KR101100809B1 - 암 진단용 펩티드 마커 및 이를 이용한 암 진단방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 암 진단용 펩티드 마커 및 이를 이용한 암 진단방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 암 발생과 관계있는 특이적 당쇄를 포함하는 당단백질들을 분리 및 농축하는 단계; 상기 당단백질을 가수분해하여 폴리펩티드를 획득하는 단계; 상기 폴리펩티드를 정량적으로 분석하여 암 발생에 따른 특이적으로 당쇄화된 당단백질의 정량적 변화를 추적할 수 있는 특이 폴리펩타이드들을 선별하는 단계;를 이용하여 스크리닝된 암 진단용 펩티드 마커, 및 상기 펩티드 마커를 이용한 암 진단 방법에 관한 것이다.

당쇄화(glycosylation), 펩티드 마커, 정량적 변화, 암, 진단, 키트.

Description

암 진단용 펩티드 마커 및 이를 이용한 암 진단방법{Polypeptide markers for the diagnosis of cancers and methods for the diagnosis using the same}

암 발생에 따른 특이적으로 당쇄화된 당단백질의 정량적 변화를 추적할 수 있는 특이 폴리펩타이드들을 이용하여 암을 진단하는 방법에 관한 것이다.

단백질들은 다양한 생명 유지 활동에 관여되는 역할을 수행하면서, 신호전달에 의해 필요시마다 수식화(post-translatinal modification)가 이루어진다. 단백질의 수식화 중에서 가장 대표적인 것이 단백질의 당쇄화(glycosylation)와 인산화(phosphorylation) 등이다. 특히, 당단백질의 당쇄화는 세포막 표면에 존재하는 많은 종류의 단당류들이 신호전달에 의해 세포막 안으로 들어가 당전이 효소인 N-아세틸글루코사미닐트랜스퍼라아제(N-acetylglucosaminyltransferase)에 의해 필요한 단백질의 당쇄화가 이루어지고 이러한 당단백질들이 세포막 바깥에 위치하여 필요한 역할을 수행한다. 당단백질의 필요한 역할이 끝나면 당분해효소인 글리코시다제(glycosidase)에 의해 당분해가 진행되기도 한다. 그러나 세포막 표면에 존재 하는 많은 당단백질이나 당지질의 경우, 암유전자(oncogene)와 같은 특정 신호의 명령을 받으면 당쇄화가 비정상적으로 일어난다. 많은 질병의 경우 암유전자의 비정상적인 신호전달로 인해 당전이효소와 당분해효소의 비정상적인 작용과 관련이 있음이 알려져 있다(Kim, Y. J., et al., Glycoconj. J., 1997, 14, 569-576., Hakomori, S., Adv. Cancer Res., 1989, 52, 257-331., Hakomori, S., Cancer Res., 1996, 56, 5309-5318).

암세포에서 진행되는 이러한 비 정상적인 당질화의 패턴에는 N-연결형 당쇄의 크기 및 곁사슬 수의 증가, sialylation 및 fucosylation의 증가, 그리고 polylactosamine의 형성과 같은 당사슬 크기의 변화 등이 있으며, 당단백질에서 진행되는 이러한 현상을 이용하면 암의 존재와 진행을 확인할 수 있는 암마커로서 이 당단백질을 활용할 수 있다. 이렇게 비정상적으로 당쇄화된 당단백질은 또한 당쇄의 구조 및 크기의 특이성에 의해 당단백질의 접힘(folding), 인식(recognition), 용해도(solubility)등의 기능에 특이한 영향을 미친다(Varki, A. et al., Glycobiology 1993, 3, 97-130., Parodi, A. J. et al., Annu. Rev. Biochem. 2000, 69, 69-93.). 특히 암세포 등에서 비정상적으로 활성화된 N-아세틸글루코사미닐트랜스퍼라아제(N-acetylglucosaminyltransferase) 등과 같은 당전이 효소들은 암세포에 존재하는 단백질들을 정상세포의 그것들과 구별될 수 있게 비정상적으로 당쇄화를 유도함으로써 암세포를 정상세포로부터 구별할 수 있는 가능성을 제공하며, 따라서 비정상적으로 당질화된 당단백질은 암을 진단할 수 있는 암마커로서 개발될 수 있다(Dennis, J.W.; Laferte, S.; Waghorne, C.; Breitman, M.L.; Kerbel, R.S. Beta 1-6 branching of Asn-linked oligosaccharides is directly associated with metastasis. Science 1987,236:582-585). 이러한 암에 관한 정보를 포함하는 당단백질들은 필요한 역할이 끝나면 세포 밖 media로 secreted 되기도 하고 세포막으로부터 media로 떨어져 shed 되기도 하므로, 다양한 cancer cells의 culturing media, 암세포 조직의 lysis, 그리고 특히 환자의 혈액 등은 이러한 암 정보를 포함하는 당단백질, 즉 암마커들을 검출하기 위한 적절한 재료가 된다.

정상군과 환자군 각각으로부터 얻은 단백질 시료에 있어서, 단백질 당쇄화의 차이는 환자군을 정상군으로부터 구별할 수 있는 중요한 단서가 될 수 있으며, 따라서 이들 차이를 구별하기 위한 많은 분석 방법들이 소개되어 왔다. 단백질의 당쇄화에 있어서의 차이를 확인하는 방법으로는 당단백질들로부터 당을 가수분해 시켜 얻어진 당(glycan)만을 모아 당들을 질량분석기로 분석하여 당 프로파일링(profiling)을 보는 방법이 있다(Barkauskas. et al., Bioinformatics, 2009, 25, 251-257). 그러나, 이런 방법은 서로 다른 단백질 및 당질화 자리로부터 유리된 그리고 질량이 같은 수많은 이형체(isoform)의 당쇄들이 혼합되어 질량분석됨으로써, 단백질 각각의 특정한 당쇄화 자리에서의 당쇄화 특성 및 당쇄구조의 차이에 따른 당쇄 이형체에 대한 정보가 소실되므로 한정된 정보만을 얻을 수 있다.

당단백질만을 농축(enrichment)하는 방법으로 하이드라지드(hydrazide)를 이용하는 글리코-캡처링(glyco-capturing) 방법도 사용되고 있으나(Zhang H. et al., Nat. Biotechnol., 2003, 21, 660~666), 이 방법은 글리칸을 캡쳐링하는 과정에 온전한 상태의 당쇄구조가 유지될 수 없기 때문에 암세포 등에서 유래되는 비정상 적인 특이한 구조의 당쇄에 대한 정보가 소실되는 단점이 있다.

당단백질 또는 당펩티드만을 분리 농축하는 방법으로 당쇄의 다양한 구조에 따라, ConA(Concanavalin A), WGA(Wheat germ agglutinin), Jacalin, SNA(Sambucus nigra agglutinin), AAL(Aleuria aurantia lectin), L-PHA(Phytohemagglutinin-L), PNA(Peanut agglutinin), LCA(Lens culimaris agglutinin-A), ABA(Agaricus biflorus agglutinin), DBA(Dolichos biflorus agglutinin), DSA(Datura stramonium agglutinin), ECA(Erythrina cristagalli agglutinin), SBA(Soybean agglutinin), SSA(Sambucus sieboldiana agglutinin), UEA(Ulex europaeus agglutinin), VVL(Vicia villosa lectin), BPL(Bauhinia purpurea lectin), 또는 이러한 렉틴(lectin) 몇 가지를 혼합하여 사용하는 다중 렉틴(multilectin)을 사용하기도 한다(Yang, Z. et al., J. Chromatogr, A, 2004, 1053, 79-88., Wang, Y. et al., Glycobiology, 2006, 16, 514-523). 이 방법은 당단백질의 당쇄구조에 대한 렉틴의 선택성을 이용하는 방법이므로 특이 당쇄구조를 갖는 당단백질들에 대한 선택적인 분리, 농축이 가능하다는 장점이 있다. 특히, 렉틴에 선택적인 당단백질들에 대한 분리과정을 통하여 렉틴에 대하여 친화도를 보여주지 않는 많은 단백질들을 제거함으로써, 분석시료의 complexity를 크게 낮출 수 있는 장점도 있다. 분리, 농축된 당단백질은 다양한 분석적 방법을 이용하여 정성, 및 정량 분석이 수행될 수 있다.

렉틴의 당단백질의 당쇄구조에 대한 선택성을 이용하여 당단백질을 분석하는 방법으로서, lectin-blotting 방법이 많이 이용되고 있다. 또한 이 방법은 특정 단 백질에 대하여 높은 선택성을 보여주는 immunoblotting 방법과 함께 사용되는 것이 일반적이다. 따라서, 항원 당단백질에 대한 항체의 준비가 꼭 필요하며, 항체를 구할 수 없는 단백질의 경우 이방법을 이용하는 것이 불가능 한 단점이 있다. 또한, 기본적으로 겔-분리 기술을 사용하는 이 lectin-blotting 방법은 분석 속도 및 정량의 신뢰도 등에서 많은 한계를 보여준다. 항체와 렉틴을 사용하는 array 방법을 사용하면 기존의 렉틴-blotting 방법에 비하여 분석 속도 및 분석 감도를 크게 향상시킬 수 있다(Forrester, S. et. al., Low-volume, high-throughput sandwich immunoassays for profiling plasma proteins in mice: identification of early-stage systemic inflammation in a mouse model of intestinal cancer. Mol Oncol 2007, 1(2): 216-225). 그러나 이 경우도 신뢰할만한 항체의 확보가 필수적이며, 대규모로 새로이 발굴되고 있는 모든 당단백질들에 대한 항체를 확보하는 것은 어려운 일이다.

한편, 질량분석법은 매우 복잡한 프로테옴 시료에 대한 초고속 고감도 정성 및 정량 분석에 매우 유용한 분석법으로 활용되고 있다. 특히 다중반응탐색법(mutiple reaction monitoring) 은 단백질의 가수분해로부터 생성되는 상대적으로 작은 질량을 갖는 폴리펩티드를 신속히 그리고 높은 신뢰도로 정량할 수 있는 방법을 제공하며, 특히 분석하고자 하는 단백질에 대한 항체를 확보할 수 없는 경우 특히 유용한 정량분석 방법이라고 할 수 있다(Kuhn, E. et. al., Quantification of C-reactive protein in the serum of patients with rheumatoid arthritis using multiple reaction monitoring mass spectrometry and ¹³C-labeled peptide standards. Proteomics 2004, 4(4): 1175-1186). MRM 방법은 분석하고자 하는 타겟 단백질들로부터 가수분해 등에 의하여 생성되는 펩티드에 대하여 한번 이상의 liquid chromatography에 의한 펩티드들의 분리 및 두 번의 질량선택(precursor mass selection and fragment ion selection)에 의한 분리를 통하여 매우 복잡한 시료로부터도 타겟 펩티드를 매우 선택적으로 분석할 수 있는 고감도 분석법이다(Anderson L, et al., Mol. Cell Proteomics. 2006, 5, 573-588).

혈장 단백체와 같은 검체는 구성분이 50,000개 이상이고 단백질 성분의 농도가 매우 다이나믹(1 ~ 10¹², pg/ml)하여, 고농도의 단백질들이 함께 존재하는 검체로부터 액체크로마토그래피-질량분석기(LC/MS/MS)방법으로 미량의 혈장 바이오마커 단백질을 검출 및 정량 분석하는 것은 매우 어렵다(Anderson N.L. et al., Mol. Cell Proteomics. 2002, 1, 845-867). 따라서 혈장 내 질병 바이오마커를 찾아내기 위해 검체의 복잡성(complexity)를 최소화하기 위해 혈장의 90% 이상을 차지하는 알부민(albumin), 이뮤노글로블린 G(lgG), 이뮤노글로블린 A(lgA), 트랜스페린(transferrin), 합토글로빈(haptoglobin)등을 제거하고, 남은 단백체만을 사용하여 분석을 진행하는 것이 바람직할 수 있다. 혈장내 고농도의 단백질들의 제거에 의한 시료의 복잡성의 최소화 및 LC-MRM 분석에 의한 타겟 펩티드에 대한 높은 선택성에도 불구하고, 검체내 타겟 마커단백질의 농도가 극히 낮을 경우에는 immunoaffity에 의한 마커단백질 또는 가수분해된 마커펩티드에 대한 농축과정을 수행함으로써 암마커에 대한 검출한계(LOD, Limit of Detection)와 정량한계(LOQ, Limit of Qualification)를 향상시킬 수도 있다.

이에, 본 발명자들은 암과 관련하여 당단백질에서 일어나는 특이적 당쇄화(glycosylation)에 대한 정량적 정보를 이용하여 암을 진단하는 방법을 개발하던 중, 당단백질들을 분리 및 농축한 후, 상기 당단백질을 가수분해하여 폴리펩티드를 획득한 다음, 상기 폴리펩티드를 정량분석하여 암특이적 당쇄화를 일으키는 마커 당단백질 유래의 가수분해된 마커 펩티드들을 선별할 수 있으며, 상기 마커 펩티드들을 이용하여 암을 진단할 수 있음을 밝힘으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 암 발생에 따른 특이적으로 당쇄화된 당단백질의 정량적 변화를 추적할 수 있는 특이 폴리펩타이드들을 이용하여 암을 진단하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또다른 목적은 상기 폴리펩타이드들에 특이적인 항체를 포함하는 암 진단용 키트를 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은

1) 피검체 유래 시료에 렉틴(lectin)을 처리하여 당단백질을 분리 및 농축하는 단계;

2) 단계 1)의 당단백질을 가수분해하여 폴리펩티드를 제조하는 단계;

3) 단계 2)의 폴리펩티드를 정량분석하는 단계; 및

4) 단계 3)의 정량분석 결과, 분자량이 2143.0, 1905.9, 1288.6, 1232.6 및 992.5로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나를 갖는 폴리펩티드가 존재하는 경우, 상기 피검체가 암에 걸릴 위험이 높거나 암에 걸린 개체로 판정하는 단계를 포함하는, 암 진단을 위한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은

1) 피검체 유래 시료에 렉틴(lectin)을 처리하여 당단백질을 분리 및 농축하 는 단계;

2) 단계 1)의 당단백질을 가수분해하여 폴리펩티드를 제조하는 단계;

3) 단계 2)의 폴리펩티드를 서열분석 및 정량분석하는 단계; 및

4) 단계 3)의 서열분석 및 정량분석 결과, 서열번호 1 내지 5 중 어느 하나의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드가 존재하는 경우, 상기 피검체가 암에 걸릴 위험이 높거나 암에 걸린 개체로 판정하는 단계를 포함하는, 암 진단을 위한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 서열번호 1 내지 5 중 어느 하나의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체들의 조합을 포함하는 암 진단용 키트를 제공한다.

아울러, 본 발명은 서열번호 1 내지 5 중 어느 하나의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 생물분자(biomolecule)가 고형기질에 집적된 암 진단용 바이오칩을 제공한다.

본 발명은 많은 종류의 암세포에서 과발현되는 당전이효소인 N-아세틸글루코사미닐트랜스퍼라아제에 예민하게 양적변화를 일으키는 암 특이구조의 당쇄를 갖는 마커 당단백질 아형(isoform)에 대하여 정량분석을 수행함으로써, 효과적으로 정상군과 암환자군을 구별할 수 있는 방법을 제공한다. 본 발명은 암 특이구조의 당쇄를 갖는 마커 당단백질 아형(isoform)의 양에 대한 정보를 가수분해되어 생성된 마 커 펩타이드에 대한 정량분석을 통하여 얻음으로써, 피검체의 시료로부터 암을 간단하고 신속하게 진단할 수 있으며, 이때 상기 선별된 펩타이드는 암 진단을 위한 마커로 유용하게 이용될 수 있다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 당단백질의 특이적 당쇄화(glycosylation)에 대한 정보를 이용하여 암을 진단하는 방법을 제공한다.

구체적으로, 본 발명은 단백질을 포함하는 피검체로부터 렉틴을 사용하여 암 발생과 관계있는 특이적 당쇄를 포함하는 당단백질들을 분리한 후, 이들 분리된 당단백질들을 가수분해하여 펩티드를 획득한 다음, 가수분해하여 얻은 펩티드 시료로부터 암 발생에 따른 특이적으로 당쇄화된 당단백질의 정량적 변화를 추적할 수 있는 마커 펩타이드들을 선별한 다음, 선별된 하나 이상의 펩타이드들을 마커로 이용하여 암을 진단하는 방법을 제공한다.

본 발명의 바람직한 한가지 실시태양으로는 하기와 같은 단계를 포함하는 방법으로 암을 진단하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다:

1) 피검체 유래 시료에 렉틴(lectin)을 처리하여 당단백질을 분리 및 농축하는 단계;

2) 단계 1)의 당단백질을 가수분해하여 폴리펩티드를 제조하는 단계;

3) 단계 2)의 폴리펩티드를 정량분석하는 단계; 및

4) 단계 3)의 정량분석 결과, 분자량이 2143.0, 1905.9, 1288.6, 1232.6 및 992.5로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나를 갖는 폴리펩티드가 존재하는 경우, 상기 피검체가 암에 걸릴 위험이 높거나 암에 걸린 개체로 판정하는 단계.

본 발명의 바람직한 또다른 한가지 실시태양으로는 하기와 같은 단계를 포함하는 방법으로 암을 진단하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다:

1) 피검체 유래 시료에 렉틴(lectin)을 처리하여 당단백질을 분리 및 농축하는 단계;

2) 단계 1)의 당단백질을 가수분해하여 폴리펩티드를 제조하는 단계;

3) 단계 2)의 폴리펩티드를 서열분석 및 정량분석하는 단계; 및

4) 단계 3)의 서열분석 및 정량분석 결과, 서열번호 1 내지 5 중 어느 하나의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드가 존재하는 경우, 상기 피검체가 암에 걸릴 위험이 높거나 암에 걸린 개체로 판정하는 단계.

본 발명에 있어서, 피검체는 암의 존재 및 진행 상태와 관련된 정보를 포함할 수 있는 단백질들이 존재하는 생물체로부터 얻을 수 있는 시료로서, 생체조직, 생체조직의 배양으로부터 설정된 세포주 또는 배양액, 타액, 혈액 등을 포함할 수 있다. 특히, 암에 관한 정보를 포함하는 당단백질들은 필요한 역할이 끝나면 세포 밖 배지(media)로 분비(secreted)되기도 하고 세포막으로부터 배지(media)로 떨어 져 방출(shed)되기도 하므로, 특히 다양한 암 세포주의 배양 배지(culturing media), 및 환자의 혈액 등은 이러한 암 정보를 포함하는 당단백질, 즉 암마커들을 검출하기 위한 좋은 검체가 된다. 혈액 검체의 경우는, 혈액에 존재하는 구성 성분 단백질들 사이의 농도변화가 매우 크기 때문에, 고농도 단백질 제거용 컬럼[예를 들어, MARS(Multiple Affinity Removal System)] 등을 사용하여 시료의 복잡성(complexity)를 최소화하는 전처리를 수행하는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명에 있어서, 당단백질의 암 발생과 관계있는 특이적 당쇄란, 단백질의 당쇄화가 정상과 다르게 암환자 및 암 경력자에게서 일어난 것을 의미하며, 이러한 특이적 당쇄화는 아스파라긴(asparagine), 트레오닌(threonine) 또는 세린(serine) 등의 당쇄화 자리에 연결된 당쇄에서 일어날 수 있다. 이러한 암과 관련될 수 있는 특이적 구조를 갖는 당쇄는 정상적인 구조의 당쇄들과 함께 어느 하나의 당쇄화 자리에 공유하여 당세의 미세이질성(glycan microheterogeneity)을 나타낸다. 따라서, 상기의 특이적 당쇄는 어느 하나의 당쇄화 자리에 존재하는 많은 당쇄 아형(glycan-isoform)들 중에서 단백질의 양에 대하여 비당량적으로 적은 양으로 존재하게 되며, 특이적 당쇄의 정량적 변화를 신뢰성 있게 측정하기 위해서는 이들 특이적 당쇄들을 다른 다양한 구조의 당쇄 아형(glycan-isoform)들로부터 분리 농축하는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명에 있어서, 당쇄구조에서 차이를 보이는 다양한 당쇄 아형(glycan-isoform)들로부터, 관심 있는 특이적 당쇄를 갖는 아형(isoform)만을 분리 농축하 기 위하여 렉틴을 사용할 수 있다. 이 방법은 당단백질의 당쇄구조에 대한 렉틴의 선택성을 이용하는 방법이므로 특이 당쇄구조를 갖는 마커 당단백질들에 대한 선택적인 분리, 농축이 가능하다는 장점이 있다. 분리 농축하고자 하는 당쇄의 구조에 따라, ConA, WGA, Jacalin, SNA, AAL, L-PHA, PNA, LCA, ABA, DBA, DSA, ECA, SBA, SSA, UEA, VVL, 또는 BPL 등과 같은 다양한 종류의 렉틴(lectin)을 단독으로 또는 이들의 조합으로 사용할 수 있다. 서로 다른 구조의 당쇄 아형(glycan-isoform)을 갖는 단백질들을 선택적으로 전체 피검체로부터 분리하기 위하여 다양한 종류의 렉틴을 선택하여 사용할 수 있다.

본 발명의 실시예에서는 많은 종류의 암세포에서 과발현되는 당전이 효소인 N-아세틸글루코사미닐트랜스퍼라아제(N-acetylglucosaminyltransferase)에 기인되는 특이적 당쇄화(β-1,6-GlcNAc 연결에 의한 당쇄의 곁사슬의 증가)의 변화를 추적하기 위하여 L-PHA를 사용하여 특이적 구조의 당쇄를 갖는 당쇄 아형(glyco-isoform)을 분리 및 농축하였다. 이때, L-PHA에 선택적인 당단백질들에 대한 분리과정을 통하여 L-PHA에 대하여 친화도를 보여주지 않는 많은 단백질들이 제거됨으로써, 분석시료의 복잡성(complexity)을 크게 낮출 수 있는 장점도 있다.

본 발명에 있어서, 렉틴에 의하여 분리된 고분자량 단백질들은 분석의 효율성을 높이기 위하여 보다 작은 분자량의 펩타이드 조각으로 가수 분해되는 것이 바람직하다. 당단백질들을 가수분해하여 펩티드를 얻는 과정은 다양한 가수분해 효소를 사용하는 생물학적 방법 또는 특정한 아미노산 자리에서의 가수분해를 유도할 수 있는 화학 시약을 사용하는 화학적 방법 등이 이용될 수 있다. 가수분해효소는 아르기닌 C(Arg-C), 아스파르트산 N(Asp-N), 글루탐산 C(Glu-C), 라이신 C(Lys-C), 키모트립신(chymotrypsin) 및 트립신(trypsin)으로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 사용하는 것이 바람직하고, 트립신을 사용하는 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 않는다. 가수분해의 효율 및 생성된 펩티드들에 대한 분석의 효율성을 위하여 일반적으로 알려진 변성(denaturation), 환원(reduction), 시스테인 알킬레이션(cysteine alkylation) 등과 같은 시료 전처리 과정을 가수분해반응 전에 필요에 따라 수행할 수 있다.

본 발명에 있어서, 정상군 및 환자군으로부터 얻은 각각의 가수분해된 펩티드 시료를 상대 정량적으로 분석함으로써, 암 발생에 따른 특이적으로 당쇄화된 마커 당단백질의 정량적 변화를 추적할 수 있는 타겟 펩타이드(마커 당단백질의 대리자로서의 마커 펩티드)들을 선별할 수 있다. 특히 다양한 암 세포주의 배양배지(culturing media), 및 환자의 혈액 등은 이러한 암 정보를 포함하는 당단백질, 즉 암 마커들을 검출하기 위한 좋은 검체가 된다. 이때 암은 단백질의 암 특이적 당쇄화를 유도할 수 모든 종류의 암을 포함할 수 있으며, 대장암, 간암, 위암, 폐암, 자궁암, 유방암, 전립선암, 갑상선암 및 췌장암 등을 포함할 수 있다.

본 발명의 실시예에서는 많은 종류의 암세포에서 과발현되는 당전이 효소인 N-아세틸글루코사미닐트랜스퍼라아제(N-acetylglucosaminyltransferase)에 기인되는 특이적 당쇄화에 대하여 정량적 변화를 보이는 마커 당단백질 후보를 확보한 다음, 각 후보 당단백질의 대리자로서의 후보 마커 펩티드들에 대하여 정량적 질량분석을 수행하여, 사람의 대장암 암세포에서 과발현되는 당전이효소인 N-아세틸글루 코사미닐트랜스퍼라아제(N-acetylglucosaminyltransferase)에 기인되는 암마커 펩티드들을 선정하여 검증함으로써 펩티드 마커로 암을 진단하는 방법을 완성하였다(표 1 참조).

본 발명에 있어서, 렉틴으로 농축 후 가수분해하여 얻은 펩티드 시료로부터 선별되는 마커 펩티드들은, 하나의 당단백질로부터 유래되는 하나 이상의 펩티드들로 구성될 수 있고, 또는 서로 다른 당단백질로부터 유래되는 펩티드들을 포함할 수 있다. 따라서, 선별된 마커펩티드들은 필요에 따라서 둘 이상의 펩티드들을 함께 검체분석에 사용할 수 있다.

본 발명에 있어서, 마커 펩티드들을 포함하는 가수분해된 펩티드들을 정량적으로 분석하는 방법으로는 분석하고자 하는 펩티드에 선택적인 항체를 사용하는 면역침강 또는 면역블랏팅(immuno-precipitation/-blotting) 방법과 질량분석 방법을 바탕으로 하는 분석방법들이 사용될 수 있다. 특히, 질량분석 방법은 분석하고자 하는 펩티드에 대한 항체의 확보 문제에서 자유롭기 때문에 분석할 수 있는 페티드에 있어서 제한이 거의 없으며, 초고속 및 고감도 분석능력도 질량분석 방법의 장점이 될 수 있다. 동위원소로 표지된 표지물질을 이용하여 펩티드를 표지하여 정량 분석하는 방법(iTRAQ, ICAT etc.) 또는 동위원소로 표지된 표준물질(stable isotope standard)을 시료에 내부표준물질로 첨가하여 정량 분석하는 방법(multiple reaction monitoring, MRM) 등이 사용될 수 있다. 본 발명의 실시예에서는 암세포에서 과발현되는 당전이효소인 N-아세틸글루코사미닐트랜스퍼라아제(N-acetylglucosaminyltransferase)에 기인되는 암마커 펩티드들을 정량 분석하 기 위하여 동위원소로 표지된 마커 펩티드 표준물질을 시료에 내부표준물질로 첨가한 후 MRM 질량분석을 수행하였다.

본 발명의 실시예에서는 마커 펩티드들(표 1 참조) 중에서 펩티드 질량(peptide mass)이 1232.6인 마커 펩티드를 이용하여, 많은 종류의 암세포에서 과발현되는 당전이효소인 N-아세틸글루코사미닐트랜스퍼라아제 V(N-acetylglucosaminyltransferase V, GnT-V)가 마커 당단백질의 특이적 당질화에 미치는 영향을 검증하였다(도 1 및 2 참조). 암에서와 같이 GnT-V가 과발현된 세포주의 경우(GnT-V-treated) 와 그렇지 않은 세포주의 경우(control)를 본 발명의 방법에 따라서 렉틴으로 특이적 구조의 당쇄를 갖는 당쇄 아형(glycan-isoform)을 분리하여 가수분해를 거쳐서 MRM 정량 질량분석하였다. 그 결과, 도 1에서 보는 바와 같이, GnT-V가 과발현된 시료의 경우 그렇지 않은 경우에 비하여 L-PHA에 선택적으로 높은 친화도를 보이는 특이구조의 당쇄를 갖는 당쇄 아형(glycan-isoform)의 생성이 압도적으로 증가하는 것으로 나타났다. 이러한 결과가 마커 당단백질 중에서 특이구조의 당쇄를 갖는 당쇄 아형(glycan-isoform) 생성의 증가에 기인된 것인지를 검증하기 위하여, 동일한 시료를 L-PHA 렉틴을 사용하는 분리과정 없이 가수분해하여 동일한 마커펩티드로 MRM 정량질량분석하였다. 이 경우, 렉틴을 이용한 특이구조의 당쇄를 갖는 glycan-isoform에 대한 분리과정이 없었으므로, 정량된 마커 펩티드는 GnT-V가 과발현된 경우(GnT-V-treated) 와 그렇지 않은 경우(control)의 검체 각각에 포함된 모든 종류의 당쇄 아형(glycan-isoform)을 합친 마커 당단백질 전체의 발현 양을 대변하는 것이다. 그 결과, 도 2에서 보는 바와 같이, 마커 당단백질 전체의 발현양은 GnT-V가 과발현된 경우(GnT-V-treated)와 그렇지 않은 경우(control)와의 사이에 상대적으로 큰 차이가 없는 것으로 나타났다. 즉, 본 발명의 마커 펩티드들(표 1 참조) 중에서 펩티드 질량(peptide mass)이 1232.6인 마커 펩티드가 대변하는, 마커 당단백질의 전체 발현양은 상대적으로 GnT-V의 과발현에 큰 영향을 받지 않으나(렉틴분리를 수행하지 않고 질량분석한 경우, 도 2 참조), 특이구조의 당쇄를 갖는 마커 당단백질의 당쇄 아형(glycan-isoform)의 발현양은 GnT-V의 과발현에 매우 큰 영향을 받는 것을 알 수 있다(렉틴분리를 수행하고 질량분석한 경우, 도 1 참조).

따라서, 본 발명은 많은 종류의 암세포에서 과발현되는 당전이효소인 N-아세틸글루코사미닐트랜스퍼라아제에 예민하게 양적변화를 일으키는 특이구조의 당쇄를 갖는 마커 당단백질 아형(isoform)만에 대하여 정량을 수행함으로써, 효과적으로 정상군과 암환자군을 구별할 수 있음을 알 수 있다. 피검체에 존재하는 마커 당단백질의 모든 종류의 당쇄 아형(glycan-isoform)으로부터 특이구조의 당쇄를 갖는 당쇄 아형만에 대한 선택적 분리는 적절한 렉틴의 선택을 통하여 성취될 수 있음을 알 수 있다. 또한, 특이구조의 당쇄를 갖는 마커 당단백질 아형에 대한 정량분석은 마커 당단백질 유래의 가수분해된 마커 펩티드를 정량하여 수행할 수 있는 것을 알 수 있다. 또한, 이론적으로 마커 당단백질의 가수분해 과정에서 생성되는 여러 가지의 가수분해된 펩티드들은 모두 마커펩티드로서 활용될 수 있음을 알 수 있다. 또한, 발굴된 마커 펩타이드들은 사람의 혈액으로부터 암을 진단(diagnosis), 예측(prognosis) 또는 검증(verification)할 수 있는 마커 펩타이드들로 활용될 수 있음을 알 수 있다. 아울러, 하나 이상의 마커펩티드들의 조합으로 정량분석을 수행하면 보다 신뢰도 높은 정량결과를 얻을 수 있음을 알 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 마커 펩티드들로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 마커 펩타이드에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는, 암 진단용 키트를 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 마커 펩티드는 서열번호 1 내지 5 중 어느 하나의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

본 발명에 있어서, 상기 마커 펩티드는 분자량이 2143.0, 1905.9, 1288.6, 1232.6 및 992.5로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나를 갖는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

본 발명에 있어서, 상기 암은 대장암, 간암, 위암, 폐암, 자궁암, 유방암, 전립선암, 갑상선암 및 췌장암으로 구성된 군으로부터 선택되는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

본 발명에 있어서, 상기 키트는 피검체의 시료로부터 가수분해효소 처리 결과 생성된 마커펩티드에 대한 정량적 변화를 검출함으로써, 피검체가 암에 걸린지를 구별하여 암을 모니터링, 진단 또는 스크리닝하는 것을 가능하게 한다.

본 발명에 있어서, 상기 마커 펩타이드들, 또는 이들 각각의 동위원소로 표지된 펩타이드들은 표준물질로 상기 키트에 추가로 포함될 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 키트에 사용될 수 있는 항체는 다클론 항체, 단클론 항체 및 에피토프와 결합할 수 있는 단편 등을 포함한다. 상기 다클론 항체는 상기 펩타이드 마커 중 어느 하나를 동물에 주사하고 해당 동물로부터 채혈하여 항체를 포함하는 혈청을 수득하는 종래의 방법에 의해 생산할 수 있다. 이러한 다클론 항체는 당업계에 알려진 어떠한 방법에 의해서든 정제될 수 있고, 염소, 토끼, 양, 원숭이, 말, 돼지, 소, 개 등의 임의의 동물 종 숙주로부터 만들어질 수 있다. 상기 단클론 항체는 연속 세포주의 배양을 통한 항체 분자의 생성을 제공하는 어떠한 기술을 사용하여도 제조할 수 있다. 이러한 기술로는 이들로 한정되는 것은 아니지만 하이브리도마 기술, 사람 B-세포 하이브리도마 기술 및 EBV-하이브리도마 기술이 포함된다(Kohler G et al., Nature 256:495-497, 1975; Kozbor D et al., J Immunol Methods 81:31-42, 1985; Cote RJ et al., Proc Natl Acad Sci 80:2026-2030, 1983; 및 Cole SP et al., Mol Cell Biol 62:109-120, 1984). 또한, 상기 펩타이드 마커 중 어느 하나에 대한 특정 결합 부위를 함유한 항체 단편이 제조될 수 있다(Huse WD et al., Science 254: 1275-1281, 1989). 상기와 같이 특정 서열을 갖는 펩타이드에 대한 항체를 제조하는 방법은 당업자에게 자명한 일이다.

본 발명에 있어서, 상기 키트에 사용될 수 있는 항체는 세척이나 복합체의 분리 등 그 이후의 단계를 용이하게 하기 위해 고형기질(solid substrate)에 결합될 수 있다. 상기 고형기질은 예를 들어 합성수지, 니트로셀룰로오스, 유리기판, 금속기판, 유리섬유, 미세구체 및 미세비드 등이 사용될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 상기 합성수지에는 폴리에스터, 폴리염화비닐, 폴리스티렌, 폴리프로필렌, PVDF 및 나일론 등이 사용될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명에 있어서, 상기 키트는 피검체로부터 수득된 시료를 고형 기질에 결합된 상기 펩타이드 마커 중 어느 하나에 특이적으로 결합할 수 있는 항체와 접촉시키는 경우, 시료는 항체와 접촉 전에 알맞은 정도로 희석될 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 키트는 피검체로부터 수득된 시료를 고형 기질에 결합된 상기 펩타이드 마커 중 어느 하나에 특이적으로 결합할 수 있는 항체와 접촉시킨 후, 추가적으로 항체에 결합되지 않은 단백질 등은 세척하여 제거하고 마커 펩티드를 검출할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 키트는 추가적으로 상기 펩타이드 마커에 특이적으로 결합하는 검출용 항체를 포함할 수 있다. 상기 검출용 항체는 발색효소, 형광물질, 방사성 동위원소 또는 콜로이드 등의 검출체로 표지한 접합체(conjugate)일 수 있고, 상기 마커에 특이적으로 결합할 수 있는 2차 항체인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다. 상기 발색효소는 퍼록시다제(peroxidase), 알칼라인 포스파타제(alkaline phosphatase) 또는 산성 포스파타제(acid phosphatase)(예: 양고추냉이 퍼록시다제(horseradish peroxidase))일 수 있으나 이에 한정되지 않는다. 상기 형광물질은 플루오레신카복실산(FCA), 플루오레신 이소티오시아네이트(FITC), 플루오레신 티오우레아(FTH), 7-아세톡시쿠마린-3-일, 플루오레신-5-일, 플루오레신-6-일, 2',7'-디클로로플루오레신-5-일, 2',7'-디클로로플루오레신-6-일, 디하이드로테트라메틸로사민-4-일, 테트라메틸로다민-5-일, 테트라메틸로다민-6-일, 4,4-디플루오로-5,7-디메틸-4-보라-3a,4a-디아자-s-인다센-3-에틸 또는 4,4-디플루오로-5,7-디페닐-4-보라-3a,4a-디아자-s-인다센-3-에틸일 수 있으나 이에 한정되지 않 는다.

본 발명에 있어서, 상기 키트는 추가적으로 효소와 발색 반응할 기질 및 결합되지 않은 단백질 등은 제거하고 결합된 펩타이드 마커만을 보유할 수 있는 세척액 또는 용리액을 추가로 포함할 수 있다.

아울러, 본 발명은 마커 펩티드들로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 마커 펩타이드에 특이적으로 결합하는 생물분자(biomolecule)가 고형기질에 집적된, 암 진단용 바이오칩을 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 마커 펩티드는 서열번호 1 내지 5 중 어느 하나의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

본 발명에 있어서, 상기 마커 펩티드는 분자량이 2143.0, 1905.9, 1288.6, 1232.6 및 992.5로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나를 갖는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

본 발명에 있어서, 상기 암은 대장암, 간암, 위암, 폐암, 자궁암, 유방암, 전립선암, 갑상선암 및 췌장암으로 구성된 군으로부터 선택되는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

본 발명에 있어서, 상기 바이오칩은 피검체의 시료로부터 가수분해효소 처리 후, 얻은 마커 펩티드들의 정량적 변화를 검출함으로써, 피검체가 암에 걸린지를 구별하여 암을 모니터링, 진단 및 스크리닝하는 것을 가능하게 한다.

본 발명에 있어서, 상기 생물분자는 항체 또는 앱타머(Aptamer)인 것이 바람 직하나 이에 한정되지 않는다. 상기 생물분자는 1차 대사물질, 2차 대사물질 및 천연 물질 등의 작은 분자뿐만 아니라 단백질, 다당류 및 핵산과 같은 거대 중합 분자를 포함하는 살아있는 유기체에 의해 생산되는 유기 분자를 의미한다. 상기 앱타머는 특이적 표적 분자에 결합하는 올리뉴클레오티드 또는 펩타이드를 의미한다.

본 발명에 있어서, 상기 고형기질은 플라스틱, 유리, 금속 및 실리콘으로 구성된 군으로부터 선택되는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

이하, 본 발명의 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시 예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 시료의 제조

암세포에서 과발현되는 당전이효소인 N-아세틸글루코사미닐트랜스퍼라아제 V(N-acetylglucosaminyltransferase; GnT-V)를 과발현시키기 위하여, MGAT5 유전자로 인간 대장암 세포(human colon cancer cells)를 형질감염(transfection)시켜서 안정적인 형질감염성 세포(stable tansfectant cells)를 설립하였다. 그런 다음, GnT-V가 과발현된 세포주(GnT-V-treated)와 그렇지 않은 세포주(control)를 각각 배양하여 그 배양액을 같은 양을 취하여 각각 2 ml가 될 때까지 농축하였다. 농축 된 검체는 14 mM 베타-멀캅토에탄올(β-mercaptoethanol)로 환원한 후 탈염(desalting)시켰다. 상기 탈염된 단백질 1 mg을 L-PHA-아비딘 아가로즈 비드(L-PHA-avidin-agarose beads)에 가하고 인산완충용액(phosphate-buffered saline; PBS)을 넣은 다음, 4℃에서 12시간 동안 방치하였다. 렉틴과 결합된 단백질을 PBS 완충용액을 사용하여 3차례 세척한 후, 6 M 우레아(urea)를 사용하여 렉틴에 결합되었던 단백질을 떼어내었다. 획득한 단백질을 50 mM 탄화수소 암모늄(ammonium bicarbonate)을 사용하여 10배 묽힌 다음, 10 ug 트립신을 사용하여 1 mM CaCl₂, 37℃, 밤새(overnight) 가수분해시켰다. 상기 가수분해된 펩티드는 감압 건조시킨 후, 100 ul의 물로 취하였다. 렉틴 분리를 수행하지 않은 시료는 각각의 농축세포 배양액을 환원 및 탈염하여 얻은 상기의 단백질 각각 100 ug을 상기의 가수분해 조건에서 가수분해하여 획득하였다. 상기 가수분해된 펩티드는 감압 건조시킨 후, 100 ul의 물로 취하였다.

<실시예 2> 펩타이드 분석을 통한 마커 후보들의 선별

상기 <실시예 1>의 시료 제조과정에서 제조된 시료들을 분석하기 위하여, HPLC(high-performance liquid chromatography)를 사용(trap column, C18, 5 um, 300 X 5 mm과 analytical column, C18, 5 um, 75 um X 10 cm)하고, 이를 바로 전자 스프레이 이온화(electrospray ionization; ESI) 질량분석기인 LTQ-FT mass spectrometer(Thermo Finnigan)에 연결하여 LC/ESI-MS/MS를 수행하였다. 각각의 시료 단백체를 트립신 가수분해하여 준비된 펩타이드 시료 일부를 10배 희석하여 질량분석기가 연결된 액체크로마토그래피에 10 ㎕씩 주입하여 분석을 수행하였다.

질량분석 결과를 바탕으로 MASCOT, SEQUEST 등의 검색엔진을 통하여 GnT-V가 과발현된 세포주(GnT-V-treated) 및 그렇지 않은 세포주(control)의 검체로부터 다수의 단백질을 정성하였고, 각 단백질에 대한 정성 분석된 빈도로부터 각 검체에 존재하는 각각의 단백질의 상대적 존재량을 추측하였다. LC/ESI-MS/MS 분석으로부터 얻은 펩티드 및 이들의 분석 빈도 등으로부터 유의한 단백질들을 검색하고, 검색된 단백질들의 당질화 여부 및 암 관련 가능성 등을 NCBInr DB를 비롯한 단백질 데이타베이스(protein database), 관련 논문 및 문헌 조사 등을 통하여 확인하는 과정을 거침으로써, 암 관련 가능성이 있을 수 있다고 믿어지는 후보 당단백질들을 선별하였다. 선별된 후보 당단백질들은 각 단백질 유래의 가수분해된 펩티드를 대리자로 하고 이들에 대한 다중 반응 모니터링 질량 분석기(multiple reaction monitoring mass spectrometry; MRM MS) 방법에 의한 정량분석을 통하여, 선별된 당단백질이 암마커로서 활용될 수 있는지를 검증하였다.

본 발명자들은 암마커로서 유의하다고 판단되는 당단백질(분자량: 20.7k, Theoretical pI: 8.47)로부터 가수분해에 의하여 생성되는 마커 펩티드들(표 1) 중에서, 1232.6의 펩티드 질량을 갖는 마커 펩티드에 대하여 MRM MS 방법을 이용하여 마커로서의 타당성을 검증하였다.

상기 표 1에 포함되어 있는 마커 펩티드들은 하나의 동일한 당단백질로부터 가수분해에 의하여 생성되므로 이론적으로 표 1의 모든 펩티드들이 질량분석에 있어서 당단백질의 대리자로서 사용될 수 있다.

<실시예 3> 질량분석을 이용한 마커 당단백질의 검증

검체로부터 준비된 각각의 시료 단백체를 트립신 가수분해하여 얻은 펩티드 시료 물질 50 fmol씩을 가하고 전체 부피를 50 ul가 되도록 맞춤으로써, 각 검체에 대하여 렉틴 분리를 수행한 것과 하지 않은 것 한 쌍씩 총 4가지 시료를 준비하였다. 표적 펩티드의 동위원소로 표지된 표준물질은 표적 펩티드(마커 펩티드)와 아미노산 서열은 완전히 같지만 펩티드의 질량수에서만 차이를 보이는 합성 표준물질로서 MRM MS를 이용한 정량분석에서 내부 표준물질로 사용하였다. 또한 정량질량분석에 있어서, 표적 펩티드 및 합성 표준물질의 농도의 변화에 따른 검량선은 동일한 분석조건 하에서 미리 작성하였다.

각각 준비된 시료(각 50 ul) 중에서 일부분(10 ul)을 사용하여 LC/MRM MS를 수행하였다. 상기 MRM MS 방법으로 마커 펩티드(펩티드 질량, 1232.6)를 3회 반복하여 정량한 결과, 하기 표 2와 같이 나타내었다.

	시료	av.(fmol)	RSD(%)
렉틴 분리한 경우	대조군	0.31	12.9
	GnT-V treated	3.90	8.4
렉틴 분리하지 않은 경우	대조군	28.75	9.3
	GnT-V treated	47.46	2.0

각 시료마다 3회 반복 수행된 정량분석 결과는 표 2에서 보는 바와 같이, 매우 만족스러운 상대 표준편차를 보여주었다. 이는 본 발명의 마커 펩티드에 대한 정량방법이 매우 안정적이며, 따라서 마커 펩티드에 대한 신뢰도가 높은 것을 알 수 있었다. 또한, 수백 아토몰(attomol) 수준에서도 마커 펩티드는 작은 표준편차를 가지고 정량될 정도로 좋은 분석감도(sensitivity)를 보여주었다. 특히, 렉틴 분리를 수행하여 얻은 두 시료(GnT-V가 과발현된 경우와 그렇지 않은 경우) 사이에 있어서 마커 펩티드의 검출양의 차이는 약 12.5배에 달하며(도 1), 이는 렉틴분리를 수행하지 않고 분석한 경우와 크게 대비 되었다(도 2). 이러한 결과는 렉틴을 사용하여 발굴 및 검증된 마커펩티드(펩티드 질량, 1232.6)가 GnT-V가 과발현되는 암에 대하여 매우 높은 특이성(specificity)을 보여주고 있음을 의미하는 것이다. 또한, 본 발명의 마커 당단백질에 대한 신뢰도는 상기 표 1에 열거된 하나 이상의 마커 펩티드들을 조합하여 함께 정량질량 분석에 사용하므로써 더욱 높일 수 있음을 알 수 있다.

본 발명은 새로운 암마커를 발굴, 검증하는 방법 및 마커펩티드를 이용하여 암을 진단하는 방법을 제공한다.

도 1은 암세포에서 GnT-V가 과발현된 경우(GnT-V treated)와 그렇지 않은 경우(control) 각각을 렉틴 분리를 수행하여 암 특이 구조의 당쇄를 갖는 마커 당단백질을 마커 펩티드 대리자를 이용하여 정량분석한 경우로서, GnT-V가 과발현된 경우가 그렇지 않은 경우에 비하여 암 특이 구조를 갖는 마커 당단백질이 매우 많이(약 12.5배) 발현됨을 보여줌으로써 높은 특이성(specificity)을 나타냄을 보여주는 그림이다.

도 2는 암세포에서 GnT-V가 과발현된 경우(GnT-V treated)와 그렇지 않은 경우(control) 각각의 검체에 대하여 렉틴 분리를 수행하지 않고, 발현된 전체 마커 당단백질에 대하여 마커펩티드 대리자를 이용하여 정량분석한 경우로서, 렉틴을 수행하여 분석한 경우에 비하여 낮은 특이성(specificity)을 나타냄을 보여주는 그림이다.

<110> KOREA BASIC SCIENCE INSTITUTE <120> Polypeptide markers for the diagnosis of cancers and methods for the diagnosis using the same <130> 9p-11-43 <160> 5 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 19 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Leu Gln Ser Gly Thr His Cys Leu Trp Thr Asp Gln Leu Leu Gln Gly 1 5 10 15 Ser Glu Lys <210> 2 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Phe Val Tyr Thr Pro Ala Met Glu Ser Val Cys Gly Tyr Phe His Arg 1 5 10 15 <210> 3 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Glu Pro Gly Leu Cys Thr Trp Gln Ser Leu Arg 1 5 10 <210> 4 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Gly Phe Gln Ala Leu Gly Asp Ala Ala Asp Ile Arg 1 5 10 <210> 5 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Ser Glu Glu Phe Leu Ile Ala Gly Lys 1 5

Claims (16)

1) 피검체 유래 시료에 렉틴(lectin)을 처리하여 당단백질을 분리 및 농축하는 단계;

2) 단계 1)의 당단백질을 가수분해하여 폴리펩티드를 제조하는 단계;

3) 단계 2)의 폴리펩티드를 서열분석 및 정량분석하는 단계; 및

4) 단계 3)의 서열분석 및 정량분석 결과, 서열번호 1 내지 5 중 어느 하나의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 검출하는 단계를 포함하는, 대장암 진단을 위한 정보를 제공하기 위해 폴리펩티드의 서열 및 정량 분석 방법.

제 1항에 있어서, 단계 4)에서 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드의 분자량은 2143.0이고;

서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드의 분자량은 1905.9이며;

서열번호 3의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드의 분자량은 1288.6이고;

서열번호 4의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드의 분자량은 1232.6이며; 및

서열번호 5의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드의 분자량은 992.5인 것을 특징으로 하는 폴리펩티드의 서열 및 정량 분석 방법.

제 1항에 있어서, 단계 1)의 시료는 세포, 세포배양액, 혈액, 혈청 및 혈장으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 방법.

제 1항에 있어서, 단계 1)의 렉틴은 ConA, WGA, Jacalin, SNA, AAL, L-PHA, PNA, LCA, ABA, DBA, DSA, ECA, SBA, SSA, UEA, VVL 및 BPL로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 또는 둘 이상의 조합인 것을 특징으로 하는 방법.

제 4항에 있어서, 상기 렉틴은 L-PHA(leukoagglutinating phytohemagglutinin)인 것을 특징으로 하는 방법.

제 1항에 있어서, 단계 2)의 가수분해는 아르기닌 C(Arg-C), 아스파르트산 N(Asp-N), 글루탐산 C(Glu-C), 라이신 C(Lys-C), 키모트립신(chymotrypsin) 및 트립신(trypsin)으로 구성되는 군으로부터 선택되는 효소를 사용하는 것을 특징으로 하는 방법.

제 6항에 있어서, 상기 가수분해는 트립신을 사용하는 것을 특징으로 하는 방법.

제 1항에 있어서, 상기 단계 3)의 정량분석은 액체크로마토그래피-질량 분석(lquid chromatography-Mass Spectrometry, LC-MS)을 이용하여 분석하는 것을 특징으로 하는 방법.

제 1항에 있어서, 단계 3)의 정량분석 전에 단계 2)의 펩티드에 대한 항체를 사용하여 농축하는 단계를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.

삭제

서열번호 1 내지 5 중 어느 하나의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체들의 조합을 포함하는 대장암 진단용 키트.

제 11항에 있어서, 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드의 분자량은 2143.0이고;

서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드의 분자량은 1905.9이며;

서열번호 3의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드의 분자량은 1288.6이고;

서열번호 4의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드의 분자량은 1232.6이며; 및

서열번호 5의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드의 분자량은 992.5인 것을 특징으로 하는 키트.

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서열번호 1 내지 5 중 어느 하나의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 생물분자(biomolecule)가 고형기질에 집적된 대장암 진단용 바이오칩.

제 14항에 있어서, 상기 생물분자는 항체 또는 앱타머(Aptamer)인 것을 특징으로 하는 바이오칩.

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