KR101232123B1

KR101232123B1 - 재조합된 유전자발현 조절서열을 가지는 종양 특이적 발현이 개선된 유전자 전달체

Info

Publication number: KR101232123B1
Application number: KR1020100098498A
Authority: KR
Inventors: 윤채옥; 윤아름
Original assignee: 연세대학교 산학협력단
Priority date: 2010-10-08
Filing date: 2010-10-08
Publication date: 2013-02-12
Also published as: EP2657339A4; WO2012046943A3; JP2013543386A; WO2012046943A2; CN103314107A; EP2657339B1; US9689000B2; CN103314107B; US20130323206A1; KR20120036688A; EP2657339A2; JP5807236B2

Abstract

본 발명은 HRE, E2F 및 TERT의 조합으로 이루어진 유전자발현 조절서열 및 이를 이용한 선택적 종양세포 살상능이 크게 개선된 유전자 전달체, 특히 재조합 아데노바이러스에 관한 것이다. 또한, 상기 재조합 아데노바이러스를 포함하는 약제학적 항종양 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 재조합 아데노바이러스는 본 발명 특유의 유전자발현 조절서열에 의하여 종양 특이적으로 복제가 조절됨으로서 선택적 종양세포 살상능 또는 고사능이 개선된 효과를 발휘하며, 특히 저산조 조건에서 크게 향상된 항종양 효과를 나타낸다. 또한, 암세포 내에서 재조합 아데노바이러스의 특이적 발현으로 체내에서의 안정성이 증대되어 더욱 개선된 항종양 효과를 유도할 수 있다.

Description

재조합된 유전자발현 조절서열을 가지는 종양 특이적 발현이 개선된 유전자 전달체{Gene Delivery Systems Exhibiting Enhanced Tumor-Specific Expression with Recombinant Expression Control Sequence}

본 발명은 재조합된 유전자발현 조절서열을 가지는 종양 특이적 발현이 개선된 유전자 전달체에 관한 것이다.

악성 종양의 성장은 영양분과 산소공급에 의해 크게 좌우된다. 특히, 산소는 암세포에서 적절한 에너지 대사를 위해 절대적으로 필요한 물질이다. 일반적으로 암세포는 급속한 성장 속도로 인하여 종양의 중심부에 쉽게 산소 부족 현상(hypoxia)이 나타난다. 암세포가 성장하면서 나타나는 산소 부족 현상은 암 치료와 암 진행에 있어서 매우 중요한 요소이다. 고형암내에서 산소 부족 지역은 암세포의 생존과 전이를 위한 운동성 및 혈관형성을 촉진시킴으로써 암의 진행에 유리한 작용을 하게 된다. 또한 최근 연구에 의하면 암세포가 산소 부족 현상을 겪게 되면 항세포고사 물질의 발현이 증가하여 세포 고사가 억제 되고, 또한 방사선 치료요법과 항암 화학 치료 요법에 대한 내성을 가지게 된다고 보고되고 있다. 암세포가 가지는 이러한 특성으로 인해 야기되는 항암 치료의 한계점을 극복하기 위해 새로운 항암 치료법의 개발이 시급한 현실이다. 따라서 암 치료를 위한 효과적인 치료법으로 현재 바이러스를 이용한 방법들이 많이 개발되고 있다. 대표적으로 현재 증식 가능 아데노바이러스를 이용한 임상 시험들이 활발히 진행되고 있다. 재조합 아데노바이러스는 세포의 분열 상태 여부에 관계없이 다양한 종류의 세포에 대한 우수한 유전자 전달 효율을 보이며 높은 역가의 바이러스를 쉽게 생산할 수 있고, 쉽게 농축할 수 있을 뿐만 아니라 생체 내에서도 유전자 전달이 용이하다. 또한 암을 유전자 요법으로 치료할 경우, 치료 유전자를 장기적 혹은 지속적으로 발현할 필요가 없으며, 치료용 바이러스 자체에 의해 유도되는 숙주의 면역반응도 크게 문제시되지 않으며 오히려 이점이 될 수 있기 때문에 아데노바이러스가 암 치료용 유전자 전달체로 각광을 받고 있다. 이러한 장점을 바탕으로, 최근에 암을 대상으로 하는 유전자 치료에 재조합 아데노바이러스를 이용하는 빈도수가 지속적으로 증가하고 있다. 특히, 암세포에서만 선택적으로 증식하여 암세포를 살상하는 종양 세포 특이 증식 및 세포살상 재조합 아데노바이러스에 대한 연구가 다양하게 진행되고 있다. 암세포에서만 특이적으로 증식하여 암세포를 죽일 수 있는 종양 살상 아데노바이러스는 바이러스의 증식으로 일차 감염세포 뿐만 아니라 주변의 종양 세포들도 이차적으로 감염할 수 있어 치료 효과를 현저히 증대 시킬 수 있으며, 주변의 정상세포에서는 종양 살상 아데노바이러스의 증식이 억제되므로 아데노바이러스에 의한 독성이 감소되는 이점도 있다. 또한 암 특이적 유전자 조절부위를 E1 유전자 부위에 삽입하여 암 조직에서만 더욱 선택적으로 증식하도록 제작된 재조합 아데노바이러스도 개발되고 있다. 이에 따라 종양 특이적 살상 아데노바이러스의 임상 응용 가능성이 점차 증가 할 것으로 예상되고 있다. 암세포에서 나타나는 산소 부족 환경 하에서 HIF-1α(hypoxia-inducible factor-1α)와 p21^cip1(Cyclin-dependent kinase inhibitor 1A)이 활성화되고, 그 발현이 증가함으로써 세포 주기가 억제됨에 따라 자신의 모든 생활사를 숙주세포에 의존적으로 살아가는 바이러스의 증식이 억제되는 현상이 나타난다. 바로 이것이 바이러스를 이용한 지속적인 암 치료에 대한 제한점으로 나타나고 있다. 그러나 이를 역이용하여 산소 부족에 의해 조절되는 유전자들의 프로모터나 인핸서를 이용하면 암세포에 대한 특이성을 보다 증가시킬 수 있을 것이다.

유전자 치료를 통한 항암 치료를 하는 방안으로, 암세포 특이적인 프로모터에 의해 바이러스의 복제가 조절되어 암세포만을 선택적으로 사멸시킬 수 있는 종양 선택적 살상 바이러스를 이용하는 방법과 함께 암세포 내에 세포고사를 유도 할수 있는 치료 유전자를 전달시킬 수 있는 방안도 있다.

여러 종류의 암세포에서 높게 발현되는 것으로 알려져 있는 E2F는 암 유전자(oncogene)의 일종으로서, pRb(retinoblastoma protein)와 결합하여 그 활성이 억제된다. pRb로부터 해리된 E2F는 전사인자로서 아데노바이러스의 E2 프로모터의 활성화를 촉진시킬 뿐 아니라 세포주기의 진행을 주관하는 여러 유전자들의 전사도 함께 촉진 시키는 것으로 알려져 있다. 한편, 대부분의 고형 종양 내에는 저산소 부위가 존재하고 이러한 저산소증은 해당 효소(glycolytic enzyme)나 혈관신생유발 전구인자(proangiogenic factor)와 같은 생존인자의 생산을 야기함으로써 저산소 상태의 많은 종양들이 방사선 치료나 화학 항암 치료에 저항성을 가지게 된다. 특히, 저산소증 상태의 종양들은 저산소증에 반응하여 HIF를 생산해 내고 HIF는 HRE(hypoxia-response elements)에 결합하여 다운스트림에 존재하는 VEGF와 같은 혈관생성 유전자의 전사를 활성화 시킨다. 이러한 사실에 착안하여, 본 실험실에서는 E2F 프로모터와 HRE 인핸서에 의해 아데노바이러스의 E1의 발현이 조절되는 종양 선택적 살상 아데노바이러스를 제작하기 위하여, 이미 본 실험실에서 개발, 암세포 살상 효과를 검증한 E-Rd19 종양 선택적 살상 아데노바이러스와 더불어 변형된 E2F 프로모터를 가진 종양 선택적 살상 아데노바이러스인 EE-Rd19와 HE-Rd19를 제작하였다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 우수한 종양 선택적 유전자 전달효율을 통해 종양 특이적인 살상능이 더욱 향상된 유전자 치료제를 개발하기 위하여 예의 연구 노력하였다. 그 결과 HRE 인핸서, E2F 프로모터 및 TERT 프로모터로 구성되는 발현조절 서열을 포함하는 아데노바이러스를 이용할 경우 종양 선택적 살상능이 크게 향상됨을 발견함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서 본 발명의 목적은 종양 특이적 발현이 개선된 유전자 전달체를 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 암세포 특이적 살상능이 개선된 재조합 아데노바이러스를 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 본 발명의 재조합 아데노바이러스의 치료적 유효량을 포함하는 항종양 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 (ⅰ) HRE(hypoxia-response elements) 인핸서 서열; 및 (ⅱ) E2F 프로모터 서열을 포함하고 상기 E2F 프로모터는 상기 HRE 인핸서 서열의 다운스트림에 위치하며 상기 HRE 인핸서 서열 및 E2F 프로모터는 협동적으로 동일한 유전자의 발현을 촉진하는 것을 특징으로 하는 유전자발현 조절서열을 제공한다.

본 발명자들은 우수한 종양 선택적 유전자 전달효율을 통해 종양 특이적인 살상능이 더욱 향상된 유전자 치료제를 개발하기 위하여 예의 연구 노력하였다. 그 결과 HRE 인핸서, E2F 프로모터 및 TERT 프로모터로 구성되는 발현조절 서열을 포함하는 아데노바이러스를 이용할 경우 종양 선택적 살상능이 크게 향상됨을 발견하였다.

본 명세서에서 용어“E2F 프로모터 서열”은 아데노바이러스의 E2 프로모터의 활성화를 촉진시키고, 세포주기의 진행을 주관하는 여러 유전자들의 전사도 함께 촉진시키는 전사인자인 E2F 유전자의 프로모터를 의미한다. E2는 암 유전자(oncogene)로서 pRb(retinoblastoma protein)와 결합하여 그 활성이 억제된다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명에서 이용하는 E2F 프로모터 서열은 서열목록 제1서열의 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 보다 바람직하게는, E2F 프로모터 서열에 의한 종양 선택적 발현을 향상시키기 위하여, E2F 프로모터 반복서열을 이용한다. 본 발명의 반복서열은 동일한 서열이 연속적으로 반복될 수도 있고(immediately adjacent), 또는 프로모터나 인핸서의 활성에 영향을 주지 않는 범위 내에서 적절한 길이의 링커 뉴클레오타이드를 사이에 두면서 불연속적으로 반복될(discontinuous repeated) 수도 있다.

보다 더 바람직하게는, 본 발명에서 이용하는 E2F 서열은 서열목록 제1서열의 뉴클레오타이드 서열이 2-10번 반복된 서열, 보다 더욱 더 바람직하게는 2-7번 반복된 서열, 가장 바람직하게는 2번 반복된 서열을 갖는다.

본 명세서에서 용어 “HRE 인핸서 서열”은 저산소-반응성 인핸서 서열을 의미한다. 저산소 조건에서 세포의 특정 유전자들의 발현이 조절된다(Bunn and Poyton Physiol. Rev. 76:839-885(1996); Dachs and Stratford Br. J. Cancer 74:5126-5132(1996); Guillemin and Krasnow Cell 89:9-12(1997)). 대부분의 종양세포는 불충분한 혈액공급을 받게 되는데, 이는 종양세포들이 일반적으로 혈관을 형성시키는 내피세포보다 빠르게 성장하기 때문이며, 이는 종양에서 저산소 상태를 유발하게 된다. 대부분의 고형 종양 내에서 야기되는 이러한 저산소 상태는 해당효소(glycolytic enzyme)나 혈관신생유발 전구인자(proangiogenic factor)와 같은 생존인자의 생산을 야기함으로써 방사선 치료나 화학 항암 치료에 저항성을 가지게 된다. 이에 본 발명자들은 E2F 프로모터와 HRE 인핸서에 의해 아데노바이러스의 E1의 발현이 조절되는 종양 선택적 살상 아데노바이러스를 개발하였다.

저산소 반응의 주요한 매개자는 전사 복합체 HIF(hypoxia inducible factor)-1α이고, 이는 다양한 유전자의 조절 부위에 있는 HRE와 상호작용 하며, 상기 유전자는 예컨대 혈관내피성장 인자(VEGF) 유전자, 그리고 에놀라아제-1과 GAPDH(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)와 같은 당분해 효소-코딩 유전자들을 포함한다. 본 발명은 이와 같이 저산소 조건에서 유전자들의 발현을 조절하며 HIF-1α와 상호작용하는 서열인 HRE를 이용한다. HRE는 유전자 전달체, 특히 재조합 아데노바이러스의 종양세포 선택성을 크게 향상시키는 작용을 한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명에서 이용하는 HRE 서열은 서열목록 제2서열의 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 보다 바람직하게는, HRE 서열에 의한 전사 활성을 향상시키기 위하여, HRE 반복 서열을 이용한다. 보다 더바람직하게는, 본 발명에서 이용하는 HRE 서열은 서열목록 제2서열의 뉴클레오타이드 서열이 2-20번 반복, 보다 더욱 더 바람직하게는, 3-8번 반복된 서열, 가장 바람직하게는 6번 반복된 서열을 갖는다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 유전자 발현 조절서열은 TERT(telomere reverse transcriptase) 프로모터 서열을 추가적으로 포함한다.

TERT는 염색체 복제동안 텔로미어의 길이를 일정하게 유지하는데 관여하는 효소인 텔로머라제의 구성요소로서, 세포노화, 암, 세포불멸에 관여하는 것으로 알려졌다(Counter, C.M. et al. EMBO J. 11,1921-29(1992), Kim. N. W. et al. Science, 21:2011-5(1994), Harley, C. B. et al. Nature, 345:458-60(1990)).

텔로머라제의 활성은 사람의 경우 난소와 고환의 생식세포 및 임파구에서 관찰되나 그 외 정상 체세포에서는 관찰되지 않고 있다(Wright, W.E. et al. Dev. Genet. 18:173-9(1996)). 따라서 정상 체세포는 제한된 회수의 세포분열 후에는 텔로미어의 길이가 일정길이 이하로 감소되어 더 이상 분열하지 못하고 사멸된다(Yasumoto, S. et al. Oncogene. 3:433-9(1996)). 반면에, 암 진행 전단계인 양성 종양 세포 및 암세포에서는 텔로머라제의 활성이 증가된다(Broccoli, D. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 92:9082-6(1995). 난소암에서 텔로머라제의 활성 증가가 최초로 보고 된 이후, 혈액암, 위암, 폐암, 간암, 대장암, 뇌암, 전립선암, 두경부암, 유방암 등 거의 모든 인체 암에서 텔로머라제의 활성 증가가 관찰되고 있다(Counter, C.M. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 91:2900-4(1994)). 텔로머라제의 기능에 필수적인 역할을 하는 TERT의 발현은 텔로머라제의 활성과 관련되어 있으며, 최근에는 텔로머라제의 발현이 TERT 프로모터의 활성, 즉 TERT의 mRNA의 양에 따라 조절된다는 것이 밝혀졌으며, TERT의 활성을 조절하기 위한 최소의 프로모터의 크기는 181 bp이다. 본 발명의 유전자 전달체에서, TERT는 종양세포에 대한 특이성을 향상시키는 작용을 한다. 바람직하게는, 본 발명에서 이용하는 TERT 서열은 서열목록 제3서열의 뉴클레오타이드 서열이다.

본 발명의 보다 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 유전자 발현 조절서열은 재조합 아데노바이러스 벡터의 E1 영역에 삽입되며, 5’에서 3’방향으로 HRE 서열, E2F 프로모터 서열 및 TERT 프로모터 서열을 포함한다.

가장 바람직하게는, 상기 HRE 서열은 6번 반복되며, 상기 E2F 서열은 2번 반복된다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 본 발명의 유전자발현 조절서열; 및 (b) 상기 유전자발현 조절서열에 작동적으로 연결된(operatively linked) 발현시키고자 하는 목적 유전자를 포함하는 종양 특이적 발현이 개선된 유전자 전달체를 제공한다.

본 발명의 유전자발현 조절서열은 상술한 유전자발현 조절서열과 동일하므로, 과도한 중복을 피하기 위하여 그 기재를 생락한다.

본 명세서에서 용어 “작동적으로 결합된(operatively linked)”은 핵산 발현 조절서열(예: 프로모터, 시그널 서열, 또는 전사조절인자 결합 위치의 어레이)과 다른 핵산 서열사이의 기능적인 결합을 의미하며, 이에 의해 상기 조절서열은 상기 다른 핵산 서열의 전사 및/또는 해독을 조절하게 된다. 본 발명의 유전자발현 조절서열에 작동적으로 연결된 발현 대상의 유전자는 특별하게 제한되지 않는다. 예를 들어, 발현하고자 하는 유전자는 유전자 전달체의 지놈에서 유래된 유전자(예컨대, 아데노바이러스의 ElA 유전자) 또는 치료학적 트랜스 유전자(transgene)를 포함한다. 치료학적 트랜스 유전자는 아래에 상세하게 설명되어 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 유전자 전달체는 플라스미드, 재조합 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스(Adeno-associated viruses: AAV), 레트로바이러스, 렌티바이러스, 헤르페스 심플렉스 바이러스, 백시니아 바이러스, 폭스바이러스, 폴리머, 리포좀 또는 니오좀이다.

본 발명의 유전자발현 조절서열과 상기 유전자발현 조절서열에 작동적으로 결합된 전달하고자 하는 유전자 서열은 통상적인 유전자 치료에 이용되는 모든 유전자 전달체에 적용될 수 있으며, 바람직하게는 플라스미드, 아데노바이러스(Lockett LJ, et al., Clin. Cancer Res. 3:2075-2080(1997)), 아데노-관련바이러스(Lashford LS., et al., Gene Therapy Technologies, Applications and Regulations Ed. A. Meager (1999)), 레트로바이러스 (Gunzburg WH, et al., Gene Therapy Technologies, Applications and Regulations Ed. A. Meager, (1999)), 렌티바이러스(Wang G. et al., J. Clin. Invest. 104(11):R55-62(1999)), 헤르페스심플렉스 바이러스(Chamber R., et al., Proc. Natl . Acad . Sci USA 92:1411-1415(1995)), 백시니아 바이러스 (Puhlmann M. et al., Human Gene Therapy 10:649-657(1999)), 폭스바이러스 (GCE, NJL, Krupa M, Esteban M., The poxvirus vectors MVA and NYVAC as gene delivery systems for vaccination against infectious diseases and cancer Curr Gene Ther 8(2):97-120(2008)), 폴리머 (Hwang et al., In vitro and In vivo Transfection Efficiency of Human Osteoprotegerin Gene using Non-Viral Polymer Carriers., Korean J. Bone Metab . 13(2):119-128(2006)), 리포좀 (Methods in Molecular Biology, Vol 199, S.C. Basu and M. Basu (Eds.), Human Press 2002) 또는 니오좀에 적용될 수 있다. 가장 바람직하게는, 본 발명의 유전자 전달체는 재조합 아데노바이러스에 적용하여 제조된다.

ⅰ. 아데노바이러스

아데노바이러스는 중간 정도의 지놈 크기, 조작의 편의성, 높은 타이터, 광범위한 타깃세포 및 우수한 감염성 때문에 유전자 전달 벡터로서 많이 이용되고 있다. 지놈의 양 말단은 100-200 bp의 ITR (inverted terminal repeat)를 포함하며, 이는 DNA 복제 및 패키징에 필수적인 시스 엘리먼트이다. 지놈의 E1 영역(E1A 및 E1B)은 전사 및 숙주 세포 유전자의 전사를 조절하는 단백질을 코딩한다. E2 영역(E2A 및 E2B)은 바이러스 DNA 복제에 관여하는 단백질을 코딩한다. 현재 개발된 아데노바이러스 벡터 중에서, E1 영역이 결여된 복제 불능 아데노바이러스가 많이 이용되고 있다. 한편, E3 영역은 통상적인 아데노바이러스 벡터에서 제거되어 외래 유전자가 삽입되는 자리를 제공한다 (Thimmappaya, B. et al., Cell, 31:543-551(1982); 및 Riordan, J. R. et al., Science, 245:1066-1073(1989)). 따라서, 본 발명의 유전자발현 조절서열은 E1A 유전자의 프로모터 서열 위치에 삽입되어 E1A 유전자의 발현을 조절할 수 있다. 또한, 본 발명의 유전자발현 조절서열-발현 유전자 카세트는 결실된 E1 영역(E1A 영역 및/또는 E1B 영역, 바람직하게는 E1B 영역) 또는 E3 영역에 삽입되는 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 결실된 E1 영역에 삽입된다. 또한, 본 발명의 유전자발현 조절서열-발현 유전자 카세트는 결실된 E4 영역에도 삽입될 수 있다. 본 명세서에서 바이러스 지놈 서열과 관련하여 사용되는 용어, “결실”은 해당 서열이 완전히 결실된 것뿐만 아니라, 부분적으로 결실된 것도 포함하는 의미를 가진다.

또한, 아데노바이러스는 야생형 지놈의 약 105%까지 패킹할 수 있기 때문에, 약 2 kb를 추가적으로 패키징할 수 있다(Ghosh-Choudhury et al., EMBO J., 6:1733-1739(1987)). 따라서, 아데노바이러스에 삽입되는 상술한 외래 서열은 아데노바이러스의 지놈에 추가적으로 결합시킬 수도 있다.

아데노바이러스에 의해 운반되는 외래 유전자는 에피좀과 동일한 방식으로 복제되며, 이에 숙주세포에 대해 유전적독성이 매우 낮다. 따라서, 본 발명의 아데노바이러스 유전자 전달 시스템을 이용한 유전자 치료가 매우 안전할 것으로 판단된다.

ⅱ. 레트로바이러스

레트로바이러스는 자신의 유전자를 숙주의 지놈으로 삽입시키고, 대량의 외래 유전 물질을 운반할 수 있으며, 감염시킬 수 있는 세포의 스펙트럼이 넓기 때문에 유전자 전달 벡터로서 많이 이용되고 있다.

레트로바이러스 벡터를 구축하기 위하여, 운반하고자 하는 목적 뉴클레오타이드 서열은 레트로바이러스의 서열 대신에 레트로바이러스 지놈에 삽입되어 복제불능의 바이러스를 생산한다. 바이리온을 생산하기 위하여, gag, pol 및 env 유전자를 포함하지만 LTR(long terminal repeat)와 Ψ서열은 없는 패키징 세포주를 구축한다(Mann et al., Cell, 33:153-159(1983)). 운반하고자 하는 목적 뉴클레오타이드 서열, LTR 및 Ψ서열을 포함하는 재조합 플라스미드를 상기 세포주에 이입하면, Ψ서열은 재조합 플라스미드의 RNA 전사체의 생산을 가능하게 하며, 이 전사체는 바이러스로 패키징되고, 바이러스는 배지로 배출된다 (Nicolas and Rubinstein "Retroviral vectors," In: Vectors: A survey of molecular cloning vectors and their uses, Rodriguez and Denhardt (eds.), Stoneham: Butterworth, 494-513(1988)). 재조합 레트로바이러스를 함유하는 배지를 수집하고 농축하여 유전자 전달 시스템으로 이용한다.

2세대 레트로바이러스 벡터를 이용한 유전자 전달이 발표되었다. Kasaharaet al. Science, 266:1373-1376(1994))는 몰로니 뮤라인 류케미아 바이러스의 변이체를 제조하였고, 여기에서 EPO(erythropoietin) 서열을 엔벨로프 부위에 삽입하여 새로운 결합 특성을 갖는 키메릭 단백질을 생산하였다. 본 발명의 유전자 전달 시스템도 이와 같은 2세대 레트로바이러스 벡터의 구축 전략에 따라 제조할 수 있다.

ⅲ. AAV 벡터

아데노-관련 바이러스 (AAV)는 비분열 세포을 감염시킬 수 있고, 다양한 종류의 세포에 감염할 수 있는 능력을 갖고 있기 때문에 본 발명의 유전자 전달 시스템으로 적합하다. AAV 벡터의 제조 및 용도에 대한 상세한 설명은 미국 특허 제5,139,941 호 및 제 4,797,368 호에 상세하게 개시되어 있다. 유전자 전달 시스템으로서의 AAV에 대한 연구는 LaFace et al, Viology, 162:483486(1988), Zhou et al., Exp. Hematol. (NY), 21:928-933(1993), Walsh et al, J. Clin . Invest ., 94:1440-1448(1994) 및 Flotte et al., Gene Therapy, 2:29-37(1995)에 개시되어 있다. 최근에, AAV 벡터는 낭포성 섬유증의 치료제로서 임상 I을 실시하고 있다.

전형적으로, AAV 바이러스는 두 개의 AAV 말단 리피트가 옆에 위치되어 있는 목적의 유전자 서열(릴랙신 유전자 및 운반하고자 하는 목적 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 플라스미드 (McLaughlin et al., J. Virol., 62:1963-1973(1988); 및 Samulski et al., J. Virol ., 63:3822-3828(1989)) 및 말단 리피트가 없는 야생형 AAV 코딩 서열을 포함하는 발현 플라스미드(McCarty et al., J. Virol., 65:2936-2945( 1991))를 동시 형질전환시켜 제조된다.

ⅳ. 다른 바이러스 벡터

다른 바이러스 벡터들도 본 발명의 유전자 전달 시스템으로 이용할 수 있다. 배시니아 바이러스(Puhlmann M. et al., Human Gene Therapy 10:649-657(1999); Ridgeway, "Mammalian expression vectors," In: Vectors: A survey of molecular cloning vectors and their uses. Rodriguez and Denhardt, eds. Stoneham: Butterworth, 467-492(1988); Baichwal and Sugden, "Vectors for gene transfer derived from animal DNA viruses: Transient and stable expression of transferred genes," In: Kucherlapati R, ed. Gene transfer. New York: Plenum Press, 117-148( 1986) 및 Coupar et al., Gene, 68:1-10(1988)), 렌티바이러스(Wang G. et al., J. Clin . Invest. 104(11):R55-62(1999)) 또는 헤르페스 심플렉스 바이러스(Chamber R., et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 92:1411-1415(1995)), 폭스바이러스(GCE, NJL, Krupa M, Esteban M., The poxvirus vectors MVA and NYVAC as gene delivery systems for vaccination against infectious diseases and cancer Curr Gene Ther 8(2):97-120(2008))로부터 유래된 벡터들도, 목적 뉴클레오타이드 서열을 세포내로 운반할 수 있는 운반 시스템으로 이용할 수 있다.

ⅴ. 폴리머

비바이러스성 유전자 전달체로서 폭넓게 사용되는 폴리머계 전달체로는 젤라틴, 키토산(Carreno GB, Duncan R. Evaluation of the biological properties of soluble chitosan and chitosan microspheres. Int J Pharm 148:231-240(1997)) PLL(poly-LLysine)(Maruyama A, Ishihara T, Kim JS, Kim SW, Akaike T. Nanoparticle DNA carrier with poly (L-lysine) grafted polysaccharide copolymer and poly (D,Llactide). Bioconjugate Chem 8:735-742(1997)) 및 PEI(polyethyleneamine)(Abdallah B, Hassan A, Benoist C, Goula D, Behr JP, Demeneix BA. A powerful nonviral vector for in vivo gene transfer into the adult mammalian brain: Polyethyleneimine. Human Gene Ther 7:1947-1954(1996)) 등이 이용되고 있다. 폴리머계 유전자 전달체들의 장점은 면역반응과 급성독성의 발현율이 낮고 제조법이 간단하며 대량생산이 가능하다는 점이다.

ⅵ. 리포좀 및 니오좀

리포좀은 수상에 분산된 인지질에 의해 자동적으로 형성된다. 외래 DNA 분자를 리포좀으로 성공적으로 세포 내로 운반한 예는 Nicolau 및 Sene, Biochim. Biophys. Acta, 721:185-190(1982) 및 Nicolau et al., Methods Enzymol., 149:157-176(1987)에 개시되어 있다. 한편, 리포좀을 이용한 동물세포의 형질전환에 가장 많이 이용되는 시약으로는 Lipofectamine(Gibco BRL)이 있다. 운반하고자 하는 목적 뉴클레오타이드 서열을 내포한 리포좀은 엔도사이토시스, 세포 표면에로의 흡착 또는 플라즈마 세포막과의 융합 등의 기전을 통해 세포와 상호작용하여 세포내로 운반하고자 하는 목적 뉴클레오타이드 서열을 운반한다.

리포좀이 인지질을 이용하여 만들어 지는 것에 반하여 니오좀(niosome)은 사용하고 비-이온성 계면활성제(non-ionic surfactant) 및 콜레스테롤(cholesterol)의 혼합으로 구성된 이중막 수송체로 극성 및 비극성 물질을 봉입할 수 있고, 삼투압적으로 활성이 있으며, 인지질 등에 의한 지질미립자의 운반체인 리포좀에 비하여 안정하고, 또한 제조시 사용되는 계면활성제가 보관 및 취급 시에 특별한 조건이 필요하지 않다는 장점을 가진다.

한편, 상술한 본 발명의 유전자 전달 시스템을 세포내로 도입하는 방법은 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 실시될 수 있다.

본 발명에서, 유전자 전달 시스템이 바이러스 벡터에 기초하여 제작된 경우에는, 당업계에 공지된 바이러스 감염 방법에 따라 실시된다. 바이러스 벡터를 이용한 숙주 세포의 감염은 상술한 인용문헌에 기재되어 있다.

본 발명에서 유전자 전달 시스템이 내이키드 (naked) 재조합 DNA 분자 또는 플라스미드인 경우에는, 미세 주입법 (Capecchi, M.R., Cell, 22:479(1980); 및 Harland와 Weintraub, J. Cell Biol. 101:1094-1099(1985)), 칼슘 포스페이트 침전법 (Graham, F.L. et al., Virology, 52:456(1973); 및 Chen과 Okayama, Mol. Cell. Biol. 7:2745-2752(1987)), 전기 천공법 (Neumann, E. et al., EMBO J., 1:841(1982); 및 Tur-Kaspa et al., Mol. Cell Biol., 6:716-718(1986)), 리포좀-매개 형질감염법 (Wong, T.K. et al., Gene, 10:87(1980); Nicolau 및 Sene, Biochim. Biophys. Acta, 721:185-190(1982); 및 Nicolau et al., Methods Enzymol., 149:157-176(1987)), DEAE-덱스트란 처리법 (Gopal, Mol. Cell Biol., 5:1188-1190(1985)), 및 유전자 밤바드먼트 (Yang et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 87:9568-9572(1990)) 방법에 의해 유전자를 세포내로 이입시킬 수 있다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음을 포함하는 암세포 특이적 살상능이 개선된 재조합 아데노바이러스를 제공한다:

(a) 아데노바이러스의 ITR(inverted terminal repeat) 서열;

(b) HRE(hypoxia-response elements) 인핸서 서열; 및 (ⅱ) E2F 프로모터 서열을 포함하고 상기 E2F 프로모터는 상기 HRE 인핸서 서열의 다운스트림에 위치하며 상기 HRE 인핸서 서열 및 E2F 프로모터는 협동적으로 동일한 유전자의 발현을 촉진하는 것을 특징으로 하는 유전자발현 조절서열; 그리고,

(c) 상기 유전자발현 조절서열에 작동적으로 연결된(operatively linked) 종양 억제인자 유전자, 항원성 유전자, 세포독성 유전자, 세포증식 억제 유전자, 세포사멸 유전자 및 항-신생 혈관 생성 유전자로 구성된 군으로부터 선택되는 치료학적 트랜스 유전자.

본 발명의 유전자발현 조절서열은 상술한 유전자 전달체에서 이용되는 유전자발현 조절서열과 동일하므로, 과도한 중복을 피하기 위하여 그 기재를 생락한다.

본 발명의 유전자발현 조절서열은 재조합 아데노바이러스의 E1A 유전자의 업스트림, 결실된 E3 유전자 영역 또는 E1A 유전자의 업스트림과 결실된 E3 유전자 영역 모두에 위치할 수 있다.

본 발명의 유전자발현 조절서열이 E1A 유전자의 업스트림에 위치하는 경우, 즉 E1A 유전자에 본 발명의 유전자발현 조절서열이 작동적으로 연결된 경우(HRE-E2F-TERT-E1A), 재조합 아데노바이러스의 복제가 본 발명의 유전자발현 조절서열에 의해 조절된다. 본 발명의 유전자발현 조절서열이 결실된 E3 유전자 영역에 위치하는 경우에는, “유전자발현 조절서열-트랜스 유전자-폴리 A" 발현카세트 형태로 결실된 E3유전자 영역에 삽입될 수 있다.

본 발명의 명세서에서 용어 “치료학적 트랜스 유전자(therapeutic transgene)”는 암세포 내에서 발현되어 치료학적 효과를 나타내는 뉴클레오타이드 서열을 의미한다.

본 발명의 명세서에서 용어“종양 억제인자 유전자(tumor suppressor gene)”는 표적 세포내에서 발현되어 종양 표현형을 억제할 수 있거나 세포사멸을 유도할 수 있는 뉴클레오타이드 서열을 의미한다. 본 발명의 실시에 유용한 종양 억제 인자 유전자에는, p53 유전자, APC 유전자, DPC-4/Smad4 유전자, BRCA-1 유전자, BRCA-2 유전자, WT-1 유전자, 망막아세포종 유전자 (Lee et al., Nature, 1987, 329,642), MMAC-1 유전자, 선종양 폴립증 코일 단백질(adenomatouspolyposis coil protein)(미국특허공보 5,783,666호), 결손된 결장 종양(DCC) 유전자, MMSC-2 유전자, NF-1 유전자, 염색체 3p21.3에 위치한 비인후 종양 억제인자 유전자 (Cheng et al. Proc.Nat.Acad.Sci, 95:3042-3047 (1998)), MTS1 유전자, CDK4 유전자, NF-1 유전자, NF-2 유전자 및 VHL 유전자가 포함된다.

본 발명의 명세서에서 용어“항원성 유전자(antigenic gene)”는 표적 세포 내에서 발현되어 면역 시스템에서 인식할 수 있는 세포 표면 항원성 단백질을 생산하는 뉴클레오타이드 서열을 의미한다. 이러한 항원성 유전자의 예에는 암태아성항원 (carcinoembryonic antigen, CEA), HER-2, PSA(prostate specific antigen) 및 p53(Levine, A., 국제특허출원공개 WO94/02167호)이 포함된다. 면역 시스템이 용이하게 인식하도록 하기 위해, 상기 항원성 유전자를 MHC 제I형 항원에 결합시킬 수 있다.

본 발명의 명세서에서 용어 ‘세포독성 유전자(cytotoxic gene)’는 세포내에서 발현되어 독성 효과를 나타내는 뉴클레오타이드 서열을 의미한다. 이러한 세포독성 유전자의 예에는 슈도모나스 외독소(exotoxin), 리신 독소, 디프테리아 독소, CD(cytosine deaminase), TK(thymidine kinase) 등을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열이 포함된다.

본 발명의 명세서에서 용어 ‘세포증식 억제 유전자(cytostatic gene)’ 세포 내에서 발현되어 세포 주기 도중에 세포 주기를 정지시키는 뉴클레오타이드 서열을 의미한다. 이러한 세포증식 억제 유전자의 예에는 p21, 망막아세포종 유전자, E2F-Rb 융합 단백질 유전자, 사이클린-종속성 카이네이즈 억제인자를 코딩하는 유전자(예를 들면, p16, p15, p18 및 p19), 성장 중지 특이성 호메오박스(growth arrest specific homeobox: GAX) 유전자(국제특허출원공개 WO 97/16459호 및 WO96/30385호) 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 명세서에서 용어“세포사멸 유전자(apoptotic gene)”는 발현되어 프로그램된 세포 소멸을 유도하는 뉴클레오타이드 서열을 의미한다. 이러한 친-세포사멸 유전자의 예에는 p53, 아데노바이러스 E3-11.6K (Ad2 및 Ad5에서 유래) 또는 아데노바이러스 E3-10.5K (Ad에서 유래), 아데노바이러스 E4 유전자, p53 경로 유전자 및 카스파제를 코딩하는 유전자가 포함된다.

본 발명의 명세서에서 용어“항-신생혈관생성 유전자(anti-angiogenic gene)”는 발현되어 항-신생혈관 생성 인자를 세포밖으로 방출하는 뉴클레오타이드 서열을 의미한다. 항-신생혈관 생성 인자에는, 안지오스타틴, Tie 2 (PNAS, 95:8795-800 (1998))와 같은 혈관 내피 성장 인자 (VEGF)의 억제 인자, 엔도스타틴 등이 포함된다.

재조합 아데노바이러스에 삽입되는 트랜스 유전자는 프로모터-트랜스 유전자-폴리 A 서열의 발현 카세트로 삽입되는 것이 바람직하다. 이 경우, 상기 프로모터로서, 본 발명의 유전자발현 조절서열(HRE-TERT, HRE-E2F, HRE-TERT-E2F 또는 HRE-E2F-TERT) 또는 통상적인 프로모터를 이용할 수 있다. 트랜스 유전자에 결합되는 통상적인 프로모터는, 바람직하게는 동물세포, 보다 바람직하게는 포유동물 세포에서 작동하여 트랜스 유전자의 전사를 조절할 수 있는 것으로서, 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터 및 포유동물 세포의 지놈으로부터 유래된 프로모터를 포함하며, 예컨대, U6 프로모터, H1 프로모터, CMV (cytomegalo virus) 프로모터, 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, HSV의 tk 프로모터, RSV 프로모터, EF1 알파 프로모터, 메탈로티오닌 프로모터, 베타-액틴 프로모터, 인간 IL-2 유전자의 프로모터, 인간 IFN 유전자의 프로모터, 인간 IL-4 유전자의 프로모터, 인간 림포톡신 유전자의 프로모터, 인간 GM-CSF 유전자의 프로모터, inducible 프로모터, 암세포 특이적 프로모터 (예컨대, TERT 프로모터, PSA 프로모터, PSMA 프로모터, CEA프로모터, E2F 프로모터 및 AFP 프로모터) 및 조직 특이적 프로모터 (예컨대, 알부민 프로모터)를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

트랜스 유전자를 발현시키기 위한 발현 컨스트럭트에서 트랜스 유전자의 다운스트림에 폴리아데닐화 서열이 결합되어 있는 것이 바람직하다. 상기 폴리아네닐화 서열은, 소성장 호르몬 터미네이터(Gimmi, E. R., et al., Nucleic Acids Res. 17:6983-6998(1989)), SV40 유래 폴리 아데닐화 서열(Schek, N, et al., Mol. Cell Biol. 12:5386-5393(1992)), HIV-1 polyA(Klasens, B. I. F., et al., Nucleic Acids Res. 26:1870-1876(1998)), β-글로빈 polyA(Gil, A., et al, Cell 49:399-406(1987)), HSV TK polyA(Cole, C. N. and T. P. Stacy, Mol. Cell. Biol. 5:2104-2113(1985)) 또는 폴리오마바이러스 polyA(Batt, D. B and G. G. Carmichael, Mol. Cell. Biol. 15:4783-4790(1995))를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

가장 바람직하게는, 본 발명의 치료학적 트랜스 유전자는 LK8(Apolipoprotein Klingle 8) 유전자, CD(cytosine kinase) 유전자, TK(thymidine kinase) 유전자, 릴렉신(relaxin), 및 데코린(decorin) 유전자로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 또는 둘 이상의 유전자이다.

데코린은 TGF(tumor growth factor)-β의 활성을 억제시킴으로써 콜라겐의 섬유화를 막고 세포외 기질의 구성(matrix assembly)에 관여하고, 종양 세포 성장을 억제하여 종양의 형성과 성장에 길항제로 작용한다

LK8(Apolipoprotein Klingle 8)은 혈관 내피세포의 증식을 저해함으로써 종양의 성장 및 증식을 저해한다고 알려져 있다.

티미딘 카이네이즈(TK)는 티미딘 뿐만 아니라 뉴클레오타이드 유사체이면서 항바이러스 제제로 이용되는 갠사이클로비어도 인산화시킬 수 있으며, 인산화된 갠사이클로비어-트리포스페이트는 DNA 합성시 DNA 사슬에 삽입되어 DNA 사슬 형성을 중단시켜 결과적으로 DNA 합성을 억제한다. TK가 이입되지 않은 암세포에도 갠사이클로비어-트리포스페이트가 들어가 세포사를 일으켜 bystander effect를 유도할 수 있으며, 암세포 살상에 의한 암세포 특이적 면역반응이 유도됨으로써도 bystander effect를 유도할 수 있다.

CD(cytosine deaminase)는 독성이 없는 5-FC(5-fluorocytosine)을 강력한 세포독성을 갖는 5-FU(5-fluorouracil)로 전환시켜 암세포 살상효과가 있음이 보고되었다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 상기의 재조합 아데노바이러스의 치료학적 유효량; 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 항종양 조성물을 제공한다.

본 발명의 조성물에 포함되는 재조합 아데노바이러스는 상술한 바와 같이, 다양한 종양 세포에 대하여 살상 효능을 나타내므로, 본 발명의 약제학적 조성물은 종양과 관련된 다양한 질병 또는 질환, 예컨대 위암, 폐암, 유방암, 난소암, 간암, 기관지암, 비인두암, 후두암, 췌장암, 방광암, 결장암 및 자궁경부암 등의 치료에 이용될 수 있다. 본 명세서에서 용어 “치료”는 (ⅰ) 종양 세포 형성의 예방; (ⅱ) 종양 세포의 제거에 따른 종양과 관련된 질병 또는 질환의 억제; 및 (ⅲ) 종양 세포의 제거에 따른 종양과 관련된 질병 또는 질환의 경감을 의미한다. 따라서, 본 명세서에서 용어“치료학적 유효량”은 상기한 약리학적 효과를 달성하는 데 충분한 양을 의미한다.

본 발명의 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 비경구 투여가 바람직하고, 예컨대 정맥내 투여, 복강내 투여, 근육내 투여, 피하 투여 또는 국부 투여를 이용하여 투여할 수 있다. 난소암에서 복강내로 투여하는 경우 및 간암에서 문맥으로 투여하는 경우에는 주입 방법으로 투여할 수 있고, 유방암의 경우에는 종양 매스에 직접 주사하여 투여할 수 있으며, 결장암의 경우에는 관장으로 직접 주사하여 투여할 수 있고, 방광암의 경우에는 카테테르 내로 직접 주사하여 투여할 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 질병 증상의 정도, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 목적하는 치료에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다. 일반적으로, 본 발명의 약제학적 조성물은 1 × 10⁵- 1 × 10¹⁵ pfu/㎖의 재조합 아데노바이러스를 포함하며, 통상적으로 1 × 10¹⁰ pfu를 이틀에 한번씩 2주 동안 주사한다.

본 발명의 약제학적 조성물은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화 됨으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 단독의 요법으로 이용될 수 있으나, 다른 통상적인 화학 요법 또는 방사 요법과 함께 이용될 수도 있으며, 이러한 병행 요법을 실시하는 경우에는 보다 효과적으로 암 치료를 할 수 있다. 본 발명의 조성물과 함께 이용될 수 있는 화학 요법제는 시스플라틴(cisplatin), 카르보플라틴(carboplatin), 프로카르바진(procarbazine), 메클로레타민(mechlorethamine), 시클로포스파미드(cyclophosphamide), 이포스파미드(ifosfamide), 멜팔(melphalan), 클로라부실(chlorambucil), 비술판(bisulfan), 니트로소우레아(nitrosourea), 디악티노마이신(dactinomycin), 다우노루비신(daunorubicin), 독소루비신(doxorubicin), 블레오마이신(bleomycin), 플리코마이신(plicomycin), 미토마이신(mitomycin), 에토포시드(etoposide), 탁목시펜(tamoxifen), 택솔(taxol), 트랜스라티눔(transplatinum), 5-플루오로우라실(5-fluorouracil), 빈크리스틴(vincristin), 빈블라스틴(vinblastin) 및 메토트렉세이트(methotrexate) 등을 포함한다. 본 발명의 조성물과 함께 이용될 수 있는 방사 요법은 X-선 조사 및 γ-선 조사 등이다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물은 유효성분으로서 GCV(ganciclovir)를 추가적으로 포함한다.

GCV는 CMV(cytomegalovirus) 감염의 예방 및 치료를 위한 항바이러스제로 사용되는 퓨린계 화합물로서, HSV-TK에 의하여 인산화됨으로써 활성화된 갠싸이클로비어 트리포스페이트 형태로 전환된다. 이러한 인산화된 GCV는 뉴클레오타이드 유사체로서 작용하여 DNA 합성시 DNA 사슬에 삽입됨으로써 DNA합성을 억제하게 된다. 따라서, 본 발명의 조성물을 GCV와 함께 병용투여할 경우, HSV-TK를 발현하는 종양 특이적 바이러스에 감염된 암세포에서만 GCV의 인산화가 유도되어 암세포를 사멸시킬 수 있게 된다. 또한 HSV-TK가 이입되지 않은 암세포에서도 인산화된 GCV가 세포 사이의 간극 결합(gap junction)을 통해 들어가 세포사를 일으키는 bystander effect를 통해 극대화된 세포살상을 유도할 수 있으므로 매우 극대화된 항종양 활성을 가지는 항암 조성물로 유용하게 이용될 수 있다.

본 발명의 조성물은 상술한 유전자 전달체와 GCV를 동시에 포함함으로서 하나의 제제로 구성될 수도 있으며, 또한 유전자 전달체 조성물과 GCV가 각각 별도의 제제로써 병용투여될 수도 있다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(a) 본 발명은 HRE, E2F 및 TERT의 조합으로 이루어진 유전자발현 조절서열 및 선택적 종양세포 살상능이 크게 개선된 유전자 전달체를 제공한다.

(b) 본 발명은 특히 저산조 조건에서 더욱 향상된 항종양 효과를 나타내며, TK 유전자의 삽입 및 GCV의 병용투여에 의하여 현재 암의 유전자 치료요법의 가장 큰 제한인 모든 암세포에 치료유전자를 이입할 수 없다는 결점을 크게 개선한다.

도 1은 HRE 6 copy와 E2F 프로모터가 합체된 전사조절부위에 의해 복제가 조절되는 종양 선택적 살상 아데노바이러스인 E-Rd19, EE-Rd19, HE-Rd19, HEE-Rd19의 모식도를 나타낸 그림이다.
도 2a-b는 E2F 프로모터가 재조합된 아데노바이러스들의 암세포 선택적 살상능 비교한 결과를 나타낸 그림이다.
도 3은 MTT 분석을 통해 E2F 프로모터가 재조합된 아데노바이러스들의 암세포 선택적 살상능을 비교한 결과를 나타낸 그림이다.
도 4는 E2F 프로모터가 재조합 되고 LK8를 발현하는 종양 선택적 살상 아데노바이러스 HEE-Rd19-K35/LK의 모식도를 나타낸 그림이다.
도 5는 프로모터가 재조합 되고 LK8를 발현하는 종양 선택적 살상 아데노바이러스 HEE-Rd19-K35/LK의 암세포살상 효과를 나타낸 그림이다.
도 6은 MTT 분석을 통해 E2F 프로모터가 재조합 되고 LK8를 발현하는 종양 선택적 살상 아데노바이러스인 HEE-Rd19-K35/LK의 암세포 살상능의 검증결과를 나타낸 그림이다.
도 7은 HEE-Rd19-K35/LK 종양 선택적 복제 가능 아데노바이러스의 생체내 항종양 효과를 검증하기 위해, 인체 폐암 세포주인 A549 세포주를 누드 마우스의 복부 피하에 주사하고 형성된 종양에 1 x 10¹⁰ VP의 Rd19 또는 HEE-Rd19-K35/LK 아데노바이러스를 음성 대조군인 PBS와 함께 이틀 간격으로 3번 종양 내에 투여한 후 종양의 성장을 관찰한 결과를 나타낸 그림이다.
도 8은 HRE6, E2F, 그리고 TERT가 재조합 된 프로모터에 의해 GFP 발현이 조절되는 복제 불능 아데노바이러스들인 dE1-HmTE-k35/GFP와 dE1-HEmT-k35/GFP 모식도를 나타낸 그림이다.
도 9a-b는 여러 가지 암세포주들에서 dE1-HmTE-k35/GFP와 dE1-HEmT-k35/GFP 아데노바이러스의 유전자 전달효율 비교한 결과를 나타낸 그림이다(박스안의 숫자는 평균 형광 세기이다).
도 10은 CMV 프로모터 또는 HEmT 재조합 프로모터에 의한 GFP 발현능을 비교한 결과를 나타낸 그림이다.
도 11은 HRE 6 copy와 E2F, 그리고 TERT가 재조합된 프로모터에 의해 복제가 조절되는 종양 선택적 살상 아데노바이러스들인 HEmT-Rd19-k35와 HmTE-Rd19-k35의 모식도를 나타낸 그림이다.
도 12는 HEmT 프로모터에 의해 복제가 조절되고 데코린을 발현하는 종양 선택적 살상 아데노바이러스인 HEmT-Rd19-k35/DCN의 모식도를 나타낸 그림이다.
도 13은 데코린과 CDTK를 발현하는 종양 선택적 살상 아데노바이러스의 모식도를 나타낸 그림이다.
도 14는 HEmT-Rd19-k35/DCN 종양 선택적 살상 아데노바이러스에 의한 데코린 발현 검증결과를 나타낸 그림이다.
도 15는 HEmT-Rd19-K35/DCN 종양 선택적 살상 아데노바이러스의 암세포 선택적 살상능의 비교 검증결과를 나타낸 그림이다. a는 아데노바이러스에 감염된 뇌암 세포주, b는 아데노바이러스에 감염된 두경부암 세포주, c는 아데노바이러스에 감염된 그 외 여러 가지 암세포주, d는 아데노바이러스에 감염된 정상세포주이다.
도 16a-b는 데코린을 발현하는 종양 선택적 살상 아데노바이러스인 Rd19-k35/DCN과 HEmT-Rd19-k35/DCN의 암세포 살상능을 비교 검증한 결과를 나타낸 그림이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

E-Rd19, EE-Rd19, HE-Rd19 및 HEE-Rd19벡터의 제작

E2F 프로모터 2 copy에 의해 아데노바이러스의 종양 선택적 살상능이 더욱 향상된 아데노바이러스의 제작을 위해, pSP72-E2F 클로닝 벡터에서 SalI/NheI으로 E2F 프로모터 DNA를 잘라낸 뒤 p△E1sp1B-E2F 클로닝 벡터의 XhoI/BamHI 위치에 삽입하여 p△E1sp1B-E2F-E2F 벡터를 만들고, 이 벡터의 EcoRI/BglII 부위로 EcoRI/BamHI으로 잘라낸 Rb7△19 DNA를 서브클로닝하여 E2F 프로모터 2 copy를 가진 p△E1sp1B-E2F-E2F-Rb7△19 아데노바이러스 E1 셔틀벡터를 제작하였다. 제작된 p△E1sp1B-E2F-E2F-Rb7△19 셔틀벡터를 아데노바이러스 토탈 벡터인 dl324 Bst의 E1 부분에 상동 재조합시켜 종양 선택적 살상 아데노바이러스인 EE-Rd19를 제작하였다.

또한, 저산소증의 종양에서 좀 더 활성을 가지는 종양 선택적 살상 아데노바이러스를 개발하기 위하여, HRE 6 copy와 E2F 프로모터를 합체시키고, 합체된 프로모터에 의해 복제가 조절되는 종양 선택적 살상 아데노바이러스를 제작하였다. 먼저, HRE 6 copy와 E2F 프로모터가 합체된 E1 아데노바이러스 셔틀벡터를 제작하기 위하여, E1 셔틀벡터인 p△E1sp1A의 XhoI 부위에 pSP 72-HRE6를 SalI/XhoI으로 절단하여 얻은 HRE 6 copy DNA를 삽입하여 p△E1sp1A-HRE6 아데노바이러스 E1 셔틀벡터를 제작하였다. 제작된 p△E1sp1A-HRE6 아데노바이러스 E1 셔틀벡터의 EcoRI/BglII 부위에 EcoRI/BamHI으로 잘라낸 Rb7△19 DNA를 삽입하여 p△E1sp1A-HRE6-Rb7△19를 제작하였다. 마지막으로 p△E1sp1A-HRE6-Rb7△19의 XbaI/EcoRV 부위에 NheI-EcoRV로 잘라낸 E2F DNA를 서브클로닝하여 HRE 6 copy와 E2F 프로모터가 합체된 프로모터를 가진 E1 셔틀벡터인 p△E1sp1A-HRE6-E2F-Rb7△19를 제작하였다. 제작된 p△E1sp1A-HRE6-E2F-Rb7△19 아데노바이러스 E1 셔틀벡터를 아데노바이러스 토탈벡터인 dl324 Bst의 E1 부분에 상동 재조합시켜 종양 선택적 살상 아데노바이러스인 HE-Rd19를 제작 완료하였다.

아울러 E2F 프로모터 2 copy의 프로모터와 HRE6를 동시에 합체함으로 E2F 프로모터 2 copy에 의해 더욱 향상된 종양 선택적 살상능과 함께 저산소증의 종양에서 활성을 더욱 증가시킨 보다 개선된 종양 선택적 살상 아데노바이러스를 제작하고자, pSP72-E2F 클로닝 벡터에서 SalI/NheI으로 E2F 프로모터를 잘라낸 뒤 p△E1sp1B-E2F 클로닝 벡터의 XhoI/BamHI 위치에 삽입하여 p△E1sp1B-E2F-E2F 벡터를 만들고, p△E1sp1A-HRE6을 EcoRI-XbaI 제한효소로 자르고, p△E1sp1B-E2F-E2F를 EcoRI-NheI 제한효소로 자른 뒤 라이게이션하여 p△E1sp1B-HRE6-E2F-E2F를 제작하였다. 이렇게 제작된 E1 셔틀벡터를 아데노바이러스 토탈벡터인 dl324 Bst의 E1 부분에 상동 재조합시켜 종양 선택적 살상 아데노바이러스인 HEE-Rd19를 제작하였다.

E-Rd19, EE-Rd19, HE-Rd19 및 HEE-Rd19 프로HXJ를 가지는 종양 선택적 살상 아데노바이러스의 암세포 살상능 검증-MTT 분석

상기 제작된 E-Rd19, EE-Rd19, 그리고 HEE-Rd19 종양 선택적 살상 아데노바이러스의 암세포 특이적 살상능을 검증하기 위해서, 각각의 바이러스들을 여러 농도의 역가로 여러 종류의 암세포들과 BJ와 MRC5 같은 정상 세포들에 감염시킨 후 세포 살상 정도를 비교 관찰하였다. 도 2에서 볼 수 있듯이, HRE-E2F-E2F 프로모터에 의해 복제가 조절되는 종양 선택적 살상 아데노바이러스(HEE-Rd19)의 암세포 살상능은 E2F, HRE-E2F 또는 E2F-E2F에 의해 복제가 조절되는 종양 선택적 살상 아데노바이러스들(E-Rd19, HE-Rd19, EE-Rd19) 보다 우수한 암세포 살상력을 나타냄을 확인하였고, 특히 본 발명에 사용된 모든 암 세포주들에서 재조합된 HRE-E2F-E2F 프로모터에 의해 복제가 조절되는 종양 선택적 살상 아데노바이러스(HEE-Rd19)의 암세포 살상능이 대조군인 Rd19 또는 야생형 아데노바이러스(XC)와 비교하여 유사하거나 보다 향상된 것을 관찰할 수 있는 것에 반해, 정상 세포주들에서는 야생형 아데노바이러스에 비해 세포 살상력이 감소함을 확인할 수 있어, 암세포 특이성도 우수함을 확인하였다. 암세포 살상능을 보다 정량화하기 위한 MTT 분석결과에서도, 재조합된 HRE-E2F-E2F 프로모터에 의해 복제가 조절되는 종양 선택적 살상 아데노바이러스(HEE-Rd19)의 암세포 살상능이 대조군인 Ad-Rb7△19 또는 야생형 아데노바이러스와 비교하여 유사하거나 보다 향상되었음을 확인하였고, HEE-Rd19의 암세포 살상능이 저산소 조건에서 HRE에 의해 정상조건에서보다 암세포 살상능이 더욱 증가되었음을 확인하였다(도 3) 이와 유사하게, HRE6가 조합된 HE-Rd19의 암세포 살상능이 E-Rd19에 비해 저산소증 상태에서 증가하는 것을 확인할 수 있어, 저산소증 상태에서 HRE6가 인핸서로 작용함을 알 수 있었다.

E2F 프로모터가 재조합 되고 LK8을 발현하는 종양 선택적 살상 아데노바이러스의 제작

혈관 내피세포의 증식을 저해하는 LK8이 삽입된 E1 셔틀벡터를 제작하기 위하여, pcDNA에 삽입되어 있는 LK8 유전자를 NheI/XhoI으로 잘라낸 뒤 NheI/SalI을 처리한 p△E1sp1A-HRE-E2F-E2F-Rb7△19로 삽입하여 E1 아데노바이러스 셔틀벡터 p△E1sp1A-LK8-HRE-E2F-E2F-Rb7△19를 제작하였고, 아데노바이러스 토털벡터인 dl324-35K의 E1 부분을 BstBI 제한 효소로 자른 뒤 XmnI으로 절단한 LK8을 발현하는 E1 셔틀벡터 p△E1sp1A-LK8-HRE-E2F-E2F-Rb7△19를 상동 재조합하여 E1에 LK8을 발현하는 종양 선택적 살상 아데노바이러스인 HEE-Rd19-K35/LK를 제작하였다(도 4). 제작된 아데노바이러스는 A549 세포주에서 증식시켜 제한역가분석(limiting titeration assay)으로 생산된 아데노바이러스의 역가(plaque forming unit; PFU)를 산출하였다(도 4).

E2F 프로모터가 재조합 되고 LK8를 발현하는 종양 선택적 살상 아데노바이러스인 HEE-Rd19-K35/LK의 암세포 살상능 검증

LK8을 발현하는 재조합된 E2F 프로모터에 의해 복제가 조절되는 아데노바이러스인 HEE-Rd19-K35/LK의 암세포 살상능을 검증하기 위해서, 각각의 바이러스를 여러 농도의 역가로 암세포들에 감염시킨 후 암세포 살상 정도를 비교 관찰하였(도 5). 도 5에서 볼 수 있듯이, HEE-Rd19-K35/LK의 암세포 살상능력은 대조군인 Rd19 또는 야생형 아데노바이러스인 XC와 비교하여 매우 향상된 것을 관찰할 수 있었다. 또한, HEE-Rd19-K35/LK의 암세포살상 효과를 보다 정량화하기 위해 MTT 분석을 수행한 결과, 여러 종류의 인체 폐암 세포주들(A549, H358, H2009, H596, H2172, HCC827)에 음성 대조군인 복제불능 아데노바이러스인 dE1, 파이버를 치환하지 않은 대조군 복제가능 아데노바이러스인 Rd19, 변형된 E2F 프로모터에 의해 복제가 조절되고 아데노바이러스 타입 35의 파이버로 치환된 종양 선택적 살상 아데노바이러스인 HEE-Rd19-K35/LK 바이러스를 0.1-0.5 MOI 역가로 감염시킨 뒤, 시간대별로 살아남은 세포의 생존률을 MTT 분석을 통해 측정하였다(도 6). 도 6에서 보는 바와 같이, 본 실험에 이용된 모든 폐암 세포주들에서 대조군 바이러스인 Rd19에 비해, HEE-Rd19-K35/LK의 세포 살상능이 증가한 것을 관찰할 수 있었다. 특히, H322 세포주에서는 파이버가 치환되지 않은 대조군 바이러스인 Rd19가 아데노바이러스 타입 35의 파이버로 치환된 종양 선택적 살상 아데노바이러스인 HEE-Rd19-K35/LK와 유사한 바이러스 복제능과 암세포 살상능을 확인하였으며, 이러한 결과는 H322가 아데노바이러스 세포 수용체인 CAR(Coxsackie and Adenovirus Receptor)의 발현이 높고, 타입 35 파이버의 리셉터인 CD46의 발현이 낮은 것과 일치하는 결과이다. 상기의 결과를 요약해 볼 때, 본 연구에서 제작한 변형된 E2F 프로모터에 의해 복제가 조절 되고 아데노바이러스 타입 35 파이버로 치환한 개선된 종양 선택적 살상 아데노바이러스인 HEE-Rd19-K35/LK는 프로모터의 재조합과 파이버의 치환으로 인한 암세포 감염능이 증가되고, 이로 인하여 효과적인 암세포 살상능을 유도함을 검증할 수 있었다.

E2F 프로모터가 재조합 되고 LK8를 발현하는 종양 선택적 살상 아데노바이러스인 HEE-Rd19-K35/LK의 항종양 효과 검증

HEE-Rd19-K35/LK 종양 선택적 복제 가능 아데노바이러스의 생체내 항종양 효과를 검증하기 위해, 인체 폐암 세포주인 A549 세포주를 누드 마우스의 복부 피하에 주사하고 형성된 종양에 1 x 10¹⁰ VP의 Rd19 또는 HEE-Rd19-K35/LK 아데노바이러스를 음성 대조군인 PBS와 함께 이틀 간격으로 3번 종양 내에 투여한 후 종양의 성장을 관찰하였다(도 7). 대조군인 PBS를 투여 받은 생쥐의 경우, 바이러스 투여 후 25 일경에 종양의 용적이 약 500 mm³으로 급격히 성장하였으나, 종양 특이적 살상 아데노바이러스인 Rd19 또는 HEE-Rd19-K35/LK를 투여한 경우에는 종양의 성장이 크게 지연됨을 확인하였다. 즉, Rd19 또는 HEE-Rd19-K35/LK 아데노바이러스를 투여 받은 생쥐의 경우, 바이러스 투여후 25일에 종양의 용적이 약 300mm³ 또는 100 mm³으로 각각 대조군 대비 60%와 20%로 크게 감소함을 확인하였다. 또한, 현재 상품화된 유전자치료제인 젠디신(Gendicine)을 투여받은 생쥐의 경우, 바이러스 투여 후 25일에 종양의 용적이 약 350 mm³로 HEE-Rd19-K35/LK 는 젠디신에 비해서도 월등하게 우수한 항종양 효과가 유도되는 것을 확인할 수 있었다.

E2F 와 TERT 프로모터가 재조합된 복제 불능 아데노바이러스 ( HRE6 - TERT - E2F or HRE6 - E2F - TERT ) 제작

HRE 6 copy와 변형된 TERT 프로모터 그리고 E2F 프로모터를 합체시킨 프로모터에 의한 아데노바이러스의 복제능의 차이를 확인하기 위해, 먼저 HRE 6 copy와 변형된 TERT 프로모터 그리고 E2F 프로모터를 HRE6/TERT/E2F 순서로 재조합한 프로모터 의해 GFP의 발현이 조절되는 복제불능 아데노바이러스를 제작하였다. 먼저 본 연구실에서 제작한 pSP72-mTERT의 SfuI, SalI 부위에 pSP72-E2F 벡터에서 ClaI, SalI 제한효소로 잘라낸 E2F 프로모터를 클로닝하여 pSP72-TERT-E2F를 제작하였으며, ClaI 부위에 pGL3-HRE6-APF 벡터에서 ClaI 제한효소로 끊어낸 HRE 6 copy를 클로닝하여 pSP72-HRE6/TERT/E2F를 제작하였다. 다음으로 아데노바이러스 E1 셔틀벡터인 pΔE1sp1B(Ψ)를 XhoI, EcoRI으로 잘라내고 pSP72-HRE6/TERT/E2F를 SalI, EcoRI으로 끊어낸 재조합 프로모터 HRE6/TERT/E2F를 클로닝한 pΔE1sp1B(Ψ)-HRE6/E2F/TERT를 제작하였고, 이를 EcoRI, XbaI으로 절단하고 pCDNA3.1/zeo-EGFP을 EcoRI, NheI으로 잘라 얻은 EGFP를 클로닝 하여 pΔE1sp1B(Ψ)-HRE6/TERT/E2F-EGFP 셔틀백터를 완성하였다..

또한, HRE 6 copy와 E2F 프로모터 그리고 변형된 TERT 프로모터를 HRE6/E2F/TERT 순서로 재조합 된 프로모터에 의해 GFP의 발현이 조절되는 복제불능 아데노바이러스를 제작하기 위해서, 본 연구실에서 제작한 pΔE1sp1B(Ψ)-E2F-TERT-Rb7Δ19를 EcoRI, ClaI으로 절단하여 얻은 E2F-TERT를 E1 셔틀 벡터인 pΔE1sp1B(Ψ)의 EcoRI, ClaI 부위에 삽입하여 pΔE1sp1B(Ψ)-E2F-TERT를 제작하였고, pΔE1sp1B(Ψ)-E2F-TERT의 ClaI 부위에 pGL3-HRE6-APF 벡터에서 ClaI 제한효소로 끊어낸 HRE6를 클로닝하여 pΔE1sp1B(Ψ)-HRE6/E2F/TERT를 제작하였다. 다음으로 pΔE1sp1B(Ψ)-HRE6/E2F/TERT를 EcoRI, XbaI으로 절단하고 pCDNA3.1/zeo-EGFP을 EcoRI, NheI으로 잘라 얻은 EGFP를 삽입하여 pΔE1sp1B(Ψ)-HRE6/E2F/TERT-EGFP 셔틀벡터를 완성하였다. 이렇게 제작된 pΔE1sp1B(Ψ)-HRE6/TERT/E2F-EGFP 또는 pΔE1sp1B(Ψ)-HRE6/E2F/TERT-EGFP 아데노바이러스 E1 셔틀벡터를 아데노바이러스 토탈 벡터인 dE1-k35의 E1 부분에 상동 재조합시켜 dE1-HmTE-k35/GFP와 dE1-HEmT-k35/GFP 아데노바이러스를 제작하였다(도 8).

dE1 - HmTE - k35 / GFP 와 dE1 - HEmT - k35 / GFP 아데노바이러스의 유전자 전달효율 비교

제작된 재조합 프로모터들의 활성도를 비교하기 위하여, 여러 종류의 암세포들에 제작된 복제불능 아데노바이러스를 감염시키고 36시간 후 FACS를 이용하여 GFP의 발현을 확인하였다(도 9). 도 9에서 볼 수 있듯이, HRE 인핸서가 프로모터에 삽입되어 있는 두 종류의 dE1-HEmT-k35/GFP와 dE1-HmTE-k35/GFP 바이러스에 의해 저산소 조건에서의 GFP 발현이 정상조건에 비해 크게 증가함을 확인하였으며, 이는 HRE가 저산소 조건에서 인핸서로 작용하여 바이러스(dE1-HEmT-k35/GFP, dE1-HmTE-k35/GFP)의 유전자의 전달 효율을 증가시킬 수 있음을 의미한다. 또한, 뇌암 세포주인 U343과 그 외의 다른 암세포주(Hep1, MDA MB231)에서 dE1-HEmT-k35/GFP와 dE1-HmTE-k35/GFP에 의한 유전자 전달 효율이 우수하였으며, 특히 dE1-HEmT-k35/GFP가 감염된 세포의 GFP 발현이 dE1-HmTE-k35/GFP가 감염된 세포와 비교하여 현저히 증가함을 확인하였다. 이러한 결과들을 통해, 암세포에서의 HEmT 재조합 프로모터의 활성이 HmTE 재조합 프로모터의 활성에 비해 크게 증가함을 확인하였다. 도 10에서 볼 수 있듯이, CMV 프로모터에 의해 GFP의 발현이 조절되는 dE1-CMV-k35/GFP의 GFP발현이 암세포주인 U373MG와 정상세포인 BJ, CBHEL, IMR90에서 모두 높은 반면, dE1-HEmT-k35/GFP에 의한 GFP 발현은 암세포주인 U373MG에서는 dE1-CMV-k35/GFP에 의한 GFP 발현과 유사하여 프로모터 활성이 매우 높은 것을 확인하였지만, 정상세포에서는 어떠한 처리도 하지 않은 음성대조군과 유사하여 HEmT 프로모터의 암세포 특이성이 매우 높음을 확인하였다.

HRE 6 copy , E2F 프로모터, 그리고 변형된 TERT 프로모터가 재조합 된 프로모터에 의해 복제가 조절되는 종양 선택적 살상 아데노바이러스인 HEmT - Rd19 - k35 와 HmTE - Rd19 - k35 의 제작

HRE 6 copy와 E2F 프로모터, 그리고 변형된 TERT 프로모터 순서로 합체된 재조합 프로모터에 의해 복제가 조절되는 종양 선택적 살상 아데노바이러스인 HEmT-Rd19-k35의 제작을 위하여, 먼저 본 연구실에서 제작한 아데노바이러스 E1 셔틀벡터인 pΔE1sp1B(Ψ)-Rb7△19를 ClaI, SalI으로 절단하여 pSP72-E2F에 ClaI, SalI으로 절단하여 얻은 E2F 프로모터를 삽입하여 pΔE1sp1B(Ψ)-Rb7△19-E2F를 제작하였고, 이를 다시 EcoRI, XhoI 부위로 절단한 후, pcDNA3.1-mTERT를 EcoRI, XhoI 제한효소로 절단하여 얻은 변형된 TERT 프로모터와 클로닝하여 pSP72-E2F 벡터에서 ClaI, SalI 제한효소로 잘라낸 E2F 프로모터를 클로닝하여 pΔE1sp1B(Ψ)-Rb7△19-E2F-TERT를 제작하였다. 마지막으로 pΔE1sp1B(Ψ)-Rb7△19-E2F-TERT의 ClaI 부위에 pGL3-HRE6-APF 벡터에서 ClaI 제한효소로 끊어낸 HRE6를 클로닝하여 아데노바이러스 E1 셔틀벡터인 pΔE1sp1B(Ψ)-Rb7△19-HRE6/E2F/mTERT를 제작하였다.

한편, HRE 6 copy와 변형된 TERT 프로모터, 그리고 E2F 프로모터 순서로 재조합 된 프로모터에 의해 복제가 조절되는 종양 선택적 살상 아데노바이러스인 HmTE-Rd19-k35의 제작을 위해, 먼저 아데노바이러스 E1 셔틀벡터인 pΔE1sp1A(Ψ)를 EcoRV, HindIII로 절단하고 pSP72-E2F를 EcoRV, HindIII로 절단하여 얻은 E2F 프로모터를 삽입하여 pΔE1sp1A(Ψ)-E2F를 제작하였다. 한편, E1 셔틀벡터인 pΔE1sp1B(Ψ)를 EcoRI, XhoI 부위로 절단한 후, pcDNA3.1-mTERT를 EcoRI, XhoI 제한효소로 절단하여 얻은 TERT 프로모터와 클로닝하여 pΔE1sp1B(Ψ)-TERT를 제작하였고, pΔE1sp1A(Ψ)-E2F의 ClaI, EcoRV 부위에 ΔE1sp1B(Ψ)-TERT를 ClaI, EcoRV으로 절단하여 얻은 변형된 TERT를 삽입하여 pΔE1sp1A(Ψ)-TERT-E2F를 제작하였다. 이렇게 제작된 pΔE1sp1A(Ψ)-TERT-E2F를 ClaI, SalI으로 절단하여, 본 연구실에서 제작한 E1 셔틀벡터인 pΔE1sp1B(Ψ)-Rb7△19의 ClaI, SalI 부위에 삽입한 pΔE1sp1B(Ψ)-Rb7△19-TERT-E2F를 제작하였다. 마지막으로 pΔE1sp1B(Ψ)-Rb7△19-TERT-E2F의 ClaI 부위에 pGL3-HRE6-APF 벡터에서 ClaI 제한효소로 끊어낸 HRE6를 클로닝하여 아데노바이러스 E1 셔틀벡터인 ΔE1sp1B(Ψ)-Rb7△19-HRE6/TERT/E2F를 제작하였다. 이렇게 제작된 아데노바이러스 E1 셔틀벡터인 pΔE1sp1B(Ψ)-Rb7△19-HRE6/TERT/E2F, pΔE1sp1B(Ψ)-Rb7△19-HRE6/TERT/E2F를 아데노바이러스 토탈 벡터인 dl324-35K의 E1 부분에 상동 재조합시켜 재조합된 프로모터에 의해 바이러스의 복제가 조절되는 종양 선택적 살상 아데노바이러스인 HEmT-Rd19-k35와 HmTE-Rd19-k35의 제작을 완료하였다.

HEmT 프로모터에 의해 복제가 조절되고 세포외 기질을 분해할 수 있는 데코린 유전자를 발현하는 HEmT-Rd19-k35/DCN 종양 선택적 살상 아데노바이러스의 제작

데코린(Decorin)은 SLRP(small leucin rich proteoglycan) 부류에 속하는 단백질로서 10-12개의 류신이 풍부한 반복 서열(leucin rich repeat)로 구성되어 있으며, 코어 부위는 아치(arch) 형태로 되어 있어 세포외 기질에 존재하는 여러 종류의 성장 인자 혹은 데코린 수용체와의 결합이 용이한 구조로 형성되어 있다. 데코린은 TGF(tumor growth factor)-β의 활성을 억제시킴으로써 콜라겐의 섬유화를 막고 세포외 기질의 구성(matrix assembly)에 관여하고, 종양 세포 성장을 억제하여 종양의 형성과 성장에 천연 길항제(natural antagonist)로 작용한다고 알려져 있다. 또한, 데코린은 성장 인자나 금속 이온과 같은 세포외 기질의 구성 성분과 반응하여 MMP-1과 같은 여러 종류의 MMP 등의 발현을 촉진시켜 세포외 기질을 분해시킨다. 최근의 연구 결과에 따르면, 데코린은 EGFR(epidermal growth factor receptor)의 새로운 생물학적 리간드로써 여러 종류의 암세포들에 데코린을 처리하면 EGFR과 결합함으로써 EGFR의 역할을 불활성화 시키는 한편 내생 사이클린 의존(endogenous cyclin dependent) p21^WAF1 의 발현이 촉진되어 세포주기 G1 어레스트 유도에 따른 세포 살상을 유도한다고 보고되었다. 따라서 데코린을 발현하는 아데노바이러스는 바이러스의 확산을 증가시킴으로써 아데노바이러스를 이용한 치료 유전자의 전달 효율을 높일 수 있을 뿐 아니라, 데코린 자체로 인한 임세포 살상 효과 또한 유도할 수 있다.

이와 같은 사실을 바탕으로, 아데노바이러스의 E1 부위에 데코린을 발현하는 바이러스를 제작하기 위하여, pCA14 클로닝 벡터의 BamHI 부위에 절단된 데코린 DNA를 서브클로닝하여 pCA14-데코린을 제작하였다. pCA14/DCNG 플라tm미드에 BglII 제한효소를 처리하여 DCN의 발현 카세트를 획득하고, 본 연구실에서 제작한 pΔE1sp1B(Ψ)-Rb7△19에 BamHI 제한효소로 클로닝하여 pΔE1sp1B(Ψ)-Rb7△19-DCN를 제작하였다.

한편 프로모터를 클로닝하기 위하여 pΔE1sp1B(Ψ)-E2F-TERT를 ClaI과 EcoRI 제한효소를 처리하여 E2F-TERT를 획득한 후 pΔE1sp1B(Ψ)-Rb7Δ19-DCNG 셔틀벡터에 클로닝하여 pΔE1sp1B(Ψ)-E2F-mTERT-Rb7Δ19-DCN를 제작하였으며, PGL3-HRE6-AFP 플라스미드에서 제한 효소 ClaI을 처리하여 HRE 6 copy를 획득한 후 pΔE1sp1B(Ψ)-E2F-mTERT-Rb7Δ19-DCN 플라스미드에 ClaI 제한효소로 클로닝하여 pΔE1sp1B(Ψ)-HRE6/E2F/TERT-Rb7Δ19-DCN 아데노바이러스 셔틀벡터를 제작하였다. 제작된 아데노바이러스 셔틀벡터는 XmnI을 이용하여 선형화 한 후, 토탈벡터인 dE1-k35와 상동 재조합하여 HEmT-Rd19-k35/DCN 바이러스를 제작하였다. 이후, 제작된 아데노바이러스는 A549 세포주에서 증식시켜 대량 생산하고, 생산된 바이러스의 역가는 제한역가분석으로 산출하였다(도 12).

HEmT 재조합 프로모터가 삽입되고 E1 부위에서 데코린 유전자를 E3 부위에서 CDTK 를 발현하는 종양 선택적 살상 아데노바이러스인 HEmT - Rd19 - k35 / CDTK ( E3 )와 HEmT - Rd19 - k35 / DCN / CDTK 의 제작

HSV-TK(Herpes simplex virus-thymidine kinase)는 현재 가장 많은 빈도로 사용되어지는 약제 감수성 유전자로, 독성이 없는 전약제(prodrug)인 갠사이클로비어(ganciclovir, GCV)를 인산화시켜 감염된 세포의 DNA 합성을 억제하여 분열하는 세포를 선택적으로 살상할 수 있는 암치료 유전자다. 티미딘 카이네이즈(TK)는 DNA 합성시 회수경로(salvage pathway)에 이용되는 효소로 HSV-TK는 티미딘 뿐만 아니라 뉴클레오타이드 유사체이면서 항바이러스 제제로 이용되는 갠사이클로비어도 인산화시킬 수 있다. 인산화 된 갠사이클로비어-트리포스페이트는 DNA 합성시 DNA 사슬에 삽입되어 DNA 사슬 형성을 중단시켜 결과적으로 DNA 합성을 억제하게 된다. 또한 죽은 암세포의 아폽토시스 베지클을 인접한 살아있는 암세포가 식세포작용(phagocytosis)함으로서 HSV-TK가 이입되지 않은 암세포에도 갠사이클로비어-트리포스페이트가 들어가 세포사를 일으켜 bystander effect를 유도할 수 있으며, 암세포 살상에 의한 암세포 특이적 면역반응이 유도됨으로써도 bystander effect를 유도할 수 있다. 또한 CD(cytosine deaminase)는 독성이 없는 5-FC (5-fluorocytosine)을 강력한 세포독성과 방사선 감수성을 갖는 5-FU(5-fluorouracil)로 전환시키는 작용을 한다. 최근 이러한 CD 유전자를 이입시킨 유전자 치료에서 CD 유전자의 발현에 의한 암세포 살상효과가 보고된 바 있다. 이러한 사실에 착안하여, 암세포 특이적 활성이 우수한 HEmT 재조합 프로모터에 의해 복제가 조절되는 아데노바이러스의 E1 부위에서 데코린 유전자를 E3 부위에서는 CD와 TK를 동시에 발현하는 종양 선택적 살상 아데노바이러스들을 제작하였다. 이를 위하여 CD와 TK를 발현하는 아데노바이러스의 E3 셔틀벡터를 제작하고자, pCK-hTK-IRES-hCD 플라스미드를 BamHI 제한효소를 이용하여 human type의 CD-IRES-TK를 획득한 후 pSP72/E3/CMV-PolA 벡터에 삽입하여 pSP72-E3/CMV-CD-IRES-TK-PolA 아데노바이러스 E3 셔틀 벡터를 제작하였다. 제작된 벡터를 PvuI으로 선형화 한 뒤, 상기에서 제작된 HEmT-Rd19-k35, HEmT-Rd19-k35/DCN 토탈벡터와 E3 부위에 상동 재조합하여 HEmT-Rd19-k35/CDTK(E3)와 HEmT-Rd19-k35/DCN/CDTK 아데노바이러스를 각각 제작하였다(그림 13).

HEmT - Rd19 - k35 / DCN 종양선택적 살상 아데노바이러스의 데코린 발현 검증 ( western blot assay )

상기의 방법으로 제작한 HEmT-Rd19-k35/DCN 종양 선택적 아데노바이러스가 데코린을 충분히 발현하는지 확인하기 위해 western blot assay를 시행하였다(도 14). 도 14에서 볼 수 있듯이, 본 연구에 사용된 Rd19-k35/DCN, HEmT-Rd19-k35/DCN 아데노바이러스에 의해 데코린의 발현이 정상적으로 이루어지고 있음을 확인하였다.

HEmT 재조합 프로모터에 의해 복제가 조절되고 데코린을 발현하는 종양선택적 살상 아데노바이러스의 세포 살상능 검증( CPE assy )

상기에서 제작되어진 HEmT-Rd19-K35/DCN 종양 선택적 살상 아데노바이러스의 세포 살상능을 검증하기 위해서, 각각의 바이러스들을 여러 농도의 역가로 뇌암 세포주(U373MG, U87MG, T98G, U343)와 두경부암 세포주(CAL27, IMR90, SJSA), 그 외 여러 종류의 암세포주(H460, H358, C33A, Hep1) 그리고 정상 세포주(IMR90, BJ, CBHEL)에 감염시킨 후, 세포 살상 정도를 비교 관찰하였다(도 15). 도 15에서 볼 수 있듯이, 데코린을 발현하는 Rd19-K35/DCN 또는 HEmT-Rd19-K35/DCN 종양 선택적 살상 아데노바이러스의 암세포 살상능이 대조군인 Rd19-K35 또는 HEmT-Rd19-K35에 비해 각각 증가됨을 관찰할 수 있어, 데코린 발현에 의한 암세포 살상능 증대 효과를 확인하였다.

HEmT - Rd19 - K35 / DCN 종양 선택적 살상 아데노바이러스의 세포 살상능 검증( MTT assay )

데코린을 발현하는 HEmT-Rd19-k35/DCN 종양 선택적 살상 아데노바이러스의 세포 살상능을 보다 정량적으로 검증하기 위하여, 뇌암 세포주(U343, U87MG)와 그 외 여러 종류의 암세포주들(Huh7, C33A)에 Rd19-k35, HEmT-Rd19-k35, Rd19-k35/DCN, HEmT-Rd19-k35/DCN를 각각 감염시킨 후, 세포 살상 정도를 비교 관찰하였다(도 16). 도 16에서 볼 수 있듯이, 본 연구에 사용된 모든 암 세포주들에서 HEmT 프로모터에 의해 복제가 조절되는 HEmT-Rd19-k35 종양 선택적 살상 아데노바이러스의 암세포 살상능이 대조군인 Rd19-k35 보다 우수함을 확인하였으며, 또한, 데코린을 발현하는 Rd19-k35/DCN 또는 HEmT-Rd19-k35/DCN 종양 선택적 살상 아데노바이러스의 암세포 살상능이 각 바이러스의 대조군인 Rd19-k35, HEmT-Rd19-k35에 비해 크게 증가하였음을 확인할 수 있었다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> Industy-Academic Cooperation foundation Yonsei University <120> Gene Delivery Systems Exhibiting Enhanced Tumor-Specific Expression with Recombinant Expression Control Sequence <160> 3 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 462 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> modified E2F promoter <400> 1 atcgataccg tcgaaacttg tttattgcag cttataatgg ttacaaataa agcaatagca 60 tcacaaattt cacaaataaa gcattttttt cactgcattc tagttgtggt ttgtccaaac 120 tcatcaatgt atcttatcat gtctggatcc gctagcggcg cgccgtttca tccggacaaa 180 gcctgcgcgc gccccgcccc gccattggcc gtaccgcccc gcgccgccgc cccatctcgc 240 ccctcgccgc cgggtccggc gcgttaaagc caataggaac cgccgccgtt gttcccgtca 300 cggccggggc agccaattgt ggcggcgctc ggcggctcgt ggctctttcg cggcaaaaag 360 gatttggcgc gtaaaagtgg ccgggacttt gcaggcagcg gcggccgggg gcggagcggg 420 atcgagccct cgatgatatc agaaacgata tcaccggtcg ac 462 <210> 2 <211> 41 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 tcgagccaca gtgcatacgt gggctccaac aggtcctctt g 41 <210> 3 <211> 892 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mTERT <400> 3 tctagcatcg atgtcgaggg atctctccgc tggggccctc gctggcgtcc ctgcaccctg 60 ggagcgcgag cggcgcgcgg gcggggaagc gcggcccaga cccccgggtc cgcccggagc 120 agctgcgctg tcggggccag gccgggctcc cagtggattc gcgggcacag acgcccagga 180 ccgcgctccc cacgtggcgg agggactggg gacccgggca cccgtcctgc cccttcacct 240 tccagctccg cctcctccgc gcggaccccg ccccgtcccg acccctcccg ggtccccggc 300 ccagccccct ccgggccctc ccagcccctc cccttccttt ccgcggcccc gccctctcct 360 cgcggcgcga gtttcaggca gcgctgcgtc ctgctgcgca cgtgggaagc cctggccccg 420 ggcacccccg cgaagcttag gccgattcga gatctctccg ctggggccct cgctggcgtc 480 cctgcaccct gggagcgcga gcggcgcgcg ggcggggaag cgcggcccag acccccgggt 540 ccgcccggag cagctgcgct gtcggggcca ggccgggctc ccagtggatt cgcgggcaca 600 gacgcccagg accgcgctcc ccacgtggcg gagggactgg ggacccgggc acccgtcctg 660 ccccttcacc ttccagctcc gcctcctccg cgcggacccc gccccgtccc gacccctccc 720 gggtccccgg cccagccccc tccgggccct cccagcccct ccccttcctt tccgcggccc 780 cgccctctcc tcgcggcgcg agtttcaggc agcgctgcgt cctgctgcgc acgtgggaag 840 ccctggcccc gggcaccccc gcgaagcttc gaatcgcgaa ttcgccctcg ag 892

Claims

(ⅰ) 서열목록 제2서열의 HRE(hypoxia-response elements) 인핸서 서열; (ⅱ) 서열목록 제1서열의 E2F 프로모터 서열; 및 (ⅲ) 서열목록 제3서열의 TERT(telomere reverse transcriptase) 프로모터 서열을 포함하고 상기 E2F 프로모터는 상기 HRE 인핸서 서열의 다운스트림에 위치하며 상기 HRE 인핸서 서열 및 E2F 프로모터는 협동적으로 동일한 유전자의 발현을 촉진하는 것을 특징으로 하는 유전자발현 조절용 핵산분자.
제 1 항에 있어서, 상기 E2F 프로모터 서열은 2-10번 반복되는 것을 특징으로 하는 유전자발현 조절용 핵산분자.
제 1 항에 있어서, 상기 HRE 인핸서 서열은 2-20번 반복되는 것을 특징으로 하는 유전자발현 조절용 핵산분자.
삭제
제 1 항에 있어서, 상기 유전자 발현 조절용 핵산분자는 재조합 아데노바이러스 벡터의 E1 영역에 삽입되며, 5’에서 3’방향으로 HRE 서열, E2F 프로모터 서열 및 TERT 프로모터 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 유전자발현 조절용 핵산분자.
제 5 항에 있어서, 상기 HRE 서열은 6번 반복되며, 상기 E2F 서열은 2번 반복되는 것을 특징으로 하는 유전자발현 조절용 핵산분자.
(a) 제 1 항 내지 제 3 항, 제 5 항 및 제 6 항 중 어느 한 항의 유전자발현 조절용 핵산분자; 및
(b) 상기 유전자발현 조절용 핵산분자에 작동적으로 연결된(operatively linked) 발현시키고자 하는 목적 유전자를 포함하는 종양 특이적 발현이 개선된 유전자 전달체.
제 7 항에 있어서, 상기 유전자 전달체는 플라스미드, 재조합 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스(Adeno-associated viruses: AAV), 레트로바이러스, 렌티바이러스, 헤르페스 심플렉스 바이러스, 백시니아 바이러스, 폭스바이러스, 폴리머, 리포좀 또는 니오좀인 것을 특징으로 하는 유전자 전달체.
제 8 항에 있어서, 상기 유전자 전달체는 재조합 아데노바이러스 벡터인 것을 특징으로 하는 유전자 전달체.
다음을 포함하는 암세포 특이적 살상능이 개선된 재조합 아데노바이러스:
(a) 아데노바이러스의 ITR(inverted terminal repeat) 서열;
(b) (ⅰ) 서열목록 제2서열의 HRE(hypoxia-response elements) 인핸서 서열; (ⅱ) 서열목록 제1서열의 E2F 프로모터 서열; 및 (ⅲ) 서열목록 제3서열의 TERT(telomere reverse transcriptase) 프로모터 서열을 포함하고 상기 E2F 프로모터는 상기 HRE 인핸서 서열의 다운스트림에 위치하며 상기 HRE 인핸서 서열 및 E2F 프로모터는 협동적으로 동일한 유전자의 발현을 촉진하는 것을 특징으로 하는 유전자발현 조절용 핵산분자; 그리고,
(c) 상기 유전자발현 조절용 핵산분자에 작동적으로 연결된(operatively linked) 종양 억제인자 유전자, 항원성 유전자, 세포독성 유전자, 세포증식 억제 유전자, 세포사멸 유전자 및 항-신생 혈관 생성 유전자로 구성된 군으로부터 선택되는 치료학적 트랜스 유전자.
제 10 항에 있어서, 상기 유전자 발현 조절용 핵산분자 내의 E2F 프로모터 서열은 2-10번 반복되는 것을 특징으로 하는 재조합 아데노바이러스.
제 10 항에 있어서, 상기 유전자 발현 조절용 핵산분자 내의 HRE 인핸서 서열은 2-20번 반복되는 것을 특징으로 하는 재조합 아데노바이러스.
삭제
제 10 항에 있어서, 상기 유전자 발현 조절용 핵산분자는 재조합 아데노바이러스 벡터의 E1 영역에 삽입되며, 5’에서 3’방향으로 HRE 서열, E2F 프로모터 서열 및 TERT 프로모터 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 아데노바이러스.
제 14 항에 있어서, 상기 HRE 서열은 6번 반복되며, 상기 E2F 서열은 2번 반복되는 것을 특징으로 하는 재조합 아데노바이러스.
제 10 항에 있어서, 상기 치료학적 트랜스 유전자는 LK 8(Apolipoprotein Klingle 8) 유전자, CD(cytosine kinase) 유전자, TK(thymidine kinase) 유전자 및 데코린(decorin) 유전자로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 또는 둘 이상의 유전자인 것을 특징으로 하는 재조합 아데노바이러스.
(a) 제 10 항 내지 제 12 항 및 제 14 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항의 재조합 아데노바이러스의 치료학적 유효량; 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 항종양 조성물.
제 17 항에 있어서, 상기 조성물은 유효성분으로서 GCV(ganciclovir)를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 항종양 조성물.