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KR101070078B1 - 아밀로이드 베타1-6 항원 어레이를 포함하는 백신 조성물 - Google Patents

아밀로이드 베타1-6 항원 어레이를 포함하는 백신 조성물 Download PDF

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KR101070078B1
KR101070078B1 KR1020057000932A KR20057000932A KR101070078B1 KR 101070078 B1 KR101070078 B1 KR 101070078B1 KR 1020057000932 A KR1020057000932 A KR 1020057000932A KR 20057000932 A KR20057000932 A KR 20057000932A KR 101070078 B1 KR101070078 B1 KR 101070078B1
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라이너 뤼왼트
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노파르티스 파르마 아게
사이토스 바이오테크놀로지 아게
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Abstract

본 발명은 분자생물학, 바이러스학, 면역학 및 의학 분야에 관한 것이다. 본 발명은 질서화된 반복성 항원 또는 항원성 결정인자 어레이를 포함하는 조성물 및 특히 Aβ1-6 펩티드-VLP-조성물을 제공한다. 더 구체적으로는, 본 발명은 바이러스-유사 입자 및 이에 결합된 하나 이상의 Aβ1-6 펩티드를 포함하는 조성물을 제공한다. 본 발명은 접합물 (conjugate) 및 질서화된 반복성 어레이를 제조하는 방법도 각각 제공한다. 본 발명의 조성물은 알츠하이머병의 치료용 백신의 제조에 유용하며 알츠하이머병을 예방하거나 치유하고 면역 반응, 그 중에서도 항체 반응을 효율적으로 유도하는 파맥신 (pharmaccine)으로서 유용하다. 또한 본 발명의 조성물은 특히 지시된 맥락 내에서 자기 특이적 면역 반응을 효율적으로 유도하는 데 특히 유용하다.
알츠하이머병, 파맥신, 면역반응, 백신, 예방접종

Description

아밀로이드 베타1-6 항원 어레이를 포함하는 백신 조성물 {Vaccine Compositions Containing Amyloid Beta1-6 Antigen Arrays}
본 발명은 분자생물학, 바이러스학, 면역학 및 의학 분야에 관한 것이다. 본 발명은 질서화된 반복성 항원 또는 항원성 결정인자 어레이를 포함하는 조성물 및 특히 Aβ1-6 펩티드-VLP-조성물을 제공한다. 더 구체적으로는, 본 발명은 바이러스-유사 입자 및 이에 결합된 하나 이상의 Aβ1-6 펩티드를 포함하는 조성물을 제공한다. 본 발명은 접합물 (conjugate) 및 질서화된 반복성 어레이를 제조하는 방법도 각각 제공한다. 본 발명의 조성물은 알츠하이머병의 치료용 백신의 제조에 유용하며 알츠하이머병을 예방하거나 치유하고 면역 반응, 그 중에서도 항체 반응을 효율적으로 유도하는 파맥신 (pharmaccine)으로서 유용하다. 또한 본 발명의 조성물은 특히 지시된 맥락 내에서 자기 특이적 면역 반응을 효율적으로 유도하는 데 특히 유용하다.
알츠하이머병 (AD)은 노인들 (65세 이상) 사이에서 가장 흔한 치매의 원인이며, 공중 보건에 심각한 부담이다. 예컨대 4백만명이 미국에서 이 병을 앓고 있는 것으로 보고되어 있다. 이 병의 발병율은 사람들이 나이가 들수록 증가하는 것으로 생각된다.
알츠하이머병의 주요한 병리적 징후는 연령과 관련된 행동 변화, 신경염 플라크 또는 AD 플라크로 불리는 불용성 플라크 내로의 β-아밀로이드의 침착, 뉴런 내의 타우(tau) 단백질로 구성된 신경섬유매듭, 및 전뇌 전체에서 뉴런의 손실이다. 노년 (65세 이상)에 발생하는 후기발병 AD 이외에도 35 세와 60 세 사이에 발병하는 조기발병 AD, 가족 AD (FAD)가 있다. AD의 이 병리적 이상들은 후기발병 또는 산발성 AD에서보다도 FAD에게서 더 광범위하고 심각하며 조기에 발생한다. APP 유전자, 프레세닐린 1 및 프레세닐린 2 유전자의 돌연변이가 FAD와 연관되어 있다.
지적한 바와 같이, 알츠하이머병 (AD)의 주요한 현상 중 하나는 불용성 섬유 덩어리로서 아밀로이드가 침착되어(아밀로이드생성증) 그 결과 대뇌 혈관벽 주변에 세포외 신경염 플라크 및 침착물이 생기는 것이다 (리뷰를 위해서는 Selkoe, D.J. (1999) Nature. 399, A23-31 참조). 이들 침착물은 글리코사미노글리칸 및 아포지방단백질과 같은 다른 단백질도 포함하긴 하지만 신경염 플라크 및 콩고친화성 (congophilic) 혈관병의 주요한 성분은 아밀로이드 β(Aβ)이다. Aβ는 아밀로이드 전구 단백질 (APP)로 알려진 더 큰 당단백질로부터 단백질분해에 의하여 절단된 것이며, 하나의 소수성 막횡단 (transmembrane) 영역이 있는 695-770 아미노산의 이소형을 포함한다. Aβ는 상당한 아미노- 및 카르복시-말단 이종성 (말단절단)뿐만 아니라 변형을 보이는 길이가 최대 아미노산 43개인 일군의 펩티드를 형성한다 (Roher, A. E., Palmer, K. C., Chau, V., ＆ Ball, M. J. (1988) J. Cell Biol. 107, 2703-2716. Roher, A. E., Palmer, K. C., Yurewicz, E. C., Ball, M. J., ＆ Greenberg, B. D. (1993) J. Neurochem. 61, 1916-1926). 두드러진 이소형은 Aβ1-40 및 1-42이다. 이는, 원섬유로 응집하는 β-시트를 형성하는 성향이 커서, 결국에는 아밀로이드를 낳는다.
Aβ펩티드는 알츠하이머병의 신경병리학에서 중요한 역할을 한다. Aβ펩티드의 영역 특이적, 세포외 축적은 미세신경아교증 (microgliosis), 세포골격 변화, 이상 신경증 및 시냅스 손상에 수반된다. 이들 병리적 변화는 이 병을 규정하는 인지 저하에 연관된 것으로 생각된다.
알츠하이머병의 치료를 위하여, 아무런 면역보강제 없이 그리고 아밀로이드 베타 단백질 또는 Aβ1-28의 담체로의 아무런 결합이 없는 채로 아밀로이드 베타 단백질 또는 특히 Aβ1-28을 1회 투여시 최대 10-2 mg의 양으로 투여하는 것이 EP 526'511에 기재되어 있다.
다른 이들은 Aβ1-42에 대한 세포성 또는 체액성 면역반응을 유도하기 위하여 면역보강제와 함께 Aβ펩티드를 투여하는 것을 사용한 바 있다. 알츠하이머병의 트랜스제닉 마우스 모델에서는 동물들이 돌연변이 APP(717)V-F를 포함하는 인간 아밀로이드 전구체 단백질을 과발현하며 (PDAPP-마우스, Johnson-Wood, K. et al., Proc. Natl. Acad. USA 94:1550-1555, Games, D. et al., Nature 373:523-527 (1995a)), Aβ1-42 발병 플라크의 과생성, 이상 신경염, 연접전종말의 손실, 별아교세포 결핍증 및 미세신경아교증을 초래한다. 최근 연구에서 문헌 (Schenk, D. et al., Nature 400:173-77 (1999)) 및 WO 99/27944에 따르면, 6주령의 PDAPP-마우 스에게 처음 4회 면역화에서, 인간에게 사용할 수 없는 강력한 면역보강제 (CFA/IFA)와 혼합한 응집된 Aβ1-42를 투여한 후 후속 면역화에서 PBS 중의 응집된 Aβ1-42를 투여하면 본질적으로 플라크 형성 및 이에 수반되는 이상 신경염이 예방되었다. 동일 필자가 보고한 바로는, 같은 전략을 사용하여 늙은 마우스 (11월령)를 면역화하면 알츠하이머병 (AD)-유사 신경병리의 정도 및 진행이 현저히 감소되었다. 상기한 전략을 사용하여 면역화된 마우스에게서 지라세포의 증식이 WO 99/27944의 실시예 III (확립된 AD에 대한 치료효능 검사)에 보고되었는데, 이는 예방접종 과정에 의하여 Aβ1-42 특이적 T 세포가 유도되었음을 보여준다. Aβ 단편의 양 항-마우스 IgG로의 커플링, 및 면역보강제 CFA/IFA의 존재하에서의 이 커플링된 단편의 면역화가 WO 99/27944에 보고되어 있다. 디프테리아 독소와 같은 폴리펩티드에 연결된 Aβ 단편을 포함하는 조성물의 Aβ에 대한 면역반응을 촉진하기 위한 용도도 WO 99/27944에 공개되어 있다. 그러나 면역화의 데이터는 제공되어 있지 않다.
Aβ의 N-말단 (1-16) 내의 에피토프를 인식하는 모노클로날 항체 (항체 6C6)가 원섬유 β-아밀로이드의 신경독성으로부터 PC12 세포를 보호하며 시험관내에서 β-아밀로이드를 붕해하는 것으로 밝혀졌다 (Solomon B. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1997)). Aβ1-28에 대해 유발된 모노클로날 항체도 시험관내에서 β-아밀로이드 응집을 억제하는 것으로 밝혀졌다 (Solomon B. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1996)). 문헌 (Frenkel et al., J. Neuroimmunol. 88:85-90 (1998))은 이후에 두 항-응집 항체 10D5 및 6C6의 에피토프가 에피토프 "EFRH" 즉, Aβ3-6인 것으로 밝혀냈다. 이와 반대로 Aβ1-7에 대해 특이적인 항체는 β-아밀로이드 응집을 방지하지 못하였다 (Frenkel D. et al., J. Neuroimmunol. 95:136-142 (1999)).
Aβ1-42는 원섬유형성성이며 실제로, WO 99/27944에 기재된 백신 조성물에는 응집물을 형성할 수 있는 방식으로 처리된 Aβ1-42가 사용되었다. 이들 원섬유는 신경세포 배양물에 대해 독성이 있음과(Yankner et al., Science 245:417-420 (1989)) 동물 뇌에 주입되었을 때도 독성 효과가 관찰됨이 밝혀졌다 (Sigurdson et al., Neurobiol. Aging 17: 893-901 (1996), Sigurdson et al., Neurobiol. Aging 18: 591-608 (1997)). 문헌 (Walsh et al., Nature 416: 535-539 (2002))의 보고에 따르면, 천연 Aβ 올리고머가 세포내 비지클 내에서 형성된다. 이들 올리고머는 래트 생체내에서 장기 상승작용을 억제하였으며 사람 뇌 및 뇌척수액에서 발견되는 농도에서 시냅스 가소성을 파괴하였다.
다른 연구에서 문헌 (Bard, F. et al., Nature Medicine 6:916-19 (2000))의 보고에 따르면, Aβ1-42에 대해 유발된 항체를 말초 투여하면 그다지 많지 않은 혈청 농도일지라도 아밀로이드 양을 감소시킬 수 있었다. 이 연구에는 Aβ1-42에 대해 유발된 폴리클로날 항체 또는 Aβ의 여러 영역들로부터 유도된 합성 단편에 대해 유발된 모노클로날 항체가 사용되었다. 따라서 Aβ 펩티드에 대한 항체의 유도는 알츠하이머병의 강력한 치료로서의 전망을 내포한다.
β-아밀로이드 펩티드 및 Aβ1-40과 같은, β-아밀로이드 플라크에 수반되는 항원을 점막 투여하는 것이 WO 99/27949에 기재되어 있다. 점막 투여는 알츠하이머병에 수반되는 특정한 사이토킨 반응을 억제하며 이 병에 연결된 염증반응의 억제에 수반되는 특정한 다른 사이토킨 반응을 향상시킨다고 한다. 염증반응의 억제는 "항-염증 사이토킨 프로필에 의하여 특징화되는 T-세포 유도"에 의하여 수행되는 것으로 생각된다. WO 99/27949에 기재된 바와 같은 적합한 항원으로는 인간 및 동물 숙주의 면역 T-세포에 의하여 인식되는, AD에 대해 특이적인 항원이 있다.
Aβ를 인식하는 모노클로날 항체의 에피토프를 필라멘트 파아지의 코트 단백질에 융합하는 것이 WO 01/18169에 기재되어 있다. 코트 단백질 VIII 상에 15-머 에피토프 VHEPHEFRHVALNPV (서열 89)를 드러낸 필라멘트 파아지로 마우스를 면역화하면 Aβ1-16 및 Aβ1-40을 인식하는 항체가 생겼다. 이는 Aβ 펩티드를 사용하는 억제 ELISA에서 증명되었으며 Aβ1-16으로의 혈청의 결합을 Aβ1-40을 써서 억제하는 경우에 IC50이 1 μM인 것으로 발견되었다. 그러나 솔로몬 (Solomon)(WO 01/18169)은 VHEPHEFRHVALNPV 에피토프 (서열 89)를 보유한 필라멘트 파아지에 대해 유발된 혈청은 아밀로이드 플라크 또는 AD의 신경염 플라크에 결합한다는 징후는 전혀 제공하지 않는다.
면역화를 위하여 면역반응이 유도되어야 할 항원과 상이한 서열을 사용하는 데에는 많은 문제점이 있다. 우선, 항원 또는 항원성 결정인자에 이질적인 (foreign) 서열의 일부에 대한 항체가 유도될 수 있다. 둘째, 전장 (full-length) 항원의 상황에서보다는 이 이질적인 (foreign) 인접 (flanking) 서열 요소의 상황 에서 항원의 구조가 달라질 수 있다. 따라서 이 항원에 대 교차반응반응 하는 항체가 유발되더라도 항원에 대한 이들의 결합은 최적화되지 못할 수 있다. 전장 Aβ 상에 존재하는 잔기와는 다른 부가적인 측쇄가 에피토프에 존재하기 때문에 이들 유발된 항체의 미세한 특이성도 항원 그 자체에 대해 유발된 항체의 특이성과 일치할 수 없다. 결국, 15-머 아미노산 서열은 T-세포 에피토프를 포함할 수 있다. 필라멘트 파아지 코트의 단백질 III 상의 에피토프 YYEFRH (서열 90)의 표시도 (각 파아지 마다 통상 3-5 카피만이 존재함) WO 01/18169에 공개되어 있다. 면역화를 위한 담체로서 감염성 파아지를 사용할 때 여러 가지 문제가 발생한다. 첫째, 감염성 작용제를 대규모 면역화 캠페인에 충분한 양으로 대규모 생산하는 것이 문제다. 둘째, 백신 중에 항생제 내성 유전자를 포함하는 파아지의 DNA가 존재하는 것도 미심쩍으며 안정성 문제이다. 마지막으로, 비감염성 파아지가 백신으로서 사용되는 경우 다량의 파아지의 조사(照射)의 용이성이나 효능이 해결되지 않았다.
Aβ가 T 헬퍼 에피토프를 포함하도록 변형된 Aβ 유사체가 규명되어 있다 (WO 01/62284). 인간 APP에 대해 형질전환된 TgRND8+ 마우스를 그 Aβ로 면역화하면 면역보강제가 없이 Aβ1-42로 면역화하는 것에 비하여 4 내지 7.5 배 높은 항체 역가를 가져온다.
최근 연구에 의하면, 뇌 아밀로이드 침착의 백신-유도 감소는 인지 기능을 향상시킬 가능성을 가짐이 입증되었다 (Schenk, D., et al., Nature 400:173-177 (1999), Janus, C. et al., Nature 408: 979-982 (2000), Morgan, D. et al., Nature 408: 982-985 (2000)).
면역보강제 QS21 중의 응집된 Aβ1-42로 면역화된 환자의 생검 결과, T-림프구 수막뇌염의 존재 및 대식세포에 의한 대뇌 백색질의 침윤이 드러났다 (Nicoll, J. A. et al., Nature Med. 9:448-452 (2003)).
최근, 응집된 Aβ1-42와 면역보강제인 QS21로 구성된 백신인 AN1792로 면역화된 환자들에게서 18 수막뇌염 케이스가 한 문헌에 의하여 보고되었다 (Orgogozo J.-M. et al., Neurology 61:46-54 (2003)). T-세포 활성화는 이 질병을 초래하는 잠재적 기전으로 보고된 반면, 혈청 중의 항-Aβ1-42 역가와 질병 간의 분명한 관계는 없었다.
정제된 단백질을 단독으로 투여하는 것은 강력한 면역반응을 유발하는 데에 통상 충분하지 않은 것으로 정평이 나 있으므로, 단리된 항원은 일반적으로 면역보강제로 불리는 보조 물질과 함께 제공되어야 한다. 이들 면역보강제 내에서는 투여되는 항원이 신속히 분해되지 않도록 보호되며 면역보강제는 낮은 농도의 항원을 오랫동안 방출한다. 본 발명에서는 Aβ 펩티드가 VLP에 결합하여 면역원성이 되며 면역보강제를 필요로 하지 않는다.
따라서 예방접종의 효율을 개선하는 한 가지 방법은 적용되는 항원의 반복성의 정도를 증가시키는 것이다. 단리된 단백질과 달리 바이러스는 T-세포 도움이 있든 없든 아무런 면역보강제 없이도 즉각적이고 효율적인 면역반응을 유도한다 (Bachmann and Zinkernagel, Ann. Rev. Immunol:15:235-270 (1991)). 바이러스는 종종 몇 종 안되는 단백질로 이루어지지만 그들의 단리된 구성성분들보다는 훨씬 강력한 면역반응을 촉발할 수 있다. B-세포 반응의 경우 바이러스의 면역원성에 있어서 결정적인 한 요인은 표면 에피토프의 반복성 및 순서라고 알려져 있다. 많은 바이러스가 B 세포 상에서 에피토프 특이적 면역글로불린을 효율적으로 가교결합하는 규칙적인 에피토프 배열을 드러낸 준결정성 표면을 나타낸다 (Bachman and Zinkernagel, Immunol. Today 17:553-558 (1996)). B 세포 상의 표면 면역글로불린의 이러한 가교결합은 IgM 항체의 생산 및 세포주기 진행을 직접 유도하는 강력한 활성화 신호이다. 또한 이러한 촉발된 B 세포는 T 헬퍼 세포를 활성화시킬 수 있으며 이는 다시 B 세포 내에서 IgM에서 IgG 항체 생산으로의 전환 및 모든 예방접종의 목적인 장기지속 (long-lived) B 세포 메모리의 생성을 유도한다 (Bachmann and Zinkernagel, Ann. Rev. Immunol. 15:235-270 (1997)). 바이러스 구조는 자기면역 질환에서 항-항체의 생성 및 병원체에 대한 자연적 반응의 일부로서 연결되어 있다 (Fehr, T., et al., J. Exp. Med. 185:1785-1792 (1997)). 따라서 고도로 조직된 바이러스 표면에 의하여 제시된 항체는 강력한 항-항체 반응을 유도할 수 있다.
그러나 지적한 바와 같이, 면역계는 통상 자기-유래 (self-derived) 구조에 대한 항체를 생성하지 못한다. 낮은 농도로 존재하는 가용성 항원의 경우 이는 Th 세포 농도에 대한 관용성 때문이다. 이런 조건하에서는 T 헬프를 운반할 수 있는 담체에 자기-항원을 커플링시켜 관용성을 깰 수 있다. 높은 농도로 존재하는 가용성 단백질이나 낮은 농도로 존재하는 막 단백질의 경우 B 및 Th 세포는 관용적일 수 있다. 그러나 B 세포 관용성은 가역적 (무력증)일 수 있으며 외래 담체에 커플링된 고도로 조직된 방식으로 항원의 투여에 의하여 파괴될 수 있다 (Bachmann and Zinkernagel, Ann. Rev. Immunol. 15:235-270 (1997)). 2002년 1월 18일에 출원되고 현재 계류중인 미국 출원 제10/050,902에서 보인 바와 같이, 강력한 면역반응은 VLP에 결합된 Aβ 펩티드 (Aβ1-15, Aβ1-27 및 마우스의 자기-항원인 Aβ33-42)를 포함하는 조성물을 써서 유도할 수 있다. 특히, RNA 파아지 Qβ의 VLP에 결합된 상기한 인간 Aβ 펩티드는 인간 APP 트랜스제닉 마우스에서 높은 Aβ 특이적 역가를 유도하는데 (실시예에 기재됨), 이는 자기-항원 Aβ에 대한 관용성이 VLP에 결합된 Aβ 펩티드로 면역화함으로써 극복될 수 있음을 보여준다.
따라서 특히, 부작용을 유발할지도 모를 T-세포 에피토프 및 면역보강제 없이 면역원을 사용하면서도 아밀로이드 플라크에 결합할 수 있는 항체의 높은 항체 역가를 유도할 수 있는, 알츠하이머병을 치료하기 위한 안전한 고면역원성 조성물 및 백신이 필요하다.
발명의 간략한 요약
본 발명자들은 본 발명에 이르러, 구조가 고유의 반복성 조직을 갖는 코어 입자에 결합함으로써 특히 바이러스-유사 입자 (VLP) 및 VLP의 서브유닛 각각에 결합하여 고도로 질서화된 반복성 접합물을 초래하는 Aβ1-6 펩티드가 Aβ1-6에 대해 특이적인 항체의 유도를 위한 강력한 면역원을 대표함을 발견하였다. 따라서 본 발명은 질서화된 반복성 Aβ1-6-코어 입자 어레이, 및 특히 VLP-Aβ1-6 펩티드 접합물 및 -어레이를 각기 기재로 하는 알츠하이머병의 치료용 예방 및 치료 수단을 제공한다. 이 예방제 및 치료제는 인간 APP 트랜스제닉 마우스 모델의 인간 아밀로이드 플라크 및 AD 아밀로이드 플라크에 결합할 수 있으며 가용성 Aβ에 가교결 합하는 항-Aβ1-6 펩티드 항체의 높은 역가를 유도할 수 있다. 또한 유발된 항체는 뇌 절편 상의 APP에 결합하지 않는다.
더욱이, 본 발명은 AD의 치료 방법, 신규 조성물 및 백신을 제공한다. Aβ1-6 펩티드를 포함하는 조성물 및 백신은 T-세포 에피토프가 없으며, AD 플라크 및 가용성 Aβ에 결합하는 항체를 유도한다. Aβ1-6 펩티드는 코어 입자, 바람직하게는 VLP, 더 바람직하게는 RNA 파아지의 VLP에 Aβ 펩티드가 결합함으로써 고도의 반복성 질서화된 방식으로 환자의 면역계로 제공된다.
바람직한 실시양태에서는 항원 또는 항원성 결정인자가 Aβ (DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA, 서열 91)의 단편인 인간 아밀로이드 베타 펩티드 Aβ1-6 (DAEFRH: 서열 75)이며, 여기서 인간 아밀로이드 베타 펩티드 Aβ1-6은 각기 코어 입자 및 VLP에 결합된다. 이 아밀로이드 베타 단백질은 서열 92에 제공된다. 아밀로이드 베타 전구체 단백질은 서열 93에 제공된다.
따라서 본 발명은 (a) 제1 부착 부위가 하나 이상 있는 코어 입자, 및 (b) 제2 부착 부위가 하나 이상 있는 항원 또는 항원성 결정인자 하나 이상을 포함하되, 상기 항원 또는 항원성 결정인자가 Aβ1-6 펩티드이고, 상기 제2 부착 부위가 (i) 상기 항원 또는 항원성 결정인자에게서 자연발생하지 않는 부착 부위 및 (ⅱ) 상기 항원 또는 항원성 결정인자에게서 자연발생하는 부착 부위로 이루어진 군에서 선택된 것이며, 상기 제2 부착 부위가 상기 제1 부착 부위에 회합할 수 있고, 이 회합을 통해 상기 Aβ1-6 펩티드와 상기 코어 입자가 상호작용하여 질서화된 반복성 항원 어레이를 형성하는 조성물을 제공한다. 본 발명에 사용하기에 적합한 코 어 입자의 바람직한 실시양태는 바이러스, 바이러스-유사 입자, 박테리오파아지, RNA-파아지의 바이러스-유사 입자, 박테리아 섬모 또는 편모, 또는 본 발명에 따라 질서화된 반복성 항원 어레이를 형성할 수 있는 고유의 반복성 구조를 갖는 모든 다른 코어 입자이다.
본 발명의 Aβ단편은 가용성이며 일반적으로 응집물을 형성하지 않는다. 더욱이 이들은 코어 입자 및 VLP 각각에 결합하며, 바람직하게는 공유결합에 의하여 결합한다. 따라서 본 발명의 조성물은 아밀로이드 침착의 씨앗을 뿌리는 것(seeding)과 같은 독성 효과를 유도할 위험을 내포하지 않는다.
가용성 Aβ및 AD 아밀로이드 플라크와 교차반응하는 항체의 높은 역가가 코어 입자 및 VLP 각각에 결합된 Aβ1-6을 포함하는 조성물을 써서 얻어질 수 있음이 본 발명에 의해 뜻밖에 발견되었다. 특히 VLP는 자기 항원에 대하여 항체의 유도를 매개하기 때문에 자기-관용성을 파괴하는 것으로 밝혀져 있다 (WO 02/056905, 이 공개내용은 언급함으로써 그 전체가 본원에 도입됨). 또한, 이 에피토프의 작은 크기로 인해 T-세포 에피토프가 존재하지 못하므로 Aβ특이적 T-세포 반응을 유도하지 않는 새로운 조성물을 제공한다. 또한 유발된 항체는 뇌 절편 상에서 APP에 결합하지 않는다. 따라서 본 발명은 AD의 예방 및 치료를 위한 안전한 백신 조성물을 제공한다.
더 구체적으로는, 본 발명은 질서화된 반복성 항원 또는 항원성 결정인자 어레이를 포함하는 조성물, 및 이로써 특히 Aβ1-6 펩티드 VLP 접합물을 제공한다. 더 구체적으로는, 본 발명은 바이러스-유사 입자 및 여기에 결합된 하나 이상의 A β1-6 펩티드를 포함하는 조성물을 제공한다. 본 발명은 또한, 이 접합물 및 질서화된 반복성 어레이를 각기 제조하는 방법도 제공한다. 본 발명의 조성물은 알츠하이머병의 치료용 백신의 제조에 있어서, 그리고 알츠하이머병의 예방 또는 치료 및 면역반응을 효율적으로 유도하는 파맥신으로서 유용하다. 또한 본 발명의 조성물은 지적된 맥락 내에서 자기-특이적 면역반응을 효율적으로 유도하는 데에 특히 유용하다.
본 발명에서 Aβ1-6 펩티드는 코어 입자 및 VLP 각각에, 전형적으로는 배향적 방식으로 결합하여 질서화된 반복성 Aβ1-6 펩티드 항원 어레이를 생성한다. 또한, 코어 입자 및 VLP 각각의 고도로 반복적인 조직된 구조가 Aβ펩티드의 진열을 고도로 질서화된 반복성 방식으로 매개하여 고도로 조직된 반복성 항원 어레이를 낳는다. 또한 Aβ1-6 펩티드의 코어 입자 및 VLP 각각으로의 결합은 T 헬퍼 세포 에피토프를 제공하는데, 코어 입자 및 VLP가 코어 입자-Aβ1-6 펩티드 어레이 및 VLP-Aβ1-6 펩티드 어레이 각각으로 면역화된 숙주에서 이질적이기 때문이다. 이들 어레이는 종래 기술의 접합물과는 특히 이들의 고도로 조직된 구조, 치수 및 어레이 표면 상의 항원의 반복성에 있어서 상이하다.
본 발명의 한 측면에서 Aβ1-6 펩티드는 화학적으로 합성되는 반면, 코어 입자 및 VLP는 각기, 코어 입자 및 VLP 각각의 폴딩 및 조립에 적합한 발현 숙주로부터 발현되고 정제된다. 그 다음 Aβ1-6 펩티드를 코어 입자 및 VLP 각각에 결합시켜 Aβ1-6 펩티드 어레이를 조립한다.
다른 측면에서, 본 발명은 (a) 바이러스-유사 입자 및 (b) 하나 이상의 항원 또는 항원성 결정인자를 포함하되, 여기서 상기 항원 또는 항원성 결정인자가 Aβ1-6 펩티드이며 상기 항원 또는 항원성 결정인자가 상기 바이러스-유사 입자에 결합된 조성물을 제공한다.
다른 측면에서, 본 발명은 (a) 본 발명의 조성물 및 (b) 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물을 제공한다.
또다른 측면에서 본 발명은 (a) 바이러스-유사 입자 및 (b) 하나 이상의 항원 또는 항원성 결정인자를 포함하되, 상기 항원 또는 항원성 결정인자가 Aβ1-6 펩티드이고 상기 하나 이상의 항원 또는 항원성 결정인자가 상기 바이러스-유사 입자인 조성물을 포함하는 백신 조성물을 제공한다.
다른 측면에서 본 발명은 본 발명의 조성물, 본 발명의 제약 조성물, 또는 본 발명의 백신을 동물에 투여하는 것을 포함하는 면역화 방법을 제공한다.
또다른 측면에서 본 발명은 (a) 바이러스-유사 입자를 제공하고, (b) 하나 이상의 항원 또는 항원성 결정인자를 제공하되, 상기 항원 또는 항원성 결정인자가 Aβ1-6 펩티드이고, (c) 상기 항원 또는 항원성 결정인자가 상기 바이러스-유사 입자에 결합하도록 상기 바이러스-유사 입자와 하나 이상의 항원 또는 항원성 결정인자를 결합시키는 것을 포함하는 본 발명의 조성물의 제조 방법을 제공한다.
이와 유사하게 본 발명은 (a) 제1 부착 부위가 하나 이상 있는 코어 입자를 제공하고, (b) 제2 부착 부위가 하나 이상 있는 항원 또는 항원성 결정인자를 하나 이상 제공하되, 상기 항원 또는 항원성 결정인자가 Aβ1-6 펩티드이고, 상기 제2 부착 부위가 (i) 상기 항원 또는 항원성 결정인자에게서 자연발생하지 않는 부착 부위 및 (ⅱ) 상기 항원 또는 항원성 결정인자에게서 자연발생하는 부착 부위로 이루어진 군에서 선택된 것이며, 상기 제2 부착 부위가 상기 제1 부착 부위에 회합할 수 있고, (c) 상기 회합을 통해 상기 항원 또는 항원성 결정인자와 상기 코어 입자가 상호작용하여 질서화된 반복성 항원 어레이를 형성하도록 상기 코어 입자와 상기 하나 이상의 항원 또는 항원성 결정인자를 결합시키는 것을 포함하는, 청구범위 제1항의 조성물의 제조 방법을 제공한다.
또다른 측면에서 본 발명은 알츠하이머병의 치료용 의약의 제조를 위한 청구범위 제1항의 조성물의 용도를 제공한다.
또다른 측면에서 본 발명은 알츠하이머병의 치료 또는 예방적 치료용 의약의 제조를 위한 청구범위 제1항의 조성물의 용도를 제공한다. 또한 또다른 측면에서 본 발명은 알츠하이머병의 치료 또는 예방 및(또는) 포유동물 면역계의 자극을 위한 조성물, 제약 조성물, 백신, 약물 또는 의약의 제조에 있어서, 다른 작용제와 함께 또는 분리하여 또는 면역보강제와 같은 특정한 물질이 명백히 없이, 청구범위 제1항의 조성물의 용도를 제공한다.
따라서 본 발명은 특히, 알츠하이머병 또는 이와 관련된 상태를 예방하고(거나) 약화시키는 데에 적합한 백신 조성물을 제공한다. 또한 본 발명은 인간에게서 알츠하이머병 또는 이와 관련된 상태를 예방하고(거나) 약화시키기 위한 면역화 및 면역접종 방법을 각기 제공한다. 본 발명의 조성물은 예방적으로 및 치료적으로 사용될 수 있다.
구체적인 실시양태에서, 본 발명은 "자기" 유전자 생성물, 즉 여기에 사용된 "자기 항원"에 의하여 유발되거나 악화된 알츠하이머병 또는 이와 관련된 상태를 예방하고(거나) 약화시키는 방법을 제공한다. 관련된 실시양태에서 본 발명은 동물 및 개인에게서 각기 면역반응을 유도하여, "자기" 유전자 생성물에 의하여 유발되거나 악화된 알츠하이머병 또는 이와 관련된 상태를 예방하고(거나) 약화시키는 항체의 생성을 유도하는 방법을 제공한다.
당분야의 숙련자에 의하여 이해되는 바와 같이, 본 발명의 조성물을 동물 또는 인간에게 투여하는 경우 이들은 염, 완충제, 면역보강제, 또는 조성물의 효능을 개선하는 데에 필요한 다른 물질을 함유하는 조성물 중에 포함될 수 있다. 제약 조성물을 제조하는 데에 사용하기에 적합한 물질의 예는 문헌 (Remington's Pharmaceutical Sciences (Osol, A, ed., Mack Publishing Co. (1990))을 비롯한 많은 자료에 제공되어 있다.
본 발명의 조성물은 이들의 투여를 복용자 개인이 관용할 수 있다면 "약리적으로 허용"된다고 한다. 또한 본 발명의 조성물들은 "치료상 유효량" (즉, 원하는 생리적 효과를 생성하는 양)으로 투여될 것이다.
본 발명의 조성물은 당분야에 공지된 여러 방법으로 투여될 수 있으나, 보통은, 주사, 주입, 흡입, 경구 투여 또는 다른 적합한 생리적 방법에 의하여 투여될 것이다. 이 조성물은 이와 달리 근육내, 정맥내 또는 피하 투여될 수도 있다. 투여를 위한 조성물의 성분들은 멸균 수성 (즉, 생리적 염수) 또는 비수성 용액 및 현탁액을 포함한다. 비수성 용매의 예로는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브유와 같은 식물성 기름, 및 에틸 올레에이트와 같은 주사가능한 유기 에스테 르이다. 담체 또는 밀봉드레싱을 사용하여 피부 투과성을 증가시켜 항원 흡수를 향상시킬 수 있다.
본 발명의 다른 실시양태는 당분야에 공지된 것, 다음의 도면 및 본 발명의 설명, 및 청구범위를 고려할 때 숙련자에게 분명해 질 것이다.
도 1은 환원성 상태하에서 시행된 SDS-PAGE 겔을 도시하며, 이는 Aβ1-6 펩티드 (NH2-DAEFRHGGC-CONH2)(서열 77)의 Qβ 코트 단백질의 VLP로의 커플링 결과를 보여준다.
도 2는 Qβ 코트 단백질의 VLP에 커플링된 Aβ1-6 펩티드로 면역화된 마우스의 혈청 중 Aβ1-6에 대해 특이적인 항체의 ELISA 분석을 보여준다.
도 3은 Qβ 코트 단백질의 VLP에 커플링된 Aβ1-6 펩티드로 면역화된 마우스의 혈청 중의 Aβ1-40에 대해 특이적인 항체의 ELISA 분석을 보여준다.
도 4는 Qβ 코트 단백질의 VLP에 커플링된 Aβ1-6 펩티드로 면역화된 마우스의 혈청으로 염색된 APP23 마우스의 뇌 절편 (A) 및 AD 환자로부터 얻은 내후각뇌피질(entorhinal cortex) 절편 (B)를 보여준다.
도 5의 A 내지 E는 Qβ 코트 단백질의 VLP에 커플링된 Aβ1-6 펩티드로 면역화된 마우스의 혈청으로 또는 인간 또는 마우스 APP의 C-말단에 대해 특이적인 폴리클로날 래트 항혈청으로 염색된 APP23 마우스의 뇌 절편들을 보여준다.
도 6은 ELISA 분석에서 측정된 Qβ VLP에 커플링된 인간 Aβ1-6으로 붉은털원숭이를 면역화한 결과를 보여준다.
도 7은 인간 AD 및 트랜스제닉 마우스 플라크 상에서 조직학에 의하여 측정된, Qβ VLP에 결합된 인간 Aβ1-6으로 면역화한 원숭이로부터 얻은 혈청의 플라크에 대한 결합의 결과를 보여준다.
도 8은 쥐의 Aβ1-6의 AP205VLP로의 커플링의 SDS-PAGE 분석을 도시한다.
도 9는 ELISA 분석에서 측정된, AP205로 커플링된 쥐 Aβ1-6으로 마우스를 면역화한 결과를 보여준다.
도 10은 9.5 내지 19월령의 QβhAβ1-6으로 면역화된 "스웨덴/런던" 트랜스제닉 마우스의 혈청 중의 항-Aβ40 및 항-Aβ42 역가의 ELISA 분석을 보여준다.
도 11은 QβhAβ1-6 또는 PBS로 면역화한 "스웨덴/런던" 트랜스제닉 마우스의 뇌 절편의 면역조직학적 염색을 보여준다.
도 12는 9.5 내지 19월령의 QβhAβ1-6 또는 PBS로 면역화된 "스웨덴/런던" 트랜스제닉 마우스에게서의 플라크 침착의 정량화를 보여준다.
도 13은 13.5 내지 19월령의 QβhAβ1-6 또는 PBS로 면역화된 "스웨덴/런던" 트랜스제닉 마우스에게서의 플라크 침착의 정량화를 보여준다.
도 14는 QβhAβ1-6으로 면역화된 "스웨덴" 트랜스제닉 마우스의 혈청 중의 항-Aβ40 및 항-Aβ42 역가의 ELISA 분석을 보여준다.
도 15는 QβhAβ1-6 또는 PBS로 면역화된 "스웨덴" 트랜스제닉 마우스에게서 얻은 뇌 절편의 면역조직학적 염색을 보여준다.
도 16은 QβhAβ1-6 또는 PBS로 면역화된 "스웨덴" 트랜스제닉 마우스에게서의 플라크 침착의 정량화를 보여준다.
달리 정의되지 않는다면, 여기에 사용된 모든 기술, 과학 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 숙련자에 의해 통상 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 여기에 기재된 것들과 유사하거나 동등한 모든 방법 및 재료이 본 발명의 실시나 시험에 사용될 수 있지만 바람직한 방법 및 재료가 이하에서 설명된다.
1. 정의:
Aβ1-6 펩티드: 여기에 사용된 Aβ1-6 펩티드는 서열이 인간 Aβ1-6 서열에 상응하거나 인간 Aβ1-6 서열과 상동성이 있는 펩티드를 가리킨다. 인간 Aβ1-6 서열과 상동성이 있는 서열로는 다른 종의 Aβ1-6이 있으나 이것으로 한정되지는 않으며, 이로써, 영장류, 토끼, 기니아 피그, 제노푸스 래비스 (Xenopus laevis), 개구리, 마우스 및 래트 Aβ1-6의 서열이 있으나 이에 한정되지는 않는다. 제노푸스 래비스 또는 개구리의 Aβ1-6 서열은 두 위치에서 인간 Aβ1-6과 다르기는 하지만 보존적 돌연변이 (Ala-Ser, Phe-Tyr)를 가지며, 여전히 이 정의에 따라 Aβ1-6에 상동성 있는 것으로 여겨진다. 그러나, 본 발명에 따르면 Aβ1-6 펩티드는 제2 부착 부위가 거기에 부착되도록 변형되는 것이 전형적이다. 바람직하게는, 제2 부착 부위는 코어 입자 및 VLP에 각각 결합하기 위한 제2 부착 부위를 포함하는 링커 또는 아미노산 링커를 써서 변형된다. 여기서 Aβ1-6 펩티드를 언급할 때, 상기 지적된 바와 같이 변형된 Aβ1-6 펩티드, 즉 제1 부착 부위가 부착된 Aβ1-6 펩티드도 포괄하는 것이다. 그러나 전형적으로는 명세서에서 그 변형들이 명시적으로 언급된다. Aβ1-6 펩티드의 더 바람직한 실시양태는 본 발명에 따른 항원 또는 항 원성 결정인자임이 이 명세서 끝으로 갈수록 분명해 진다.
면역보강제: 여기에 사용된 "면역보강제"란 용어는 본 발명의 백신 및 제약 조성물 각각과 함께 합해졌을 때 훨씬 더 향상된 면역반응을 제공할 수 있는, 숙주에서 축적부위 (depot)의 생성을 가능하게 하는 면역반응 또는 면역물질의 비특이적 자극인자를 의미한다. 각 종 면역보강제가 사용될 수 있다. 예로는 완전 및 불완전 프로인드 면역보강제, 수산화알루미늄 및 변형된 무라밀디펩티드가 있다. 추가의 면역보강제는 수산화알루미늄과 같은 무기 겔, 리소레시틴과 같은 표면활성 물질, 플루로닉 폴리올, 폴리음이온, 펩티드, 오일 에멀젼, 키홀 림펫 헤모시아닌, 디니트로페놀, 및 BCG (bacille Calmette-Guerin) 및 코리네박테리움 파르붐 (Corynebacterium parvum)과 같은 잠재적으로 유용한 인간 면역보강제이다. 이러한 면역보강제도 당분야에 잘 알려져 있다. 본 발명의 조성물과 함께 투여될 수 있는 추가의 면역보강제로는 모노포스포릴 리피드 면역조절인자, AdjuVax 100a, QS21, QS-18, CRL1005, 알루미늄염 (Alum), MF-59, OM-174, OM-197, OM-294 및 바이로좀 (Virosomal) 면역보강제 기술이 있으나 이것으로 제한되지는 않는다. 면역보강제은 이들 물질의 혼합물을 포함할 수도 있다.
남아메리카 나무 퀼라자 사포나리아 몰리나 (Quillaja Saponaria Molina)의 껍질에서 유래된, 면역보강제 활성이 있는 면역활동 사포닌 분획물이 당분야에 알려져 있다. 예를 들어 QS21 (QA21로도 알려짐)은 퀼라자 사포나리아 몰리나 나무로부터 얻은 HPLC 정제 분획이며, 그 생산 방법은 미국 특허 제5,057,540호에 (QA21로서) 공개되어 있다. 퀼라자 사포닌은 또한 문헌 (Scott et al., Int. Archs. Allergy Appl. Immun., 1985, 77, 409)에서 면역보강제로 공개된 바 있다. 모노포스포릴 리피드 A 및 그 유도체가 당분야에 알려져 있다. 바람직한 유도체는 3 데-O-아실화 모노포스포릴 리피드 A이며, 영국 특허 제2220211호에서부터 알려졌다. 추가의 바람직한 면역보강제는 WO 00/00462에 기재되어 있으며, 이 공개 내용은 언급함으로써 여기에 도입된다.
그러나 본 발명의 유리한 특징은 본 발명의 조성물의 고면역원성이다. 이미 본 명세서에서 설명한 바와 같이 또는 이 명세서의 끝으로 갈수록 분명해지는 바와 같이 면역보강제 없는 백신 및 제약 조성물이 추가의 다른 또는 바람직한 실시양태에서 제공되며, 결국 면역보강제가 부작용을 일으킬 수 있기 때문에 면역보강제가 없어 안정성 프로필이 더 우수한 AD 치료용 백신 및 제약 조성물이 얻어진다. 여기서 AD 치료용 백신 및 제약 조성물과 관련하여 "없는"이란 용어는 면역보강제가 없이 사용되는 백신 및 제약 조성물을 가리킨다.
아미노산 링커: 이 명세서에서 "아미노산 링커" 또는 단지 "링커"라는 것은 여기에 사용된 바와 같이, 항원 또는 항원성 결정인자를 제2 부착 부위와 결합하거나 또는 더 바람직하게는 제2 부착 부위 (필수적으로는 아니나 통상 1 개의 아미노산, 바람직하게는 시스테인 잔기임)를 이미 포함하거나 또는 함유하는 것이다. 그러나 여기에 사용된 용어 "아미노산 링커"는, 아미노산 잔기로 이루어진 아미노산 링커가 본 발명의 바람직한 실시양태이기는 하지만 그러한 아미노산 링커가 아미노산 잔기만으로 이루어진 것을 내포하는 것은 아니다. 아미노산 링커의 아미노산 잔기는 바람직하게는 자연발생 아미노산 또는 당분야에 공지된 비자연적 아미노산 으로 구성되며, 모두 L이거나 모두 D이거나 이들의 혼합물이다. 그러나 술프히드릴 기 또는 시스테인 잔기가 있는 분자를 포함하는 아미노산 링커도 본 발명에 포함된다. 이러한 분자는 C1-C6 알킬-, 시클로알킬 (C5, C6), 아릴 또는 헤테로아릴 부분을 포함하는 것이 바람직하다. 그러나 아미노산 링커이외에, 바람직하게는 C1-C6 알킬-, 시클로알킬- (C5,C6), 아릴- 또는 헤테로아릴- 부분을 포함하고 아무런 아미노산도 없는 링커 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 항원 또는 항원성 결정인자 또는 임의로는 제2 부착 부위와 아미노산 링커간의 회합은 바람직하게는 하나 이상의 공유결합을 통하여, 더 바람직하게는 하나 이상의 펩티드 결합을 통한 것이다.
동물: 여기에 사용된 바와 같이 용어 "동물"은 예를 들면 인간, 양, 고라니, 사슴, 물레 사슴 (Mule deer), 밍크, 포유동물, 원숭이, 말, 암소, 돼지, 염소, 개, 고앙이, 래트, 마우스, 새, 닭, 파충류, 어류, 곤충류 및 거미류를 포괄하는 의미이다.
항체: 여기에 사용된 바와 같이 용어 "항체"는 에피토프 또는 항원성 결정인자에 결합할 수 있는 분자를 의미한다. 이 용어는 전체 항체 및 단쇄 항체를 비롯한 전체 항체의 항원-결합 단편을 포괄하는 의미이다. 가장 바람직하게는 항체는 인간 항원 결합 항체 단편이며, Fab, Fab' 및 F(ab')2, Fd, 단쇄 Fv (scFv), 단쇄 항체, 이황화결합 Fv (sdFv) 및 VL 또는 VH 도메인을 포함하는 단편이 있으나 이것에 한정되지는 않는다. 이들 항체는 새 및 포유동물을 비롯한 모든 동물 기원으로 부터 유래될 수 있다. 바람직하게는 항체는 인간, 쥐, 토끼, 염소, 기니아 피그, 낙타, 말 또는 닭의 것이다. 여기에 사용된 바와 같이, "인간" 항체에는 인간 면역글로불린의 아미노산 서열을 갖는 항체가 포함되며, 미국 특허 제5,939,598호 (Kucherlapati et al.) 등에 기재된 바와 같이, 인간 면역글로불린 라이브러리로부터 단리된 항체 또는 내인성 면역글로불린을 발현하지 않으며 하나 이상의 인간 면역글로불린에 대해 형질전환된 동물로부터 단리된 항체가 포함된다.
항원: 여기에 사용된 바와 같이, 용어 "항원"은 항체, 또는 MHC 분자가 제시된다면 T 세포 수용체 (TCR)가 결합할 수 있는 분자를 의미한다. 용어 "항원"은 여기에 사용된 바와 같이 T-세포 에피토프를 포괄한다. 항원은 추가로 면역계에 의하여 인식될 수 있고(거나) 체액성 면역반응 및(또는) B- 및(또는) T-림프구의 활성화를 유도하는 세포성 면역반응을 유도할 수 있다. 그러나 이는 적어도 일정한 경우에는 항원이 Th 세포 에피토프를 포함하거나 Th 세포 에피토프에 연결되고 면역보강제 중에 제공될 것을 필요로 할 수 있다. 항원은 하나 이상의 에피토프 (B- 및 T-에피토프)를 가질 수 있다. 상기에 언급된 특이적 반응은 바람직하게는 항원이 전형적으로는 고도로 선택적 방식으로 그에 상응하는 항체 또는 TCR과 반응하고 다른 항원에 의하여 유발될 수 있는 다른 항체나 TCR의 많은 양과 반응하지 않을 것임을 지시하는 의미이다. 여기에 사용된 항원은 여러 개별적 항원들의 혼합물일 수도 있다.
항원성 결정인자: 여기에 사용된 바와 같이, 용어 "항원성 결정인자"는 B- 또는 T-림프구에 의하여 특이적으로 인식되는 항원의 그 부분을 지칭하는 의미이 다. 항원성 결정인자에 응답하는 B-림프구는 항체를 생성하는 반면, T-림프구는 세포성 및(또는) 체액성 면역성의 조정에 있어서 결정적인 이펙터 기능의 증식 및 확립을 통하여 항원성 결정인자에 응답한다.
회합: 여기에 사용된 바와 같이, 용어 "회합"은 이것이 제1 및 제2 부착 부위에 대해 적용될 때, 그 제1 및 제2 부착 부위가 바람직하게는 적어도 하나의 비-펩티드 결합을 통하여 결합하는 것을 가리킨다. 이 회합의 성질은 공유, 이온, 소수성, 극성 또는 이들의 조합일 수 있으며, 바람직하게는 이 회합의 성질은 공유결합이다.
제1 부착 부위: 여기에 사용된 바와 같이, "제1 부착 부위"란 문구는 항원 또는 항원성 결정인자 상에 위치한 제2 부착 부위가 회합할 수 있는, 비자연 또는 자연적 기원의 요소를 가리킨다. 제1 부착 부위는 단백질, 폴리펩티드, 아미노산, 펩티드, 당, 폴리뉴클레오티드, 천연 또는 합성 폴리머, 2차 대사산질 또는 화합물 (바이오틴, 플루오레세인, 레티놀, 디곡시게닌, 금속 이온, 페닐메틸술포닐플루오라이드), 또는 이들의 조합, 또는 이들의 화학적 작용성 기일 수 있다. 제1 부착 부위는, 바람직하게는 바이러스-유사 입자와 같은 코어 입자의 표면 상에 위치하는 것이 전형적이고 바람직하다. 다수의 제1 부착 부위가 코어 입자 및 바이러스-유사 입자 각각의 표면에, 전형적으로는 반복적 배열로 존재한다.
제2 부착 부위: 여기에 사용된 바와 같이 제2 부착 부위는 코어 입자 및 바이러스-유사 입자 각각의 표면 상에 위치한 제1 부착 부위가 회합할 수 있는 항원 또는 항원성 결정인자에 수반되는 요소를 가리킨다. 항원 또는 항원성 결정인자의 제2 부착 부위는 단백질, 폴리펩티드, 펩티드, 당, 폴리뉴클레오티드, 천연 또는 합성 폴리머, 2차 대사산물 (바이오틴, 플루오레세인, 레티놀, 디곡시게닌, 금속 이온, 페닐메틸술포닐플루오라이드), 또는 이들의 조합, 또는 이들의 화학적 반응성 기일 수 있다. 하나 이상의 제2 부착 부위가 항원 또는 항원성 결정인자 상에 존재한다. 그러므로, 용어 "제2 부착 부위가 하나 이상 있는 항원 또는 항원성 결정인자"란 하나 이상의 항원 또는 항원성 결정인자 및 제2 부착 부위를 포함하는 항원 또는 항원성 구조물을 가리킨다. 그러나, 특히 비천연 기원, 즉 항원 또는 항원성 결정인자 내에서 자연발생하지 않는 제2 부착 부위의 경우, 이들 항원 또는 항원성 구조물은 "아미노산 링커"를 포함한다.
결합된 (bound): 여기서 사용된 바와 같이, "결합된"이란 용어는 화학적 커플링과 같은 공유결합, 또는 이온 상호작용, 소수성 상호작용, 수소결합 등과 같은 비공유결합일 수 있는 결합 또는 부착을 가리킨다. 공유결합은 예를 들면, 에스테르, 에테르, 포스포에스테르, 아미드, 펩티드, 이미드, 탄소-황 결합, 탄소-인 결합 등일 수 있다. 용어 "결합된"이란 "커플링된", "융합된 (fused)" 및 "부착된 (attached)"와 같은 용어들보다 넓은 의미며 이들을 포함한다.
코트 단백질(들): 여기에 사용된 바와 같이, 용어 "코트 단백질(들)"은 박테리오파아지 또는 RNA-파아지의 캡시드 조립물 내에 혼입될 수 있는 박테리오파아지 또는 RNA 파아지의 단백질을 가리킨다. 그러나 RNA-파아지의 코트 단백질 유전자의 특이적 유전자 생성물을 가리킬 때에 용어 "CP"가 사용된다. 예를 들면, RNA-파아지 Qβ의 코트 단백질 유전자의 특이적 유전자 생성물은 "Qβ CP" 뿐만 아니라 A1 단백질을 포함한다. 박테리오파아지 Qβ의 캡시드는 Qβ CP로 주로 구성되며 적은 함량의 A1 단백질이 포함된다. 마찬가지로 VLP Qβ 코트 단백질은 주로 Qβ CP를 포함하며, 소량의 A1 단백질이 포함된다.
코어 입자: 여기에 사용된 바와 같이, 용어 "코어 입자"는 고유의 반복성 조직을 갖는 견고한 구조를 가리킨다. 여기에 사용된 코어 입자는 생체 과정의 산물이거나 합성 과정의 산물일 수 있다.
커플링된: 여기에 사용된 용어 "커플링된"이란 공유결합 또는 강력한 비공유 상호작용을 통한 부착, 전형적이고 바람직하게는 공유결합에 의한 부착을 가리킨다. 당분자의 숙련자들이 생체활성 물질의 커플링에 통상 사용하는 모든 방법을 본 발명에서 사용할 수 있다.
유효량: 여기에 사용된 바와 같이, 용어 "유효량"이란 원하는 생체 효과를 실현하기에 충분하거나 필요한 양을 가리킨다. 조성물의 유효량은 이 선택된 결과를 달성하는 양이며 이러한 양은 당분야의 숙련자에 의하여 관행적으로 결정될 수 있다. 예를 들면, 면역계 결핍을 치료하기 위한 유효량은 면역계를 활성화시켜서 항원에 노출되었을 때 항원 특이적 면역반응의 발생을 가져오는 데 필요한 양일 수 있다. 이 용어는 또한 "충분량"과 동의어이다.
어떤 특정한 응용을 위한 유효량은 치료될 질병이나 상태, 투여되는 특정한 조성물, 환자의 체격, 및(또는) 질병 또는 상태의 증세와 같은 요인들에 따라 달라질 수 있다. 당분야의 숙련자라면 불필요한 실험을 수행하지 않고도 본 발명의 특정 조성물의 유효량을 실험적으로 결정할 수 있을 것이다.
에피토프: 여기서 사용된 바와 같이, 용어 "에피토프"는 동물, 바람직하게는 포유동물, 가장 바람직하게는 인간에게서 항원성 또는 면역원성 활성이 있는 폴리펩티드의 연속 또는 불연속 부분들을 가리킨다. 에피토프는 MHC 분자와 관련하여 T 세포 수용체를 통해 T 세포 또는 항체에 의하여 인식된다. 여기서 사용된 "면역원성 에피토프"는 당분야에 공지된 모든 방법에 의하여 결정된 바와 같이, 동물에게서 T-세포 반응을 유도하거나 항체 반응을 유발하는 폴리펩티드의 부분으로서 정의된다 (예를 들면, Geysen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:3998-4002 (1983) 참조). 여기에 사용된 용어 "항원성 에피토프"란 당분야에 잘 알려진 모든 방법으로 결정되는 바와 같이 항체가 그 항원에 면역특이적으로 결합할 수 있는 단백질의 부분으로서 정의된다. 면역특이적 결합은 비특이적 결합을 배제하지만 반드시 다른 항원과의 교차-반응성을 배제하는 것은 아니다. 항원성 에피토프는 반드시 면역원성일 필요가 있는 것은 아니다. 항원성 에피토프는 T-세포 에피토프일 수 있으며, 이 경우 이들은 MHC 분자와 관련하여 T-세포 수용체에 의하여 면역특이적으로 결합될 수 있다.
에피토프는 그 에피토프에 독특한 공간 구조로 3 개 아미노산을 포함할 수 있다. 일반적으로 에피토프는 약 5 개 이상의 그러한 아미노산으로 이루어지며, 더 일반적으로는 적어도 약 8 내지 10 개의 그러한 아미노산으로 이루어진다. 에피토프가 유기 분자라면 니트로페닐과 같이 작을 수 있다.
융합: 여기에 사용된 바와 같이, 용어 "융합"은 하나의 폴리펩티드 쇄에 기원이 다른 아미노산 서열을 이들의 코딩 뉴클레오티드 서열의 프레임내 (in-frame) 조합에 의하여 조합하는 것을 가리킨다. 용어 "융합"은 폴리펩티드 한쪽 말단으로 융합하는 것외에도 내부 융합, 즉 폴리펩티드 쇄 내에 기원이 다른 서열을 삽입하는 것도 명백히 포함한다.
면역반응: 여기에 사용된 바와 같이, 용어 "면역반응"은 B- 및(또는) T-림프구 및(또는) 항원 제시 세포의 활성화 또는 증식을 가져오는 세포성 및(또는) 체액성 면역 반응을 가리킨다. 그러나, 몇몇 경우에는 면역반응이 강도가 낮을 수 있으며 본 발명에 따른 하나 이상의 물질을 사용할 때만 검출될 수 있다. "면역원성"이란 면역계의 하나 이상의 기능이 증가되고 면역원성 작용제에 대해 유도되도록 살아있는 유기체의 면역계를 자극하는 데에 사용되는 작용제를 가리킨다. "면역원성 폴리펩티드"는 면역보강제가 있든 없든 담체에 연결되든 단독으로든 세포성 및(또는) 체액성 면역반응을 유발하는 폴리펩티드이다. 바람직하게는 항원 제시 세포가 활성화될 수 있다.
면역반응을 향상시키는 물질이란 이 물질을 부가하지 않고 측정된 동일한 면역반응과 비교할 때 이 물질을 첨가하여 어떤 식으로든 면역반응이 커지거나 강해지거나 빗나가는 것으로 관찰되는 물질을 가리킨다. 예를 들면, 세포독성 T 세포의 용균 활성은 면역화 동안 그 물질을 사용하거나 사용하지 않고 얻어진 샘플에서 51Cr 방출 분석법 등을 써서 측정할 수 있다. 그 물질 없는 CTL 용균 활성과 비교할 때 CTL 용균 활성이 향상된 경우 그 물질의 양은 항원에 대해 동물의 면역반응을 향상시키는 데에 충분한 양이라고 한다. 바람직한 실시양태에서 면역반응은 약 2 배 이상, 더 바람직하게는 약 3 배 이상 향상된다. 분비된 사이토킨의 양이나 종류도 변경할 수 있다. 이와 달리 유도되는 항체 또는 이들의 아종의 양을 변경할 수 있다.
면역화: 여기서 사용된 바와 같이, 용어 "면역화하다" 또는 "면역화" 또는 이와 관련된 용어는 표적 항원 또는 에피토프에 대한 상당한 면역반응 (항체 및(또는) 이펙터 CTL과 같은 세포성 면역을 포함)을 상승시키는 능력을 부여하는 것이다. 이들 용어는 완벽한 면역성이 창조됨을 요구하는 것이 아니라 오히려 기준선보다 실질적으로 큰 면역반응이 발생할 것을 요구한다. 예를 들면, 포유동물은 표적 항원에 대한 세포성 및(또는) 체액성 면역반응이 본 발명의 방법을 적용한 후에 발생한다면 표적 항원에 대해 면역화된 것으로 생각될 수 있다.
천연 기원: 여기에 사용된 바와 같이, 용어 "천연 기원"은 전체 또는 그 일부가 합성된 것이 아니라 자연적으로 존재하거나 생성되는 것임을 의미한다.
비천연: 여기에 사용된 바와 같이, 이 용어는 일반적으로 자연으로부터 유래되지 않은 것임을 의미하는데, 더 구체적으로는 이 용어는 인공적인 것임을 의미한다.
비천연 기원: 여기에 사용된 바와 같이, 용어 "비천연 기원"이란 일반적으로 합성되거나 자연으로부터 유래되지 않은 것을 의미하며, 더 구체적으로는 이 용어는 인공적인 것임을 의미한다.
질서화된 반복성 항원 또는 항원성 결정인자 어레이: 여기에 사용된 바와 같이 용어 "질서화된 반복성 항원 또는 항원성 결정인자 어레이"는 코어 입자 및 바 이러스-유사 입자와 관련하여 항원 또는 항원성 결정인자의 공간적 배열이 전형적이고 바람직하게는 균일함을 특징으로 하는, 항원 또는 항원성 결정인자의 반복 패턴을 통상 가리킨다. 본 발명의 한 실시양태에서는 이 반복 패턴은 기하학적 패턴일 수 있다. 적합한 질서화된 반복성 항원 또는 항원성 결정인자 어레이의 전형적이고 바람직한 예는 항원 또는 항원성 결정인자의 엄격히 반복적인 파라결정성 질서 (바람직하게는 간격이 0.5 내지 30 nm, 더 바람직하게는 5 내지 15 nm임)를 갖는 것들이다.
섬모: 여기에 사용된 바와 같이, 용어 "섬모 (pili)" (단수형은 pilus)는 질서화된 반복성 패턴으로 조직된, 단백질 단량체 (예를 들면, 필린 단량체)로 구성된 박테리아 세포의 세포외 구조물을 가리킨다. 또한, 섬모는 박테리아 세포의 숙주 세포 표면 수용체로의 부착, 세포내 유전적 교환, 및 세포-세포 인식과 같은 과정에 관여하는 구조물이다. 섬모의 예로는 1형 섬모, P-섬모, F1C 섬모, S-섬모 및 987P-섬모가 있다. 섬모의 추가적인 예는 아래에 기재한다.
섬모-유사 구조: 여기에 사용된 바와 같이, "섬모-유사 구조"란 구절은 단백질 단량체로 구성되며 섬모의 것과 유사한 특징을 갖는 구조를 가리킨다. "섬모-유사 구조"의 일례는 천연 섬모의 것과 동일한 질서화된 반복성 어레이를 형성하지 않는 변형된 필린 단백질을 발현하는 박테리아 세포에 의하여 형성된 구조물이다.
폴리펩티드: 여기에 사용된 바와 같이, 용어 "폴리펩티드는 아미드 결합 (펩티드 결합으로도 알려짐)에 의하여 선형적으로 연결된 단량체 (아미노산)로 구성된 분자를 가리킨다. 이는 아미노산의 분자쇄를 지시하며, 이 생성물의 구체적인 길 이는 가리키는 것은 아니다. 따라서 펩티드, 디펩티드, 트리펩티드, 올리고펩티드 및 단백질이 폴리펩티드의 정의에 포함된다. 이 용어는 또한 예를 들어 당화, 아세틸화, 포스포릴화 등 폴리펩티드의 발현후 변형을 가리키는 것으로 의도된다. 재조합 또는 유도된 폴리펩티드는 지명된 핵산 서열로부터 반드시 번역되어야 하는 것은 아니다. 화학적 합성을 비롯한 여하한의 방식으로 생성될 수도 있다.
잔기: 여기에 사용된 바와 같이, 용어 "잔기"는 폴리펩티드 백본 또는 측쇄에서의 특정한 아미노산을 의미한다.
자기 항원: 여기에 사용된 바와 같이, 용어 "자기 항원"이란 숙주의 DNA에 의하여 코딩되는 단백질을 가리키며, 숙주의 DNA에 의하여 코딩된 RNA 또는 단백질에 의하여 생성되는 생성물은 자기 (self)로서 정의된다. 또한 둘 또는 수개의 자기 분자가 조합되어 생기거나 자기 분자의 분획을 나타내는 단백질 및 상기 정의한 바와 같은 2 개의 자기 분자와 상동성이 큰 단백질 (>95 ％, 바람직하게는 >97％, 더 바람직하게는 >99 ％)도 또한 자기로 여겨질 수 있다.
치료: 여기에 사용된 바와 같이, 용어 "치료", "치료하다", "치료된" 또는 "치료하는"이란 예방 및(또는) 치료를 가리킨다. 예를 들어 감염성 질병과 관련하여 사용될 때, 이 용어는 병원체에 의한 감염에 대해 환자의 내성을 증가시키거나 또는 달리 말하면 환자가 병원체에 감염되거나 이 감염으로 인한 병의 징후를 나타낼 가능성을 감소시키는 예방적 치료뿐만 아니라 환자가 감염된 후에 감염과 싸우기 위해, 즉 감염을 완화하거나 제거하거나 상태가 악화되는 것을 막기 위한 치료를 가리킨다.
백신: 여기에 사용된 바와 같이, 용어 "백신"은 본 발명의 조성물을 포함하며 동물에게 투여될 수 있는 형태의 제제를 가리킨다. 전형적으로 백신은 본 발명의 조성물이 현탁되거나 용해되는 통상적인 염수 또는 완충된 수용액 매질을 포함한다. 이런 형태에서는 본 발명의 조성물이 상태를 예방하거나 완화하거나 달리 치료하는 데에 편리하게 사용될 수 있다. 숙주로의 도입시 백신은 항체 (또는) 사이토킨의 생성 및(또는) 세포독성 T 세포, 항원 제시 세포, 헬퍼 T 세포, 수상 세포 및(또는) 다른 세포성 반응들의 활성화에 한정되지 않으나 이들을 포함하는 면역반응을 유발할 수 있다.
임의로는, 본 발명의 백신은 추가로, 본 발명의 화합물에 비하여 적거나 주된 비율로 존재할 수 있는 면역보강제를 포함한다.
바이러스-유사 입자 (VLP): 여기에 사용된 바와 같이, 용어 "바이러스-유사 입자"는 바이러스 입자를 닮은 구조를 가리킨다. 더욱이 본 발명에 따른 바이러스-유사 입자는 바이러스 게놈의 전부 또는 일부, 특히 바이러스 게놈의 복제 및 감염성 성분들이 결여되었기 때문에 비복제성 및 비감염성이다. 본 발명에 따른 바이러스-유사 입자는 이들의 게놈과 다른 핵산을 포함할 수 있다. 본 발명에 따른 바이러스-유사 입자의 전형적이고 바람직한 실시양태는 상응하는 바이러스, 박테리오파아지, 또는 RNA 파아지의 바이러스 캡시드와 같은 바이러스 캡시드이다. 용어 "바이러스 캡시드" 또는 "캡시드"는 여기에서 서로 바꿔 사용되며, 바이러스 단백질 서브유닛으로 구성된 마크로분자 조립물을 가리킨다. 전형적이고 바람직하게는 바이러스 단백질 서브유닛들은 고유한 반복성 조직이 있는 구조 (이 구조는 전형적 으로는 구형 또는 관형임)를 갖는 바이러스 캡시드 및 캡시드로 각기 조립된다. 예를 들면 RNA-파아지 또는 HBcAg의 캡시드는 정이십면체 대칭의 구형을 갖는다. 여기에 사용된 용어 "캡시드-유사 구조"는 바이러스 단백질 서브유닛으로 구성된 마크로분자 조립물로서, 상기 정의된 의미에서 캡시드 형태와 유사하지만 충분한 질서도 및 반복성을 유지하면서 전형적인 대칭적 조립물로부터는 벗어나 있는 것을 가리킨다.
박테리오파아지의 바이러스-유사 입자: 여기에 사용된 바와 같이, 용어 "박테리오파아지의 바이러스-유사 입자"는 비복제성 및 비감염성이며 적어도 박테리오파아지의 복제 기구를 코딩하는 유전자 또는 유전자들이 결여되고 또한 통상적으로 바이러스의 숙주로의 부착 또는 숙주 내로의 진입을 일으키는 단백질 또는 단백질들을 코딩하는 유전자 또는 유전자들이 결여된 박테리오파아지의 구조와 유사한 바이러스-유사 입자를 가리킨다. 그러나 이 정의는 박테리오파아지의 바이러스-유사 입자도 포괄해야 하며, 여기서 상기 유전자 또는 유전자들은 여전히 존재하지만 불활성이며 따라서 역시, 박테리오파아지의 비복제성 비감염성 바이러스-유사 입자를 가져온다.
RNA 파아지 코트 단백질의 VLP: RNA 파아지 코트 단백질의 180 서브유닛의 자기 조립로부터 형성되고 임의로는 숙주 RNA를 포함하는 캡시드 구조는 "RNA 파아지 코트 단백질의 VLP"로서 언급된다. 구체적인 예가 Qβ 코트 단백질의 VLP이다. 이 특정한 경우에, Qβ 코트 단백질의 VLP는 Qβ CP 서브유닛 (억제 (suppression)를 통해 긴 A1 단백질의 어떠한 발현도 막는 TAA 정지 코돈 등을 포함하는 QβCP 유전자의 발현에 의하여 생성됨, Kozlovska, T. M., et al., Intervirology 39: 9-15 (1996) 참조)으로만 조립될 수 있거나 또는 캡시드 조립물 중에 A1 단백질 서브유닛을 추가로 포함할 수 있다.
바이러스 입자: 여기에 사용된 용어 "바이러스 입자"는 바이러스의 형태학적 형태를 가리킨다. 일부 바이러스 종류에서는 바이러스 입자가 단백질 캡시드에 의하여 둘러싸인 게놈을 포함하며, 나머지는 추가의 구조 (예를 들면, 엔벨로프, 꼬리 등)를 갖는다.
하나, 단수형: "하나" 또는 단수형이 이 명세서에서 사용된 경우 이들은 특별한 언급이 없다면 "적어도 하나" 또는 "하나 이상"을 의미한다.
당분야의 숙련자에게 명백한 바와 같이, 본 발명의 특정한 실시양태는 클로닝, 중합효소 연쇄반응, DNA 및 RNA의 정제, 원핵세포 및 진핵세포에서 재조합 단백질의 발현 등과 같은 재조합 핵산 기술을 사용하는 것을 포함한다. 이러한 방법들은 당분야의 숙련자에게 잘 알려져 있고, 출판된 실험실 방법 설명서에서 편리하게 찾을 수 있다 (예컨대, Sambrook, J. et al., eds., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd. edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989), Ausubel, F. et al., eds., Current Protocols in Molecular Biology, John H. Wiley ＆ Sons, Inc. (1997)). 조직 배양 세포주를 처리하는 기본적인 실험 기술 (Celis, J., ed., Cell Biology, Academic Press, 2nd edition, (1998)) 및 항체-기초 기술 (Harlow, E. and Lane, D., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. (1988), Deutscher, M.P., "Guide to Protein Purification," Meth. Enzymol. 128, Academic Press San Diego (1990), Scopes, R.K., Protein Purification Principles and Practice, 3rd ed., Springer-Verlag, New York (1994))도 문헌에 적절히 기재되어 있으며, 이는 모두 언급함으로써 본원에 도입된다.
2. 면역반응을 향상시키는 조성물 및 방법
공개되는 발명은 동물에게서 Aβ1-6 펩티드에 대한 면역반응을 유도하여 Aβ 아밀로이드 플라크 및 가용성 Aβ에 결합할 수 있는 항체를 유도하는 조성물 및 방법을 제공한다. 본 발명의 조성물은 (a) 제1 부착 부위가 하나 이상 있는 코어 입자, 및 (b) 제2 부착 부위가 하나 이상 있는 항원 또는 항원성 결정인자 하나 이상을 포함하거나 또는 이루어지되, 상기 항원 또는 항원성 결정인자가 Aβ1-6 펩티드이고, 상기 제2 부착 부위가 (i) 상기 항원 또는 항원성 결정인자에게서 자연발생하지 않는 부착 부위 및 (ⅱ) 상기 항원 또는 항원성 결정인자에게서 자연발생하는 부착 부위로 이루어진 군에서 선택된 것이며, 상기 제2 부착 부위가 상기 제1 부착 부위에 회합할 수 있고, 이 회합을 통해 상기 Aβ1-6 펩티드와 상기 코어 입자가 상호작용하여 질서화된 반복성 항원 어레이를 형성한다. 더 구체적으로는, 본 발명의 조성물은 바이러스-유사 입자 및 하나 이상의 항원 또는 항원성 결정인자를 포함하거나 또는 이루어지되, 항원 또는 항원성 결정인자가 Aβ1-6 펩티드이며 하나 이상의 항원 또는 항원성 결정인자가 바이러스-유사 입자에 결합하여 질서화된 반복성 항원-VLP-어레이를 형성한다. 또한, 본 발명에 의하면 실시자가 특히 알츠 하이머병의 치료 및(또는) 예방을 위한 그러한 조성물을 편리하게 제작할 수 있다. 본 출원과 관련하여 바이러스-유사 입자는 바이러스 입자와 닮았지만 병원성이 아닌 구조물을 가리킨다. 일반적으로 바이러스-유사 입자는 바이러스 게놈이 없기 때문에 비감염성이다. 또한 바이러스-유사 입자는 이종 발현에 의하여 다량으로 제조될 수 있으며 쉽게 정제될 수 있다.
한 실시양태에서 코어 입자는 바이러스, 박테리아 섬모, 박테리아 편모로 형성된 구조, 박테리오파아지, 바이러스-유사 입자, RNA 파아지의 바이러스-유사 입자, 바이러스 캡시드 입자 또는 이의 재조합 형태를 포함하거나 또는 이들로 이루어진 군에서 선택된다. 질서화된 반복성 코트 및(또는) 코어 단백질 구조를 갖는 당분야에 공지된 모든 바이러스가 본 발명의 코어 입자로서 선택될 수 있다. 적합한 바이러스의 예로는 신드비스 및 그외 알파바이러스, 랍도바이러스 (예를 들면, 수포성 구내염 바이러스), 피코나바이러스 (예를 들면, 인간 리노 바이러스, 아이치 바이러스), 토가바이러스 (예를 들면, 루벨라 바이러스), 오르토믹소바이러스 (예를 들면, 토고토 바이러스, 바트켄 바이러스, 조류 흑사병 바이러스), 폴리오마바이러스 (예를 들면, 폴리오마바이러스 BK, 폴리오마바이러스 JC, 조류 폴리오마바이러스 BFDV), 파르보바이러스, 로타바이러스, 노르웍 (Norwalk) 바이러스, 구제역 바이러스 (foot and mouth disease virus), 레트로바이러스, B형 간염 바이러스, 담배 모자이크 바이러스, 플록 하우스 바이러스, 및 인간 파필로마 바이러스, 및 바람직하게는 RNA 파아지, 박테리오파아지 Qβ, 박테리오파아지 R17, 박테리오파아지 M11, 박테리오파아지 MX1, 박테리오파아지 NL95, 박테리오파아지 fr, 박테 리오파아지 GA, 박테리오파아지 SP, 박테리오파아지 MS2, 박테리오파아지 f2, 박테리오파아지 PP7 (예를 들면, Bachmann, M.F. and Zinkernagel, R.M., Immunol. Today 17:553-558 (1996)의 표 1 참조)이 있다.
또다른 실시양태에서 본 발명은 바이러스 유전공학을 이용하여, 이종 단백질, 펩티드, 항원성 결정인자 또는 정선한 반응성 아미노산 잔기를 포함하거나 달리 또는 바람직하게는 이종 단백질, 펩티드, 항원성 결정인자 또는 정선한 반응성 아미노산 잔기인 제1 부착 부위와, 질서화된 반복성 엔벨로프 단백질과의 융합을 만들었다. 당분야에 공지된 다른 유전자 조작법이 본 발명의 조성물 제작에 포함될 수 있다. 예를 들어 유전자 돌연변이를 통하여 재조합 바이러스의 복제능을 제한하는 것이 바람직할 수 있다. 또한 본 발명에 사용된 바이러스는 화학적 또는 물리적 불활성화로 인하여 또는, 지시된 바와 같이 복제 능력있는 게놈의 결여로 인하여 복제 능력이 없다. 제1 부착 부위로의 융합을 위하여 선택된 바이러스 단백질은 조직된 반복성 구조를 가져야 한다. 이러한 조직된 반복성 구조는 바이러스 표면 상에 간격이 5 내지 30 nm, 바람직하게는 5 내지 15 nm인 파라결정 조직을 포함한다. 이런 타입의 융합 단백질의 제조는 바이러스의 표면 상에 다수의 질서화된 반복성 제1 부착 부위를 초래하며 천연 바이러스 단백질의 정상적인 조직을 반영할 것이다. 당분야의 숙련자에게 이해되는 바와 같이, 제1 부착 부위는 항원 또는 항원성 결정인자에 특이적으로 부착하여 질서화된 반복성 항원 어레이를 가져오는 데 관여할 수 있는, 임의의 적합한 단백질의 일부, 폴리펩티드, 당, 폴리뉴클레오티드, 펩티드 (아미노산), 천연 또는 합성 폴리머, 2차 대사산물 또는 이들의 조합물이거나 일 수 있다.
본 발명의 다른 실시양태에서 코어 입자는 재조합 알파바이러스, 더 구체적으로는 재조합 신드비스 바이라스이다. 알파바이러스는 감염된 세포의 세포질에서 DNA 중간체 없이 자신들의 게놈 RNA를 복제하는 양성 가닥 RNA 바이러스이다 (Strauss, J. and Strauss, E., Microbiol. Rev. 58:491-562 (1994)). 알파바이러스족의 여러 구성원들, 신드비스 (Xiong, C. et al., Science 243:1188-1191 (1989), Schlesinger, S., Trends Biotechnol. 11:18-22 (1993)), 셈리키 포레스트 바이러스 (SFV) (Liljestrom, P. ＆ Garoff, H., Bio/Technology 9:1356-1361 (1991)) 및 그외의 것들 (Davis, N.L. et al., Virology 171:189-204 (1989))이 여러 상이한 단백질을 위한 바이러스-기재 발현 벡터로서의 사용 (Lundstrom, K., Curr. Opin. Biotechnol. 8:578-582 (1997), Liljestrom, P., Curr. Opin. Biotechnol. 5:495-500 (1994)) 및 백신 개발용 후보물질로서 상당한 관심을 받고 있다. 최근들어 이종 단백질의 발현 및 백신 개발에 있어서 알파바이러스의 사용에 관한 많은 특허가 부여되었다 (참고로, 미국특허 제5,766,602호, 제5,792,462호, 제5,739,026호, 제5,789,245호 및 제5,814,482호). 본 발명의 알파바이러스 코어 입자의 제작은 상기한 논문들 (이들은 언급됨으로써 본원에 도입됨)에 기재된 바와 같이 재조합 DNA 기술분야에서 통상적으로 알려진 방법에 의하여 수행될 수 있다.
각종 상이한 재조합 숙주세포를 항원 또는 항원성 결정인자 부착을 위한 바이러스-기재 코어 입자를 제조하는 데에 이용할 수 있다. 예를 들어 알파바이러스 는 숙주 범위가 넓은 것으로 알려져 있는데, 신드비스 바이러스는 배양된 포유류, 파충류, 및 양서류 세포뿐만 아니라 몇몇 곤충 세포도 감염시킨다 (Clark, H., J. Natl. Cancer Inst. 51:645 (1973), Leake, C., J. Gen. Virol. 35:335 (1977), Stollar, V. in THE TOGAVIRUSES, R.W. Schlesinger, Ed., Academic Press, (1980), pp.583-621). 따라서 수많은 재조합 숙주세포가 본 발명의 실시에 사용될 수 있다. BHK, COS, Vero, HeLa 및 CHO 세포가 특히 이종 단백질의 제조에 적합한데, 왜냐하면 이들은 인간 세포와 유사한 방식으로 이종 단백질을 당화시킬 잠재력이 있고 (Watson, E. et al., Glycobiology 4:227, (1994)) 혈청-유리 배지에서 뿐만 아니라 현탁액 중에서도 증식하도록 선별되거나 (Zang, M. et al., Bio/Technology 13:389 (1995)) 유전자조작될 수 있기 때문이다 (Renner W. et al., Biotech. Bioeng. 4:476 (1995), Lee K. et al. Biotech. Bioeng. 50:336 (1996)).
폴리뉴클레오티드 벡터를 숙주세포로 도입하는 것은 전기천공법, DEAE-덱스트란 매개 형질감염, 형질감염, 마이크로주사, 양이온 지질-매개 형질감염, 형질도입, 스크레이프 로딩 (scrape loading), 유전자총 도입, 및 감염 등의 방법을 비롯하여 표준적인 실험 설명서에 기재된 방법으로 수행할 수 있다 (예를 들어, Sambrook, J. et al., eds., MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL, 2nd. edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989), 제9장, Ausubel, F. et al., eds., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John H. Wiley ＆ Sons, Inc. (1997), 제16장). 숙주세포로의 외인성 DNA 서열의 도입 방법은 미국 특허 제5,580,859호 (Felgner, P. et al.)에 논의되어 있다.
포장된 RNA 서열을 숙주세포 감염에 사용할 수도 있다. 이들 포장된 RNA 서열을 배양 배지에 첨가함으로써 이들 서열을 숙주세포에 도입할 수 있다. 예를 들어 비감염성 알파바이러스 입자의 제조는 "신드비스 발현계", 버전 C (Invitrogen 카탈로그 번호 K750-1)를 비롯한 많은 자료에 기재되어 있다.
포유동물 세포를 바이러스-기재 코어 입자의 제조에 재조합 숙주세포로서 사용하는 경우 이들 세포는 일반적으로 조직 배양으로 증식될 것이다. 세포를 배양하여 증식하는 방법은 당분야에 잘 알려져 있다 (예를 들어 Celis, J., ed., CELL BIOLOGY, Academic Press, 2nd edition, (1998), Sambrook, J. et al., eds., MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL, 2nd. edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989), Ausubel, F. et al., eds., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John H. Wiley ＆ Sons, Inc. (1997), Freshney, R., CULTURE OF ANIMAL CELLS, Alan R. Liss, Inc. (1983) 참조).
본 발명에서 코어 입자로서 사용하기에 적합한 RNA 바이러스의 또다른 예로는, 오르토레오바이러스종 (포유동물 및 조류 레트로바이러스 양자의 다수 혈청형), 오르비바이러스종 (블루텅 바이러스, 유게난기 바이러스, 케메로보 바이러스, 아프로칸 말 시크니스 바이러스, 및 콜로라도 틱 열 바이러스), 로타바이러스종 (인간 로타바이러스, 네브라스카 송아지 설사 바이러스, 뮤린 (murine) 로타바이러스, 원숭이 로타바이러스, 소 또는 양 로타바이러스, 조류 로타바이러스)를 비롯한 레오비리대족의 구성원들; 엔테로바이러스종 (폴리오바이러스, 콕사키 바이러스 A 및 B, 장 세포병변 인간 오어펀 (ECHO) 바이러스, A, C, D, E 및 G형 간염 바이러스, 원숭이 엔테로바이러스, 뮤린 뇌척수염 (ME) 바이러스, 폴리오바이러스 뮤리스, 소 엔테로바이러스, 돼지 엔테로바이러스, 카르디오바이러스 (뇌심근염 바이러스 (EMC), 멩고바이러스), 리노바이러스종 (적어도 113 서브타입을 포함하는 인간 리노바이러스, 다른 리노바이러스), 아프토바이러스종 (구제역 (FMDV)을 포함하는 피코마비리대족; 돼지 혈관 발진 바이러스, 산 미구엘 강치 바이러스, 고양이 피코르나바이러스 및 노르웍 바이러스를 포함하는 칼시비리대족; 알파바이러스종 (동양 말 뇌염 바이러스, 셈리키 포레스트 바이러스, 신드비스 바이러스, 치쿵운야 바이러스, 오뇽-뇽 바이러스, 로스 리버 바이러스, 베네주엘란 말 뇌염 바이러스, 서양 말 뇌염 바이러스), 플라비리우스종 (모기 매개 황열 바이러스, 뎅기 바이러스, 일본 뇌염 바이러스, 세인트루이스 뇌염 바이러스, 머레이 밸리 뇌염 바이러스, 웨스트 나일 바이러스, 쿤진 바이러스, 중유럽 진드기 매개바이러스, 극동 진드기 매개 바이러스, 캬사누르 포레스트 바이러스, 로우핑 III 바이러스, 포와산 바이러스, 옴스크 출혈열 바이러스), 루비바이러스종 (루벨라 바이러스), 페스티바이러스종 (점막 질환 바이러스, 호그 콜레라 바이러스, 보르더병 바이러스)를 포함하는 토가비리대족; 부니바이러스종 (분얌웨라 및 관련 바이러스, 캘리포니아 뇌염군 바이러스), 플레보바이러스종 (샌드플라이 열 시실리안 바이러스, 리프트밸리 바이러스), 나이로바이러스종 (크리민-콩고 출혈열 바이러스, 나이로비 양 질병 바이러스), 및 유쿠이러스종 (유쿠니에미 및 관련 바이러스)를 포함하는 분야비리대족; 인플루엔 자 바이러스종 (A형 인플루엔자 바이러스, 많은 인간 서브타입들)을 포함하는 오르토미속비리대족; 돼지 인플루엔자 바이러스, 및 조류 및 말 인플루엔자 바이러스; B형 인플루엔자 (많은 인간 서브타입들), 및 C형 인플루엔자 (가능한 별개의 종); 파라미속바이러스종 (1형 파라인플루엔자 바이러스, 센다이 바이러스, 헴흡착 바이러스, 파라인플루엔자 바이러스 2 내지 5형, 뉴캐슬병 바이러스, 멈프스 바이러스), 모르빌리바이러스 (홍역 바이러스, 아급성경화범뇌염 바이러스, 디스템퍼 바이러스, 린더페스트 바이러스), 뉴모바이러스종 (호흡기 세포융합 바이러스 (RSV), 소 호흡기 세포융합 바이러스 및 마우스 뉴모니아 바이러스)을 포함하는 파라미속비리대족; 포레스트 바이러스, 신드비스 바이러스, 치쿵군야 바이러스, 오뇽-뇽 바이러스, 로스 리버 바이러스, 베네주엘란 말 뇌염 바이러스, 서양 말 뇌염 바이러스), 플라비리우스종 (모기 매개 황열 바이러스, 뎅기 바이러스, 일본 뇌염 바이러스, 세인트루이스 뇌염 바이러스, 머레이 밸리 뇌염 바이러스, 웨스트 나일 바이러스, 쿤진 바이러스, 중유럽 진드기 매개바이러스, 극동 진드기 매개 바이러스, 캬사누르 포레스트 바이러스, 로우핑 III 바이러스, 포와산 바이러스, 옴스크 출혈열 바이러스), 루비바이러스종 (루벨라 바이러스), 페스티바이러스종 (점막 질환 바이러스, 호그 콜레라 바이러스, 보르더병 바이러스); 부니바이러스종(분얌베라 및 관련 바이러스, 캘리포니아 뇌염 그룹 바이러스), 플레보바이러스 (샌모래파리 열 시실리안 바이러스, 리프트 밸리 열 바이러스), 나이로바이러스종 (크리민-콩고 출혈열 바이러스, 나이로비 양 질병 바이러스), 및 유쿠바이러스종 (유쿠니에미 및 관련바이러스)를 포함하는 분야비리대족; 인플루엔자 바이러스종 (A형 인플루엔자 바 이러스, 많은 인간 서브타입)를 포함하는 오르토믹소비리대족; 돼지 인플루엔자 바이러스, 및 조류 및 말 인플루엔자 바이러스; B형 인플루엔자 (많은 인간 서브타입), 및 C형 인플루엔자 (가능한 별개의 종); 파라미속바이러스종 (파라인플루엔자 바이러스 1형, 센다이 바이러스, 헴흡착 바이러스, 파라인플루엔자 바이러스 2 내지 5형, 뉴캐슬병 바이러스, 멈프 바이러스), 모르빌리바이러스종 (홍역 바이러스, 아급성경화범뇌염 바이러스, 디스템퍼 바이러스, 린더페스트 바이러스), 뉴모바이러스종 (호흡기세포융합 바이러스 (RSV), 소 호흡기 세포융합 바이러스 및 마우스 뉴모니아 바이러스)를 포함하는 파라믹소비리대족; 베시큘로바이러스종 (VSV), 챈디푸라 바이러스, 플랜더스-하르트 파크 바이러스), 리사바이러스종 (래비스 바이러스), 피시 래브도바이러스 및 필로바이러스 (마르부르그 바이러스 및 에볼라 바이러스)를 포함하는 라브도비리대족; 림프구 맥락수막염 바이러스 (LCM), 타카리베 바이러스 컴플렉스, 및 라사 바이러스를 포함하는 아레나비리대족; 감염성 기관지염 바이러스 (IBV), 마우스 간염 바이러스, 인간 장 코로나 바이러스, 및 고양이 감염성 복막염 (고양이 코로나바이러스)을 포함하는 코로노아비리대족이 있으나 이것으로 한정되는 것은 아니다.
코어 입자로서 사용할 수 있는 예시적인 DNA 바이러스로는, 오르토폭스바이러스종 (바리올라 메이저, 바리올라 마이너, 몽키 폭스 백시니아, 우두, 버팔로폭스, 래빗폭스, 엑트로멜리나), 레포리폭스바이러스종 (믹소마, 피브로마), 아비폭스바이러스종 (파울폭스, 다른 조류 폭스바이러스), 카프리폭스바이러스종 (양폭스, 거위), 수이폭스바이러스 (스와인폭스), 파라폭스바이러스종 (전염성 포스툴라 피부염 바이러스, 슈도유두, 소 구진 구내염 바이러스)를 포함하는 폭스비리대족; 이리도비리대족 (아프리카 돼지 열 바이러스, 개구리 바이러스 2 및 3, 어류의 림포시스티스 바이러스); 알파-헤르페스바이러스 (단순포진 1 및 2형, 바리셀라-조스터, 말 낙태 바이러스, 말 헤르페스 바이러스 2 및 3, 슈도라비스 바이러스, 감염성 소 각막결막염 바이러스, 감염성 소 비기관염 바이러스, 고양이 비기관염 바이러스, 감염성 후두기관염 바이러스) 베타-헤르페스바이러스 (인간 시토메갈로바이러스 및 돼지, 원숭이 및 설치료의 시토메갈로바이러스)를 포함하는 헤르페스비리대족; 감마-헤르페스바이러스 (엡스타인-바 바이러스 (EBV), 마렉스병 바이러스, 헤르페스 사이미리, 헤르페스바이러스 아텔레스, 헤르페스바이러스 실빌라구스, 기나아 피그 헤르페스 바이러스, 루크 종양 바이러스); 마스타데노바이러스종 (인간 서브그룹 A, B, C, D 및 E 및 그룹화되지 않은 것들; 원숭이 아데노바이러스 (적어도 23 혈청형), 감염성 송곳니 간염, 및 소, 돼지, 양, 개구리 및 많은 다른 종의 아데노바이러스, 아비아데노바이러스종 (조류 아데노바이러스)를 포함하는 아데노비리대족; 및 재배할 수 없는 아데노바이러스; 파포비리대족, including the genus 파필로마 바이러스 종 (인간 파필로마 바이러스, 소 파필로마 바이러스, 숍 토끼 파필로마 바이러스, 및 다른 종의 다양한 병원성 파필로마 바이러스), 폴리오마바이러스종 (폴리오마바이러스, 원숭이 공포형성제 (SV-40), 토끼 공포형성제 (RKV), K 바이러스, BK 바이러스, JC 바이러스, 및 림포영양성 파필로마 바이러스와 같은 다른 영장류 폴리오마 바이러스); 아데노-관련 바이러스종, 파르보바이러스종 (고양이 범백혈구감소증 바이러스, 소 파르보바이러스, 송곳니 파르보바이러스, 아로 우시안 밍크병 바이러스 등)을 포함하는 파르보비리대족이 있으나 이에 한정되지는 않는다. 마지막으로 DNA 바이러스로는 만성 감염성 신경병증 제제 (CHINA virus)가 있을 수 있다.
다른 실시양태에서는 박테리아 필린, 박테리아 필린의 일부 (subportion), 또는 박테리아 필린 또는 그의 일부를 포함하는 융합 단백질을 사용하여 본 발명의 조성물 및 백신 조성물을 각기 제조한다. 필린 단백질의 예는 에쉐리키아 콜라이 (Escherichia coli), 해모필루스 인플루엔자 (Haemophilus influenzae), 네이세리아 메닝기티디스 (Neisseria meningitidis), 네이세리아 고노르호에애 (Neisseria gonorrhoeae), 카울로박터 크레센투스 (Caulobacter crescentus), 슈도모나스 스투제리 (Pseudomonas stutzeri), 및 슈도모나스 아에루기노사 (Pseudomonas aeruginosa)에 의하여 생산되는 필린이 있다. 본 발명에 사용하기에 적합한 필린 단백질의 아미노산 서열은 진뱅크 리포트 AJ000636, AJ132364, AF229646, AF051814, AF051815, 및 X00981에 기재된 것들이 있으며 이들 전체 공개 내용은 언급에 의하여 본원에 도입된다.
박테리아 필린 단백질은 일반적으로 박테리아 원형질막주위공간 (periplasm) 내로 단백질을 배출하기 전에 프로세싱되어 N-말단 리더 서열이 제거된다. 또한 당분야의 숙련자가 인식하는 바와 같이, 본 발명의 조성물 및 백신 조성물을 각각 제조하는 데에 사용되는 박테리아 필린 단백질은 일반적으로 자연적으로 존재하는 리더 서열을 갖지 않을 것이다.
본 발명에 사용하기에 적합한 필린 단백질의 특정한 일례는 이. 콜라이의 P- 필린 (진뱅크 리포트 AF237482 (서열 1))이다. 본 발명에 사용하기에 적합한 1형 이. 콜라이 필린의 예는 진뱅크 리포트 P04128 (서열 2)에 기재된 아미노산 서열을 갖는 필린이며, 이는 진뱅크 리포트 M27603 (서열 3)에 기재된 뉴클레오티드 서열을 갖는 핵산에 의하여 코딩된다. 이들 진뱅크 리포트의 전체 공개내용은 언급에 의하여 본원에 도입된다. 또한, 상기 언급된 단백질의 성숙형은 본 발명의 조성물 및 백신 조성물을 각기 제조하는 데에 일반적으로 사용될 것이다.
본 발명의 실시에 사용하기에 적합한 박테리아 필린 또는 필린 일부는 일반적으로, 질서화된 반복성 항원 어레이를 형성하도록 회합할 수 있다.
섬모 및 섬모-유사 구조를 시험관내에서 제조하는 방법은 당분야에 공지되어 있다. 예를 들면, 문헌 (Bullitt et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:12890-12895 (1996))은 이. 콜라이 P-섬모 서브유닛의 시험관내 재구성 (reconstitution)을 설명한다. 또한 문헌 (Eshdat et al., J. Bacteriol. 148:308-314 (1981))은 이. 콜라이의 1형 섬모의 해리 및 섬모의 재구성에 적합한 방법을 설명한다. 간략하게 설명하면, 이들 방법은 다음과 같다. 섬모를 포화된 염화구아니딘 중의 37 ℃에서 인큐베이션하여 해리시킨다. 그 다음 섬모 단백질을 크로마토그래피로 정제한 후 필린 다이머를 5 mM 트리스(히드록시메틸) 아미노메탄 히드로클로라이드 (pH 8.0)에 대해 투석하여 형성한다. 에쉬다트 등(Eshdat et al.)은 또한 필린 다이머가 5 mM MgCl2를 함유하는 5 mM 트리스(히드록시메틸)아미노메탄 (pH 8.0)에 대해 투석시에 재조립되어 섬모를 형성한다는 것도 발견하였다.
또한, 예를 들어 전통적인 유전자 공학 및 단백질 변형법을 사용하여, 항원 또는 항원성 결정인자가 제2 부착 부위를 통해 연결되는 제1 부착 부위를 포함하도록 필린 단백질을 변형할 수 있다. 이와 달리, 항원 또는 항원성 결정인자는 이들 단백질에서 자연적으로 존재하는 아미노산 잔기로 제2 부착 부위를 통해 직접 연결될 수 있다. 그 다음 본 발명의 백신 조성물에 이들 변형된 필린 단백질을 사용할 수 있다.
본 발명의 조성물 및 백신 조성물을 각각 제조하는 데 사용되는 박테리아 필린 단백질은 HBcAg에 대해 여기에 설명된 것과 유사한 방식으로 변형될 수 있다. 에를 들면, 시스테인 및 라이신 잔기가 결실되거나 다른 아미노산 잔기로 치환될 수 있으며, 제1 부착 부위를 이들 단백질에 부가할 수 있다. 또한 필린 단백질은 변형된 형태로 발현되거나 발현 후에 화학적으로 변형될 수 있다. 이와 유사하게 무손상 섬모는 박테리아로부터 수거한 후 화학적으로 변형될 수 있다.
또다른 실시태양에서 섬모 또는 섬모-유사 구조를 박테리아 (예를 들면, 이. 콜라이)로부터 수거하여 본 발명의 조성물 및 백신 조성물을 형성하는 데에 사용한다. 조성물 및 백신 조성물을 제조하는 데에 적합한 섬모의 한 예는 이. 콜라이의 1형 섬모이며, 이는 서열 2에 기재된 아미노산 서열을 갖는 필린 단량체로 형성된다.
박테리아 섬모를 수거하는 많은 방법이 당분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌 (Bullitt and Makowski (Biophys. J. 74:623-632 (1998))은 이. 콜라이로부터 P-섬모를 수거하는 섬모 정제 방법을 설명한다. 이 방법에 따르면, 필리는 P-섬모 플라스미드를 포함하는 과섬모화 (hyperpiliated) 이. 콜라이로부터 잘라서 가용화와 MgCl2 (1.0 M) 침전의 순환에 의하여 정제한다.
섬모 또는 섬모-유사 구조는 일단 수거되면 다양한 방식으로 변형될 수 있다. 예를 들면, 제1 부착 부위가 그 섬모에 부가되어, 여기로 항원 또는 항원성 결정인자가 제2 부착 부위를 통해 부착될 수 있다. 다시 말하면, 박테리아 섬모 또는 섬모-유사 구조는 수거되고 질서화된 반복성 항원 어레이를 형성하도록 변형될 수 있다.
항원 또는 항원성 결정인자는 섬모 또는 섬모-유사 구조에 존재하는 자연발생 시스테인 잔기 또는 라이신 잔기에 연결될 수 있다. 이러한 경우에, 자연발생 아미노산의 높은 질서 및 반복성이 항원 또는 항원성 결정인자로 하여금 섬모 또는 섬모-유사 구조에 커플링되도록 이끌 것이다. 예를 들어, 섬모 또는 섬모-유사 구조는 이종이중관능성 (heterobifunctional) 가교결합제를 사용하여 항원 또는 항원성 결정인자의 제2 부착 부위로 연결될 수 있다.
유기체가 자연적으로 합성하는 구조 (예를 들면 섬모)를 본 발명의 조성물 및 백신 조성물의 제조에 사용하는 경우, 그 유기체가 원하는 특징을 갖는 구조를 생산하도록 그 유기체를 유전적으로 조작하는 것이 종종 유리할 것이다. 예를 들어, 이. 콜라이의 1형 섬모를 사용하는 경우, 이들 섬모를 수거할 이. 콜라이를 특정한 특징을 갖는 구조를 생산하도록 변형할 수 있다. 필린 단백질의 가능한 변형의 예로는 하나 이상의 라이신 잔기의 삽입, 자연적으로 존재하는 라이신 잔기 하 나 이상의 결실 또는 치환, 및 자연적으로 존재하는 시스테인 잔기 하나 이상의 결실 또는 치환 (예를 들면, 서열 2에서 44 및 84번 위치의 시스테인 잔기)이 있다.
또한 추가의 변형이 라이신 잔기 외에 제1 부착 부위 (예를 들면 FOS 또는 JUN 도메인)를 포함하는 발현 생성물을 초래하는 필린 유전자에게 이루어질 수 있다. 물론 적합한 제1 부착 부위는 필린 단백질이 본 발명의 백신 조성물에 사용하기 적합한 섬모 또는 섬모-유사 구조를 형성하지 못하게 막지 않는 것들로 제한되는 것이 일반적일 것이다.
박테리아 세포에서 자연적으로 존재하는 필린 유전자는 생체내에서 변형될 수 있거나 (예를 들면, 상동성 재조합에 의하여) 또는 특정한 특징을 갖는 필린 유전자를 이들 세포에 삽입할 수 있다. 예를 들면, 복제가능한 클로닝 벡터 또는 박테리아 염색체 내로 삽입되는 벡터의 구성성분으로서 필린 유전자를 박테리아 세포 내로 도입할 수 있다. 삽입된 필린 유전자는 또한 발현 조절 제어 서열 (예를 들면 lac 오퍼레이터)로 연결될 수도 있다.
대부분의 경우에 본 발명의 조성물 및 백신 조성물 각각에 사용되는 섬모 또는 섬모-유사 구조는 한 타입의 섬모 서브유닛으로 구성될 것이다. 동일한 서브유닛으로 구성된 섬모 또는 섬모-유사 구조는 이들이 고도로 질서화된 반복성 항원 어레이를 제시하는 구조를 형성하는 것으로 기대되기 때문에 일반적으로 사용될 것이다.
그러나, 본 발명의 조성물은 이종 필린 서브유닛으로 형성된 섬모 또는 섬모-유사 구조를 포함하는 조성물 및 백신 조성물도 포함한다. 섬모 또는 섬모-유사 구조를 형성하는 필린 서브유닛은 박테리아 세포에서 자연적으로 존재하는 유전자로부터 발현될 수 있거나 또는 이들 세포 내로 도입될 수 있다. 자연적으로 존재하는 필린 유전자 및 도입된 유전자가 둘다 섬모 또는 섬모-유사 구조를 형성하는 세포 내에서 발현될 때, 그 결과는 일반적으로, 이들 필린 단백질의 혼합물로부터 형성되는 구조일 것이다. 또한 둘 이상의 필린 유전자가 박테리아 세포에서 발현되는 경우, 전형적으로는, 각 필린 유전자의 상대적 발현이 섬모 또는 섬모-유사 구조에서 상이한 필린 서브유닛의 비율을 결정하는 요인이 될 것이다.
혼합된 필린 서브유닛의 특정한 조성을 갖는 섬모 또는 섬모-유사 구조가 필요한 경우, 필린 유전자 하나 이상의 발현을 이종의 유도성 프로모터에 의하여 조절할 수 있다. 이러한 프로모터뿐만 아니라 다른 유전적 요소도, 박테리아 세포에서 생산되는 상이한 서브유닛들의 상대적 양 및 이에 따른 섬모 또는 섬모-유사 구조의 조성을 조절하는 데에 사용할 수 있다.
이에 더하여, 항원 또는 항원성 결정인자는 박테리아 섬모 또는 섬모-유사 구조에 펩티드 결합이 아닌 결합을 통해 연결될 수 있다. 본 발명의 조성물에 사용되는 섬모 또는 섬모-유사 구조를 생산하는 박테리아 세포는 항원 또는 항원성 결정인자에 융합되는 필린 단백질을 생성하도록 유전적으로 조작될 수 있다. 섬모 또는 섬모-유사 구조를 형성하는 이러한 융합 단백질은 본 발명의 백신 조성물에 사용하기에 적합하다.
바람직한 실시양태에서는 코어 입자가 바이러스-유사 입자이며, 여기서 바이러스-유사 입자는 재조합 바이러스-유사 입자이다. 숙련자라면 재조합 DNA 기술 및 쉽게 입수할 수 있는 바이러스 코딩 서열을 사용하여 VLP를 제조할 수 있다. 예를 들면, 바이러스 엔벨로프 또는 코어 단백질의 코딩 서열은, 조절 서열로 코딩 서열의 기능적 연결을 가능하게 하는 서열의 적절한 변형과 함께, 바이러스 프로모터의 조절적 제어 하에, 시판되는 바큘로바이러스 벡터를 사용하여 바큘로바이러스 발현 벡터 중에 발현을 위하여 조작될 수 있다. 예를 들면, 바이러스 엔벨로프 또는 코어 단백질의 코딩 서열은 박테리아 발현 벡터 중에 발현을 위해 조작될 수도 있다.
VLP의 예로는 B형 간염 바이러스 (Ulrich, et al., Virus Res. 50:141-182 (1998)), 홍역 바이러스 (Warnes, et al., Gene 160:173-178 (1995)), 신드비스 바이러스, 로타바이러스 (미국 특허 제5,071,651호 및 미국 특허 제5,374,426호), 구제역 바이러스 (Twomey, et al., Vaccine 13:1603-1610, (1995)), 노르웍 바이러스 (Jiang, X., et al., Science 250:1580-1583 (1990), Matsui, S.M., et al., J. Clin. Invest. 87:1456-1461 (1991)), 레트로바이러스 GAG 단백질 (WO 96/30523), 레트로트랜스포존 Ty 단백질 p1, B형 간염 바이러스의 표면 단백질 (WO 92/11291), 인간 파필로마 바이러스 (WO 98/15631), RNA 파아지, Ty, fr-파아지, GA-파아지, AP205-파아지 및 Qβ-파아지가 있으나 이것으로 한정되는 것은 아니다.
당분야의 숙련자에게 이해되는 바와 같이, 본 발명의 VLP는 임의의 특정한 형태로 제한되는 것은 아니다. 입자는 화학적으로 합성되거나 자연적이거나 비자연적일 수 있는 생물학적 과정을 통해 합성될 수 있다. 예를 들면, 이런 타입의 실시양태는 바이러스-유사 입자 또는 이들의 재조합 형태를 포함한다.
더 구체적인 실시양태에서는 VLP가 로타바이러스의 재조합 폴리펩티드, 노르웍 바이러스의 재조합 폴리펩티드, 알파바이러스의 재조합 폴리펩티드, 구제역 바이러스의 재조합 폴리펩티드, 홍역 바이러스의 재조합 폴리펩티드, 신드비스 바이러스의 재조합 폴리펩티드, 폴리오마 바이러스의 재조합 폴리펩티드, 레트로바이러스의 재조합 폴리펩티드, B형 간염 바이러스의 재조합 폴리펩티드 (예를 들면 HBcAg), 담배 모자이크 바이러스의 재조합 폴리펩티드, 플록 하우스 바이러스의 재조합 폴리펩티드, 인간 파필로마 바이러스의 재조합 폴리펩티드, 박테리오파아지의 재조합 폴리펩티드, RNA 파아지의 재조합 폴리펩티드, Ty의 재조합 폴리펩티드, fr-파아지의 재조합 폴리펩티드, GA-파아지의 재조합 폴리펩티드 및 Qβ-파아지의 재조합 폴리펩티드 중에서 선택된, 재조합 폴리펩티드 또는 이의 단편을 포함하거나 다르게는 본질적으로 이루어지거나 또는 다르게는 이루어질 수 있다. 바이러스-유사 입자는 추가로 그러한 폴리펩티드의 단편 하나 이상뿐만 아니라 이러한 폴리펩티드의 변이체를 포함하거나 다르게는 본질적으로 이루어지거나 다르게는 이루어질 수 있다. 폴리펩티드의 변이체는 이들의 대응 야생형과 아미노산 수준에서 예를 들면 적어도 80 ％, 85 ％, 90 ％, 95 ％, 97 ％ 또는 99 ％를 공유할 수 있다.
바람직한 실시양태에서 바이러스-유사 입자는 RNA-파아지의 재조합 단백질 또는 이들의 단편을 포함하거나 다르게는 본질적으로 이루어지거나 또는 다르게는 이루어진다. 바람직하게는 RNA-파아지가 a) 박테리오파아지 Qβ, b) 박테리오파아지 R17, c) 박테리오파아지 fr, d) 박테리오파아지 GA, e) 박테리오파아지 SP, f) 박테리오파아지 MS2, g) 박테리오파아지 M11, h) 박테리오파아지 MX1, i) 박테리오 파아지 NL95, k) 박테리오파아지 f2, l) 박테리오파아지 PP7, 및 m) 박테리오파아지 AP205로 이루어진 군에서 선택된다.
본 발명의 또다른 바람직한 실시양태에서는 바이러스-유사 입자는 RNA-박테리오파아지 Qβ 또는 RNA-박테리오파아지 fr, 또는 RNA-박테리오파아지 AP205의 재조합 단백질 또는 이의 단편을 포함하거나 다르게는 본질적으로 이루어지거나 다르게는 이루어진다.
본 발명의 추가로 바람직한 실시양태에서는 재조합 단백질이 RNA 파아지의 코트 단백질을 포함하거나 다르게는 본질적으로 이루어지거나 다르게는 이루어진다.
따라서 캡시드 또는 VLP를 형성하는 RNA-파아지 코트 단백질 또는 캡시드 또는 VLP로 자기 조립할 수 있는 박테리오파아지 코트 단백질의 단편은 본 발명의 추가로 바람직한 실시양태이다. 예를 들면, 박테리오파아지 Qβ 코트 단백질은 이. 콜라이에서 재조합에 의하여 발현될 수 있다. 또한 이러한 발현시 이들 단백질은 동시에 캡시드를 형성한다. 추가로 이들 캡시드는 고유의 반복성 조직을 갖는 구조를 형성한다.
본 발명의 조성물을 제조하는 데에 사용될 수 있는 박테리오파아지 코트 단백질의 구체적인 바람직한 예로는 박테리오파아지 Qβ (서열 4, Qβ CP을 지칭하는 PIR 데이타베이스, 수탁번호 VCBPQβ및 서열 5, Qβ A1 단백질을 지칭하는 수탁번호 AAA16663), 박테리오파아지 R17 (서열 6, PIR 수탁번호 VCBPR7), 박테리오파아지 fr (서열 7, PIR 수탁번호 VCBPFR), 박테리오파아지 GA (서열 8, 진뱅크 수탁번 호 NP-040754), 박테리오파아지 SP (서열 9, SP CP를 지칭하는 진뱅크 수탁번호 CAA30374 및 서열 10, SP A1 단백질을 지칭하는 수탁번호 NP 695026), 박테리오파아지 MS2 (서열 11, PIR 수탁번호 VCBPM2), 박테리오파아지 M11 (서열 12,, 진뱅크 수탁번호 AAC06250), 박테리오파아지 MX1 (서열 13, 진뱅크 수탁번호 AAC14699), 박테리오파아지 NL95 (서열 14, 진뱅크 수탁번호 AAC14704), 박테리오파아지 f2 (서열 15, 진뱅크 수탁번호 P03611), 박테리오파아지 PP7 (서열 16), 및 박테리오파아지 AP205 (서열 28)와 같은 RNA 박테리오파아지의 코트 단백질이 있다. 또한 박테리오파아지 Qβ(서열 5)의 A1 단백질 또는 C-말단에서 100, 150 또는 180 개 정도의 아미노산이 상실된 C-말단 말단절단 형태가 Qβ 코트 단백질의 캡시드 조립에 혼입될 수 있다. 일반적으로, 캡시드 조립물에서 QβCP에 대한 QβA1 단백질의 백분율은 캡시드의 형성을 보장하기 위하여 제한될 것이다.
Qβ 코트 단백질은 또한 이. 콜라이에서 발현될 때 캡시드로 자기조립하는 것으로 발견되었다 (Kozlovska TM. et al., GENE 137: 133-137 (1993)). 얻어진 캡시드 또는 바이러스-유사 입자는 직경이 25 nm이고 T=3 준대칭의 20면체 파이지-유사 캡시드 구조를 나타냈다. 또한, 파아지 Qβ의 결정 구조가 해결되었다. 캡시드는 코트 단백질 180 카피를 포함하며, 이들은 공유적 오량체 및 육량체로 이황화 가교에 의하여 연결되어 (Golmohammadi, R. et al., Structure 4: 543-5554 (1996)) Qβ 코트 단백질의 캡시드의 현저한 안정성을 유도한다. 그러나, 재조합 Qβ 코트 단백질으로 만들어진 캡시드 또는 VLP는 캡시드 내에 다른 서브유닛에 이황화 링크를 통해 연결되지 않거나 또는 불완전하게 연결된 서브유닛을 포함할 수 있다. 그러나 전형적으로는 서브유닛 약 80 ％ 이상이 VLP 내에서 서로 이황화 가교를 통해 연결된다. 따라서 재조합 Qβ캡시드를 비환원성 SDS-PAGE 상에 로딩하면 단량체 Qβ 코트 단백질에 상응하는 밴드뿐만 아니라 Qβ 코트 단백질의 6량체 또는 5량체에 상응하는 밴드도 볼 수 있다. 불완전하게 이황화-연결된 서브유닛은 비환원성 SDS-PAGE에서 2량체, 3량체 또는 심지어 4량체 밴드로서 나타날 수 있었다. Qβ캡시드 단백질은 또한 유기 용매 및 변성제에 대해 보기드문 내성을 나타낸다. 놀랍게도, 본 발명자들은 DMSO 및 아세토니트릴 농도 30 ％ 정도와 구아니디늄 농도 1 M 정도는 캡시드의 안정성에 영향을 주지 않음을 발견하였다. Qβ 코트 단백질의 캡시드의 높은 안정성은 특히, 본 발명에 따른 포유동물 및 인간의 면역화 및 예방접종에 사용하는데 있어서 유리한 측면이다.
문헌 (Stoll, E. et al. J. Biol. Chem. 252:990-993 (1977))에 기재된 바와 같이 N-말단 에드만 서열분석에 의하여 우리가 관찰한 바로는 이. 콜라이에서 발현시에 Qβ 코트 단백질의 N-말단 메티오닌은 제거되는 것이 보통이다. N-말단 메티오닌이 제거되지 않는 Qβ 코트 단백질로 구성된 VLP 또는 N-말단 메티오닌이 절단되거나 존재하는 Qβ 코트 단백질의 혼합물을 포함하는 VLP도 모두 본 발명의 범위 내에 포함된다.
본 발명에 따른, RNA-파아지, 특히 Qβ의 추가로 바람직한 바이러스-유사 입자는 WO 02/056905에 기재되어 있으며, 그 공개 내용은 언급함으로써 그 전체가 본원에 도입된다.
추가로 RNA 파아지 코트 단백질은 박테리아 숙주에서 발현시에 자기조립되는 것으로 밝혀졌다 (Kastelein, RA. et al., Gene 23: 245-254 (1983), Kozlovskaya, TM. et al., Dokl. Akad. Nauk SSSR 287: 452-455 (1986), Adhin, MR. et al., Virology 170: 238-242 (1989), Ni, CZ., et al., Protein Sci. 5: 2485-2493 (1996), Priano, C. et al., J. Mol. Biol. 249: 283-297 (1995)). Qβ파아지 캡시드는 코트 단백질 외에 소위 연속판독 (read-through) 단백질 A1 및 성숙 단백질 A2를 포함한다. A1은 UGA 정지 코돈에서 억제되어 생성되며 길이가 329 aa이다. 본 발명에 사용되는 파아지 Qβ재조합 코트 단백질의 캡시드는 A2 용균 단백질이 없고 숙주로부터의 RNA를 포함한다. RNA 파아지의 코트 단백질은 RNA 결합 단백질이며, 바이러스의 생존주기 동안 번역 리프레서로서 작용하는 복제효소 유전자의 리보솜 결합 부위의 스템 루프와 상호작용한다. 이 상호작용의 서열 및 구조적 요소는 공지되어 있다 (Witherell, GW. ＆ Uhlenbeck, OC. Biochemistry 28: 71-76 (1989), Lim F. et al., J. Biol. Chem. 271: 31839-31845 (1996)). 스템 루프 및 RNA는 일반적으로 바이러스 조립에 관여하는 것으로 알려져 있다 (Golmohammadi, R. et al., Structure 4: 543-5554 (1996)).
본 발명의 추가의 바람직한 실시양태에서는 바이러스-유사 입자는 RNA 파아지의 재조합 단백질 또는 이의 단편을 포함하거나 다르게는 본질적으로 이루어지거나 다르게는 이루지되, 여기서 재조합 단백질은 RNA 파아지의 돌연변이 코트 단백질, 바람직하게는 상기 언급된 RNA 파아지의 돌연변이 코트 단백질을 포함하거나 다르게는 본질적으로 이루어지거나 다르게는 이루어지는 것이다. 또다른 바람직한 실시양태에서 RNA 파아지의 돌연변이 코트 단백질은 하나 이상, 다르게는 둘 이상 의 라이신 잔기가 치환에 의하여 제거되거나 또는 하나 이상의 라이신 잔기가 치환에 의하여 부가되어 변형된 것이며, 이와 다르게는 RNA 파아지의 돌연변이 코트 단백질은 하나 이상, 다르게는 둘 이상의 라이신 잔기가 결실되거나 하나 이상의 라이신 잔기가 삽입에 의하여 부가되어 변형된 것이다. 하나 이상의 라이신 잔기의 결실, 치환 또는 부가는 커플링 정도, 즉 RNA 파아지의 VLP의 서브유닛 당 Aβ1-6 펩티드의 양을 변화시켜서 백신의 요구사항과 조화를 이루고 그에 맞출 수 있다.
또다른 바람직한 실시양태에서 바이러스-유사 입자는 RNA-박테리오파아지 Qβ의 재조합 단백질 또는 이들의 단편을 포함하거나 다르게는 본질적으로 이루어지거나 다르게는 이루어지되, 여기서 재조합 단백질은 서열 4의 아미노산을 갖는 코트 단백질 또는 서열 4 및 서열 5의 아미노산 서열을 갖는 코트 단백질들의 혼합물, 또는 서열 5의 돌연변이를 포함하거나 다르게는 본질적으로 이루어지거나 다르게는 이루어지며, N-말단 메티오닌은 절단되는 것이 바람직하다.
본 발명의 추가로 바람직한 실시양태에서 바이러스-유사 입자는 Qβ의 재조합 단백질 또는 이들의 단편을 포함하거나 다르게는 본질적으로 이루어지거나 다르게는 이루어지되, 여기서 재조합 단백질은 돌연변이 Qβ 코트 단백질을 포함하거나 다르게는 본질적으로 이루어지거나 다르게는 이루어진다. 또다른 바람직한 실시양태에서 이들 돌연변이 코트 단백질은 하나 이상의 라이신 잔기가 치환에 의하여 제거되거나 또는 하나 이상의 라이신 잔기가 치환에 의하여 부가되어 변형된 것이다. 이와 다르게는 이들 돌연변이 코트 단백질은 하나 이상의 라이신 잔기가 결실되거나 하나 이상의 라이신 잔기가 삽입에 의하여 부가되어 변형된 것이다.
4 개의 라이신 잔기가 Qβ 코트 단백질의 캡시드 표면에 노출된다. 노출된 라이신 잔기가 아르기닌에 의하여 대체된 Qβ돌연변이도 본 발명에 사용할 수 있다. 따라서 다음의 Qβ 코트 단백질 돌연변이 및 돌연변이 QβVLP는 본 발명의 실시에 사용될 수 있다: "Qβ-240" (Lys 13-Arg; 서열 17), "Qβ-243" (Asn 10-Lys; 서열 18), "Qβ-250" (Lys 2-Arg, Lys 13-Arg; 서열 19), "Qβ-251" (서열 20) 및 "Qβ-259" (Lys 2-Arg, Lys16-Arg; 서열 21). 따라서 본 발명의 추가의 바람직한 실시양태에서는 바이러스-유사 입자는, (a) 서열 17의 아미노산 서열, (b) 서열 18의 아미노산 서열, (c) 서열 19의 아미노산 서열, (d) 서열 20의 아미노산 서열, 및 (e) 서열 21의 아미노산 서열의 군에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 단백질을 포함하는, 돌연변이 Qβ 코트 단백질의 재조합 단백질을 포함하거나 다르게는 본질적으로 이루어지거나 다르게는 이루어진다. 상기 지적된 Qβ 코트 단백질, 돌연변이 Qβ 코트 단백질 VLP 및 캡시드의 제작, 발현 및 정제는 각기 WO 02/056905에 기재되어 있다. 특히 상기 언급된 출원의 실시예 18을 참조한다.
본 발명의 추가로 바람직한 실시양태에서 바이러스-유사 입자는 Qβ의 재조합 단백질 또는 이의 단편을 포함하거나 다르게는 본질적으로 이루어지거나 다르게는 이루어지되, 여기서 재조합 단백질은 상기 Qβ돌연변이 및 상응하는 A1 단백질 중 하나의 혼합물을 포함하거나 다르게는 본질적으로 이루어지거나 다르게는 이루어진다.
본 발명의 추가로 바람직한 실시양태에서는 바이러스-유사 입자가 RNA-파아지 AP205의 재조합 단백질 또는 이들의 단편을 포함하거나 다르게는 본질적으로 이 루어지거나 다르게는 이루어진다.
AP205 게놈은 성숙화 단백질, 코트 단백질, 복제효소 및 관련 파아지에는 존재하지 않는 두 개의 오픈 리딩 프레임; 용균 유전자, 및 성숙화 유전자의 번역에서 기능하는 오픈 리딩 프레임으로 이루어진다 (Klovins,J., et al., J. Gen. Virol. 83: 1523-33 (2002)). AP205 코트 단백질은 pQb10의 유도체 (Kozlovska, T. M.. et al., Gene 137:133-37 (1993))이며 AP205 리보솜 결합 부위를 포함하는 플라스미드 pAP283-58 (서열 27)로부터 발현될 수 있다. 이와 다르게는 AP205 코트 단백질은 벡터 내에 존재하는 리보솜 결합 부위의 하류에서 pQb185 내로 클로닝될 수 있다. 두 접근법 모두, 제목이 분자 항원 어레이 (Molecular Antigen Array) (대리인 관리번호 1700.0310000)이고 2002년 7월 17일에 출원된 동시계류 중인 미국 가특허출원 (언급됨으로써 그 전체가 본원에 도입됨)에 기재된 바와 같이, 단백질의 발현 및 캡시드의 형성을 가져온다. 벡터 pQb10 및 pQ185는 pGEM 벡터로부터 유래된 벡터이며, 이들 벡터 중의 클로닝된 유전자의 발현은 trp 프로모터에 의하여 제거된다 (Kozlovska, T. M. et al., Gene 137:133-37 (1993)). 플라스미드 pAP283-58 (서열 27)은 다음 서열에서, XbaI 부위의 하류이고 AP205 코트 단백질의 ATG 개시 코돈의 바로 상류인 추정적 AP205 리보솜 결합 부위를 포함한다: tctagaATTTTCTGCGCACCCAT CCCGGGTGGCGCCCAAAGTGAGGAAAATCACatg (서열 57). 벡터 pQb185는 XbaI 부위의 하류와 개시 코돈의 상류에 샤인 델라가르노 서열을 포함한다 (tctagaTTAACCCAACGCGTAGGAG TCAGGCCatg (서열 58), 밑줄 그은 부분이 샤인 델라가르노 서열).
본 발명의 추가로 바람직한 실시양태에서 바이러스-유사 입자는 RNA-파아지 AP205의 재조합 코트 단백질 또는 이들의 단편을 포함하거나 다르게는 본질적으로 이루어지거나 다르게는 이루어진다.
본 발명의 바람직한 실시양태에서는 캡시드를 형성하는 AP205 코트 단백질을 포함한다. 이러한 단백질은 천연 공급원으로부터 재조합에 의하여 발현되거나 제조된다. 박테리아에서 생산되는 AP205 코트 단백질은 전자현미경 (EM) 및 면역분산에 의해 입증된 바와 같이, 동시에 캡시드를 형성한다. AP205 코트 단백질 (서열 28)에 의하여 형성된 캡시드 및 AP205 RNA 파아지의 코트 단백질에 의하여 형성된 것들의 구조적 성질은 EM으로 볼 때 거의 구별되지 않는다. AP205 VLP는 고도로 면역원성이며 항원 및(또는) 항원성 결정인자와 연결되어, 반복식으로 배향된 항원 및(또는) 항원성 결정인자를 드러내는 백신 구조물을 생성할 수 있다. 이렇게 드러난 항원에 대하여는 높은 역가가 유발되는데 이는 결합된 항원 및(또는) 항원성 결정인자가 항체 분자와 상호작용하기에 접근가능하며 면역원성임을 보여준다.
본 발명의 추가의 바람직한 실시양태에서는 바이러스-유사 입자가 RNA-파아지 AP205의 재조합 돌연변이 코트 단백질 또는 이들의 단편을 포함하거나 다르게는 본질적으로 이루어지거나 다르게는 이루어진다.
아미노산 5의 프롤린을 트레오닌으로 치환한 AP205 코트 단백질을 포함하는 AP205 VLP의 조립 능력있는 돌연변이 형태는 본 발명의 실시에 사용될 수도 있으며 본 발명의 추가로 바람직한 실시양태를 가져온다. 이들 VLP, 천연 공급원으로부터 유래된 AP205 VLP, 또는 AP205 바이러스 입자는 항원에 결합하여 본 발명에 따른 질서화된 반복성 항원 어레이를 생산할 수 있다.
AP205 P5-T 돌연변이 코트 단백질은 pQb185로부터 직접 유래되며 Qβ 코트 단백질 유전자 대신에 돌연변이 AP205 코트 단백질 유전자를 포함하는 플라스미드 pAP281-32 (서열 30)으로부터 발현될 수 있다. AP205 코트 단백질의 발현을 위한 벡터를 AP205 코트 단백질의 발현을 위해 이. 콜라이 내로 형질감염시킨다.
VLP 내로 자기조립을 가져오는 코트 단백질 및 돌연변이 코트 단백질 각각의 발현 방법은 실시예 1에서 설명한다. 적합한 이. 콜라이 균주로는 이. 콜라이 K802, JM 109, RR1이 있으나 이것으로 한정되지는 않는다. 적합한 벡터 및 균주 및 이들의 조합은 SDS-PAGE를 통해서 코트 단백질 및 돌연변이 코트 단백질 각각의 발현을, 그리고 임의로는 우선 겔 여과를 통해 캡시드를 정제한 후 이들을 면역분산 분석법 (Ouchterlony 시험) 또는 전자현미경으로 시험함으로써 캡시드 형성 및 조립을 시험함으로써 확인할 수 있다 (Kozlovska, T. M.. et al., Gene 137:133-37 (1993)).
벡터 pAP283-58 및 pAP281-32로부터 발현된 AP205 코트 단백질은 이. 콜라이의 세포질에서의 프로세싱으로 인해 처음 메티오닌 아미노산이 없다. AP205 VLP의 절단된 형태, 미절단 형태 또는 이들의 혼합물이 본 발명의 추가의 바람직한 실시양태이다.
본 발명의 추가의 바람직한 실시양태에서 바이러스-유사 입자는, RNA-파아지 AP205의 재조합 코트 단백질 또는 이들의 단편과 RNA 파아지 AP205의 재조합 돌연 변이 코트 단백질 또는 이들의 단편과의 혼합물을 포함하거나 다르게는 본질적으로 이루어지거나 다르게는 이루어진다.
본 발명의 추가의 바람직한 실시양태에서는 바이러스-유사 입자는 RNA-파아지 AP205의 재조합 코트 단백질 또는 재조합 돌연변이 코트 단백질의 단편을 포함하거나 다르게는 본질적으로 이루어지거나 다르게는 이루어진다.
VLP 및 캡시드 각각으로 조립될 수 있는 재조합 AP205 코트 단백질 단편도 역시 본 발명의 실시에 있어서 유용하다. 이들 단편들은 코트 단백질 및 돌연변이 코트 단백질 각각의 내부 또는 말단에서 결실에 의하여 생성될 수 있다. 코트 단백질 및 돌연변이 코트 단백질 서열에서의 삽입 또는 코트 단백질 및 돌연변이 코트 단백질 서열로의 항원 서열의 융합은 VLP로 조립될 수 있는 것이라면 본 발명의 추가의 실시양태이며 키메라 AP205 코트 단백질 및 입자를 각기 가져온다. 코트 단백질 서열로의 삽입, 결실 및 융합의 성과 및 이들이 VLP로 조립될 수 있는지는 전자현미경으로 결정할 수 있다.
AP205 코트 단백질, 코트 단백질 단편 및 상기한 키메라 코트 단백질에 의하여 형성된 입자는 침전에 의한 분획화 단계와 세파로오스 CL-4B, 세파로오스 CL-2B, 세파로오스 CL-6B 컬럼 및 이들의 조합 등을 사용하는 겔 여과에 의한 정제 단계의 조합에 의하여 순수한 형태로 단리될 수 있다. 바이러스-유사 입자를 단리하는 다른 방법은 당분야에 공지되어 있으며 박테리오파아지 AP205의 바이러스-유사 입자 (VLP)를 단리하는 데에 사용할 수 있다. 예를 들면, 효모 레트로트랜스포존 Ty의 VLP를 단리하는 데에 초원심분리를 사용하는 것이 미국 특허 제4,918,166호 ( 언급됨으로써 그 전체가 본원에 도입됨)에 기재되어 있다.
여러 RNA 박테리오파아지의 결정 구조가 결정되어 있다 (Golmohammadi, R. et al., Structure 4:543-554 (1996)). 이러한 정보를 사용하여, 표면 노출된 잔기를 확인할 수 있으므로, RNA-파아지 코트 단백질은 삽입 또는 치환을 통해 하나 이상의 반응성 아미노산 잔기가 삽입될 수 있도록 변형될 수 있다. 결과적으로, 박테리오파아지 코트 단백질의 이들 변형된 형태도 본 발명에 사용될 수 있다. 따라서 캡시드 또는 캡시드-유사 구조를 형성하는 단백질의 변이체 (예를 들면, 박테리오파아지 Qβ, 박테리오파아지 R17, 박테리오파아지 fr, 박테리오파아지 GA, 박테리오파아지 SP, 박테리오파아지 AP205, 및 박테리오파아지 MS2의 코트 단백질)도 본 발명의 조성물을 제조하는 데에 사용할 수 있다.
상기 논의된 변이체 단백질의 서열이 이들의 대응 야생형과는 다르겠지만, 이들 변이체 단백질은 캡시드 또는 캡시드-유사 구조를 형성할 수 있는 능력을 일반적으로 보유할 것이다. 따라서 본 발명은 추가로 캡시드 또는 캡시드-유사 구조를 형성하는 단백질의 변이체를 더 포함하는 조성물 및 백신 조성물 각각 뿐만 아니라 이러한 조성물 및 백신 조성물 각각의 제조 방법, 이러한 조성물을 제조하는 데 사용되는 개별 단백질 서브유닛, 및 이들 단백질 서브유닛을 코딩하는 핵산 분자도 포함한다. 따라서 캡시드 또는 캡시드-유사 구조를 형성하며 회합하여 캡시드 또는 캡시드-유사 구조를 형성할 수 있는 능력을 보유한 야생형 단백질의 변이체 형태가 본 발명의 범위에 포함된다.
결과적으로 본 발명은, 질서화된 어레이를 형성하며 고유의 반복적 구조를 각기 갖는 야생형 단백질과 적어도 80 ％, 85 ％, 90 ％, 95 ％, 97 ％ 또는 99 ％ 동일한 아미노산 서열을 포함하거나 다르게는 본질적으로 이루어지거나 다르게는 이루어지는 단백질을 각기 포함하는 조성물 및 백신 조성물을 포함한다.
본 발명의 범위 내에는 본 발명의 조성물을 제조하는 데에 사용되는 단백질을 코딩하는 핵산 분자도 포함된다.
다른 실시양태에서 본 발명은 추가로, 서열 4-21에 나타낸 아미노산 서열 중 어느 하나와 적어도 80 ％, 85 ％, 90 ％, 95 ％, 97 ％ 또는 99 ％ 동일한 아미노산 서열을 포함하거나 다르게는 본질적으로 이루어지거나 다르게는 이루어진 단백질을 포함하는 조성물을 포함한다.
본 발명에 사용하기에 적합한 단백질로는 또한, 캡시드 또는 캡시드-유사 구조, 또는 VLP를 형성하는 단백질의 C-말단 말단절단 돌연변이체가 있다. 이러한 말단절단 돌연변이체의 구체적인 예로는 1, 2, 5, 7, 9, 10, 12, 14, 15, 또는 17 아미노산이 C-말단에서 제거된, 서열 4 내지 41 중 어느 것에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 단백질이 있다. 전형적으로는 이들 C-말단 말단절단 돌연변이체는 캡시드 또는 캡시드-유사 구조를 형성하는 능력을 보유할 것이다.
본 발명에서 사용하기에 적합한 추가의 단백질로는 또한, 캡시드 또는 캡시드-유사 구조를 형성하는 단백질의 N-말단 말단절단 돌연변이체가 있다. 이러한 말단절단 돌연변이체의 구체적인 예로는 1, 2, 5, 7, 9, 10, 12, 14, 15, 또는 17 아미노산이 N-말단에서 제거된 서열 4-21 중 어느 하나에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 단백질이 있다. 전형적으로는 이들 N-말단 말단절단 돌연변이체는 캡시드 또 는 캡시드-유사 구조를 형성하는 능력을 보유할 것이다.
본 발명에 사용하기에 적합한 추가의 단백질로는 캡시드 또는 캡시드-유사 구조를 형성하는 N- 및 C-말단 말단절단 돌연변이체가 있다. 적합한 말단절단 돌연변이체로는 1, 2, 5, 7, 9, 10, 12, 14, 15, 또는 17 아미노산이 N-말단에서 제거되고 1, 2, 5, 7, 9, 10, 12, 14, 15, 또는 17 아미노산이 C-말단에서 제거된 서열 4-21 중 어느 하나에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 단백질이 있다. 전형적으로는 이들 N-말단 및 C-말단 말단절단 돌연변이체는 캡시드 또는 캡시드-유사 구조를 형성하는 능력을 보유할 것이다.
본 발명은 추가로, 상기한 말단절단 돌연변이체와 적어도 80 ％, 85 ％, 90 ％, 95 ％, 97 ％ 또는 99 ％ 동일한 아미노산 서열을 포함하거나 다르게는 본질적으로 이루어지거나 다르게는 이루어진 단백질을 포함하는 조성물을 포함한다.
따라서 본 발명은 추가로 캡시드 또는 VLP를 형성하는 단백질로 제조된 조성물 및 백신 조성물, 개별 단백질 서브유닛 및 VLP 또는 캡시드로부터 이러한 조성물을 제조하는 방법, 이들 개별 단백질 서브유닛을 제조하는 방법, 이들 서브유닛을 코딩하는 핵산 분자, 및 본 발명의 이들 조성물을 사용하여 예방접종하고(거나) 개인에게서 면역반응을 유발하는 방법도 포함한다.
이미 언급한 바와 같이, 본 발명은 바이러스-유사 입자 또는 이들의 재조합 형태를 포함한다. 하나의 추가의 바람직한 실시양태에서는 본 발명의 조성물에 사용되는 입자가 B형 간염 단백질 (HBcAg) 또는 HBcAg의 단편으로 구성된다. 추가의 실시양태에서, 본 발명의 조성물에 사용되는 입자는, 유리 시스테인 잔기의 수를 제거하거나 감소시키도록 변형된 B형 간염 코어 단백질 (HBcAg) 또는 HBcAg 단백질의 단편으로 구성된다. 문헌 (Zhou et al. J. Virol. 66:5393-5398 (1992))에서는 자연적으로 존재하는 시스테인 잔기를 제거하도록 변형된 HBcAg은 캡시드를 회합하여 형성하는 능력을 보유함이 입증되었다. 따라서 본 발명의 조성물에 사용하기에 적합한 VLP는, 자연적으로 존재하는 시스테인 잔기 중 하나 이상이 결실되거나 또다른 아미노산 잔기 (예를 들면, 세린 잔기)로 치환된 변형된 HBcAg 또는 이들의 단편을 포함하는 것들이 있다.
HBcAg는 B형 간염 코어 항원 전구체 단백질의 프로세싱에 의하여 생성된 단백질이다. HBcAg의 많은 이소형이 밝혀졌으며, 이들의 아미노산 서열은 당분야의 숙련자가 쉽게 입수할 수 있다. 대부분의 경우에 본 발명의 조성물 및 백신 조성물은 HBcAg의 프로세싱된 형태를 사용하여 제조될 것이다 (즉, B형 간염 코어 항원 전구체 단백질의 N-말단 리더 서열이 제거된 HBcAg).
또한, 프로세싱이 발생하지 않을 조건하에서 HBcAg이 생성될 때, HBcAg는 일반적으로 "프로세싱된" 형태로 발현될 것이다. 예를 들면, 단백질의 발현을 세포질로 지시하는 이. 콜라이 발현계를 사용하여 본 발명의 HBcAg을 제조한 때, 이들 단백질은 일반적으로 B형 간염 코어 항원 전구체의 N-말단 리더 서열이 존재하지 않도록 발현될 것이다.
본 발명에 사용할 수 있는, B형 간염 바이러스-유사 입자의 제조법은 WO 00/32227 및 이로써, 특히 실시예 17 내지 19 및 21 내지 24에서뿐만 아니라 WO 01/85208 및 이로써, 특히 실시예 17 내지 19 및 21 내지 24, 31 및 41, 및 WO 02/056905에 공개되어 있다. 이들 문서들은 모두 언급됨으로써 여기에 명백하게 혼입된다.
본 발명은 하나 이상의 추가의 시스테인 잔기가 결실되거나 치환되도록 변형한 HBcAg 변이체를 포함한다. 유리 시스테인 잔기는 많은 화학적 부반응에 관여할 수 있음이 당분야에 공지되어 있다. 이들 부반응으로는 이황화 교환, 예를 들어 다른 물질과 병용치료에서 주사되거나 형성된 화학적 물질 또는 대사산물과의 반응, 또는 UV광에 노출되었을 때 뉴클레오티드와의 반응 및 직접 산화가 있다. 따라서 특히 HBcAg가 핵산을 결합하는 강한 경향이 있다는 사실을 감안할 때 독성 부가물이 생성될 수 있다. 따라서 독성 부가물은, 개별적으로 각기 저농도로 존재할 수 있으나 함께일 때는 독성 수준에 도달할 수 있는 가지각색의 종류들 사이에 분포할 것이다.
위의 관점에서 자연적으로 존재하는 시스테인 잔기가 제거되도록 변형된 HBcAg를 백신 조성물에 사용하는 하나의 이점은 항원 또는 항원 결정인자가 부착할 때 독성 종류가 결합할 수 있는 부위가 수적으로 감소하거나 일괄하여 제거될 것이라는 점이다.
본 발명의 실시에 사용하기에 적합한 많은 자연발생 HBcAg 변이체가 확인되었다. 문헌 (Yuan et al., J. Virol. 73:10122-10128 (1999))은 예를 들면, 서열 22에서 97번 위치에 상응하는 위치의 이소루이신 잔기가 루이신 잔기 또는 페닐알라닌 잔기 중 하나로 대체된 변이체를 설명한다. 많은 HBcAg 변이체 뿐만 아니라각종 B형 간염 코어 항원 전구체 변이체의 아미노산 서열은 진뱅크 리포트 AAF121240, AF121239, X85297, X02496, X85305, X85303, AF151735, X85259, X85286, X85260, X85317, X85298, AF043593, M20706, X85295, X80925, X85284, X85275, X72702, X85291, X65258, X85302, M32138, X85293, X85315, U95551, X85256, X85316, X85296, AB033559, X59795, X85299, X85307, X65257, X85311, X85301 (서열 23), X85314, X85287, X85272, X85319, AB010289, X85285, AB010289, AF121242, M90520 (서열 24), P03153, AF110999, 및 M95589 (이들 각각의 공개 내용은 언급에 의하여 본원에 도입됨)에 공개되어 있다. 상기 언급된 B형 간염 코어 항원 전구체 변이체의 서열은 WO 01/85208에 서열 89 - 138에 추가로 공개된다. 이들 HBcAg 변이체는 서열 25에서 12, 13, 21, 22, 24, 29, 32, 33, 35, 38, 40, 42, 44, 45, 49, 51, 57, 58, 59, 64, 66, 67, 69, 74, 77, 80, 81, 87, 92, 93, 97, 98, 100, 103, 105, 106, 109, 113, 116, 121, 126, 130, 133, 135, 141, 147, 149, 157, 176, 178, 182 및 183번에 위치하는 아미노산 잔기에 상응하는 아미노산 서열을 비롯하여 많은 위치에서 아미노산 서열에 차이가 있다. 본 발명의 조성물에 사용하기에 적합하고 본 명세서의 공개내용에 따라 더 변형될 수 있는 추가의 HBcAg 변이체가 WO 00/198333, WO 00/177158 및 WO 00/214478에 기재되어 있다.
상기한 바와 같이, 유전적으로 프로세싱된 HBcAg (즉, 리더 서열이 결여된 것들)가 본 발명의 조성물 및 백신 조성물 각각에 사용될 것이다. 본 발명은 상기한 변이체 HBcAg를 사용하는, 백신 조성물 뿐만 아니라 이들 조성물을 사용하는 방법을 포함한다.
폴리펩티드의 아미노산 서열이 상기 야생형 아미노산 서열 중 하나 또는 이 의 일부와 적어도 80 ％, 85 ％, 90 ％, 95 ％, 97 ％ 또는 99 ％ 동일한 아미노산 서열을 갖는지는 베스트핏 (Bestfit) 프로그램과 같은 공지된 컴퓨터 프로그램을 사용하여 통상적으로 결정될 수 있다. 베스트핏 또는 임의의 다른 서열배열 프로그램을 사용하여 특정 서열이 기준 아미노산 서열과 예를 들어 95 ％ 동일한지를 결정하려고 할 때는 동일성 백분율이 기준 아미노산 서열의 전체 길이에 걸쳐 계산되고 기준 서열에서 아미노산 잔기의 총수의 최대 5 ％의 상동성 차이가 허용되게 매개변수를 설정한다.
상기 언급된 HBcAg 변이체 및 전구체의 아미노산 서열은 비교적 서로 유사하다. 따라서 서열 25의 특정한 위치에 상응하는 위치에 위치하는 HBcAg의 아미노산 잔기를 지칭하는 것은 서열 25에 나타난 아미노산 서열에서 그 위치에 존재하는 아미노산 잔기를 가리킨다. 이들 HBcAg 변이체 간의 상동성은 대부분 포유동물을 감염시키는 B형 간염 바이러스 사이에서 충분히 높아서 당분야의 숙련자라면 서열 25에 나타낸 아미노산 서열과 특정한 HBcAg 변이체의 아미노산 서열 둘다를 검토하여 상응하는 "아미노산 잔기"를 밝혀내는 데에 거의 어려움을 격지 않을 것이다. 또한, 우드척 (woodchuck)을 감염시키는 바이러스로부터 유래한 HBcAg의 아미노산 서열을 보여주는 서열 24에 나타낸 HBcAg 아미노산 서열은 서열 25에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 HBcAg과의 상동성이 충분하여, 3 개의 아미노산 잔기 삽입부가 서열 25의 아미노산 잔기 155와 156 사이에서 서열 25에 존재한다는 것이 쉽게 분명해진다.
본 발명은 또한 조류를 감염시키는 B형 간염 바이러스의 HBcAg 변이체를 포 함하는 백신 조성물 뿐만 아니라 이들 HBcAg 변이체의 단편을 포함하는 백신 조성물도 포함한다. 이들 HBcAg 변이체의 경우 이들 폴리펩티드에 자연적으로 존재하는 시스테인 잔기 하나, 둘, 셋 또는 그 이상이 본 발명의 백신 조성물 중에 이들을 포함시키기 전에 다른 아미노산 잔기로 치환되거나 결실될 수 있다.
상기한 바와 같이, 유리 시스테인 잔기를 제거하면 독성 성분이 HBcAg에 결합할 수 있는 부위의 수를 감소시켜서 동일한 또는 이웃한 HBcAg 분자의 라이신과 시스테인 잔기의 가교결합이 발생할 수 있는 부위를 제거한다. 따라서 본 발명의 또다른 실시양태에서는 B형 간염 바이러스 캡시드 단백질의 시스테인 잔기 하나 이상이 결실되거나 또는 다른 아미노산 잔기로 치환된다.
다른 실시양태에서는 본 발명의 조성물 및 백신 조성물 각각이 C-말단 영역 (예를 들면, 서열 25의 아미노산 잔기 145-185 또는 150 - 185)이 제거된 HBcAg을 함유할 것이다. 따라서 본 발명의 실시에 사용하기에 적합한 추가의 변형된 HBcAg로는 C-말단 말단절단 돌연변이체가 있다. 적합한 말단절단 돌연변이체에는 C-말단에서 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 34, 35 아미노산이 제거된 HBcAg가 있다.
본 발명의 실시에 사용하기에 적합한 HBcAg로는 또한 N-말단 말단절단 돌연변이체가 있다. 적합한 말단절단 돌연변이체로는 N-말단에서 1, 2, 5, 7, 9, 10, 12, 14, 15, 또는 17 아미노산이 제거된 변형된 HBcAg이 있다.
본 발명의 실시에 사용하기에 적합한 추가의 HBcAg로는 또한 N-말단 말단절단 돌연변이체가 있다. 적합한 말단절단 돌연변이체로는 N-말단에서 1, 2, 5, 7, 9, 10, 12, 14, 15, 또는 17 아미노산이 제거되고 C-말단에서 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 34, 35 아미노산이 제거된 변형된 HBcAg이 있다.
본 발명은 또한 상기한 말단절단 돌연변이체와 적어도 80 ％, 85 ％, 90 ％, 95 ％, 97 ％ 또는 99 ％ 동일한 아미노산 서열을 포함하거나 다르게는 본질적으로 이루어지거나 다르게는 이루어지는 HBcAg 폴리펩티드를 각기 포함하는 조성물 및 백신 조성물을 포함한다.
본 발명의 특정한 실시양태에서는 라이신 잔기를 HBcAg 폴리펩티드 내로 도입하여 HBcAg의 VLP에 Aβ1-6 펩티드의 결합을 조절할 수 있다. 바람직한 실시양태에서는, 79 및 80번 위치에 상응하는 아미노산을 Gly-Gly-Lys-Gly-Gly (서열 33)의 아미노산 서열을 갖는 펩티드로 대체하여 서열 26에 나타낸 서열을 갖는 HBcAg 폴리펩티드가 생성되도록 변형된, 서열 25의 아미노산 1-144, 또는 1-149, 1-185를 포함하거나 다르게는 본질적으로 이루어지는 HBcAg를 사용하여 본 발명의 조성물을 제조한다. 이들 조성물은 항원성 결정인자가 HBcAg의 VLP에 커플링된 이들 실시양태에 특히 유용하다. 추가의 바람직한 실시양태에서는, 서열 25의 48 및 107번 위치의 시스테인 잔기를 세린으로 돌연변이시킨다. 본 발명은 추가로, 상기한 아미노산 변이도 갖는 상기한 B형 간염 코어 항원 전구체 변이체 중 어느 하나에서 나타나는 아미노산 서열을 갖는 상응하는 폴리펩티드를 포함하는 조성물을 포함한다. 또한 본 발명의 범위에는 회합하여 캡시드 또는 VLP를 형성할 수 있으며 상기한 아미노산 변이를 가지는 추가의 HBcAg 변이체가 포함된다. 따라서 본 발명은 또한 적절한 경우에는 프로세싱되어 N-말단 리더 서열이 제거되고 상기한 변이를 갖도록 변형된 이들 단백질을 형성하며 야생형 아미노산 서열 중 어느 하나와 적어도 80 ％, 85 ％, 90 ％, 95 ％, 97 ％ 또는 99 ％ 동일한 아미노산 서열을 포함하거나 다르게는 본질적으로 이루어지는 HBcAg 폴리펩티드를 각기 포함하는 조성물 및 백신 조성물을 포함한다.
본 발명의 조성물 또는 백신 조성물은 상이한 HBcAg의 혼합물을 포함할 수 있다. 따라서 이들 백신 조성물은 아미노산 서열에서 차이가 있는 HBcAg로 구성될 수 있다. 예를 들면, 하나 이상의 아미노산 잔기가 변이된 (예를 들면, 결실, 삽입 또는 치환된) "야생형" HBcAg 및 변형된 HBcAg를 포함하는 백신 조성물이 제조될 수 있다. 또한 본 발명의 바람직한 백신 조성물은 항원이 Aβ1-6 펩티드인 고도로 질서화된 반복성 항원 어레이를 제시하는 것들이다.
본 발명의 추가의 바람직한 실시양태에서는 하나 이상의 Aβ1-6 펩티드가 상기 바이러스-유사 입자 및 코어 입자 각각에 하나 이상의 공유결합을 통하여 결합된다. 바람직하게는 하나 이상의 Aβ1-6 펩티드가 하나 이상의 공유결합을 통하여 바이러스-유사 입자 및 코어 입자 각각에 결합하되, 여기서 공유결합은 Aβ1-6 펩티드 어레이 및 Aβ1-6 펩티드-VLP 접합물을 각기 생성하는 비-펩티드 결합이다. 하나 이상의 Aβ1-6 펩티드가 배향식으로 VLP 및 코어 입자 각각에 결합되기 때문에, 이 Aβ1-6 펩티드 어레이 및 접합물은 각기 전형적으로 바람직하게는 반복적인 질서화된 구조를 갖는다. 반복적인 질서화된 Aβ1-6 펩티드-VLP 어레이 및 접합물의 형성은 각기, 이하에서 명백하게 되는 바와 같이, 하나 이상의 Aβ1-6 펩티드가 VLP 및 코어 입자 각각에 배향되고 지정되었을 뿐만 아니라 정의된 결합 및 부착을 각각 함으로써 보장된다. 또한, VLP 및 코어 입자 각각의 전형적인 고유의 고도로 반복적이고 조직된 구조는 유리하게는 고도로 질서화된 반복적 방식으로의 Aβ1-6 펩티드의 진열에 기여하여 고도로 조직된 반복성 Aβ1-6 펩티드-VLP 어레이 및 접합물 각각을 생성한다.
따라서 바람직한 본 발명의 접합물 및 어레이는 각각 이들의 고도로 조직화된 구조, 치수 및 어레이 표면상의 항원의 반복성이라는 점에서 종래 기술의 접합물과 상이하다. 본 발명의 바람직한 실시양태는 또한, VLP의 적절한 폴딩 및 조립을 보장하는 발현 숙주에서 입자의 발현을 가능하게 하고, 그 후에 그 VLP에 항원 즉 Aβ1-6 펩티드가 더 결합된다.
본 발명은 VLP로의 Aβ1-6 펩티드의 결합 방법을 공개한다. 지적한 바와 같이, 본 발명의 한 측면에서 Aβ1-6 펩티드는 화학적 가교결합을 통해, 바람직하게는 이종이관능성 가교결합제를 사용하여 VLP에 결합된다. 각종 이종이관능성 가교결합제가 당분야에 공지되어 잇다. 바람직한 실시양태에서는, 이종이관능성 가교결합제가, 바람직한 제1 부착 부위, 즉 VLP 또는 하나 이상의 VLP 서브유닛의 라이신 잔기의 측쇄 아미노기와 반응할 수 있는 관능기, 및 바람직한 제2 부착 부위, 즉 Aβ1-6 펩티드에 융합되는 시스테인 잔기와 반응할 수 있고 임의로는 환원에 의하여 반응에 이용될 수 있게 되는 추가의 관능기를 포함한다. 이 방법의 제1 단계 (전형적으로는 유도체화로 불림)는 VLP와 가교결합제와의 반응이다. 이 반응의 생성물은 활성화된 담체라고도 불리는 활성화된 VLP이다. 제2 단계에서는 미반응된 가교결합제를 겔 여과 또는 투석과 같은 통상적 방법을 써서 제거한다. 제3 단계에서는 Aβ1-6 펩티드를 활성화된 VLP와 반응시키는데, 이 단계는 통상 커플링 단 계라고 한다. 미반응된 Aβ1-6 펩티드는 제4 단계에서 임의로 제거될 수 있다. 각종 이종이관능성 가교결합제는 당분야에 공지되어 있다. 이들은 바람직한 가교결합제 SMPH (피어스(Pierce) 제품), Sulfo-MBS, Sulfo-EMCS, Sulfo-GMBS, Sulfo-SIAB, Sulfo-SMPB, Sulfo-SMCC, SVSB, SIA 및 피어스 케이칼사 (미국 아일랜드주 록포드 소재) 등으로부터 입수할 수 있고 아미노기에 대해 반응성이 있는 하나의 관능기 및 시스테인 잔기에 대해 반응성이 있는 하나의 관능기를 갖는 그외 가교결합제를 포함한다. 상기 언급한 가교결합제는 모두 티오에테르 결합의 형성을 가져온다. 본 발명의 실시에 적합한 가교결합제의 다른 부류는 커플링시에 Aβ1-6 펩티드와 VLP 사이의 이황화 결합의 도입을 특징으로 한다. 이러한 부류에 속하는 바람직한 가교결합제로는 예를 들면 SPDP 및 술포-LC-SPDP (피어스 (Pierce) 제품)가 있다. 가교결합제를 이용한 VLP의 유도체화의 정도는 반응 참여물질들 각각의 농도, 다른 시약에 대한 한 시약의 과량, pH, 온도 및 이온 세기와 같은 실험 조건을 달리함으로써 영향을 받을 수 있다. 커플링의 정도, 즉 VLP의 서브유닛 당 Aβ1-6 펩티드의 양은 상기한 실험 조건을 변화시킴으로써 조정하여 백신의 요구사항을 맞출 수 있다.
Aβ1-6 펩티드를 VLP로 결합시키는 특히 유리한 방법은 Aβ1-6 펩티드 상의 시스테인 잔기와 VLP의 표면 상의 라이신 잔기를 연결하는 것이다. 몇몇 실시양태에서는 시스테인 잔기를 포함하는 아미노산 링커를 제2 부착 부위 또는 그 일부로서 Aβ1-6에 VLP로의 커플링을 위하여 융합시킬 필요가 있을 수 있다.
일반적으로, 유연한 아미노산 링커가 유리하다. 아미노산 링커의 예는 (a) CGG, (b) N-말단 감마 1-링커, (c) N-말단 감마 3-링커, (d) Ig 힌지 영역, (e) N-말단 글리신 링커, (f) (G)kC(G)n (n=0-12, k=0-5) (서열 34); (g) N-말단 글리신-세린 링커, (h) (G)kC(G)m(S)l(GGGGS)n (n=0-3, k=0-5, m=0-10, l=0-2) (서열 35), (i) GGC, (k) GGC-NH2, (l) C-말단 감마 1-링커, (m) C-말단 감마 3-링커, (n) C-말단 글리신 링커, (o) (G)nC(G)k (n=0-12, k=0-5) (서열 36), (p) C-말단 글리신-세린 링커, (q) (G)m(S)l(GGGGS)n(G)oC(G)k (n=0-3, k=0-5, m=0-10, l=0-2, o=0-8) (서열 37)로 이루어진 군에서 선택된다.
아미노산 링커의 추가의 예는 면역글로불린의 힌지 영역, 글리신 세린 링커 (GGGGS)n (서열 38), 및 글리신 링커 (G)n이며 모두 제2 부착 부위로서 시스테인 잔기를 추가로 포함하며 임의로는 글리신 잔기도 추가로 포함한다. 전형적으로는 상기 아미노산 링커의 바람직한 예는 N-말단 감마1: CGDKTHTSPP (서열 39), C-말단 감마 1: DKTHTSPPCG (서열 40), N-말단 감마 3: CGGPKPSTPPGSSGGAP (서열 41), C-말단 감마 3: PKPSTPPGSSGGAPGGCG (서열 42), N-말단 글리신 링커: GCGGGG (서열 43) 및 C-말단 글리신 링커: GGGGCG (서열 44)이다.
소수성 Aβ펩티드가 VLP에 결합될 때 본 발명의 실시에 특히 적합한 다른 아미노산 링커는 N-말단 링커의 경우 CGKKGG (서열 46), 또는 CGDEGG (서열 31)이거나, C-말단 링커의 경우 GGKKGC (서열 45) 및 GGEDGC (서열 32)이다. C-말단 링커의 경우, 말단 시스테인은 임의로는 C-말단에서 아미드화된다.
본 발명의 바람직한 실시양태에서는 펩티드의 C-말단에서 GGCG (서열 47), GGC 또는 GGC-NH2 (아미드화를 위한 "NH2" 가닥) 링커 또는 N-말단에서는 CGG가 아미노산 링커로서 바람직하다. 일반적으로 글리신 잔기는 대형 아미노산과 시스테인 사이에 삽입되어 제2 부착 부위로서 사용되어, 커플링 반응에서 큰 아미노산의 잠재적인 입체 방해 (steric hinderance)를 방지한다. 본 발명의 가장 바람직한 실시양태에서는 아미노산 링커 GGC-NH2가 Aβ1-6의 C-말단에 융합된다.
Aβ1-6 펩티드 상에 존재하는 시스테인 잔기는 활성화된 VLP 상의 이종이관능성 가교결합제와 반응하기 위하여는 환원된 상태에 있어야 하는데, 즉 유리 시스테인이거나 유리 술프히드릴기가 있는 시스테인 잔기가 이용가능해야 한다. 결합 부위로서 기능하는 시스테인 잔기가 산화된 형태인 경우에는, 예를 들어 이황화 가교를 형성한 경우라면, DTT, TCEP 또는 β-메르캅토에탄올을 사용하여 이 이황화 가교의 환원이 필요하다. WO 02/056905에 기재된 바와 같이 환원제의 낮은 농도가 커플링과 상용성이 있으며, 숙련자들이 아는 바와 같이, 높은 농도는 커플링 반응을 억제하므로, 이 경우에는 이 환원제를 커플링하기 전에 투석, 겔 여과 또는 역상 HPLC 등에 의하여 제거하거나 농도를 감소시켜야 한다.
상기한 바람직한 방법에 따라서 이종이관능성 가교결합제를 사용하여 Aβ1-6 펩티드의 VLP로 결합시키면 배향식으로 Aβ1-6 펩티드의 VLP로의 커플링이 가능해 진다. VLP로 Aβ1-6 펩티드를 결합시키는 다른 방법으로는, 카르보디이미드 EDC 및 NHS를 사용하여 Aβ1-6 펩티드를 VLP로 가교결합하는 방법이 있다. 또다른 방 법에는 Aβ1-6 펩티드를 글루타르알데히드, DSG, BM[PEO]4, BS3, (피어스 케미컬사, 미국 아일랜드주 록포드 소재) 또는 VLP의 아민기 또는 카르복실기에 대한 반응성이 있는 관능기들이 있는 그외 공지된 동종이관능성 가교결합제와 같은 동종이관능성 가교결합제를 사용하여 VLP에 부착시킨다.
Aβ1-6 펩티드로 VLP를 결합시키는 다른 방법은 VLP를 바이오티닐화하고 Aβ1-6 펩티드를 스트렙타비딘-융합 단백질로서 발현되게 하는 방법, 또는 예를 들어 WO 00/23955에 기재된 바와 같이 Aβ1-6 펩티드와 VLP 둘다를 바이오티닐화하는 방법이 있다. 이 경우 Aβ1-6 펩티드는 Aβ1-6 펩티드의 스트렙타비딘에 대한 비율을 조절함으로써 유리 결합 부위가 여전히 다음 단계에서 첨가될 VLP의 결합에 이용될 수 있도록 스트립타비딘 또는 아빈딘에 우선 결합될 수 있다. 이와 다르게는, 모든 성분들은 "한 용기 (one pot)" 반응에서 혼합될 수 있다. 수용체 및 리간드의 가용성 형태가 이용가능하고 VLP 또는 Aβ1-6 펩티드로 가교결합될 수 있는 다른 리간드-수용체 쌍을 Aβ1-6 펩티드를 VLP로 결합시키는 결합제로서 사용할 수 있다. 이와 다르게는, 그 리간드 또는 수용체가 Aβ1-6 펩티드로 융합될 수 있기 때문에 수용체 또는 리간드 중 하나로 각기 화학적으로 결합되거나 융합된 VLP로의 결합을 매개할 수 있다. 융합은 또한 삽입 또는 치환에 의하여 수행할 수 있다.
이미 지적한 바와 같이, 본 발명의 유리한 실시양태에서는, VLP가 RNA 파아지의 VLP이며, 더 바람직한 실시양태에서는 VLP가 RNA 파아지 Qβ 코트 단백질의 VLP이다.
하나 또는 여러 항원 분자, 즉 Aβ1-6 펩티드를 RNA 파아지 코트 단백질의 캡시드 또는 VLP의 하나의 서브유닛에, 바람직하게는 입체적으로 허용된다면 RNA 파아지의 VLP의 노출된 라이신 잔기를 통해서, 부착될 수 있다. 따라서 RNA 파아지의 코트 단백질의 VLP 및 특히 Qβ 코트 단백질 VLP의 구체적인 특징은 서브유닛 당 여러 항원을 커플링할 수 있는 가능성이다. 이는 조밀한 항원 어레의 생성을 허용한다.
본 발명의 바람직한 실시양태에서는 바이러스-유사 입자로의 하나 이상의 Aβ1-6 펩티드의 각 결합 및 부착이 바이러스-유사 입자의 제1 부착 부위 하나 이상과 항원 또는 항원성 결정인자의 제2 부착 부위 하나 이상 사이의 상호작용 및 회합에 의한다.
Qβ 코트 단백질의 VLP 또는 캡시드는 자신들의 표면 상에 정의된 수의 라이신 잔기를 정의된 토폴로지로 드러내며, 3 개의 라이신 잔기는 캡시드의 안쪽을 향하여 가리키며 RNA와 상호작용하며, 4개의 다른 라이신 잔기는 캡시드의 외부로 노출된다. 이들 정의된 성질은 RNA와 라이신 잔기가 상호작용하는 입자의 내부로보다는 입자의 외부로 항원의 부착을 돕는다. 다른 RNA 파아지 코트 단백질의 VLP도 자신들의 표면 상에 정의된 수의 라이신 잔기 및 이들 라이신 잔기들의 정의된 토폴로지를 갖는다.
본 발명의 더 바람직한 실시양태에서는 제1 부착 부위가 라이신 잔기이고(거나) 제2 부착 부위는 술프히드릴기 또는 시스테인 잔기를 포함한다. 본 발명의 매우 바람직한 실시양태에서는 제1 부착 부위는 라이신 잔기이며, 제2 부착 부위는 시스테인 잔기이다.
본 발명의 매우 바람직한 실시양태에서는 Aβ1-6 펩티드는 시스테인 잔기를 통하여 RNA 파아지 코트 단백질의 VLP의 라이신 잔기에 그리고 특히 Qβ 코트 단백질의 VLP에 결합된다.
RNA 파아지로부터 유래된 VLP의 또다른 이점은 적당한 비용으로 다량의 물질의 제조가 가능한 박테리아에서의 발현 수율이 높다는 것이다.
지적한 바와 같이, 본 발명의 접합물 및 어레이는 각각 이들의 고도로 조직된 구조, 치수 및 어레이의 표면 상에서 항원 반복성 면에서 종래의 접합물과 다르다. 또한 VLP를 담체로서 사용하면 다양한 항원 밀도로, 각기 튼튼한 항원 어레이 및 접합물을 생성할 수 있다. 특히 RNA 파아지의 VLP를 사용함으로써, 특히 RNA 파아지 Qβ 코트 단백질의 VLP를 사용하면 매우 높은 에피토프 밀도를 달성할 수 있다. 특히, Qβ 코트 단백질의 VLP로 인간 Aβ1-6 펩티드를 커플링함으로써 서브유닛 당 에피토프 1.5 이상인 밀도에 도달할 수 있다. 높은 에피토프 밀도로 RNA 파아지 코트 단백질의 VLP의 조성물을 제조하는 것은 본 발명의 설명을 이용하여 수행될 수 있다. 본 발명의 바람직한 실시양태에서 Aβ1-6 펩티드는 Qβ 코트 단백질의 VLP에 커플링될 때, 서브유닛 당 Aβ1-6 펩티드의 평균수가 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6 , 1.7, 1.8, 1.9, 2.0, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9, 또는 그 이상인 것이 바람직하다.
제2 부착 부위는 여기에 정의된 바와 같이, 항원 또는 항원성 결정인자에 자연적으로 존재하거나 비자연적으로 존재하는 것일 수 있다. 항원 또는 항원성 결 정인자 상에 적절한 자연발생 제2 부착 부위가 없는 경우에는 그러한 비자연적 제2 부착은 항원에 인위적으로 부여해야 한다.
상기한 바와 같이, 4 개의 라이신 잔기는 Qβ 코트 단백질의 VLP의 표면에 노출된다. 전형적으로 이들 잔기는 가교결합제 분자와 반응시 유도체화된다. 노출된 라이신 잔기의 전부가 항원에 커플링될 수 없는 경우에 가교결합제와 반응한 라이신 잔기는 유도체화 단계에서 ε-아미노기에 부착된 가교결합제 분자가 남아있다. 이는 하나 또는 여러 양성 대전물질을 소실시키며, 이는 VLP의 가용성 및 안정성에 유해할 수 있다. 하기한 공개된 Qβ 코트 단백질 돌연변이체에서와 같이 라이신 잔기의 일부를 아르기닌으로 대체함으로써 본 발명자들은 양성 대전물질의 과도한 소실을 방지하는데, 왜냐하면 아르기닌 잔기는 가교결합제와 반응하지 않기 때문이다. 더욱이, 라이신 잔기를 아르기닌으로 대체하면 더 적은 부위가 항원으로의 반응에 이용될 수 있기 때문에, 더 정의된 항원 어레이를 생성할 수 있다.
따라서 노출된 라이신 잔기는 본 발명에 공개된 다음의 Qβ 코트 단백질 돌연변이체 및 돌연변이체 QβVLP에서 아르기닌에 의하여 대체되었다: Qβ-240 (Lys13-Arg, 서열17), Qβ-250 (Lys 2-Arg, Lys13-Arg, 서열 19) 및 Qβ-259 (Lys 2-Arg, Lys16-Arg, 서열 21). 제작물을 클로닝하고 단백질을 발현시키고, VLP를 정제하여 펩티드 및 단백질 항원으로의 커플링에 사용하였다. Qβ-251 (서열 20)도 제작하고, Qβ-251 코트 단백질의 VLP를 어떻게 발현하고 정제 및 커플링할 것인지에 대한 안내는 본 출원 전체에서 발견할 수 있다.
추가의 실시양태에서는 본 발명자들은 훨씬더 높은 밀도의 항원 어레이를 얻 는데 적합한, 하나 이상의 추가의 라이신 잔기가 있는 Qβ 돌연변이체 코트 단백질을 공개한다. 이 돌연변이체 Qβ 코트 단백질인 Qβ-243 (Asn 10-Lys, 서열 18)을 클로닝하고 단백질을 발현시키고, 캡시드 또는 VLP를 단리하여 정제하였는데, 추가의 라이신 잔기의 도입은 서브유닛의 캡시드 또는 VLP로의 자기조립 능력이 있다는 것을 보여주었다. 따라서 Aβ1-6 펩티드 어레이 및 접합물 각각은 Qβ 코트 단백질 돌연변이체의 VLP를 사용하여 준비할 수 있다. VLP 그리고 특히 RNA 파아지 코트 단백질의 VLP로의 특히 유리한 항원 부착 방법은 RNA 파아지 코트 단백질의 VLP 표면 상에 존재하는 라이신 잔기를 항원, 즉 Aβ1-6 펩티드에 부가된 시스테인 잔기와 연결하는 것이다. 시스테인 잔기가 제2 부착 부위로서 효과적이려면, 술프히드릴기를 커플링에 이용할 수 있어야 한다. 따라서 시스테인 잔기는 환원된 상태, 즉 유리 시스테인이거나 유리 술프히드릴기가 있는 시스테인 잔기가 이용가능해야 한다. 제2 부착 부위로서 기능하는 시스테인 잔기가 산화된 형태로 있는 경우, 예를 들어 이황화 가교를 형성하고 있다면, DTT, TCEP 또는 β-메르캅토에탄올을 사용하여 이 이황화 가교의 환원이 필요하다. 환원제의 농도 및 항원에 대한 환원제의 몰과량은 각 항원에 대해 조절되어야 한다. 환원제 10 μM 이하의 낮은 농도에서부터 최대 10 내지 20 mM 이상의 적정 범위가 필요한 경우 시험되며, 담체로의 항원의 커플링이 평가된다. WO 02/056905에 기재된 바와 같이 환원제의 낮은 농도가 커플링과 상용성이 있으며, 숙련자들이 아는 바와 같이, 높은 농도는 커플링 반응을 억제하므로, 이 경우에는 이 환원제를 커플링하기 전에 투석, 겔 여과 또는 역상 HPLC 등에 의하여 제거하거나 농도를 감소시켜야 한다. 유리하게는 투석 또는 평형 완충제의 pH는 7 보다 낮고, 바람직하게는 6 보다 낮다. 낮은 pH 완충제와 항원 활성 또는 안정성과의 상용성이 시험되어야 한다.
RNA 파아지 코트 단백질의 VLP 상의 에피토프 밀도는 가교결합제의 선택 및 그외 반응 조건에 의하여 조절될 수 있다. 예를 들면, 가교결합제 술포-GMBS 및 SMPH는 전형적으로 높은 에피토프 밀도에 도달하는 것을 가능하게 한다. 유도체화는 고농도의 환원제에 의하여 긍정적으로 영향을 받으며, 이 반응 조건의 조작을 통해 RNA 파아지 코트 단백질의 VLP, 그리고 특히 Qβ 코트 단백질의 VLP로 커플링되는 항원의 수를 제어하는 데 사용될 수 있다.
비자연적 제2 부착 부위의 설계에 앞서서, 그것이 융합되거나 삽입되거나 일반적으로 조작되는 위치가 선택되어야 한다. 제2 부착 부위의 위치의 선택은 예를 들면, 항원의 결정 구조에 기초할 수 있다. 항원의 이러한 결정 구조는 분자의 C- 또는 N-말단의 이용가능성 (예컨대 이들의 용매에 대한 접근성으로부터 결정됨)에 대한 또는 시스테인 잔기와 같은 제2 부착 부위로서의 사용에 적합한 잔기의 용매에 대한 노출에 대한 정보를 제공할 수 있다. Fab 단편의 경우에서와 같이 노출된 이황화 가교도, 2-메르캅토에틸아민, TCEP, β-메르캅토에탄올 또는 DTT 등으로 온화한 환원을 통해 단일 시스테인 잔기로 일반적으로 전환할 수 있기 때문에, 제2 부착 부위의 공급원이 될 수 있다. 항원의 면역원성에 영향을 주지 않는 온화한 환원 조건이 선택될 것이다. 일반적으로 자기항원을 사용한 면역화가 이 자기항원과 이의 천연 리간드와의 상호작용을 방해하는 것을 목적으로 하는 경우에, 제2 부착 부위는, 천연 리간드와의 상호작용 부위에 대하여 항원의 생성을 가능하게 하도 록 부가될 수 있다. 추가의 실시양태에서는, 자기항원과 이의 천연 리간드와의 상호작용 부위와는 다른 부위에 대해 유도된 항원 반응이 필요하다. 이러한 실시양태에서는 자기항원과 이의 천연 리간드와의 상호작용 부위에 대한 항원의 생성을 제2 부착 부위가 방해하도록 제2 부착 부위를 선택할 수 있다.
제2 부착 부위의 위치를 선택하는 데 있어서 다른 기준으로는 항원의 올리고머화 상태, 올리고머화 부위, 보조인자 (cofactor)의 존재, 및 항원의 변형이 자기항원의 기능 또는 자기항원을 인식하는 항체의 생성과 상용성이 있는 항원 구조 및 서열에서의 부위를 공개하는 실험적 증거의 이용가능성이 있다.
대부분의 바람직한 실시양태에서, Aβ1-6 펩티드는 코어 입자 및 VLP 또는 VLP 서브유닛 각각 상의 제1 부착 부위와 회합할 수 있는 단일 제2 부착 부위 또는 단일 반응성 부착 부위를 포함한다. 이는 코어 입자 및 VLP, 각각으로의 항원 적어도 하나, 전형적으로는 하나 이상, 바람직하게는 10, 20, 40, 80, 120, 150, 180, 210, 240, 270, 300, 360, 400, 450 이상의 정의된 균일한 결합 및 회합 각각을 보장한다. 따라서, 항원 상의 단일 제2 부착 부위 또는 단일 반응성 부착 부위의 제공은 단일하고 균일한 타입의 결합 및 회합을 각각 보장하여 매우 고도의 질서화된 반복성 어레이를 생성할 것이다. 예를 들면, 결합 및 회합이 각각 (제1 부착 부위로서) 라이신- 및 (제2 부착 부위로서)시스테인- 상호작용을 통하여 수행된다면, 본 발명의 이런 바람직한 실시양태에 따라서, 이 시스테인 잔기가 항원에 자연적으로 존재하거나 비자연적으로 존재하는지와 무관하게 항원상 단지 하나의 시스테인 잔기가 VLP 및 코어 입자의 제1 부착 부위 각각과 결합 및 회합을 각각 할 수 있다는 것이 분명하다.
몇몇 실시양태에서는 제2 부착 부위의 항원 상으로의 조작은 본 발명의 공개내용에 따라서 제2 부착 부위로서 적합한 아미노산을 포함하는 아미노산 링커의 융합을 필요로 한다. 따라서, 본 발명의 바람직한 실시양태에서는 아미노산 링커를 하나 이상의 공유 결합을 통하여 항원 또는 항원성 결정인자에 결합된다. 바람직하게는 아미노산 링커는 제2 부착 부위를 포함하거나 본질적으로 이루어진다. 추가의 바람직한 실시양태에서는 아미노산 링커가 술프히드릴기 또는 시스테인 잔기를 포함한다. 또다른 바람직한 실시양태에서는 아미노산 링커는 시스테인이다. 아미노산 링커의 선별의 일부 기준 뿐만 아니라 본 발명에 다른 아미노산 링커의 추가의 바람직한 실시양태는 이미 위에서 언급하였다.
본 발명의 추가의 바람직한 실시양태에서는 하나 이상의 항원 또는 항원성 결정인자, 즉 Aβ1-6 펩티드를 바이러스-유사 입자에 융합한다. 위에서 개설한 바와 같이, VLP는 전형적으로는 VLP로 조립되는 하나 이상의 서브유닛으로 구성된다. 따라서, 본 발명의 추가의 바람직한 실시양태에서는 항원 또는 항원성 결정인자, 바람직하게는 하나 이상의 Aβ1-6 펩티드가, 키메라 VLP-서브유닛-Aβ1-6 펩티드 단백질 융합을 생성하는 VLP로 혼입될 수 있는 단백질, 또는 바이러스-유사 입자의 하나 이상의 서브유닛에 융합된다.
Aβ1-6 펩티드의 융합은 VLP 서브유닛 서열 내로 삽입에 의하여, 또는 VLP-서브유닛 또는 VLP 내로 혼입될 수 있는 단백질의 N- 또는 C-말단으로의 융합에 의하여 수행될 수 있다. 그 후 VLP 서브유닛으로의 펩티드의 융합 단백질을 언급할 때, 서브유닛 서열의 말단으로의 융합 또는 서브유닛 서열 내에 펩티드의 내부 삽입이 포함된다.
융합은 말단절단 돌연변이체로서 더 언급되는, 서브유닛 서열의 일부가 결실된 VLP 서브유닛의 변이체 내로 Aβ1-6 펩티드 서열을 삽입함으로써 수행될 수도 있다. 말단절단 돌연변이체는 VLP 서브유닛의 서열의 일부를 N- 또는 C-말단, 또는 내부 결실일 수 있다. 예를 들어, 아미노산 잔기 79 내지 81가 결실된 특정 VLP HBcAg는 내부 결실이 있는 말단절단 돌연변이체이다. 말단절단 돌연변이체 VLP-서브유닛의 N- 또는 C-말단으로의 Aβ1-6 펩티드의 융합도 본 발명의 실시양태을 가져온다. 이와 마찬가지로, VLP 서브유닛의 서열 내로 에피토프의 융합은 치환에 의하여 수행될 수도 있는데, 여기서 예를 들어 특정한 VLP HBcAg의 경우 아미노산 79-81은 외래 에피토프로 대체된다. 따라서, 이하에서 언급되는 융합은 VLP 서브유닛의 서열에서 Aβ1-6 펩티드 서열의 삽입에 의하여, Aβ1-6 펩티드로 VLP 서브유닛의 서열의 일부를 대체하거나 또는 결실, 치환 또는 삽입의 조합에 의하여 수행될 수 있다.
키메라 Aβ1-6 펩티드-VLP 서브유닛은 일반적으로, VLP로 자기조립할 수 있을 것이다. 또한, 이들의 서브유닛으로 융합된 에피토프를 드러내는 VLP는 여기서는 키메라 VLP로서 언급된다. 지적한 바와 같이, 바이러스-유사 입자는 하나 이상의 VLP 서브유닛을 포함하거나 다르게는 구성된다. 본 발명의 추가의 실시양태에서는 바이러스-유사 입자는 키메라 VLP 서브유닛 및 비키메라 VLP 서브유닛 (즉, 항원이 융합되지 않은 VLP 서브유닛)의 혼합물을 포함하거나 다르게는 구성되어, 소위 모자이크 입자를 생성한다. 이는 VLP의 생성 또는 VLP로의 조립을 보장하는 데 있어서 유리할 수 있다. 이들 실시양태에서는 키메라 VLP-서브유닛의 비율은 1, 2, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95 ％ 또는 그 이상일 수 있다.
인접 (flanking) 아미노산 잔기를, VLP 서브유닛의 서열의 말단으로 융합될펩티드 또는 에피토프의 서열의 말단에 부가하거나 또는 VLP 서브유닛의 서열 내로 이러한 펩티드 서열의 내부 삽입을 위하여 부가할 수 있다. 글리신 및 세린 잔기는 융합될 펩티드에 부가되는 인접 서열에 사용하게 특히 유리한 아미노산이다. 글리신 잔기는 추가의 유연성을 부여하며, VLP 서브유닛의 서열 내로 외래 서열을 융합하는 잠재적으로 탈안정화 효과를 감소시킬 수 있다.
본 발명의 특정한 실시양태에서는 VLP가 B형 간염 코어 항원 VLP이다. HBcAg의 N-말단으로의 Aβ1-6 펩티드의 융합 단백질 (Neyrinck, S. et al., Nature Med. 5:1157-1163 (1999)) 또는 소위 주요 면역우성 영역 (MIR) 내로의 삽입이 기재되어 있으며 (Pumpens, P. and Grens, E., Intervirology 44:98-114 (2001)), WO 01/98333), 본 발명의 바람직한 실시양태이다. MIR에서 결실된 HBcAg의 자연발생 변이체도 기재되어 있고 (Pumpens, P. and Grens, E., Intervirology 44:98-114 (2001), 이는 언급됨으로써 본원에 명백히 도입됨), wt HBcAg와 비교할 때 결실 부위에 상응하는 MIR의 위치에서의 삽입 뿐 아니라 N- 또는 C- 말단으로의 융합은 본 발명의 추가의 실시양태이다. C-말단으로의 융합도 기재되어 있다 (Pumpens, P. and Grens, E., Intervirology 44:98-114 (2001)). 당분야의 숙련자라면 전통적인 분자생물학 기술을 사용하여 융합 단백질을 어떻게 제작할 것인지를 쉽게 알 것이 다 (Sambrook, J.et al., eds., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd. edition, Cold Spring Habor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989), Ho et al., Gene 77:51 (1989)). HBcAg 및 HBcAg 융합 단백질을 코딩하며, HBcAg 및 HBcAg 융합 단백질의 발현에 유용한 벡터 및 플라스미드가 기재되어 있으며 (Pumpens, P. ＆ Grens, E. Intervirology 44: 98-114 (2001), Neyrinck, S. et al., Nature Med. 5:1157-1163 (1999)) 본 발명의 실시에 사용될 수 있다. 본 발명자들은 또한, HBcAg의 MIR 내로 에피토프를 삽입하여 키메라 자기조립 HBcAg를 생성하는 것을 실시예 (실시예 6)로써 설명한다.
HBcAg의 MIR에 삽입되는 에피토프의 진열 및 자기조립의 효율성의 최적화를 위한 중요한 요인은, 삽입 시에 삽입 부위의 선택 뿐만 아니라 MIR 내에서 HBcAg 서열로부터 결실될 아미노산의 수 (Pumpens, P. and Grens, E., Intervirology 44:98-114 (2001); EP 0 421 635; 미국 특허 제6,231,864호) 또는 달리 말하면 또는 달리 말하면, 새로운 에피토프로 HBcAg로부터 어떤 아미노산이 대체되는가이다. 예를 들어 HBcAg 아미노산 76-80, 79-81, 79-80, 75-85 또는 80-81를 외래 에피토프로 치환이 기재되어 있다 (Pumpens, P. and Grens, E., Intervirology 44:98-114 (2001); EP 0421635, 미국 특허 제6,231,864호). HBcAg는 긴 아르기닌 꼬리부를 포함하는데 (Pumpens, P. and Grens, E., Intervirology 44:98-114 (2001)), 이는 캡시드 조립에 필수적이며 핵산에 결합할 수 있다 (Pumpens, P. and Grens, E., Intervirology 44:98-114 (2001)). 이 아르기닌 꼬리부를 포함하거나 결여된 HBcAg 둘다 본 발명의 실시양태이다.
본 발명의 추가의 바람직한 실시양태에서 VLP는 RNA 파아지의 VLP이다. RNA 파아지의 주요 코트 단백질은 박테리아에서, 그리고 특히 이. 콜라이에서 발현시에 VLP 내로 동시에 조립된다. 본 발명의 조성물을 제조하는 데에 사용될 수 있는 박테리오파아지의 특정한 예로는 박테리오파아지 Qβ(서열 4, PIR 데이타베이스, QβCP를 지칭하는 수탁번호 VCBPQβ 및 서열 5, QβA1 단백질을 지칭하는 수탁번호 AAA16663) 및 박테리오파아지 fr (서열 7, PIR 수탁번호 VCBPFR)과 같은 RNA 박테리오파아지의 코트 단백질과 같은 RNA 박테리오파아지의 코트 단백질이 있다.
더 바람직한 실시양태에서 하나 이상의 Aβ1-6 펩티드는 Qβ 코트 단백질로 융합된다. 에피토프가 Qβ의 A1 단백질의 말단절단 형태의 C-말단으로 융합되거나 A1 단백질 내로 삽입된 융합 단백질 제작물이 기재되어 있다 (Kozlovska, T. M., et al., Intervirology, 39:9-15 (1996)). A1 단백질은 UGA 정지 코돈에서 억제되어 생성되며 N-말단 메티오닌의 절단이 고려된다면, 길이가 329 aa, 또는 328 aa이다. 알라닌 (QβCP 유전자에 의해 코딩되는 제2 아미노산) 앞에서 N-말단 메티오닌의 절단이 통상 이. 콜라이에서 일어나며 Qβ 코트 단백질의 N-말단의 경우에도 그러하다. A1 유전자의 부분인 UGA 앰버 (amber) 코돈의 3'은 길이가 195 아미노산인 CP 연장부를 코딩한다. 이 CP 연장부의 72번 위치와 73번 위치 사이에 하나 이상의 Aβ1-6 펩티드의 삽입은 본 발명의 추가의 실시양태를 낳는다 (Kozlovska, T. M., et al., Intervirology 39:9-15 (1996)). C-말단 말단절단된 QβA1 단백질의 C-말단에서의 Aβ1-6 펩티드의 융합은 본 발명의 추가의 바람직한 실시양태를 낳는다. 예를 들면, 문헌 (Kozlovska et al., Intervirology, 39: 9-15 (1996))은 에피토프가 위치 19번에서 말단절단된 QβCP 연장부의 C-말단에 융합되는 QβA1 단백질 융합물을 기재한다.
문헌 (Kozlovska et al., Intervirology, 39: 9-15 (1996))에 기재된 바와 같이, 융합된 에피토프를 드러내는 입자의 조립은 모자이크 입자의 형성을 위해서 통상적으로 A1 단백질-Aβ1-6 펩티드 융합 및 wt CP의 존재를 필요로 한다. 그러나 바이러스-유사 입자 및 이로써, 특히 RNA 파아지 Qβ 코트 단백질의 VLP (하나 이상의 Aβ1-6 펩티드가 융합된 VLP 서브유닛으로만 구성됨)를 포함하는 실시양태도 본 발명의 범위에 포함된다.
모자이크 입자의 제조는 여러 방식으로 수행될 수 있다. 문헌 (Kozlovska et al., Intervirology, 39:9-15 (1996))는 3 가지 방법을 기재하는데, 모두 본 발명의 실시에 사용될 수 있다. 제1 방법에서는, VLP 상의 융합된 에피토프의 효율적 진열이, UGA 코돈에서 Trp으로의 번역을 유도하는 클로닝된 UGA 서프레서 tRNA를 코딩하는 플라스미드 (pISM3001 플라스미드 (Smiley B.K., et al., Gene 134:33-40 (1993)))를 보유한 이. 콜라이 균주에서 CP와 CP 연장부 사이에 UGA 정지 코돈을 갖는 QβA1 단백질 융합을 코딩하는 플라스미드의 발현에 의하여 매개된다. 다른 방법에서는 CP 유전자 정지 코돈이 UAA로 변형되며, A1 단백질-Aβ1-6 펩티드 융합을 발현하는 제2 플라스미드가 동시형질감염된다. 제2 플라스미드는 상이한 항생제 저항성을 코딩하며, 복제의 개시점이 제1 플라스미드와 상용성이 있다 (Kozlovska, T. M., et al., Intervirology 39:9-15 (1996)). 제3 방법에서는, CP 및 A1 단백질-Aβ1-6 펩티드 융합이, 문헌 (Kozlovska et al., Intervirology, 39:9-15 (1996))의 도 1에 기재된 바와 같이, Trp 프로모터와 같은 프로모터에 작동가능하게 연결된, 이중구조유전자 (bicistronic) 방식으로 코딩되는 코딩된다.
추가의 실시양태에서는 Aβ1-6 펩티드를 fr CP의 아미노산 2 및 3 (절단된 CP, 즉 N-말단 메티오닌이 절단된 경우의 번호매김) 사이에 삽입되어, Aβ1-6 펩티드-fr CP 융합 단백질이 생성된다. VLP로 자기조립되는 fr CP 융합 단백질의 제작 및 발현을 위한 벡터 및 발현계는 기재되어 있다 (Pushko P. et al., Prot. Eng. 6:883-891 (1993)). 특정한 실시양태에서는 Aβ1-6 펩티드 서열이 fr CP의 잔기 3 및 4가 결실된 fr CP의 결실 변이체내로 아미노산 2 다음에 삽입된다 (Pushko P. et al., Prot. Eng. 6:883-891 (1993)).
RNA 파아지 MS-2의 코트 단백질의 N-말단의 돌출된 β-헤어핀에서의 에피토프의 융합 및 RNA 파아지 MS-2의 자기조립된 VLP 상의 융합된 에피토프의 뒤이은 제시도 기재되어 있으며 (WO 92/13081), MS-2 RNA 파아지의 코트 단백질 내로의 삽입 또는 치환에 의하여 Aβ1-6 펩티드의 융합도 본 발명의 범위 하에 속한다.
본 발명의 또다른 실시양태에서는 Aβ1-6 펩티드는 파필로마바이러스의 캡시드 단백질로 융합된다. 더 구체적인 실시양태에서는, Aβ1-6 펩티드를 1형 소 파필로마바이러스 (BPV-1)의 주요 캡시드 단백질 L1에 융합된다. 바큘로바이러스/곤충 세포계에서 BPV-1 융합 단백질의 제작 및 발현을 위한 벡터 및 발현계가 기재되어 있다 (Chackerian, B. et al., Proc. Natl. Acad. Sci.USA 96:2373-2378 (1999), WO 00/23955). BPV-1 L1의 아미노산 130-136을 Aβ1-6 펩티드로 치환하면 BPV-1 L1-Aβ1-6 펩티드 융합 단백질이 생성되며, 이는 본 발명의 바람직한 실시양태이다. 바큘로바이러스 벡터에서의 클로닝 및 바큘로바이러스 감염된 Sf9 세포에서의 발현이 설명되어 있으며 본 발명의 실시에 사용될 수 있다 (Chackerian, B. et al., Proc. Natl. Acad. Sci.USA 96:2373-2378 (1999), WO 00/23955). 융합된 Aβ1-6 펩티드를 드러내는 조립된 입자의 정제는 겔 여과 또는 수크로오스 구배 초원심분리 등과 같은 많은 방식으로 수행될 수 있다 (Chackerian, B. et al., Proc. Natl. Acad. Sci.USA 96:2373-2378 (1999), WO 00/23955).
본 발명의 추가적 실시양태에서는 Aβ1-6 펩티드가 Ty VLP 내로 혼입될 수 있는 Ty 단백질로 융합된다. 더 구체적인 실시양태에서 Aβ1-6 펩티드는 TYA 유전자에 의하여 코딩되는 p1 또는 캡시드 단백질에 융합된다 (Roth, J.F., Yeast 16:785-795 (2000)). 효모 레트로트랜스포존 Ty1, 2, 3 및 4는 사카로미세스 세레비지애 (Saccharomyces Serevisiae)로부터 단리한 반면, 레트로트랜스포존 Tf1은 쉬조사카로미세스 폼배 (Schizosaccharomyces Pombae)로부터 단리되었다 (Boeke, J.D. and Sandmeyer, S.B., "Yeast Transposable elements," in The molecular and Cellular Biology of the Yeast Saccharomyces: Genome dynamics, Protein Synthesis, and Energetics, p. 193, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1991)). 레트로트랜스포존 Ty1 및 2는 식물 및 동물 요소의 코피아(copia) 부류에 관련되는 반면 Ty3은 식물 및 동물 레트로바이러스에 관련된 레트로트랜스포존의 집시 (gypsy) 족에 속한다. Ty1 레트로트랜스포존에서, Gag 또는 캡시드 단백질로도 불리는 p1 단백질은 길이가 440 아미노산이다. P1은 VLP의 성숙화 동안에 408 번 위치에서 절단되어 VLP의 필수 성분인 p2 단백질을 생성한다.
p1에 대한 융합 단백질 및 이 융합 단백질을 효모에서 발현하기 위한 벡터는 설명되어 있다 (Adams, S.E., et al., Nature 329:68-70 (1987)). 따라서, 예를 들면 Aβ1-6 펩티드는 Aβ1-6 펩티드를 코딩하는 서열을 pMA5620 플라스미드의 BamH1 부위 내로 삽입함으로써 p1에 융합될 수 있다 (Adams, S.E., et al., Nature 329:68-70 (1987)). 외래 에피토프를 코딩하는 서열을 pMA5620 벡터 내로 클로닝하면 이 외래 에피토프의 N-말단에 C-말단으로 융합되는 Ty1-15의 p1의 아미노산 1-381을 포함하는 융합 단백질의 발현을 가져온다. 이와 마찬가지로 Aβ1-6 펩티드의 N-말단 융합 또는 p1 서열 내로의 내부 삽입, 또는 p1 서열의 일부의 치환도 본 발명의 범위에 속하는 것이다. 특히 Aβ1-6 펩티드를 Ty 단백질 p1 (EP0677111)의 아미노산 30-31, 67-68, 113-114 및 132-133의 사이에 삽입하면 본 발명의 바람직한 실시양태를 생성한다.
Aβ1-6 펩티드의 융합에 적합한 추가의 VLP는 예를 들면, 레트로바이러스-유사-입자 (WO9630523), HIV2 Gag (Kang, Y.C., et al, Biol. Chem. 380:353-364 (1999)), 카우피(Cowpea) 모자이크 바이러스 (Taylor, K.M.et al., Biol. Chem. 380:387-392 (1999)), 파르보바이러스 VP2 VLP (Rueda, P. et al., Virology 263:89-99 (1999)), HBsAg (미국 특허 제4,722,840호, EP0020416B1)이다.
본 발명의 실시에 적합한 키메라 VLP의 예는 또한 문헌 (Intervirology 39:1 (1996))에 기재된 것들이다. 본 발명에서 사용을 위해 고려된 VLP의 추가의 예는 HPV-1, HPV-6, HPV-11, HPV-16, HPV-18, HPV-33, HPV-45, CRPV, COPV, HIV GAG, 담 배 모자이크 바이러스이다. SV-40, 폴리오마바이러스, 이데노바이러스, 단순포진바이러스, 로타바이러스 및 노르웍 바이러스의 바이러스-유사 입자도 만들어졌으며, Aβ1-6 펩티드를 포함하는 이들 VLP의 키메라 VLP도 본 발명의 범위에 포함된다.
본 발명의 바람직한 실시양태에서 본 발명의 백신을 제조하는 데에 적합한 Aβ1-6 펩티드는 VLP에 결합하기 위한 아미노산 링커로 변형된다. 이들 Aβ1-6 펩티드로는 링커 GGC에 C-말단에서 융합된 Aβ1-6가 있으나 이에 한정되지는 않는다. Aβ1-6 단편의 N-말단으로 융합에 적합한 아미노산 링커로는 서열 CGG 및 CGHGNKS가 있으나 이에 한정되지는 않는다. 바람직한 실시양태에서 링커가 Aβ또는 Aβ단편의 C-말단에 융합될 때 C-말단 시스테인이 아미드화된다. 바람직한 실시양태에서는 Aβ1-6가 아미노산 링커에 융합되며, 서열 "NH2-DAEFRHGGC-CONH2"를 가지며, 여기서 C-말단 시스테인이 아미드화되며, 이는 C-말단 "-CONH2"로 표시되며, 펩티드의 N-말단은 유리되며, 추가로 "NH2-"로 표시된다. 아미노산 링커는 바람직하게는, 상기 링커의 아미노산 서열에 대한 면역반응의 유도를 피하기 위해 짧아야 하나 가용성 Aβ및 AD 플라크와 가교결합하는 항체의 유도를 허용해야 하며 Aβ1-6 펩티드와 항체의 상호작용을 용이하게 할 수 있다. 아미노산 링커의 다른 적합한 성질은 유연성이고 바람직하게는, 커플링을 방해하고(거나) 링커 자체에 대한 면역반응을 생성하는 것을 방해할 수 있는 대형 아미노산이 없다. 더 바람직한 실시양태에서는 제2 부착 부위로서 시스테인 잔기를 포함하는 아미노산 링커가 Aβ1-6 펩티드의 C-말단으로 융합된다.
본 발명의 실시에서 적합한 추가의 Aβ단편으로는 인간 아밀로이드 플라크 및 가용성 인간 Aβ과의 가교결합성이 있는 항체를 유발하며 다른 동물 종으로부터의, 상기한 바와 같이 변형된, 상기한 단편에 상응하는 Aβ단편이 있다. 이러한 단편의 예는 영장류(DAEFRH, 서열 84), 토끼 (DAEFRH, 서열 85), 기니아 피그 (DAEFRH, 서열 88), 마우스 (DAEFGH, 서열 76), 래트 (DAEFGH, 서열 87), 및 제노푸스 래비스 (DSEYRH, 86)로부터의 Aβ1-6이다.
인간 APP의 돌연변이된 형태를 과발현하는 트랜스제닉 마우스에 기초한 많은 AD 동물 모델이 보고되어 있다 (Games, D. et al., Nature 373: 523-527 (1995a); Sturchler-Pierrat et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 13287-13292 (1997); Hsiao, K., et al., Science 274: 99-102 (1996); Chen, G. et al., Nature 408 : 975- 979 (2000) ; Janus, C. et al., Nature 408 : 979-982 (2000) ; Morgan, D. et al., Nature 408 : 982-985 (2000)). 이들 마우스 모델들은 형질도입 유전자의 과발현 정도, 형질도입 유전자 상에 존재하는 AD 돌연변이 및 형질도입 유전자의 과발현을 지시하는 프로모터가 서로 상이하다. 이들 동물 모델은, 특히 연령과 관련된 행동 변화, 불용성 플라크 내로의 β-아밀로이드의 침착, 뉴런 내의 신경섬유매듭, 및 전뇌 전체에서 뉴런의 손실인 AD의 모든 병리적 징후를 드러내지 못한다 (Chapman, P.F. Nature 408: 915-916 (2000)). 기억 상실 및 이들을 확인하는 방법은 그러나 이들 모델에서도 확인될 수 있으며, 동물 모델에서 본 발명의 조성물의 영향을 시험하는데 사용될 수 있다 (Chen, G. et al., Nature 408 : 975- 979 (2000) ; Janus, C. et al., Nature 408 : 979-982 (2000) ; Morgan, D. et al., Nature 408 : 982-985 (2000)). 또한 아밀로이드 플라크 내로의 Aβ의 연령-관련 침착은 이들 모델에서 연구될 수 있으며, 별아교세포 결핍증 및 미세신경아교증을 또한 발생시킨다.
여기에 기재된 방법 및 응용에 다른 적합한 변형 및 개조가 쉽게 분명해 지며 본 발명 또는 이의 임의의 실시양태의 범위를 벗어나지 않고도 이루어질 수 있음이 관련 분야의 숙련자에 의하여 이해될 것이다. 본 발명을 자세히 설명하였으나 동일한 것이 다음의 실시예을 언급함으로써 더 명백하게 이해될 것이다. 실시예는 예시를 목적으로 여기에 포함될 뿐 본 발명을 제한하려는 것은 아니다.
<실시예 1>
바람직한 코어 입자 및 RNA 파아지의 VLP 각각의 각 클로닝 및 제작, 발현 및 발현.
A. 돌연변이 Qβ 코트 단백질의 제작 및 발현, 및 돌연변이 Qβ 코트 단백질 VLP 또는 캡시드의 정제.
돌연변이 코트 단백질의 플라스미드 제작 및 클로닝
pQβ-240의 제작:
플라스미드 pQβ10 (Kozlovska, TM, et al., Gene 137:133-137)를 pQβ-240의 제작용 초기 플라스미드로서 사용하였다. 돌연변이 Lys13→Arg를 역방향 PCR로 생성했다. 역방향 프라이머는 역전된 꼬리-대-꼬리 방향으로 설계되었다:
5'-GGTAACATCGGTCGAGATGGAAAACAAACTCTGGTCC-3' (서열 48) 및
5'-GGACCAGAGTTTGTTTTCCATCTCGACCGATGTTACC-3' (서열 49).
제1 PCR의 생성물을 제2 PCR 반응을 위한 주형으로서 사용하였으며, 여기서
상류 프라이머 5'-AGCTCGCCCGGGGATCCTCTAG-3' (서열 50) 및
하류 프라이머 5'-CGATGCATTTCATCCTTAGTTATCAATACGCTGGGTTCAG-3' (서열 51)을 사용하였다. 제2 PCR의 생성물을 XbaI 및 Mph1103I로 소화하고 동일한 제한 효소로 절단된 pQβ10 발현 벡터 내로 클로닝하였다. PCR 반응을 제조자 프로토콜 (MBI Fermentas, 리투아니아 빌니우스 소재)에 따라 PCR 키트 시약을 써서 수행하였다.
직접적 표지 혼입 방법을 사용하여 서열분석하여, 원하는 돌연변이를 입증하였다. pQβ-240을 보유한 이. 콜라이 세포는 Qβ파아지 입자로부터 단리된 대조구 Qβ 코트 단백질과 SDS-PAGE 상에서 동시이동하는 14-kD 단백질의 효율적인 합성을 뒷받침하였다.
생성되는 아미노산 서열: (서열 17)
AKLETVTLGNIGRDGKQTLVLNPRGVNPTNGVASLSQAGAVP
ALEKRVTVSVSQPSRNRKNYKVQVKIQNPTACTANGSCDPSVTRQ
KYADVTFSFTQYSTDEERAFVRTELAALLASPLLIDAIDQLNPAY
pQβ-243의 제작:
플라스미드 pQβ10 을 pQβ-243의 제작용 초기 플라스미드로서 사용하였다. 돌연변이 Asn10→Lys를 역방향 PCR로 생성했다. 역방향 프라이머는 역전된 꼬리- 대-꼬리 방향으로 설계되었다:
5'-GGCAAAATTAGAGACTGTTACTTTAGGTAAGATCGG -3' (서열 52) 및
5'-CCGATCTTACCTAAAGTAACAGTCTCTAATTTTGCC -3' (서열 53).
제1 PCR의 생성물을 제2 PCR 반응을 위한 주형으로서 사용하였으며, 여기서
상류 프라이머 5'-AGCTCGCCCGGGGATCCTCTAG-3' (서열 50) 및
하류 프라이머 5'-CGATGCATTTCATCCTTAGTTATCAATACGCTGGGTTCAG-3' (서열 51)을 사용하였다. 제2 PCR의 생성물을 XbaI 및 Mph1103I로 소화하고 동일한 제한 효소로 절단된 pQβ10 발현 벡터 내로 클로닝하였다. PCR 반응을 제조자 프로토콜 (MBI Fermentas, 리투아니아 빌니우스 소재)에 따라 PCR 키트 시약을 써서 수행하였다.
직접적 표지 혼입 방법을 사용하여 서열분석하여, 원하는 돌연변이를 입증하였다. pQβ-243을 보유한 이. 콜라이 세포는 Qβ파아지 입자로부터 단리된 대조구 Qβ 코트 단백질과 SDS-PAGE 상에서 동시이동하는 14-kD 단백질의 효율적인 합성을 뒷받침하였다.
생성되는 아미노산 서열: (서열 18)
AKLETVTLGKIGKDGKQTLVLNPRGVNPTNGVASLSQAGAVP
ALEKRVTVSVSQPSRNRKNYKVQVKIQNPTACTANGSCDPSVTRQ
KYADVTFSFTQYSTDEERAFVRTELAALLASPLLIDAIDQLNPAY
pQβ-250의 제작:
플라스미드 pQβ10 을 pQβ-250의 제작용 초기 플라스미드로서 사용하였다. 돌연변이 Lys10→Arg를 위치-지정 돌연변이유발법으로 생성했다. 상류 프라이머
5'-GGCCATGGCACGACTCGAGACTGTTACTTTAGG-3' (서열 54) 및
하류 프라이머 5'-GATTTAGGTGACACTATAG-3' (서열 55)를 사용하여 돌연변이 PCR 단편을 합성하였으며, 이를 유일한 제한 부위 NcoI 및 HindIII에서 pQβ-185 발현 벡터 내로 도입하였다. PCR 반응을 제조자 프로토콜 (MBI Fermentas, 리투아니아 빌니우스 소재)에 따라 PCR 키트 시약을 써서 수행하였다.
직접적 표지 혼입 방법을 사용하여 서열분석하여, 원하는 돌연변이를 입증하였다. pQβ-250을 보유한 이. 콜라이 세포는 Qβ파아지 입자로부터 단리된 대조구 Qβ 코트 단백질과 PAGE 상에서 동시이동하는 14-kD 단백질의 효율적인 합성을 뒷받침하였다.
생성되는 아미노산 서열: (서열 19)
ARLETVTLGNIGRDGKQTLVLNPRGVNPTNGVASLSQAGAVP
ALEKRVTVSVSQPSRNRKNYKVQVKIQNPTACTANGSCDPSVTRQ
KYADVTFSFTQYSTDEERAFVRTELAALLASPLLIDAIDQLNPAY
pQβ-251의 제작:
플라스미드 pQβ10 을 pQβ-251의 제작용 초기 플라스미드로서 사용하였다. 돌연변이 Lys10→Arg를 역방향 PCR로 생성했다. 역방향 프라이머는 역전된 꼬리-대-꼬리 방향으로 설계되었다:
5'-GATGGACGTCAAACTCTGGTCCTCAATCCGCGTGGGG -3' (서열 56) 및
5'-CCCCACGCGGATTGAGGACCAGAGTTTGACGTCCATC -3' (서열 57).
제1 PCR의 생성물을 제2 PCR 반응을 위한 주형으로서 사용하였으며, 여기서
상류 프라이머 5'-AGCTCGCCCGGGGATCCTCTAG-3' (서열 50) 및
하류 프라이머 5'-CGATGCATTTCATCCTTAGTTATCAATACGCTGGGTTCAG-3' (서열 51)를 사용했다. 제2 PCR의 생성물을 XbaI 및 Mph1103I로 소화하고 동일한 제한 효소로 절단된 pQβ10 발현 벡터 내로 클로닝하였다. PCR 반응을 제조자 프로토콜 (MBI Fermentas, 리투아니아 빌니우스 소재)에 따라 PCR 키트 시약을 써서 수행하였다.
직접적 표지 혼입 방법을 사용하여 서열분석하여, 원하는 돌연변이를 입증하였다. pQβ-251을 보유한 이. 콜라이 세포는 Qβ파아지 입자로부터 단리된 대조구 Qβ 코트 단백질과 SDS-PAGE 상에서 동시이동하는 14-kD 단백질의 효율적인 합성을 뒷받침하였다.
pQβ-259의 제작:
플라스미드 pQβ-251을 pQβ-259의 제작용 초기 플라스미드로서 사용하였다. 돌연변이 Lys2→Arg를 위치지정 돌연변이유발법으로 생성했다. 상류 프라이머
5'-GGCCATGGCACGACTCGAGACTGTTACTTTAGG-3' (서열 54) 및 하류 프라이머
5'-GATTTAGGTGACACTATAG-3' (서열 55)를 사용하여 돌연변이 PCR 단편을 합성하였으며, 이를 유일한 제한 부위 NcoI 및 HindIII에서 pQβ-185 발현 벡터 내로 도입하였다. PCR 반응을 제조자 프로토콜 (MBI Fermentas, 리투아니아 빌니우스 소재)에 따라 PCR 키트 시약을 써서 수행하였다.
직접적 표지 혼입 방법을 사용하여 서열분석하여, 원하는 돌연변이를 입증하였다. pQβ-259를 보유한 이. 콜라이 세포는 Qβ파아지 입자로부터 단리된 대조구 Qβ 코트 단백질과 SDS-PAGE 상에서 동시이동하는 14-kD 단백질의 효율적인 합성을 뒷받침하였다.
생성되는 아미노산 서열: (서열 21)
AKLETVTLGNIGKDGKQTLVLNPRGVNPTNGVASLSQAGAVP
ALEKRVTVSVSQPSRNRKNYKVQVKIQNPTACTANGSCDPSVTRQ
KYADVTFSFTQYSTDEERAFVRTELAALLASPLLIDAIDQLNPAY
Qβ및 Qβ돌연변이체의 발현 및 정제를 위한 일반적 방법
발현
이. 콜라이 JM109를 Qβ 코트 단백질 플라스미드로 형질전환시켰다. 20 ㎍/ml 암피실린을 함유하는 LB 액체 배지 5 ml를 Qβ 코트 단백질 발현 플라스미드로 형질전환된 클론으로 접종하였다. 이 접종된 배양물을 37 ℃에서 16-24 시간 동안 진탕없이 인큐베이션시켰다. 이어서, 준비된 접종물을 20 ㎍/ml 암피실린이 함유된 새 LB 배지 100-300 ml로 1:100으로 희석하고 진탕없이 37 ℃에서 밤새 인큐베이션시켰다. 생성된 제2 접종물을 1 ％ 카사미노산 및 0.2 ％ 포도당을 함유하는 M9 배지로 플라스크 내에서 1:50으로 희석하고 진탕하에 밤새 37 ℃에서 인큐베이션시켰다.
정제
정제 과정을 위한 용액 및 완충제:
1. 용균 완충제 LB
5 mM EDTA, 0.1 ％ 트리톤X-100 및 ml 당 5 mg 농도의 새로 제조된 PMSF를 포함하는 50 mM 트리스-HCl pH 8.0. 리소자임 및 DNase는 없음.
2. SAS
수 중에 완충된 황산암모늄
3. 완충제 NET
5 mM EDTA 및 150 mM NaCl 함유하는 20 mM 트리스-HCl, pH 7.8
4. PEG
NET 중의 40 ％ (w/v) 폴리에틸렌글리콜 6000
분쇄 및 용균
냉동된 세포를 LB에 2 ml/g 세포로 재현탁시켰다. 이 혼합물을 15 초 동안 22 kH로 5회 초음파처리하였으며, 간격은 얼음 상에서 이 용액을 냉각시키기 위해 1 분으로 하였다. 용균물을 그 다음 14000 rpm에서 1 시간 동안 자네키 (Janecki) K 60 로터를 사용하여 원심분리하였다. 하기한 원심분리 단계는 다른 언급이 없다 면 모두 동일한 로터를 사용하여 수행하였다. 상층물은 4 ℃에 보관하고 세포 찌꺼기는 LB로 2회 세척하였다. 원심분리 후 용균물의 상층물 및 세척 분획물을 모았다.
분획화
상기 모은 용균물로 교반하면서 황산암모늄 포화용액을 적가하였다. SAS의 부피를 총 부피의 1/5로 조절하여 20 ％의 포화도를 얻었다. 이 용액을 밤새 방치해 두고 20 분 동안 14000 rpm에서 다음날 원심분리하였다. 이 펠렛을 소량의 20 ％ 황산암모늄으로 세척하고 다시 원심분리하였다. 얻어진 상층물을 모으고, SAS를 적가하여 40 ％ 포화도를 얻었다. 이 용액을 밤새 방치해 두었다가 다음날 20 분동안 14000 rpm에서 원심분리하였다. 얻어진 펠렛을 NET 완충제 중에 용해하였다.
크로마토그래피
NET 완충제 중에 재용해된 캡시드 또는 VLP 단백질을 세파로오스 CL-4B 컬럼 상에 로딩하였다. 3 개 피크를 크로마토그래피 동안 용출하였다. 첫번째 것은 주로 막 및 막 단편들을 포함하며 수집하지 않았다. 캡시드는 제2 피크에 포함되었으며, 세번째 것은 다른 이. 콜라이 단백질을 함유하였다.
이 피크 분획물을 모으고 NaCl 농도를 최종 농도 0.65 M으로 조절하였다. 모은 피크 분획의 절반에 상응하는 PEG 용액을 교반하면서 적가하였다. 이 용액을 교반하지 않고 밤새 방치해 두었다. 캡시드 단백질은 20 분 동안 14000 rpm에서 원심분리에 의하여 침강시켰다. 그 다음 이를 최소 부피의 NET 중에 용해하고 다시 세파로오스 CL-4B 컬럼 상에 로딩하였다. 이 피크 분획물을 모으고 포화도 60 ％ (w/v)의 황산암모늄으로 침전시켰다. 원심분리 및 NET 완충제 중에 재용해 후에, 캡시드 단백질을 재크로마토그래피를 위해 세파로오스 CL-6B 컬럼 상에 로딩하였다.
투석 및 건조
위에서 얻어진 피크 분획물을 모으고 멸균수에 대해 광범위하게 투석하고 보관을 위해 동결건조하였다.
발현 및 정제 Qβ-240
세포 (이. 콜라이 JM 109, 플라스미드 pQβ-240로 형질전환됨)를 LB에 재현탁하고 15 초 동안 5회 초음파처리하고 (워터 아이스 재킷), 1 시간 동안 13000 rpm에서 원심분리하였다. 상층물을 추가 처리하기까지 4 ℃에서 보관하고 찌꺼기는 LB 9 ml 2회 세척하고 마지막으로 LB 중의 0.7 M 우레아 9 ml로 세척했다. 모든 상층물을 모으고 세파로오스 CL-4B 컬럼 상에 로딩하였다. 모은 피크 분획물을 황산암모늄으로 침전시키고 원심분리하였다. 그 다음 재용해된 단백질을 세파로오스 2 B 컬럼 상에서 추가로 정제하고 마지막으로 세파로오스 6B 컬럼 상에서 정제하였다. 캡시드 피크는 물에 마지막으로 광범위하게 투석하고 상기한 바와 같이 동결건조하였다. 코트 단백질의 캡시드로의 조립은 전자현미경으로 확인되었다.
발현 및 정제 Qβ-243
세포 (이. 콜라이 RR1)를 LB에 재현탁하여 일반적 과정에서 설명한 바와 같이 처리하였다. 이 단백질을 세파로오스 CL-4B 상에 두 개의 연속적 겔 여과 단계에 의하여 정제하고 마지막으로 세파로오스 CL-2B 컬럼 상에서 정제하였다. 피크 분획물을 모으고 상기한 바와 같이 동결건조하였다. 피크 분획물을 모으고 상기한 바와 같이 동결건조하였다. 코트 단백질의 캡시드로의 조립을 전자현미경으로 확인하였다.
발현 및 정제 Qβ-250
세포 (이. 콜라이 JM 109, Qβ-250로 형질전환됨)를 LB에 재현탁하여 상기한 바와 같이 처리하였다. 이 단백질을 세파로오스 CL-4B 상에서 겔 여과에 의하여 정제하고 마지막으로 세파로오스 CL-2B 컬럼 상에서 정제하고 상기한 바와 같이 동결건조하였다. 코트 단백질의 캡시드로의 조립을 전자현미경으로 확인하였다.
발현 및 정제 Qβ-259
세포 (이. 콜라이 JM 109, Qβ-259로 형질전환됨)를 LB에 재현탁하고 초음파 처리하였다. 찌꺼기를 LB 10 ml로 1회 세척하고 2회째에는 LB 중의 0.7 M 우레아 10 ml로 세척하였다. 단백질을 두 개의 겔 여과 크로마토그래피 단계에 의하여 세 파로오스 CL-4B 컬럼 상에서 정제하였다. 이 단백질을 상기한 바와 같이 투석하고 동결건조하였다. 코트 단백질의 캡시드로의 조립을 전자현미경으로 확인하였다.
B. 재조합 AP205 VLP의 클로닝, 발현 및 정제
AP205 코트 단백질 유전자의 클로닝
AP205 코트 단백질 (CP)의 cDNA (서열 28)를, 서열분석을 위하여 상업용 플라스미드 pCR 4-TOPO 내에 클로닝하고 역방향 전사-PCR 기술을 사용하여 파아지 AP205 RNA로부터 생성된 두 cDNA 단편으로부터 조립하였다. 역방향 전사 기술은 관련분야에의 숙련자들에게 잘 알려져 있다. 플라스미드 p205-246 중에 포함된 제1 단편은 CP 서열의 상류에 269 뉴클레오티드 및 CP의 첫번째 24 N-말단 아미노산을 코딩하는 74 뉴클레오티드를 포함했다. 플라스미드 p205-262 중에 포함된 제2 단편은 CP의 아미노산 12-131을 코딩하는 364 뉴클레오티드 및 CP 서열의 하류에 추가의 162 뉴클레오티드를 포함했다. p205-246 및 p205-262는 둘다 클로빈스(J. Klovins)가 제공했다.
하나의 전장 CP 서열에서 플라스미드 p205-246 및 p205-262로부터의 두 CP 단편을 융합하기 위하여 플라스미드 283-58를 두 단계 PCR에 의하여 설계하였다.
플라스미드 pQb185 내로 클로닝하기 위한 NcoI 부위를 포함하는 상류 프라이머 p1.44 또는 플라스미드 pQb10 내로 클로닝하기 위한 XbaI 부위를 포함하는 p1.45, 및 HindIII 제한 부위를 포함하는 하류 프라이머 p1.46을 사용하였다 (제한 효소의 인식 서열은 밑줄침):
p1.44 5'-AACC ATG GCA AAT AAG CCA ATG CAA CCG-3' (서열 79)
p1.45 5'-AATCTAGAATTTTCTGCGCACCCATCCCGG-3' (서열 80)
p1.46 5'-AAAAGC TTA AGC AGT AGT ATC AGA CGA TAC G-3' (서열 81)
p205-262에 포함된 단편의 5' 말단에서 어닐닝되는 추가의 프라이머 p1.47 및 플라스미드 p205-246 중에 포함된 단편의 3' 말단에서 어닐링되는 p1.48를 사용하여 제1 PCR에서 단편들을 증폭시켰다. 프라이머 p1.47 및 p1.48은 서로 상보적이다.
p1.47: 5'-GAGTGATCCAACTCGTTTATCAACTACATTT-TCAGCAAGTCTG-3' (서열 82)
p1.48: 5'-CAGACTTGCTGAAAATGTAGTTGATAAACGA-GTTGGATCACTC-3' (서열 83)
첫번째 두 PCR 반응에서, 2개의 단편들을 생성하였다. 제1 단편을 p1.45 및 p1.48와 주형 p205-246을 써서 생성하였다. 제2 단편을 프라이머 p1.47 및 p1.46와 주형 p205-262를 써서 생성하였다. 두 단편을 프라이머 조합 p1.45와 p1.46 또는 p1.44와 p1.46와 함께 제2 PCR 반응, 스플라이스-오버랩 연장을 위해 주형으로서 사용하였다. 제2 단계 PCR 반응들의 생성물 XbaI 또는 NcoI 각각 및 HindIII로 소화하고 동일한 제한 부위와 함께 이. 콜라이 트립토판 오페론 프로모터의 제어하에서 두 pGEM-유래 발현 벡터들 pQb10 또는 pQb185 각각 내로 클로닝하였다.
두 플라스미드 즉, pQb10 중의 wt AP205 CP (서열 28)을 코딩하는 유전자를 포함하는 pAP283-58 (서열 27) 및 pQb185 중에 돌연변이 Pro5-->Thr (서열 29)가 있는 pAP281-32 (서열 30)을 얻었다. 코트 단백질 서열을 DNA 서열분석에 의하여 증명하였다. PAP283-58는 XbaI 부위의 하류에 CP의 ATG 코돈의 상류에 49 뉴클레 오티드를 포함하며 코트 단백질 mRNA의 추정적인 본래의 리보솜 결합 부위를 포함한다.
재조합 AP205 VLP의 발현 및 정제
A. 재조합 AP205 VLP의 발현
이. 콜라이 JM109를 플라스미드 pAP283-58로 형질전환하였다. 20 ㎍/ml 암피실린이 함유된 LB 액체 배지 5 ml를 단일 콜로니로 접종하고 진탕없이 16-24 시간 동안 37 ℃에서 인큐베이션시켰다.
준비한 접종물을 20 ㎍/ml 암피실린을 함유하는 LB 배지 100-300 ml로 1:100으로 희석하였고 진탕없이 밤새 37 ℃에서 인큐베이션하였다. 생성된 제2 접종물을 0.2 ％ 포도당 및 완충용 인산염을 함유하는 2TY 배지에서 1:50으로 희석하였고 진탕기에서 37 ℃로 밤새 인큐베이션시켰다. 세포를 원심분리에 의하여 수거하여 -80 ℃에서 냉동시켰다.
B. 재조합 AP205 VLP의 정제
용액 및 완충제:
용균 완충제
5 mM EDTA, 0.1 ％ 트리톤X-100 및 ml 당 5 mg 농도의 PMSF를 포함하는 50 mM 트리스-HCl pH 8.0.
SAS
수 중에 완충된 황산암모늄
완충제 NET
5 mM EDTA 및 150 mM NaCl 함유하는 20 mM 트리스-HCl, pH 7.8
PEG
NET 중의 40 ％ (w/v) 폴리에틸렌글리콜 6000
용균
냉동된 세포를 LB에 2 ml/g 세포로 재현탁시켰다. 이 혼합물을 15 초 동안 22 kH로 5회 초음파처리하였으며, 간격은 얼음 상에서 이 용액을 냉각시키기 위해 1 분으로 하였다. 용균물을 그 다음 12000 rpm에서 20 분 동안 F34-6-38 로터 (Ependorf)를 사용하여 원심분리하였다. 하기한 원심분리 단계는 다른 언급이 없다면 모두 동일한 로터를 사용하여 수행하였다. 상층물은 4 ℃에 보관하고 세포 찌꺼기는 용균 완충제로 2회 세척하였다. 원심분리 후 용균물의 상층물 및 세척 분획물을 모았다.
황산암모늄 침전물을 더 사용하여 AP205 VLP를 정제하였다. 제1 단계에서는 AP205 VLP가 침전되지 않는 황산암모늄의 농도를 선택한다. 생성된 펠렛을 폐기한다. 다음 단계에서는 AP205 VLP가 정량적으로 침전되는 황산암모늄 농도를 선택하고, AP205 VLP를 원심분리 (14000 rpm, 20 분 동안)에 의하여 침전 단계의 펠렛으로부터 단리하였다. 얻어진 펠렛을 NET 완충제에서 용해하였다.
크로마토그래피
모은 상층물로부터의 캡시드 단백질을 세파로오스 4B 컬럼 (2.8 x 70 cm) 상에 로딩하고 NET 완충제로 4 m/h/분획으로 용출하였다. 분획 28-40을 수집하고 60 ％ 포화도의 황산암모늄으로 침전시켰다. 침전하기 전에 AP205에 특이적인 항혈청을 써서 SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯에 의하여 분획물을 분석하였다. 원심분리에 의하여 단리된 펠렛을 NET 완충제에 재용해하였고 세파로오스 2B 컬럼 (2.3 x 65 cm) 상에 로딩하고 3 ml/h/분획으로 용출하였다. 분획을 SDS-PAGE로 분석하고 분획 44-50을 수집하여, 모으고 60 ％ 포화도의 황산암모늄으로 침전시켰다. 원심분리에 의하여 단리된 펠렛을 NET 완충제 중에 재용해하고 세파로오스 6B 컬럼 (2.5 x 47 cm) 상에서 정제하고 3 ml/hr/분획으로 용출하였다. 분획물을 SDS-PAGE로 분석하였다. 분획 23-27을 수집하고 염 농도를 0.5 M로 조절하고 PEG 6000으로 침전시키고, 수 중에 40 ％ 스톡으로부터 최종 농도 13.3 ％까지 첨가하였다. 원심분리에 의하여 단리된 펠렛을 NET 완충제 중에 재용해하고 상기한 것과 동일한 세파로오즈 2B 컬럼 상에 로딩하고, 동일한 방식으로 용출하였다. 분획 43-53을 수집하고 포화도 60 ％의 황산암모늄으로 침전시켰다. 원심분리에 의하여 단리된 펠렛을 수 중에 재용해하고, 얻어진 단백질 용액을 광범위하게 물에 대해 투석하였다. 세포 1 g 당 정제된 단백질 약 10 mg을 단리할 수 있다.
전자현미경로 바이러스-유사 입자를 검사한 결과 이들이 파아지 입자와 동일하다는 것을 보여주었다.
<실시예 2>
HBcAg(1-149)의 c/e1 에피토프 내로 라이신 잔기를 포함하는 펩티드의 삽입.
HBcAg의 c/e1 에피토프 (잔기 72 내지 88)는 B형 간염 바이러스 캡시드 (HBcAg)의 표면 상에 팁 영역에 위치한다. 이 영역의 일부 (프롤린 79 및 알라닌 80)을 펩티드 Gly-Gly-Lys-Gly-Gly (서열 33)으로 유전적으로 대체하여 HBcAg-Lys 제작물 (서열 26)을 생성한다. 도입된 라이신 잔기는, 유리 시스테인기를 포함하는 임의의 항원과 HBcAg 입자의 분자간 화학적 가교결합에 사용될 수 있는 그 측쇄에 반응성 아미노기를 포함한다.
서열 78에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 HBcAg-Lys DNA를 PCR을 통해 생성하였다: HBcAg 단편 (아미노산 잔기 1 내지 78 및 81 내지 149)을 코딩하는 두 단편을 따로따로 PCR로 증폭시켰다. 이들 PCR에 사용된 프라이머는 또한 Gly-Gly-Lys-Gly-Gly 펩티드 (서열 33)를 코딩하는 DNA 서열을 도입하였다. HBcAg (1 내지 78) 단편을 프라이머 EcoRIHBcAg(s) 및 Lys-HBcAg(as)를 사용하여 pEco63로부터 증폭시켰다. HBcAg (81 내지 149) 단편을 프라이머 Lys-HBcAg(s) 및 HBcAg(1-149)Hind(as)를 사용하여 pEco63로부터 증폭시켰다. 프라이머 Lys-HBcAg(as) 및 Lys-HBcAg(s)는 뒤이은 조립 PCR 에서 두 PCR 생성물의 융합을 허용하는 두 PCR 생성물의 말단에 상보적 DNA 서열을 도입하였다. 조립된 단편은 프라이머 EcoRIHBcAg(s) 및 HbcAg(1-149)Hind(as)를 사용하여 PCR로 증폭시켰다.
PCR의 경우, 각 올리고 100 pmol 및 주형 DNA의 50 ng을 사용하여 Pwo 중합 효소 2 유닛, 0.1 mM dNTP 및 2 mM MgSO4을 써서 50 ml 반응 혼합물 중에 사용하였다. 두 반응의 경우, 온도 주기를 다음과 같이, 94°C에서 2 분, 94°C에서 1 분 30 주기, 50°C에서 1 분, 72°C에서 2 분으로 하였다.
프라이머 서열
EcoRIHBcAg(s):
(5'-CCGGAATTCATGGACATTGACCCTTATAAAG-3') (서열 58),
Lys-HBcAg(as):
(5'-CCTAGAGCCACCTTTGCCACCATCTTCTAAATTAG-TACCCACCCAGGTAGC-3') (서열 59),
Lys-HBcAg(s):
(5'-GAAGATGGTGGCAAAGGTGGCTCTAGGGACC-TAGTAGTCAGTTATGTC -3') (서열 60),
HBcAg(1-149)Hind(as):
(5'-CGCGTCCCAAGCTTCTAAACAACAGTAGTCTCCGGAAG-3') (서열 61).
PCR에 의한 두 PCR 단편의 융합을 위하여 프라이머 EcoRIHBcAg(s) 및 HBcAg(1-149)Hind(as) 100 pmol를 Pwo 중합효소 2 유닛, 0.1 mM dNTP 및 2 mM MgSO4를 함유하는 50 ml 반응 혼합물 중의 두 정제된 PCR 단편 100 ng과 함께 사용하였다. PCR 주기 조건은 2 분간 94 ℃, 94 ℃ (1 분)의 30 주기, 50 ℃ (1 분), 72 ℃ (2 분)이었다. 조립된 PCR 생성물을 아가로오스 겔 전기영동으로 분석하고 정제하고 19 시간 동안 적절한 완충제 중에서 EcoRI 및 HindIII 제한 효소로소화시켰 다. 소화된 DNA 단편을 EcoRI/HindIII-소화된 pKK 벡터 내로 라이게이션하여 pKK-HBcAg-Lys 발현 벡터를 생성하였다. PCR 생성물을 벡터 내로 삽입하는 것은 EcoRI/HindIII 제한 분석법 및 삽입물의 DNA 서열분석을 통해 분석하였다.
<실시예 3>
HBcAg-Lys의 발현 및 정제
이. 콜라이 균주 K802 또는 JM109를 pKK-HBcAg-Lys로 형질전환하였다. 박테리아의 밤새 배양물 1 ml를 사용하여 100 ㎍/ml 암피실린을 함유한 LB 배지 100 ml를 접종하였다. 이 배양물을 600 nm에서의 OD가 대략 0.8에 도달할 때까지 37 ℃에서 4 시간 동안 증식하였다. HBcAg-Lys의 합성의 유도는 IPTG를 최종 농도 1 mM까지 첨가함으로써 수행하였다. 유도 후에는 4 시간 동안 박테리아를 추가로 37 ℃에서 진탕시켰다. 박테리아를 15 분 동안 5000 x g으로 원심분리하여 수거하였다. 이 펠릿을 -80 ℃에서 냉동시켰다. 펠렛을 해동하고 200 ㎍/ml 리소자임 및 10 ㎕ 벤조나제 (Merck)가 보충된 박테리아 용균 완충제 (10 mM Na2HPO4, pH 7.0, 30 mM NaCl, 0.25％ 트윈-20, 10 mM EDTA) 중에 재현탁시켰다. 세포를 실온에서 30 분 동안 인큐베이션시키고 초음파처리하여 파쇄하였다. pKK-HBcAg-Lys 발현 플라스미드 또는 대조구 플라스미드를 보유하는 이. 콜라이 세포를 IPTG와 함께 HBcAg-Lys 발현의 유도에 사용하였다. IPTG를 첨가하기 전에 샘플을 pKK-HBcAg-Lys 플라스미드를 보유하는 박테리아 배양물 및 대조구 플라스미드를 보유하는 배 양물로부터 분리하였다. IPTG를 첨가한 지 4 시간 후에 다시 샘플을 pKK-HBcAg-Lys를 함유하는 배양물 및 대조구 배양물로부터 분리하였다. 단백질 발현을 SDS-PAGE을 통해 관찰한 후 쿠마시 염색으로 검사하였다.
그 다음 용균물을 불용성 세포 찌꺼기를 제거하기 위하여 12,000 x g에서 30 분 동안 원심분리하였다. 상층물 및 펠렛을 HBcAg에 대한 모노클로날 항체(YVS1841, 애큐릿 케미칼 및 사이언티픽사 (Accurate Chemical and Scientific Corp., 미국 뉴욕주 웨스버리 소재)로부터 구입)를 사용하여 웨스턴 블롯을 통해 분석하였는데, HBcAg-Lys 단백질의 상당한 양이 가용성임을 나타냈다. 간략하게는, HBcAg-Lys를 발현하는 이. 콜라이 세포로부터의 용균물 및 대조구 세포로부터의 용균물을 30 분 동안 14,000 x g에서 원심분리하였다. 상층물 (=가용성 분획) 및 펠렛 (=불용성 분획)을 분리하여 SDS 샘플 완충제로 동일 부피로 희석하였다. 샘플을 SDS-PAGE 이후 항-HBcAg 모노클로날 항체 YVS 1841를 써서 웨스턴 블롯으로 분석하였다.
65 ％ 수크로오스 용액 4 ml, 15 ％ 수크로오스 용액 3 ml, 박테리아 용균물 4 ml 으로 이루어진 수크로오스 단계 구배를 사용하여 청정해진 세포 용균물을 단계-구배 원심분리하였다. 이 샘플을 4 ℃에서 100,000 x g로 3 시간 동안 원심분리하였다. 원심분리 후에 구배의 상부로부터 1 ml 분획을 수집하고 SDS-PAGE에 이어 쿠마시 염색으로 분석하였다. HBcAg-Lys 단백질은 쿠마시 염색으로 검출하였다.
HBcAg-Lys 단백질은 15 내지 65 ％ 수크로오스 사이의 인터페이스에서 풍부 해 졌는데, 이는 캡시드 입자를 형성했음을 지시한다. 박테리아 단백질 대부분은 구배의 수크로오스 없는 상층에 잔류하기 때문에 HBcAg-Lys 입자의 단계-구배 원심분리는 입자의 풍부화 및 부분 정제 둘다를 낳는다.
대량으로 HBcAg-Lys의 발현 및 정제를 다음과 같이 수행하였다. 밤새 배양물을 100 ml LB, 100 ㎍/ml 암피실린 중에 단일 콜로니를 접종하고 37 ℃에서 배양물을 밤새 증식시켜서 준비했다. 예비배양물 25 ml를 다음날 LB 암피실린 800 ml 중에 희석하고, 이 배양물을 0.6-0.8의 흡광도 OD600까지 증식하였다. 이어서 배양물을 1 mM IPTG로 유도하고 4 시간 더 증식하도록 놓아두었다. 세포를 수거하고 상기한 바와 같이 본질적으로 용균시켰다.
이어서 청정해진 세포 용균물로부터 황산암모늄 (30 ％ 포화도)으로 단백질을 우선 침전시킨 후 겔 여과 컬럼 (세파크릴 S-400, Pharmacia)상에 재용해된 펠렛을 로딩하여 HBcAg-Lys를 정제하였다. 모은 분획을 황산암모늄으로 다시 침전시키고, 펠렛을 재용해하고 동일한 겔 여과 컬럼 상에 두번째로 로딩하였다. 분획을 마지막으로 모으고 농축하고 농도를 브래드포드 (Bradford) 시험 (BioRad)을 사용하여 평가하였다.
<실시예 4>
유리 시스테인 잔기가 없고 삽입된 라이신 잔기를 포함하는 HBcAg의 제작
서열 25의 48 및 107에 상응하는 위치에 시스테인 잔기가 없고 삽입된 라이 신 잔기를 포함하는, HBcAg-lys-2cys-Mut로서 여기에 언급되는, 간염 코어 항원 (HBcAg)을 다음의 방법을 사용하여 제작하였다.
우선 실시예 2에서 상기한 바와 같이 제조된 HBcAg-Lys 유전자의 단편 3 개를 다음의 PCR 프라이머 조합을 사용하여 따로따로 증폭시켜서 두 개의 돌연변이를 도입했다. PCR 방법 및 종래의 클로닝 기술을 사용하여 HBcAg-lys-2cys-Mut 유전자를 제조하는 데에 사용하였다.
간략하게 말하자면 다음의 프라이머를 사용하여 단편 1을 제조하였다:
프라이머 1: EcoRIHBcAg(s)
CCGGAATTCATGGACATTGACCCTTATAAAG (서열 58)
프라이머 2: 48as
GTGCAGTATGGTGAGGTGAGGAATGCTCAGGAGACTC (서열 62)
다음의 프라이머를 사용하여 단편 2를 제조하였다:
프라이머 3: 48s
GSGTCTCCTGAGCATTCCTCACCTCACCATACTGCAC (서열 63)
프라이머 4: 107as
CTTCCAAAAGTGAGGGAAGAAATGTGAAACCAC (서열 64)
The following primers were used to prepare fragment 3:
프라이머 5: HBcAg149hind-as
CGCGTCCCAAGCTTCTAAACAACAGTAGTCTCCGGAAGC-GTTGATAG (서열 65)
프라이머 6: 107s
GTGGTTTCACATTTCTTCCCTCACTTTTGGAAG (서열 66)
그 다음 단편 1 및 2를 PCR 프라이머 EcoRIHBcAg(s) 및 107as와 합하여 단편 4를 얻었다. 그 다음 단편 4 및 단편 3를 프라이머 EcoRIHBcAg(s) 및 HBcAg149hind-as와 합하여 전장 유전자를 제조하였다. 그 다음 전장유전자를 EcoRI (GAATTC) 및 HindIII (AAGCTT) 효소로 소화하여 동일한 제한 부위에서 절단된 pKK 벡터 (Pharmacia) 내로 클로닝하였다. HBcAg-lys-2cys-Mut의 발현 및 정제를 실시예 3에 기재된 바와 같이 수행하였다.
<실시예 5>
HBcAg1-185-Lys의 제작
간염 코어 항원 (HBcAg) 1-185를 실시예 2에 기재된 바와 같이 변형하였다. HBcAg의 c/e1 에피토프 (잔기 72 내지 88) 영역의 일부 (프롤린 79 및 알라닌 80)를 펩티드 Gly-Gly-Lys-Gly-Gly (서열 33)으로 유전적으로 대체하여 HBcAg-Lys 제작물 (서열 26)을 생성한다. 도입된 라이신 잔기는, 유리 시스테인기를 포함하는 임의의 항원과 HBcAg 입자의 분자간 화학적 가교결합에 사용될 수 있는 그 측쇄에 반응성 아미노기를 포함한다. PCR 방법 및 전통적인 클로닝 기술을 사용하여 HBcAg1-185-Lys 유전자를 제조했다.
Gly-Gly-Lys-Gly-Gly 서열 (서열 33)은 실시예 2에서 상기한 바와 같이 pEco63로부터 HBcAg의 두 개의 별개의 단편을 증폭시키고 두 단편을 PCR로 융합하여 전장 유전자를 조립하였다. 다음의 PCR 프라이머 조합을 사용하였다:
단편 1:
프라이머 1: EcoRIHBcAg(s) (서열 58) (실시예 2 참조)
프라이머 2: Lys-HBcAg(as) (서열 59) (실시예 2 참조)
단편 2:
프라이머 3: Lys-HBcAg(s) (서열 60) (실시예 2 참조)
프라이머 4: HBcAgwtHindIIII
CGCGTCCCAAGCTTCTAACATTGAGATTCCCGAGATTG (서열 67)
조립:
프라이머 1: EcoRIHBcAg(s) (서열 58) (실시예 2 참조)
프라이머 2: HBcAgwtHindIIII (서열 67)
조립된 전장 유전자를 EcoRI (GAATTC) 및 HindIII (AAGCTT) 효소로 소화하고 동일한 제한 부위에서 절단된 pKK 벡터 (Pharmacia) 내로 클로닝하였다.
<실시예 6>
HBcAg의 MIR 영역에서 펩티드 에피토프의 융합
HBcAg1-185의 잔기 79 및 80을 서열 VNLTWSRASG (서열 68)의 에피토프 CεH3으로 치환하였다. CεH3 서열은 인간 IgE의 중쇄의 제3 불변 도메인의 서열로부터 유래한다. 에피토프를 조립 PCR 방법을 사용하여 HBcAg1-185 서열에 삽입하였다. 제1 PCR 단계에서, ATCC 클론 pEco63에서 기원하며 프라이머 HBcAg-wt EcoRI fwd 및 HBcAg-wt Hind III rev를 써서 증폭된 HBcAg1-185 유전자를 두 개의 별개의 반 응에서 주형으로 사용하여 CεH3 서열을 코딩하는 서열 요소를 포함하는 두 개의 단편을 증폭시켰다. 이들 두 단편은 제2 PCR 단계에서, 조립 PCR 반응에서 조립하였다.
제1 PCR 단계에서의 프라이머 조합: CεH3fwd와 HBcAg-wt Hind III rev, 및 HBcAg-wt EcoRI fwd와 CεH3rev. 조립 PCR 반응에서 제1 PCR 단계에서 단리된 두 개의 단편을 외부 (outer) 프라이머 없이 3 PCR 주기 동안에 먼저 조립하고 나중에 다음 25 주기를 위해 외부 프라이머를 반응 혼합물에 첨가하였다. 외부 프라이머: HBcAg-wt EcoRI fwd 및 HBcAg-wt Hind III rev.
PCR 생성물은 이. 콜라이에서의 발현을 위해 EcoRI 및 HindIII를 사용하여 pKK223.3에 클로닝하였다 (실시예 2 참조). 키메라 VLP는 실시예 2에 기재된 바와 같이 이. 콜라이에서 발현되고 정제되었다. HBcAg1-185-CεH3가 겔 여과로부터 용출되는 용출 부피는 키메라 VLP로의 융합 단백질의 조립을 보여주었다.
프라이머 서열:
CεH3fwd:
5'GTT AAC TTG ACC TGG TCT CGT GCT TCT GGT GCA TCC AGG GAT CTA GTA GTC 3' (서열 69)
V N L T W S R A S G A80 S R D L V V86 (서열 70)
CεH3rev:
5' ACC AGA AGC ACG AGA CCA GGT CAA GTT AAC ATC TTC CAA ATT ATT ACC CAC 3' (서열 71)
D78 E L N N G V72 (서열 72)
HBcAg-wt EcoRI fwd:
5' CCGgaattcATGGACATTGACCCTTATAAAG (서열 73)
HBcAg-wt Hind III rev:
5' CGCGTCCCaagcttCTAACATTGAGATTCCCGAGATTG (서열 74)
<실시예 7>
HbcAg의 MIR 영역에 Aβ1-6 펩티드의 융합.
HBcAg1-185의 잔기 79 및 80을 서열 DAEFRH (서열 75) 또는 DAEFGH (서열 76)의 Aβ1-6 펩티드로 치환하였다. 두 개의 오버랩핑 프라이머를 실시예 6에 기재된 동일한 전략을 사용하여 설계하고 융합 단백질을 조립 PCR로 제작하였다. PCR 생성물을 pKK223.3 벡터에 클로닝하고, 이. 콜라이 K802에서 발현시켰다. 키메라 VLP를 실시예 3에서 기재된 바와 같이 발현하고 정제한다.
<실시예 8>
CP 연장부의 19번 위치에서 말단절단된 QβA1 단백질의 C-말단으로의 Aβ1-6 펩티드의 융합
QβA1 유전자의 5' 말단에서 어닐링하는 프라이머 및 A1 유전자의 3' 말단에서 어닐링하며 서열 DAEFRH (서열 75) 또는 DAEFGH (서열 76)인 Aβ1-6 펩티드를 코딩하는 서열 요소를 추가로 포함하는 프라이머를 pQβ10을 주형으로서 써서 PCR 반응에 사용한다. PCR 생성물은 pQβ10에 클로닝되고 (Kozlovska T.M. et al., Gene 137: 133-37 (1993)), 실시예 1에 기재된 바와 같이 키메라 VLP 발현되고 정제되었다.
<실시예 9>
fr 코트 단백질의 2번 및 3번 위치 사이의 Aβ1-6 펩티드의 삽입
서열 DAEFRH (서열 75) 또는 DAEFGH (서열 76)인 Aβ1-6 펩티드의 서열을 코딩하며 Bsp119I 상용성 말단 및 프레임내 삽입을 가능하게 하는 추가의 뉴클레오티드를 포함하는 상보적 프라이머를 표준적인 분자생물학 기술을 통해 pFrd8 벡터의 Bsp119I 부위에 삽입한다 (Pushko, P. et al., Prot. Eng. 6: 883-91 (1993)). 이와 다르게는, pFrd8 벡터의 오버행을 Bsp119I으로 소화한 후 클레노우 (Klenow)로 채우고, Aβ1-6 펩티드의 서열을 코딩하는 올리고뉴클레오티드 및 프레임내 클로닝을 위한 추가의 뉴클레오티드를 클레노우로 처리한 후 pFrd8에서 연결한다. 오른쪽 방향으로 삽입물을 포함한 클론을 서열분석을 통해 분석한다. 이. 콜라이 JM109E 또는 이. 콜라이 K802에서 키메라 융합 단백질의 발현 및 정제는 문헌 (Pushko, P. et al, Prot. Eng. 6:883-91 (1993))에 기재된 바와 같이 수행하나, 다만 크로마토그래피 단계는 세파로오스 CL-4B 또는 세파크릴 S-400 (Pharmacia) 컬럼을 사용하여 수행한다. 세포 용균물을 황산암모늄으로 침전시키고 2 개의 연속적 겔 여과 정제 단계에 의하여 실시예 1에서 Qβ에 대해 기재된 것과 유사하게 정제한다.

<실시예 10>
벡터 pOGS8111에서 Ty1 단백질 p1의 67 및 68번 위치의 사이에 Aβ1-6 펩티드의 삽입
말단이 NheI 부위와 상용성이 있는 서열 DAEFRH (서열 75) 또는 DAEFGH (서열 76)인 Aβ1-6 펩티드를 코딩하기 위한 두 개의 상보적 올리고뉴클레오티드를 합성한다. EP677,111의 설명에 따라서 Aβ1-6 펩티드를 코딩하는 서열의 프레임내 삽입이 가능하도록 추가의 뉴클레오티드를 부가한다. 삽입된 에피토프에 인접하는 아미노산 AS 및 SS는 pOGS8111의 TyA(d) 유전자 중에 올리고뉴클레오티드의 삽입을 초래하는 변경된 NheI 부위에 의하여 코딩된다.
EP0677111에 기재된 바와 같이 키메라 Ty VLP의 발현을 위해 POGS8111를 S. 세레비지애 균주 MC2 내로 형질전환시켰다. 키메라 Ty VLP를 EP 677,111에 기재된 바와 같이 수크로오스 구배 초원심분리에 의하여 정제한다.
<실시예 11>
1형 파필로마바이러스 (BPV-1)의 주요 캡시드 단백질 L1 내로의 Aβ1-6 펩티드의 삽입.
서열 DAEFRH (서열 75) 또는 DAEFGH (서열 76)을 갖는 Aβ1-6 펩티드를 코딩하는 서열을, 문헌 (Chackerian, B. et al., Proc. Natl. Acad. USA 96: 2373-2378 (1999))에 기재된 바와 같이 pFastBac1 (GIBCO/BRL) 벡터에 클로닝된 BPV-1 L1 유 전자의 아미노산 130-136를 코딩하는 서열로 치환했다. 이 제작물의 서열을 뉴클레오티드 서열 분석에 의하여 증명했다. GIBCO/BRL 바큘로바이러스계를 제조자가 설명한 대로 사용하여 재조합 바큘로바이러스를 생성했다. 키메라 VLP를 문헌 (Kirnbauer, R. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 89:12180-84 (1992) 및 Greenstone, H.L., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 95:1800-05 (1998))에 기재된 바와 같이 바큘로바이러스 감염된 Sf9 세포로부터 정제했다.
<실시예 12>
VLP로 융합된 Aβ1-6 펩티드를 사용한 마우스의 면역.
실시예 7-11에서 생성된 서열 DAEFRH (서열 75) 또는 DAEFGH (서열 76)의 Aβ1-6 펩티드를 드러내는 키메라 VLP를 실시예 13 및 14에 기재된 바와 같이 인간 트랜스제닉 APP 마우스 또는 C57/BL6 마우스의 면역화에 사용하였다. 면역화된 마우스로부터 얻은 혈청을 실시예 13에 기재된 바와 같이 Aβ1-6 펩티드 또는 Aβ1-40 또는 Aβ1-42 특이적 ELISA에서 분석했다.
백신의 보호 효과는 실시예 14에 기재된 바와 같이 인간 APP 트랜스제닉 마우스의 큰 집단을 면역화하여 시험한다.
<실시예 13>
QβVLP (QβAβ1-6)으로의 Aβ1-6 펩티드의 커플링 및 QβAβ1-6를 사용한 마우스의 면역화
A. Aβ1-6 펩티드 QβVLP의 커플링
Aβ1-6 펩티드 (서열: NH2-DAEFRHGGC-CONH2) (서열 77)를 화학적으로 합성하였는데, 처음 NH2기는 이 펩티드가 유리 N-말단을 갖는다는 것을 지시하며, 마지막 NH2기는 이 펩티드가 아미드화된 카르복시 말단을 가짐을 지시한다. QβVLP은 실시예 1에 기재된 바와 같이 발현 및 정제하였다. 20 mM Hepes, 150 mM NaCl, pH 8.2 (HBS, pH 8.2) 중의 QβVLP는 2 mg/ml (브래드포드 분석에서 결정됨)의 농도에서 DMSO 중의 스톡으로부터 희석된, 1.43 mM SMPH (Pierce, 미국 아일랜드 록포드)과 실온 (RT)에서 30 분 동안 반응시켰다. 그 다음 반응 혼합물을 4 ℃에서 HBS, pH 8.2 완충제에 대해 투석하고 DMSO 중의 50 mM 스톡으로부터 반응 혼합물 중에 희석된, Aβ1-6 펩티드의 0.36 mM과 반응시켰다. 커플링 반응은 15 ℃에서 2 시간 동안 진행되게 방치해 두었고, 반응 혼합물을 1000 배 부피의 HBS pH 8.2에 대해 2 X 2 시간 투석하였고, 다음 사용할 때까지 -80 ℃에서 저장하기 위해 분액으로 액체 질소 중에서 급속냉동시켰다.
분액을 해동시켜서 Qβ VLP 서브유닛로의 Aβ1-6 펩티드의 커플링을 SDS-PAGE로 평가하고 단백질 농도는 브래드포드 분석에서 측정했다. 커플링 반응의 결과는 도 1에 도시하였다.
도 1은 Aβ1-6 펩티드 및 Qβ VLP의 커플링 반응의 SDS-PAGE 분석을 보여준다. 샘플은 쿠마시 브릴리언트 블루로 염색된, 16 ％ 트리스-글리신 겔 상에 환원성 조건하에서 시행되었다. 레인 1은 단백질 마커이며 상응하는 분자량이 겔의 왼쪽 가장자리에 표시했으며, 레인 2는 유도체화된 Qβ VLP 단백질이고 레인 3은 Aβ1-6 펩티드로의 Qβ VLP의 커플링 반응의 상층물이며, 레인 4는 Aβ1-6 펩티드로의 Qβ VLP의 커플링 반응의 펠렛이고, 단량체 당 1, 2 및 3 펩티드의 커플링에 상응하는 커플링 생성물은 도 1에서 화살표로 표시한다. 서브유닛 당 1.5 이상의 펩티드가 평균적으로 커플링되었으며, 커플링되지 않고 남아있는 서브유닛은 거의 없었다.
B. Qβ VLP로 커플링된 Aβ1-6 펩티드를 사용한 마우스의 면역화 및 면역반응의 분석
Aβ1-6 펩티드로 커플링된 Qβ VLP (여기서는 Qb-Ab-1-6)를 0 일 및 14 일에 마우스 (3 마우스)에 피하 주사하였다. Aβ1-6 펩티드를 상기한 Qβ VLP 단백질에 커플링하였다. 200 ㎕까지 PBS로 희석된 백신 10 ㎍으로 각 마우스 (C57BL/6)를 면역화하였다. 마우스를 21 일에 눈 뒤에서 (retroorbitally) 채혈하고, Aβ1-6 펩티드에 특이적인 항체의 역가를 Aβ1-6에 대한 ELISA에서 측정하였다. Aβ1-6 펩티드를 화학적 가교결합제 술포-SPDP를 써서 소 RNAse A에 커플링시켰다. ELISA 플레이트를 10 ㎍/ml의 농도에서 커플링된 RNAse 제제로 코팅하였다. 이 플레이트를 연속적으로 희석된 마우스 혈청으로 블록킹한 후 인큐베이션시켰다. 결합된 항체를 효소적으로 표지된 항-마우스 IgG 항체로 검출하였다. 대조구로서 동일한 마우스의 면역전 혈청도 시험하였다. 결과를 도 2에 도시하였다.
도 2는 Qβ VLP에 커플링된 Aβ1-6 펩티드에 대하여 면역화된 마우스의 혈청 중 Aβ1-6 펩티드에 특이적인 IgG 항체의 ELISA 분석을 보여준다. 이 결과는 면역화된 3 마리의 마우스 (A1-A3)에 대해 나타냈는데, 면역전 혈청은 도면에서 "pre"로 표시하고 면역전 혈청 하나에 대한 결과를 나타낸다. 면역전 혈청을 "Qb-Ab-1- 6"로 면역화된 마우스 혈청과 비교하면, 펩티드 Aβ1-6에 대한 강력한 특이적 항체 반응이 면역보강제 없이도 얻어질 수 있다는 것을 보여준다.
C. Aβ1-40 펩티드에 대한 ELISA
인간 Aβ1-40 펩티드 또는 Aβ1-42 펩티드 스톡을 DMSO 중에 만들고 코팅 완충제 중에서 사용전에 희석시켰다. ELISA 플레이트를 0.1 ㎍/웰 Aβ1-40 펩티드로 코팅되었다. 플레이트를 위에서 얻어진 연속적으로 희석된 마우스 혈청으로 블록킹한 후 인큐베이션시켰다. 결합된 항체를 효소적으로 표지된 항-마우스 IgG 항체로 검출하였다. 대조구로서 예방접종 전에 얻어진 혈청도 포함시켰다. 기준선 위의 평균 3 표준편차를 보이는 혈청 희석율이 계산되었고 이를 ""ELISA 역가"로서 정의하였다. 면역전 혈청에서는 아무런 특이적 항체가 검출되지 않았다. 3 마리 마우스에 대해 얻어진 역가는 1:100000이었으며, 이는 Aβ1-40에 대한 강력한 특이적 면역반응을 보인다. 따라서 Qβ VLP로 커플링된 Aβ1-6를 사용한 면역화는 Aβ1-40과 가교결합성 있는 강력한 항체 역가를 유발한다.
도 3은 ELISA 결과를 보여준다. 상기한 Qβ VLP에 커플링된 Aβ1-6 펩티드로 면역화된 3 마리 마우스 (A1-A3)의 혈청에 대해 얻어진 405 nm에서의 흡광도로서의 ELISA 신호를 x-축상에 나타낸 각 희석물에 대하여 그래프로 나타냈다. 21 일에 채혈된 3 마리 마우스에 대한 결과를 나타낸다. 또한 면역전 혈청이 포함된다. 혈청 중의 항체에 대한 역가는 상기한 바와 같이 결정되며, 3 마리 마우스 모두 1:100000이었다.
<실시예 14>
인간 APP 트랜스제닉 마우스의 면역화
인간 APP 형질도입 유전자를 보유한 8개월된 늙은 암컷 APP23 마우스 (Sturchler-Pierrat et al., Proc.Natl. Acad.Sci. USA 94: 13287-13292 (1997))를 예방접종에 사용하였다. 마우스에게 멸균 PBS 중에 희석된 25 ㎍ 백신을 피하 주사하고 14 일 후 동일량의 백신으로 2차 접종하였다. 면역 시작전과 2차 접종 주사 후 7일에 마우스 꼬리 정맥으로부터 채혈하였다. 이 혈청을 실시예 13에 기재된 바와 같이 Aβ1-6, Aβ1-40 및 Aβ1-42에 특이적인 항체의 존부에 대하여 분석한다.
<실시예 15>
Qβ VLP로 뮤린 Aβ1-6의 커플링, 마우스에 이 백신의 주사 및 면역반응의 분석.
뮤린 Aβ1-6 펩티드 (서열: NH2-DAEFGHGGC-CONH2) (서열 78)를 화학적으로 합성하고 실시예 13에 기재된 바와 같이 Qβ VLP에 커플링시키는데 사용하였다. 이 백신을 C57BL/6 마우스에 주사하였고 뮤린 Aβ1-6, 뮤린 Aβ1-40 및 뮤린 Aβ1-42에 대해 유발된 항체의 역가을 결정하였다. 면역화 및 ELISA 측정은 실시예 13에 기재된 바와 같이 수행한다.
<실시예 16>
Aβ1-6에 대해 유발된 혈청의 인간 APP 트랜스제닉 마우스 플라크로의 결합 및 AD 플라크.
뇌 조각에서의 면역조직화학
18개월령 늙은 이형접합 APP23 마우스의 연속적 파라핀 뇌 절편 및 AD 환자 프락 스테이지 (Braak Stage) III (바젤대학 병리학연구소)로부터의 내후각뇌피질 절편을 염색에 사용하였다. 인간 뇌 절편을 진한 포름산으로 5 분간 처리하고 마우스 뇌 절편을 3 분 동안 90 ℃에서 마이크로파가열하여 항원성을 향상시켰다. 인간 Aβ1-6에 대하여 유발된 마우스 혈청 (실시예 13에 기재된 바와 같이 얻음)을 3 ％ 염소 혈청이 포함된 PBS 중에 1:1000으로 희석하고 밤새 인큐베이션하였다. 세정한 후에 절편을 PBS 중에 1:200로 희석된 바이오티닐화된 항 마우스 2차 항체와 1 시간 동안 인큐베이션시켰다. 세청 후에 절편을 아비딘-바이오틴-과산화효소 기술 (ABC--Elite Kit PK6100; Vector Laboratories)로 더 처리하였다. 마지막으로 절편을 디아미노벤지딘 (DAB) 금속 보강 기질 (Boehringer, Code 1718096)과 반응시키고 헤말룸 (Hemalum)으로 반대염색 (counterstain)하고 탈수하고 크실렌 중에 세척하고 커버스립으로 덮었다.
조직학 염색의 결과를 도 4A 및 4B에 나타냈다. 절편을 Qβ VLP로 커플링된 인간 Aβ1-6에 대해 면역화된 3 마리 마우스의 혈청으로 염색하였다. 각 혈청은 트랜스제닉 마우스 및 AD에서 유래한 아밀로이드 플라크를 양성으로 염색하였다. 3 혈청 중 하나의 결과를 도시한다. 인간 Aβ1-6에 대해 유발된 혈청은 트랜스제닉 인간 APP23 마우스의 아밀로이드 플라크 뿐만 아니라 AD 환자에게서 유래한 아 밀로이드 플라크도 명백하게 염색하였다. 면역전 혈청은 음성이었다. 세포외 아밀로이드 플라크 및 단리된 혈관은 항체에 의하여 염색되었다.
<실시예 17>
마우스 플라크의 조직학에 의하여 평가된, Aβ1-6에 대해 유발된 혈청의 특이성
뇌 조각에서의 면역조직화학
인간 APP를 과발현하는 3월령 및 18개월령 늙은 이형접합 APP23 마우스의 연속적 파라핀 뇌 절편을 실시예 16에 기재된 바와 같이, 실시예 13에 기재된 바와 같이 인간 Aβ1-6에 대해 유발된 대표적 마우스 혈청으로 염색하거나 뮤린 또는 인간 APP의 마지막 20개 아미노산에 대해 특이적이어서 Aβ를 인식하지 않는 토끼 폴리클로날 항체로 염색하였다. 토끼 폴리클로날 항체와 인큐베이션한 절편을 실시예 16에 기재된 바와 같이 처리하되, 다만 바이오티닐화된 항 토끼 2차 항체 (BA1000, Vector Laboratories)를 사용한다.
조직학적 염색의 결과를 도 5의 A, B, C, D 및 E에 나타낸다. 절편의 하부 왼쪽에 마크된 Aβ1-6는 Aβ1-6에 대해 유발된 혈청을 염색에 사용했음을 지시하며, 반면에 "Pab"는 APP695에서 위치 676-695에 상응하는 뮤린 또는 인간 APP의 마지막 20개 아미노산에 특이적인 폴리클로날 항체로 염색하였음을 지시한다.
18월령 늙은 마우스에서 유래한 절편의 염색 (도 5의 A 및 C)을 비교하면 Aβ1-6에 대해 유발된 항체는 뇌에서 발현되는 APP와 가교결합하지 않으나 대조구 폴리클로날 항체에 의하여는 염색된다. 도 5의 B는 아밀로이드 침착물이 아직 가시화되지 않은 시점인 3월령 늙은 마우스에서 유래한 뇌 절편이 APP에 특이적인 폴리클로날 항체로 염색됨을 보여준다. 도 5의 D 및 E는 도 5의 A 및 B 각각에서의 해마의 CA1 피라미드층의 확대를 보여준다.
<실시예 18>
A. fr 캡시드 단백질로의 Aβ1-6 펩티드의 커플링
20 mM Hepes, 150 mM NaCl pH 7.2 중의 120 μM fr 캡시드 단백질의 용액을 DMSO 중의 스톡 용액으로부터 희석된, 10배 몰 과량의 SMPH (Pierce)와 30 분 동안 록킹 진탕기 상에서 25 ℃에서 반응시켰다. 그 다음 이 반응 용액을 20 mM Hepes, 150 mM NaCl, pH 7.2 1L에 대해 4 ℃에서 2 시간 동안 2회 투석하였다. 그 다음 투석된 fr 반응 혼합물을 5배 몰 과량의 Aβ1-6 펩티드 (서열: NH2-DAEFRHGGC-CONH2) (서열 77)와 록킹 진탕기 상에서 16 ℃에서 2 시간 동안 반응시켰다. 커플링 생성물을 SDS-PAGE로 분석하였다.
B. HBcAg-Lys-2cys-Mut로의 Aβ1-6 펩티드의 커플링
20 mM Hepes, 150 mM NaCl pH 7.2 중의 120 μM HBcAg-Lys-2cys-Mut의 용액을 DMSO 중의 스톡 용액으로부터 희석된, 10배 몰 과량의 SMPH (Pierce)와 30 분 동안 록킹 진탕기 상에서 25 ℃에서 반응시켰다. 그 다음 이 반응 용액을 20 mM Hepes, 150 mM NaCl, pH 7.2 1L에 대해 4 ℃에서 2 시간 동안 2회 투석하였다. 그 다음 투석된 HBcAg-Lys-2cys-Mut 반응 혼합물을 5배 몰 과량의 Aβ1-6 펩티드 (서 열: NH2-DAEFRHGGC-CONH2) (서열 77)와 록킹 진탕기 상에서 16 ℃에서 2 시간 동안 반응시켰다. 커플링 생성물을 SDS-PAGE로 분석하였다.
C. 섬모로의 Aβ1-6 펩티드의 커플링
20 mM Hepes, 150 mM NaCl pH 7.2 중의 120 μM 이. 콜라이 1형 섬모의 용액을 DMSO 중의 스톡 용액으로부터 희석된, 50배 몰 과량의 SMPH (Pierce)와 60 분 동안 록킹 진탕기 상에서 RT에서 반응시켰다. 반응 혼합물을 PD-10 컬럼 (Amersham-Pharmacia Biotech)으로 탈염하였다. 이 컬럼에서 용출된 단백질-함유 분획을 포으고 원하는 유도체화된 섬모 단백질을 5배 몰 과량의 Aβ1-6 펩티드 (서열: NH2-DAEFRHGGC-CONH2) (서열 77)와 록킹 진탕기 상에서 16 ℃에서 2 시간 동안 반응시켰다. 커플링 생성물을 SDS-PAGE로 분석하였다.
D. fr-캡시드 단백질, HBcAg-Lys-2cys-Mut 또는 섬모로 커플링된 Aβ1-6 펩티드를 사용한 마우스의 면역화
fr-캡시드 단백질, HBcAg-Lys-2cys-Mut 또는 섬모로 커플링된 Aβ1-6 펩티드를 0일 및 14일에 마우스 (3 마리)에 피하주사하였다. 각 마우스 (C57BL/6)를 PBS 중에서 200 ㎕로 희석된 백신 10 ㎍을 써서 면역화하였다. 마우스를 21일에 눈 뒤에서 채혈하고 Aβ1-6 펩티드 또는 Aβ1-40 또는 Aβ1-42에 특이적인 항체의 역가를 실시예 13에 기재된 바와 같이 ELISA로 측정하였다.
<실시예 19>
QβhAβ1-6를 사용한 붉은털원숭이의 면역화
Aβ1-6가 자기항원인 경우에 인간 Aβ1-6 펩티드 기초 백신을 사용하여 인간 Aβ에 대한 항체의 유도를 시험하기 위하여, Aβ 서열이 인간과 붉은털원숭이 간에 동일하기 때문에 붉은털원숭이를 QβhAβ1-6으로 면역화하였다. QβhAβ1-6 백신은 실시예 13에 기재된 바와 같이 제조되었다. 10 내지 15 세의 붉은털원숭이 4 마리를 백신 50 ㎍으로 0일에 면역화하고 백신 25 ㎍을 써서 28일 및 56일에 2차 접종하였다. 이 원숭이들을 등에서 피하로 면역화하였다. 이 동물들을 0일 (사전 채혈), 42일 및 70일에 채혈하였다. 혈액 4 ml를 정맥(V. cephalica antebrachii)으로부터 수집하였다. Aβ1-40에 특이적인 항체의 역가를 원숭이 IgG에 특이적인 2차 항체를 사용하여 본질적으로 실시예 13에 기재된 바와 같이 ELISA로 측정했다.
인간 및 붉은털원숭이는 동일한 Aβ 서열을 공유하기 때문에 Aβ1-40에 대한 특이적인 붉은털원숭이의 높은 역가 항체의 생성은 Qβ에 커플링된 hAβ1-6를 사용한 면역화가 자기항원 Aβ에 대한 관용성을 파괴한다는 것을 보여준다. 전장 Aβ를 인식하는 항체는 영장류에서 커플링된 Aβ1-6 단편을 써서 생성된다.
ELISA 결과를 도 6에 나타냈다. QβhAβ1-6으로 면역화된 원숭이 4 마리의 혈청 (1-4)에서 측정된 Aβ1-40 특이적 항체의 역가 및 원숭이 4마리의 역가의 평균이 도형으로 그려져 있다. 이 역가는 OD50 역가로서 대표된다. OD50은 신호가 최대값의 절반에 도달하는 항체의 희석율이다. 최대값 (ODmax)은 QβhAβ1-27로 면역화한 원숭이로부터 유래하며 Aβ1-40을 인식하는 기준 혈청으로부터 얻어졌으며 동일한 ELISA 플레이트 상에서 측정되었다.
(상기한) 원숭이 2 마리를 97, 110, 117, 124, 138, 143, 152, 159, 166일에 채혈하고 110일에 백신 25 ㎍으로 3차 접종을 받게 하였다. 혈청을 모으고 (99 ml) Aβ1-6 특이적 항체의 친화성 정제에 사용하였다. 이들 항체는 1.5 ㎍/ml 농도에서 면역조직학적 염색에 사용되었으며 바이오티닐화 2차 항-원숭이 항체를 검출에 사용하였다. 18개월령 늙은 이형접합 APP23 마우스 및 AD 환자Braak Stage III)의 파라핀 뇌 절편을 염색에 사용하였다. 플라크-특이적 염색이 APP23 마우스 뇌 절편 및 AD 환자 뇌 절편에서 관찰되었다 (도 7).
조직학적 분석의 결과를 도 7의 A 및 B에 나타낸다. Aβ1-6에 특이적인 상기한 친화성 정제된 항혈청을 써서 인간 APP 트랜스제닉 마우스 플라크를 염색 (APP23 염색)한 것을 도 7의 A에 도시한다. 도 7의 B는 동일한 정제된 항혈청으로 인간 AD 플라크를 염색한 것을 보여준다. 이 정제된 항혈청은 두 경우에 1.5 ㎍/ml의 농도로 사용되었다. 전형적인 플라크를 두 그림에서 화살표로 표시하였다.
<실시예 20>
AP205 VLP로 뮤린 Aβ1-6의 커플링, 마우스의 면역화 및 면역반응의 분석.
A. AP205 VLP로 뮤린 Aβ1-6 펩티드의 커플링
펩티드 뮤린 Aβ1-6 (mAβ1-6, 서열: NH2-DAEFGHGGC-CONH2 (서열 78))을 화학적으로 합성하였는데, 처음 NH2기는 이 펩티드가 유리 N-말단을 갖는다는 것을 지시하며, 마지막 NH2기는 이 펩티드가 아미드화된 카르복시 말단을 가짐을 지시한다. 20 mM Hepes, 150 mM NaCl, pH 8.2 (HBS, pH 8.2) 중의 AP205VLP (실시예 1에 기재된 바와 같이 발현 및 정제됨)를 2 mg/ml (브래드포드 분석에서 결정됨)의 농도에서 DMSO 중의 100 mM 스톡으로부터 희석된, 2.86 mM SMPH (Pierce, 미국 아일랜드 록포드)과 실온 (RT)에서 30 분 동안 반응시켰다. 그 다음 반응 혼합물을 4 ℃에서 2 시간 동안 1000 배 부피의 HBS, pH 7.4 에 대해 투석하고 생성되는 투석되고 유도체화된 AP205 VLP를 액체 질소 중에 급속냉동하고 밤새 -20 ℃에서 보관하였다. 유도체화된 AP205 VLP를 1 부피의 20 mM HBS, pH 7.4로 희석하고 2 시간 동안 15 ℃에서 진탕하면서, DMSO 50 mM 스톡으로부터 반응 혼합물 주에 희석된 719 μM mAβ1-6 펩티드와 반응시켰다. 투석된 반응 혼합물을 다음 사용할 때까지 -80 ℃에서 보관하기 위해 분액으로 액체 질소 중에서 급속냉동시켰다.
분액을 해동시켜서 AP205 VLP 서브유닛로의 mAβ1-6 펩티드의 커플링을 SDS-PAGE로 평가하고 단백질 농도는 브래드포드 분석에서 측정했다. 커플링 반응의 결과는 도 8에 도시하였다.
도 8은 mAβ1-6 펩티드 및 AP205 VLP의 커플링 반응의 SDS-PAGE 분석을 보여준다. 샘플은 쿠마시 브릴리언트 블루로 염색된, 16 ％ 트리스-글리신 겔 상에 환원성 조건하에서 시행되었다. 레인 1은 단백질 마커이며 상응하는 분자량이 겔의 왼쪽 가장자리에 표시했으며, 레인 2는 AP205 VLP 단백질이고 레인 3은 유도체화된 AP205 VLP 단백질이고 레인 4는 mAβ1-6 펩티드로의 AP205 VLP의 커플링 반응의 상층물이며, 레인 5는 mAβ1-6 펩티드로의 AP205 VLP의 커플링 반응의 펠렛이다. 커플링되지 않고 남아있는 AP205 VLP 서브유닛은 거의 없었던 반면 서브유닛 당 여러 펩티드에 상응하는 밴드가 가시화되었는데, 이는 매우 높은 커플링 효율성을 보여준다. 특히 AP205 VLP 서브유닛 당 하나 보다 훨씬 더 많은 Aβ1-6 펩티드가 있 다.
B. AP205 VLP로 커플링된 mAβ1-6 펩티드를 사용한 마우스의 면역화 및 면역반응의 분석
mAβ1-6 펩티드로 커플링된 AP205 VLP를 0 일 및 14 일에 마우스 (3 마우스)에 피하 주사하였다. mAβ1-6 펩티드를 상기한 바와 같이 AP205 VLP 단백질에 커플링하였다. 200 ㎕까지 PBS로 희석된 백신 25 ㎍으로 각 마우스 (C57BL/6)를 면역화하였다. 마우스를 21 일에 눈 뒤에서 (retroorbitally) 채혈하고, mAβ1-6 펩티드에 특이적인 항체의 역가를 mAβ1-6에 대한 ELISA에서 측정하였다. mAβ1-6 펩티드를 화학적 가교결합제 술포-SPDP를 써서 소 RNAse A에 커플링시켰다. ELISA 플레이트를 10 ㎍/ml의 농도에서 커플링된 RNAse-mAβ1-6 제제로 코팅하였다. ELISA 플레이트를 RNA-mAβ1-6의 제제로 10 ㎍/ml의 농도에서 코팅하였다. 플레이트를 연속적으로 희석된 마우스 혈청으로 블록킹한 후 인큐베이션시켰다. 결합된 항체를 효소적으로 표지된 항-마우스 IgG 항체로 검출하였다. 대조구로서 동일한 마우스의 면역전 혈청도 시험하였다. 결과를 도 9에 도시하였다.
도 9는 AP205 VLP에 커플링된 mAβ1-6 펩티드에 대하여 면역화된 마우스의 혈청 중 mAβ1-6 펩티드에 특이적인 IgG 항체의 ELISA 분석을 보여준다. 이 결과는 면역화된 3 마리의 면역화된 마우스의 혈청 (A1 d21-A3 d21)에 대해 나타냈는데, 면역전 혈청은 도면에서 "pre"로 표시하고 면역전 혈청 하나에 대한 결과를 나타낸다. 면역전 혈청을 AP205 VLP에 커플링된 mAβ1-6으로 면역화된 마우스의 혈청과 비교하면, 자기항원인 펩티드 mAβ1-6에 대한 강력한 특이적 항체 반응이 면 역보강제 없이도 얻어질 수 있다는 것을 보여준다. 또는 AP205 VLP로 자기-펩티드의 커플링은 이 펩티드에 대한 관용성의 파괴 및 매우 특이적 면역반응을 가져온다. 따라서 AP205 VLP는 면역보강제 없이도 Aβ 펩티드들에 대한 높은 항체 역가를 생성하는 데에 적합하다.
<실시예 21>
QβhAβ1-6을 사용한 면역화가 "스웨덴/런던" 돌연변이체 아밀로이드 전구체 단백질을 감소시킨다.
이 실시예는 알츠하이머병-유사 분산 (콩고-레드 음성) 아밀로이드 플라크를 발생시키는 마우스 모델에서 QβhAβ1-6을 사용한 면역화가 신피질 및 피질밑 뇌 영역에서 플라크 밀도의 대량 감소를 초래했다. 분산 아밀로이드 플라크의 조직학적 발생은 AD 뇌 병리학의 두드러진 특징이므로 (Selkoe, 1994, Annu. Rev. Neurosci. 17:489-517), 이 실시예는 QβhAβ1-6으로 면역화하면 알츠하이머병의 효과적인 치료법을 제공함을 증명한다.
Qβ-Aβ1-6를 이용한 면역화의 치료 효능을 평가하기 위하여 "스웨덴/런던" 돌연변이 아밀로이드 전구체 단백질을 마우스 Thy-1 프로모터 (APP24; K670N/M671L; V717I, WO980-36-4423)의 제어하에 과발현하는 트랜스제닉 마우스를 사용하였다. 이 마우스계는 18개월령에서 신피질, 해마, 미상피각 (caudate putamen) 및 시상에서 다수의 아밀로이드 플라크를 특징으로 한다. 플라크는 9월령에서 처음 관찰될 수 있다. 조직학적으로 APP24 마우스의 아밀로이드 플라크는 분산 형이 두드러지며, 즉 이들은 콩고-레드 염색에서 음성이다. 더 낮은 정도까지도 조밀한 아밀로이드 플라크 (콩고-레드 양성)이 발견될 수 있다.
Qβ VLP에 커플링된 인간 Aβ1-6 펩티드 (QβhAβ1-6)를 실시예 13에 기재된 바와 같이 제조하였다. 본 발명을 설명하거나 가능하게 하는 데에 필요하지 않은, 다음의 실험 순서와 관련하여 APP24 트랜스제닉 마우스 9.5 개월령은 0일에 인산완충염수 (PBS) 중의 QβhAβ1-6 25 ㎍ (마우스마다 2 x 100 ㎕을 투여함)(n=16) 또는 음성 대조구로서 PBS (마우스마다 2 x 100 ㎕을 투여함) (n=9) 또는 커플링된 항원이 없는 Qβ 바이러스-유사 입자 (n=11)를 피하 주사하였다. 그 후 마우스에게 QβhAβ1-6-백신 25 ㎍ , Qβ, 또는 PBS를 15, 49, 76, 106, 140, 169, 200, 230, 259, 291일에 주사하였다. 동물들을 제1 면역화 (0일)의 하루나 이틀전 및 56, 90, 118, 188, 214, 246, 및 272일에 꼬리 혈관을 통해 채혈하였다. 또한 305일에 혈청을 모으고 이 시점에서 조직병리학을 위하여 뇌도 모은다 (이 시험에서 마우스의 연령은 19.5 개월임).
Aβ1-40에 특이적인 항체의 역가는 본질적으로 실시예 13에 기재된 바와 같이 ELISA로 측정하였다. ELISA의 결과는 도 10에 나타냈다. QβhAβ1-6으로 면역화한 마우스의 혈청에서 측정된 Aβ1-40 또는 Aβ1-42 특이적 항체의 역가를 그래프로 나타냈다. 역가는 OD50％ 역가로서 대표된다. OD50％는 신호가 최대값의 절반에 도달할 때의 항체의 희석율이다. 최대값 (ODmax)는 Aβ1-40 및 Ab42을 인식하는 기준 항체로부터 얻었으며, 동일한 ELISA 플레이트에서 측정하였다. 모든 QβhAβ1-6으로 면역화된 마우스는 OD50％ 역가 1:8000 이상 (면역전 혈청 역가는 1:100이하였음)을 발생시켰는데, 이는 늙은 APP24 마우스에서조차도 QβhAβ1-6에 대한 지속적인 항체 반응을 증명한다. 면역화된 집단에서 중간 OD50％ 역가는 면역화 기간 내내 1:20,000 내지 1:50,000의 범위에 있었다.
아밀로이드 플라크의 정량을 위해 뇌를 4 ℃에서 0.1 M PBS 중의 4 ％ 포름알데히드 중에 담가 고정시켰다. 에탄올로 탈수한 후 뇌를 파라핀에 함침시키고 4 ㎛ 두께로 마이크로톰으로 시상으로 절단하였다. 절편을 슈퍼 프로스트 슬라이드 상에 고정하고 37 ℃에서 건조하였다. 절편을 PBS 중에서 세척하고 3 분 동안 0.1 M 시트르산 완충제 중에서 90 ℃에서 마이크로파 가열에 의하여 항원성을 향상시켰다. NT11 항혈청 (항 Aß1-40, Sturchler-Pierrat et al., 1997, Proc. Natl. Acad. Sci. 94: 13287-13292)을 3 ％ 염소 혈청이 포함된 PBS를 써서 1:1000로 희석하고 4 ℃에서 밤새 인큐베이션시켰다. 세정 후 절편을 아비딘-바이오틴-퍼옥시다제 기술 (ABC-Elite Kit PK6100; Vector Laboratories)을 써서 추가로 처리하였다. 마지막으로 절편을 디아미노벤지딘 (DAB) 금속 보강 기질 (Boehringer, Code 1718096)과 반응시키고 헤말룸으로 반대염색하고 탈수하고 크실렌 중에서 세척하고 커버슬립으로 덮었다. 동물마다 3 개의 다른 해부 판에서의 뇌 절편의 계통-무작위 시리즈를 분석에 사용하였다. 아밀로이드 플라크를 MCID 이미지 분석기(Imaging Research, Brock University, 캐나다 온타리오 소재, 프로그램 버전 M5 엘리트)를 써서 정량하였다. 현미경 이미지를 크실릭스 (Xillix) 흑백 CCD TV 카메라를 써서 디지탈화하고 256 회색도에서 640 x 480 픽셀 해상도로 저장하였다. 픽셀 크기는 5x 확대에서 오브젝트 마이크로미터를 사용하여 검정하였다 (Leica Neoplan Objective). 이웃한 오브젝트 필드의 정확한 위치설정을 위한 모터 유도 현미경 단계를 사용하므로, 각 절편의 전체 신피질 및 후각 핵을 분석했다. 각 오프젝트 필드의 경우 해부 면적이 매뉴얼 아웃라인에 의하여 정해졌다. 각 개별 절편의 경우 샘플 면적은 면역양성 아밀로이드 플라크와 조직 배경 사이에 매뉴얼 한계 설정 (회색도)에 의하여 정의되었다. 단리된 조직 인공물을 매뉴얼 아웃라인으로 배제하였다. 가공하지 않은 데이터를 개별 카운트(아밀로이드 침착물) 및 비례적 면적값 (면역양성 아밀로이드/피질 또는 후각 핵)으로서 측정했다.
각 마우스의 데이타는 전체 신피질의 ％로 전체 플라크 면적 및 mm2 당 침착물 (플라크)의 개수로 정규화되었다. QβhAβ1-6으로 면역화된 마우스는 PBS 또는 Qβ 주사 대조군과 비교할 때 피질 및 피질밑 영역에서 아밀로이드 침작물의 결정적 감소를 드러냈다 (도 11). 침착물의 중간 개수 및 전체 플라크 면적은 피질, 미상피각, 해마 및 시상에서 PBS군과 비교할 때 80 내지 98％ 사이로 꽤 상당히 감소하였다 (p< 0.001 대 PBS군, 만-위트니 시험(Mann-Whitney test) 도 12).
제2 연구에서는 13.5개월령의 APP24 트랜스제닉 마우스에게 0일에 인산염-완충 염수 (PBS) 중의 QβhAβ1-6 25 ㎍ (마우스마다 2x100 ㎕로 투여됨)(n=15) 또는 음성 대조구로서 PBS (마우스마다 2x100 ㎕로 투여됨)(n=15)를 피하 주사하였다. 그 다음 마우스에게 25 ㎍ 의 QβhAβ1-6-백신 또는 PBS를 16, 46, 76, 109, 140, 및 170일에 주사하였다. 동물들을 제1 면역화 (0일)하기 하루나 이틀전과 31, 59, 128, 및 154일에 꼬리 정맥을 통해 채혈하였다. 혈청을 184일에도 수집하였는데, 이 시점에서는 뇌도 조직병리학을 위하여 수집하였다 (마우스의 이 시점에서의 연령: 19.5개월). Aβ1-40에 특이적인 항체의 역가는 상기에 기재된 바와 같이 결정하고 표현하며, 또한 모든 면역화된 마우스는 혈청 OD50％ 역가 적어도 1:2000 이상 (도시하지 않음)으로 QβhAβ1-6에 반응하는 것으로 밝혀졌다. 중간적 OD50％ 역가는 면역화 기간 전체에 걸쳐 1: 10,000 sowl 1: 50,000의 범위에 있었다. 아밀로이드 침착물의 정량화를 상기한 바와 같이 수행하였다. 면역화를 보다 일찍 개시한 실험과 비교할 때 (즉, 9.5개월령), 플라크 침착물 개수 (-55 ％) 및 면적 (-32 ％)의 감소가 신피질에서 덜 극적이었으나 여전히 매우 두드러졌고 (도 13) 꽤 상당했다 (p>0.001 대 PBS, 만-휘트니 시험). 피질밑 면적에서 플라크 침착물 개수 및 면적은 QβhAβ1-6 면역화된 군에서 60 내지 90 ％까지 감소했다. 이들 면적에서 더 두드러진 효과는 피질과 비교할 때 이들 면적에서의 플라크 생성의 더 연장된 시간 과정에 관련된 것이다.
함께 고려할 때, 두 실험은 "스웨덴/런던" 돌연변이 아밀로이드 전구체 단백질을 과발현하는 트랜스제닉 마우스에서 QβhAβ1-6 면역화는 이들 마우스 내의 아밀로이드 치착물의 발생을 극적으로 감소시킨다는 것을 입증한다.
도 10: "스웨덴/런던" 돌연변이 아밀로이드 전구체 단백질을 과발현하는 트랜스제닉 마우스에서 혈청 항 Aβ40/42 항체 역가 (OD50％). 마우스는 9.5 내지 19 개월령 사이에서 QβhAβ1-6으로 면역화하였다. 개별 값 (검은 점) 및 박스 플롯이 나타나 있는데, 여기서 박스의 말단은 25번째 백분위수 및 75번째 백분위수를 정의하며, 중간의 선 및 에러 막대는 10번째 및 90번째 백분위수를 정의한다 (외부 층은 점으로 표시함).
도 11: 시상 뇌 절편에서 아밀로이드 플라크의 면역조직화학적 염색. Qβ (A) 또는 Qβ Aβ1-6 (B) 백신으로 면역화한, "스웨덴/런던" 돌연변이 아밀로이드 전구체 단백질을 과발현하는 트랜스제닉 마우스에서 시상 뇌 절편을 도면에 나타냈다.
도 12: 9.5 내지 19월령인 "스웨덴/런던" 돌연변이 아밀로이드 전구체 단백질을 과발현하는 트랜스제닉 마우스에서 플라크 침착의 정량화. (A) 피질 플라크 밀도. (B) 피질 플라크 면적, (C) 미상피각에서의 플라크 밀도, (D) 미상피각에서의 플라크 면적, (E) 해마에서의 플라크 밀도, (F) 해마에서의 플라크 면적, (G) 시상에서의 플라크 밀도, (H) 시상에서의 플라크 면적. 플라크 밀도는 플라크/mm2로 표현하며, 플라크 면적은 아밀로이드 베타에 의하여 커버된 조직 면적의 백분율로 나타낸다. 데이타는 개별 값 (검은 점) 및 박스 플롯으로 나타냈다. 박스의 말단은 25번째 백분위수 및 75번째 백분위수를 정의하며, 중간의 선 및 에러 막대는 10번째 및 90번째 백분위수를 정의한다. ** p<0.001 (만 휘트니 순위 합계 시험). PBS, n=9, Qβ, n=11, QβhAβ1-6, n=16.
<실시예 22>
"스웨덴" 돌연변이 아밀로이드 전구체 단백질을 과발현하는 트랜스제닉 마우스에서 QβhAβ1-6의 면역화가 아밀로이드 플라크를 감소시킨다.
이 실시예는, 면역화가 아밀로이드 플라크 병리학의 매우 진전된 단계에서 개시되었다고 하더라도 QβhAβ1-6에 의한 면역화가 알츠하이머병의 효과적인 치료법을 제공한다는 것을 증명한다. 이 실시예에 사용된 AD 마우스 모델에서 아밀로이드 플라크 침작은 약 6개월령에서 이미 시작된다 (Sturchler-Pierrat et al., 1997, Proc. Natl. Acad. Sci. 94: 13287-13292). 여기에 기재된 연구에서는 QβhAβ1-6에 의한 면역화가, 이미 피질내에서 조밀한 플라크가 많이 생성된 때인 18개월령에서 개시되었다. 이 실시예는 또한 매우 늙은 동물에게서 Aβ40/42 항체를 유도하는 QβhAβ1-6의 능력을 입증한다 (19 면역화된 마우스에서 무반응자가 없음).
QβhAβ1-6의 면역화의 치료 효과를 평가하기 위하여, "스웨덴" 돌연변이 아밀로이드 전구체 단백질 (APP23; K670N/M671L, Sturchler-Pierrat et al., 1997, Proc. Natl. Acad. Sci. 94: 13287-13292)을 과발현하는 트랜스제닉 마우스를 사용하였다. 이들 마우스에서 알츠하이머와 유사한 병리상태가 광범위하게 특징분석되어 있다 (Calhoun et al., 1998, Nature 395: 755-756; Phinney et al., 1999, J. Neurosci. 19: 8552-8559; Bondolfi et al., 2002, J. Neurosci. 22: 515-522).
Qβ VLP에 커플링된 인간 Aβ1-6 펩티드 (QβhAβ1-6)는 실시예 13에 기재된 바와 같이 제조하였다. 본 발명을 설명하거나 가능하게 하는 데에 필요하지 않은, 다음의 실험 순서와 관련하여 APP24 트랜스제닉 마우스 18 개월령은 0일에 인산완충염수 (PBS) 중의 QβhAβ1-6 25 ㎍ (마우스마다 2 x 100 ㎕을 투여함)(n=19) 또는 음성 대조구로서 인산염-완충 염수 (마우스마다 2 x 100 ㎕을 투여함) (n=17)를 피하 주사하고, 백신 25 ㎍를 13, 27-34, 61-63, 90-96 및 123-130일에 2차 접종하였다. 동물들을 제1 면역화 (0일)의 하루나 이틀전 및 41-45일 및 68일에 꼬리 혈관을 통해 채혈하였다. 또한 152-154일에 혈청을 모으고 이 시점에서 조직병리학을 위하여 뇌도 모은다 (이 시험에서 마우스의 연령은 23 개월임).
Aβ1-40에 특이적인 항체의 역가는 본질적으로 실시예 13에 기재된 바와 같이 ELISA로 측정하였고 결과는 실시예 21에 기재된 바와 같이 표현하였다. ELISA의 결과는 도 14에 나타냈다. QβhAβ1-6으로 면역화한 마우스 전부가 OD50％ 역가 1:2000 이상 (면역전 혈청 역가는 1:100이하였음)을 발생시켰는데, 이는 매우 늙은마우스에서 (도 14)조차도 QβhAβ1-6에 대한 지속적인 항체 반응을 증명한다. 중간 OD50％ 역가는 면역화 기간 내내 1:9,000 내지 1:20,000의 범위에 있었다.
아밀로이드 플라크의 정량은 실시예 21에 기재된 바와 같이 수행하였다. 각 마우스의 데이타는 전체 신피질의 ％로 전체 플라크 면적 및 mm2 당 침착물 (플라크)의 개수로 정규화되었다. QβhAβ1-6으로 면역화된 마우스는 피질에서의 침작물의 더 적은 개수를 드러냈는데 (도 15, 도 16) 대체로 작은 크기의 플라크의 감소에 기인한다. 비면역화된 군과 비교할 때 중간 플라크 개수는 QβhAβ1-6 면역화된 군에서 33 ％가 감소되었다 (p< 0.001 대 PBS군, 만-위트니 시험(Mann-Whitney test)). 대체로 작은 크기 플라크는 영향을 받기 때문에, 전체 플라크 면적의 감소는 중간정도이며 10 ％에 달한다 (p<0.01 대 PBS군, 만-휘트니 시험).
도 14: "스웨덴" 돌연변이 아밀로이드 전구체 단백질을 과발현하는 트랜스제 닉 마우스에서 혈청 항 Aβ40/42 항체 역가 (OD50 ％). 마우스는 18 내지 23 개월령에서 QβhAβ1-6으로 면역화하였다. 개별 값 (검은 점) 및 박스 플롯이 나타나 있는데, 여기서 박스의 말단은 25번째 백분위수 및 75번째 백분위수를 정의하며, 중간의 선 및 에러 막대는 10번째 및 90번째 백분위수를 정의한다 (외부층은 점으로 표시함).
도 15: 시상 뇌 절편에서 아밀로이드 플라크의 면역조직화학적 염색. 화살표는 작은 크기 침착물을 가리킨다. PBS (A) 또는 Qβ Aβ1-6 (B)으로 면역화한, "스웨덴" 돌연변이 아밀로이드 전구체 단백질을 과발현하는 트랜스제닉 마우스에서 시상 뇌 절편을 도면에 나타냈다.
도 16: 18 내지 23개월령인 "스웨덴" 돌연변이 아밀로이드 전구체 단백질을 과발현하는 트랜스제닉 마우스에서 플라크 침착의 정량화. (A) 피질 플라크 밀도. (B) 피질 플라크 면적. 플라크 밀도는 플라크/mm2으로 표현한다. 플라크 면적은 아밀로이드 베타에 의하여 커버된 조직 면적의 백분율로 나타낸다. 데이타는 개별 값 (검은 점) 및 박스 플롯으로 나타냈다. 박스의 말단은 25번째 백분위수 및 75번째 백분위수를 정의하며, 중간의 선 및 에러 막대는 10번째 및 90번째 백분위수를 정의한다. ** p<0.001 (만 휘트니 순위 합계 시험). PBS, n=17, QβhAβ1-6, n=19.
분명한 이해를 위하여 본 발명을 설명과 실시예를 통해 자세히 지금까지 충분히 설명했지만, 본 발명 또는 이의 어떤 구체적인 실시양태의 범위에 영향을 주 지 않고도 조건, 제제 및 다른 매개변수의 광범위하고 동등한 범위 내에서 본 발명을 변형 또는 변화시킴으로써 같은 것을 수행할 수 있다는 점과 이러한 변형 또는 변화가 첨부된 청구의 범위 내에 포함되는 것임이 당분야의 숙련가에게 명백할 것이다.
이 명세서에 언급된 모든 문헌, 특허 및 특허출원은 본 발명이 속하는 분야의 숙련자들의 숙련도의 지표이며 각 개별 문헌, 특허 또는 특허출원이 구체적으로 개별적으로 언급에 의하여 도입된다고 지시된 것과 같은 정도로 언급에 의하여 본원에 도입된다.
SEQUENCE LISTING <110> Cytos Biotechnology AG Novartis Pharma AG Bachmann, Martin F Tissot, Alain Ortmann, Rainer Lueoend, Rainer Staufenbiel, Matthias Frey, Peter <120> Amyloid Beta 1-6 Antigen Arrays <130> PA041WO <150> US 60/396,639 <151> 2002-07-19 <150> US 60/470,432 <151> 2003-05-15 <160> 93 <170> PatentIn version 3.2 <210> 1 <211> 172 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 1 Met Ala Val Val Ser Phe Gly Val Asn Ala Ala Pro Thr Thr Pro Gln 1 5 10 15 Gly Gln Gly Arg Val Thr Phe Asn Gly Thr Val Val Asp Ala Pro Cys 20 25 30 Ser Ile Ser Gln Lys Ser Ala Asp Gln Ser Ile Asp Phe Gly Gln Leu 35 40 45 Ser Lys Ser Phe Leu Ala Asn Asp Gly Gln Ser Lys Pro Met Asn Leu 50 55 60 Asp Ile Glu Leu Val Asn Cys Asp Ile Thr Ala Phe Lys Asn Gly Asn 65 70 75 80 Ala Lys Thr Gly Ser Val Lys Leu Ala Phe Thr Gly Pro Thr Val Ser 85 90 95 Gly His Pro Ser Glu Leu Ala Thr Asn Gly Gly Pro Gly Thr Ala Ile 100 105 110 Met Ile Gln Ala Ala Gly Lys Asn Val Pro Phe Asp Gly Thr Glu Gly 115 120 125 Asp Pro Asn Leu Leu 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cgccggacgc atcgtggccg gcatcaccgg cgcacacagt gcggttgctg 840 gcgcctatat cgccgacatc accgatgggg aagatcgggc tcgccacttc gggctcatga 900 gcgcttgttt cggcgtgggt atggtggcag gccccgtggc cgggggactg ttgggcgcca 960 tctccttgca tgcaccattc cttgcggcgg cggtgcttca acggcctcaa cctactactg 1020 ggctgcttcc taatgcagga gtcgcataag ggagagcgtc gatatggtgc actctcagta 1080 caatctgctc tgatgccgca tagttaagcc aactccgcta tcgctacgtg actgggtcat 1140 ggctgcgccc cgacacccgc caacacccgc tgacgcgccc tgacgggctt gtctgctccc 1200 ggcatccgct tacagacaag ctgtgaccgt ctccgggagc tgcatgtgtc agaggttttc 1260 accgtcatca ccgaaacgcg cgaggcagct tgaagacgaa agggcctcgt gatacgccta 1320 tttttatagg ttaatgtcat gataataatg gtttcttaga cgtcaggtgg cacttttcgg 1380 ggaaatgtgc gcggaacccc tatttgttta tttttctaaa tacattcaaa tatgtatccg 1440 ctcatgagac aataaccctg ataaatgctt caataatatt gaaaaaggaa gagtatgagt 1500 attcaacatt tccgtgtcgc ccttattccc ttttttgcgg cattttgcct tcctgttttt 1560 gctcacccag aaacgctggt gaaagtaaaa gatgctgaag atcagttggg tgcacgagtg 1620 ggttacatcg 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gtgagttttc gttccactga gcgtcagacc ccgtagaaaa gatcaaagga 2520 tcttcttgag atcctttttt tctgcgcgta atctgctgct tgcaaacaaa aaaaccaccg 2580 ctaccagcgg tggtttgttt gccggatcaa gagctaccaa ctctttttcc gaaggtaact 2640 ggcttcagca gagcgcagat accaaatact gtccttctag tgtagccgta gttaggccac 2700 cacttcaaga actctgtagc accgcctaca tacctcgctc tgctaatcct gttaccagtg 2760 gctgctgcca gtggcgataa gtcgtgtctt accgggttgg actcaagacg atagttaccg 2820 gataaggcgc agcggtcggg ctgaacgggg ggttcgtgca cacagcccag cttggagcga 2880 acgacctaca ccgaactgag atacctacag cgcgagcatt gagaaagcgc cacgcttccc 2940 gaagggagaa aggcggacag gtatccggta agcggcaggg tcggaacagg agagcgcacg 3000 agggagcttc cagggggaaa cgcctggtat ctttatagtc ctgtcgggtt tcgccacctc 3060 tgacttgagc gtcgattttt gtgatgctcg tcaggggggc ggagcctatg gaaaaacgcc 3120 agcaacgcgg cctttttacg gttcctggcc ttttgctggc cttttgctca catgttcttt 3180 cctgcgttat cccctgattc tgtggataac cgtattaccg cctttgagtg agctgatacc 3240 gctcgccgca gccgaacgac gagcgcagcg agtcagtgag cgaggaagcg gaagagcgcc 3300 caatacgcaa accgcctctc cccgcgcgtt ggccgattca ttaatgcagc tgtggtgtca 3360 tggtcggtga tcgccagggt gccgacgcgc atctcgactg catggtgcac caatgcttct 3420 ggcgtcaggc agccatcgga agctgtggta tggccgtgca ggtcgtaaat cactgcataa 3480 ttcgtgtcgc tcaaggcgca ctcccgttct ggataatgtt ttttgcgccg acatcataac 3540 ggttctggca aatattctga aatgagctgt tgacaattaa tcatcgaact agttaactag 3600 tacgcaagtt cacgtaaaaa gggtatcgcg gaatt 3635 <210> 28 <211> 131 <212> PRT <213> Bacteriophage AP205 <400> 28 Met Ala Asn Lys Pro Met Gln Pro Ile Thr Ser Thr Ala Asn Lys Ile 1 5 10 15 Val Trp Ser Asp Pro Thr Arg Leu Ser Thr Thr Phe Ser Ala Ser Leu 20 25 30 Leu Arg Gln Arg Val Lys Val Gly Ile Ala Glu Leu Asn Asn Val Ser 35 40 45 Gly Gln Tyr Val Ser Val Tyr Lys Arg Pro Ala Pro Lys Pro Glu Gly 50 55 60 Cys Ala Asp Ala Cys Val Ile Met Pro Asn Glu Asn Gln Ser Ile Arg 65 70 75 80 Thr Val Ile Ser Gly Ser Ala Glu Asn Leu Ala Thr Leu Lys Ala Glu 85 90 95 Trp Glu Thr His Lys Arg Asn Val Asp Thr Leu Phe Ala Ser Gly Asn 100 105 110 Ala Gly Leu Gly Phe Leu Asp 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120 acaatgcaac cgatcacatc tacagcaaat aaaattgtgt ggtcggatcc aactcgttta 180 tcaactacat tttcagcaag tctgttacgc caacgtgtta aagttggtat agccgaactg 240 aataatgttt caggtcaata tgtatctgtt tataagcgtc ctgcacctaa accgaaggtc 300 agatgcctgt gtcattatgc cgaatgaaaa ccaatccatt cgcacagtga tttcagggtc 360 agccgaaaac ttggctacct taaaagcaga atgggaaact cacaaacgta acgttgacac 420 actcttcgcg agcggcaacg ccggtttggg tttccttgac cctactgcgg ctatcgtatc 480 gtctgatact actgcttaag cttgtattct atagtgtcac ctaaatcgta tgtgtatgat 540 acataaggtt atgtattaat ggtagccgcg ttctaacgac aatatgtaca agcctaattg 600 tgtagcatct ggcttactga agcagaccct atcatctctc tcgtaaactg ccgtcagagt 660 cggttgggtt ggacagacct ctgagtttct ggtaacgccg ttccgcaccc cggaaatggt 720 caccgaacca ttcagcaggg tcatcgctag ccagatcctc tacgccggac gcatcgtggc 780 ccgcatcacc ggcgccacag gtgcggtgct ggcgcctata tcgccgacat caccgatggg 840 gaagatcggg ctcgccactt cgggctcatg atcgctggtt tccgcctggg tatggtggca 900 ggccccgtgg cccgggggac tgttgggcgc catctccttg catgcaccat tccttgcggc 960 ggcggtgctc aacggcctca acctactact gggctgcttc ctaatgcagg agtcgcataa 1020 gggagagcgt cgatatggtg cactctcagt acaatctgct ctgatgccgc atagttaagc 1080 caactccgct atcgctacgt gactgggtca tggctgcgcc ccgacacccg ccaacacccg 1140 ctgacgcgcc ctgacgggct tgtctgcttc cggcatccgc ttacagacaa gctgtgaccg 1200 tctccgggag ctgcatgtgt cagaggtttt caccgtcatc accgaaacgc gcgaggcagc 1260 ttgaagacga aagggcctcg tgatacgcct atttttatag gttaatgtca tgataataat 1320 ggtttcttag acgtcaggtg gcacttttcg gggaaatgtg cgcggacccc ctattggttt 1380 atttttctaa atacattcaa atatgtatcc gctcatgaga caataaccct gataaatgct 1440 tcaataatat tgaaaaagga agagtatgag tattcaacat ttccgtgtcg cccttattcc 1500 cttttttgcg gcattttgcc ttcctgtttt tgctcaccca gaaacgctgg tgaaagtaaa 1560 agatgctgaa gatcagttgg gtgcacgagt gggttacatc gaactggatc tcaacagcgg 1620 taagatcctt gagagttttc gccccgaaga acgtttttca atgatgagca cttttaaagt 1680 tctgctatgt gtcgcggtat tatcccgtat tgacgccggg caagagcaac tcggtcgccg 1740 catacactat tctcagaatg acttggtggt acctaccagt cacagaaaag catcttacgg 1800 atggcatgac agtaagagaa ttatgcagtg ctgccataac catgagtgat aacactgcgg 1860 ccaacttact tctgacaacg atcggaggac cgaaggagct aaccgctttt ttgcacaaca 1920 tgggggatca tgtaactcgc cttgatcgtt gggaaccgga gctgaatgaa gccataccaa 1980 acgacgagcg tgacaccacg atgcctgtac gaacggcaac aacgttgcgc aaactattaa 2040 ctggcgaact acttactcta gcttcccggc aacaattaat agactggatg gaggcggata 2100 aagttgcagg accacttctg cgctcggccc ttccggctgg ctggtttatt gctgataaat 2160 ctggagccgg tgagcgtggg tctcgcggta tcattgcagc actggggcca gatggtaagc 2220 cctcccgtat cgtagttatc tacacgacgg ggagtcaggc aactatggat gaacgaaata 2280 gacagatcgc tgagataggt gcctcactga ttaagcattg gtaactgtca gaccaagttt 2340 actcatatat actttagatt gatttaaaac ttcattttta atttaaaagg atctaggtga 2400 agatcctttt tgataatctc atgaccaaaa tcccttaacg tgagttttcg ttccactgag 2460 cggtcagacc ccgtagaaag atcaaaggat cttcttgaga tccttttttt ctgcgcgtaa 2520 tctgctgctt gcaaacaaaa aaaccaccgc taccagcggt ggtttgtttg ccggatcaag 2580 agctaccaac tctttttccg aaggtaactg gcttcagcag agcgcagata ccaaatactg 2640 tccttctagt gtagccgtag ttaggccacc acttcaagaa ctctgtagca ccgcctacat 2700 acctcgctct gctaatcctg ttaccagtgg ctgctgccag tggcgataag tcgtgtctta 2760 ccgggttgga ctcaagacga taggtaccgg ataaggcgca gcggtcgggc tgaacggggg 2820 gttcgtgcac acagcccagc ttggagcgaa cgacctacac cgaactgaga tacctacagc 2880 gcgagcattg agaaagcgcc acgcttcccg aagggagaaa ggcggacagg tatccggtaa 2940 gcggcagggt cggaacaaga gagcgcacga gggagcttcc agggggaaac gcctggtatc 3000 tttatagtcc tgtcgggttt cgccacctct gacttgagcg tcgatttttg tgatgctcgt 3060 caggggggcg gagcctatgg aaaaacgcca gcaacgcggc ctttttacgg ttcctggcct 3120 ttggctggcc ttttgctcac atgttctttc ctgcgttatc ccctgattct gtggataacc 3180 gtattaccgc ctttgagtga gctgataccg ctcgccgcag ccgaacgacc gacggcgcag 3240 cgagtcagtg agcgaggaag cggaagagcg cccaatacgc aaaccgcctc tccccgcgcg 3300 ttggccgatt cattaatgca gctgtggtgt catggtcggt gatcgccagg gtgccgacgc 3360 gcatctcgac tgcatggtgc accaatgctt ctggcgtcag gcagccatcg gaagctgtgg 3420 tatggccgtg caggtcgtaa atcactgcat aattcgtgtc gctcaaggcg cactcccgtt 3480 ctggataatg ttttttgcgg cgacatcata acggttctgg caaatattct gaaatgagct 3540 ggtgacaatt aatcatcgaa ctagttaact agtacgcaag ttcacgtaaa aagggtatcg 3600 cggaatt 3607 <210> 31 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> N-terminal linker <400> 31 Cys Gly Asp Glu Gly Gly 1 5 <210> 32 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C-terminal linker <400> 32 Gly Gly Glu Asp Gly Cys 1 5 <210> 33 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 33 Gly Gly Lys Gly Gly 1 5 <210> 34 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> N-terminal glycine linker <220> <221> REPEAT <222> (1)..(1) <223> Glycine can be repeated from zero to five times <220> <221> REPEAT <222> (3)..(3) <223> Glycine can be repeated from zero to twelve times <400> 34 Gly Cys Gly 1 <210> 35 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> N terminal glycine serine linkers <220> <221> REPEAT <222> (1)..(1) <223> Glycine can be repeated from zero to five times <220> <221> REPEAT <222> (3)..(3) <223> Glycine can be repeated from zero to ten times <220> <221> REPEAT <222> (4)..(4) <223> Serine can be repeated from zero to two times <220> <221> REPEAT <222> (5)..(9) <223> These residues can be repeated from zero to three times as a group <400> 35 Gly Cys Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 <210> 36 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C-terminal glycine linker <220> <221> REPEAT <222> (1)..(1) <223> Glycine can be repeated from zero to twelve times <220> <221> REPEAT <222> (3)..(3) <223> Glycine can be repeated from zero to five times <400> 36 Gly Cys Gly 1 <210> 37 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C terminal glycine serine linkers <220> <221> REPEAT <222> (1)..(1) <223> Glycine can be repeated from zero to ten times <220> <221> REPEAT <222> (2)..(2) <223> Serine can be repeated from zero to two times <220> <221> REPEAT <222> (3)..(7) <223> These residues can be repeated from zero to three times as a group <220> <221> REPEAT <222> (8)..(8) <223> Glycine can be repeated from zero to eight times <220> <221> REPEAT <222> (10)..(10) <223> Glycine can be repeated from zero to five times <400> 37 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Cys Gly 1 5 10 <210> 38 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Glycine serine linker <220> <221> REPEAT <222> (1)..(5) <223> These residues can be repeated any times as a group <400> 38 Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 <210> 39 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> N-terminal gamma1 <400> 39 Cys Gly Asp Lys Thr His Thr Ser Pro Pro 1 5 10 <210> 40 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C-terminal gamma 1 <400> 40 Asp Lys Thr His Thr Ser Pro Pro Cys Gly 1 5 10 <210> 41 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> N-terminal gamma 3 <400> 41 Cys Gly Gly Pro Lys Pro Ser Thr Pro Pro Gly Ser Ser Gly Gly Ala 1 5 10 15 Pro <210> 42 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C-terminal gamma 3 <400> 42 Pro Lys Pro Ser Thr Pro Pro Gly Ser Ser Gly Gly Ala Pro Gly Gly 1 5 10 15 Cys Gly <210> 43 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> N-terminal glycine linker <400> 43 Gly Cys Gly Gly Gly Gly 1 5 <210> 44 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C-terminal glycine linker <400> 44 Gly Gly Gly Gly Cys Gly 1 5 <210> 45 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C-terminal glycine-lysine linker <400> 45 Gly Gly Lys Lys Gly Cys 1 5 <210> 46 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> N-terminal glycine-lysine linker <400> 46 Cys Gly Lys Lys Gly Gly 1 5 <210> 47 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C.terminal linker <400> 47 Gly Gly Cys Gly 1 <210> 48 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide primer <400> 48 ggtaacatcg gtcgagatgg aaaacaaact ctggtcc 37 <210> 49 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide primer <400> 49 ggaccagagt ttgttttcca tctcgaccga tgttacc 37 <210> 50 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide primer <400> 50 agctcgcccg gggatcctct ag 22 <210> 51 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide primer <400> 51 cgatgcattt catccttagt tatcaatacg ctgggttcag 40 <210> 52 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide primer <400> 52 ggcaaaatta gagactgtta ctttaggtaa gatcgg 36 <210> 53 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide primer <400> 53 ccgatcttac ctaaagtaac agtctctaat tttgcc 36 <210> 54 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide primer <400> 54 ggccatggca cgactcgaga ctgttacttt agg 33 <210> 55 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide primer <400> 55 gatttaggtg acactatag 19 <210> 56 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide primer <400> 56 gatggacgtc aaactctggt cctcaatccg cgtgggg 37 <210> 57 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide primer <400> 57 ccccacgcgg attgaggacc agagtttgac gtccatc 37 <210> 58 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EcoRIHBcAg(s) primer <400> 58 ccggaattca tggacattga cccttataaa g 31 <210> 59 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Lys-HBcAg(as) primer <400> 59 cctagagcca cctttgccac catcttctaa attagtaccc acccaggtag c 51 <210> 60 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Lys-HBcAg(s) primer <400> 60 gaagatggtg gcaaaggtgg ctctagggac ctagtagtca gttatgtc 48 <210> 61 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HBcAg(1-149)Hind(as) primer <400> 61 cgcgtcccaa gcttctaaac aacagtagtc tccggaag 38 <210> 62 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 48as primer <400> 62 gtgcagtatg gtgaggtgag gaatgctcag gagactc 37 <210> 63 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 48s primer <400> 63 gagtctcctg agcattcctc acctcaccat actgcac 37 <210> 64 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 107as primer <400> 64 cttccaaaag tgagggaaga aatgtgaaac cac 33 <210> 65 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HBcAg149hind-as <400> 65 cgcgtcccaa gcttctaaac aacagtagtc tccggaagcg ttgatag 47 <210> 66 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 107s primer <400> 66 gtggtttcac atttcttccc tcacttttgg aag 33 <210> 67 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HBcAgwtHindIIII primer <400> 67 cgcgtcccaa gcttctaaca ttgagattcc cgagattg 38 <210> 68 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> epitope CeH3 <400> 68 Val Asn Leu Thr Trp Ser Arg Ala Ser Gly 1 5 10 <210> 69 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CeH3fwd primer <220> <221> CDS <222> (1)..(51) <400> 69 gtt aac ttg acc tgg tct cgt gct tct ggt gca tcc agg gat cta gta 48 Val Asn Leu Thr Trp Ser Arg Ala Ser Gly Ala Ser Arg Asp Leu Val 1 5 10 15 gtc 51 Val <210> 70 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CeH3fwd primer <400> 70 Val Asn Leu Thr Trp Ser Arg Ala Ser Gly Ala Ser Arg Asp Leu Val 1 5 10 15 Val <210> 71 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CeH3rev primer <400> 71 accagaagca cgagaccagg tcaagttaac atcttccaaa ttattaccca c 51 <210> 72 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CeH3rev primer peptide <400> 72 Asp Glu Leu Asn Asn Gly Val 1 5 <210> 73 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HBcAg-wt EcoRI fwd primer <400> 73 ccggaattca tggacattga cccttataaa g 31 <210> 74 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HBcAg-wt Hind III rev primer <400> 74 cgcgtcccaa gcttctaaca ttgagattcc cgagattg 38 <210> 75 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 75 Asp Ala Glu Phe Arg His 1 5 <210> 76 <211> 6 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 76 Asp Ala Glu Phe Gly His 1 5 <210> 77 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Abeta 1-6 GGC <400> 77 Asp Ala Glu Phe Arg His Gly Gly Cys 1 5 <210> 78 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> murine Abeta 1-6 GGC <400> 78 Asp Ala Glu Phe Gly His Gly Gly Cys 1 5 <210> 79 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer p1.44 <400> 79 aaccatggca aataagccaa tgcaaccg 28 <210> 80 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer p1.45 <400> 80 aatctagaat tttctgcgca cccatcccgg 30 <210> 81 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer p1.46 <400> 81 aaaagcttaa gcagtagtat cagacgatac 30 <210> 82 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer p1.47 <400> 82 gagtgatcca actcgtttat caactacatt ttcagcaagt ctg 43 <210> 83 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer p1.48 <400> 83 cagacttgct gaaaatgtag ttgataaacg agttggatca ctc 43 <210> 84 <211> 6 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 84 Asp Ala Glu Phe Arg His 1 5 <210> 85 <211> 6 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus <400> 85 Asp Ala Glu Phe Arg His 1 5 <210> 86 <211> 6 <212> PRT <213> Xenopus laevis <400> 86 Asp Ser Glu Tyr Arg His 1 5 <210> 87 <211> 6 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <400> 87 Asp Ala Glu Phe Gly His 1 5 <210> 88 <211> 6 <212> PRT <213> Cavia porcellus <400> 88 Asp Ala Glu Phe Arg His 1 5 <210> 89 <211> 15 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 89 Val His Glu Pro His Glu Phe Arg His Val Ala Leu Asn Pro Val 1 5 10 15 <210> 90 <211> 6 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 90 Tyr Tyr Glu Phe Arg His 1 5 <210> 91 <211> 42 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 91 Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys 1 5 10 15 Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile 20 25 30 Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala 35 40 <210> 92 <211> 770 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 92 Met Leu Pro Gly Leu Ala Leu Leu Leu Leu Ala Ala Trp Thr Ala Arg 1 5 10 15 Ala Leu Glu Val Pro Thr Asp Gly Asn Ala Gly Leu Leu Ala Glu Pro 20 25 30 Gln Ile Ala Met Phe Cys Gly Arg Leu Asn Met His Met Asn Val Gln 35 40 45 Asn Gly Lys Trp Asp Ser Asp Pro Ser Gly Thr Lys Thr Cys Ile Asp 50 55 60 Thr Lys Glu Gly Ile Leu Gln Tyr Cys Gln Glu Val Tyr Pro Glu Leu 65 70 75 80 Gln Ile Thr Asn Val Val Glu Ala Asn Gln Pro Val Thr Ile Gln Asn 85 90 95 Trp Cys Lys Arg Gly Arg Lys Gln Cys Lys Thr His Pro His Phe Val 100 105 110 Ile Pro Tyr Arg Cys Leu Val Gly Glu Phe Val Ser Asp Ala Leu Leu 115 120 125 Val Pro Asp Lys Cys Lys Phe Leu His Gln Glu Arg Met Asp Val Cys 130 135 140 Glu Thr His Leu His Trp His Thr Val Ala Lys Glu Thr Cys Ser Glu 145 150 155 160 Lys Ser Thr Asn Leu His Asp Tyr Gly Met Leu Leu Pro Cys Gly Ile 165 170 175 Asp Lys Phe Arg Gly Val Glu Phe Val Cys Cys Pro Leu Ala Glu Glu 180 185 190 Ser Asp Asn Val Asp Ser Ala Asp Ala Glu Glu Asp Asp Ser Asp Val 195 200 205 Trp Trp Gly Gly Ala Asp Thr Asp Tyr Ala Asp Gly Ser Glu Asp Lys 210 215 220 Val Val Glu Val Ala Glu Glu Glu Glu Val Ala Glu Val Glu Glu Glu 225 230 235 240 Glu Ala Asp Asp Asp Glu Asp Asp Glu Asp Gly Asp Glu Val Glu Glu 245 250 255 Glu Ala Glu Glu Pro Tyr Glu Glu Ala Thr Glu Arg Thr Thr Ser Ile 260 265 270 Ala Thr Thr Thr Thr Thr Thr Thr Glu Ser Val Glu Glu Val Val Arg 275 280 285 Glu Val Cys Ser Glu Gln Ala Glu Thr Gly Pro Cys Arg Ala Met Ile 290 295 300 Ser Arg Trp Tyr Phe Asp Val Thr Glu Gly Lys Cys Ala Pro Phe Phe 305 310 315 320 Tyr Gly Gly Cys Gly Gly Asn Arg Asn Asn Phe Asp Thr Glu Glu Tyr 325 330 335 Cys Met Ala Val Cys Gly Ser Ala Met Ser Gln Ser Leu Leu Lys Thr 340 345 350 Thr Gln Glu Pro Leu Ala Arg Asp Pro Val Lys Leu Pro Thr Thr Ala 355 360 365 Ala Ser Thr Pro Asp Ala Val Asp Lys Tyr Leu Glu Thr Pro Gly Asp 370 375 380 Glu Asn Glu His Ala His Phe Gln Lys Ala Lys Glu Arg Leu Glu Ala 385 390 395 400 Lys His Arg Glu Arg Met Ser Gln Val Met Arg Glu Trp Glu Glu Ala 405 410 415 Glu Arg Gln Ala Lys Asn Leu Pro Lys Ala Asp Lys Lys Ala Val Ile 420 425 430 Gln His Phe Gln Glu Lys Val Glu Ser Leu Glu Gln Glu Ala Ala Asn 435 440 445 Glu Arg Gln Gln Leu Val Glu Thr His Met Ala Arg Val Glu Ala Met 450 455 460 Leu Asn Asp Arg Arg Arg Leu Ala Leu Glu Asn Tyr Ile Thr Ala Leu 465 470 475 480 Gln Ala Val Pro Pro Arg Pro Arg His Val Phe Asn Met Leu Lys Lys 485 490 495 Tyr Val Arg Ala Glu Gln Lys Asp Arg Gln His Thr Leu Lys His Phe 500 505 510 Glu His Val Arg Met Val Asp Pro Lys Lys Ala Ala Gln Ile Arg Ser 515 520 525 Gln Val Met Thr His Leu Arg Val Ile Tyr Glu Arg Met Asn Gln Ser 530 535 540 Leu Ser Leu Leu Tyr Asn Val Pro Ala Val Ala Glu Glu Ile Gln Asp 545 550 555 560 Glu Val Asp Glu Leu Leu Gln Lys Glu Gln Asn Tyr Ser Asp Asp Val 565 570 575 Leu Ala Asn Met Ile Ser Glu Pro Arg Ile Ser Tyr Gly Asn Asp Ala 580 585 590 Leu Met Pro Ser Leu Thr Glu Thr Lys Thr Thr Val Glu Leu Leu Pro 595 600 605 Val Asn Gly Glu Phe Ser Leu Asp Asp Leu Gln Pro Trp His Ser Phe 610 615 620 Gly Ala Asp Ser Val Pro Ala Asn Thr Glu Asn Glu Val Glu Pro Val 625 630 635 640 Asp Ala Arg Pro Ala Ala Asp Arg Gly Leu Thr Thr Arg Pro Gly Ser 645 650 655 Gly Leu Thr Asn Ile Lys Thr Glu Glu Ile Ser Glu Val Lys Met Asp 660 665 670 Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys Leu 675 680 685 Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile Gly 690 695 700 Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala Thr Val Ile Val Ile Thr Leu 705 710 715 720 Val Met Leu Lys Lys Lys Gln Tyr Thr Ser Ile His His Gly Val Val 725 730 735 Glu Val Asp Ala Ala Val Thr Pro Glu Glu Arg His Leu Ser Lys Met 740 745 750 Gln Gln Asn Gly Tyr Glu Asn Pro Thr Tyr Lys Phe Phe Glu Gln Met 755 760 765 Gln Asn 770 <210> 93 <211> 82 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 93 Gly Ser Gly Leu Thr Asn Ile Lys Thr Glu Glu Ile Ser Glu Val Lys 1 5 10 15 Met Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln 20 25 30 Lys Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile 35 40 45 Ile Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala Thr Val Ile Ile Ile 50 55 60 Thr Leu Val Met Leu Lys Lys Gln Tyr Thr Ser Asn His His Gly Val 65 70 75 80 Val Glu

Claims (51)

  1. (a) 제1 부착 부위가 하나 이상 있는 코어 입자, 및
    (b) 제2 부착 부위가 하나 이상 있는 항원 또는 항원성 결정인자 하나 이상을 포함하되,
    상기 코어 입자가 RNA-파아지의 바이러스-유사 입자이고,
    상기 항원 또는 항원성 결정인자가 Aβ1-6 펩티드이고,
    상기 제2 부착 부위가 (i) 상기 항원 또는 항원성 결정인자에게서 자연발생하지 않는 부착 부위 및 (ⅱ) 상기 항원 또는 항원성 결정인자에게서 자연발생하는 부착 부위로 이루어진 군에서 선택된 것이며,
    상기 제2 부착 부위가 상기 제1 부착 부위에 회합할 수 있고, 이 회합을 통해 상기 Aβ1-6 펩티드와 상기 코어 입자가 상호작용하여 질서화된 반복성 항원 어레이를 형성하는 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 바이러스-유사 입자가 RNA-파아지의 재조합 단백질 또는 이의 단편을 포함하거나 또는 이들로 이루어진 것인 조성물.
  3. 제2항에 있어서, 상기 RNA-파아지가
    (a) 박테리오파아지 Qβ,
    (b) 박테리오파아지 R17,
    (c) 박테리오파아지 fr,
    (d) 박테리오파아지 GA,
    (e) 박테리오파아지 SP,
    (f) 박테리오파아지 MS2,
    (g) 박테리오파아지 M11,
    (h) 박테리오파아지 MX1,
    (i) 박테리오파아지 NL95,
    (k) 박테리오파아지 f2,
    (l) 박테리오파아지 PP7 및
    (m) 박테리오파아지 AP205
    로 이루어진 군에서 선택된 것인 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 바이러스-유사 입자가 RNA-파아지 Qβ의 재조합 단백질 또는 이의 단편을 포함하거나 또는 이들로 이루어진 것인 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 바이러스-유사 입자가 RNA-파아지 fr의 재조합 단백질 또는 이의 단편을 포함하거나 또는 이들로 이루어진 것인 조성물.
  6. 제1항에 있어서, 상기 바이러스-유사 입자가 RNA-파아지 AP205의 재조합 단백질 또는 이의 단편을 포함하거나 또는 이들로 이루어진 것인 조성물.
  7. 제1항에 있어서, 상기 바이러스-유사 입자가 RNA 파아지의 코트 단백질을 포함하거나, 또는 RNA 파아지의 코트 단백질로 본질적으로 이루어지거나, 또는 RNA 파아지의 코트 단백질로 이루어진 것인 조성물.
  8. 제7항에 있어서, 아미노산을 갖는 RNA 파아지의 상기 코트 단백질이
    (a) 서열 4,
    (b) 서열 4와 서열 5의 혼합물,
    (c) 서열 6,
    (d) 서열 7,
    (e) 서열 8,
    (f) 서열 9,
    (g) 서열 9와 서열 10의 혼합물,
    (h) 서열 11,
    (i) 서열 12,
    (k) 서열 13,
    (l) 서열 14,
    (m) 서열 15,
    (n) 서열 16, 및
    (o) 서열 28
    로 이루어진 군에서 선택된 것인 조성물.
  9. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 바이러스-유사 입자가 RNA 파아지의 돌연변이 코트 단백질을 포함하거나, 또는 RNA 파아지의 돌연변이 코트 단백질로 본질적으로 이루어지거나, 또는 RNA 파아지의 돌연변이 코트 단백질로 이루어진 것인 조성물.
  10. 제9항에 있어서, 상기 RNA-파아지가
    (a) 박테리오파아지 Qβ,
    (b) 박테리오파아지 R17,
    (c) 박테리오파아지 fr,
    (d) 박테리오파아지 GA,
    (e) 박테리오파아지 SP,
    (f) 박테리오파아지 MS2,
    (g) 박테리오파아지 M11,
    (h) 박테리오파아지 MX1,
    (i) 박테리오파아지 NL95,
    (k) 박테리오파아지 f2,
    (l) 박테리오파아지 PP7 및
    (m) 박테리오파아지 AP205
    로 이루어진 군에서 선택된 것인 조성물.
  11. 제9항에 있어서, 상기 RNA 파아지의 상기 돌연변이 코트 단백질이 치환에 의하여 하나 이상의 라이신 잔기가 제거됨으로써 변형된 것인 조성물.
  12. 제9항에 있어서, 상기 RNA 파아지의 상기 돌연변이 코트 단백질이 치환에 의하여 하나 이상의 라이신 잔기가 부가됨으로써 변형된 것인 조성물.
  13. 제9항에 있어서, 상기 RNA 파아지의 상기 돌연변이 코트 단백질이 하나 이상의 라이신 잔기가 결실됨으로써 변형된 것인 조성물.
  14. 제9항에 있어서, 상기 RNA 파아지의 상기 돌연변이 코트 단백질이 삽입에 의하여 하나 이상의 라이신 잔기가 부가됨으로써 변형된 것인 조성물.
  15. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 부착 부위가 하나 이상의 공유결합을 통하여 제1 부착 부위에 회합할 수 있는 것인 조성물.
  16. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 부착 부위가 하나 이상의 비-펩티드 결합을 통하여 제1 부착 부위에 회합할 수 있는 것인 조성물.
  17. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Aβ1-6 펩티드가 상기 코어 입자에 융합된 것인 조성물.
  18. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Aβ1-6 펩티드가
    (a) 서열 75의 아미노산 서열을 갖는 인간 Aβ1-6 펩티드,
    (b) 서열 76의 아미노산 서열을 갖는 뮤린 (murine) Aβ1-6 펩티드,
    (c) 서열 84의 아미노산 서열을 갖는 영장류 Aβ1-6 펩티드,
    (d) 서열 85의 아미노산 서열을 갖는 토끼 Aβ1-6 펩티드,
    (e) 서열 86의 아미노산 서열을 갖는 제노푸스 래비스 (Xenopus laevis) Aβ1-6 펩티드,
    (f) 서열 87의 아미노산 서열을 갖는 래트 Aβ1-6 펩티드, 및
    (g) 서열 88의 아미노산 서열을 갖는 기니아 피그 Aβ1-6 펩티드
    로 이루어진 군에서 선택된 것인 조성물.
  19. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Aβ1-6 펩티드가 서열 75의 아미노산 서열을 갖는 것인 조성물.
  20. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 부착 부위를 포함하거나 또는 상기 제2 부착 부위로 이루어진 아미노산 링커를 더 포함하는 조성물.
  21. 제20항에 있어서, 상기 제2 부착 부위 또는 상기 제2 부착 부위가 있는 아미노산 링커가 상기 Aβ1-6 펩티드에 그의 C-말단에서 결합하는 것인 조성물.
  22. 제20항에 있어서, 상기 제2 부착 부위 또는 상기 제2 부착 부위가 있는 아미노산 링커가
    (a) GGC,
    (b) GGC-CONH2,
    (c) GC,
    (d) GC-CONH2,
    (e) C, 및
    (f) C-CONH2
    로 이루어진 군에서 선택된 것인 조성물.
  23. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 제2 부착 부위가 있는 상기 Aβ1-6 펩티드가 NH2-DAEFRHGGC-CONH2 (서열 77)인 조성물.
  24. 제23항에 있어서, 상기 바이러스-유사 입자가 RNA-파아지 Qβ 코트 단백질의 바이러스-유사 입자인 조성물.
  25. 제1항에 있어서, 상기 바이러스-유사 입자가 서열 4의 아미노산 서열을 갖는 재조합 RNA-박테리오파지 Qβ 코트 단백질을 포함하고, 상기 제2 부착 부위가 하나 이상의 비-펩티드 결합을 통해 상기 제1 부착 부위에 회합할 수 있고, 상기 Aβ1-6 펩티드가 서열 75의 아미노산 서열을 가지며,
    상기 조성물이 (a) GGC 또는 (b) GGC-CONH2로 이루어진 군으로부터 선택된 하나인 아미노산 링커를 추가로 포함하고, 여기서 (a)인 경우 상기 하나 이상의 제2 부착 부위가 상기 링커를 포함하고, 상기 하나 이상의 제2 부착 부위가 있는 상기 Aβ1-6 펩티드가 DAEFRHGGC의 서열을 갖고, (b)인 경우 상기 하나 이상의 제2 부착 부위가 상기 링커를 포함하고, 상기 하나 이상의 제2 부착 부위가 있는 상기 Aβ1-6 펩티드가 NH2-DAEFRHGGC-CONH2의 서열을 갖는 것인 조성물.
  26. 제1항 또는 제25항에 있어서, 상기 조성물이 상기 제1 부착 부위와 반응할 수 있는 관능기 및 상기 제2 부착 부위와 반응할 수 있는 추가의 관능기를 포함하는 이종이관능성 크로스링커(heterobifunctional crosslinker)를 추가로 포함하는 것인 조성물.
  27. 제26항에 있어서, 상기 이종이관능성 크로스링커가 바이러스-유사 입자 또는 하나 이상의 바이러스-유사 입자 서브유닛의 리신 잔기의 측쇄 아미노기와 반응할 수 있는 관능기를 포함하는 것인 조성물.
  28. 제26항에 있어서, 상기 이종이관능성 크로스링커의 상기 추가의 관능기가 Aβ1-6 펩티드에 융합된 시스테인 잔기와 반응하는 것인 조성물.
  29. 제26항에 있어서, 상기 이종이관능성 크로스링커가 SMPH, 술포-MBS, 술포-EMCS, 술포-GMBS, 술포-SIAB, 술포-SMPB, 술포-SMCC, SVSB, SIA 및 아미노 기에 대해 반응성이 있는 하나의 관능기 및 시스테인 잔기에 대해 반응성이 있는 하나의 관능기를 갖는 다른 크로스링커로부터 선택되는 것인 조성물.
  30. 제26항에 있어서, 상기 이종이관능성 크로스링커가 SPDP 또는 술포-LC-SPDP인 조성물.
  31. (a) 제1항의 조성물, 및
    (b) 제약상 허용되는 담체
    를 포함하는 알츠하이머병 치료용 제약 조성물.
  32. 제31항에 있어서, 면역보강제 (adjuvant)를 더 포함하는 제약 조성물.
  33. 제31항에 있어서, 상기 조성물이 면역보강제가 없는 것인 제약 조성물.
  34. 제1항 내지 제8항, 제25항 및 제31항 내지 제33항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는 백신 조성물.
  35. 제34항에 있어서, 면역보강제를 더 포함하는 백신 조성물.
  36. 제34항에 있어서, 상기 백신 조성물이 면역보강제가 없는 것인 백신 조성물.
  37. (a) 제1 부착 부위가 하나 이상 있는 코어 입자를 제공하고,
    (b) 제2 부착 부위가 하나 이상 있는 항원 또는 항원성 결정인자를 하나 이상 제공하되,
    상기 코어 입자가 RNA-파아지의 바이러스-유사 입자이고,
    상기 항원 또는 항원성 결정인자가 Aβ1-6 펩티드이고,
    상기 제2 부착 부위가 (i) 상기 항원 또는 항원성 결정인자에게서 자연발생하지 않는 부착 부위 및 (ⅱ) 상기 항원 또는 항원성 결정인자에게서 자연발생하는 부착 부위로 이루어진 군에서 선택된 것이며,
    상기 제2 부착 부위가 상기 제1 부착 부위에 회합할 수 있고,
    (c) 상기 회합을 통해 상기 항원 또는 항원성 결정인자와 상기 코어 입자가 상호작용하여 질서화된 반복성 항원 어레이를 형성하도록 상기 코어 입자와 상기 하나 이상의 항원 또는 항원성 결정인자를 결합시키는 것
    을 포함하는, 제1항 내지 제8항, 제25항 및 제31항 내지 제33항 중 어느 한 항의 조성물의 제조 방법.
  38. 제1항 내지 제8항 및 제25항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는, 동물 또는 인간의 면역화를 위한 조성물.
  39. 제38항에 있어서, 상기 항원 또는 항원성 결정인자가 자기-항원인 조성물.
  40. 제38항에 있어서, 상기 동물이 인간인 조성물.
  41. 제38항에 있어서, 상기 항원 또는 항원성 결정인자가 인간 Aβ1-6 펩티드인 조성물.
  42. 제1항 내지 제8항 및 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 알츠하이머병 치료용 의약으로서 사용하기 위한 조성물.
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