KR100997411B1

KR100997411B1 - 반대이온의 교환을 이용한 공액 고분자 ｆｒｅｔ 시스템 및바이오센서

Info

Publication number: KR100997411B1
Application number: KR1020080035842A
Authority: KR
Inventors: 우한영; 강미정; 란잔 나약 라티; 쿠마르 나그 오크힐
Original assignee: 부산대학교 산학협력단
Priority date: 2008-04-17
Filing date: 2008-04-17
Publication date: 2010-11-30
Also published as: KR20090110185A

Abstract

본 발명은 반대이온의 교환을 이용한 수용성 공액 고분자 FRET 시스템 및 바이오센서에 관한 것으로, 보다 구체적으로 형광 공여체로서 양이온 공액 고분자를 사용하고, 형광 수용체로서 핵산이 결합된 형광분자를 사용하며, 상기 양전하 공액 고분자의 반대이온을 크기가 다른 반대이온으로 이온교환반응에 의하여 바꾸어 줌으로써 공여체와 수용체간의 거리를 조절하여 상기 공여체와 수용체 사이의 형광 공명 에너지 전달을 최적화시킨 FERT 시스템 및 이를 이용한 DNA센서에 관한 것이다.

따라서, 본 발명의 수용성 공액 고분자를 이용한FRET 시스템은 반대이온의 크기를 이온교환반응에 의하여 바꾸어 줌으로써 FRET 공여체와 수용체 사이의 거리를 분자수준에서 제어하여, PCT 는 최소화 시키고 FRET 시그날을 극대화시킬 수 있으므로, 본 발명의 FRET시스템을 이용한 DNA센서는 복잡한 합성과정에 의해 분자구조를 변경시킬 필요없이 모든 구조의 양이온 고분자에 적용할 수 있어 간단하면서도 효과적이다.

FRET (fluorescence resonance energy transfer), 반대이온 (counterion), 고분자 바이오센서, 양이온 공액 고분자, 고분자전해질, 수용성 공액 고분자, 수용 성 형광 고분자

Description

반대이온의 교환을 이용한 공액 고분자 ＦＲＥＴ 시스템 및 바이오센서{Conjugated polymer FRET System and Biosensor by exchanging Counterion}

본 발명은 반대이온의 교환을 이용하여 형광 공명 에너지 전달을 최적화시킨 수용성 공액 고분자 FRET 시스템 및 이를 이용한 바이오센서에 관한 것이다.

수용성 공액 고분자 전해질 (water-soluble conjugated polyelectrolytes, CPs)은 공액 고분자 주쇄에서 기인한 유기반도체의 형광특성과 전자적 특성 및 물과 같은 극성 용매에 대한 용해도, 전해질 특성을 동시에 갖고 있는 매우 흥미로운 유기소재이다. 최근 들어 공액 구조에서 기인한 반도체적 특성을 활용하여 유기발광소자 (organic light emitting diode, OLED), 유기박막 트랜지스터 (organic thin film transistor, OTFT), 유기태양전지 (organic photovoltaic cell, OPVC) 등 유기전자소자에 응용하려는 연구결과 발표가 꾸준히 증가하고 있다. 또한 공액구조에서 기인한 형광 특성 혹은 전기화학적 성질과 물에 녹는 특성을 결합하여 특정 염기서열을 갖는 DNA 검출, 단백질 검출, 효소 활성 조사, 생리활성 물질 검출 등 바이오센서나 유전자 전달 모니터링, 바이오 이메징 등에 활용하고자 하는 첨단 고부가 연구가 미국, 유럽 등 선진국가를 시작으로 점차 확대되고 있는 실정이다.

또한 이러한 CPs의 다양한 특성은 수용액에서 정전기적 상호작용에 의하여 조절된다. 전자소자 및 화학센서, 바이오센서에 잠재적인 적용을 위해서 다양한 공액 고분자에 술포네이트 (-SO₃ ^-), 카르복실레이트 (-CO₂ ^-), 포스페이트 (-PO₄ ³ ^-) 및 4차 암모늄 (-NR₃ ⁺) 그룹과 같은 양이온 혹은 음이온의 이온 작용기를 고분자 측쇄에 치환기로 도입한 구조들이 보고되었다. 말단에 암모늄 작용기를 가지는 양이온성 공액 고분자 (cationic CPs ,CCPs)의 색깔변화 (colorimetric change) 또는 형광 공명 에너지 전달 (fluorescence resonance energy transfer, FRET) 메커니즘을 사용하여 광학적으로 DNA를 검출할 수 있다는 것이 발견되었다. (H. A. Ho, M. Boissinot, M. G. Bergeron, G. Corbeil, K. Dore D. Boudreau, M. Leclerc, Angew. Chem . Int . Ed . 2002, 41, 1548. B. S. Gaylord, A. J. Heeger, G. C. Bazan, Proc . Natl . Acad . Sci . USA 2002, 99, 10954. B. S. Gaylord, A. J. Heeger, G. C. Bazan, J. Am . Chem . Soc . 2003, 125, 896.) 즉, 양이온성 공액 고분자와 음전하를 띄는 DNA 사이의 정전기적 복합체는 공액 고분자 주쇄의 3차원적 형태에 변화를 초래하거나 고분자에서 특정 염기서열의 표적 DNA로 효율적인 형광 에너지 전달을 할 수 있도록 배위될 수 있다. 바잔에 의한 후자의 원리는 수용성 양이온 공액 고분자의 안테나 효과 또는 광-수확 (light harvesting) 특성에 의하 여 감지 신호의 증폭 및 향상된 검출감도를 얻을 수 있다.

이러한 원리의 한계는 D/A 정전기적 착체, 즉 CCP/DNA-C* 복합체(D:FRET 공여체, A: FRET수용체, C*: 발색단)에서 FRET과 경쟁하는 에너지 소모적인 PCT (photo-induced charge transfer)에 의하여 형광약화가 일어나고, 검출감도가 떨어진다는 것이다. 최근 연구에서, 양이온 공액 고분자 (CCP) 주쇄에 부피가 큰 분자를 달거나, 고분자 주쇄에 알킬 그룹을 치환하고 알킬 체인의 길이를 변경하거나, CCP와 DNA-C* 복합체가 형성되는 완충액에 유기 용매를 혼합하여, D-A의 분자간 거리(r_D _-A) 를 조절함으로써 실질적으로 PCT에 의한 형광약화를 감소시키고, 향상된 FRET-유도 Fl 신호증대를 관찰하였다. (H. Y. Woo, D. Vak, D. Korystov, A. Mikhailovsky, G. C. Bazan, D.-Y. Kim, Adv . Funct . Mater . 2007, 17, 290., B. Liu, B. S. Gaylord, S. Wang, G. C. Bazan, J. Am . Chem . Soc . 2003, 125, 6705., B. Liu, G. C. Bazan, Chem . Asian J. 2007, 2, 499)

FRET과 PCT는 공여체와 수용체의 거리에 매우 민감하여, FRET의 속도는 r^-6에 비례하고 PCT의 경우 D-A 거리가 증가할수록 지수함수적(e^-r)으로 감소하는 특성이 있다. 즉, FRET과 PCT 모두 D-A 거리가 증가할수록 감소하지만 PCT는 지수함수적으로 더 급격하게 감소하게 되므로, FRET과 PCT의 경쟁관계는 FRET 공여체와 수용체의 거리를 분자수준으로 조절함으로써 제어할 수 있다. 또한 양전하 고분자의 HOMO-LUMO 전자 구조와 발색단의 HOMO-LUMO 전자구조를 조절함으로써 PCT 가 감소 될 수 있으나, 이와 같이 분자 구조를 변경하여 (D-A 거리를 조절하거나 HOMO-LUMO 전자구조를 조절하여) PCT를 감소시키는 접근법은 복잡한 화학적 합성을 수반하며, 모든 고분자에 적용할 수 없다는 단점을 가진다.

따라서 PCT quenching을 제어하고 FRET에너지 전달을 극대화하기 위하여, 다른 고분자 구조에도 일반적으로 적용할 수 있는 단순하고 쉬운 방법이 절대적으로 필요하다. 특히, CCP 기반의 FRET 센서에 있어서, 형광에너지 전달을 통해 DNA 검출을 최적화하기 위해서는 FRET 특성에 중요한 역할을 하는CCP와 형광 수용체의 HOMO-LUMO 전자구조, D/A 정전기착체의 미세구조, FRET 공여체인 고분자 주쇄와 FRET 수용체인 발색단 간의 거리, FRET과 PCT의 경쟁 등의 요소를 미세하게 제어할 필요가 있다.

이에, 본 발명자는 동일한 공액구조의 양이온 고분자에 두 가지 다른 반대이온 (counterion)인 브로마이드 (bromide, BR)와 테트라페닐보레이트 (tetraphenylborate, PB)를 갖는 두 가지 수용성 CCPs, FHQ-BR, FHQ-PB, FPQ-BR 및 FPQ-BR 의 FRET-관련 광물리적 특성에 대하여 연구하였다. 이러한 FHQ-BR 및 FHQ-PB는 동일한 π-공액 구조를 가지며, 주된 구조적 차이는 말단 헥실트리메틸암모늄 (hexyltrimethylammonium) 그룹의 전하상쇄를 위해 수반되는 반대이온이 다르다는 것이며, 이는FPQ-BR 및 FPQ-PB의 경우도 동일하다.

그 결과, 상기의 동일한 주쇄를 가지나 다른 반대이온을 갖는 CCP, 즉 FHQ-BR, FHQ-PB 또는 FPQ-BR, FPQ-PB는 FRET 공여체로서 단일가닥 DNA에 표지된 플루오레신 (ssDNA-Fl)으로 형광 공명 에너지를 전달하는데 있어 차이를 보이고, 이는 상 기 반대이온이 D/A 정전기 착체의 미세구조에 영향을 미쳐 FRET과 에너지 소모적인 PCT사이의 경쟁관계를 제어함으로써, CP를 기반으로 하는 DNA 검출을 최적화할 수 있음을 확인하였다. 이에 따라 본 발명자는, FRET과 에너지 소모적인 PCT사이의 경쟁관계를 제어하는 단순하고 쉬운 방법으로서, FRET 공여체인 수용성 양이온 고분자의 반대이온을 변경하여 고분자/ssDNA-Fl 정전기착체 형성시 D-A 분자간 거리 등 D/A 정전기 착체의 미세구조를 조절하여 FRET 시스템 및 바이오센서에 관한 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 목적은 반대이온의 교환을 이용한 수용성 공액 고분자 FRET 시스템 및 바이오센서를 제공하고자 하는 것이다. 보다 구체적으로 본 발명은 양이온 공액 고분자의 반대이온을 이온교환반응에 의하여 다른 크기의 반대이온으로 변경하여 정전기착체 형성시 FRET 공여체-수용체 간의 거리를 분자수준에서 제어할 수 있도록 함으로써, FRET과 경쟁적인 관계에 있는 PCT를 감소시키고 발색단의 형광을 향상시킨 FRET 시스템 및 이를 이용하여 FRET 기반의 DNA 센서의 감도를 증대시킨 바이오센서를 제공하고자 한다.

상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여,

본 발명에서는 FRET 공여체로서FHQ-BR 또는 FHQ-PB (반대이온으로써 브로마이드 또는 테트라페닐보레이트를 갖는 폴리(9,9'-비스(6-N,N,N-트리메틸암모늄헥실)플루오렌-알트-1,4-(2,5-비스(6-N,N,N-트리메틸암모늄헥실옥시))페닐렌)); 및 FPQ-BR 또는 FPQ-PB (반대이온으로써 브로마이드 또는 테트라페닐보레이트를 갖는 폴리(9,9'-비스(6''-N,N,N-트리메틸암모늄헥실)플루오렌-알트-페닐렌));를 이용하여 플루오레신(Fl)이 레이블된 단일가닥 DNA (ssDNA-Fl)으로의 FRET을 광 발광 분광광도계로 측정한 결과, 부피가 큰 PB를 반대이온으로 갖는 고분자에 의해 FRET에 의한 Fl 형광이 향상되는 것을 확인하였다. 이는 고분자/ssDNA-Fl 정전기착체 내의 Fl를 직접적으로 여기시켜 측정한 형광 스펙트럼으로부터 부피가 큰 PB에 의해서 PCT가 감소하여 Fl 형광 약화가 줄어드는 데에서 비롯됨을 확인하였다.

그러므로 본 발명은, 간단한 이온교환반응을 통해 크기가 다른 반대이온으로의 변경에 의하여 FRET 공여체와 수용체간의 거리를 분자 수준에서 미세하게 조절하여 형광공명에너지전달을 최적화시킨 FRET 시스템 및 이를 이용한 바이오센서를 제공할 수 있다.

이하 본 발명을 자세히 설명한다.

본 발명의 제 1견지에 의하면, 본 발명은 형광 수용체로서 핵산에 결합된 형광분자 (-C*); 형광 공여체로서 양이온 공액 고분자를 포함하고 상기 고분자의 반대이온과 크기가 다른 반대이온;을 더 포함하여 구성되며,

상기 양이온 공액 고분자의 반대이온을 상기 크기가 다른 반대이온으로 이온 교환반응시켜, 고분자/핵산-C* 정전기착체 형성시 상기 공여체와 수용체 간의 거리를 조절함을 특징으로 하는 FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) 시스템에 관한 것이다. 바람직하게는 상기 핵산은 단일가닥 DNA (ssDNA)일 수 있다.

FRET시스템에서는, 고분자 구조 또는 수용체 구조에 따라 PCT (photo-induced charge transfer)에 의한 형광약화를 억제하고 FRET 시그날을 극대화함으로써 형광 수용체의 형광 발광을 증대시킬 수 있는 공여체와 수용체 간의 거리가 달라지게 된다. 따라서 본 발명의 FRET 시스템은 상기한 바와 같이 고분자 구조 또는 수용체 구조에 따라 적절하게 크기가 다른 반대이온으로의 간단한 이온교환반응을 통하여 PCT quenching과 FRET의 경쟁을 제어할 수 있도록 공여체와 수용체간의 거리를 조절할 수 있도록 한 것이다. 즉, 본 발명의 상기 FRET시스템은 반대이온의 크기를 변경하여 줌으로써, 고분자/핵산-C* 정전기 착체 형성시 상기 공액 고분자의 반대이온에 의하여 상기 공여체와 수용체간의 거리를 옹스트롬의 분자수준에서 제어할 수 있게 함으로써, 형광 수용체의 형광발광을 증대될 수 있다.

본 발명에서 사용된 수용성 공액 고분자 (water-soluble conjugated polymer), 양이온 공액 고분자 (cationic conjugated polymer, CCP), 공액 고분자전해질 (Conjugated polyelectrolyte, CP)과 같은 용어는 FRET에 사용되는 공여체로서 양전하를 가진 수용성 고분자를 의미하는 것으로 상호교환 가능하게 사용된다.

이러한 공액 고분자 전해질은 비편재화된 전자 구조를 특징으로 하며, 화학 적 표적 및 생물학적 표적에 대한 높은 반응 광 리포터(highly responsive optical reporter)로서 사용될 수 있다. 또한 공액 고분자 전해질은 광여기시, 엑시톤(exciton)이 형성되고 엑시톤은 개개의 고분자 쇄 또는 고상 고분자 내에서 중첩된 π-오비탈을 통하여 이동할 수 있으며, FRET을 유발하여 공액 고분자의 발광 스펙트럼이 발색단의 흡수 스펙트럼과 겹치게 되면 에너지 전이에 의하여 장파장의 형광이 증폭되어 발현된다. 또한, 효율적인 콘쥬게이트 길이는 폴리머 사슬보다 실질적으로 짧기 때문에, 골격은 다량의 콘쥬게이트 세그먼트를 포함한다. 그러므로 콘쥬게이트된 폴리머는 집광에 효율적이며, 포스터 에너지 전달을 통해 광 시그널을 증폭할 수 있다.

본 발명의 바람직한 실시예에서, 상기 양이온 공액 고분자는 수용성 양이온성 폴리플루오렌 코폴리머로, poly(9,9'-bis(6-N,N,N-trimethylammonium hexyl)fluorene-alt-1,4-(2,5-bis(6-N,N,N-trimethylammoniumhexyloxy))phenylene)에 반대이온으로써 브롬이온 또는 테트라페닐보레이트를 갖는 양전하 공액 고분자 FHQ-BR 또는 FHQ-PB, poly(9,9'-bis(6''-N,N,N-trimethylammonium hexyl)fluorene-alt-phenylene) 에 반대이온으로써 브롬이온 또는 테트라페닐보레이트를 갖는 FPQ-BR 또는 FPQ-PB를 사용하였다. 이러한 FHQ-BR 및 FHQ-PB는 동일한 π-공액구조를 가지며, 주된 구조적 차이는 알킬 체인 말단의 암모늄 그룹 (hexyltrimethylammonium)의 전하 균형을 위해 수반되는 반대이온이 다르다는 것이며 이는 FPQ-BR 및 FPQ-PB의 관계에서도 동일하다. 분자식 및 분자구조는 다음과 같다.

FHQ - BR: poly(9,9’-bis(6-N,N,N-trimethylammoniumhexyl)fluorene -alt-1,4-(2,5-bis(6-N,N,N-trimethylammoniumhexyloxy))phenylene) with bromide;

FHQ - PB: poly(9,9’-bis(6-N,N,N-trimethylammoniumhexyl)fluorene-alt-1,4-(2,5-bis(6-N,N,N-trimethylammoniumhexyloxy))phenylene) with tetraphenylborate;

FPQ - BR: poly(9,9'-bis(6''-N,N,N-trimethylammonium hexyl)fluorene-alt-phenylene) with bromide;

FPQ - PB: poly(9,9'-bis(6''-N,N,N-trimethylammonium hexyl)fluorene-alt-phenylene) with tetraphenylborate.

(단, CA는 counter anion을 나타낸다. n의 전형적인 값은 10 내지 50이다.)

<화학식 1>

본 발명의 수용성 공액 고분자 FRET 시스템에서 반대이온은 정전기적 착체, CCP/핵산-C*의 미세구조에 있어서, 에너지 전달 및 PCT에 실질적인 효과가 있는 분자간 D-A 거리를 변화시켜, FRET과 PCT quenching사이의 경쟁관계를 제어한다. 즉, FRET과 PCT 모두 D-A 거리가 증가할수록 감소하지만 PCT는 지수함수적으로 더 급격하게 감소하므로, 양이온 공액 고분자의 반대이온을 이온교환반응을 통하여 교환된 다른 크기의 반대이온에 의하여 최적의 D-A 거리를 갖게 함으로써 FRET에 의해 유도된 발색단의 신호를 증폭시킬 수 있다. 이에 따라, 본 발명에서 FRET 공여체인 수용성 양이온 고분자의 반대이온을 이온교환반응에 의하여 크기가 다른 반대이온으로 변경하여주면, 고분자/핵산-C* 정전기착체 형성시 D/A 분자간 거리를 조절하여 FRET과 PCT quenching사이의 경쟁관계를 제어함으로써 형광신호를 증폭시켜 FRET 시스템을 최적화하게 되는 것이다.

상기 이온교환반응을 위해 본 발명의 FRET시스템에 더 포함되도록 하는 반대이온은 상기 사용된 공액 고분자의 양이온과 전하 균형을 맞출 수 있는 음이온이면 충분하다. 바람직하게는 -1가의 음이온일 수 있다. 상기 -1가의 음이온으로는 카르복실레이트 (carboxylate), 아세테이트 (acetate), 시트레이트 (citrate), 카르보네이트 (carbonate), 락테이트 (lactate) 등을 포함하는 각종 산의 염형태;와, 보레이트 이온 (Borate ion), 포스페이트 이온 (Phosphate ion), 설포네이트 이온 (Sulfonate ion), 할로겐 음이온 (Halogen anion);과, BF₄-, BIm₄-, ClO₄-, BrO₄-, AsF₆-, PF₆-, SbF₆- 등의 라디칼이온; 및 상기 음이온들의 유도체를 들 수 있다. 예를 들자면, 할로겐 음이온으로는 플루오라이드 (fluoride), 클로라이드 (chloride), 아이오다이드 (iodide), 브로마이드 (bromide) 를 들 수 있고, 상기 보레이트 이온으로는 테트라플루오로보레이트 (tetrafluoroborate), 헥사플루오로 포스페이트 (hexafluorophosphate), 테트라키스(1-이미다졸릴)보레이트 (tetrakis (1-imidazolyl)borate), 테트라페닐보레이트 (tetraphenylborate), 테트라벤질보레이트(tetrabenzyl borate), 테트라아니실보레이트 (tetraanisyl borate), n-부틸트리페닐보레이트 (n-butyltriphenyl borate), n-부틸트리(4-테르트-부틸페닐)보레이트 (n-butyltri(4-tert-butylphenyl)borate), n-부틸트리(4-플루오로-2-메틸페닐)보레이트 (n-butyltri(4-fluoro-2-methylphenyl)borate) 등이 있으며, 상기 설포네이트 이온으로는 벤젠설포네이트 음이온 (benzenesulfonate anion), p-톨루엔설포네이트 음이온 (p-toluenesulfonate anion), 메탄설포네이트 음이온 (methanesulfonate anion), 1-나프탈렌설포네이트 음이온 (1-naphthalenesulfonate anion), 2-나프탄설포네이트 음이온 (2-naphthanesulfonate anion) 등을 들 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는, 반대이온으로서 브로마이드를 가지는 양이온 공액 고분자에 대하여 이온교환반응에 의하여 테트라페닐보레이트로 변경하였다.

또한 본 발명의 FRET 시스템에 사용되는 형광분자는 신호 발색군(signaling chromophore)으로서, 적당한 용액에서 양이온 공액 고분자로부터 에너지를 흡수할 수 있고, 광을 방출할 수 있는 물질을 포함한다. 전형적인 형광분자로는 형광 염료, 반도체 나노크리스탈, 란탄화물 킬레이트 및 녹색 형광 단백질을 포함한다.

형광 염료의 예로는 플루오레신, 6-FAM, 로다민, 텍사스 레드(Texas Red), 테트라메틸로다민, 카르복시로다민, 카르복시로타민 6G, 카르복시로돌, 카르복시로다민 110, 캐스케이드 블루(Cascade Blue), 캐스케이트 옐로우(Cascade Yellow), 코마린, Cy2(상표명), Cy3(상표명), Cy3.5(상표명), Cy5(상표명), Cy5.5(상표명), Cy-크롬, 피코에리트린, PerCP(페리디닌 클로로필-a 단백질), PerCP-Cy5.5, JOE(6- 카르복시-4',5'-디클로로-2',7'-디메톡시플루오레신), NED, ROX(5-(및-6)-카르복시-X-로다민), HEX, 루시퍼 옐로우(Lucifer Yellow), 마리나 블루(Marina Blue), 오레곤 그린(Oregon Green) 488, 오레곤 그린(Oregon Green) 500, 오레곤 그린(Oregon Green) 514, 알렉사 플로어(Alexa Fluor, 상표명) 350, 알렉사 플로어(상표명) 430, 알렉사 플로어(상표명) 488, 알렉사 플로어(상표명) 532, 알렉사 플로어(상표명) 546, 알렉사 플로어(상표명) 568, 알렉사 플로어(상표명) 594, 알렉사 플로어(상표명) 633, 알렉사 플로어(상표명) 647, 알렉사 플로어(상표명) 660, 알렉사 플로어(상표명) 680, 7-아미노-4-메틸코마린-3-아세트산, 보디피(BODIPY, 상표명) FL, 보디피(상표명) FL-Br 2 , 보디피(상표명) 530/550, 보디피(상표명) 558/568, 보디피(상표명) 564/570, 보디피(상표명) 576/589, 보디피(상표명) 581/591, 보디피(상표명) 630/650, 보디피(상표명) 650/665, 보디피(상표명) R6G, 보디피(상표명) TMR, 보디피(상표명) TR, 이의 콘쥬게이트화물, 이들의 배합물을 포함한다. 란탄화물 킬레이트의 예로는 유로피윰(europium) 킬레이트, 테르비윰(terbium) 킬레이트 및 사마리윰(samarium) 킬레이트를 포함한다.

또한 본 발명의 제 2견지에 의하면,

본 발명은 형광수용체로서 타겟 DNA에 상보적인 서열을 갖는 단일가닥 DNA 또는 단일가닥 PNA에 결합된 형광분자 (-C*) 및 형광공여체로서 양이온 공액 고분 자를 포함하고, 상기 양이온 공액 고분자의 반대이온과 크기가 다른 반대이온을 더 포함하여 구성되며,

상기 양이온 공액 고분자의 반대이온을 상기 크기가 다른 반대이온으로 이온교환반응시켜, 고분자/(DNA-C* 또는 PNA-C*) 정전기착체 형성시 상기 크기가 다른 반대이온에 의하여 상기 공여체와 수용체간의 거리를 조절함을 특징으로 하는, 타겟 DNA를 실시간으로 검출하는 수용성 공액 고분자 FRET 바이오센서에 관한 것이다. 또한 상기 본 발명의 바이오센서에 있어서, 더 포함되는 반대이온은 상기 양이온 공액고분자와 전하균형을 이룰 수 있는 음이온이면 충분하다. 바람직하게는 -1가의 음이온일 수 있다.

이러한 본 발명의 FRET 센서의 일 양태로서, 양이온 공액 고분자를 여기할 수 있고, 검출되는 방출 파장(들) 보다 짧은 파장을 제공하는 임의의 기구를 여기용으로 사용할 수 있다. 여기 공급원은 신호표시 형광분자를 직접적으로 크게 여기하지 않는 것이 바람직하다. 공급원은: 적당한 필터와 자외선(deuterium) 램프와 같은 광대역 UV 광원, 목적하는 파장을 추출 하는 모노크로마터를 통과시킨 후의 제논(xenon) 램프 또는 자외선 램프와 같은 백광원의 방출, 연속 파장(cw) 가스 레이저, 고형 상태 다이오드 레이저, 또는 임의의 펄스된 레이저일 수 있다. 신호표시 발색단에서 방출된 광은 임의의 적당한 장치 또는 기술(여러가지 적합한 접근법이 당업에 공지되어 있음)로 검출할 수 있다. 예를 들어, 형광측정기 또는 분광광도계를 고분자의 여기에 의해 신호표시 발색단의 파장 특성의 광을 시험 샘플이 방출하는 지의 여부를 검출하기 위해 사용할 수 있다.

상기한 바와 같이, 본 발명의 수용성 공액 고분자를 이용한FRET 시스템은 이온교환반응에 의하여 크기가 다른 반대이온으로 바꾸어 줌으로써 FRET 공여체와 수용체 사이의 거리를 분자수준에서 제어하여, PCT 는 최소화 시키고 FRET 시그날을 극대화시킬 수 있다. 또한 상기한 본 발명의 FRET시스템을 이용한 DNA센서는 복잡한 합성과정에 의해 분자구조를 변경시킬 필요없이 모든 구조의 양이온 고분자에 적용할 수 있어 간단하면서도 효과적이다.

이하, 본 발명을 실시예에 의하여 자세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명의 예시일 뿐 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 재료 및 방법

(1) 다른 언급이 없는 한 모든 화학물질은 Aldrich Chemical Co.에서 구입하여 사용하였다. HPLC-정제된 단일가닥 DNA는 20개의 염기서열 (5'-Fl-TTAA TCGA GTTA CCGC AATC)로 5'위치에 플루오레신 (fluorescein)으로 라벨된 HPLC-정제 단일가닥 DNA (ssDNA-Fl)는 Sigma-Genosys로부터 입수하였다. 양이온성 폴리풀루오렌 코폴리머는 이전 절차를 수정하여 합성하였다. 모든 고분자 구조는 ¹H-NMR, UV/vis- 및 PL 분광법으로 특징지워지고, ¹H-NMR 스펙트럼은 JEOL (JNM-AL300) FT NMR system으로 기록되었다. X-ray 광전자 산란 데이터는 부산대학교 기초과학센터에서 측정되었다. UV/vis 흡광 스펙트럼은 Jasco (V-630) 분광광도계로 측정되었다. 광 발광 (PL) 스펙트럼은 Xenon lamp 여기 원 (excitation source )으로 용액시료에 대한 90 도 각도 검출을 사용하여 Jasco (FP-6500) 분광광도계로 얻어졌으며, 모든 FRET PL 스펙트럼은 별도의 언급이 없는 한 20mM 포스페이트 완충용액에서 측정되었다. 형광 양자 수득량은 pH=11인 물에서 측정한 플루오레신의 형광과 비교하여 측정되었다.

(2) 형광공여체의 합성

도 1b에 나타낸 방법에 의하여 4종류의 폴리플루오렌 코폴리머, FHQ-BR 또는 FHQ-PB, 및 FPQ-BR 또는 FPQ-PB 를 합성하였다.

반응중간체 및 모노머는 보고된 방법((a) Heeger, P. S.; Heeger, A. J. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1999, 96, 12219. (b) Xu, Q.-H.; Gaylord, B. S.; Wang, S.; Bazan, G. C.; Moses, D.; Heeger, A. J. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2004, 101, 11634.)에 의하여 준비하였다. FHN은 toluene/H₂O (2:1)에서 Pd(PPh₃)₄ 를 사용하여, 9,9-bis(6’-bromohexyl)fluorene diboronic ester와 1,4-bis(6-bromohexyloxy)-2,5-dibromobenzene을 커플링하여 합성하였다. FPN은 2,7-dibromo-9,9-bis(6'-bromohexyl)fluorene 와 1,4-phenylenebisboronic ester의 반응에 의하 여 얻었다.

고분자의 분자량은 폴리스티렌을 기준으로 GPC (solvent: chloroform)를 사용하여 측정하였으며 각각 FHN 에 대해서는 M_n =15,300 (PDI =2.03), FPN에 대해서는 M_n = 16,700 (PDI = 2.32) 이었다. 수용성 고분자 FHQ-BR 및 FPQ-BR는 48시간 동안 THF/water의 혼합물에서 농축된 트리메틸아민과 FHN 및 FPN의 반응에 의해 얻어졌다. FHQ-PB 및 FPQ-PB 는 메탄올에서 과잉의 테트라페닐보레이트를 첨가하여 반대이온을 이온교환함으로써 얻어진다. 교환된 반대이온의 정도는 H¹-NMR 및 X-ray 광전자 분광법 (XPS, X-ray photoelectron spectroscopy)에 의하여 결정되었다. 브롬이온은 95% 이상 대부분 테트라페닐보레이트 음이온에 의하여 치환되었다.

실시예 2. UV / vis 및 PL 분광 데이터

수용액내에서 FHQ-BR, FHQ-PB, FPQ-BR 및 FPQ-PB 의 광학적 특성을 측정하였다. 소수성을 띄는 PB에 의해 수용액 에서 FHQ-PB의 용해도가 감소하여서 FHQ-BR의 흡수 및 형광 특성과 약간의 차이를 보였다 (표 1). 이것은 FPQ-BR, FPQ-PB 경우에서도 동일하였다. 그러나 4가지 고분자가 잘 용해되는 dimethylsulfoxide (DMSO) 내에서 측정하였을 때에는 반대이온의 변경에 관계없이 같은 주쇄를 가진 고분자의 흡수 및 형광 특성이 거의 일치함을 알 수 있었다. 이는 전하균형을 위해 수반되는 반대이온이 주쇄와 비공액화되어 있기 때문에 주쇄에서 기인하는 고분자의 HOMO-LUMO 전자 구조에 영향을 주지 않는다는 것을 의미한다.

solvent	properties	FPQ - BR	FPQ - PB	FHQ - BR	FHQ - PB
water	λ _abs [ nm ] ^a	380.5	374.4	365.0	364.8
	λ _PL [ nm ] ^b	422.5	423.7	419.6	425.7
	Φ _PL (%) ^c	65.2	54.4	64.5	52.9
DMSO	λ _abs [ nm ]	383.1		376.1
	λ _PL [ nm ]	418.5		421.8
	Φ _PL (%)	80.9	83.2	69.7	69.0

양전하 공액 고분자의 광학적 특성 (^a최대흡수파장, ^b최대형광파장, ^cPL 양자효율)

실시예 3. FRET -유도 플루오레신의 발색

ssDNA-Fl으로의 PL에너지 전달에 대한 반대이온의 효과를 알아보기 위하여 고분자/ssDNA-Fl 정전기착체에서 FRET에 의한 발색단 Fl 형광을 측정하였다.

포스페이트 완충 용액 (20 mM, pH=8)에서 ssDNA-Fl의 농도는 2.5×10^-8 M이고 FHQ-BR, FHQ-PB는 0 M에서 5.9×10^-7 M까지, FPQ-BR, FPQ-PB는 0 M에서 1.2×10^-6 M까지 단계적으로 추가하였다. 최종적으로 ssDNA-Fl와 고분자의 전하 비율은 1 : 4.8 (고분자→(+), ssDNA-Fl→(-))로 동일하므로 이들간 복합체 형성의 정전기적 원동력은 같다고 할 수 있다.

이와 같이 형성된 정전기착체를 380nm에서 여기시켜 형광에너지 전달에 의한 Fl 형광을 측정하였다 (도 7). FHQ-BR의 경우, 고분자가 첨가되어도 FRET에 의해 유도된 Fl 형광은 증가하지 않았다 (도 7a). 그러나 BR이 부피가 큰 PB로 대체되면 FRET에 의해 유도된 Fl 형광이 최종적으로 8.6배 더 향상되는 것을 알 수 있었다 (도 7b). FPQ-BR, FPQ-PB에서도 반대이온이 큰 경우에 Fl 형광의 세기가 2배 정도 높은 것으로 측정되었다 (도 7c, d).

이 같은 차이를 유발하는 요인 중 하나는 고분자의 전자가 HOMO에서 LUMO로 여기된 후 인접한 Fl의 LUMO로 PCT 되어 Fl 형광이 발현되지 않는 것이다. PCT는 관련 개체간의 거리가 짧을수록 증가하므로 PB를 가지는 고분자보다 BR을 가지는 고분자에 의해서 FRET에 의한 Fl 형광이 상대적으로 약하게 발현되었고, 이는 PCT가 보다 우세하게 일어났다고 해석할 수 있다. 이는 FRET의 경우 r^-6에 비례하고 PCT의 경우 지수함수적(e^-r)으로 거리가 증가할수록 감소하는 특성이 있기 때문이다. 따라서 이온교환을 통하여 반대이온의 크기를 변경하면 고분자/ssDNA-Fl 정전기 착체에서 D-A 거리를 분자수준에서 미세 조절하는 것이 가능하고, PCT와 FRET의 경쟁을 제어하여, PCT quenching을 더 효과적으로 억제하고 FRET에 의한 형광시그날을 극대화할 수 있다.

실시예 4. FRET 비율 측정

CCP/ssDNA-Fl 복합체에서 FRET 비율 (FRET ratio)을 측정함으로써 FRET 효율을 평가하였다. I_Fl/I_CCP FRET 비율 (charge ratio [+]:[-] = 0.5 : 1)은 FPQ-BR/ssDNA-Fl 에 대해서는 18.6, FPQ-PB/ssDNA-Fl 에 대해서는 5.0이었다. 복합체에서 D-A 분자간 거리가 증가됨에 따라 부피가 더 큰 PB반대이온의 경우 FRET 비율이 감소될 수 있다.

즉, FRET 효율은 부피가 큰 반대이온을 사용하면 고분자/ssDNA-Fl 정전기 착체에서 D-A 거리가 증가하여 감소하지만 PCT 효율이 더 급격하게 감소하기 때문에 결국 FRET에 의해 유도된 Fl 형광은 증대되어 신호증폭 (signal amplification)현상을 보이는 것으로 해석된다.

실시예 5. 플루오레신의 직접적 여기 ( Direct excitation of Fl )

직접적으로 정전기착체 내의 Fl를 여기시킴으로서 고분자의 반대이온이 PCT 에 의한 형광약화 (PCT quenching)에 어떠한 영향을 끼치는지 확인하였다. ssDNA-Fl이 단독으로 존재할 때 보다 고분자와의 정전기착체가 형성되었을 때, Fl의 형광이 현저하게 감소하였다 (도 8). 이것은 Fl HOMO의 전자가 LUMO로 여기된 후, 고분자의 전자가 비어있는 Fl의 HOMO로 PCT되어 Fl 형광이 억제되기 때문인데, 고분자와 ssDNA-Fl 간의 거리가 짧을수록 PCT가 증가하여 Fl 형광이 더욱 감소한다.

도 8을 참고하면, FHQ-BR의 경우에서 PCT quenching에 의해 Fl 형광 대부분이 억제되어 형광을 볼 수 없었으나 FHQ-PB에서는 PCT quenching이 상당히 감소되어 뚜렷한 Fl 형광을 볼 수 있었고, FPQ-BR, FPQ-PB에서도 유사한 현상을 나타내었다. 이는 고분자/ssDNA-Fl 정전기 착체에서 BR을 반대이온으로 가지는 고분자와 ssDNA-Fl 간 거리가 상대적으로 짧음을 의미한다.

실시예 6. FRET -유도 플루오레신 발색 양자효율 측정

더 농축적인 조건 ([ssDNA-Fl] = 8ⅹ10^-7 M, [FHQ-BR] or [FHQ-PB] = 2ⅹ10^-6 M, [FPQ-BR] or [FPQ-PB] = 4ⅹ10^-6 M, 전하비율 [+] : [-] = 0.5 : 1 )에서 FRET에 의해 유도된 Fl 발색의 PL 양자수득량 (Φ_FRET _- _PL)을 측정하였다. 측정은 고분자가 완전히 복합체를 이루도록 하기 위하여 과잉ssDNA-Fl이 존재할 때 수행되었고, 앞의 FRET 형광 데이터와 유사한 경향의 FRET 데이터를 얻을 수 있었다.

측정된 Φ_FRET _- _PL은 FPQ-BR/ssDNA-Fl에 대해서는 8.7, FPQ-PB/ssDNA-Fl에 대해서는 16.5로 각각 나타났다. FHQ-BR/ssDNA-Fl의 경우, 형광 세기가 노이즈 범위 정도로 아주 미약하여 이것의 Φ_FRET _- _PL은 무시할 수 있으며, FHQ-PB는 더 향상된 Φ_FRET _-PL인 10.9를 나타내었다 (도 9).

상기의 실시예를 통하여 CCP/ssDNA-Fl에서 FHQ-BR 및 FPQ-BR 에 대하여 PB로 반대이온의 교환 후에 FRET 비율 (I_Fl/I_CCP)을 측정함으로써 FRET 효율이 감소됨을 확인하였다. FHQ-PB (또는 FPQ-PB)/ssDNA-Fl 에서 증대된 Fl 발광은 부피가 큰 PB에 의해 증가된 D-A 분자간 거리로 인하여 PCT가 실질적으로 더 감소하는 것과 상관관계가 있다.

상기한 바와 같이, 본 발명에서는 FRET 공여체로서FHQ-BR 또는 FHQ-PB (반대이온으로써 브로마이드 또는 테트라페닐보레이트를 갖는 폴리(9,9'-비스(6-N,N,N-트리메틸암모늄헥실)플루오렌-알트-1,4-(2,5-비스(6-N,N,N-트리메틸암모늄 헥실옥시))페닐렌)) 및 FPQ-BR 또는 FPQ-PB (반대이온으로써 브로마이드 또는 테트라페닐보레이트를 갖는 폴리(9,9'-비스(6''-N,N,N-트리메틸암모늄헥실)플루오렌 -알트-페닐렌))를 이용하여 플루오레신(Fl)이 레이블된 단일가닥 DNA (ssDNA-Fl)으로의 FRET을 광 발광 분광광도계로 측정한 결과, 부피가 큰 PB를 반대이온으로 갖는 고분자에 의해 FRET에 의한 Fl 형광이 향상되는 것을 확인하였다. 이는 직접적으로 고분자/ssDNA-Fl 정전기착체 내의 Fl를 여기시켜 측정한 형광 스펙트럼으로부터 부피가 큰 PB에 의해서 PCT가 감소하여 Fl 형광 약화가 줄어드는 데에서 비롯됨을 확인하였다.

즉, 상기 실시예에서 두 가지 다른 반대이온 (bromide, tetraphenylborate)을 갖는 두 가지 공액 고분자 전해질 (FHQ, FPQ)은 올리고뉴클레오타이드 표지된 플루오레신 (ssDNA-Fl)에 대한 FRET 공여체로서 사용하였고, 상기 다른 반대이온을 갖는 고분자는 동일한 π-공액구조를 가지며, 수반된 반대이온은 정전기적 복합체에서 ssDNA-Fl과 고분자간의 거리에 영향을 준다. (D-A 분자간 거리를 증가시키고 PCT quenching을 감소시키는 반대이온으로서 브로마이드를 테트라페닐보레이트로 변경한 결과 FRET Fl 신호를 2~8.6배 향상시킬 수 있음을 확인하였다. (도 7참고))

따라서, 상기 실시예를 통하여 비록 CCP/DNA복합체의 정확한 구조는 밝혀지지 않았으나, 상기 결과는 정전기적 복합체의 미세한 구조, 예를 들면 D-A 분자간 거리를 단지 양이온 고분자의 반대이온 교환에 의하여 분자수준 (subnanometer)에서 성공적으로 제어할 수 있음을 보여준다. 즉, 반대이온에 의하여 정전기착체 형성시D-A 분자간 거리가 달라지게 되어, D-A거리에 비례하여 감소하는FRET 과 PCT 모두에 영향을 줄 뿐만 아니라 둘 사이의 경쟁에 영향을 주므로, 간단한 이온교환반응을 통해 반대이온을 변경하면 FRET 공여체와 수용체간의 거리를 분자 수준에서 미세하게 조절하여 형광 공명 에너지 전달을 제어할 수 있다.

본 발명은 바람직한 실시형태를 참고하여 보다 자세하게 설명되었지만, 당업에 통상의 지식을 가진 자에게 본 명세서의 기술의 도움으로 본 발명의 범주나 정신에서 벗어나지 않는 범위내에서의 어떤 변화 및 변형이 가능할 수 있음은 명백할 것이다. 따라서 본 발명은 청구범위에 의해서만 제한된다.

도1a는 동일한 고분자 주쇄에 반대이온의 이온교환에 의한 양이온 공액 고분자 구조의 예이다.

도 1b는 고분자의 합성방법을 나타낸 것으로, 반응조건은 다음과 같다.

i) Pd(PPh₃)₄, 2 M Na₂CO₃, 80 ^oC in toluene, 38 시간;

ii) 트리메틸아민 (trimethylamine), 실온, 48 시간 in THF/MeOH;

iii) 암모늄 테트라페닐보레이트 (ammonium tetraphenylborate), 48 시간 in MeOH

도2는 도1a의 서로 다른 반대이온을 갖는 양전하 폴리플루오렌 공중합체를 사용하여 FRET에 의해 유도된 플루오레신 발광을 측정한 것이다.

(단, FPQ-BR (black), FPQ-BF₄ (pink), FPQ-PF₆ (green), FPQ-BIm₄ (blue), FPQ-PB (red), [ssDNA-Fl] = 2×10^-8 M, [FPQ-BR] = [FPQ-BF₄] = [FPQ-PF₆] = [FPQ-BIm₄] = [FPQ-PB] = 6.0×10^-7 M)

도3은 FHQ-BR, FHQ-PB의, 도 4는FPQ-BR, FPQ-PB 의 정상화된 UV-vis 및 PL 스펙트럼을 나타낸 것이다 (DMSO에서 측정).

도5는 FHQ-BR, FHQ-PB의, 도 6은 FPQ-BR, FPQ-PB의 정상화된 UV-vis 및 PL 스펙트럼을 나타낸 것이다 (수용액에서 측정).

도 7는 380nm 에서 CCP여기에 따른FRET PL 스펙트럼을 나타낸 것(20mM 포스 페이트 완충액에서 측정)으로, (a)는 FHQ-BR/ssDNA-Fl, (b)는 FHQ-PB/ssDNA-Fl, (c)는 FPQ-BR/ssDNA-Fl 및 (d)는 FPQ-PB/ssDNA-Fl의 FRET PL 스펙트럼이다. (단, [ssDNA-Fl] = 2.5ⅹ10^-8 M, [FHQ-BR] 또는 [FHQ-PB] = 0 ~ 5.9ⅹ10^-7 M, [FPQ-BR] 또는 [FPQ-PB] = 0 ~ 1.2ⅹ10^-6 M)

도 8 은 490nm 에서 플루오레신 여기에 따른 CCP/ssNDA-Fl 의 PL 스펙트럼을 나타낸 것으로, (a)는 FHQ-BR/ssDNA-Fl 및 FHQ-PB/ssDNA-Fl, (b)는 FPQ-BR/ssDNA-Fl 및 FPQ-PB/ssDNA-Fl 의 PL 스펙트럼이다. (단, [ssDNA-Fl] = 2.5ⅹ10^-8 M, [FHQ-BR] 또는 [FHQ-PB] = 5.9ⅹ10^-7 M, [FPQ-BR] 또는 [FPQ-PB] = 1.2ⅹ10^-6 M)

도 9 완충용액 내에서 FPQ-BR/ssDNA-Fl 및 FPQ-PB/ssDNA-Fl 의 FRET-유도 PL 스펙트럼을 나타낸다. 스펙트럼 아래의 면적은 PL 양자효율에 비례한다. (단, [ssDNA-Fl] = 8 ⅹ10^-7M, [FPQ-BR] 또는 [FPQ-PB] = 4.0ⅹ10^-6 M).

Claims

형광 수용체로서 핵산에 결합된 형광분자 (-C*) 및 형광 공여체로서 양이온 공액 고분자를 포함하고,

상기 양이온 공액 고분자의 반대이온과 크기가 다른 반대이온;을 더 포함하여 구성되며,

상기 양이온 공액 고분자의 반대이온을 상기 크기가 다른 반대이온으로 이온교환반응시켜, 고분자/핵산-C* 정전기착체 형성시 상기 크기가 다른 반대이온에 의하여 상기 공여체와 수용체간의 거리를 조절함을 특징으로 하는 FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) 시스템.
제 1 항에 있어서, 상기 핵산은 단일가닥 DNA (ssDNA)인 것을 특징으로 하는 FRET 시스템.
제 1 항에 있어서, 상기 형광분자는 형광 염료, 반도체 나노크리스탈, 란탄화물 킬레이트 및 녹색 형광 단백질인 것을 특징으로 하는 FRET 시스템.
제 1 항에 있어서, 상기 더 포함되는 반대이온은 -1가의 음이온인 것을 특징으로 하는 FRET 시스템.
제 4 항에 있어서, 상기 음이온은 카르복실레이트 (carboxylate), 아세테이트 (acetate), 시트레이트 (citrate), 카르보네이트 (carbonate), 락테이트 (lactate)를 포함하는 산의 염(salt)형태;와, 보레이트 이온 (Borate ion); 포스페이트 이온 (Phosphate ion); 설포네이트 이온 (Sulfonate ion); 할로겐 음이온 (Halogen anion); BF₄-, BIm₄-, ClO₄-, BrO₄-, AsF₆-, PF₆-, SbF₆- 등의 라디칼이온; 및 상기 음이온의 유도체에서 선택되는 것을 특징으로 하는 FRET 시스템.
형광수용체로서 타겟 DNA에 상보적인 서열을 갖는 단일가닥 DNA 또는 단일가닥 PNA에 결합된 형광분자 (-C*) 및 형광공여체로서 양이온 공액 고분자를 포함하고,

상기 양이온 공액 고분자의 반대이온과 크기가 다른 반대이온을 더 포함하여 구성되며,

상기 양이온 공액 고분자의 반대이온을 상기 크기가 다른 반대이온으로 이온교환반응시켜, 고분자/(DNA-C* 또는 PNA-C*) 정전기착체 형성시 상기 크기가 다른 반대이온에 의하여 상기 공여체와 수용체간의 거리를 조절함을 특징으로 하는, 타겟 DNA를 실시간으로 검출하는 수용성 공액 고분자 FRET 바이오센서.