KR101154246B1

KR101154246B1 - 활성화 혼합물

Info

Publication number: KR101154246B1
Application number: KR1020057021281A
Authority: KR
Inventors: 안소니 허바드
Original assignee: 내셔날 인스티튜트 포 바이올로지칼 스탠다즈 앤 컨트롤 (엔아이비에스씨)
Priority date: 2003-05-16
Filing date: 2004-05-17
Publication date: 2012-06-13
Also published as: JP4787756B2; US20060115868A1; US20100227346A1; CA2525940A1; EP1625405A1; WO2004102202A1; JP2007503589A; CN1806176A; AU2004239468A1; KR20060002013A; AU2004239468B2

Abstract

본 발명은 인자-결핍 기질 플라스마, 활성제 및 인지질을 포함한 활성화 혼합물에 관한 것이다. 또한 본 발명은 활성화 혼합물의 제조방법 및 그의 이용에 관한 것이다. 또한 본 발명은 시험 표본 내의 혈액 응고 인자의 양을 측정하는 분석방법 및 여기에 기술된 분석방법을 수행하기 위한 키트에 관한 것이다.

인자-결핍 기질 플라스마, 활성제, 인지질, 활성화 혼합물, 혈액 응고 인자

Description

활성화 혼합물{Activation mixture}

본 발명은 혈액 응고 인자에 관한 것이다.

특히, 본 발명은 혈액 응고 인자의 측정을 위한 활성화 혼합물에 관한 것이다.

혈액 응고의 과정은 응혈의 형성에 영향을 미치도록 연속단계(cascade) 방식으로 작용하는 혈액 응고 단백질로 알려진 단백질 시리즈를 포함한다. 혈우병은 혈액 응고 인자를 인코드하는 유전자가 돌연변이를 포함하여 인코드된 단백질이 연속단계 과정에서 정상적으로 기능하지 않는 인간 및 다른 포유류의 질병이다.

A형 혈우병(hemophilia A)은 가장 일반적인 형태의 질병이고, 응고인자 Ⅷ(coagulation Factor Ⅷ)의 활성의 결핍에 의해 유발된 X-연관성, 열성, 출혈성 질 병이다. 영향받은 개체는 관절 및 근육 내로의 출혈, 이상성(easy bruising) 및 상처로부터의 지속된 출혈의 다양한 표현형을 발달시킨다. 본 질병은 Xq28로 지도화된(maped) 응고인자 Ⅷ(Factor Ⅷ) 유전자 내의 이질성 돌연변이에 의해 유발된다. 응고인자 Ⅷ 돌연변이 내의 이질성에도 불구하고 담체 검출 및 태아기 진단이 연관 분석에 의해 간접적으로 뿐만 아니라 선택된 돌연변이(특히 역위)의 직접적인 검출에 의해 수행될 수 있다. 응고인자 Ⅷ의 대치는 인간 플라스마로부터 유래된 다양한 제제 또는 재조합 기술을 이용하여 수행될 수 있다. 대치 요법이 대부분의 경우 효과적인 반면, 치료된 개체의 10～15%는 그의 효과를 감소시키는 중화 항체를 발달시킨다. A형 혈우병의 중요한 일반적 치료는 응고인자 Ⅷ 활성을 치료적 수준으로 회복하는데 필요한 양을 이용하여 수행된 응고인자 Ⅷ의 주입이다. 응고인자 Ⅷ의 반감기가 8～12시간이기 때문에 매일 2회 주입이 일부의 환경에서 요구된다.

유전병인 B형 혈우병은 혈액 응고 단백질인 응고인자 Ⅸ(F.Ⅸ)를 인코드하는 유전자 내의 돌연변이에 의한 것이 특징이다. F.Ⅸ는 High et al.(1995. "Factor Ⅸ" In: Molecular Basis of Thrombosis and Hemostasis, Hign and Roberts, eds., Marcel Dekker, Inc.)에 의해 조사되었다.

1936년 Patek and Stetson(J. Clin. Invest. 15, 531-542)는 혈우병이 플라스마 인자의 대치에 의해 교정될 수 있다고 보고하였다. 이후 모니터링 치료 및 치료적 응고인자 Ⅷ 제제의 질 조절을 위해 임상적 진단을 지지하는 이러한 인자(현재 응고인자 Ⅷ로 불림)에 대한 분석이 요구되었다.

이러한 목적으로 다양한 시험관 내 분석이 개발되었다. 예를 들어 잘 알려진 1-단계 분석(one-stage assay)이 Lagdell et al.(1953) J. Lab. Clin. Med. 41, 637-647 및 Hardisty and Macpherson(1962) Thromb. Diath. Haemorrh 7, 215-229에 의해 보고되었고, 2 단계 분석이 Biggs et al.(1995) Br. J. Haematol. 1, 20-34에 의해 보고되었다. 발색 분석(Seghatchian and Miller-Anderson, (1978) Med. Lab. Sci. 35, 347-354) 또는 플루로젠(fluorogenic) 분석(Mitchell et al.(1981) Thromb. Res. 21, 573-584)과 같은 다른 형태의 분석이 이후에 개발되었으나 전통적인 분석 시스템이 여전시 이용된다.

혈액 응고 인자 - 응고인자 Ⅷ와 같은 -에 대한 모든 종류의 분석 중 1 단계 분석이 속도, 단순성 및 자동화 용이성의 이유로 가장 일반적으로 이용된다(Barrowcliffe et al., (1981) Haemostasis 11, 96-101). 본 분석의 원리는 Over (1984) Scandinavian Journal of Haematology Supplementum No. 41, 33, 13-24에 의해 기술되었다. 본 분석은 응고인자 Ⅷ-결핍 플라스마의 응고를 교정하는 응고인자 Ⅷ-함유 표본의 능력에 기반한다. 희석된 응고인자 Ⅷ-함유 표본의 첨가에 의해 응고 시간이 감소되고, 응고인자 Ⅷ의 양이 속도 제한되도록 희석이 선택되는 한 이러한 단축은 첨가된 응고인자 Ⅷ의 양의 기능이다. 고농도의 응고인자 Ⅷ에 서 다른 인자는 속도 제한되는 반면, 저농도에서 응고 시간은 가장 긴 응고 시간에 근접한다. 그러나 이들 극단 사이에 용량 반응이 직선이 되는 응고 시간 범위가 일반적으로 존재한다. 알려지지 않은 표본의 용량-반응 곡선을 알려진 활성(즉, 표준)을 지닌 표본과 비교함으로서 시험 표본의 응고인자 Ⅷ 함량이 측정될 수 있다.

Over (1984) Scandinavian Journal of Haematology Supplementum No. 41, 33, 13-24는 하기와 같이 1 단계 분석의 절차를 기술하였다.

시험은 응고인자 Ⅷ-결핍 기질 플라스마, 희석된 시험 표본, 인지질 현탁액 및 활성제 반응제(후자 2개는 결합된 반응제로서 첨가됨)의 1 부피로 피펫팅함으로서 수행된다. 이후 혼합물은 37℃에서 인큐베이트된다. 응고 반응은 칼슘 이온을 첨가함으로서 시작되고 이 시점부터 종점에 도달하는 시간이 기록된다.

분석의 재현성과 관련된 문제점을 극복하기 위해 1-단계 분석에 대한 다양한 변형이 기술되었다. Geiger et al. (1955) Proc. V. Congr. Europ. Soc. Haemat. Freiburg i. B., 413, Springer, Berlin은 본 시스템에 일반 혈청을 첨가하였다. Waller (1959) Scand. J. Clin. Lab. Invest. 11, 194는 유리제품의 조심스러운 규격화 및 재석회화전 6분간 플라스마 혼합물의 예비-인큐베이션에 의해 분석을 개선하고자 했다. Egeberg (1961) Scand. J. Clin. Lab. Invest. 13, 140은 사용 직 전에 기질 혈우병 플라스마의 격렬한 교반이 추가된 Waller에 의해 기술된 측정이 재현성을 증가시킴을 발견하였다. Hardisty & Macpherson (1962) Thromb. Diath. Haemorrh 7, 215-229는 플라스마가 재석회화 직전에 최적의 양의 고령토로 인큐베이트되는 또다른 변형을 기술하였다.

본 발명은 표본 내 혈액 응고의 양을 측정하기 위한 1 단계 분석내 개선에 관한 것이다.

발명의 요약

본 발명은 단일 활성화 혼합물이 현존하는 1 단계 분석 방법에 사용되는 개별 성분 대신에 사용될 수 있다는 놀라운 발견에 기반한다.

유리하게는, 여기에 기술된 변형된 1 단계 분석 방법은 수행하기에 더욱 빠르고 용이하며 자동화에 더욱 용이하다.

첫 번째 관점에서 본 발명은 인자-결핍 기질 플라스마, 활성제 및 인지질을 포함한 활성화 혼합물에 관한 것이다.

두 번째 관점에서 본 발명은 인자-결핍 기질 플라스마, 활성제 및 인지질을 함께 혼합하는 단계를 포함한 활성화 혼합물의 제조방법에 관한 것이다.

세 번째 관점에서 본 발명은 시험 표본에 활성화 혼합물을 첨가하는 것을 포함한 시험 표본 내 혈액 응고 인자의 양을 측정하기 위한 분석방법에 관한 것이다.

수술동안 담체 검출을 위해 또는 치료 농축액의 질 조절의 일부로서 혈우병에 대한 치료를 진단하거나 모니터하는(즉, 과도한 출혈의 특이적 원인을 탐지하는) 것과 같은 다양한 적용에 대해 혈액 응고 인자가 측정된다.

네 번째 관점에서 본 발명은 활성화 혼합물을 함유한 첫 번째 용기(vessel)를 포함한 시험 표본 내 혈액 응고 인자의 양을 측정하기 위한 키트에 관한 것이다.

다섯 번째 관점에서 본 발명은 표본 내 혈액 응고 인자의 양을 측정하기 위한 분석방법에 있어서 활성화 혼합물의 이용에 관한 것이다.

바람직하게는 활성제는 마이크론화된 실리카이다.

바람직하게는 인지질은 합성 인지질이다.

바람직하게는 활성제 및 인지질은 단일 반응제로서 제공된다. 더욱 바람직하게는 단일 반응제는 APTT 반응제이다.

바람직하게는 인자-결핍 기질 플라스마는 화학적으로 고갈되거나 면역-고갈된다.

바람직하게는 활성화 혼합물은 적어도 5시간 이상 동안 4℃ 및/또는 22℃에서 안정하다.

바람직하게는 본 발명의 세 번째 관점에 다른 분석방법은: (a) 시험 표본을 제공하는 단계; (b) 제 1항 내지 제 7항의 어느 한 항에 따른 활성화 혼합물을 제공하는 단계; (c) 시험 표본 및 활성화 혼합물을 함께 첨가하는 단계; (d) 칼슘 반응제를 첨가하는 단계; (e) 응고 시간/응고 종점을 측정하는 단계; 및 (f) 시험 표본 내 혈액 응고 인자의 양을 측정하는 단계를 포함한다.

바람직하게는 단계 (a), (b) 및 (d) 내에 기술된 분석 성분 각각은 예열된다. 더욱 바람직하게는 단계 (a), (b) 및 (d) 내에 기술된 분석 성분 각각은 약 37℃로 예열된다.

바람직하게는 응고 시간/응고 종점은 포인트 오브 케어 장치(point of care device) 및/또는 니어 페이션트 케어 장치(near patient care device)를 이용하여 측정된다.

바람직하게는 키트는 칼슘 반응제를 함유한 추가 용기를 포함한다.

바람직하게는 키트는 하나 이상의 혈액 응고 인자를 함유한 추가 용기를 포함한다.

바람직하게는 키트는 포인트 오브 케어 장치(point of care device) 및/또는 니어 페이션트 케어 장치(near patient care device)를 포함한다.

바람직하게는 활성화 혼합물은 예열된다. 더욱 바람직하게는 활성화 혼합물은 약 37℃로 예열된다.

본 발명의 다른 관점은 수반된 청구항 및 하기 설명 및 토론에 나타나 있다. 이들 관점은 별도의 섹션 표제하에 존재한다. 그러나 각 섹션 표제 하의 지침은 특정한 섹션 표제에 한정적이 필요는 없음이 이해된다.

장점

본 발명은 많은 장점을 지닌다. 이들 장점은 하기 설명에서 명백해질 것이다.

예로서 본 발명이 현존하는 방법보다 더 빠르게 수행하는 표본 내 혈액 응고 인자의 양을 측정하는 분석방법을 제공하기 때문에 본 발명은 유리하다.

또다른 예로서 본 발명이 현존하는 방법보다 더 적은 단계를 포함하고 따라서 수행하기에 더욱 간단한 분석방법을 제공하기 때문에 본 발명은 유리하다.

또다른 예로서 본 발명은 자동화에 더욱 용이한 분석방법을 제공하기 때문에 본 발명은 유리하다.

또다른 예로서 본 분석방법에 사용되는 반응제는 목적 혈액 응고 인자의 평가에 특이적으로 제조될 수 있기 때문에 본 발명은 유리하다.

활성화 혼합물

여기에 기술된 바와 같이 발명자들은 활성화 혼합물이 현존하는 1 단계 분석방법에 사용되는 개별 성분(즉, 인자-결핍 기질 플라스마, 활성제 및 인지질 또는 인자-결핍 기질 플라스마 및 활성제/인지질)을 대치하는데 사용될 수 있음을 발견하였다.

본 발명 내의 "활성화 혼합물"은 시험 표본과 접촉되기 전에 함께 혼합된 인자-결핍 기질 플라스마, 활성제 및 인지질을 나타낸다. 따라서 활성화 혼합물은 시험 표본 - 혈액 응고 인자에 대한 분석방법에서와 같은 -을 함유한 반응에 사용되기 전에 제조된다.

바람직한 실시태양에서 본 발명은 인자-결핍 기질 플라스마, 활성제 및 인지질을 포함한 활성화 혼합물에 관한 것이다.

또다른 바람직한 실시태양에서 본 발명은 인자-결핍 기질 플라스마, 활성제 및 인지질을 필수적으로 포함하거나 이로 구성된 활성화 혼합물에 관한 것이다.

일반적으로 활성화 혼합물은 단일 반응제를 함께 형성하도록 실질적으로 동일한 부피의 인자-결핍 기질 플라스마, 활성제 및 인지질을 혼합함으로서 제조된다.

바람직하게는 활성화 혼합물은 본 발명의 분석방법에 사용되기 전에 예열된다. 더욱 바람직하게는 활성화 혼합물은 약 37℃로 예열된다.

본 발명의 바람직한 실시태양에서 활성화 혼합물은 본 발명의 분석방법에 사용되기 전에 약 37℃에서 10분간 예비-인큐베이트된다.

구성성분 중 2개가 단일 반응제로 제공된 후 세 번째 성분에 첨가되어 활성화 혼합물을 형성한다.

바람직하게는 활성제 및 인지질은 단일 반응제로서 제공된 후 실질적으로 동일한 부피의 인자-결핍 기질 플라스마와 혼합된다.

통상적으로 구입가능한 활성제 및 인지질의 혼합물은 일반적으로 APTT 반응제로서 표기되고, 이는 Poller and Thomson (1972) J. Clin. Pathol. 25, 1038-1044에서 광범위하게 조사되었다.

예로서, APTT 반응제는 bioMerieux, France; Sigma Diagnostics, USA; Helena Haemostasis Systems Ltd, UK; 및 Instrumentation Laboratory, USA를 포함하나 이에 한정적이지 않은 다양한 회사로부터 구입된다.

바람직한 실시태양에서 사용되는 APTT 반응제는 실리카 활성제 및 인지질 혼합물을 포함한 Instrumentation Laboratory APTT-SP(액체)(카달로그 번호 20006300)이다.

바람직하게는 활성화 혼합물은 적어도 5시간 동안 4℃ 및/또는 22℃에서 안정적이다.

유리하게는 안정성은 분석 동안 일시적 표류를 방지한다.

혈액 응고 인자

여기에 사용된 "혈액 응고 인자"라는 용어는 상처 또는 손상 부위에서의 혈액 손실의 방지에 관련된 혈액 응고/응혈 인자를 나타낸다.

혈액 응고는 반고체 덩어리 물질인 응혈을 포함하고, 이는 상처를 막는다. 응고는 집합된 혈소판 및 다수의 플라스마 단백질, 적어도 하나 이상의 조직 단백질, 인지질막 표면, 칼슘 이온 및 혈소판을 포함한 섬유소 분자 그물로 구성된다. 혈액 응고의 메커니즘 및 관련된 성분은 Cell 53 (1988) 505-518; Biochem. 30 (1991) 10363-10379; Methods of Enzymatic Analysis, Vol. V, chapter 3 3rd ed., Academic Press, New York(1983)을 포함한 여러 보고 문헌에 포괄적으로 기술되어 있다.

혈액 응고 과정에 관련된 단백질은 일반적으로 인자(factor)로 표기된다.

혈액 응고 인자는 응고인자(Factor) Ⅱ, 응고인자 Ⅴ, 응고인자 Ⅶ, 응고인자 Ⅷ, 응고인자 Ⅸ, 응고인자 Ⅹ, 응고인자 XI, 응고인자 XⅡ 및 응고인자 XⅢ를 포함한다. 숫자에 의한 인자의 표기는 당업자에게 상응하는 단백질을 확인시킨다.

바람직하게는 본 발명 내의 혈액 응고 인자는 응고인자 Ⅷ, 응고인자 Ⅸ 및 응고인자 XI를 나타낸다. 가장 바람직하게는 혈액 응고 인자는 응고인자 Ⅷ이다.

따라서 본 발명의 가장 바람직한 실시태양에서 혈액 응고 인자는 응고인자 Ⅷ이다.

인자-결핍 기질 플라스마

당업자는 사용될 인자-결핍 기질 플라스마가 분석되는 혈액 응고 인자와 동일할 것임을 인식할 것이다. 따라서 예로서 분석되는 혈액 응고 인자가 응고인자 Ⅷ, 응고인자 Ⅸ 또는 응고인자 XI인 경우 응고인자 Ⅷ-, 응고인자 Ⅸ- 또는 응고인자 XI-결핍 기질 플라스마가 각각 사용될 것이다.

본 발명의 분석방법에 사용되는 인자-결핍 기질 플라스마는 다양한 출처로부터 수득될 수 있다.

플라스마의 제조는 이를 무세포가 되게 하고(이중 원심분리), 빠르게 동결시키고, 동결-건조가 적용시 완충액으로 이를 안정화시키는 조치를 포함한다(Godfrey et al. (1975) Thromb. Diath. Haemorrh. 34, 879-882).

기질 플라스마는 중증 혈우병 환자 - A형 혈우병과 같은 -로부터 수득된다. 그러나 중증 혈우병환자에 대한 예방 치료가 더욱 강해지기 때문에 혈액 응고 인자를 함유하지 않은 플라스마를 수득하는 것이 더욱 어렵다. 더욱이 HCV 감염의 빈도도 문제이다.

대안적 출처는 상업적 출처로부터 기질 플라스마를 구입하는 것이다 - Barrowcliffe et al. (1981) Haemostasis 11, 96-101 내에 기술된 출처와 같이.

또다른 가능성은 정상 플라스마로부터 혈액 응고 인자를 선택적으로 제거함으로서 수득된 인공 혈액 인자-결핍 플라스마를 사용하는 것이다. 이는 물리적, 화학적 또는 면역적 처리에 의해 수행된다.

적당하게는 기질 플라스마의 잔여 혈액 응고 인자 응고 활성은 일반적으로 정상의 1% 이하 정도로 낮아야 한다.

또한 속도 제한적이지 않기 위해 혈액 응고 인자에 대한 항체가 부재해야 하고 다른 응고 인자는 충분히 높은 농도로 존재해야 한다. 블랭크 응고 시간과 높은 혈액 응고 인자 농도에서의 혈액 응고 시간 사이의 큰 차이가 존재해야 하며, 일반적으로 이는 광범위한 혈액 응고 인자 농도에 걸친 직선성을 지닌(적당한 변환 후) 가파른 기울기를 나타낸다.

바람직하게는 인공 혈액 응고 인자-결핍 플라스마 - 인공 응고인자 Ⅷ 결핍 플라스마(Biomerieux/Organon Teknika Corp, USA)와 같은 -가 사용된다. 이러한 플라스마는 화학적으로 고갈되고 정상 vWF 수준을 포함한다.

활성제

일반적으로 사용되는 활성제는 응고인자 XⅡ의 활성제이다. 응고인자 XⅡ의 다양한 용해성 및 불용성 활성제가 알려져 있다.

응고인자 XⅡ는 응고인자 XI를 활성화시키는 단백질가수분해효소 응고인자 XⅡa의 순환 전구체이다. 응고인자 XI는 응고인자 XIa의 순환 전구체이고, 이는 응고인자 Ⅸ를 응고인자 Ⅸa로 전환시킨다. 응고인자 Ⅸa 및 응고인자 Ⅷ는 응고의 내인성 경로에서 응고인자 Ⅹ의 활성화에 함께 관여한다.

일반적으로 활성제는 고령토, 셀라이트(celite), 유리, 엘라직산(ellagic acid) 및 마이크론화된 실리카와 같은 표면 상에서 또는 덱스트라설페이트(dextrasulfate)와 같은 고분자량 성분 상에서 순수 음전하를 지닌다.

당업자는 여기에 기술된 활성제가 고갈되지 않고 다른 것이 사용됨을 인식할 것이다.

일반적으로 고령토, 엘라직산 또는 마이크론화된 실리카가 1 단계 분석에 사용된다. 응고 시간이 포토옵티칼 응고 검출을 지닌 코어귤로모터(coagulomoter) 내에 기록될 때 엘라직산 및 마이크론화된 실리카가 활성제로 사용되고; 고령토는 다른 코어귤로모터에서 가장 널리 사용된다(Barrowcliffe et al., 1981).

바람직한 실시태양에서 활성제는 마이크론화된 실리카이다.

또한 활성제는 응고인자 Ⅸa를 포함한다. 응고인자 Ⅸa는 응고의 내인성 경로에서 응고인자 X를 활성화시키고 응고인자 Ⅸ를 응고인자 Ⅸa로 전환시키는 세린 프로테아제이다.

활성제의 농도는 최적 활성화 시간을 적용한 후 응고 시간이 가능한 짧도록 선택되어야 한다.

인지질

일반적으로 시험관 내 시험을 위한 인지질의 최상의 원료는 중증 혈우병인자로부터 수득된 혈소판-풍부 플라스마의 형태 내의 혈소판 자체이다(Nilsson et al. (1957) Acta. Med. Scand. 159, 35-37 (1957)). 그러나 이는 대부분의 실험실에서의 실용적인 접근이 아니고 다른 반응제가 사용되어야 한다.

음성적으로 하전된 인지질의 혼합물 - 포스파티딜세린과 같은 - 및 하전되지 않은 인지질 - 포스파티딜콜린과 같은 -이 적당한 반응제로서 작용한다(Zwaal & Hemker (1982) Haemostasis 11, 12-39).

Bell and Alton (1954) Nature 174, 880-881; Hjort et al., (1955) J. Lab. Clin. Med. 46, 89-97; 및 Barrowcliffe et al. (1982) Homeostasis 11, 96-101에 기술된 바와 같이 소, 토끼 또는 인간 뇌와 같은 다른 원료의 인지질 추출물이 사용되기도 한다.

인지질은 실질적으로 정제된 인지질이다.

본 발명의 바람직한 실시태양에서 예를 들어 실질적으로 정제된 합성 인지질과 같은 합성 인지질이 사용된다.

유리하게는 시험 시스템 내에서 인지질 농도의 작은 변이(시험 표본의 인지질 함량 내의 차이 때문에)가 응고 시간 상에 최소한의 효과를 지님을 보증하기 위해 가장 짧은 응고 시간을 산출하는 인지질 농도가 사용된다. 서브(sub)- 및 수프라(supra)-최적 농도는 더 긴 응고 시간을 유발한다.

칼슘 반응제

응고 연속단계의 일부에 의존적인 혈액 응고 인자를 시작하기 위해 혼합물 내에 존재하는 구연산염(기질 플라스마의 항응고제로서 존재하는)이 압도되고 최적 자유 칼슘 농도가 수득되는 양으로 첨가되어야 한다.

칼슘 양이온의 화학적 원료가 사용된다. 예를 들어 칼슘 양이온(Ca⁺⁺)의 원료는 CaCl₂, Ca(NO₂)₂, CaSO₄ 또는 화합물을 함유한 다른 무기 칼슘 양이온이 사용된다.

바람직하게는 칼슘 양이온의 원료는 CaCl₂이다.

일반적으로 25～33 mM 칼슘 반응제가 기질 플라스마의 동일한 부피로 사용된다. 그러나 당업자는 가장 짧은 응고 시간을 수립함으로서 칼슘 반응제에 대한 최적 농도를 측정할 수 있을 것이다(Lenahan & Philips (1966) Clin. Chem. 12, 269-273).

바람직하게는 칼슘 반응제는 본 발명에 따른 분석방법에 사용되기 전에 예열된다. 더욱 바람직하게는 칼슘 반응제는 약 37℃로 예열된다.

분석방법

또다른 관점에서 본 발명은 시험 표본 내의 혈액 응고 인자의 양을 측정하는 분석방법에 관한 것이다.

본 발명의 이러한 관점에 따른 분석방법은 인자-결핍 기질 플라스마, 활성제 및 인지질을 포함한 활성화 혼합물을 첨가하는 단계를 포함한다.

유리하게는 여기에 기술된 분석방법은 현존하는 방법을 수행하는 것보다 더 빠르다. 이러한 원인은 2가지이다. 첫 번째로 여기에 기술된 분석방법은 혈액 응고 인자-결핍 플라스마가 활성제 및 인지지 또는 그의 혼합물에 첨가되는 것이 필요한 현존하는 1 단계 분석보다 1 단계 적게 포함한다. 여기에 기술된 인자-결핍 플라스마, 활성제 및 인지질은 분석에 사용되기 전에 단일 혼합물로서 제공된다. 두 번째로 약 37℃에서의 10분간 인큐베이션 단계가 생략된다. 대신에 활성화 혼합물이 필요한 온도로 예열되어 다른 분석 성분과 직접 혼합될 수 있다.

유리하게는 여기에 기술된 분석방법은 현존하는 방법보다 수행하기에 더욱 간단하다. 이는 상기 기술된 바와 같이 더 적은 단계를 포함한 본 발명의 분석방법에 의한 것이다.

유리하게는 여기에 기술된 분석방법은 현존하는 방법보다 자동화에 더욱 용이하다. 이는 본 발명의 분석방법이 더 적은 단계를 포함하고 약 37℃에서의 10분간 인큐베이션 단계가 필요하지 않기 때문이다. 따라서 여기에 기술된 분석방법의 성분은 분석 혼합물 내로 직접 첨가될 수 있고 응고 시간/응고 종점이 측정될 수 있다.

바람직한 실시태양에서 분석방법은: (a) 시험 표본을 제공하는 단계; (b) 본 발명에 따른 활성화 혼합물을 제공하는 단계; (c) 시험 표본과 활성화 혼합물을 함께 첨가하는 단계; (d) 칼슘 반응제를 첨가하는 단계; 및 (e) 응고 시간/응고 종점을 측정하는 단계를 포함한다.

본 발명의 분석을 수행시 단백질 농도, 인큐베이션 시간, 반응제 농도 및 온도 상의 변동이 이용된다. 특정한 분석 파라미터의 선택은 원료, 형태 및 분석되는 표본의 크기, 시험 표본 내에 함유된 혈액 응고 인자의 예상 수준 및 원하는 민감도에 의해 영향 받을 것이다. 이러한 상황을 고려하면 분석 파라미터의 선택이 당업자에게 명백해질 것이다.

표준 및 시험 표본의 희석에 사용되는 배지는 일반적으로 칼슘 이온을 함유하지 않는 완충제 - 바르비탈, 바르비탈-아세테이트, 이미다졸 또는 트리스와 같으나 이에 한정적이지 않은 -를 포함한다.

완충제는 생리적 pH로 적정되고 생리 이온 강도를 제공하기 위해 식염수로 보충된다.

단백질 농도가 다른 물질이 시험되는 경우 - 플라스마에 대한 농축액과 같은 - 추가 단백질이 이러한 차이를 감추기 위해 완충액 내에 포함된다. 대안으로, 정상 플라스마 표본을 모방하기 위해 농축액의 첫 번째 희석(미리-희석)이 혈액 응고 인자-결핍 플라스마 내에 수행된다.

약 37℃의 반응 온도는 혈액 응고 인자의 활성화 및 응고 단계를 위해 일반적으로 사용된다. 그러나 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36℃와 같은 더 낮은 온도 내지 38, 39 또는 40℃와 같은 약간 더 높은 온도에서 응고 시간/응고 종점이 영향을 받기 때문에 당업자는 온도가 37℃ 이외도 됨을 이해할 것이다. 이러한 영향은 응고 시간을 증가시키거나 감소시킨다.

그러나 온도가 37℃보다 높거나 낮은지 여부에 관계없이 분석 동안 일정한 온도를 유지하는 것이 바람직하다. 이는 분석 동안 작은 변동이 응고 시간/응고 종점에 영향을 미치기 때문이다.

다양한 장치 - 튜브 및 반응 큐벳(cuvette)과 같은 -가 본 발명의 분석방법에 일반적으로 사용된다. 이러한 장치는 예를 들어 플라스틱 또는 유리로 이루어진다. 분석 시스템 내의 접촉 활성이 활성화 혼합물의 첨가에 의해 표준화되기 때문에 장치의 조성은 거의 중요하지 않다.

바람직하게는 기계에서 사용시 - 반-자동화 또는 전체 자동화 기계(즉, 코어귤로미터)와 같은 - 장치는 최적으로 규격화되어야 한다(Zacharski & Resenstein (1978) Am. J. Clin. Pathol. 70, 280-286).

여기에 기술된 분석방법의 수행시 당업자는 다수의 포인트가 3가지 다른 희석의 최소한도로부터 일반적으로 유래되나 적당한 변형 후 직선이 그어질 수 있도록 사용되는 희석이 선택되어야 함을 이해할 것이다. 일반적으로 용량(혈액 응고 인자 농도) 및 반응(응고 시간)의 그의 알고리즘으로의 변형 또는 용량만의 변형은 일반적으로 희석 범위에 대한 직선을 유발한다.

일반적으로 반응제의 첨가 순서는 중요한 인자가 아니다. 그러나 안정성의 이유로 혈액 응고 인자 시험 표본으로 시작하는 것이 아니라 - 희석된 혈액 응고 인자 시험 표본과 같은 - 활성화 혼합물로 시작한 후 혈액 응고 인자 시험 표본이 뒤따르는 것이 더욱 좋다. 이후 칼슘 반응제가 활성화 혼합물/시험 표본 내로 첨가된다.

시험 표본

여기에 사용된 "시험 표본"이라는 용어는 그의 본래의 의미를 지닌다.

시험 표본은 표본 내 혈액 응고 인자의 양이 본 발명에 따라 측정되는 어떠한 물질적 실체도 된다.

표본은 포유류이거나 그로부터 유래된다. 바람직하게는 시험 표본은 동물 또는 인간이거나 그로부터 유래된다. 가장 바람직하게는 시험 표본은 인간이거나 그로부터 유래된다.

표본은 포유류 또는 비-포유류 발현 시스템 내에서 혈액 응고 인자를 인코드하는 정상 또는 변형된 인간 유전자의 발현이거나 그로부터 유래된다.

표본은 재조합 생물학적 물질을 포함한 생물학적 물질이거나 그로부터 유래된다.

시험 표본은 예를 들어 정맥 또는 모세혈관 플라스마와 같은 혈액 또는 그의 구성성분이거나 그로부터 유래된다.

바람직하게는 시험 표본은 본 발명에 따른 분석방법에 사용되기 전에 예열된다. 더욱 바람직하게는 시험 표본은 약 37℃로 예열된다.

혈액은 Langdell et al.(1953) J. Lab. Clin. Med. 41, 637-647에 의해 기술된 방법에 따라 준비된다. 간단히, 혈액은 전주(antecubital) 또는 경(jugular) 정맥천자와 같은 정맥천자에 의해 수득되고 구연산나트륨 또는 수산나트륨과 같은항응고제와 즉시 혼합된다.

적당하게는 플라스마 표본은 분석될 때까지 일반적으로 혈액 표본의 채취 1시간 이내에 용해 얼음 상에서 보관되어야 한다.

정맥 플라스마는 Hardisty and Macpherson (1962) Thromb. Diath. Haemorrh 7, 215-229의 방법에 따라 제조된다. 간단히, 전주 정맥으로부터 3.1% 구연산삼나트륨 1 부피 내로 9 부피의 혈액이 취해지고 적어도 15분 이상 동안 약 2000 g에서 원심분리되어 혈소판 부족 플라스마가 수득된다. 플라스마는 -20℃ 이하에서 보관되고 사용 직전에 해동된다. 분석용 시험 및 대조군 플라스마는 pH 7.35에서 0.15% 구연산삼나트륨을 함유한 9 부피의 베로날(veronal)-완충된 등장 식염수(VBIS)로 희석된다. 추가 희석은 구연산염이 없는 VBIS 내에서 이루어질 수 있다.

모세혈관 플라스마는 Hardisty and Macpherson (1962) Thromb. Diath. Haemorrh 7, 215-229의 방법에 따라 제조된다. 간단히, Dormandy and Hardistry (1961) J. Clin. Path. 14, 543에 기술된 바와 같이 0.2 ml의 자유 유동 모세혈관 혈액이 0.2% 구연산삼나트륨을 함유한 1.8 ml의 VBIS 내로 취해져서 전체 혈액의 1:10 희석을 제공하고, 15분간 2000 g에서 원심분리되어 희석 혈소판-부족 플라스마가 수득된다. 추가 희석은 VBIS 내에서 이루어질 수 있다. 낮은 혈액 응고 인자 농도가 예측되는 경우 0.2 ml의 모세혈관 혈액이 0.22% 구연산삼나트륨을 함유한 0.8 ml의 VBIS 내로 취해져서 전체 혈액의 1:5 희석을 제공한다.

혈액 응고 인자 표준

여기에 기술된 분석방법 내의 또다른 파라미터는 혈액 응고 인자 표준이다. 일반적으로 표준은 시험 표본와 사실상 유사해야 한다. 이는 비병행(nonparallelism)의 위험을 감소시키고, 희석 배지 내에서 단백질에 의해 작용된 효과를 제거하고, 적은 변이를 지닌 더 많은 재현 가능한 결과를 야기한다.

플라스마 표준을 제조하는 하나의 방법은 Harper & Chauhan (1981) Am. J. Clin. Pathol. 77, 614-618에 의해 기술되어 있다. 간단히, 제한된 수의 기부로부터의 플라스마 풀(pool) - 4와 같이 -이 작은 알리쿼트로 빠르게 동결되고 동결 또는 동결건조되어 보관된다. 이후, 1 U/ml의 임시 역가(단위는 1 ml의 정상 플라스마 내에 존재하는 혈액 응고 인자의 양으로 정의됨)가 본 표준에 대해 추정된다. 이후, 약 30～40개 결과가 수득될 때까지 신선한 플라스마 표본의 혈액 응고 인자 함량이 표준에 대해 측정된다. 이들 표본에 대한 평균 결과가 정의 1 U/ml에 의한 것이기 때문에 표준의 실제 역가는 1 U/ml를 분명한 플라스마 평균으로 나눔으로서 계산될 수 있다.

당업자는 이러한 방법이 국제 단위(IU)를 정의하는 Concentrate and Plasma내의 응고인자 Ⅷ와 같은 혈액 응고 인자에 대한 국제 표준의 도입에 의해 대체되었음을 인식할 것이다.

응고인자 Ⅷ와 같은 혈액 응고 인자에 대한 국제 표준은 세계보건기구에 의해 수립되었고(Bangham et al. (1971) Bull. Wld. Hlth. Org. 45, 337-351) 이후에 다양한 국제 표준이 고안되었다. 국제 농축액 표준의 다른 버전은 중간, 높은 및 매우 높은 정제 플라스마-유래 농축액으로 구성되었다. 현재 버전(6^th IS)은 재조합 혈액 응고 인자이다.

이들 표준은 National Institute of Biological Standards and Control, London, Potters Bar, UK로부터 수득된다. 예를 들어 21st British Standard FⅧ Plasma(NIBSC 코드 00/586)이 사용된다.

응고 시간/응고 종점의 측정

다양한 방법이 응고 검출에 이용된다.

예로서 워터 배쓰 내의 후크 또는 틸팅(tilting) 튜브가 수동 측정에 사용된다. 대안으로, 반-자동화 코어귤로미터는 섬유소 실 형성, 점도의 증가, 섬유소 응고에 의한 강철 막대 또는 볼의 전치, 응고 형성시(포토-옵티칼 기구 이용시) 반응 혼합물의 광 투과 또는 광선 투과의 변화에 기반한 다른 형태의 기구를 검출하는데 사용된다.

또한 종점의 검출을 위한 반- 또는 전체-자동화 코어귤로미터와 같은 자동화 기계가 사용된다(Harms et al. (1978) Am. J. Clin. Pathol. 70, 560-562).

일반적으로 코어귤로미터는 더욱 빠른 시험 방법을 제공한다.

유리하게는 응고 시간/응고 종점은 니어-페이션트 테스팅(near patient testing) 또는 포인트-오브-케어 장치를 이용하여 측정된다.

당업자는 응고 시간/응고 종점이 측정되면 다양한 계산 및 통계 분석 방법이 시험 표본 내의 혈액 응고 인자의 양을 측정하는데 적용됨을 이해할 것이다.

바람직하게는 사용되는 방법은 분석이 유효한지 여부를 수립할 것이고, 예를 들어 손으로 용량 반응 곡선을 주관적으로 그리는 오류에 의해 치우치지 않는 역가의 더욱 정확한 평가를 제공할 것이기 때문에 회귀 분석에 기반한 프로그램화된 계산이다.

일반적으로 용량-반응 곡선이 직선성 또는 병행론에서 벗어날 때 분석은 무효로 고려될 것이다. 이러한 편향의 존재는 분산의 분석에 의해 평가될 수 있다. 이로 인해 무작위 오류를 측정하고 적어도 3 이상의 희석 내의 모든 제제를 시험하기 위해 각 희석에 대한 반복을 시험할 필요가 있다. 평행-선 생물검정을 분석하는 컴퓨터 프로그램이 Williams et al. (1975) Brit. J. Haematol. 31, 13-23; Counts & Hays (1979) Am. J. Clin. Pathol. 71, 167-171; Kirkwood & Snape (1980) Clin. Lab. Haematol (1980) 2, 155-167에 의해 기술되어 있다.

키트

또다른 관점에서 본 발명은 활성화 혼합물을 함유한 용기를 포함한 시험 표본 내 혈액 응고 인자의 양을 측정하는 키트에 관한 것이다.

희석제를 함유하거나 포함한 추가 용기가 포함된다.

칼슘 반응제를 함유하거나 포함한 추가 용기가 포함된다.

혈액 응고 인자 표준과 같은 혈액 응고 인자를 함유하거나 포함한 추가 용기가 포함된다.

포인트 오브 케어 및 니어 페이션트 테스팅

유리하게는 응고 시간 및/또는 응고 종점은 예를 들어 전체 혈액 또는 플라스마가 여기에 기술된 변형된 활성화 혼합물을 함유한 카트리지 또는 카세트와 같은 장치 요소에 첨가되는 포인트-오브-케어 테스팅 장치를 이용하여 측정된다.

포인트-오브-케어 테스팅은 표본이 실험실 테스팅 시설로 운반되고 처리되고 결과가 발송되는 동안의 몇 시간에서 몇 주까지 될 수 있는 기다리는 기간이 있는 통상의 테스팅과는 대조적으로 즉각적인 결과를 제공하는 장점을 제공한다.

포인트 오브 케어 테스팅은 의사의 사무실 내에서, 침상에서, 임상 실험 병원과 같은 실험실에서 야외 또는 다른 위치와 같은 사이트 상에서 빠르게 수행된다.

지혈의 포인트 오브 케어 테스팅의 연구는 Thrombosis Journal (2003) 1, 1.에 나타나 있다. 여기에 기술된 바와 같이 혈액 응고 시간/응고 종점을 측정하는 다양한 방법 및 장치가 고안되었다. 더욱이 혈액 점탄성 성질 및/또는 혈소판 기능을 평가하는 다른 침상 기구는 섬유소 분해 및 혈소판 기능에 대한 추가 정보가 빠르게 수득될 수 있게 한다.

현재 유용한 대부분의 기구는 카트리지 또는 시험관이 선택되는 것에 따라 다수의 응고 시험을 수행할 수 있다. 이러한 기구의 예는 하기에 요약된다.

Hemochron 자동화 기구(International Technidyne Corp, USA - ITC) J(Extra Corpor Technol 1999, 31:130-134)는 셀라이트 또는 고령토를 포함한 튜브 또는 실리카, 고령토 및 인지질 제제로 미리 장전된 카트리지를 이용한 2가지 형태의 장치를 포함한다.

Automated Coagulation Timer Ⅱ(ACT Ⅱ) 및 Hepcon Hemostasis Management System(HMS)(Medtronic Hemotec, USA)는 활성제로서 고령토 또는 덜 일반적으로는 셀라이트를 이용하여 혈액 응고를 측정한다.

Rapidpoint Coag 기계(Bayer, USA)로 수행되는 Heparin Management Test(HMT)는 시험-특이적 반응제(셀라이트 및 안정화제) 및 진동 자기장에 대한 반응하여 운동하는 상자성 이온 산화물 입자(PIOPs)를 지닌 반응 챔버를 포함한 1회용 시험 카드를 이용한다.

i-STAT analyzer(Abbott, USA)는 셀라이트 미리 장전된 카트리지를 지닌 전체-혈액-기반 테스팅에 대해 고안되었다.

Actalyke Activated Clotting Time(Array Medical, Somerville, NJ) 시험 시스템은 Hemochron 시리즈와 같은 전자기 응고 검출을 이용한다. 셀라이트 이외에 본 시스템은 MAX-ACT를 수행하고, 이는 모든 응고인자 XⅡ를 XⅡa로 최대한 전환시키기 위해 활성제(셀라이트, 고령토 및 유리 비드)의 "칵테일"을 함유한 튜브를 이용하는 새로운 형태의 ACT이다.

혈액 응고 형성을 평가하는 다양한 자동화 시스템도 유용하다(Blood Coag Fibrinol 2001, 12:327-337; Br J Anaesth 1995, 75:771-776).

TEG 장치는 이중-채널 Coagulation Analyzer(Teg^R-Hemoscope, USA) 및 Teg^R 분석 소프트웨어를 포함한 벤치-탑(bench-top) 기구로 구성된다. TEG는 응고 형성 및 세포용해의 관점의 그래프 표현을 제공한다.

ROTEG 분석(Pentapharm, GMBH)는 회전 혈전탄성묘사기(thromboelastography)에 기반하고, 이는 TEG로의 전통적인 분석과 다른 일부 관점에 관련된다.

Sonoclot analyzer(Sienco Inc, USA)는 혈액 응고의 점탄성 성질 내의 변화를 측정한다.

Platelet function Analyzer-100(PFA-100, DADE Behring, USA)은 콜라겐과 에피네프린 또는 콜라겐과 이인산아데노신으로 코팅된 합성 멤브레인으로 절단된 정밀하게 한정된 틈을 폐색하기 위해 구연산화된 전체 혈액 내의 혈소판에 필요한 폐쇄 시간(closure time, CT)을 측정함으로서 전체 혈액 혈소판 기능을 평가한다.

여기에 사용된 바와 같이 시험 표본 내의 혈액 응고 인자의 양은 혈액 응고 시간/응고 종점으로부터 계산된다.

또한 유리하게는 응고 시간/응고 종점은 니어 페이션트 테스팅(near patient testing)을 이용하여 측정된다.

니어 페이션트 테스팅 장치의 이용은 British Journal of Haematology (2001) 113, 847-852 내에서 연구되었다.

일반적으로 니어 페이션트 테스팅 장치는 염화칼슘이 있거나 없거나 동결-건조된 반응제와 같은 반응제를 혼합시킨 작은 카트리지 내에 건조된 반응 챔버 내로 구연산화된 혈액 또는 플라스마와 같은 전체 혈액을 첨가하면 응고 형성을 검출할수 있는 작은 운반가능한 기구이다.

본 발명에서 카트리지는 변형된 활성화 혼합물을 포함한다.

니어-페이션트 테스팅 장치의 하나의 형태에서 시험 물질은 일반적으로 37℃로 예열된 카트리지의 반응 구역 내에 첨가되고, 반응은 반응제를 재구성함으로서 시작된다. 반응의 시작으로부터 경과된 시간이 기록되고 응고 시간/응고 종점으로서 장치에 의해 표시된다.

니어-페이션트 테스팅 장치의 하나의 형태에서 상자성 이온 산화물 입자는 반응 챔버 내에서 반응제와 혼합된다. 혈액의 첨가는 반응을 시작시키고 상자성 입자는 전자석이 켜지고 꺼질 때 반응 챔버 내에서 자유롭게 운동한다. 운동은 응고가 형성되면 중지하고 이는 응고 시간/응고 종점으로서 장치에 의해 기록된다.

다른 장치는 Coagucheck(Roche Diagnostics); Protime Microcoagulation System(International Technidyne Corp)를 포함하나 이에 한정적인 것은 아니다. 다른 장치는 www.pointofcare.net/vendors/index.htm에 기술되어 있다.

본 발명은 실시예에 의해 더욱 상세히 설명될 것이고, 이는 본 발명의 수행시 당업자를 돕고자 하는 것이나 본 발명의 범위를 한정하고자 하는 것은 아니다.

도 1

현존하는 1-단계 분석방법 및 본 발명에 따른 변형된 1-단계 분석방법의 개요.

도 2

4℃에서 5시간 동안 활성화 혼합물의 안정성을 나타낸 그래프.

도 3

22℃에서 5시간 동안 활성화 혼합물의 안정성을 나타낸 그래프.

도 4는

FⅧ-결핍 플라스마에 첨가된 FⅧ에 대한 용량 반응을 나타낸 그래프. 그래 프는 응고 시간(초)(수직축) 및 FⅧ-결핍 플라스마 내에 스파이크된 FⅧ의 농도(수평축)를 나타낸다.

(실시예 1)

1-단계 응고 분석을 위한 수립된 방법과 변형된 방법의 비교

수립된 방법과 변형된 방법의 직접적인 비교(도 1)는 낮은 FⅧ:C(약 25% 정상)을 지닌 시험 플라스마 표본을 이용하여 수행되었다. 시험 표본 내 FⅧ:C의 추정은 21st British Standard FⅧ 플라스마에 대해 계산되었다.

재료 및 방법

분석 표본

참조 표준: ml 당 0.55 IU의 지정된 수치를 지닌 21st British Standard FⅧ 플라스마(NIBSC 코드 00/586)

시험 표본: ml 당 약 0.25 IU의 FⅧ:C 함량을 제공하는 FⅧ-결핍 플라스마 내 희석된 정상 인간 플라스마. 동결된 알리쿼트로 보관됨.

기구:

KC-4 coagulometer(Amelung)

방법

균형잡힌 디자인(12-플레이스 분석)에 따른 각 방법을 이용하여 2개의 독립적인 분석이 수행되었다.

표준 및 시험의 3개 희석의 표준/시험이 각 분석에서 반복으로 분석되었다(표준은 1/10, 1/30, 1/100으로 희석되고 시험은 1/3, 1.10, 1.30으로 희석됨).

ⅰ. 수립된 방법 (KC-4 coagulometer)

FⅧ-결핍 플라스마(Organon Teknika/Biomerieux) 0.1 ml

+

표준/시험 희석 0.1 ml

+

APTT 반응제(Intrumentation Laboratory APTT-SP 액체) 0.1 ml

37℃에서 10분간 인큐베이트

CaCl₂ 25 mmol/L 0.1 ml

응고 시간 측정

ⅱ. 변형된 방법(본 발명에 따른)

표준/시험 희석 0.1 ml(37℃)

+

미리-인큐베이트된 FⅧ-결핍 플라스마/APTT 반응제 0.2 ml(37℃)

+

CaCl₂ 25 mmol/L 0.1 ml(37℃)

응고 시간 측정

분석 상의 주의

상대 역가 추정은 A.D. Curtis "The Statistical Evaluation of Factor Ⅷ Clotting Assays" in Scand. J. Haematol. supplement(1984) 41, 33 p55-68에 기술된 바와 같이 로그 반응에 대한 로그-용량에 관련한 평행선 생물-검정 원리에 따라 분석되었다. 이러한 분석은 표준 및 시험 표본의 용량-반응 관계의 병행론에 관련된다. 이러한 기준은 모든 분석에 대해 만족되었다:

결과

ⅰ. 수립된 방법

a) 응고 시간(초)

b) 상대 역가 평가(ml 당 IU)

ⅱ. 변형된 방법

a) 응고 시간(초)

b) 상대 역가 평가(ml 당 IU)

결론

변형된 방법을 이용하여 수득된 역가 평가는 수립된 방법을 이용하여 수득된 평가와 유의적으로 다르지 않았다.

(실시예 2)

활성화 혼합물의 안정성

Intrumentation Laboratory APTT 반응제(APTT-SP)(실리카 활성제 + 인지질 혼합물)가 응고인자 Ⅷ-결핍 플라스마(Organon Teknica)의 동일한 부피로 혼합되고 10분간 37℃에서 인큐베이트되었다. 이후 혼합물은 4℃ 또는 22℃에서 보관된다.

응고 시간은 0.2 ml의 미리-활성화된 반응제 혼합물(37℃로 예열)을 0.2 ml의 응고인자 Ⅷ/염화칼슘 혼합물(37℃로 예열)과 혼합시킨 후 측정된다. 측정은 응고인자 Ⅷ 시험 표본의 신선한 알리쿼트를 이용하여 30분마다 이루어진다(응고인자 Ⅷ 불안정성의 효과를 방지하기 위해).

결과는 도 1 및 2에 나타나 있다.

따라서 활성화 혼합물은 적어도 5시간 이상 동안 4℃ 및 22℃에서 안정함이 증명되었다.

(실시예 3)

변형된 방법의 민감도

다양한 농도의 정제 FⅧ(1 부피)로 스파이크된 응고인자 Ⅷ-결핍 플라스마가 실시예 1에서 준비된 미리-활성화된 반응제(2 부피) 및 염화칼슘(25 mmol/ml)(1 부피)과 혼합되었고 응고 시간이 측정되었다.

모든 반응제는 37℃로 예열되었다.

결과는 도 4에 나타나 있다.

그래프는 응고 시간(초)(수직축) 및 FⅧ-결핍 플라스마 내에서 스파이크된 FⅧ의 농도(수평축)을 나타낸다.

여기에 기술된 변형된 방법은 NPT/POC 장치에 이용하기에 적당함이 이해된다.

상기 명세서 내에서 논의된 모든 문헌은 참고문헌으로 포함된다. 기술된 본 발명의 방법 및 시스템의 다양한 변형 및 변화가 본 발명의 범위 및 정신에서 벗어남이 없이 당업자에게 명백해질 것이다. 본 발명이 특정한 바람직한 실시태양과 관련하여 기술되었으나 청구된 본 발명이 이러한 특정한 실시태양에 부당하게 한정적이지 않아야함이 이해되어야 한다. 실제로 생물학 또는 관련 분야의 기술자에게 분명한 본 발명을 수행하기 위한 기술된 방법의 다양한 변형은 하기 청구항의 범위 내에 있다.

Claims

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(a) 시험 표본을 제공하는 단계; (b) 인자-결핍 기질 플라스마, 활성제 및 인지질을 포함하는 활성화 혼합물을 제공하는 단계; (c) 시험 표본 및 활성화 혼합물을 함께 첨가하는 단계; (d) 칼슘 반응제를 첨가하는 단계; (e) 응고 시간 또는 응고 종점을 측정하는 단계; 및 (f) 시험 표본 내의 혈액 응고 인자의 양을 측정하는 단계;로 이루어진 시험 표본 내의 혈액 응고 인자의 양을 측정하기 위한 분석방법에 있어서,

상기 단계 (a)의 시험 표본, 단계 (b)의 활성화 혼합물 및 단계 (d)의 칼슘 반응제는 분석 전에 예열되어 있음을 특징으로 하는 시험 표본 내의 혈액 응고 인자의 양을 측정하기 위한 분석방법
제 11항에 있어서, 상기 단계 (a)의 시험 표본, 단계 (b)의 활성화 혼합물 및 단계 (d)의 칼슘 반응제는 37℃로 예열되어 있음을 특징으로 하는 분석방법
제 11항에 있어서, 상기 응고 시간 또는 응고 종점은 코어귤로미터(coagulometer)를 이용하여 측정됨을 특징으로 하는 분석방법
제 11항에 있어서, 상기 응고 시간 또는 응고 종점은 현장 현시 검사(point of care testing) 장치 또는 환자 주위 케어(near patient care) 장치를 이용하여 측정됨을 특징으로 하는 분석방법
제 11항에 있어서, 상기 활성제는 마이크론화된 실리카임을 특징으로 하는 분석방법
제 11항에 있어서, 상기 인지질은 합성 인지질임을 특징으로 하는 분석방법
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제 11항에 있어서, 상기 활성제 및 인지질은 단일 반응제로서 제공됨을 특징으로 하는 분석방법
제 24항에 있어서, 상기 단일 반응제는 활성화 부분 트롬보플라스틴 시간(APTT) 반응제임을 특징으로 하는 분석방법
제 11항에 있어서, 상기 인자-결핍 기질 플라스마는 화학적 또는 면역학적으로 고갈되어 있음을 특징으로 하는 분석방법
제 11항에 있어서, 상기 활성화 혼합물은 4℃ 또는 22℃에서 적어도 5 시간 이상 동안 안정함을 특징으로 하는 분석방법