KR101130587B1 - 생물질 제조용 글루코오스 수송 돌연변이 - Google Patents

Abstract

탄수화물 수송을 위해 포스포트랜스퍼라제 수송계 (PTS) 를 원래 이용할 수 있는 PTS^-/Glu^- 박테리아 세포에 Glu⁺ 표현형을 회복시키는 방법이 개시되어 있다. 상기 Glu⁺ 표현형을 포함하는 박테리아 세포는 갈락토오스 투과효소 및 글루코키나아제를 코딩하는 폴리뉴틀레오티드에 작동적으로 연결된, 변경된 내재성 염색체 조절 영역을 갖는다.

Description

생물질 제조용 글루코오스 수송 돌연변이{GLUCOSE TRANSPORT MUTANTS FOR PRODUCTION OF BIOMATERIAL}

관련 출원에 대한 상호 참조

본 출원은 2002 년 10 월 4 일 출원된 미국 가출원 제 60/416,166 호 및 2002 년 10 월 4 일 출원된 미국 가출원 제 60/374,931 호를 우선권 주장하고 있으며, 이는 이로써 참조 문헌으로 포함된다.

본 발명은 박테리아 숙주 세포 내의 유전 공학적 대사 경로에 관한 것이며, 조작된 (engineered) 숙주 세포 내의 바람직한 생성물의 제조를 위한 방법 및 시스템을 제공한다. 특히, 본 발명은 숙주 균주 내에서의 글루코오스 수송의 강화에 관한 것이며, 이는, PTS 포스포에놀피루베이트(PEP) 소비의 감소 및 PEP 또는 PEP 전구체를 통상의 방향족 아미노산 경로와 같은 바람직한 대사 경로로의 방향 변경에 의해서, 글루코오스 수송을 위해, 원래 포스포에놀피루베이트(PEP):인산전이효소 수송 시스템(PTS)를 사용할 수 있다.

많은 산업적으로 중요한 미생물들은 생합성 산물을 생산하기 위해 그들의 주 탄소원으로 글루코오스를 사용한다. 따라서, 상기 산물의 비용-효과적 및 효율적인 생합성적 제조는 높은 백분율의 수율로 상기 산물로 전환되는 글루코오스와 같은 탄소원을 필요로 한다. 이러한 필요를 만족시키기 위해서, 통상의 방향족 경로, TCA 경로 및 보전(anaplerotic) 옥살로아세테이트 합성경로와 같은 다양한 대사 경로 내 또는 이를 통한 탄소원의 유입을 증가시키는 것이 유리할 수 있다.

숙주 세포 탄수화물 대사의 초기 단계에서, 각각의 글루코오스 분자는 사이토졸 (cytosol) 내에서 포스포에놀피루베이트(PEP) 분자 2 개로 전환된다. PEP 는 세포들이 그 생합성 경로에서 사용하는 주요 대사 형성 장벽(building blocks) 중의 하나이다. 예를 들면, PEP 는 추가로 피루베이트로 전환될 수 있고, 글루코오스를 피루베이트로 전환하는 화학 반응은 Embden-Meyerhoff 경로로서 언급된다. 최초 글루코오스 탄수화물과 최종 생성물 사이의 모든 대사 중간체, 피루베이트는 모두 인산화 화합물이다. Embden-Meyerhoff 경로를 통하여 글루코오스를 발효시키는 박테리아, 예컨대 Enterobacteriacea 및 Vibrionaceae 의 구성원은 [Bouvet 등, (1989) International Jounal of Systematic Bacteriology, 39:61-67] 에 기재되어 있다. 그 후, 피루베이트는 대사되어, 락테이트, 에탄올, 포르메이트, 아세테이트 및 아세틸 CoA 와 같은 생성물을 제공한다(도 1A 및 1B 참조).

Embden-Meyerhoff 경로 외에, 많은 박테리아는 포스포에놀피루베이트(PEP)-의존성 인산전이효소 수송 시스템(PTS)으로 공지된 능동수송 시스템을 가진다. 상기 시스템은 글루코오스와 같은 탄소원의 수송을 그 인산화와 커플링되어 있다. 인산기는 PEP 에서 효소 I 로 및, 효소 I 에서 단백질 Hpr 로 순차적으로 전이된다. 실제 전위(translocation) 단계는 막 결합 효소들(효소 II 라 함)의 패밀 리에 의해 촉매화되는데, 이들 각각은 하나 이상의 탄소원에 특이적이다. 참고 문헌으로서, [Postma 등, (1993) Phosphoenolpyruvate: Carbohydrate Phosphotransferase Systems in Baceteria, Microbiol. Reviews. 57:573 - 594] 및 [Postma P.W. (1996) Phosphotransferase System for Glucose and Other Sugars. In: Neidhardt 등, Eds. Escherichia Coli and Salmonella Typhimurium: Cellular and Molecular Biology. Vol. 1. Washington, D.C. ASM Press pp 127 - 141] 이 있다. 그러나, PTS 가 PEP 를 대사시켜 탄소원을 인산화한다는 사실 때문에, PTS 시스템은 탄소 기질의 바람직한 생성물로의 전환 효율을 감소시킨다. 해당과정(glycolysis)에서, 2 개의 PEP 분자는 모든 동화된(catabolized) 글루코오스 분자를 형성한다. 그러나, 1 개의 PEP 분자는, 다른 생합성 반응에 필요한 오직 하나의 PEP 분자를 남겨 둔채, PTS 가 작용하기 위해 필요한다.

PEP 의 중심 대사체(central matabolite)로서의 역할 때문에, 수많은 접근법들이 세포 내에서의 PEP 공급을 증가시키기 위해 이용되어 왔으며, 이들 중 몇몇은 하기와 같다:

a) pyk 돌연변이의 생성에 의한 피루베이트 키나아제 활성의 제거. 피루베이트 키나아제는 PEP 의 피루베이트로의 전환을 촉매화한다(Mori 등, (1987) Agric. Biol. Chem. 51:129-138);

b) ppc 돌연변이의 생성에 의한 PEP 카르복실라제 활성의 제거. PEP 카르복실라제는 PEP 의 옥살로 아세테이트로의 전환을 촉매화한다 (Miller 등, (1987) J. Ind. Microbiol. 2:143-149);

c) PEP 합성효소를 코딩하는 pps 의 발현 증폭. PEP 합성효소는 피루베이트의 PEP(USSN 08/307,371)로의 전환을 촉매화한다; 그리고

d) 예를 들면, 트랜스케톨라아제 유전자(tktA 또는 tktB)의 과발현 (미국 특허 제 5,168,056 호) 또는 트랜스알돌라아제 유전자(talA)의 과발현(Iida 등, (1983) J. Bacteriol. 175:5375-5383) 에 의한 D-에리트로스-4-포스페이트(E4P) 의 공급의 증가. 트랜스케톨라아제는 D-프룩토스-6-포스페이트의 E4P 로의 전환을 촉매화하고, 트랜스알돌라아제는 D-세도헵툴로스-7-포스페이트 + 글리세르알데히드-3-포스페이트의 E4P + 프룩토스-6-포스페이트로의 전환을 촉매화한다.

상기 접근법들 외에, 연구자들은 PTS 의 작용을 제거 또는 변경함으로써 PTS : PEP 의존형 소비를 감소시키는 방법을 찾아보았다. 이러한 접근법은, PEP 가 ATP 보다 2 배로 에너지 작용하기 때문에 또한 매력적이다. 많은 이러한 노력들은 불활성 PTS 시스템의 사용에 초점을 두고 있다. PTS 시스템을 다루는 연구들의 예로서 하기가 있다:

a) Zymomonas mobilis 유래의 글루코오스-촉진화 확산 단백질 및 글루코키나아제를 각각 코딩하는, glf 및 glk 유전자를 도입함으로써, PTS 불활성화 E. coli 세포 내의 글루코오스 표현형(Glu⁺)의 회복, 여기서 E. coli 세포는 pstHlcrr 오페론의 결실에 의하여 불활성화된 PTS 를 가짐(미국 특허 제 5,602,030 호 및 Snoep 등, (1994) J. Bact. 176:2133-2135) 및

b) PTS^-/Glu^- E. coli 균주를 글루코오스 상의 연속적인 배양 선택에 적용하 여, 야생형 PTS^-/Glu^- 균주 것과 동등 또는 그 이상의 성장 속도를 수득하는 용량으로 Glu⁺ 복귀변이체(revertant)(PTS^-/GL⁺) 를 수득함 (Flores 등, (2002) Metab. Eng 4:124 - 137; Flores 등, (1996) Nature Biotechnol. 14:620 - 623 및 WO96/34961).

그러나, 상기 접근법들은 다양한 제한을 가진다. 일반적으로, 이종성 유전자들의 사용은 새로운 숙주에서 항상 효율적으로 작동하는 것은 아니다. 게다가, 글루코오스-촉진화 확산 단백질과 같은 막 단백질들은, 보통 세포막 내에서 지질과 친밀하게 회합되고, 이들은 종별로 다양할 수 있다. 글루코키나아제와 같은 도입된 가용성 단백질들은, 단백분해효소(protease) 분해에 적용될 수 있다. 또한, 표현형을 다시 얻기 위해 세포 내에서의 자발적인 돌연변이의 이용은 예측 불가능한 결과를 가질 수 있으며, 완전히 특징화된 균주를 사용하는 것이 산업적인 공정을 위해서 바람직하다.

상기 방법과는 대조적으로, 본 발명은 공정 동안 PEP 의 소비 없이, 글루코오스를 수송할 수 있는 박테리아 균주 내의 대사 경로로의 탄소 흐름을 증가시킨다. 그 후, 전환된 PEP 또는 PEP 전구체는 바람직한 생성물의 증강된 생산을 위해 주어진 대사 경로로 방향이 바뀔 수 있다. 불활성화된 PTS 를 유지하면서, 탄소원으로서의 글루코오스를 사용하는 세포의 능력을 회복 또는 다시 얻기위해, 글루코오스 동화 단백질 및 더욱 구체적으로 글루코오스 수송자 및/또는 글루코오스 인산화 단백질에 작동적으로 연결되어 있는 내인성 염색체 조절 영역의 변 형에 의해서, 상기 균주들은 불활성화된 PEP-의존성 PTS 를 가지는 세포 내에서 발생된다. 상기 세포들은 지정된 PTS^-/Glu⁺ 이다.

발명의 개요

따라서, 본 발명에 의해서 박테리아 숙주 세포의 대사 경로로의 탄소 흐름을 증가시키는 방법이 제공되는데, 여기서 상기 숙주 세포는 원래 탄수화물 수송을 위해 PTS 를 사용할 수 있다. 상기 방법은 표현형이 PTS^-/Glu^- 인 박테리아 숙주 세포의 선택, 및 Glu⁺ 표현형을 회복하기 위해 글루코오스 동화에 수반되는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산에 작동적으로 연결되어 있는 내인성 염색체 조절 영역의 변형을 포함한다.

제 1 측면에서, 본 발명은 원래 탄수화물 수송을 위해 인산전이효소 수송계(PTS) 를 사용할 수 있는 PTS^-/Glu^- 박테리아 숙주 세포의 대사 경로로의 탄소 흐름을 증가시키는 방법에 관한 것으로, 이는 하기 단계를 포함한다: a) 프로모터, 및 글루코오스 동화 단백질의 상류 (5') 영역에 상응하는 인접 DNA 서열을 포함하는 DNA 구축물을 사용하여, PTS^-/Glu^- 숙주 세포를 형질전환함으로써, PTS^-/Glu^- 숙주 세포 내의 글루코오스 동화 단백질을 코딩하는 핵산에 작동적으로 연결되어 있는, 내인성 염색체 조절 영역을 변화시키는 단계; b) DNA 구축물의 통합으로 Glu⁺ 표현형이 회복되도록 하는 단계; 및 c) 적절한 배양 조건 하에서의 형질전환된 숙주세포 의 배양 단계, 여기서 형질전환된 숙주 세포의 대사 경로로의 탄소 흐름은, 본질적으로 동일한 배양 조건 하에서 배양된 상응하는 PTS 박테리아 숙주 세포 내의 동일한 대사 경로로의 탄소 흐름과 비교하여 증가됨. 본 방법의 제 1 구현예에서, 프로모터는 비-숙주 세포 프로모터 또는 변형된 내인성 프로모터가다. 제 2 구현예에서, 글루코오스 동화 단백질은 글루코오스 수송자, 바람직하게는 에셰리키아 콜라이 (E. coli) 로부터 수득되는 갈락토스 투과효소(permease) 또는 그와 80% 이상의 서열 상동성을 가지는 글루코오스 수송자이다. 제 3 구현예에서, 글루코오스 동화 단백질은 인산화 단백질, 바람직하게는 E. coli 로부터 수득되는 글루코키나아제 또는 그와 80% 이상의 서열 상동성을 가지는 글루코키나아제이다. 본 방법의 제 4 구현예에서, 박테리아 숙주 세포는 에셰리키아 콜라이 (E. coli) 세포, 바실러스 (Bacillus) 세포 및 판토에아 (Patoea) 세포로 이루어진 군으로부터 선택된다. 제 5 구현예에서, PTS^-/Glu^- 숙주 세포는 ptsl, ptsH 및 crr 로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자의 결실에 의해서, PTS 세포로부터 수득된다. 제 6 구현예에서, PTS^-/Glu⁺ 숙주 세포는, 트랜스케톨라아제, 트랜스알돌라아제, 포스포에놀피루베이트 합성효소, DAHP 합성효소, DHQ 합성효소, DHQ 디하이드라타제, 시키메이트 디하이드로게나제, 시키메이트 키나아제 EPSP 합성효소 및 코리스메이트 합성효소로 이루어진 군으로부터 선택되는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 사용하여 형질전환된다.

제 2 측면에서, 본 발명은 제 1 측면에서 기술되어 있고, 또한 프로모터, 및 글루코키나아제의 상류 (5') 영역에 상응하는 인접 DNA 서열을 포함하는 제 2 DNA 구축물을 사용하여, PTS^-/Glu^- 숙주 세포를 형질전환함으로써, PTS^-/Glu^- 숙주 세포 내의 글루코키나아제를 코딩하는 핵산에 작동적으로 연결되어 있는, 내인성 염색체 조절 영역의 변형을 포함하는 방법에 관한 것이다.

제 3 측면에서, 본 발명은 원래 탄수화물 수송을 위해 PTS 를 사용할 수 있는 PTS^-/Glu^- 박테리아 숙주 세포 내에서, 요망되는 산물의 제조를 증가시키는 방법 에 관한 것이며, 이는 하기 단계를 포함한다: a) 프로모터를 포함하고 있는 DNA 구축물을 사용한 PTS^-/Glu^- 표현형을 가진 박테리아 숙주 세포의 형질전환 단계, 여기서, 상기 DNA 구축물은 글루코오스 동화 단백질을 코딩하는 핵산에 작동적으로 결합되어 있는 내인성 프로모터를 대체하고 있는 PTS^-/Glu^- 숙주 세포에 통합되어 있음; b) 적절한 조건 하에서 형질전환된 박테리아 숙주 세포를 배양하는 단계; c) 글루코오스 동화 단백질의 발현으로 PTS^-/Glu⁺ 표현형을 가진 숙주 세포를 수득하는 단계; 및 d) 본질적으로 동일한 배양 조건 하에서 배양된 PTS 박테리아 세포 내의 요망되는 생성물의 양과 비교하여, 증가된 양의 형질전환된 박테리아 숙주 세포 내의 생성물을 수득하는 단계, 여기서 상기 요망되는 생성물은 피루베이트, PEP, 락테이트, 아세테이트, 글리세롤, 숙시네이트, 에탄올 및 코리스메이트로 이루어진 군으로부터 선택됨. 제 1 구현예에서, 숙주세포는 E. coli 세포, Bacillus 세포 및 Pantoea 세포로 이루어진 군으로부터 선택된다. 제 2 구현예에서, 글루 코오스 동화 단백질은 E. coli 로부터 수득되는 갈락토스 투과효소 또는 그와 80% 이상의 서열 상동성을 가지는 글루코오스 수송자이다. 제 3 구현예에서, 글루코오스 동화 단백질은 E. coli 로부터 수득되는 글루코키나아제 또는 그와 70% 이상의 서열 상동성을 가지는 글루코키나아제이다.

제 4 측면에서, 본 발명은 원래 탄수화물 수송을 위해 PTS 를 사용할 수 있는 PTS^-/Glu^- 박테리아 숙주 세포의 대사 경로로의 탄소 흐름을 증가시키는 방법에 관한 것으로, 이는 하기 단계를 포함한다: a) 프로모터, 및 갈락토스 투과효소의 상류 (5') 영역에 상응하는 인접 DNA 서열을 포함하는 제 1 DNA 구축물을 사용하여, PTS^-/Glu^- 숙주 세포를 형질전환함으로써, PTS^-/Glu^- 숙주 세포 내의 갈락토스 투과효소를 코딩하는 핵산에 작동적으로 연결되어 있는, 내인성 염색체 조절 영역을 변화시키는 단계; b) 프로모터, 및 글루코키나아제의 상류 (5') 영역에 상응하는 인접 DNA 서열을 포함하는 제 2 DNA 구축물을 사용하여, PTS^-/Glu^- 숙주 세포를 형질전환함으로써, PTS^-/Glu^- 숙주 세포 내의 글루코키나아제를 코딩하는 핵산에 작동적으로 연결되어 있는, 내인성 염색체 조절 영역을 변화시키는 단계; c) 제 1 및 제 2 DNA 구축물의 통합 단계, 여기서 제 1 DNA 구축물은 갈락토스 투과효소를 코딩하는 핵산의 내인성 프로모터를 대체하고, 제 2 DNA 구축물은 글루코키나아제를 코딩하는 핵산의 내인성 프로모터를 대체하는데, 여기서 갈락토스 투과효소 및 글루코키나아제 모두 숙주 세포 내에서 발현되며, 여기서 상기 발현은 상응하는 비변 경 PTS^-/Glu^- 박테리아 세포 내의 동일한 대사 경로로의 탄소 흐름과 비교하여 형질전환된 숙주 세포의 대사 경로로의 탄소 유입의 증가를 야기함. 제 1 구현예에서, 상기 대사 경로는 통상의 방향족 경로이다. 제 2 구현예에서, 상기 방법은 추가로 트랜스케톨라아제, 트랜스알돌라아제 및 포스포에놀피루베이트 합성효소로 이루어진 군으로부터 선택되는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 사용한 PTS^-/Glu^- 숙주 세포의 형질전환 단계를 포함한다.

제 5 측면에서, 본 발명은 Glu⁺ 표현형을, 원래 탄수화물 수송을 위해 인산전이효소 수송계(PTS) 를 사용할 수 있는 PTS^-/Glu^- 박테리아 숙주 세포로 회복시키는 방법에 관한 것으로, 이는 하기를 포함한다: a) 프로모터, 및 글루코오스 수송자의 상류 (5') 영역에 상응하는 인접 DNA 서열을 포함하는 제 1 DNA 구조를 사용하여, PTS^-/Glu^- 숙주 세포를 형질전환함으로써, PTS^-/Glu^- 숙주 세포 내의 글루코오스 수송자를 코딩하는 핵산에 작동적으로 연결되어 있는, 내인성 염색체 조절 영역을 변화시키는 단계; b) 제 1 DNA 구축물의 통합 단계, 여기서 제 1 DNA 구축물은 글루코오스 수송자를 코딩하는 핵산의 내인성 프로모터를 대체함; c) 글루코오스 수송자의 발현 단계, 여기서 상기 발현은 Glu⁺ 표현형을 PTS^-/Glu^- 숙주 세포로 회복시킴. 바람직한 구현예에서, 상기 측면에 따른 방법은 또한, 외인성 프로모터, 및 글루코키나아제의 상류 (5') 영역에 상응하는 인접 DNA 서열을 포함하는 제 2 DNA 구축물을 사용하여, PTS^-/Glu^- 숙주 세포를 형질전환함으로써, PTS^-/Glu^- 숙주 세포 내의 글루코키나아제를 코딩하는 핵산에 작동적으로 연결되어 있는, 내인성 염색체 조절 영역의 변형; 글루코키나아제를 코딩하는 핵산의 내인성 프로모터를 대체하는 제 2 DNA 구조의 통합의 허용; 및 글루코키나아제의 발현의 허용을 포함한다. 하나의 구현예에서, 회복된 Glu⁺ 세포는 약 0.4 시간^-1 이상의 특이적인 성장속도를 가진다. 또다른 구현예에서, 글루코오스 수송자는 갈락토스 투과효소이다.

제 6 측면에서, 본 발명은 박테리아 숙주 세포 내의 포스포에놀피루베이트(PEP) 의 이용가능성을을 증가시키는 방법에 관한 것으로, 이는 하기 단계를 포함한다: a) 원래 탄수화물 수송을 위해 인산전이효소 수송계 (PTS) 를 사용할 수 있는, PTS^-/Glu^- 표현형을 가지는 박테리아 숙주 세포의 선택 단계; b) 프로모터를 포함하고 있는 DNA 구축물을 사용한, 상기 선택된 박테리아 숙주 세포의 형질전환을 포함하는 선택된 박테리아 숙주 세포의 내인성 염색체 조절 서열의 변형 단계, 여기서 상기 DNA 구조는 글루코오스 동화 단백질을 코딩하는 핵산과 작동적으로 결합되어 있는 내인성 프로모터를 대체하는 선택된 박테리아 숙주 세포로 염색체적으로 통합되어 있음; c) 적절한 조건 하에서의, 형질전환된 박테리아 숙주 세포의 배양 단계; 및 d) 글루코오스 동화 단백질의 발현으로 PTS^-/Glu⁺ 표현형을 가진 비변경 숙주 세포를 수득하는 단계, 여기서 PEP 이용률은, 본질적으로 동일한 배양 조건 하에서 배양된 상응하는 비변경 PTS 박테리아 숙주 세포 내의 PEP 이용률과 비교하여 증가됨. 하나의 구현예에서, 글루코오스 동화 단백질은 갈락토스 투과효소 및, 갈락토스 투과효소의 내인성 프로모터를 대체하는 외인성 프로모터를 포함하는 DNA 구축물이다. 또다른 구현예에서, 글루코오스 동화 단백질은 글루코키나아제 및 글루코키나아제의 내인성 프로모터를 대체하는 외인성 프로모터를 포함하는 DNA 구축물이다.

제 8 측면에서, 본 발명은 원래 탄수화물 수송을 위해 인산전이효소 수송계(PTS) 를 사용할 수 있는 PTS^-/Glu^- 박테리아 숙주 세포의 대사 경로로의 탄소 흐름을 증가시키는 방법에 관한 것으로, 이는 하기 단계를 포함한다: a) 외인성 프로모터, 및 갈락토스 투과효소의 상류 (5') 영역에 상응하는 인접 DNA 서열을 포함하는 DNA 구축물을 사용하여, PTS^-/Glu^- 숙주 세포를 형질전환함으로써, PTS^-/Glu^- 숙주 세포 내의 갈락토스 투과효소를 코딩하는 핵산에 작동적으로 연결되어 있는, 내인성 염색체 조절 영역을 변화시키는 단계; b) 외인성 프로모터(promoter), 및 글루코키나아제의 상류 (5') 영역에 상응하는 인접 DNA 서열을 포함하는 제 2 DNA 구축물을 사용하여, PTS^-/Glu^- 숙주 세포를 형질전환함으로써, PTS^-/Glu^- 숙주 세포 내의 글루코키나아제를 코딩하는 핵산에 작동적으로 연결되어 있는, 내인성 염색체 조절 영역을 변화시키는 단계; c) 제 1 및 제 2 DNA 구축물의 통합 단계, 여기서 제 1 DNA 구축물은 갈락토스 투과효소를 코딩하는 핵산의 내인성 프로모터를 대체하고, 제 2 DNA 구축물은 글루코키나아제를 코딩하는 핵산의 내인성 프로모터를 대체함; d) 적 절한 조건 하에서의 형질전환된 박테리아 숙주 세포의 배양 단계; 및 e) 변형된 조절 영역으로부터 갈락토스 투과효소 및 글루코키나아제의 발현이, 본질적으로 동일한 배양 조건 하에서 배양된 비변경 상응하는 PTS 박테리아 숙주 세포의 특이적인 성장 속도와 비교하여, 증가된 성장 속도를 가지는 비변경 박테리아 세포를 수득하는 단계.

제 9 의 측면에서, 본 발명은 원래 탄수화물 수송을 위해 PTS 를 사용할 수 있는 PTS^-/Glu^- E. coli 숙주 세포 내의 바람직한 생성물의 생성을 증가시키는 방법에 관한 것으로, 이는 하기 단계를 포함한다: a) 프로모터 및, 갈락토스 투과효소의 상류 (5') 영역에 상응하는 인접 DNA 서열을 포함하고 있는 제 1 DNA 구축물을 사용하여 E. coli PTS^-/Glu^- 세포를 형질전환함으로써, E. coli PTS^-/Glu^- 세포 내의 갈락토스 투과효소를 코딩하는 핵산에 작동적으로 결합되어 있는 내인성 염색체 조절 영역을 변형하는 단계; b) 외인성 프로모터 및, 글루코키나아제의 상류 (5') 영역에 상응하는 인접 DNA 서열을 포함하고 있는 제 2 DNA 구축물을 사용하여 E. coli PTS^-/Glu^- 세포를 형질전환함으로써, E. coli PTS^-/Glu^- 세포 내의 글루코키나아제를 코딩하는 핵산에 작동적으로 결합되어 있는 내인성 염색체 조절 영역을 변형하는 단계; c) 갈락토스 투과효소의 발현 및 글루코키나아제의 발현이 가능하도록 적절한 조건 하에서 형질전환된 E. coli PTS^-/Glu^- 세포의 배양 단계; d) 본질적으로 동일한 배양 조건 하에서 배양된 상응하는 PTS^-/Glu^- E. coli 세포 내의 바람 직한 생성물의 양과 비교하여, 형질전환된 E. coli 세포 내의 요망되는 생성물의 증량 수득 단계, 여기서 요망되는 생성물은 에탄올, 코리스메이트 및 숙시네이트이다.

제 10 의 측면에서, 본 발명은 제 1 내지 제 9 의 측면에 따라 수득된 형질전환된 박테리아 세포에 관한 것이다. 바람직한 하나의 구현예에서, 형질전환된 박테리아 세포는 E. coli 세포, Bacillus 세포 또는 Pantoea 세포이다.

도면의 간단한 설명

도 1A 및 1B 는 아미노산 생합성 과정의 화합물을 포함한 다양한 바람직한 화합물의 탄소 골격의 유도를 보여주는 E. coli 내의 중추 탄소 대사의 경로를 예시한다. 도 1A 로부터, (a) 글루코오스가 갈락토스 투과효소(GalP) 수송 단백질에 의해 세포막 사이를 가로질러 수송되고 (b) 글루코오스가 막 사이를 가로질러 이동하여 PTS 시스템 내의 PEP 에 의해 인산화되는 것이 관찰될 수 있다. PTS 에 의한 글루코오스의 인산화는 PTS 세포 내의 PEP 의 주 소비자이고, 도면에 나타난 백분율은 [Holms (1986) The central metabolic pathways of Escherichia coli: relationship between flux and control at a branch point, efficiency of conversion to biomass, and excretion of acetate. In: Current Topics in Cellular Regulation, Vol. 28, pp. 69 - 105 Academic Press, New York.] 에 기재된 바와 같이 경쟁 경로로 통과된 PEP 의 양을 나타낸다. 예를 들면, 생성된 PEP 66% 가 PTS 시스템 내에서 사용된다. 후속 대사 시스템은 도면에 도식적으로 도해된다: Embden-Meyerhoff 경로 (해당과정), 펜토스 포스페이트 경로, TCA 경 로, 통상의 방향족 경로, 및 Entner-Doudoroff 경로.

다음의 약어(abbreviation)들은 도면 및 명세서에 두루 사용되었다: PEP = 포스포에놀피루베이트; DAHP = 3-디옥시-D-아라비노-헵툴로소네이트 7-포스페이트; DHQ = 3-디하이드로퀴네이트; DHS = 3-디하이드로시키메이트; SHK = 시키메이트; S3P = 시키메이트 3-포스페이트; EPSP = 5-에놀피루빌 시키메이트 3-포스페이트; PHE = 페닐알라닌; TYR = 타이로신; TRP = 트립토판; Pyk = 피루베이트 키나아제, 이는 pyk 유전자에 의해서 코딩됨; 및 Ppc = PEP 카르복실라제, 이는 ppc 유전자에 의해서 코딩됨. 또한, 다음의 유전자들은 통상의 방향족 경로를 위해 예시된다: DHQ 합성효소를 코딩하는 aroB; DHQ 디하이드라타제를 코딩하는 aroD; 시키메이트 디하이드로게나제(dehydrogenase)를 코딩하는 aroE; 시키메이트 키나아제를 코딩하는 aroL 및 aroK; EPSP 합성효소를 코딩하는 aroA 및 코리스메이트 합성효소를 코딩하는 aroC. 구체적으로 예시되지는 않았지만, 당업자는 aroG, aroF 및 aroH 가 E. coli 내에서 에리트로스-4P(E4P) 및 PEP 의 DAHP 로의 전환을 촉매화하는 DAHP 합성효소의 3가지 동종효소(isozyme)을 코딩한다는 것을 알고 있다. 도 1B 는 다양한 화합물을 예시하는데, 이의 제조는 본 발명에 의한 방법에 따른 탄소 흐름 및 PEP 이용률의 증가에 의해서 강화될 수 있다.

도 2 는 R6K 벡터(pR6K-galP 를 제공) 내로 클로닝된 서열 번호 1 내에서 전방에 배치된 Galp-ptrc DNA 카세트의 DNA 서열을 예시한다. 이탤릭체 및 볼드체의 뉴클레오티드 서열은 loxP 서열을 나타낸다; 볼드체 및 밑줄체의 뉴클레오티드 서열은 galP 에 역으로 배치된 클로람페니콜 아세틸전이효소(CAT) 유전자를 나 타낸다; 밑줄체의 서열은 trc 프로모터의 -35 영역 (TTGACA) 및 -10 영역(TATAAT) 을 나타내고, 이탤릭체의 뉴클레오티드는 trc 프로모터의 lac 작동자를 나타내고; 볼드체의 뉴클레오티드는 galP ATG 개시 코돈을 나타낸다(실시예 1B 참조).

도 3 은 CAT 유전자의 제거 후의 galP-trc DNA 카세트의 DNA 서열 (서열 번호 2) 을 예시한다. 볼드체의 뉴클레오티드는 galP 상류 서열을 나타내며; 이탤릭체 뉴클레오티드는 단일 loxP 부위를 나타내고, 볼드체 및 이탤릭체 뉴클레오티드는 trc 프로모터 영역을 나타내는데, 여기서 -35 박스 및 -10 박스가 밑줄쳐져 있다(실시예 1E 참조).

도 4 는 서열 번호 3 내의 전방에 배치된 glk-trc DNA 카세트의 DNA 서열을 예시하는데, 이는 보통 R6K 벡터 내로 클로닝된다. 이탤릭체 및 볼드체의 뉴클레오티드 서열은 loxP 서열을 나타내며; 볼드체 및 밑줄체의 뉴클레오티드 서열은 glk 에 역방향 배치의 CAT 유전자를 나타내며; 밑줄체 서열은 trc 유도 프로모터의 -35 영역(CTGACA) 및 -10 영역(TATAAT)을 나타내며; 이탤릭체 뉴클레오티드는 trc 프로모터의 lac 작동자를 나타내며; 볼드체 뉴클레오티드는 glk ATG 개시 코돈을 나타낸다(실시예 1F 참조).

도 5 는 pMCGG 의 플라스미드 지도를 예시하며, 실시예 1G 를 참조한다. galP 및 glk 오픈 리딩 프레임(orf)은 각각 trc 프로모터의 조절 하에서, pACYC177 내로 클로닝된다. Trc = trc 프로모터; galP = 갈락토스 투과효소 코딩 서열; glk = 글루코키나아제 코딩 서열; KmR' = (클로닝된 유전자에 의해서 차단) pACYC177 의 카나마이신 저항성 마커; Amp =pACYC177 의 암피실린 저항성 마커 및 ori = 복제의 플라스미드 기원.

도 6 은 pTrcm42 의 플라스미드 지도를 예시하며, 실시예 1A 를 참조한다. LoxP = loxP 부위; trc = trc 프로모터, laclq = Lacl ^q 억제자 단백질을 코딩하는 유전자; CAT = CAT 코딩 유전자; 5S = 5StRNA; rrnBT1 및 2 = 리보좀 RNA 종결자; Amp = pTrc99a 의 암피실린 저항 유전자; 및 ori = 복제의 pMB1기원.

도 7A 및 7B. 도 7A 는 loxP-CAT-loxP-ptrc 를 포함하는 도식적인 프로모터 DNA 통합 카세트의 다이어그램을 보여준다. 전체 카세트에 인접하도록 PCR 에 의해서 DNA 상동 부분이 통합이 요망되는 부위에 추가되며, 이는 실시예 1E 및 1F 를 참조한다. loxP = loxP 부위; CAT = 클로람페니콜 아세틸전이효소 유전자; trc = trc 프로모터; 및 ATG = DNA 카세트의 통합을 위해 표적화된 글루코오스 동화 유전자의 개시 코돈. 도 7B 는 pR6K-galP-trc 의 플라스미드 지도를 예시하는데, 이는 galP (5' 부분)의 ATG 개시 코돈의 221 - 183 bp 상류 및 galP (3' 부분)의 ATG 개시 코돈을 포함하며 40 bp 상류로부터의 galP 의 조절 영역에 상동성의 40- bp 에 인접된 도 7A 의 DNA 카세트를 증폭함으로써 제공되고, 여기서 ploxP = loxP 코딩된 플라스미드; loxP = DNA 카세트로부터의 도입된 loxP 서열; trc = trc 프로모터; Km = 카나마이신 저항 유전자; CAT 는 상기 정의된 바와 같음; ori = 복제의 R6K 플라스미드 기원.

도 8 은 플라스미드 pSYCO101 (서열 번호 4)의 뉴클레오티드 서열을 예시한다.

도 9 는 pSYCO101 의 플라스미드 지도를 나타내는데, 여기서 DAR1 (디하이드록시아세톤 포스페이트 환원효소) 및 GPP2 (글리세롤-포스페이트 인산분해효소)는 글리세롤 경로 유전자이며; STR(R) 은 스펙티노마이신 저항 코딩 유전자; pSC101 ori 는 플라스미드의 복제 기원; 용어 AspA 는 아스파르테이트 암모니아 분해효소(lyase) 유전자 종결자; dhaB1-3, dhaX, 및 orf W, X, Y 는 1,3-프로판디올 경로 유전자; atten 은 E. coli 트레오닌 오페론 감쇠자(attenuator); 용어 TonB 는 E. coli tonB 유전자 종결자; trc 는 trc 프로모터이고 EcoR1 은 pSYCO101 내의 EcoR1 제한 효소 부위이다(실시예 1H 참조).

도 10A 및 10B 는 세포 성장 및, PTS^-/Glu⁺ E. coli 내에서의 PEP-비의존성 글루코오스 수송 시스템에 의해 코딩된 플라스미드를 사용한 발효 시간(h)에 대한 글리세롤 및 1,3-프로판디올의 제조를 예시한다. PTS^-/Glu^- 균주, KLpts7 (실시예 1D) 는 pMCGG (실시예 1G) 및 pSYCO101 을 사용하여 형질전환되고, 그 결과 생성된 균주는 세포 성장, 글리세롤 및 1,3-프로판디올의 생성을 위해 시험되고 분석된다. 광학 밀도(OD₆₀₀)는 ?◆? 로 나타내어지고, 글리세롤 농도는 ?▲? 로 나타내어지며, 1,3-프로판디올 농도는 ?■? 로 나타내어진다.

도 11A 및 11B 는 세포 성장 및, 염색체적으로 통합된 trc 프로모터에 의해 조절된 galP 의 발현 및 자연 조절에 의한 glk 의 발현을 사용한 PTS^-/Glu⁺ E. coli 내에서의 발효 시간(h)에 대한 글리세롤 및 1,3-프로판디올의 제조를 예시한다. PTS^-/Glu^-, KLpts7 (실시예 1D) 는 균주 KlgalP-ptrc (실시예 1E)를 제공하기 위해 galP 표적 부위에서, trc 프로모터의 통합에 의해 Glu⁺ 가 만들어진다. 상기 균주는 pSYCO103 을 사용하여 형질전환되고 발효 (실시예 2) 에 의해서 분석되었다. 시험된 파라미터는 도 11A 에서 세포 밀도 (OD₆₀₀) (?◆?) 및 도 11B 에서 글리세롤 농도(?▲?) 및 1,3-프로판디올 농도(?■?)이다.

도 12A 및 12B 는 세포 성장 및, 염색체적으로 통합된 trc 프로모터에 의해 조절되는 galP 및 glk 의 발현을 사용한 PTS^-/Glu⁺ E. coli 내에서의 발효 시간(h)에 대한 글리세롤 및 1,3-프로판디올의 제조를 예시한다. PTS^-/Glu^-, KLpts7 (실시예 1D) 는, galP 및 glk 표적 부위에서 trc 프로모터의 통합으로 Glu⁺ 로 만들어 균주 KLGG (실시예 1F) 를 수득했다. 상기 균주는 pSYCO101 로 형질전환되고 발효(실시예 3)에 의해서 분석되었다. 시험된 파라미터는 도 12A 에서 세포 밀도 (OD₆₀₀) (?◆?) 및 도 12B 에서 글리세롤 농도(?▲?) 및 1,3-프로판디올 농도(?■?)이다.

도 13 은 실시예 1G 에 기재된 바와 같은 플라스미드 pVHGalPglk11 의 지도이다.

도 14A - E 는 뉴클레오티드 서열 (서열 번호 25) 및 , galP 및 pVHGalPglk11 의 Glk (서열 번호 26) 에 대한 코딩 서열을 예시한다.

바람직한 구현예의 상세한 설명

다른 지시가 없다면, 본 발명의 수행이 당업계의 분자 생물학(재조합 기술을 포함), 미생물학, 세포생물학, 생화학의 통상적인 기술들로 수행될 것이다. 상기의 기술들은 하기의 문헌에 충분히 설명되어있는데, 예를 들어, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 제 2 판 (Sambrook 등, 1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press; CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (F.M. Ausubel 등, 1987 및 매년 신간 출판); GENE EXPRESSION TECHNOLOGY, (Goeddel, D. 등 편저, 1991, METHODS IN ENZYMOLOGY Vol. 185 Academic Press, San Diego, CA); GUIDE To PROTEIN PURIFICATION (Deutshcer M. P. 등, 1989, METHODS IN ENZYMOLOGY, Academic Press, San Diego, CA); PCR PROTOCOLS:A GUIDE TO METHODS AND APPLICATIONS (Innis 등, 1990, Academic Press, San Diego, CA); OLIGONUCLEOTIDE SYNTHESIS (M.J. Gait 등, 1984); PCR: THE POLYMERASE CHAIN REACTION, (Mullis 등 편저, 1994); MANUAL OF INDUSTRIAL MICROBIOLOGY AND BIOTECHNOLOGY, 2판 (A.L. Demain 등 편저, 1999); MANUAL OF METHODS FOR GENERAL BACTERIOLOGY (Phillipp Gerhardt, R. G. E. Murray, Ralph N. Costilow, Eugene W. Nester, Willis A. Wood, Noel R. Krieg and G. Briggs Phillips, 등 편저), pp. 210-213 American Society for Microbiology, Washington, DC.; 및 BIOTECHNOLOGY: A TEXTBOOK OF INDUSTRIAL MICROBIOLOGY, (Thomas D. Brock) 2판 (1989) Sinauer Associates, Inc., Sunderland, Mass.

정의

본원에서 다르게 정의되지 않는다면, 본원에서 사용되는 모든 기술과 과학 용어는 본 발명의 분야에서 당업자에게 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. Singleton, 등., DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY, 2판., John Wiley and Sons, New York (1994) 및 Hale 및 Marham , THE HARPER DICTIONARY OF BIOLOGY, Harper Perennial, New York (1991) 은 본 발명에서 사용된 다수의 용어의 일반 사전으로써 당업자에게 제공된다.

수치 범위는 범위를 정의하는 숫자를 포함한다. 다르게 정의되지 않는다면, 핵산은 5' 에서 3' 배향을 왼쪽에서 오른쪽으로 기재하고, 아미노산 서열은 각각 아미노기에서 카르복시 배향을 왼쪽에서 오른쪽으로 기재한다.

본원에서 제공되는 서두가 명세서에서 전부 언급될 수 있는 발명의 다양한 국면 또는 구현예의 한정을 하는 것은 아니다. 따라서, 하기에서 바로 정의되는 용어들은 명세서의 전반에서 참고문헌에 의해 더욱 충분히 정의되어 있다.

본원에서 인용된 참고문헌, 공개된 특허 및 출원중인 특허출원이 본 개시에서 참고문헌으로 포함된다.

인산수송효소 시스템 (PTS) (E.C. 2.7.1.69) 은 포스포에놀피루브산-의존형 당 섭취 시스템으로 언급된다. 이것은 각종 당의 수송 및 포스포에놀피루베이트 의존형 인산화에 참여하는 수송 단백질의 시스템이다. 상기 시스템은 두개의 포스포단백질, 효소 I 및 HPr 를 함유하는데, 그것은 전 PTS 탄수화물에 일반적이며, PEP 의 포스포릴기를 효소 Ⅱ가 결합된 탄수화물 특이적 막까지, 이후 탄수화물까지의 수송을 촉매한다. 일부 경우엔, 효소 Ⅲ 가 HPr 및 효소 Ⅱ 사이에 위치한다. 각종 효소 Ⅱ 및 효소 Ⅲ 를 구별하기 위해, 세자리의 위첨자가 탄수화물이 바람직한 기질임을 나타내기 위해 사용되곤 한다. 예를 들어, 효소 Ⅱ^glc 는 글루코오스가 바람직한 기질임을 의미한다. 그러나, 다른 기질이 사용될 수 있다.

용어 "Ptsl" 및 "효소 I" 은 E. coli 내 ptsl 에 의해 코딩되는 인산수송효소 EC 2.7.3.9 를 의미한다. 용어 "HPr" 및 "PtsH" 는 E. coli 내 ptsH 에 의해 코딩되는 포스포운반체 단백질을 의미한다. "글루코오스-특이적 ⅡA 구성원", "효소 Ⅱ^glc" 및 "Crr" 는 E. coli 내 crr 에 의해 코딩되는 EC 2.7.1.69 를 의미한다. 상기 PTS 는 Ptsl, PtsH 및 Crr 및 기능적으로 등가인 단백질을 포함한다.

용어 "PTS^- /GIu^_ 표현형" 및 "PTS^-/Glu^-" 는 PEP-의존형 PTS가 대응하는 야생형 PTS 세포에 비해 불활성화되어, 탄소원으로서 글루코오스를 이용할 수 있는 능력이 상당히 감소하는 숙주세포를 의미한다. 유효하게는, 야생형 PTS 세포보다 글루코오스의 수송에 더 적은 PEP 가 이용된다.

"글루코오스⁺ (Glu⁺) 표현형 회복" 은 PTS 의 불활성화에도 불구하고 탄소원으로써 글루코오스를 사용할 수 있는 숙주 세포를 의미한다. 추가로 본원에서 사용된 "PTS^-/Glu⁺ 표현형" 은 회복된 Glu⁺ 표현형을 가진 PTS^-/GIu^- 숙주 세포를 의미한다.

"증가된 포스포에놀피루브산 (PEP) 이용가능성" 은 대사적 또는 생산적 경로에 따라 탄소수가 증가하는 세포 내의 PEP 의 총량의 증가를 의미하며, 다르게는 상기의 PEP는 글루코오스의 인산화반응을 위해 PTS 내에서 대사된다.

어구 "증가된 탄소 흐름(flow)" 은 대사적 혹은 생산적 경로에서 탄소 기질의 이용가능성의 증가를 의미하며, 다른 뜻으로 상기의 탄소 기질은 PTS 내에서 PEP 의 대사에 의해 전환된다. 개별적 경로에서의 탄소 흐름은 기체 크로마토그래피 및 질량분석법 같은 잘 공지된 방법에 의해 측정될 수 있다. 생산물에서 측정된 탄소 흐름은 적어도 2%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 또는 본질적으로 동일한 성장 조건하에서 성장하는 대응 PTS 세포내의 탄소 흐름보다 더 클 수 있다.

"특이적 성장 속도 (μ)" 는 시간 당 질량이나 세포 수 증가를 의미한다. 본 발명의 한 구현예에서, 회복된 Glu⁺ 표현형을 가진 세포는 글루코오스 상에서 성장할때 적어도 약 0.3 hr^-1, 적어도 0.4 hr^-1, 적어도 0.5 hr^-1, 적어도 0.6 hr^-1, 적어도 0.7 hr^-1 및 적어도 0.8 hr^-1 의 특이적 성장 속도 (μ)를 가질 것이다.

"조절 영역" 및 "조절 서열" 은 본원에서 교환적으로 사용되고 코딩 영역의 발현에 영향을 주는 유전자의 코딩 영역과 작동적으로 연결되어 있는 핵산 서열을 의미한다. 조절 서열은 작동적으로 연결된 코딩 서열의 발현 또는 mRNA 의 번역을 저해, 억제 또는 촉진할 수 있다. 조절 서열의 예시에는 프로모터, 인핸서, 리보솜 결합 부위, 작동자 및 사이렌서를 포함한다.

"내인성 염색체 조절 영역" 및 "동질성 염색체 조절 영역" 은 염색체 조절 영역을 의미하는데, 그것은 숙주 세포내에서 자연스럽게 생기고 상기 숙주 세포 내에서 글루코오스 동화 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드에 작동적으로 연결되어 있다.

본원에서 사용된 "프로모터" 는 하류의 유전자 또는 유전자들의 직접 전사에 기능을 하는 조절 핵산 서열을 의미한다. 본 발명에 따른 프로모터는 두 개의 일치영역(consensus region)이 있다. 첫번째 일치영역은 전사 개시 영역으로부터 약 10 염기쌍 위에 위치하고, -10 일치영역 (또한 -10 박스 또는 Pribnow 박스) 로 언급된다. 두번째 일치영역은 개시 영역로부터 약 35 염기쌍 위에 위치하고 -35 일치박스 또는 서열로 언급된다. 링커 또는 스페이서 서열은 일치 박스 사이에 위치하고 일반적으로 14 내지 20 bp 를 포함한다.

본원에서 사용된 "외인성 프로모터" 는 자연 발생 프로모터와는 다른 프로모터로써, 숙주 세포내에 글루코오스 동화 단백질의 내인성 코딩 영역과 작동적으로 연결되어 있고, 비-천연의 (non-native) 프로모터, 합성 프로모터, 변형된 자연 발생 프로모터를 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다. 변형된 자연 발생 프로모터는 글루코오스 동화 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드와 작동적으로 연결된 천연의 내인성 프로모터를 포함하는데, 상기에서 천연의 프로모터는 변경되고 이어서 숙주 세포 염색체에 재도입되고 글루코오스 동화 단백질의 내인성 코딩 영역에 작동적으로 연결되지 않은 천연의 내인성 프로모터를 포함한다.

"유도 프로모터", "변형 프로모터" 및 "변이체 프로모터" 는 프로모터를 의미하는데, 상기에서 하나 이상의 뉴클레오티드는 변형된다. 한 바람직한 구현 예에서, 유도 프로모터는 프로모터 -35 박스의 하나 이상의 뉴클레오티드가 치환 같은 변형을 하는 것을 포함할 것이다.

"전사 조절 조건" 또는 "전사적으로 조절" 이 폴리뉴클레오티드 서열, 보통은 DNA 서열의 전사가, 전사 개시에 공헌하거나 촉진하는 구성원에 작동적으로 연결된 것에 의존성임을 가리킨다는 것을 당업자에게는 잘 이해된다.

"작동적으로 연결" 은 구성원들이 서로 기능적으로 연결되는 것을 허용하는 배열 하에 있는 병렬상태를 의미한다. 예를 들어, 그것이 서열의 전사를 지령하는 경우 프로모터가 코딩 서열과 작동적으로 연결된 것이다.

"번역 조절 하" 는 메신저 RNA가 형성된 후에 일어나는 조절 과정을 가리킨다는 것을 당업자에게는 잘 이해되는 용어이다.

본원에서 사용된 용어 "유전자" 는 폴리펩티드 생산에 수반되는 DNA 분절을 의미하고 코딩 영역 뿐만 아니라 각각의 코딩 분절 (엑손) 사이에 끼어드는 서열 (인트론) 의 전후 영역을 포함한다.

본원에서 호환적으로 사용되는 "폴리뉴클레오티드" 및 "핵산" 은 리보뉴클레오티드 또는 데옥시리보뉴클레오티드 중 하나인, 임의 길이의 뉴클레오티드의 중합체 형태를 말한다. 상기 용어는 단일-, 이중- 또는 삼중-나선 DNA, 게놈 DNA, cDNA, RNA, DNA-RNA 하이브리드, 또는 퓨린 및 피리미딘 염기를 포함하는 중합체, 또는 다른 자연적, 화학적, 생화학적으로 변형된, 비-자연적 또는 유도된 뉴클레오티드 염기를 포함한다. 하기는 폴리뉴클레오티드의 비제한적 예시이다 : 유전자 또는 유전자 절편, 엑손, 인트론, mRNA, tRNA, rRNA, 리보자임, cDNA, 재조합 폴리뉴클레오티드, 분지형 폴리뉴클레오티드, 플라스미드, 벡터, 임의의 서열의 단리된 DNA, 임의의 서열의 단리된 RNA, 핵산 프로브, DNA 구축물 및 프라이머. 폴리뉴클레오티드는 메틸화 뉴클레오티드 및 뉴클레오티드 유사체, 우라실, 기타의 당 같은 변형 뉴클레오티드 및 플루오로리보스 및 티오에이트 같은 연결 기, 및 뉴클레오티드 분지를 포함할 수 있다.

"구조적 서열" 은 산물 형성을 코딩하는 DNA의 추정되는 폴리뉴클레오티드 서열이다. 구조 서열은 메신저 RNA 를 가진 폴리펩티드 사슬의 아미노산 서열이 그것의 일차 산물이 되도록 코딩할 수 있다. 구조 서열은 또한 구조 또는 조절 기능을 가진 RNA 형성을 코딩할 수 있다.

본원에서 사용된 대로, "벡터" 라는 용어는 하나 이상의 세포 타입내로 핵산을 도입하도록 고안된 폴리뉴클레오티드 구축물을 의미한다. 벡터는 클로닝 벡터, 발현 벡터, 수송 벡터, 플라스미드, 카세트 등을 포함한다. DNA 카세트의 특별한 경우에서, DNA 는 PCR 또는 다른 적당한 기술에 의해 시험관 내에서 생산될 수 있다.

"과발현" 이란 용어는 숙주 세포내에서 동일 유전자의 복제 산물의 증가된 수치를 의미한다.

"단백질" 및 "폴리펩티드" 는 본원에서 상호교환적으로 사용된다. IUPAC-IUB Joint Commission on Biochemical Nomenclature (JCBN) 로 확인하여 정의된 아미노산 세단위 코드가 본 개시를 통해 사용된다. 폴리펩티드가 유전 코드의 퇴축에 기인하여 하나 이상의 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩될 수 있음을 또한 이해 할 수 있다.

단백질 및 그것을 코딩하는 유전자를 기재할 때 본원에서 사용되는 대로, 유전자에 대한 용어는 대문자가 아니며 이탤릭체, 예를 들어, glkA 로 한다. 단백질에 대한 용어는 일반적으로 이탤릭체가 아니며 처음 문자는 대문자로, 예를 들어, GlkA로 한다.

"글루코오스 동화 단백질" 또는 "글루코오스 동화에 수반되는 효소 " 는 탄소원으로서 글루코오스를 사용하는 숙주 세포를 이용할 수 있는 효소 또는 단백질을 의미한다. 글루코오스 동화에 수반되는 효소 및 단백질은 세포막을 가로지르는 글루코오스 수송에 수반되는 것 및 글루코오스-6-포스페이트로 되는 글루코오스의 인산화에 수반되는 것을 포함한다.

"인산화 효소" 는 글루코오스가 글루코오스-6-포스페이트로 되는 글루코오스의 반응을 촉매하는 효소를 의미한다.

상기 반응을 촉매하는 공지 효소는 헥소키나아제 (E.C.No.: 2.7.1.1) 및 글루코키나아제 (E.C.No.2.7.1.2)를 포함한다. 글루코키나아제는 E. coil 내에서 glk 에 의해 코딩된다.

"수송 단백질" 또는 "수송자" 는 세포막을 가로질러 분자의 수송을 촉매하는 단백질을 의미한다. 바람직한 구현예에서, 수송자는, 또한 투과효소로도 언급되며, 글루코오스 수송자이다. 글루코오스 수송자는 세포질내로 세포막을 가로 질러 글루코오스의 능동 수송을 촉매한다. 글루코오스 수송자는 또한 다른 당의 수송을 촉매할 수 있다. 글루코오스 수송자의 한 예시로는 갈락토오스-단백질 공수송자 (갈락토오스 투과효소로도 공지됨), GalP 가 있다. GalP 는 E. coli 내의 galP 에 의해 코딩된다 (Henderson 등 (1990) Phil. Trans. R. Soc., London 326:391-410).

"능동 수송" 은 에너지 소비가 동반되는 세포내로의 화합물 수송을 의미한다. 본 발명에 포함되는 한 예시는 글루코오스 수송자에 의해 막 전위가 사용된다.

본원에서 사용된 "선별가능 표지" 는 도입된 핵산 또는 벡터를 함유하는 숙주의 선택이 용이하게끔 하는 숙주 세포 내에서 발현이 가능한 유전자를 의미한다. 상기의 선택가능 표지의 예시로는 항균성 물질 (예를 들어, 카나마이신, 에리트로마이신, 악티오마이신, 클로람페니콜, 스펙티노마이신, 및 테트라사이클린) 을 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다. 예를 들어, "CM^Rn" 및 "CAT" 표시는 모드 의미는 동일한 유전자, 클로람페니콜 저항 유전자 및 또한 공지된 클로람페니콜 아세틸 수송효소 유전자를 의미한다.

"인접 (flanking) 서열" 은 논의된 서열 (예를 들어, 유전자 A, B, 및 C; 유전자 B 는 A 및 C 유전자 서열에 근접한다) 의 상류 또는 하류의 임의의 서열을 의미한다. 일부 구현예에서는, 인접 서열은 DNA 절편의 오직 한 측면(3' 또는 5') 에만 존재하나, 바람직한 구현예에서, 논의된 서열의 각 측면이 인접한다.

야생형이란 용어는 본래대로 또는 자연발생의 숙주 세포 또는 숙주 세포 서열을 의미한다.

본원에서 사용되는 대로, 용어 "내인성" 은 숙주내에서의 핵산 또는 상기 자연발생적 핵산에 의해 코딩되는 단백질을 의미한다. 용어 "외인성" 은 상이한 숙주 세포 균주 유래의 핵산 또는 단백질을 의미한다. 외인성 서열은 비-숙주 서열 및 합성적으로 변형된 천연의 서열이 될 수 있다.

용어 "동종성" 은 동일한 유기체, 균주 또는 종을 의미한다. "동종성 서열" 은 동일한 유전적 기원 또는 종에서 발견되는 서열이다. 예를 들어, 숙주 균주가 특정 유전자가 결핍된 경우, 동일한 유전자가 같은 종의 상이한 균주에서 발견된다면 그 유전자는 동종성 서열라고 여겨진다. 용어 "이종성" 은 상이한 유기체, 균주 또는 종을 의미하며, 더욱 구체적으로는 숙주 세포 내에서 자연발생한 것이 아닌 핵산 또는 아미노산 서열을 의미한다.

"형질 전환", "형질 도입" 및 "감염" 은 세포내 새로운 폴리뉴클레오티드의 혼입 또는 도입을 의미한다. 도입된 폴리뉴클레오티드는 염색체 DNA 로 통합되거나 또다른 염색체 복제 서열로서 도입될 수 있다.

본원에서 사용된 용어 "단리된" 또는 "정제된" 은 자연적으로 회합되는 하나 이상의 구성원으로부터 제거된 효소, 핵산, 단백질, 펩티드 또는 공-요소 (co-factor) 를 의미한다.

본원에서 사용된 "목적 산물" 은 탄소 기질이 생물변환되는 목적 화합물을 의미한다. 예시적인 목적 산물은 숙시네이트, 리신, 글리세롤, 메티오닌, 트레 오닌, 이소루신, 피루브산, 에탄올, 포르메이트, 아세테이트, DAHP, DHQ, DHS, SHK, S3P, EPSP, 코리스메이트, 페닐알라닌, 타이로신, 트립토판, 및 아소코르브산 중간체이다.

본원에서 사용된 대로, "탄소원" 이란 용어는 미생물에 의해 보통 사용되는 적당한 탄소 기질을 포함하는데, 예를 들어 6 탄당은 글루코오스 (G), 글루오스, 락토오스, 소르보오스, 프룩토오스, 아이도오스, 갈락토오스 및 D 또는 L 형 모두의 만노오스, 또는 6 탄당의 혼합물, 예를 들어 글루코오스 및 프룩토오스, 및/또는 6 탄당 산을 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다. 바람직한 탄소 기질은 글루코오스 및 프룩토오스를 포함한다.

유전자 또는 단백질에 대해 언급하는 경우, 용어 "무-기능성", "불활성화된" 및 "불활성화" 는 유전자 또는 단백질의 공지된 정상적인 기능 또는 활성을 제거하거나 크게 감소시키는 것을 의미한다. 유전자 또는 단백질을 무-기능성으로 만드는 불활성화 핵산 서열내의 결실, 돌연변이, 치환, 또는 차단, 삽입 같은 방법을 포함한다.

"숙주 세포" 는 도입된 이종성 폴리뉴클레오티드를 수용할 수 있는 세포이다. 한 구현예에서, 숙주 세포는 그람-음성 또는 그람-양성 박테리아이다.

본원에서 사용되는 용어 "박테리아" 는 막결합 핵 및 세포소기관이 결핍된 원핵생물인 현미경적 유기체의 임의의 군을 지칭한다. 모든 박테리아는 세포 안과 밖의 물질 흐름을 조절하는 지질 막에 의해 둘러싸여있다. 단단한 세포벽은 박테리아로 완전히 둘러싸여있고 막 외부에 놓여있다. 다수의 상이한 타입 의 박테리아가 있는데, 이에는 바실러스, 스트렙토마이스, 슈도모나스, 및 장내 세균 군의 균주가 포함되나 이에 제한되지 않는다.

본원에서 사용되는, "장내 세균" 패밀리는 그람 음성의 일반적 특징을 가지고 무산소 상태에서 살 수 있는 박테리아 균주을 의미한다. 장내 세균 패밀리 안에는 에르위니아(Erwinia), 엔테로박테리아(Enterobacter), 글루코노박터(Gluconobacter), 클렙시엘라(Klebsiella), 에셰리키아(Escherichia), 아세토박터(Acetobacter), 코이르네박테리아(Coyrnebacteria) 및 판토에아(Pantoea)이 포함된다.

본 발명에 따른 "변경 박테리아 숙주" 또는 "변형 박테리아 숙주" 는 PTS^-/Glu⁺ 표현형을 가진 유전적으로 조작된 박테리아 세포이다.

"비변경 박테리아 숙주 세포" 는 글루코오스의 수송 및 인산화를 위해 PTS를 사용하는 박테리아 숙주 세포 또는 PTS^-/Glu^- 세포를 의미한다.

본원에서 사용된 "염색체 통합" 은 도입된 폴리뉴클레오티드가 숙주 세포 염색체로 혼입되는 과정이다. 상기 과정은 바람직하게는 동종성 재조합에 의해 일어난다. 동종성 재조합은 두 DNA 분자 사이의 DNA 절편의 교환이며, 상기에서 도입된 폴리뉴클레오티드의 동종성 서열이 숙주 세포 염색체의 동종성 영역과 정렬되고 염색체의 동종성 영역 사이의 서열이 이중 교환으로써 도입된 폴리뉴클레오티드의 서열로 대체된다.

"표적 부위" 는 DNA 구축물의 통합이 발생하는 숙주 세포 염색체 내에 미리 예정된 게놈 위치를 의미한다.

본원에서 사용된 바와 같이 숙주 세포에 의해 생산되는 단백질 또는 효소 활성의 "변형" 수준은 배양 동안 생산된 단백질 또는 효소 활성 수준을 조절하는 것을 의미하는데, 상기 수준은 목적한 대로, 증가되거나 감소한다.

본원에서 사용된 바와 같이, 핵산 또는 폴리뉴클레오티드를 언급할 때 "변형" 이란 용어는 핵산이 야생형 핵산과 비교해 소정의 방법으로 변경된 것을 의미하는데, 예를 들어 핵산의 전체 또는 일부의 돌연변이, 치환, 삽입, 결실; 또는 전사 조절 영역의 작동적 연결이 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 핵산을 언급할 때 용어 "돌연변이" 는 핵산의 산물이 부분적 또는 전체적으로 불활성화되도록 하는 핵산 내의 임의의 변경을 의미한다. 돌연변이의 예시에는 포인트 돌연변이, 격자이동돌연변이 및 유전자의 부분 또는 전체 결실을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.

또다른 서열에 대한 "서열 상동성" 의 특정 비율 (예를 들어, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97% 또는 99%) 을 가지는 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드는, 정렬시, 염기 또는 아미노산의 백분율이 두 서열을 비교하여 동일함을 의미한다. 상기 정렬 및 백분율 동종성 또는 서열 상동성은 당업자에게 잘 알려진 소프트웨어, 예를 들어 CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (F.M. Ausubel 등, 1987) Supplement 30, section 7.7.18. 에 기술된 소프트웨어를 사용하여 결정할 수 있다. 바람직한 프로그램은 GCG Pileup 프로그램, FASTA (Pearson 등 (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444-2448) 및 BLAST (BLAST Manual, Altschul 등, Natl. Cent. Biotechnol. Inf., Natl Library Med. (NCBI NLM), NIH, Bethesda MD 및 Altschul 등, (1997) NAR 25:3389-3402) 를 포함한다. 또 다른 바람직한 정렬 프로그램은 바람직하게는 하기와 같은 디폴트 파라미터를 사용하는 ALIGN Plus (Scientific and Educational Software, Pennsylvania) 이다: mismatch= 2; open gap = 0; extend gap = 2. 사용될 수 있는 또 다른 서열 소프트웨어 프로그램은 Sequence Analysis Software Package Version 6.0 (Genetic Computer Group, University of Wisconsin, Madison, WI) 에서 사용될 수 있는 TFastsA Data Searching Program 이다. 당업자는 본 발명에서 포함되는 서열이 예시되는 서열과 엄격한 조건하에서 하이브리디제이션될 수 있는 능력에 의해 또한 정의됨을 인식할 수 있을 것이다.

단일 가닥 형태의 핵산이 적당한 조건의 온도 및 용액 이온 강도 조건 하에 다른 핵산과 어닐링할 수 있는 경우 "하이브리디제이션" 할 수 있다. 하이브리디제이션 및 세척 조건은 [Sambrook 1989, 상기 문헌 (각 9 및 11 장 참고)] 에 공지되어 있고 예시되어 있다. 낮은 정도의 엄격한(stringency) 하이브리디제이션 조건은 55 ℃ 의 Tm (예를 들어, 5X SSC, 0.1% SDS, 0.25 우유 및 무-포름아미드 또는 5X SSC, 0.5% SDS 및 30% 포름아미드) 에 상응한다. 적당한 엄격한 조건은 6X SSC, 0.1% SDS, 포름아미드의 존재 또는 부재 하에 0.05% 우유에 상응하며, 엄격한 조건은 예를 들어, 65 ℃ 의 Tm 및 0.1X SSC, 0.1 % SDS 와 상응한다.

용액 내, 또는 그것들이 고체 형태로 제조되는 용액 외이든지, 당류 및 유기산 같은 다른 혼합물의 산성 유도체가 그것의 주변 매질에 의존하는 다양한 이온화 조건 하에 존재할 수 있음이 당 업계에서 잘 이해된다. 예를 들어, 상기 분자들에 지정되는 글루콘산 또는 아세트산 같은 용어의 사용은 언급된 유기 분자의 모든 이온화 상태를 포함하도록 의도된다. 즉, 예를 들어, "글루콘산" 및 "글루콘산염" 은 동일한 유기 부분을 의미하고, 특별한 이온화 상태 또는 화학적 형태를 특정하도록 의도하지는 않는다.

본원에서 사용되는 용어 "배양" 은 반응 용기 내에서 탄소 기질을 목적한 산물로 발효적 생물전환 (bioconversion) 하는 것을 의미한다. 생전환은 탄소 기질을 목적 산물로 전환하기 위해 탄소 기질을 가진 미생물과 접촉하는 것을 의미한다.

본원에서 사용되는 용어 "함유" 및 그것의 동일어원들은 그것들의 포괄적인 의미로 사용된다; 그것은 "포함" 과 동일한 의미의 용어 및 그것과 일치하는 동일어이다.

"A", "an" 및 "the" 는 문맥에서 분명히 다르게 지시되지 않는다면 복수의 언급을 포함한다.

"탄소원으로부터 목적 산물이 생산되도록 하고, 상기에서 목적 산물의 생산은 대응하는 비변경 박테리아 숙주 세포 내에서의 목적 산물의 생산과 비교하여 증강된다" 는 것은 목적 산물을 생산하기 위해 PTS ^-/Glu⁺ 박테리아 세포를, 기질, 예를 들어, 탄소원과 접촉시키는 것을 의미한다.

바람직한 구현예

본 발명은, 본래 탄수화물 수송을 위해 PTS 를 이용할 수 있는 숙주 세포의 요망되는 대사 경로 내로 탄소 흐름을 증가시키는 방법에 관한 것으로서, 상기 방법은, 표현형적으로 유효하게 PTS^- 인 숙주 세포를 선택하는 단계 및, 글루코오스 동화에 수반되는 폴리펩티드를 코딩하는 염색체 핵산에 작동적으로 연결된 상동염색체 조절 영역을 하나 이상 변형시켜 글루코오스⁺ 표현형이 회복되게 하고, 이로써 요망되는 대사 경로 내로 및 상기 경로를 통해 탄소 흐름을 증가시키는 단계를 포함한다.

A. PTS 숙주 세포

상기 PTS 에 대한 일반적인 개관은 문헌 [Postma et al., 1993, Microbiol. Rev. 57:543-594; Romano et al., 1979, J. Bacteriol. 139:93-97 및 Saier et al. 1990, In: BACTERIAL ENERGETICS pp. 273-299, T.A. Krulwich, Ed. Academic Press, NY] 에서 찾을 수 있다. 본 발명에 유용한 숙주 세포 또는 균주로는 탄수화물 수송을 위한 PTS 시스템을 이용할 수 있는 임의의 개체를 들 수 있다. 이는, Escherichia 속(屬), Corynebacterium 속, Brevibacterium 속, Bacillus 속, Pseudomonas 속, Streptomyces 속, Pantoea 속 또는 Staphylococcus 속에 속하는 원핵세포 (prokaryote) 를 포함한다. 적당한 개체들의 목록이 표 1 에 제시된다. 이들 개체들 중 어느 것에서 상기 PTS 의 불활성화가 일어나면, 대안적인 대사 경로를 위하여 세포 내의 탄소 흐름과 PEP (및 PEP 전구체) 가 잠재적으로 증가하였을 것이고, 결과적으로 상기 세포들로부터의 요망되는 화합물 (예컨대, 방향 족) 의 생산을 증가시킬 수 있었다.

바람직한 숙주 균주는 방향족 화합물을 생산하는데 유용한 것으로 알려진 것들로서, Escherichia 속(屬), Corynebacterium 속, Brevibacterium 속, Pantoea 속및 Bacillus 속으로부터 선택되는 균주들이 있다. Pantoea 속으로서는, 당업계의 숙련된 자들에게 공지된 모든 일원들을 포함하며, 이에 제한되는 것은 아니나, P. citrea, P. ananatis, P. stewartii, P. agglomerans, P. punctata 및 P. terrea 가 있다. 유용한 Bacillus 균주들로는, B. subtilis, B. licheniformis, B. lentus, B. brevis, B. stearothermophilus, B. alkalophilus, B. amyloliquefaciens, B. coaglulans, B. ciculans, B. lautus 및 B. thuringiensis 가 있다.

B. PTS ^_ /Glu ^_ 숙주 세포 선별

PTS^- 세포 선별은 당업계의 숙련된 자들에 대하여 이용가능한 기술들을 사용하여 수행될 수 있다. 불활성화는 PEP 인산화를, 문헌 [Gachelin, G. (1969). Biochem. Biophys. Acta. 34:382-387; Romero, et al., (1979) J. Bact. 139:93-97; 또는 Bouvet 및 Grimont., (1987) Ann. Inst. Pasteur/Microbiol 138:3-13] 에 기술된 프로토콜을 사용한 2-데옥시-D-글루코오스의 PEP-의존 인산화로 측정시 검출불가능한 수준으로 효과적으로 감소시킬 것이다. 또한, PEP 인산화 검정은 PTS^- 발현 수준을 결정하는데도 유용하다.

상기 PTS 를 포함한 효소들의 전부 또는 일부를 코딩하는 유전자 하나 이상을 불활성화시킴으로써 PTS 야생형 숙주 세포들로부터 PTS^-/Glu^- 숙주 세포를 선별할 수 있다. 예로서, 한 가지 구현예에서, 각각 상기 PTS 의 EI, HPr 및 IIA^Glc 단백질을 코딩하는 ptsI, ptsH 및 crr 로 이루어진 군으로부터 선택되는 유전자 하나 이상을 결실시킴으로써 상기 PTS 를 불활성화시킨다 (Postma, et al (1993) Microbiol. Rev. 57:543-594). 다른 구현예들에서, 상기 유전자들 둘 이상이 불활성화된다. ptsI, ptsH 및 crr 의 뉴클레오티드 서열이 결정되었다 (Saffen et al., (1987) J. Biol Chem. 262:16241-16253; Fox et al., (1984) Biochem. Soc. Trans. 12:155-157; Weigel et al., (1982) J. Biol. Chem. 257:14461-14469 및 DeReuse et al., (1988) J. Bacteriol 176:3827-3837). 다른 구현예들에서는, 상기 세 유전자 ptsI, ptsH 및 crr 모두를 결실로 불활성화시킬 경우, PEP 인산화가 검출불가능한 수준으로 효과적으로 감소할 것이다.

일반적으로, 상기 PTS 를 불활성화시키기 위하여 본 발명에서 이용된 방법론은 하기와 같다. E. coli 에서 ptsI, ptsH 및 crr 이 하나의 오페론 내에 함께 연결되어 있다는 것이 공지되어 있다. Silhavy 등 (1984) 에 의해 문헌 [EXPERIMENTS WITH GENE FUSIONS, pp 110-112, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY] 에 기술된 일반화된 형질도입법을 사용하여 E. coli 균주 JM101 (Yanisch-Perron et al. (1985) Gene 33:103-119) 및 균주 PB103 (Mascarenhas (1987) PCT WO/87/01130) 내의 ptsHIcrr 오페론을 불활성화시켰다. P1vir 파지 (phage) 를 사용하여 형질도입을 수행하고, 상기 ptsHIcrr 결실의 공여자로 TP2811 균주 (Levy et al., (1990) Gene 86:27-33) 를 사용하였다. 상기 방법을 두 단계로 수행하였다. 첫번째로, TP2811 균주 상에 박테리오파지를 증식시켜 무세포 파지 현탁액을 준비하였다. 상기 TP2811 균주에서, 대부분의 ptsHIcrr 오페론을 결실시켰고, 동일 DNA 영역에 카나마이신-저항 표지자를 삽입하였다 (Levy et al., (1990) Gene 86:27-33). 수득한 P1vir 용해물은 ptsHIcrr 결실 및 카나마이신 저항 표지자를 동시에 형질도입시킬 수 있었다. 둘째로, 이들 파지를 사용하여 수용자 균주들인 JM101 또는 PB103 을 감염시키고, 카나마이신을 함유한 MacConkey-글루코오스 플레이트 상에서 플레이팅하여 형질도입체들을 선별하였다. 상기 플레이트들을 37 ℃ 에서 16 시간동안 인큐베이션한 결과, 수 개의 백색 콜로니들이 나타났다.

상기 수용자 균주들 (JM101 및 PB103) 은 카나마이신 민감성이며, MacConkey-글루코오스 플레이트 상에서 홍색 콜로니를 형성한다. 상기 MacConkey-글루코오스 플레이트는 pH 에 따라 백색에서 진홍색까지 변할 수 있는 지시자 염료를 함유한다. 세포들이 빠른 속도로 글루코오스를 수송할 수 있는 경우, 정상적으로는 이들은 유기산을 분비하여 홍색 콜로니들을 생산할 것이다. 글루코오스 수송이 감소되거나 없을 경우, 세포들은 유기산을 생산하지 않을 것이며, 콜로니들은 백색이 될 것이다. 이는 상기 숙주 세포가 글루코오스⁺ 표현형인지 또는 글루코오스^- 표현형인지를 확인할 수 있게 해준다.

생성된 카나마이신 저항 콜로니들을 형질도입시킨 것은 백색이었는데, 이는 상기 세포들의 글루코오스를 동화시키는 능력이 영향을 받았다는 것을 가리키는 것이며, 이는 ptsHIcrr 오페론 결실의 이동때문인 것으로 추정된다. 이 가정을 확증하기 위하여, 형질도입체들을 선별하여 유일한 탄소원으로 글루코오스를 함유한 최소배지에 접종시킬 수 있다. (37 ℃ 에서 12 시간동안) 인큐베이션한 후, 상기 형질도입체들은 검출될 만한 세포 성장이 없을 것이고, 상기 PTS 모 균주들인 JM101 및 PB103 은 아주 잘 성장할 것이라는 것을 예측했을 것인데, WO 96/34961 을 참조한다. 이 결과가 관찰되었으며, 이 결과에 기초하여, 상기 JM101 의 PTS^- 유도체들을 PB11 로 표기하고, PB103 의 PTS^- 유도체들은 NF6 으로 표기하였다.

상기 PTS 시스템의 부재에 대한 또 다른 테스트는 PTS^- 균주들이 항생제인 포스포마이신 (fosfomycin) 에 대한 저항성을 갖게 된다는 사실에 기초한다 (Cordaro et al., (1976) J. Bacteriol 128:785-793).

상기 방법론이 불활성화된 PTS (PTS^-/Glu^-) 를 제공하는 바람직한 수단이지만, 다른 방법들 또한 사용할 수 있다. 한 가지 추가적인 비제한적인 방법으로는, 발현 단백질을 코딩하는 유전자에 작동적으로 연결된 억제자 결합 영역을 삽입하거나 또는 상기 유전자의 발현이 특이적 분자의 존재하에서 일어나도록 변형시키는 것을 포함한다. 예를 들어, lac 작동자는 Lac 억제자에 의하여 인식되는 DNA 서열이다. 상기 작동자가 상기 프로모터와 관련하여 적절한 위치에 위치할 경우, 상기 억제자가 상기 작동자에 결합하면, 이는 RNA 중합효소의 결합을 방해하여 유전자 전사를 방해할 것이다. 상기 방해는 유도자인 IPTG (이소프로필-β-D-티오갈락토시드) 를 첨가함으로써 제거할 수 있다. 억제 및/또는 유도의 수준은 상기 프로모터의 세기, 상기 작동자의 위치 및 서열, 및 상기 억제자 및 유도자의 양에 좌우될 것이다 (Muller J. et al., (1996) J. MoL Biol 257:21-29). lac 작동자는, 다수의 프로모터들, 이들 중, lac 프로모터 및 잡종 (hybrid) trc 프로모터의 수 개의 변형체들을 조절하는데 사용된다.

PTS^-/Glu^- 표현형에 영항을 주는 또 다른 비제한적인 방법은 특정 조건들이 존재할 때 상기 구조 유전자 서열의 발현에 영향을 주는 프로모터를 삽입하는 것을 포함한다. 예를 들어, TOL 플라스미드로부터의 Pm 프로모터는 유전자 발현을 조절하는데 사용될 수 있다. 이 시스템에서는, 벤조에이트 또는 톨루에이트를 배지에 첨가할 때 유전자 발현이 일어난다. (Mermod et al., (1986) J. Bact. 167:447-454). PTS^- 표현형에 영향을 주는 또 다른 추가적인 비제한적인 방법은 문헌 [Carrier 및 Keasling (1997) BiotechnoL Prog. 13:699-708] 에 기술된 바와 같이 mRNA 안정성을 변경하는 것이다.

그러나, 불활성화 PTS 숙주 세포에서 탄소 흐름을 증가시키거나 또는 탄소 흐름의 방향을 희망하는 대사 경로로 바꾸기 위해서는, 글루코오스 수송 및 인산화를 증폭시키거나 이에 대한 조절을 중지해야 한다.

C. 글루코오스 ⁺ 표현형 회복

이론에 제한되는 것을 원하지 않으나, 대안적인 글루코오스 동화 경로를 변형시킬 경우, PTS 에 의하여 글루코오스를 능동적으로 수송할 수 없는 것이 상쇄되어, 숙주 세포가, 다른 목적으로 글루코오스 수송에서 다른 방식으로 대사되는 PEP 를 이용할 수 있게 된다.

일단 PTS^-/Glu^- 숙주 세포가 수득되면, 글루코오스 동화에 수반되는 폴리펩티드를 코딩하는 염색체 핵산에 작동적으로 연결된 상동염색체 조절 영역을 변형하여 글루코오스⁺ 표현형을 회복하고, 이로써 PTS^-/Glu⁺ 표현형을 수득한다. 글루코오스 동화에 수반되는 상기 폴리펩티드의 발현에 작동적으로 연결된 조절 영역은 작동자, 프로모터, 저해자 또는 억제자일 수 있다.

한 가지 바람직한 구현예에서, 프로모터를 포함하는 조절 영역을 포함한 DNA 카세트를 PTS^-/Glu^- 숙주 세포 내로 도입하고, 글루코오스 동화에 수반되는 폴리펩티드를 코딩하는 염색체 핵산에 작동적으로 연결된 상동염색체 조절 영역을 변형하여 글루코오스⁺ 표현형을 회복한다.

D. 조절 영역들을 포함한 DNA 통합 카세트 구축

전형적으로 본 발명에 따른, PTS^-/Glu^- 숙주 내의 내인성 염색체 조절 영역 변형에 유용한 DNA 카세트 또는 구축물로는, 프로모터 등의 조절 서열을 들 수 있다. 또 다른 구현예에서, 상기 DNA 카세트는 선별 표지자 및 자율 복제 또는 염색체 통합을 가능하게 하는 서열, 예컨대 재조합효소 (recombinase) 인식 부위를 추가로 포함한다. 또 다른 구현예에서는, 상기 DNA 카세트는 상기 재조합효소 인식 부위의 상류 (5') 및 하류(3') 에 위치한 인접 서열들 (flanking sequences) 을 추가로 포함한다.

프로모터-

한 구현예에서, 상기 DNA 카세트를 포함한 조절 영역은 프로모터를 포함한다. 추가적인 구현예에서, 상기 프로모터는 외인성 프로모터이다. 다른 구현예에서, 상기 외인성 프로모터는 비-천연 프로모터 및 이의 유도체이다. 추가적인 구현예에서, 상기 프로모터는 본래의 내인적 형태에서는 글루코오스 동화 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 작동적으로 연결되어 있지 않은 자연적 프로모터이다. 일부 구현예에서, 상기 외인성 프로모터는 변형된 자연 발생적인 프로모터로서, 그의 본래의 내인적 형태가 글루코오스 동화 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 연결되어 있는 것인데, 이때 상기 천연 프로모터는 변경되고 그 후 숙주 세포 염색체 내로 재도입된다. 예를 들어, 상기 본래의 프로모터는 -35 영역, -10 영역 또는 링커 영역에서 변형되었을 수 있고, 또는 상기 본래의 프로모터는 억제자 결합 부위의 변형을 포함하였을 수 있다. 다른 구현예들에서, 상기 본래의 프로모터는 글루코오스 수송자, 예컨대 갈락토오스-양성자 공동운반자 (symporter) 를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 좀 더 구체적으로는 galP 에 연결되지 않은 것이다. 또한, 다른 구현예들에서, 상기 본래의 프로모터는, 인산화 단백질 예컨대 글루코키나제 (glucokinase) 를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 연결되지 않은 것으로서, 좀 더 구체적으로는 glk 에 연결되지 않은 것이다. 조절 영역 및 특히 본 발명에 따른 DNA 카세트에 유용한 프로모터를 포함한 조절 영역은 약 20 내지 200 bp, 약 20 내지 150 bp 및 약 20 내지 100 bp 의 서열을 포함한다.

바람직하게는, 상기 프로모터는 자연 발생적인 내인성 야생형 프로모터보다 더 강력할 것이고, 상기 글루코오스 동화 단백질의 발현 증가를 야기할 것이다. 당업자는 상기 프로모터의 상대적인 세기를 결정하는 다양한 방법론이 공지되어 있음을 인식할 것이다. 프로모터 세기는, RNA 중합효소가 특정 DNA 조각에 결합하는 속도를 측정하는 시험관내 방법을 사용하여 정량화할 수 있으며, 이는 또한 전사 개시의 측정도 가능하게 한다 (Hawley D.K et al., Chapter 3: in: PROMOTERS: STRUCTURE AND FUNCTION. R.L/ Rodriguez 및 M.J. Chamberlin 편저 Praeger Scientific. New York). 또한, 생체내 방법 역시 프로모터 세기를 정량화하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 프로모터를 리포터 유전자에 융합시킨 후, RNA 합성효소의 효율을 측정할 수 있다. Deuschle 등 (1986) (EMBO J. 5: 2987-2994) 은 3 개의 상이한 리포터 유전자를 사용하여 14 개의 E. coli 프로모터들의 세기를 측정하였다. 이들 프로모터들은 하기를 포함한다: trc, tacI, D/E20, H207, N25, G25, J5, A1, A2, A3, L, Lac, LacUV5, Con, β-lactamase (bla), T5"초기" P_L, 및 H/McC. 이들 프로모터 또는 이들의 유도체 각각은 본 발명에 따라 외인성 프로모터로 사용될 수 있다.

덧붙여, 그의 본래적인 내인적 형태로는 글루코오스 동화 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드에 연결되어 있지 않은 변형된 자연 발생적 프로모터 및 본래의 프로모터를 본 발명에 따라 사용할 수 있다. 다양한 예시적인 방법으로 본래의 프로모터들을 결정할 수 있다. 이에 제한되는 것을 원치 않지만, 한 가지 구현예에서, 컴퓨터를 이용한 검색 알고리즘을 사용하여 특정 게놈의 서열을 밝히는 것을 수행할 수 있고, 프로모터로 추정되는 서열을 동정할 수 있다. 예를 들어, 한 게놈 영역의 서열을 밝히고, Neural Network for Promoter Prediction software (NNPP) 를 사용하여 추정 프로모터들의 존재 여부를 분석할 수 있다. NNPP 는, 주로 2 개의 특징적인 층, 즉 TATA 박스 (TATA box) 를 인식하는 층 및 전사 시작 부위를 확장하는 영역인 소위 "개시자" 를 인식하는 층으로 이루어진 시간 지연 네트워크이다. 상기 특징적인 층들 모두 하나의 생산 장치 내에 결합되어 있다. 상기 추정 서열들을 그 후 E. coli 에서의 예비 특징화 및/또는 직접적인 특징화 에 적합한 카세트 내로 클로닝할 수 있다. 또 다른 구현예에서, 컨센서스 프로모터 서열의 동정은 상동성 분석, 예를 들어 BLAST 를 사용하여 동정할 수 있다. 상기 추정 프로모터 서열을 그 후 E. coli 에서의 예비 특징화에 적합한 카세트 내로 클로닝할 수 있다.

수많은 프로모터 및 이들의 유도체가 사용될 수 있지만, 바람직한 프로모터로는, trc 프로모터 및 이들의 유도체를 들 수 있다 (Amann et al., (1983) Gene 25:167-178). 상기 trc 프로모터는 도 2 에 도시되어 있는데, 여기서 -35 박스는 TTGACA 이고, -10 박스는 TATAAT 이다. 또 다른 바람직한 프로모터는 tac 프로모터이다. 상기 tac 프로모터 및 trc 프로모터의 핵산 서열은 링커 영역을 제외하고는 동일하다. tac 프로모터의 링커 영역은 1 bp 가 다르다 (Russell 및 Bennett (1982) Gene 20:231-243). 또 다른 바람직한 프로모터는 글루코오스 이성질화효소 (glucose isomerase, GI) 프로모터 (자일로오스 이성질화효소 프로모터로도 공지되어 있음) 이다. 문헌 [Amore et al. (1989) Appl. Microbiol. Biotechnol. 30:351-357] 이 참조된다. 상기 GI 프로모터의 단편의 서열 (-10 박스의 +50 에서 -7 ) 은 서열번호 5

(이 때, -35 박스는 TTGACA 로 표현되고, -10 박스는 AATAAT 로 표현된다) 에 나와 있다.

유도체 프로모터는 -35 박스, 링커 영역 또는 -10 박스 내의 하나의 뉴클레오티드에 해당하는 위치 내의 하나 이상의 뉴클레오티드에 대한 변형을 포함할 수 있다. 바람직한 구현예에서, 이들 유도체 프로모터에서 -35 박스 내의 위치에 해당하는 위치를 변경시킨다. 특히 바람직한 유도체 프로모터는 TTGACA 및 TTTACA 에 해당하는 -35 박스에 대한 변형을 포함한다. 일부 TTGACA 변형은 TTGAAA, TTCAC 및 CTGACA 를 포함한다. 한 가지 특별한 변형은 -35 위치에 해당하는 위치에 대한 것이다. 특히 바람직한 유도체 프로모터는 또한 TATAAT, TAAGAT 및 TATGTT 에 해당하는 -10 박스에 대한 변형을 포함한다. 링커 영역 또한 변형될 수 있다 (Burr et al., (2000) NAR 28:1864-1870). 바람직하게는, 링커 영역은 변형되었든지 그렇지 않든지 간에 길이가 14 내지 20 bp, 바람직하게는 16 bp, 17 bp, 18 bp 및 19 bp 이다. 당업자들은 프로모터 내에 변형을 일으키는데 사용되는 방법을 잘 알고 있으며, 본 발명은 이들 방법들에 제한되지 않는다. 한 가지 예시적인 방법으로는, Quikchange 키트 (Stratagene) 를 사용하는 것이 있으며; 또한 WO 98/07846 ; [Russell 및 Bennett (1982) Gene 231-243 및 Sommer et al. (2000) Microbiol. 146:2643-2653] 을 참조한다.

추가적인 바람직한 유도체 프로모터로는 trc 유도체 프로모터가 있다. 상기 trc 유도체 프로모터는 -35 컨센서스 박스, -10 컨센서스 박스 또는 링커 영역 내에 하나 이상의 변형을 포함할 수 있다. 상기 변형은 삽입, 치환 또는 결실일 수 있다. 바람직한 구현예에서, 상기 trc 유도체 프로모터는 -35 박스에 대한 하나 이상의 변형을 포함한다. 예를 들어, E. coli 에서, -30 위치에서의 코돈이 아데닌 (A) 이므로, 이를 티민 (T), 구아닌 (G) 및 시토신 (C) 으로 치환할 수 있고; -31 위치에서의 코돈은 C 이므로, 이를 A, T 및 G 로 치환할 수 있으며; -32 위치에서의 코돈은 A 이므로, 이를 T, G 및 C 로 치환할 수 있고; -33 위치에서의 코돈은 G 이므로, 이를 C, T 및 A 로 치환할 수 있고; -34 위치에서의 코돈은 T 이므로, 이를 A, C 및 G 로 치환할 수 있고; -35 위치에서의 코돈은 T 이므로, 이를 A, G 및 C 로 치환할 수 있다. 한 가지 특히 바람직한 trc 유도체 프로모터는 -35 위치의 코돈에 대한 변형을 포함하고, 가장 바람직하게는, 이때 T 가 C 로 치환된 변형이다.

다른 바람직한 trc 유도체 프로모터는 -10 박스 내의 변형을 포함한다. 예를 들어, -7 에서의 뉴클레오티드가 T 이므로, 이를 C, G 및 A 로 이루어진 군으로부터 선택되는 1 개의 뉴클레오티드로 치환할 수 있고; -8 에서의 뉴클레오티드가 A 이므로, 이를 C, G 및 T 로 이루어진 군으로부터 선택되는 1 개 뉴클레오티드로 치환할 수 있고; -9 에서의 뉴클레오티드가 G 이므로, 이를 C, T 및 A 로 이루어진 군으로부터 선택되는 1 개 뉴클레오티드로 치환할 수 있고; -10 에서의 뉴클레오티드가 A 이므로, 이를 C, G 및 T 로 이루어진 군으로부터 선택되는 1 개 뉴클레오티드로 치환할 수 있고; -11 에서의 뉴클레오티드가 A 이므로, 이를 T, G 및 C 로 이루어진 군으로부터 선택되는 1 개 뉴클레오티드로 치환할 수 있고; -12 에서의 뉴클레오티드가 T 이므로, 이를 A, C 및 G 로 이루어진 군으로부터 선택되는 1 개 뉴클레오티드로 치환할 수 있다.

선별 마커 및 재조합효소 인식 부위

본 발명에 포함되는 DNA 카세트는 선별 마커를 포함할 것이며, E. coli 내에서 상기 유전자 삽입을 검출하기 위해 다수의 유전자를 사용할 수 있다. 이들 유전자들 중 일부는 선별 표현형을 제공한다. 이 경우, 배지 조건을, 이들 유전자의 발현만이 활성화된 콜로니들만이 증식하도록 확립할 수 있다. 다른 유전자들은 스크리닝할 수 있는 표현형을 제공한다. 스크리닝가능 표현형은 종종 유전자 발현 수준에 관한 정보를 산출할 수 있다. 임의의 희망하는 표지자를 사용할 수 있지만, 이 특성들에 기초하여, 유용한 항생제 저항 (Anb^R) 표지자는 이에 제한되지는 않으나, Cm^R, Km^R 및 Gm^R 이 있다. 선별 표지자의 바람직한 비-제한적인 예는 클로람페니콜 아세틸트랜스페라제 (CAT) 유전자이다.

바람직한 구현예에서, 숙주 세포 염색체의 표적 부위로 삽입될 프로모터를 포함한 DNA 카세트는 재조합효소 인식 부위의 양 측면에 인접한 선별 표지자를 포함할 것이다. 재조합효소 부위는 당업계에 주지되어 있으며, 일반적으로 이들의 촉매 기작을 기준으로 별개의 2 개의 집단으로 나뉘며, 문헌 [Huang et al., (1991) NAR. 19:443; Datsenko 및 Warner (2000) Proc. Natl. Acad. Sci 97:6640-6645 및 Nunes-Duby, D, et al, (1998) NAR 26:391-406] 을 참조한다. 바람직하게는, 상기 인식 부위들은 동일하다.

한 가지 주지의 재조합 시스템은 Saccharomyces Flp/FRT 재조합 시스템으로서, 이는 Flp 효소 및 2 개의 비대칭 34 bp FRT 최소 재조합 부위를 포함하고 있다 (Zhu et al., (1995) J. Biol. Chem 270:11646-11653). FRT 부위는 역위(inversion) 되어 있고 불완전하게 반복된 2 개의 13 bp 서열을 포함하는데, 이들은, 교차가 일어나는 8 bp 의 코어 비대칭 서열을 둘러싸고 있다 (Huffman et al., (1999) J. Mol. Biol. 286:1-13).

한 가지 바람직한 재조합효소 시스템은 박테리오파지 P1 의 Cre/loxP 부위-특이적 재조합 시스템으로서, 이는 Cre 효소 및 2 개의 비대칭 34 bp loxP 재조합 부위를 포함하고 있다 (Sternberg 및 Hamilton (1981) J. Mol. Biol. 150:467-486); Palmeros, B, et al (2000) Gene 247:255-264; Hoess et al. (1986) NAR 14:2287-2300; Sauer B. (1994) Curr. Opinions in Biotechnol. 5:521-527). loxP 부위는 역위되어 있고 불완전하게 반복된 2 개의 13 bp 서열을 포함하는데, 이들은, 교차가 일어나는 8 bp 의 코어 비대칭 서열을 둘러싸고 있다. 두 평행한 loxP 부위들 사이의 Cre-의존적 분자내 재조합의 결과, 환상 (circular) 분자 로서의 임의의 개재 DNA 서열이 절단되어, 각각 1 개의 loxP 부위를 포함한 2 개의 재조합 산물이 생산된다 (Kilby et al., (1993) Trends Genet. 9:414-421).

상동 측부 영역

본 발명에 따른 통합 DNA 카세트는 또한 글루코오스 동화 단백질을 인코딩하는 유전자의 상류 (5') 영역과 상동인 핵산 서열을 포함할 수 있다. 이 상동 서열들은 바람직하게는 제 1 재조합효소 인식 부위 (이에 대한 5') 및 상기 프로모터 (이에 대한 3') 측부를 이룬다. 글루코오스 동화 단백질을 인코딩하는 유전자의 상류 (5') 영역과 상동인 핵산 서열은 a) 변형의 표적이 되는 내인성 조절 영역에 대한 5' 서열, 및 b) 변형의 표적이 되는 내인성 조절 영역의 3' 서열로부터 유래된 서열들을 포함한다. 상기 3' 서열은 글루코오스 동화 단백질 코딩 서열의 일부를 포함할 수 있다. 상동 측부 서열은 약 2 내지 300 bp, 약 5 내지 200 bp, 약 5 내지 150 bp, 약 5 내지 100 bp 및 약 5 내지 50 bp 를 포함할 수 있다.

유전자 및 글루코오스 동화 단백질 분리

세균 세포로부터 희망하는 유전자를 수득하는 방법은 통상적이며, 분자 생물학 업계에 주지되어 있다. 예를 들어, 유전자 서열이 공지되어 있을 경우, 적당한 게놈 라이브러리들을 생성하여 스크리닝할 수 있다. 일단 서열이 분리되면, 중합효소연쇄반응 (PCR) (USP 4,683,202) 등의 표준 방법을 사용하여 DNA 를 증폭시켜 제한에 의하여 다양한 양의 DNA 를 수득할 수 있다. 상기 언급한 Sambrook et al. 을 또한 참조한다. 본 발명의 목적상, 글루코오스 동화 단백질을 코딩하는 임의의 유전자의 상기 정의된 바와 같은 상류 서열들이 상기 개시된 방법들에서 사용하기에 적합하다.

한 구현예에서, 글루코오스 동화단백질을 코딩하는 유전자는 글루코오스 수송자이다. 수송자들은 [Saier et al., (1998) ADVANCES IN MICROBIAL PHYSIOLOGY, Poole, R. K. 편저 pp 81-136 Academic press, San Diego, CA] 에 개시된다. 통상적으로, 상기 글루코오스 수송자들은 본원에 정의된 것과 같이 제 2 류 수송자(GALP) 및/또는 제 4 류 수송자(PTS)의 Transport Council(TC) 분류에 포함된다.

하나의 바람직한 글루코오스 수송자는 GalP이고, 이것은 E. coli 내에서 galP에 의해 코딩된다. 선행 기술 분야의 당업자는 E. coli 이외의 다른 공급원으로부터 분리된 GalP 를 코딩하는 유전자들이 또한 본 발명에 사용하기에 적합할 것이라는 점을 인정할 것이다. 게다가, 글루코오스 수송자로서 기능하고 E. coli로부터의 GalP에 20 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97% 및 98% 이상의 아미노산 서열 상동성을 갖는 단백질들이 본 발명에 따라서 사용하기에 적합할 것이다.

또한 대중적으로 이용가능한 컴퓨터 프로그램들이 글루코오스 동화단백질 및 특히 글루코오스 수송자에 상동인 서열을 결정하기 위해 사용될 수 있다. 바람직한 프로그램은 GCG Pileup 프로그램, FASTA (Pearson et al.(1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444-2448) 및 BLAST (BLAST Manual, Altschul et al., Natl. Cent. Biotechnol. Inf., Natl Library Med. (NCBI NLM), NIH, Bethesda MD 및 Altschul et al., (1997) NAR 25:3389-3402)를 포함한다.

BLAST를 사용함으로써 GalP와 단백질 서열이 유사한 3 개 이상의 투과효소들이 발견되었다. 예를 들어, 64 %의 단백질 서열 상동성을 갖는 araE; 34 %의 단백질 서열 상동성을 갖는 xylE 및 23 %의 단백질 서열 상동성을 갖는 yaaU. 상기 투과효소들은 또한 글루코오스 수송자로서 기능할 수 있다.

많은 경우, 수송자 단백질들은 세포 내에서 고도로 조절되고 일반적으로 수송자 유전자들의 발현은 배지 내 기질의 존재에 의해 유도된다. 상기 글루코오스 수송자, 즉 E. coli로부터의 갈락토오스 투과효소(GalP)는 갈락토오스에 의해 유도되나, 더욱 선호되는 기질은 글루코오스이다 (Henderson & Maidenn (1990). Phil. Trans. R. Soc. Lond. 326:391-410). E. coli에서는, GalP 외에, 다른 투과효소들이 글루코오스을 인식 및 수송할 수 있고, 예를 들어:

(a) mglBCA 유전자에 의해 코딩된 고친화성 갈락토오스 수송계 (Hogg et al. (1991) Mol. Gen. Genet. 229:453-459 및 Ferenci T. (1996) FEMS Microbiol. Rev. 18:301-317); 및

(b) 막성분 PtsM이 넓은 기질 특이성을 갖고 글루코오스 및 프룩토오스를 수송할 수 있는 만노오스 PTS 시스템 (Postma & Lengeler(1985) Microbial Rev. 49:232-269 및 Erni et al., (1987) J. Biol. Chem. 262:5238-5247).

게다가, 정상적으로는 글루코오스-PTS 시스템의 일부분인 ptsG 유전자의 생성물은, 돌연변이화에 의해 글루코오스 동화단백질 및 보다 명확하게는 글루코오스-촉진자로서 기능하는, PTC-비의존성 수송자로 전환될 수 있다. (Ruijter et al (1992) J. Bact. 174: 2843-2850 및 Erni et al (1986) J. Biol. Chem 261:16398-16403).

특성 기술이 잘 된 상기 예들에 부가하여, 다른 글루코오스 수송자들은 수송자DB 데이터베이스의 목록에 실린 것들을 포함한다. 이것은 완전한 유전체 서열이 사용 가능한 유기체에 대한, 예측되는 세포질막 수송자 단백질 보체를 기술하고 있는 관계 데이터베이스이다 (http://66.93.129.133/transporter/wb/index.html).

또 다른 구현 예에서, 상기 글루코오스 동화단백질은 인산화단백질이다. 상기 인산화단백질은 헥소키나제일 수 있고, 바람직하게는 글루코키나제이다. 하나의 바람직한 글루코키나제는 Glk이고 NCBI (NC 000913)를 참조한다. 글루코오스 수송자에 대해 상기에 나타낸 바와 같이, 다른 글루코오스 인산화효소들은 상기 컴퓨터 프로그램, 예를 들면 FASTA, GCG Pileup 및 BLASTA를 사용하여 확인할 수 있다.

E. coli는 [Flores et al. (2002) Met. Eng. 4:124-137] 및 [Curtis et al. (1975) J. Bacteriol. 122:1189-1199] 의 결과에 의해 제안된 바와 같이 다른 글루코오스 인산화효소들을 포함한다. glk가 E. coli 내에 단속되었을 때, 상기 세포는 야생형 균주와 비교하여 22 내지 32 %의 잔여 글루코오스 인산화 활성도를 가졌다. Glk 서열을 사용한 E. coli 유전체의 BLAST 검색은, 34 % 초과 수준의 서열 상동성을 갖는 어떤 단백질도 나타내지 않았다. 이것은 측정된 글루코키나제 활성도가 Glk와 관계없거나 또는 먼 관계의 하나 이상의 효소(들)에 의해 좌우됨을 나타낼 수 있다. 글루코키나제 활성도에 기여할 수 있는 이러한 글루코오스 동화 단백질들 중 몇 개를 하기에 나열하였다:

상기 목록은 총망라하고 있지는 않으며, 적당한 돌연변이-선택 프로토콜을 사용함으로써, 상기 및/또는 다른 키나아제들이 글루코오스를 인산화시키는 그들의 활성도를 증가시키도록 변화될 수 있음이 본 발명자들에 의해 제안되었다.

E. PTS ^- /Glu ^- 세포 내로의 DNA 카세트의 도입

일단 적당한 DNA 카세트가 구축되면 이들은 플라스미드 내로 도입되거나 직접 적당한 PTS^- /Glu^- 숙주 세포를 형질전환하는 데 사용될 수 있다. 박테리아 유기체에서 벡터로서 사용될 수 있는 플라스미드는 잘 공지되어있고, [Maniatis, et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2d Edition (1989)] 및 [MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, second edition (Sambrook et al., 1989)] 및 [Bron, S, Chapter 3, Plasmids, in MOLECULAR BIOLOGY METHODS FOR BACILLUS, Ed. Harwood and Cutting, (1990) John Wiley & Sons Ltd.] 를 참조한다.

본 발명에서 유용한 벡터는 벡터들 pSYCO101 (도 8 및 9), 및 pSYCO 101 유도 플라스미드 pSYCO103 및 pSYCO106; pKD46; pR6K-ECHO (Invitrogen); pJW168 (Palmeros et al., 2000 Gene, 247:255-264); ptrcM2; ptrc99A; pTrc99 (Pharmacia); pACYC177; pMCGG; pSC101; pKD46 (Datsenko and Wanner.(2000) PNAS 97:6640-6645); 및 pKP32 (WO 01/012833)을 포함한다.

숙주 세포 내로의 DNA 카세트 및 다른 벡터들의 도입은 공지된 수송 기술에 의해 달성될 수 있다. 이러한 유전자 수송 기술은 형질전환, 형질도입, 접합 및 원형질체 융합을 포함한다. 유전자 수송은 그 안에서 외인적으로 부가된 DNA가 박테리아에 의해 흡수되는 하나의 세포 또는 세포들로 하나의 유전자 또는 폴리뉴클레오티드를 수송시키는 과정이다. 일반적인 형질전환 과정은 [CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (Vol. 1 , Ausubel et al. 편저, John Wiley & Sons, Inc. 1987, Chapter 9)] 에 교시되어있고 칼슘 인산화 방법들, DEAE-덱스트란을 사용한 형질전환 및 전기천공을 포함한다. 다양한 형질전환 과정들이 주어진 숙주 세포에 핵산을 도입하는 선행 기술 분야의 당업자들에 의해 공지되어 있다.(USP 5,032,514; Potter H. (1988) Anal. Biochem 174:361-373; Sambrook, J. et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989); 및 Ferrari et al., Genetics, pgs 57-72 in BACILLUS, Harwood et al., Eds. Plenum Publishing Corp를 또한 참조한다).

글루코오스 동화 단백질을 코딩하는 유전자의 프로모터 및 상류 서열을 포함하는 DNA 카세트의 PTS^-/Glu^- 숙주 세포 내로의 도입은, 바람직하게는 내인성 조절 영역의 치환에 의해, 상기 내인성 염색체 조절 영역의 변화를 가져온다. 한 구현예에서, 상기 DNA 카세트는 외인성 프로모터를 포함하고 상기 내인성 조절 영역의 프로모터가 치환된다. 상기 도입된 조절 서열(프로모터 포함)은 PTS^-/Glu^- 세포 내로 염색체적으로 통합되고 상기 도입된 서열은 내인성 조절 서열을 치환하는 글루코오스 동화 단백질의 코딩 서열과 작동적으로 연결된다. 바람직한 구현예에서, 통합된 DNA 카세트와 함께 도입된, 선택할 수 있는 표지 유전자는, 바람직하게는 [Palmeros et al. (2000) Gene 247:255-264] 에 기술된 방법을 사용하여 제거된다. 상기 외인성 프로모터에 연결된, 상기 글루코오스 동화 단백질의 발현은 글루코오스⁺ 표현형을 갖는 세포를 생성한다. 글루코오스⁺ 표현형(PTS^-/Glu⁺)을 갖는 박테리아 균주는 본원에 개시된 바와 같이 또한 본 발명에 포함된다.

추가 구현예에서, 상기 변화된 내인성 조절 영역은 글루코오스 수송자의 조절 영역이다. 바람직한 구현예에서, 상기 글루코오스 수송자 유전자는 E. coli로부터의 GalP 및 E. coli로부터의 GalP에 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97% 및 98% 이상의 아미노산 서열 상동성을 갖는 글루코오스 수송자들을 코딩한다. 또다른 구현예에서, 상기 변화된 내인성 조절 영역은 인산화 단백질의 조절 영역이다. 바람직한 구현예에서, 상기 인산화 단백질은 글루코키나제이고, 더욱 바람직하게는 E. coli로부터의 Glk 및 E. coli로부터의 Glk에 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97% 및 98% 이상의 아미노산 서열 상동성을 갖는 인산화 단백질이다.

한 구현예에서, 글루코오스 동화 단백질에 작동적으로 연결된 변화된 내인성 조절 서열, 특히 본 발명에 따라서 갈락토오스 투과효소에 작동적으로 연결된 변화된 내인성 조절 서열 및 글루코키나제에 작동적으로 연결된 변화된 내인성 조절 서열을 갖는 상기 수득된 PTS^-/Glu⁺ 세포에서는, 야생형 숙주 세포와 비교하여 목적하는 화합물의 생산이 증가될 수 있다. 상기 목적하는 화합물은 도 1B에 도해된 화합물들을 포함한다. 특히 바람직한 화합물들은 디히드록시아세톤-P, 글리세롤, 1, 3-프로판디올, 피루베이트, 락테이트, 코리스메이트, 트립토판, 페닐알라닌, 타이로신, 옥살아세트산, 아스파르트산, 아스파라긴, 타이로신, 숙신산, 에탄올 및 아세틸-CoA를 포함한다. 특히 목적하는 화합물들은 피루브산, 코리스메이트 및 숙신산을 포함한다.

F. PTS ^- /Glu ⁺ 세포의 추가적 변경

상기 발명의 방법에 따라서 수득된 PTS^-/Glu⁺ 세포는 일반적 방향성 경로 내로 및 이를 통하는 탄소 흐름을 지시하는 하나 이상의 단백질을 코딩하는 이종성 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함할 수 있다. 상기 이종성 폴리뉴클레오티드는 Glu⁺ 표현형으로의 회복 전, 회복 동안 또는 회복 후 PTS^-/Glu⁺ 세포 내로 도입될 수 있다.

한 구현예에서 PTS^-/Glu⁺ 세포는 본 발명에 따라서 tktA 또는 tktB에 의해 코딩된 트랜스케톨라아제를 과발현시킬 수 있다. 트랜스케톨라아제는 각각이 생성물로서 E4P를 생산하는 두개의 분리된 반응들을 촉매하는 펜토오스 인산화 경로 효소이다.(도 1 참조) 트랜스케톨라아제를 코딩하는 핵산 서열의 도입에 의한 tktA 유전자의 증폭(과발현)은 방향족 전구체 E4P의 세포 내 농도를 증가시키는 결과를 가져올 수 있다(미국 특허 5,168,056).

또다른 구현예에서, DAHP 합성효소를 코딩하는 하나 이상의 유전자들(aroG, aroF 및 aroH)은 본 발명에 따라서 PTS^-/Glu⁺ 세포에 도입되거나 증폭될 수 있다. E4P 및 DAHP 합성효소 모두의 증가된 발현은 오직 증가된 DAHP 합성효소 활성만을 갖는 균주와 비교하여 방향성 경로로 넘겨지는 탄소의 현저한 증가를 가져올 수 있다.

따라서 한 구현예에서 본 발명은 PTS(PTS^-)의 불활성화를 통해 PEP를 보존하는 숙주 세포에 부가하여, 트랜스케톨라아제의 증폭에 기인한 탄소 흐름의 급증을 야기하는 숙주 세포에 관한 것이다.

상기 숙주 세포가 방향성 경로 내로의 탄소 흐름의 증가를 야기하는 조건에서 배양될 때, 상기 경로에서 속도 결정 단계를 확인 및 극복하는 것이 필요할 수 있음을 명심해야 한다. 상기 방법론은 당업자에게 유용하고, 예를 들어, 미국 특허. Nos. 5,168,056 및 5,776,736을 참조한다.

한 예로서, 하기 전환에서:

예를 들어 PTS^-/Glu⁺ 및 Tkt 과발현 균주의 경로 내로의 탄소 흐름의 급증을 야기하는 조건 하에서, DHQ 합성효소의 활성도 수준은 DAHP를 형성되는 속도만큼 빨리 소비하는 데 불충분하다. aroB에서의 상기 자연적 속도 결정 단계의 결과로, DAHP가 축적되고 배양상청액 내로 분비된다. 이는 DAHP의 축적이 PTS^-/Glu⁺ 균주들로부터 기인하는 증가된 세포 내 PEP 수준을 확인하는 방법으로서 사용되게끔해준다.

상기 방향족 경로를 통한 탄소 유동의 증가에 부가하여, 본 발명에 따른 하기 유전자들이 PTS^-/Glu⁺ 세포에서 과발현될 수 있다: E. coli에서 PEP 합성효소를 코딩하는 pps (미국 특허 No. 5,985,617 참조) 및 트랜스알돌라아제를 코딩하는 talA (lida et al. (1993) J. Bacterial. 175:5375-5383). 게다가 상기 일반적 방향성 경로 (예를 들어, DAHP 합성효소 (aroF, aroG, aroH), DHQ 합성효소 (aroB), DHQ 탈수효소 (aroD), 시키메이트 탈수소효소 (aroE), 시키메이트 키나아제 (aroL, aroK), EPSP 합성효소 (aroA) 및 코리스메이트 합성효소 (aroC)) 내에서 반응들을 촉매하는 효소를 코딩하는 임의의 유전자가 본 발명에 포함된 PTS^-/Glu⁺ 세포에서 증폭될 수 있다.

목적하는 생성물에 따라 다양한 상이한 유전자들이 과발현될 수 있음은 선행 기술 분야의 당업자들에게 쉽게 명백해질 것이다.

한 구현예에서, 목적하는 생성물이 코리스메이트이면, PTS^-/Glu⁺ 세포는 본 발명에 따라서 효소들 DAHP 합성효소, DHQ 합성효소; DHQ 탈수효소; 시키메이트 탈수소효소; 시키메이트 키나아제; EPSP 합성효소 및 코리스메이트 합성효소를 코딩하는 유전자들을 포함하여 상기 방향성 경로에서 임의의 하나의 유전자를 과발현시킬 수 있다.

한 구현예에서, 목적하는 생성물이 트립토판이면, 효소들 트립토판 합성효소 (trpA 및 trpB), 포스포리보실 안트라아닐레이트 이소머라제-인돌글리세롤 포스페이트 합성효소 (trpC), 안트라아닐레이트 포스포리보실 전이효소 (trpD) 및 안트라닐레이트 합성효소 (trpE)를 코딩하는 유전자들을 포함하여, 상기 방향성 경로의 트립토판-특정 구역에서 임의의 유전자들이 증폭될 수 있다. 또다른 구현예에서는 트립토판분해효소를 코딩하는 유전자(tnaA)가 결핍될 수 있다.

또다른 구현예에서, 목적하는 생성물이 피루베이트이면 본 발명에 따라서 PTS^-/Glu⁺ 세포는 pyk를 과발현하도록 유전적으로 설계될 수 있다. 상기 유전자는 피루베이트 키나아제를 코딩한다. 목적하는 화합물이 옥살아세트산이면 PTS^-/Glu⁺ 세포는 본 발명에 따라서 PEP 카르복실라아제를 코딩하는 ppc를 과발현하도록 유전적으로 설계될 수 있다 (EC 4.1.1.31).

만약 목적하는 화합물이 카테콜이면, PTS^-/Glu⁺ 세포는 본 발명에 따라서 하나 이상의 하기 효소(들)을 코딩하는 DNA를 가지고 추가로 형질전환될 수 있다:DAHP 합성효소 (aroF, aroG, aroH); 3-디히드로퀴네이트 (DHQ) 합성효소 (aroB); 트랜스케톨라아제 (tktA 또는 tktB); 3-디히드로시키메이트 (DHS) 탈수효소 (aroZ) 또는 프로토카테츄에이트 (PCA) 디카르복실라아제 (aroY) (US 특허 5,272,073 및 5,629,181 참조).

또한, 예를 들어, 만약 목적하는 생성물이 아디프산이면, 하나 이상의 하기 효소(들)은 (상응하는 유전자의 증폭에 의해) PTS^-/Glu⁺ 세포에서 본 발명에 따라서 과발현될 수 있다: 3-디히드로시키메이트 (DHS) 탈수효소 (aroZ); 프로토카테츄에이트 (PCA) 디카르복실라아제 (aroY) 또는 카테콜 1,2-디옥시저네이스 (catA); 및, 임의로, 트랜스케톨라아제 (tktA 또는 tktB); DAHP 합성효소 (aroF, aroG, aroH) 또는 DHQ 합성효소 (aroB). (미국 특허 5,487,987 참조).

목적하는 생성물이 인디고이면, PTS^-/Glu⁺ 세포는 본 발명에 따라서 트립토판 합성효소 베타 서브유닛의 폴리펩티드 유사체를 코딩하는 DNA 및 방향족 디옥시게네이즈를 코딩하는 DNA 로 추가로 형질전환될 수 있다.(미국 특허 5,374,543 참조).

따라서, PEP를 보존하여 PEP 및 PEP 전구체를 재지령하여 대사경로, 예를 들어 방향족 아미노산 경로, 당분해, TCA 회로 및 펜토스 인산화 경로 내로의 탄소 흐름을 증가시키는 결과를 가져오는 PTS^-/Glu⁺ 균주를 제공하면서, 본 발명자들은 상응하는 PTS 숙주세포에서의 동일한 화합물의 생산과 비교하여 목적하는 화합물들의 생산을 향상시키는데 사용될 수 있는 숙주 시스템을 제공하였다.

G. 세포 배양 및 발효

박테리아 세포의 유지 및 성장에 적합한 방법들이 잘 공지되어 있고 [MANUAL OF METHODS OF GENERAL BACTERIOLOGY , 편저 P. Gerhardt et al., American Society for Microbiology, Washington DC (1981) 및 T.D. Brock in BIOTECHNOLOGY: A TEXTB00K OF INDUSTRIAL MICROBIOLOGY, 2nd ed, (1989) Sinauer Associates, Sunderland, MA] 를 참조한다.

세포 예비배양

전형적으로 세포배양은 적당한 배지 내에서 25 내지 32 ℃, 및 바람직하게는 28 내지 29 ℃에서 성장시킨다. 본 발명에 사용되는 전형적인 성장배지는 상업적으로 제조된 배지, 예를 들어 Luria Bertani (LB) 액체배지, 사부로 덱스트로스 (SD) 액체배지 또는 효모 배지 (YM) 액체배지가 일반적이나 이에 제한되지는 않는다. 이들은 예를 들어, GIBCO/BRL (Gaithersburg, MD)로부터 입수가능하다. 다른 한정 또는 합성 성장배지가 사용될 수 있고 특정한 박테리아 미생물의 성장에 적당한 배지가 미생물 또는 발효과학 분야에서 당업자에게 공지되어 있을 것이다. 상기 발효에 바람직한 적당한 pH 범위는 pH 5 내지 pH 8 사이이다. 시드 플라스크에 바람직한 범위는 pH 7 내지 pH 7.5 이고, 반응 용기에 바람직한 범위는 pH 5 내지 pH 6 이다. 발효 미생물의 분야의 당업자는 상기 발효 과정에 영향을 미치는 많은 인자들이 아스코르빈산 중간체 생산을 극대화하기 위하여 최적화되어야 하고 조절되어야 함을 인정할 것이다. 많은 이러한 인자들, 예를 들어 pH, 탄소원 농도 및 용존 산소 농도는 아스코르빈산 중간체 생산에 사용되는 상기 세포형에 따라 효소적 과정에 영향을 미칠 수 있다.

목적하는 생성물의 생산은 발효적 환경, 즉 생체 내 환경 또는 비발효적 환경, 즉 시험관 내 환경; 또는 결합된 생체 내/시험관 내 환경에서 계속될 수 있다. 상기 발효 또는 생물 반응기는 배치(batch)과정 또는 연속된 과정으로 수행될 수 있다.

발효 배지

본 발명에서 발효 배지는 글루코오스 같은 단당류, 락토오스 또는 슈크로스 같은 올리고당류, 전분 또는 셀룰로오스 같은 다당류 및 재생 공급원료로부터의 비정제 혼합물, 예를 들어 치즈 훼이 펄밋(cheese whey permeate), 콘스팁 액(cornsteep liquor), 사탕무 몰라세, 및 맥아를 포함하나 이에 제한되지 않는 적합한 탄소 기질을 함유하여야 한다. 추가로 상기 탄소 기질은 또한 탄소와 같은 한 탄소 기질일 수 있다. 본 발명에 사용되는 탄소원은 기질들을 함유하는 매우 다양한 탄소를 포함할 수 있고 다만 유기체의 선택에 의해서만 제한될 것임이 고려될 수 있으나, 바람직한 탄소 기질들은 글루코오스 및/또는 프룩토오스 및 이들의 혼합물을 포함한다. 본 출원의 다른 곳에 설명된 변화된 게놈과 조합하여 글루코오스 및 프룩토오스의 혼합물을 사용함으로써, 산화경로의 대사경로로부터의 분리는 숙주 세포의 대사적 요구를 만족시키기 위하여 프룩토오스를 사용하는 동안에도 향상된 수율로의 글루코오스의 사용 및 목적하는 아스코르빈산 중간체로의 전환을 가능하게 한다.

상기 언급된 탄소 기질 모두는 본 발명에 적합할 수 있는 것으로 여겨지나, 바람직한 것은 탄수화물 글루코오스, 프룩토오스 또는 슈크로스이다. 상기 탄소 기질의 농도는 중량/중량 기준으로 약 55 % 내지 약 75 % 이다. 바람직하게는, 상기 농도는 중량/중량 기준으로 약 60 내지 약 70 %이다. 상기 발명자들은 가장 바람직하게는 60 % 또는 67 % 글루코오스를 사용하였다.

적절한 탄소원에 부가하여, 발효 배지는 성장 또는 배양 및 아스코르빈산 중간체 생산에 필요한 효소적 경로의 촉진에 적합한 광물, 염, 비타민, 보조인자 및 완충액을 함유하여야 한다.

회분식 및 연속 발효

본 과정은 배양계로서 회분식, 주입-회분식 또는 연속식 발효 방법을 사용한다. 이러한 방법들은 선행 기술 분야에 잘 공지되어있고, 예들은 [Brock, 상기 문헌] 에서 발견할 수 있다. 고전적 회분식 발효는 상기 배지의 조성을 상기 발효의 개시시 정해 발효 동안에 인위적인 변화를 겪지 않도록 한 폐쇄계이다. 따라서, 발효의 개시시 상기 배지는 바람직한 유기체 또는 유기체들로 접종해 발효는 상기 계에 아무것도 첨가하지 않은 채 일어나도록 둔다. 그러나, 전형적으로, "회분식" 발효는 탄소원의 첨가와 관련된 배치이고, pH 및 산소 농도와 같은 인자들의 조절이 종종 시도된다. 회분식 계에서 상기 계의 대사물 및 생물자원 조성은 상기 발효가 정지하는 시간까지 계속하여 변화한다. 회분식 배양 내에서 세포들은 정지된 지체기를 통해 고성장 대수증식기로 그리고 최종적으로 성장 속도가 감소되거나 정지된 정지기로 완화된다. 미처리시, 상기 정지기의 세포들은 결국 죽을 것이다. 대수증식기의 세포들은 일반적으로 최종산물 또는 중간체의 생산의 급증을 초래한다.

표준 회분식 계의 변화는 주입-회분식 계이다. 주입-회분식 발효 과정 또한 본 발명에 적합하고, 상기 기질이 상기 발효 진행에 따라 증가하여 첨가되는 것을 제외하면 전형적 회분식 계를 포함한다. 주입-회분식 계는 대사산물 억제가 세포들의 대사를 방해하기 쉬울 때 및 배지 내 제한된 양의 기질을 갖는 것이 바람직한 곳에 유용하다. 주입-회분식 계 내 실제 기질 농도의 측정은 어렵고 따라서 측정할 수 있는 인자들, 예를 들어 pH, 용해된 산소 및 CO₂ 같은 폐가스의 분압의 변화를 기준으로 추정된다.

본 발명에서 회분식 또는 주입-회분식 방법이 바람직함에도 불구하고, 연속식 발효 방법 또한 사용될 수 있다. 연속식 발효는 제한 발효 배지를 연속적으로 생물 반응기에 첨가하고 공정 중 동시에 동량의 조절 배지를 제거하는 개방계이다. 연속식 발효는 일반적으로 세포들이 주로 대수증식기 성장에 있는 일정한 고밀도로 배양을 유지한다. 연속식 배양은 세포 성장 또는 최종산물 농도에 영향을 미치는 하나의 인자 또는 임의의 수의 인자들의 조정을 가능하게 한다. 예를 들어, 한 방법은, 제한 영양분, 예를 들어 탄소원 또는 질소수준을 고정된 비율로 유지하고, 모든 다른 매개 변수들을 알맞게 유지하도록 할 것이다. 다른 계에서는, 배지의 혼탁 정도로 측정되는 세포 농도가 일정하게 유지되는 동안에도, 성장에 영향을 미치는 많은 인자들이 연속적으로 변할 수 있다. 연속계는 정류상태 성장조건을 유지하기 위해 노력하고, 따라서 배지가 빠진데 기인한 상기 세포의 손실은 상기 발효에서의 세포 성장 속도에 대해 균형을 이루어야 한다. 생성물 형성 속도를 극대화하는 기술 뿐만 아니라 연속 발효 과정에서 영양분 및 성장 인자를 조정하는 방법들이 산업적 미생물학의 분야에서 널리 공지되어 있고, 다양한 방법들이 [Brock, 상기 문헌] 에 의해 상세히 설명된다.

본 발명을 수행하는 상기 방식 및 방법은 하기의 실시예들을 참조하여 선행 분야의 당업자들에 의해 좀더 충분히 이해될 수 있고, 본 실시예들은 어떠한 방식으로도 본 발명 또는 그에 지시된 청구항들의 범위를 제한하려고 의도되지 않았다. 본원에 언급된 모든 참조들 및 특허 공보들은 이로써 참고 문헌으로 포함된다.

실험

실시예 1 - PTS ^- E. coli 균주의 구축

A). lox P-CAT- lox P-trc 카세트, 플라스미드 pTrcM42의 구축

공급자 (New England Biolabs) 의 지시에 따라 제한효소 HindⅢ 및 NcoⅠ으로 절단하여 플라스미드 pTrc99a (Pharmacia) 로부터 링커 DNA 를 수득하였다. 정제 후, 상기 절단한 DNA 말단을 [Sambrook et al. 상기 문헌] 에 기재된 바와 같은 T4DNA 중합효소로 채웠다. 상기 생성 평단 말단, 선형 DNA 를 표준 프로토콜에 따라 폐환시키고, E. coli TOP-10 컴피턴트 세포 (Invitrgen, Carlsbad CA) 내에 형질전환시켰다. 세포들을 50 마이크로그램/ml 의 카르베니실린을 함유하는 루리아-아가 (LA) 플레이트 (5 g/L 의 효모 추출물; 10 g/L 의 트립톤, 및 10 g/L 의 NaCl + 2% 아가를 함유하는 LB 배지) 에 도포하였다. 37 ℃ 에서 16 시간 인큐베이션 후, 4 개의 콜로니를 추가적 분석을 위하여 선택하였다. 정제한 플라스미드 DNA 를 상기 콜로니로부터 수득하고, 제한효소 분석을 수행하였다. 4 개의 콜로니가 동일한 플라스미드를 함유하고 있다는 것, 및 HindⅢ 및 NcoⅠ 사이의 DNA 영역이 제거되었음을 확인하였다. 상기 수득한 플라스미드를 pTrc1 이라 명명하였다.

플라스미드 pTrc1 은 trc 프로모터의 -35 영역의 약 120 bp 상위에 위치한 제한효소 BspM1 에 대한 단 1 개의 인식 부위를 포함하고 있다. 상기 위치를 선택하여 절단가능한 선택 마커로 사용하였다. pTrc1 을 공급자 (New England Biolabs) 의 지시에 따라 BspM1 효소로 소화하였다. 선형 pTrc1 을 QIAquick 젤 추출 키트 (QIAGEN) 를 사용하여 젤-정제하고, [Sambrook, 상기 문헌] 에 기재된 T4 DNA 중합효소로 채우고, loxP-CAT-loxP DNA 카세트로 연결하였다. loxP-CAT-loxP DNA 카세트를 Stu1 및 Bam H1 으로 절단한 플라스미드 pLoxCAT2 (Palmeros et al., (2000) Gene 247:255-264) 로부터 수득하였다. 상기 라이게이션 혼합물을 E. coli TOP-10 컴피턴트 세포 (Invitrogen) 에 형질전환시키고, 50 마이크로그램/ml 의 카르베니실린 및 20 마이크로그램/ml 의 클로람페니콜을 함유하는 루리아-아가 플레이트에 도포하였다. 37℃ 에서 16 시간 인큐베이션 후, 수개의 콜로니가 플레이트 상에 나타났다. 상기 콜로니의 일부를 카르베니실린 및 콜로람페니콜을 함유하는 신선한 LB 플레이트에 옮겼다. 플라스미드 정제 및 제한효소 분석 후, 상기 trc 프로모터에 대해 동일한 방향 및 반대 방향에 있는 loxP-CAT-loxP 카세트를 갖는 loxP-CAT-loxP-trc 를 포함하는 2 개의 플라스미드를 선택하여, pTrcm41 및 pTrcm42 로 정하였다. (도 6)

B). gal P 에 대한 trc 프로모터 대체 템플레이트의 구축 (pR6KgalP)

상류 loxP-CAT-loxP 카세트를 갖는 trc 프로모터 및 lac 작동자를 포함하는 DNA 카세트를 GalA/GalP2 의 프라이머 세트를 사용하여 pTrcm42 로부터 PCR 로 증폭하였다.

상기 프라이머 쌍이 galP 상류 영역에 대해 일치성을 갖는 40 bp 를 상기 PCR 산물의 양 말단에 주입하였다. 상기 증폭은 Taq 중합효소 (Roche) 를 사용하여 30 사이클 (95℃에서 1분; 55℃에서 1분; 72℃에서 2분) 을 사용하였다. 상기 DNA 카세트를 Echo pUni/His5 R6K 벡터 (Invitrogen) 내로 클로닝하고, E. coli Pir1 세포 내에 형질전환하였다. 양성 클론들을 제한효소 절단에 의해 확인하여 상기 단편들을 유리하였다. 상기 구축물을 pR6KgalP 로 정하였다.

C). glk 에 대한 trc 프로모터 대체 템플레이트의 구축 (pR6Kglk).

상류 loxP-CAT-loxP 카세트를 갖는 trc 프로모터 및 lac 작동자를 포함하는 DNA 카세트를 GlkA/Glk2 프라이머 세트를 사용하여 pTrcm42 로부터 PCR 로 증폭하였다.

상기 프라이머 쌍이 galP 상류 영역에 대해 상동성을 갖는 40 bp 를 상기 PCR 산물의 양 말단에 주입하였다. 상기 증폭은 Taq 중합효소 (Roche) 를 사용하여 30 사이클 (95℃에서 1분; 55℃에서 1분; 72℃에서 2분) 을 사용하였다. 상기 DNA 카세트를 Echo pUni/His5 R6K 벡터 (Invitrogen) 내로 클로닝하고, E. coli Pir1 세포 내에 형질전환하였다. 양성 클론들을 제한효소로써 확인하고, 상기 플라스미드를 pR6Kglk 라 정하였다.

D). E. coli ptsHlcrr 결실 균주 KLpts7 의 구축

E. coli KLndh8l 의 PTS^- (△ ptsHlcrr) 균주 (KLp23ndh)를, ptsH, ptsl 및 crr 을 포함하는 전체 오페론을 카나마이신 내성 마커 (Levy et al., (1990) Gene 86:27-33) 로 대체함으로써 수득하였다. 이는 [Flores et al., (1996) Nature Biotechnol, 14:620-623] 에 기재된 바와 같은 파지 분해산물 2611 NF9pykF::Gm 을 사용하여 P1vir 형질도입으로써 수행하였다. 상기 오페론의 결실은 상기 결실 상류 또는 하류 영역에 하이브리디제이션시킨 프라이머 (ptsHF/crrR) 를 가지고 PCR 로써 영역 증폭시키고, MacConkey (락토스^-) 아가 + 1% 글루코오스 상에 상기 콜로니들을 도포함으로써 확인하였다.

글루코오스::PTS 시스템 내 결실을 갖는 상기 콜로니들은 더이상 글루코오스를 이용하지 못하고 산을 생성하기 때문에 상기 플레이트 상에서 흰색 표현형을 나타냈다. 상기 균주를 KLpts7 로 정하였다.

E). 선형 DNA 카세트 형질전환에 의한 gal P 천연 프로모터의 합성 외인성 trc 프로모터로의 대체

rTth RNA 중합효소 (Perkin Elmer), 템플레이트로서 pR6K-galP (서열번호.1) 및 프라이머 쌍 GalA/GalP2 (서열번호 6/서열번호 7) 를 사용하여 E. coli galP 상류 영역에 대해 상동성을 갖는 양 말단상의 인접 DNA 의 40 bp 를 갖는 loxP-CAT-loxP-ptrc 를 포함하는 DNA 카세트를 생성하였다. 상기 PCR 산물을 [Datsenko and Wanner (2000), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:6640-6645] 에 기재된 바와 같은 lambda Red 시스템을 사용하는 통합을 위해 pKD46 을 포함하는 전기-컴피턴트 KLpts7 세포 내에 형질전환시켰다. 상기 카세트의 통합은 galP ATG 개시 코돈 (GenBank Accession U28377 를 참조) 의 36-183 bp 상류로부터 조절 영역을 loxP-CAT-loxP-ptrc 카세트로 대체하여 균주 KLpts::galP-trc 를 제조하였다.

콜로니들을 10 ㎍/㎖ 클로람페니콜을 함유하는 LA 플레이트 상에서 선택하였다. 상기 통합을 프라이머 쌍 GalA/GalP2 (서열번호 6/서열번호 7)(상기 통합 부위를 증폭시켜 1.4 kb 산물을 수득함) 및 프라이머 쌍 GalB1/GalC11 (통합 부위를 상류 및 하류 영역을 포함하여 증폭시켜 2.1 kb 산물을 수득함) 을 사용하여 PCR 분석으로써 확인하였다.

PCR 파라미터는 제조자의 제안에 따라 Taq DNA 중합효소 또는 rTth 중합효소를 사용하여 95℃ 에서 1 분; 55℃ 에서 1 분; 72℃ 에서 2 분, 30 사이클이었다. 상기 균주, KLpts::galP-trc 를 MacConkey 아가 (락토스^-) + 1% 글루코오스 상에 도포하였다. 상기 콜로니는 KLpts7 과 비교하여 흐린 적색 표현형을 나타냈으며, 이는 전자 균주는 글루코오스로부터 산을 만들수 있는데 반해, 후자 균주 (부모) 는 그러하지 않음을 지시한다. 이는 galP 의 발현 및 상기 GalP 가 글루코오스를 섭취하였음을 확인시켜주었다. 상기 프로모터 영역을 서열분석하여 프로모터의 존재를 확인하였다. 상기 클로람페니콜 마커를 [Palmeros et al. (2000) Gene 247:255-264] 에 기재된 바와 같은 Cre 재조합효소 (recombinase) 를 사용하여 제거하고, 상기 제거를 프라이머 세트 GalB1/GalC11 (서열번호.10/서열번호.11) 을 사용하여 PCR 로 확인하였다. 상기 생성 균주를 KLgalP-ptrc 라 정하였다.

F). 선형 DNA 카세트 형질전환에 의한, 천연 글루코키나제 프로모터의 합성 외인성 trc 프로모터 (KLGG) 로의 대체

glk 상류 영역에 대해 상동성을 갖는 인접 DNA 의 40 bp 를 갖는 loxP-CAT-loxP-ptrc 를 포함하는 DNA 카세트를 상기 실시예 1E) 의 galP DNA 카세트에 대해 기재된 바와 같이 제조하였다. 상기 사용된 프라이머 세트는 glk ATG 의 149-189 상류로부터 5' 말단까지 및 glk ATG 로부터 3' 말단에 ATG 의 37 bp 상류까지 (glk 접근번호 AE000327) 까지의 인접 DNA 를 첨가한 GlkA/Glk2 (서열번호.8 및 서열번호.9) 였다. 상기 PCR 증폭에 사용된 템플레이트는 rTth 중합효소 (Perkin Elmer) 를 갖는 pR6Kglk 였다. 상기 glk-trc DNA 카세트를 [Datsenko and Wanner (2000) 상기 문헌] 에 기재된 바와 같이 pKD46 플라스미드를 포함하는 전기-컴피턴트 KLgalP-trc 세포에 형질전환하였다. 양성 클론들을 10 ㎍/㎖ 의 클로람페니콜을 함유하는 LA 아가 상에서 선택하였다. 상기 카세트의 통합을 프라이머 세트 GlkB1/GlkC11 및 KLgalP-trc 의 구축에서 기재된 PCR 프로그램을 사용하여 PCR 로서 확인하였다. GlkB1 은 glk ATG 의 700 bp 상류에서 시작하여 결합하는 포워드 프라이머였으며, GlkC11 은 glk ATG 개시 코돈의 500 bp 하류에서 시작하여 결합하였다.

콜로니들은 MacConkey 아가 (락토스^-) + 1% 글루코오스 상에 도포하였다. 콜로니들은 진한 적색을 나타냈으며, 이는 상기 부모(KLgalP-trc) 에 비교하여 글루코오스의 산으로의 전환이 증가했음을 지시한다. 상기 클로람페니콜 마커를 [Palmeros et al., 상기 문헌] 에 기재된 바와 같이 Cre 재조합효소를 사용하여 제거하였고, 제거를 프라이머 세트 GlkB1/GlkC11 을 사용하여 PCR 로 확인하여 1.3 kb 산물을 수득하였다. 상기 생성 균주를 KLGG 로 정하였다.

G). pACYC177 내로 클로닝된 ptrc 로부터 PEP-독립적 글루코오스 수송 시스템의 구축 (pMCGG)

trc 프로모터로부터 galP 및 glk 의 발현할 적절한 카피 수의 플라스미드를 구축하였다. trc 프로모터의 조절 하 galP 및 glk 각각을 함유하는 3040 bp AccⅠ 절편을 플라스미드 pVHGalPglk11 로부터 단리하였다 (도 13). 플라스미드 pVHGalPglk11 은 trc 프로모터의 조절 하 스펙티노마이신 항생제에 대한 내성 및 E. coli 로부터의 galP 및 glk 유전자를 갖는 pCL1920 벡터 (Lerner et al. (1990) NAR 18:4631) 로부터 유도된 낮은 카피 수 플라스미드이다. AccⅠ 절단에 의해 수득한 3040 bp DNA 단편의 상기 뉴클레오티드 서열 (서열번호 25) 이 도 14A-E 에 기재되어 있다. 상기 말단을 표준 방법 (Sambrook et al., 상기 문헌) 를 사용하여 채웠다. 상기 평단 말단 단편을 pACYC177 (New England Biolabs) 의 ClaⅠ 위치에 클로닝하여, 상기 카나마이신 내성 유전자를 불활성화시켰다. 콜로니들을 카르베니실린 (100 마이크로그램㎖) 상 성장 및 카나마이신 (10 ㎍/㎖) 상 성장의 결핍을 스크리닝하였다. 플라스미드 DNA 를 표준방법으로 양성 콜로니로부터 단리하고, 목적하는 단편의 존재성을 클로닝된 단편 내 오직 1 회만 절단하는 XbaⅠ 을 사용하고, 별도로 상기 플라스미드 내 2 개의 인식 부위를 갖는 BamHⅠ 을 가지고 제한효소 절단으로 확인하였다. 이로써 본 발명자들이 주입된 단편의 배열을 결정할 수 있었다. 상기 플라스미드를 pMCGG 로 정하였다.

H). pSYCO 구축물의 구축

탄소를 글루코오스로부터 생성물로 전환하기 위해 PTS^-/Glu⁺ 균주 (예 1E-G) 의 이용을 DHAP 의 1,3 프로판디올로의 전환을 수행하는 효소를 코딩하고 있는 유전자를 운반하는 플라스미드로써 시험하였다. 상기 pSYCO 구축물은 사카로마이시스 세레비제 (Saccharomyces cerevisiae) 로부터 DHAP (디히드록시아세톤-P) 의 글리세롤로의 전환을 위한 유전자 (dart1 및 gpp2) (이하 글리세롤 경로라 한다) 및 이어서 클레브셀라 (Klebsiella) 로부터 글리세롤을 1,3-프로판디올로의 (이하 1,3-프로판디올 경로라 한다) 전환을 위한 유전자 (dhaB1-3, dhaX, orfW, X, 및 Y) 를 운반하는 플라스미드계 pSC101 (Stratagene) 이었다. 현재 실시예에서 사용된 pSYCO 구축물은 pSYCO101, 103 및 106 이었고, 각각 pSYCO101 의 뉴클레오티드 서열 및 플라스미드 지도를 나타내는 도 8 및 9 를 참조하였다. 상기 pSYCO103 구축물은 글리세롤 경로를 포함하는 DNA 영역 및 pSYCO101의 방향과 반대 배향 중인 2 개의 EcoR1 인식 부위를 제외하고는 pSYCO101 과 동일하다. 상기 pSYCO106 구축물은 도 9 에 지시된 바와 같이 상기 EcoR1 부위 사이에 비-코딩 플라스미드 DNA 126 bp 및 10589-11145 bp 가 제거되있음을 제외하고는 pSYCO103 과 동일하다. 본원에 기재된 실험을 위한 상기 플라스미드는 기능적으로 동등하였다.

실시예 2 - 글루코오스 섭취를 위한 PET-PTS 시스템이 결핍된 균주의 염색체로부터 갈락토스 투과효소를 코딩하고 있는 gal P 의 구성적 발현

Glu+ 표현형을 갖는 PTS^-/Glu⁺ E. coli 균주 내에서의 글리세롤 및 1,3-프로판디올의 제조여부를 결정하였다. KLpts7/pMCGG 를 제조하기 위하여 표준방법 (Sambrook et al. 상기 문헌) 에 의하여 pMCGG (예 1G) 를 가지고 상기 PTS^-/Glu^- 균주 (KLpts7) 를 형질전환시키고, KlgalP-ptrc (예 1E) 를 만드는 KLpts7 내 내인성 토착 galP 프로모터를 대체하기 위하여 trc 프로모터의 염색체 통합시켜 상기 PTS^-/Glu⁺ E. coli 균주를 수득하였다. KLpts7/pMCGG 및 KlgalP-ptrc 양자 모두를 글리세롤 및 1,3-프로판디올 생성을 위한 경로를 가진 플라스미드를 가지고 표준방법 (Sambrook et al., 상기 문헌) 으로 형질전환하였다. 상기 세포 집단, 글리세롤 및 1,3-프로판디올의 생성을 발효 내 시험하였다.

표준 발효를 하기와 같이 수행하였다: 200 rpm 에서 쉐이킹하며 4-6 시간동안 표준 2YT 배지 (Sambrook et al. 상기 문헌) 내 35℃ 에서 500 ml 씨드 플라스크를 키웠다. 상기 시드 배양 (seed culture) 을 사용하여 K₂HPO₄ (13.6); KH₂PO₄ (13.6): MgSO₄.7H₂0 (2); 시트르산 모노히드레이트 (2), 페릭 암모늄 시트레이트 (0.3), (NH₄)₂SO₄ (3.2) 이스트 추출물 (5) 추적 원소 용액 (1 ml) 및 6.8 에 조정된 pH:로 이루어진 TN 2 매질 (g/L) 내에서 60 시간동안 pH 6.8, 35℃ 에서 글루코오스 과도 조건으로 작동되는 14 L 발효기를 인큐베이션하였다.

상기 추적 원소 용액 (g/L) 은 시트르산.H₂0 (4.0), MnSO₄.H₂0 (3.0), NaCl (1.0), FeSO₄.7H₂O (0.10), CoCL₂.6H₂0 (0.10), ZnSO₄.7H₂O (0.10), CuSO₄.5H₂O (0.01), H₃BO₃ (0.01) 및 Na₃MoO₄.2H₂O (0.01) 을 함유하고 있다.

상기 발효물을 흡광기 내 600nM 에서 배양물의 흡광도를 측정함으로써 세포 밀도를 분석하였고, 글리세롤 및 1,3-프로판디올 농도를 HPLC 를 사용하여 결정하였다.

1,3-프로판디올의 단리 및 확인:

글루코오스의 글리세롤 및 1,3-프로판디올로의 전환을 HPLC 로 모니터링하였다. 크로마토그래피 관련 기술분야의 당업자에게 익숙한 표준 기술 및 물질을 사용하여 분석을 수행하였다. 하나의 적절한 방법으로 RI 감지법을 사용한 Waters Alliance HPLC 시스템을 이용하였다. 50℃ 로 조절된 온도, 0.4 ml/분의 유속에서 이동상으로서 5 mM H₂SO₄ 를 사용하여 시료를 양이온 H 리필 카트리지 예비컬럼 (4.6 mm x 30 mm, Biorad, Hercules, CA) 를 장착한 Aminex HPX87H 컬럼 (7.8 mm x 300 mm, BioRad, Hercules, CA) 에 주입하였다. 상기 시스템을 공지된 농도 표준으로 매주 조정하였다. 전형적으로, 글루코오스, 글리세롤, 1,3-프로판디올 및 아세테이트의 보유시간은 각각 12.7 분, 19.0 분, 25.2 분 및 21.5 분이었다.

본 실시예에서, 2 개의 시스템을 비교하였다. 제 1 시스템에서는, trc 프로모터는 E. coli 균주가 glk 의 자연적 조절 하 글루코키나제를 생성케 하는 galP 목표 위치 (galP 위치- 예 1E를 참조) 내 통합시켰고, 제 2 시스템 내에서 상기 trc 프로모터를 galP 목표 위치 및 glk 목표 위치 (glk 위치-예 1F 를 참조) 양자 모두에 통합시켰다. 도 10 및 11 은 각각 pSYCO101 및 pSYCO103 으로 형질전환시킨 KLpts7/pMCGG 및 KLgalP-ptrc 에 대한 발효 결과를 설명하는 것이다.

상기 KLpts7/pMCGG 내 글루코오스 수송 시스템을 코딩하고 있는 플라스미드는 상기 균주가 높은 세포 밀도로 자라게 하고 (도 10A), 글리세롤 및 1,3-프로판디올을 생성케 하였다 (도 10B). 그러나, 상기 세포 군집에 대해 생성된 글리세롤 및 1,3-프로판디올의 양은 194 의 OD₆₀₀ 에 대하여 1,3-프로판디올 약 7 g/L 였다. 반대로, 도 11 에서 나타난 바와 같이, KlgalP-ptrc 는 발효물 내 훨씬 적은 세포 군집 및 더 많은 산물 1,3-프로판디올 약 61 g/L 및 글리세롤 36 g/L (도 11B) 를 생성하였다 (도 11A).

상기 trc 프로모터로부터 염색체 상에서 galP 를 구성적으로 발현시킴으로써, 글루코오스로부터의 탄소 흐름이 세포 군집을 생성하는 경로쪽보다 목적하는 산물, 글리세롤 및 1,3-프로판디올에 대한 경로쪽으로 증가하였다.

실시예 3 - PTS ^- 균주의 염색체로부터 gal P 및 glk 의 구성적 발현

상기 PTS^-/Glu^- 균주, KLpts7 을 galP 및 glk 표적 부위에 trc 프로모터를 통합시킴으로써 Glu⁺ 로 만들어 균주 KLGG 제조하였고, 상기 실시예 1 을 참조하였다. 상기 균주를 pSYCO101 을 사용해 표준방법으로 형질전환시켰다. 상기 세포 군집, 글리세롤 및 1,3-프로판디올의 생성은 표준 발효 내 시험하였다 (실시예 2 를 참조).

도 11 및 12 에 설명된 바와 같이, Klgal/P-trc 과 비교시, KLGG 는 더 빠르게 자랐다 (온도 33.9 에서, KlgalP 의 OD₆₀₀ 이 19.6 인데 반해, KLGG 는 24.7 의 OD₆₀₀ 값을 나타냈다). KLGG 는 균주 KlgalP-trc 에 의해 생성된 61 g/L 와 비교하여 1,3-프로판디올 70 g/L 을 생성하였다. 추가로, KLGG 발효에서 보다 조기에 최대 농도에 도달하였다 (KlgalP 에 대해 62.7 시간임과 비교하여 56.8 시간). 따라서, trc 프로모터의 염색체 통합에 의한 galP 및 glk 의 구성적 발현은 galP 만의 구성적 발현보다 더 짧은 발효 시간 내 더 많은 1,3-프로판디올을 생성하였다.

실시예 4 - E. coli 의 급속히 자라는 PTS ^- /Glu ⁺ 균주의 선택 및 분석

글리세롤 및 1,3-프로판디올을 생성하는 동안 균주 KLGG (상기 실시예 3) 의 발효 연구에서 증명된 성장 중 장기 지체기는 하기의 표 2 에 제시된 바와 같이 24 및 48 시간에 KLGG 에 대한 쉐이크 플라스크 실험에서 반복될 수 있었다.

발효 시간을 감소시키기 위해 빠르게 자라는 변종 KLGG 를 35℃, pH 6.8 에서 TM2 및 글루코오스 과량 조건에서 발효기 내 KLGG 를 배양함으로써 선택하였다. 세포들을 이른 대수기 (early log phase) 에서 수합하여 L 아가 상에 단리된 콜로니를 위해 도포하였다. KLGG 와 동등한 농도에서 pSYCO 로 형질전환시 글리세롤 및 1,3-프로판디올을 생성하는 변종을 찾기 위해 단리된 콜로니들을 스크린 하였다. 변종을 확인한 후, FMP 라 정하였다. FMP 는 KLGG 와 동등한 능력을 나타냈으나, KLGG 에 대한 48 시간과 비교하여 쉐이크 플라스크 성장 16 시간 내 동일한 능력을 달성하였다 (도 2).

쉐이크 플라스크 실험을 2% 글루코오스 + 50 마이크로그램/ml 의 농도의 스펙티노마이신 및 2 밀리그램/리터 의 B₁₂ 를 가지고 TM2 에서 수행하였다. 상기 pSYCO 플라스미드를 갖는 균주의 밤새 배양물을 37℃ 에서, 200 rpm 으로 쉐이킹하며 LB + 스펙티노마이신 (50 마이크로그램/ml) 내에서 배양하였다. 상기 쉐이킹 플라스크를 상기 200 마이크로리터의 밤새 컬처 (250 ml 배플 플라스크 내 10 mls 컬처) 로 접종하였고, 34℃ 에서 200 rpm 으로 쉐이킹하며 배양하였다. 상기 컬처에 대한 세포 밀도 (OD₆₀₀) 를 분석하였고, 글루코오스 소비 및 글리세롤 및 1,3-프로판디올의 생성을 HPLC 로 분석하였다 (실시예 2 를 참조).

빠르게 자라는 변종의 분석:: 상기 FMP 변종에 대한 글루코키나제 활성, glk mRNA 및 상기 유전자의 상대적 수준 및 프로모터 서열로 분석하였다. 표 3 에 제시된 바와 같이, FMP 의 글루코키나제 활성은 KLGG 의 활성에 비해 3 배, 즉 0.08 유니트에서 0.22 유니트로 증가하였다. 이는 더 활성있는 효소를 초래하는 코딩 영역 내 돌연변이 또는 현존하는 효소의 양의 증가를 시사한다.

발현 수준을 시험하기 위해, glk mRNA 의 상대적 수준을 결정 하였으며, 표 4A 및 4B 를 참조할 것이다. 라이트 사이클러를 사용하여, 교차 시간의 형태로 결과를 얻었다. 교차 시간이 더 짧을수록, mRNA 는 더 많이 존재하였다. galP 에 대한 교차 시간은 KLGG 및 FMP 내에서 동등하였으며, 이는 양 균주에서 mRNA의 유사 수준을 지시한다. FMP 내 glk 의 교차 시간은 KLGG 의 그것보다 더 짧았고 (각각, 18.47 에 대해 15.7), 평균 교차 시간의 비는 1.18 이었으며 (KLGG-glk:FMP-glk), 이는 더 많은 glk mRNA 가 FMP 균주 내 존재함을 지시한다. 시료를 2 회씩 (1 또는 2) 시험하였으며, 평균 (Avg.) 을 취하였다. 평균은 비를 결정하는데 사용하였다 (glk-K/glk-F 는 각각 KLGG glk 및 FMP glk 를 나타낸다).

서열 분석을 KLGG 및 FMP glk 유전자, 및 trc 프로모터 상에서 수행하였다. FMP 의 glk 코딩 서열 상에서 어떠한 돌연변이도 발견되지 않았다. trc 프로모터의 서열을 glkB1/glkBC11 프라이머를 사용하여 KGLL 및 FMP 의 염색체로부터 PCR 로 증폭하여 결정하였다. 또한, 서열분석을 프라이머 TrcF (서열번호.14) 를 사용하여 수행하였다.

G 의 A 로의 단일돌연변이를 FMP 내 trc 프로모터의 lac 작동자 내에서 하기 지시된 바와 같이 확인하였다.

상기 돌연변이는 연결된 유전자의 발현을 증가시키고, lac 억제자에 대한 작동자의 친화도를 감소시키는 O^C 작동자 구성적 돌연변이의 하나로 종래에 기재된 바 있다 (THE OPERON, Miller, JH and Reznikoff, WS eds., 1980, p190-192 및 그안의 참고문헌들). 이는 효과적으로 프로모터로부터 glk 의 전사를 증가시키며, 이는 효소 활성에 있어 증가를 통해 증명되었다. 상기 변이체 균주는 유입되는 글루코오스를 인산화시키는 글루코키나제가 더 많이 존재하고, 더 많은 G-6-P 가 중심 대사로 수송될 것이기 때문에 더 빠르게 자란다.

하기 조건 하에서의 글루코키나제에 대한 검정

100 mM 인산 버퍼 pH 7.2, 5 mM MgCl₂, 500 mM NADP, 5 mM ATP, 글루코오스-6-인산 탈수소화효소 2 단위. 본 검정법은 하기의 식에 있어서 NADPH₂ 의 출현을 모니터링함으로써 글루코오스 및 ATP 의 전환을 감지한다:

글루코오스 + ATP → 글루코오스-6-포스페이트 + ADP

글루코오스-6-포스페이트 + NADP + 2H → 글루코노-1,5-락톤-6-포스페이트 + NADPH₂

쉐이크 플라스크 실험에서의 대조군으로서 gal P, glk 및 16S rRNA 유전자 ( rrs H) mRNA 의 상대적 수준의 라이트 사이클러 결정 - 상기 균주 KLGG 및 FMP 를 TM2 10 ml + 2% 글루코오스 내에서 20 의 OD₆₀₀ 까지 배양하였다. 상기 배양물을 직접 50 ml 코니칼 튜브 내 액체 질소에 붓고, RNA 를 하기 기재된 바와 같이 정제하였다. 하기 프라이머를 사용하였다:

상기 라이트 사이클러 반응을 10 ㎕ 반응물로 조정한 Lightcycler RNA Amplication Kit SYBR Green I (Roche) 를 사용하여 제조자의 프로토콜에 따라 수행하였다. RNA 의 전체 500 ng 을 반응마다 사용하였다. 상기 사용된 프로그램은: 목표 온도 55℃; 인큐베이션 시간 10 분 및 온도 전이 속도 20℃/초 였다.

상기 RNA 단리 방법은 상기 예 4 에서 특정된 바와 같은 적절한 조건 하에서 쉐이크 플라스크 내 배양하고 50 ml 코니칼 튜브 내 액체 질소 내로 직접 7 내지 10 ml 를 피페팅하여 수합하는 것을 포함한다. 상기 시료를 사용준비 전까지 -70℃ 에서 냉동시켰다. 일반적으로, RNA 단리를 위하여 하기의 초기 조정으로 표준 방법을 사용하였다: 50 ml 튜브의 냉동 시료를 드라이 아이스 버킷에 위치시켰다; 페놀:클로로포름(1:1) 15 ml 및 3 M NaOAc (pH 4.8) 1.5 ml 을 각각 50 ml 튜브에 첨가하였다; 적은 양의 냉동 시료 (약 500 내지 2000 ㎕ 의 브로쓰) 를 (드라이 아이스로) 예비-냉장한 커피 분쇄기에 첨가하였다; 추가적 드라이 아이스 (2 또는 3 작은 조각) 를 상기 커피 분쇄기에 첨가하고, 시료를 1 분 이상 분쇄하였다; 상기 분쇄기를 두드려 모든 물질을 분쇄기 캡에 얻고, 상기 냉동 분쇄 세포 브로스 및 잔여 드라이 아이스를 함유하고 있는 캡을 분리하였다; 동량의 2X RNA 추출물 버퍼를 신속히 상기 캡내로 피페팅하였다; 냉동 물질을 일회용 무균 루프를 이용하여 현탁액 내로 교반하고 이어서 15 ml 페놀: 클로로포름/NaOAc 를 함유하는 코니칼 튜브 내에 위치시키고, 혼합하고 얼음에 위치시켰다. 이어서, 당업계에 공지된 표준방법을 수행하였다 (Sambrook et al., 상기 문헌).

Claims (48)

1. 하기 단계를 포함하는, 탄수화물 수송을 위해 인산수송효소 수송계 (phosphotransferase transport system: PTS) 를 원래 이용할 수 있었던 PTS^-/Glu^- 박테리아 숙주 세포의 대사 경로로 탄소 유입을 증가시키는 방법으로서:

   a) PTS^-/Glu^- 숙주 세포를, 에셰리키아 콜라이 (E. coli) 로부터 수득한 갈락토시다아제 투과효소 또는 그와 80% 이상의 서열 상동성을 가진 글루코오스 수송자로부터 선택되는 글루코오스 동화 단백질의 상류 (5') 영역에 해당하는 DNA 인접 서열 (flanking sequence) 및 비-숙주 세포 프로모터 또는 변화된 내인성 프로모터를 포함하는 DNA 구축물로 형질전환시켜 PTS^-/Glu^- 숙주 세포에서 글루코오스 동화 단백질을 코딩하는 핵산에 작동적으로 연결된 내인성 염색체 조절 영역을 변화시키는 단계;

   b) 상기 DNA 구축물의 통합으로 Glu⁺ 표현형을 회복시키는 단계; 및

   c) 적합한 배양 조건 하에 상기 형질전환된 숙주 세포를 배양하는 단계,

   여기서, 형질전환된 숙주 세포의 대사 경로로의 탄소 유입이, 본질적으로 동일한 배양 조건 하에 배양된 상응하는 PTS 박테리아 숙주 세포에서의 동일한 대사 경로로의 탄소 유입에 비해 증가하는 방법.
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4. 제 1 항에 있어서, 상기 글루코오스 동화 단백질이 글루코오스 수송자인 방법.
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6. 제 1 항에 있어서, 상기 글루코오스 동화 단백질이 인산화 단백질인 방법.
7. 제 6 항에 있어서, 상기 인산화 단백질이 글루코키나아제인 방법.
8. 제 1 항에 있어서, PTS^-/Glu^- 숙주 세포를 글루코키나아제의 상류 (5') 영역에 상응하는 DNA 인접 서열 및 프로모터를 포함하는 제 2 DNA 구축물로 형질전환해 PTS^-/Glu^- 숙주 세포에서 글루코키나아제를 코딩하는 핵산에 작동적으로 연결된 내인성 염색체 조절 영역을 변화시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
9. 제 1 항에 있어서, 상기 박테리아 숙주 세포가 에셰리키아 콜라이 (E. coli) 세포, 바실러스 (Bacillus) 세포 및 판토에아 (Pantoea) 세포로 이루어진 군으로부 터 선택되는 방법.
10. 제 1 항에 있어서, 상기 PTS^-/Glu^- 숙주 세포가 ptsI, ptsH 및 crr 로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자의 결실에 의해 PTS 세포로부터 수득되는 방법.
11. 제 1 항에 있어서, 트랜스케톨라아제, 트랜스알돌라아제 및 포스포에놀피루베이트 합성효소로 이루어진 군으로부터 선택되는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드로 PTS^-/Glu⁺ 숙주 세포를 형질전환하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
12. 제 1 항에 있어서, DAHP 합성효소, DHQ 합성효소, DHQ 탈수효소, 시키메이트 탈수소효소, 시키메이트 키나아제 EPSP 합성효소 및 코리스메이트 합성효소로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드로 PTS^-/Glu⁺ 숙주 세포를 형질전환하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
13. 제 1 항의 방법으로 수득되는 형질전환 박테리아 세포.
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