터 선택되는 작용기가 Cys 유니트의 티올기와 티오에테르 결합을 형성하여 폴리펩티드 또는 단백질과 함께 다당류의 컨쥬게이트를 형성하는 방법.
  31. 제10항에 있어서, 상기 폴리시알산은 10 이상의 당류 유니트를 갖는 화합물.
  32. 제31항에 있어서, 상기 폴리시알산은 50 이상의 당류 유니트를 갖는 화합물.
  33. 제31항에 있어서, 상기 당류 유니트는 서로에 2,8 연결된 시알산 유니트, 또는 2,9 연결된 시알산 유니트, 또는 2,8 및 2,9 연결된 시알산 유니트인 화합물.
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Families Citing this family (32)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7723296B2 (en) 2001-01-18 2010-05-25 Genzyme Corporation Methods for introducing mannose-6-phosphate and other oligosaccharides onto glycoproteins and its application thereof
KR101062525B1 (ko) 2002-11-12 2011-09-06 더 브리검 앤드 우먼즈 하스피털, 인크. 포도상구균 감염에 대한 다당류 백신
WO2005016949A2 (en) * 2003-08-12 2005-02-24 Lipoxen Technologies Limited Sialic acid derivatives
ES2294535T3 (es) * 2003-08-12 2008-04-01 Lipoxen Technologies Limited Derivados del acido polisialico.
ES2593318T3 (es) 2004-08-12 2016-12-07 Lipoxen Technologies Limited Derivados de ácido siálico
EP1789454B1 (en) 2004-08-12 2017-07-05 Lipoxen Technologies Limited Fractionation of charged polysaccharide
EP3138855A1 (en) 2005-02-23 2017-03-08 Lipoxen Technologies Limited Activated sialic acid derivatives for protein derivatisation and conjugation
PL1877099T3 (pl) * 2005-04-06 2013-02-28 Genzyme Corp Terapeutyczne koniugaty zawierające enzym lizosomalny, kwas polisialowy i grupę kierującą
AR060187A1 (es) * 2006-03-30 2008-05-28 Glaxosmithkline Biolog Sa Composicion inmunogenica
US7645860B2 (en) 2006-03-31 2010-01-12 Baxter Healthcare S.A. Factor VIII polymer conjugates
EP2041167B1 (en) 2006-07-25 2010-05-12 Lipoxen Technologies Limited Derivatisation of granulocyte colony-stimulating factor
EP2532369B1 (en) 2006-12-15 2017-11-01 Baxalta GmbH Factor VIIa-(poly)sialic acid conjugate having prolonged in vivo half-life
DK2457919T3 (da) 2007-01-18 2019-09-16 Genzyme Corp Oligosaccharider, der omfatter en aminooxygruppe, og konjugater deraf
US7700551B2 (en) * 2007-06-26 2010-04-20 Baxter International Inc. Hydrolysable polymeric FMOC-linker
KR20110031393A (ko) 2008-07-21 2011-03-25 더 브리검 앤드 우먼즈 하스피털, 인크. 합성 베타-1,6 글루코사민 올리고당에 관한 방법 및 조성물
CN102177438A (zh) 2008-07-25 2011-09-07 理查德·W·瓦格纳 蛋白筛选方法
AU2009292643B2 (en) 2008-09-19 2016-02-18 Nektar Therapeutics Polymer conjugates of therapeutic peptides
CA2747230C (en) 2008-12-16 2019-06-11 Genzyme Corporation Oligosaccharide-protein conjugates
TW201042257A (en) * 2009-05-26 2010-12-01 Baxter Int Detection of antibody that binds to water soluble polymer-modified polypeptides
AU2010277438B2 (en) 2009-07-27 2015-08-20 Baxalta GmbH Glycopolysialylation of non-blood coagulation proteins
SG10201401194VA (en) 2009-07-27 2014-07-30 Lipoxen Technologies Ltd Glycopolysialylation of non-blood coagulation proteins
KR102068133B1 (ko) 2009-07-27 2020-01-20 박스알타 인코퍼레이티드 혈액 응고 단백질 복합체
JP5566226B2 (ja) * 2009-09-03 2014-08-06 旭化成株式会社 １１糖シアリルオリゴ糖ペプチドの製造方法
RU2522846C2 (ru) * 2009-11-30 2014-07-20 Российская Федерация, От Имени Которой Выступает Министерство Промышленности И Торговли Российской Федерации Лекарственный препарат и способ улучшения реологических свойств мокроты и ингаляционное применение такого препарата
JP5285022B2 (ja) * 2010-04-30 2013-09-11 旭化成株式会社 糖ペプチド誘導体及びその製造方法
RU2559522C2 (ru) * 2010-11-29 2015-08-10 Российская Федерация в лице Министерства промышленности и торговли Российской Федерации Ингаляционная лекарственная форма полисиалированной дезоксирибонуклеазы i человека и способ ее получения
JP5680576B2 (ja) * 2011-03-03 2015-03-04 旭化成株式会社 １１糖シアリルオリゴ糖アスパラギンの製造方法
WO2015130963A2 (en) 2014-02-27 2015-09-03 Xenetic Biosciences, Inc. Compositions and methods for administering insulin or insulin-like protein to the brain
US20200179524A1 (en) 2017-04-25 2020-06-11 Lipoxen Technologies Limited Methods of treating multiple myeloma cancers expressing high levels of epo-receptor using psa-epo
US20190083636A1 (en) 2017-04-25 2019-03-21 Lipoxen Technologies Limited Methods of treating diseases related to net formation with parenteral administration of polysialylated dnase i
ES2711669A1 (es) * 2017-11-02 2019-05-06 Univ Santiago Compostela Sistemas de liberacion de farmacos de acido polisialico y metodos
US20220023430A1 (en) 2018-11-13 2022-01-27 Lipoxen Technologies Limited Glycopolysialylation of blinatumomab

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5329028A (en) * 1992-08-05 1994-07-12 Genentech, Inc. Carbohydrate-directed cross-linking reagents

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SU675053A1 (ru) 1977-08-10 1979-07-25 Институт Белка Ан Ссср 9-Йодацетамидо-метил-антрацен в качестве люминесцентной метки дл белков и белковоподобных полимеров
GB9112212D0 (en) 1991-06-06 1991-07-24 Gregoriadis Gregory Pharmaceutical compositions
AU685776B2 (en) * 1993-01-22 1998-01-29 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Ganglioside-KLH conjugate vaccines with QS-21
US5965532A (en) 1996-06-28 1999-10-12 Trustees Of Tufts College Multivalent compounds for crosslinking receptors and uses thereof
WO2001087922A2 (en) 2000-05-16 2001-11-22 Lipoxen Technologies Limited Derivatisation of proteins in aqueous solution
ES2294535T3 (es) * 2003-08-12 2008-04-01 Lipoxen Technologies Limited Derivados del acido polisialico.
ES2593318T3 (es) * 2004-08-12 2016-12-07 Lipoxen Technologies Limited Derivados de ácido siálico
EP2041167B1 (en) * 2006-07-25 2010-05-12 Lipoxen Technologies Limited Derivatisation of granulocyte colony-stimulating factor

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5329028A (en) * 1992-08-05 1994-07-12 Genentech, Inc. Carbohydrate-directed cross-linking reagents

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