KR100984735B1

KR100984735B1 - 신개념 신약개발을 위한 타겟 단백질단백질 상호작용을 저해하는 신약후보물질의 스크리닝 방법

Info

Publication number: KR100984735B1
Application number: KR1020090047136A
Authority: KR
Inventors: 김소연
Original assignee: 동국대학교 산학협력단
Priority date: 2009-05-28
Filing date: 2009-05-28
Publication date: 2010-10-01
Also published as: US10132801B2; JP5936721B2; CN102449476A; JP2015092183A; EP2437055A4; WO2010137903A2; WO2010137903A3; EP2437055B1; EP2437055A2; US20120129722A1; CN102449476B; JP2012528323A

Abstract

본 발명은 단백질-단백질 상호작용 저해 물질의 스크리닝 방법에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 졸-겔 물질과 단백질이 혼합된 스폿이 고정화되어 있는 단백질 칩을 이용하여 단백질-단백질 상호작용 저해 물질을 스크리닝하는 방법에 관한 것이다.

본 발명에 따르면, 졸-겔 물질을 사용하여 96웰 플레이트에서 손쉽게 단백질칩을 제작할 수 있어, 천연물질 라이브러리로부터 간편하게 단백질-단백질 상호작용 저해 물질을 스크리닝할 수 있다.

단백질칩, 졸-겔, 단백질 상호작용 저해제, 저해물질 스크리닝

Description

신개념 신약개발을 위한 타겟 단백질단백질 상호작용을 저해하는 신약후보물질의 스크리닝 방법{New Concept Drug Developement for Screening Drug Candidate Inhibitor of Target Protein-Protein Interaction}

본 발명은 단백질-단백질 상호작용 저해 물질의 스크리닝 방법에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 졸-겔 물질과 단백질이 혼합된 스폿이 고정화되어 있는 단백질 칩을 이용하여 단백질-단백질 상호작용을 저해하는 물질을 스크리닝하는 방법에 관한 것이다.

단백질-단백질 상호작용을 저해하는 저분자 저해제의 개발에는 많은 문제점이 있는 것으로 알려져 있으나, 그 중요성 때문에 단백질-단백질 상호작용을 저해할 수 있는 저분자 물질을 개발하려는 시도가 계속적으로 진행되어 왔으며 몇몇 성공적인 일례가 존재한다(Nature Reviews Drug Discovery, 3:853, 2004)

신약 개발의 방법은 주로 특정 분석시스템을 구축하고 이에 대해 보유하고 있는 수십-수백만 종의 화합물 라이브러리를 고속으로 스크린 하는 방법을 사용하 고 있으며, 이러한 방법은 화합물의 보유량이나 고속 스크린 시스템의 구축 등 여러 가지 제약 때문에 주로 다국적 제약 회사 등에서 적용하고 있으며 소규모의 실험실에서는 적용하기에는 어려움이 있었다. 더욱이 기존에 구축되어 있지 않았던 천연물 라이브러리와 같은 수만 개 정도의 비교적 작은 크기의 라이브러리를 이용한 신규 고속 스크린 시스템을 구축하기 위해서는 적은 비용으로 빠른 시간에 개념을 입증하고 또한 학교 및 연구소와 같은 중, 소규모의 실험실에서는 새로운 개념의 분석 시스템 및 스크리닝 시스템의 구축을 통하여 리드 화합물을 확보하는 전략이 필요하다.

이를 위해서는 적은 샘플에 적용할 수 있는 칩 기반 스크리닝 적당할 뿐 아니라, 기존에 구축된 저렴한 고분자를 이용한 칩 시스템을 이용하여 새로운 신약탐색 방법을 확립해 원천 기술을 확보하는 것이 신약 개발 산업의 인프라를 향상시키는데 기여할 것으로 예상된다.

이에, 본 발명자들은 실험실기반의 소규모 실험에서도 유용하게 사용할 수 있는 칩 기반 단백질-단백질 상호작용의 저해제를 스크리닝하는 방법을 개발하고자 예의 노력한 결과, 졸-겔 물질과 단백질을 혼합하여 스폿팅한 단백질칩을 이용하는 경우, 기존의 항체분석 방법을 이용하여, 손쉽게 저해제를 스크리닝할 수 있다는 것을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 목적은 단백질-단백질 상호작용을 간편하게 분석할 수 있는 칩기반 단백질-단백질 상호작용을 저해하는 물질을 스크리닝하는 방법을 제공하는데 있다.

본 발명은 (a) 졸-겔 물질과 단백질이 혼합된 스폿이 고정화되어 있는 단백질 칩을 제작하는 단계; (b) 상기 단백질 칩과 상기 칩에 고정화된 단백질에 결합능을 가지는 단백질 을 상기 결합을 저해하는 물질후보의 존재 하에 반응시키는 단계; 및 (c) 상기 칩에 고정화된 단백질과 상기 고정화된 단백질에 결합능을 가지는 단백질의 결합여부를 확인하여, 상기 후보물질이 없는 경우의 단백질-단백질 상호작용에 비해, 단백질-단백질 상호작용이 저해되는 경우의 후보물질을 단백질 단백질 상호작용을 저해하는 물질로 선정하는 단계를 포함하는 단백질-단백질 상호작용을 저해하는 물질의 스크리닝 방법을 제공한다.

일 관점에서, 본 발명은 ((a) 졸-겔 물질과 단백질이 혼합된 스폿이 고정화되어 있는 단백질 칩을 제작하는 단계; (b) 상기 단백질 칩과 상기 칩에 고정화된 단백질에 결합능을 가지는 단백질 을 상기 결합을 저해하는 물질후보의 존재 하에 반응시키는 단계; 및 (c) 상기 칩에 고정화된 단백질과 상기 고정화된 단백질에 결합능을 가지는 단백질의 결합여부를 확인하여, 상기 후보물질이 없는 경우의 단백질-단백질 상호작용에 비해, 단백질-단백질 상호작용이 저해되는 경우의 후보물질을 단백질 단백질 상호작용을 저해하는 물질로 선정하는 단계를 포함하는 단백질-단백질 상호작용을 저해하는 물질의 스크리닝 방법에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 물질후보는 천연물, 화합물 및 압타머로 구성되는 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있으며, 상기 (c)단계의 결합여부는 단백질칩에 고정화된 단백질에 결합능을 가지는 단백질에 대한 항체를 이용하여 확인하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 스폿은 96웰 플레이트에 고정되어 있는 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 단백질칩에 고정화된 단백질은 CyclinT1이고, 단백질칩에 고정화된 단백질에 결합능을 가지는 단백질은 CDK9인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 (c) 단계에서 후보물질을 단백질-단백질 상호작요을 저해하는 물질로 선정하는 것은 후보물질이 칩에 고정화된 단백질과 결합하여, 단 백질칩에 고정화된 단백질에 결합능을 가지는 단백질이 단백질 칩에 고정화된 단백질과 결합하지 못하게 하는 경우, 상기 후보물질을 저해물질로 선정하는 것이다.

예를 들면, CyclinT1은 CDK9과 상호작용하는 단백질이며, Cyclin T1이 고정된 단백질 칩에 후보물질과 CDK9을 반응시켰을 때, 후보물질이 Cyclin T1과 결합하여, CDK9이 CyclinT1에 결합하는 것을 억제하는 경우, 후보물질을 Cyclin T1과 CDK9의 상호작용을 저해하는 물질로 선정할 수 있으며, 상기 저해는 CDK9에 대한 항체를 단백질 칩에 처리하고, Cy3등의 형광물질로 표지된 CDK9 항체에 대한 2차항체를 처리하여 확인할 수 있다. 즉, 상기 후보물질이 없는 경우의 CDK9 항체 시그널에 비하여, 후보물질을 처리하였을 때의 CDK9 항체 시그널이 감소하는 경우, 상기 후보물질을 CyclinT1-CDK9 상호작용에 대한 저해물질로 선정할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 졸-겔 물질은 상기 졸-겔 물질은 TMOS 17.5 중량부, MTMS 5~15 중량부 및 GPTMOS 0~15 중량부로 구성되는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에서는 새로운 의약 탐색 기술을 확립하고 이로부터 나온 후보군을 검증하여 새로운 단백질-단백질 상호작용 저해 천연물질을 발굴하기 위하여, 단백질-단백질 상호작용에 대한 칩 기반 천연물 스크리닝 시스템을 구축하였다.

본 발명은 일실시예에서는 CyclinT/Cdk9의 상호작용을 분석할 수 있는 칩 기반 시스템을 확립하여 CyclinT/Cdk9 저해제 후보 스크리닝 하였다. 즉, 도 5에 나타난 바와 같이, sol-gel 물질과 혼합된 CyclinT 단백질을 기판위에 스폿팅하여 단백질 칩을 제작하고, 상기 단백질 칩을 방선균 배양추출액, 곰팡이 배양추출액, 식물추출액 및 압타머 등의 CyclinT/Cdk9의 상호작용 저해물질 후보 및 Cdk9와 반 응시킨 다음, Cdk9 항체 및 Cy3로 표지된 2차항체를 차례로 반응시킨 후, 스캐닝하여, 시그널여부를 확인하여, 시그널이 확인되지 않은 스폿에 반응시킨 물질을, 저해물질로 확인하였다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: Cyclin T 유전자 및 CDK9 유전자의 클로닝 및 Cyclin T 및 CDK9의 정제

Cyclin T는 상동성이 큰 단백질로 특히, cyclin 박스라고 하는 공통적인 부분이 존재하고, 이 부분이 CDK9과의 결합을 좌우한다고 열려져 있으며, Human cyclin T(GenBank #NM_001240)의 cyclin 박스는 266개의 아미노산으로 이루어져 있으며, 서열번호 1의 염기서열로 표시하였다 (도 1).

human CDK9(GenBank#BC001968)는 서열번호 2로 나타내었다.

CDK9을 증폭하기 위한 주형으로 Human cDNA mixture를 사용하였고, Human Cyclin T1을 증폭하기 위한 주형으로는 HEK293 세포와 HeLa 세포의 1:1 혼합물을 사용하였다.

PCR에 사용된 프라이머는 하기에 나타내었다.

서열번호 3: GAATTCATGGCGAAGCAGTACGACTC (Human CDK9 forward primer, EcoRI site 포함)

서열번호 4: CTCGAGGAAGACGCGCTCAAACTCC (Human CDK9 reverse primer, XhoI site 포함)

서열번호 5: GAATTCATGGAGGGAGAGAGGAAGAACA (Human Cyclin T1 forward primer, EcoRI site 포함)

서열번호 6: GTCGACAGCCTCGCATGCCCTCCAA (Human Cyclin T1 reverse primer, SalI site 포함)

Human CDK9과 Human Cyclin T1의 유전자를 중폭한 후 T 벡터(Promega, USA) 에 ligation하여 TA 클로닝하고 대장균 DH5α에 형질전환시켰다. 형질전환된 콜로니에서 플라스미드를 정제하고, 전기영동으로 클로닝된 유전자를 확인하였으며, Sequencing을 통하여 염기서열을 확인하고, 클로닝된 유전자를 pET28a 벡터 (Novagen, USA)로 클로닝하고, E.coli BL21 cell에 형질전환시켰다.

상기 제조된 Human CDK9 유전자와 Human Cyclin T1 유전자로 형질전환된 E.coli BL21을 각각 배양하고, IPTG로 각 유전자의 발현을 유도한 후, 추가 배양한 다음, 균체를 회수하고, 단백질 발현정도를 SDS-PAGE로 확인하였다 (도 2).

회수된 각각의 균체에 PMSF가 포함되어 있는 His-Tag Binding Buffer 10mL을 첨가하여 현탁시키고, 소니케이션하여, 균체를 깨뜨린 용액을 His tag resin에 적용시켜, Human CDK9 유전자 및 Human Cyclin T1를 각각 정제하고, SDS-PAGE로 Human CDK9 단백질 및 Human Cyclin T1 단백질이 충분히 발현되었는지 확인하였다 (도 3 및 도 4).

실시예 2: 칩 상에서의 단백질과 저해제의 상호작용 확인

sol-gel chip에서 CDK9과 Human Cyclin T1의 상호작용을 확인하기 위하여, 도 5에 나타낸 방법으로 단백질간의 결합을 칩 상에서 확인하였다.

Human Cyclin T1 및 CDK9를 각각 50ng 씩 sol-gel 물질 조성 1(25.0% TMOS, 7.5% MTMS, 5% GPTMOS)에 섞어 Arrayer로 96-웰 플레이트에 스폿팅하여 고정화하였다. Affinity가 없는 물질이 칩에 붙는 것을 방지하기 위해 skim milk가 들어 있는 binidng buffer로 blocking한 후, CDK9에 결합하는 항체인 Anti-CDK9을 1/500 농도로 상온에서 1시간 반응시켰다. 스캐너에서 시그널을 확인하기 위해 cy3로 표지된 2차 항체를 1/1000 농도로 상온에서 1시간 반응시킨 후 스캔하여 시그널을 확인하였다(도 6).

그 결과, 도 6에 나타난 바와 같이, 약하긴 하나 CDK9에 Anti-CDK9이 결합하여 시그널이 보이는 것을 알 수 있었다.

천연물 라이브러리를 본격적으로 스크리닝 하기 전에 4가지의 천연물을 선정해서 Chip-based 어세이 시스템의 조건을 잡아보았다. 상기 결과에서 CDK9의 시그널이 약했기 때문에 칩에 고정화시키는 Human Cyclin T1과 CDK9의 양을 50ng의 3배인 150ng으로 늘려서 sol-gel 물질 조성 2(25.0% TMOS, 7.5% MTMS, 15% GPTMOS)에 섞어 96-웰 플레이트e에 고정화하였다.

Skim milk가 들어 있는 binding buffer로 blocking한 후 CDK9 (50ng/rxn Vol. 50μl) 을 반응시키고, 세척한 후 Anti-CDK9을 1/500 농도로 상온에서 1시간 동안 반응시킨 다음, 세척하고 cy3로 표지된 2차 항체를 1/1000 농도로 상온에서 1시간 반응시키고, 세척한 후 스캐닝 하여 시그널을 확인하였다.

그 결과, 도 7에 나타난 바와 같이, Anti-CDK9 만 반응시킨 웰에서는 CDK9 스폿의 시그널이 확인되는데 반해, CDK9과 Anti-CDK9을 반응시킨 웰에서는 시그널이 나타나지 않았다. 따라서, 천연물 라이브러리 스크리닝에 앞서 CDK9과 Human Cyclin T1의 결합을 칩 상에서 확인하는 실험을 우선적으로 실시하기로 하였다.

Human Cyclin T1 180ng과 CDK9 150ng을 각각 sol-gel 물질 조성 1(25.0% TMOS, 7.5% MTMS, 5% GPTMOS)에 섞어 96-웰 plate에 spotting 하였다. Skim milk가 들어 있는 binding buffer로 blocking 한 뒤, CDK9 (50ng/rxn vol. 50μl) 를 반응시키고, 세척한 후 Anti-CDK9을 1/500 농도로 상온에서 1시간 반응시킨 다음, 세척하고 cy3로 표지된 2차 항체를 1/1000 농도로 상온에서 1시간 반응한 후 세척하고 스캐닝으로 시그널을 확인하였다.

그 결과, 도 8에 나타난 바와 같이, CDK9과 Anti-CDK9, 2차항체를 모두 반응시킨 2번 웰에서는 아무것도 고정화하지 않은 negative 스폿에서도 시그널이 보이는데 반해, Anti-CDK9, 2차항체를 반응시킨 1번, 4번 웰에서는 시그널이 거의 보이지 않았으며, 같은 실험을 반복하였을 때에는 positive 스폿을 제외한 모든 스폿에서 시그널이 보이지 않았다.

상기 두 실험과 앞의 도 4의 결과로 보아 sol-gel 물질의 조성이 단백질에 맞지 않아서 실험 결과가 일정하게 나오지 않는 것으로 판단하고, 적절한 sol-gel 물질 조성을 먼저 선정하기로 하였다. 그리고 negative spot에서 시그널이 나오는 것으로 보아 blocking이 제대로 되지 않는다고 생각되어 이후의 실험부터 blocking 하는 시간을 1시간에서 2시간으로 늘렸다.

실시예 3: sol-gel 물질 선정

단백질을 고정화 하여 assay 하는데 적절한 sol-gel 물질을 선정하기 위하여, 실시예 2에서 사용한 조성 1(25.0% TMOS, 7.5% MTMS, 5% GPTMOS)과 pore size가 조성 2-9 보다 커서 큰 단백질 분자를 assay 하는데 좋은 조성인 조성 2(25.0% TMOS, 7.5% MTMS, 15% GPTMOS)의 두 가지 sol material에 도 9와 가팅, CDK9 (150ng/sol-gel 물질 11μl)과 Human Cyclin T1 (180ng/sol-gel 물질 11μl), 양성대조군 및 음성대조군을 각각 고정화 한 뒤, 실시예 2와 동일한 방법으로, 항체를 처리한 후, 스캐닝 하였다.

그 결과, 도 9에 나타난 바와 같이, 조성 2에서 CDK9과 Anti-CDK9이 잘 결합하여 시그널이 보이며 Anti-CDK9은 Human Cyclin T1에는 결합하지 않는다는 것을 확인하였다. 따라서 이후의 실시예에서는 sol-gel 물질 조성 2를 이용하였다.

또한, sol-gel chip에 CDK9을 반응시켜 chip 상에서 Human Cyclin T1과 결합할 수 있는지를 확인하였다. 도 9와 같은 sol-gel Chip을 skim milk buffer로 blocking한 뒤 CDK9 (60ng/rxn vol. 60μl)을 반응시키고, 세척한 후, CDK9에 결합하는 항체인 Anti-CDK9을 1/500 농도로 상온에서 1시간 반응시키고, 세척한 다음, Cy3로 표지된 2차 항체를 1/1000 농도로 상온에서 1시간 반응시키고, 스캐닝하 였다.

그 결과, 도 10에 나타난 바와 같이, 조성 1에서는 음성 스폿에서도 시그널이 보이는 것에 반해, 조성 2에서는 Human Cyclin T1과 CDK9이 결합한 스폿에서 시그널을 볼 수 있었고, 또한 CDK9을 반응시키지 않은 웰에서 Human Cyclin T1에 Anti-CDK9이 결합하지 않는다는 것도 확인하였다.

상기 결과를 통해 단백질의 상호결합을 분석하는 데에 조성 1아 적합하다는 것을 확인하였으며, Chip-based 분석시스템을 통해 칩 상에서 CDK9과 Human Cyclin T1의 결합을 확인하였다.

실시예 4: 칩 기반 분석시스템을 이용한 천연물 라이브러리 스크리닝

실시예 2 및 3에서 확립된 단백질 상호작용에 대한 칩기반 에세이 시스템을 이용하여, 천연물 라이브러리를 스크리닝하였다. 천연물 라이브러리는 한구생명공학연구원으로부터 방선균 배양추출액 21종, 곰팡이 배양추출액 40종 및 식물추출액 19종을 분양받아 사용하였으며, 방선균 배양추출액은 아세톤:물=1:1용매에 용해시켰으며, 식물추출액은 5mg/mL 농도로 물에 용해시켰다.

일차적으로 방선균 배양추출액 #15, 곰팡이 배양추출액 (배지 A) #25, 곰팡이 배양추출액 (배지 B) 중 #55, 식물 추출액 #411을 선정하여 칩기반 어세이에 적용하였다. 상기 천연물추출액은 1/100의 농도로 1μl 씩, Human Cyclin T1과 CDK9 (control)은 150ng 씩 sol-gel 물질 조성 2와 섞어 11μl로 준비한 후 96-웰 플레이트에 고정화하였다.

Skim milk buffer로 blocking한 뒤 CDK9 (60ng/rxn vol. 60μl)을 반응시키고, 세척한 후 CDK9에 결합하는 항체인 Anti-CDK9을 1/500 농도로 상온에서 1시간 반응시키고 세척한 후, 그 위에 cy3로 표지된 2차 항체를 1/1000 농도로 상온에서 1시간 반응시켰다.

그 결과, 도 11에 나타난 바와 같이, CDK9을 반응시키지 않은 웰에서도 Human Cyclin T1에 시그널이 나타났으나, 이는 sol-gel spot을 너무 오래 말린 후 스캐닝하여 background 인데도 시그널처럼 보인 것이라 생각되었다. 따라서 스캐닝 시에 spot을 건조시키는 시간을 일정하게 하여 분석을 수행하도록 하였다.

실시예 5: 칩 기반 분석시스템의 sol-gel 물질 개량

sol-gel의 formμlation을 변화시켜 CDK9과 CyclinT1의 interaction이 가장 잘 이루어질 수 있는 조성을 찾기 위하여, 조성 1에서 3가지의 실리케이트 모노머와 버퍼의 조성을 변화시켜 조성 1과는 다른 포어사이즈를 갖도록 새로운 조성을 제조하였다.

각 각의 조성에서의 protein interaction을 확인하기 위해 우선 BSA를 각각의 조성의 sol-gel 물질로 고정화 하여 96 웰 플레이트에 스폿팅하였다. 500ng/μl의 BSA를 각 조성의 sol-gel에 섞어 스폿팅하였으며, 시그널을 확인하기 위하여, Cy3-anti-BSA를 1/500으로 희석하여 1시간동안 반응시킨 후, 세척하고, 스캐닝하였다.

그 결과, 도 12에 나타난 바와 같이, 원래 조성인 조성 1(2-9) 보다 조성 T, 조성 3(25.0% TMOS, 7.5% MTMS, 0% GPTMOS, 2-9C)에서 더 진한 시그널을 확인하였으며 나머지 조성의 sol-gel 스폿은 웰 표면에서 분석 도중 떨어져 나간 것을 확인할 수 있었다.

조성 3(2-9C) 및 조성 1(2-9)을 이용하여 BSA를 고정화하여, 상기와 동일한 방법으로 분석을 수행한 후 시그널을 확인한 결과, 조성 1보다 조성 3의 시그널이 더 선명함을 확인할 수 있었다(도 13).

실시예 6: 칩 기반 분석을 이용한 천연물 스크리닝

실시예 5에서 확인된 조성을 이용하여, 도 14에 나타난 바와 같이, 천연물 fμll screening용 단백질-단백질 저해 분석시스템을 제작하였다. 선정된 3가지 천연물을 바탕으로 다시 low density 칩을 제작하였을 때, 도 15에 나타난 바와 같이, Anti-CDK9과 2차 항체만 반응시켰을 경우에는 CDK9과 천연물을 고정한 스폿에서만 시그널이 보였고, CDK9, Anti-CDK9과 2차 항체를 반응시켰을 경우에는 CDK9과 천연물, Human Cyclin T1과 천연물을 고정화한 스폿 모두에서 시그널을 볼 수 있었으나 시그널이 약하게 감소하는 것도 관찰되었다.

따라서 천연물 중 방선균 배양추출액 #15, 곰팡이 배양추출액 (배지 A) #25, 곰팡이 배양추출액 (배지 B) #55, 식물 추출액 #411은 CDK9과 Human Cyclin T1의 결합에 약하게 작용하고 있다는 것을 알 수 있었다.

실시예 7: CDK9과 Cyclin T1의 상호작용을 저해하는 핵산 마커 개발

본 발명의 칩 기반 시스템이 단백질 상호작용에 대한 저해제 개발에 적용작용하는지를 검증하기 위하여, 압타머 제작하여 검증을 수행하였다.

In vivo에서 CDK9와 CyclinT1이 결합하면, Tat이라는 protein이 CyclinT1의 C-터미널에 결합하고, RNA 폴리머라아제가 결합을 하면서 세포분열에 대한 기작이 작용하게 된다 (도 16).

CdK9와 결합하는 부분인 CyclinT의 cyclin box에 대해서 C-터미널 부위가 없는 새로운 단백질을 제작하고, SELEX법으로 이에 대한 RNA 압타머(aptamer)를 개발하였다.

주형:GGTAATACGACTCACTATAGGGAGATACCAGCTTATTCAATT-N40-AGATAGTAAGTGCAATCT

40bp의 랜덤 sequence를 가진 single strand를 주문제작하여 PCR 후 reverse transcription 하여 10¹⁵의 complexity를 갖는 RNA 라이브러리를 제작하였다.

단백질은 잘 결합하지만 DNA, RNA는 결합하지 않는 니트로셀룰로오스 멤브레인(nitrocellμlose membrane)을 이용하여 filter binding assay 기법을 도입하여 CyclinT1을 고정화하였다.

RNA 라이브러리와 타겟 단백질인 CyclinT를 1:1의 비율로 2시간 동안 반응시킨 후 니트로셀룰로오스 멤브레인에 옮겨 필터링하고, 단백질에 결합하지 않은 RNA 분자들을 세척하였다. 멤브레인에서 단배질-RNA를 용출시키고, PCI 처리 후 에탄올 침전과정을 통해 RNA를 수득하였다. 상기 수득된 RNA를 PCR로 증폭시키고, reverse transcription하여, SELEX를 진행할 새 라이브러리를 제작하였다. 상기 과정을 8회 반복 진행하여 Cyclin T에 대한 압타머를 수득하였다 (도 17).

상기 압타머를 TA cloning 후 임의적으로 콜로니를 재취하여 시퀀싱하여, 압타머 시퀀스(서열번호 7~10)를 확인하고, m-fold program을 이용하여 2차 구조를 확인하였다.

서열번호 7: UUACAGAACAACCAACGUCGCUCCGGGUACUUCUUCAUCG

서열번호 8: ACCATCGCGGAAGTCCAGTCTGCCATCAAAATCCGAAGTG

서열번호 9: AATTCTCTCTCTTCATAATATTCCGGCGTCTACATCCACT

서열번호 10:CACGCGTTCAACCCCCGGAATTTAGCAATAGCAGATTACG

상기 압타머는 CyclinI1의 N-터미널 부분에 결합하여 CDK9와의 상호작용을 저해함으로써 RNA 폴리머라아제가 결합하지 못하게 하여 세포의 증식 기작을 억제할 것으로 예상하였다(도 18).

sol gel 2-9C 조성을 이용하여 CyclinT1을 고정화시켜 압타머와의 결합정도를 확인하였다. CyclinT1이 고정화 되어 있는 웰 안에 4개의 Cy3 labeled aptamer를 각각 2시간씩 반응시킨 후 세척하고, 스캐닝하여, CyclinT1과 결합하는 압타머와 CyclinT1과 결합하지 않은 압타머를 확인하였다(도 19).

CyclinT1(1mg/1ml)을 sol gel 조성 3에 잘 섞어 96웰 플레이트에 스폿팅하여 cyclinT1가 고정화 되어 있는 칩을 제작하였다. 각 웰에 압타머, CDK9, anti-CDK9 와 Cy3-표지 2차항체를 차례대로 1시간씩 반응시킨 후, 세척하였다.

이전 결과에서, CyclinT1과 결합하지 않는 압타머를 반응시킨 well에는 sol gel 안의 CyclinT1과 CDK9이 결합하여 시그널이 확인되었고, CyclinT1과 결합한 앞타머를 반응시킨 웰에는 시그널이 확인되지 않았다.

이 결과로부터, 본 발명에 따른 칩 기반 단백질-단백질 저해제 스크리닝 시스템이 작용한다는 것을 확인할 수 있었다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

도 1은 Cyclin T 단백질의 구조적 상동성을 나타낸 것이다.

도 2는 재조합 CDK9 및 Cyclin T의 E.coli BL21에서의 발현을 확인한 SDS-PAGE 결과를 나타낸 것이다.

도 3은 재조합 human CDK9의 발현 양상 및 정제과정을 확인한 것이다.

도 4는 재조합 human cylin T의 발현 양상 및 정제과정을 확인한 것이다.

도 5는 sol-gel chip에서 CDK9과 Human Cyclin T1의 상호작용을 단백질 칩 상에서 확인하는 방법을 나타낸 모식도이다.

도 6은 sol-gel chip에서 단백질간 결합을 확인한 결과를 나타낸 것이다.

도 7은 sol-gel chip에서 천연물 4개를 이용한 예비실험 결과를 나타낸 것이다.

도 8은 sol-gel chip에서의 분석조건 확립을 위한 결과를 나타낸 것이다.

도 9는 sol-gel 물질 조성에 따른 분석 결과를 나타낸 것이다.

도 10은 sol-gel 물질 조성에 따른 분석 결과를 나타낸 것이다.

도 11은 천연물 라이브러리를 이용한 CDK9과 Human Cyclin T1의 상호작용 저해효과를 확인한 결과를 나타낸 것이다.

도 12는 sol-gel 물질 조성에 따른 BSA 시그널을 확인한 결과를 나타낸 것이다.

도 13은 sol-gel 물질 조성에 따른 BSA 시그널을 확인한 결과를 나타낸 것이다.

도 14는 천연물 fμll 스크리닝용 단백질-단백질 저해 분석시스템의 제작과정을 나타낸 것이다.

도 15는 3가지 천연물을 이용한 low density 칩에서의 DK9과 Human Cyclin T1의 상호작용 저해효과를 분석한 것이다.

도 16은 CyclinT1과 CDK9의 상호작용기작을 나타낸 모식도이다.

도 17은 CyclinT1의 압타머 제작을 위한 SELEX 방법을 나타낸 모식도이다.

도 18은 CyclinT1 압타머의 작용기작을 나타낸 모식도이다.

도 19는 sol-gel칩에서의 압타머와 CyclinT1의 결합을 확인한 결과를 나타낸 것이다.

<110> Dongguk University Industry-Academic Cooperation Foundation <120> New Concept Drug Developement for Screening Drug Candidate Inhibitor of Target Protein-Protein Interaction <130> P09-B095 <160> 10 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 789 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 atggagggag agaggaagaa caacaacaaa cggtggtatt tcactcgaga acagctggaa 60 aatagcccat cccgtcgttt tggcgtggac ccagataaag aactttctta tcgccagcag 120 gcggccaatc tgcttcagga catggggcag cgtcttaacg tctcacaatt gactatcaac 180 actgctatag tatacatgca tcgattctac atgattcagt ccttcacaca gttccctgga 240 aattctgtgg ctccagcagc cttgtttcta gcagctaaag tggaggagca gcccaaaaaa 300 ttggaacatg tcatcaaggt agcacatact tgtctccatc ctcaggaatc ccttcctgat 360 actagaagtg aggcttattt gcaacaagtt caagatctgg tcattttaga aagcataatt 420 ttgcagactt taggctttga actaacaatt gatcacccac atactcatgt agtaaagtgc 480 actcaacttg ttcgagcaag caaggactta gcacagactt cttacttcat ggcaaccaac 540 agcctgcatt tgaccacatt tagcctgcag tacacacctc ctgtggtggc ctgtgtctgc 600 attcacctgg cttgcaagtg gtccaattgg gagatcccag tctcaactga cgggaagcac 660 tggtgggagt atgttgacgc cactgtgacc ttggaacttt tagatgaact gacacatgag 720 tttctacaga ttttggagaa aactcccaac aggctcaaac gcatttggaa ttggagggca 780 tgcgaggct 789 <210> 2 <211> 1119 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 atggcgaagc agtacgactc ggtggagtgc cctttttgtg atgaagtttc caaatacgag 60 aagctcgcca agatcggcca aggcaccttc ggggaggtgt tcaaggccag gcaccgcaag 120 accggccaga aggtggctct gaagaaggtg ctgatggaaa acgagaagga ggggttcccc 180 attacagcct tgcgggagat caagatcctt cagcttctaa aacacgagaa tgtggtcaac 240 ttgattgaga tttgtcgaac caaagcttcc ccctataacc gctgcaaggg tagtatatac 300 ctggtgttcg acttctgcga gcatgacctt gctgggctgt tgagcaatgt tttggtcaag 360 ttcacgctgt ctgagatcaa gagggtgatg cagatgctgc ttaacggcct ctactacatc 420 cacagaaaca agatcctgca tagggacatg aaggctgcta atgtgcttat cactcgtgat 480 ggggtcctga agctggcaga ctttgggctg gcccgggcct tcagcctggc caagaacagc 540 cagcccaacc gctacaccaa ccgtgtggtg acactctggt accggccccc ggagctgttg 600 ctcggggagc gggactacgg cccccccatt gacctgtggg gtgctgggtg catcatggca 660 gagatgtgga cccgcagccc catcatgcag ggcaacacgg agcagcacca actcgccctc 720 atcagtcagc tctgcggctc catcacccct gaggtgtggc caaacgtgga caactatgag 780 ctgtacgaaa agctggagct ggtcaagggc cagaagcgga aggtgaagga caggctgaag 840 gcctatgtgc gtgacccata cgcactggac ctcatcgaca agctgctggt gctggaccct 900 gcccagcgca tcgacagcga tgacgccctc aaccacgact tcttctggtc cgaccccatg 960 ccctccgacc tcaagggcat gctctccacc cacctgacgt ccatgttcga gtacttggca 1020 ccaccgcgcc ggaagggcag ccagatcacc cagcagtcca ccaaccagag tcgcaatccc 1080 gccaccacca accagacgga gtttgagcgc gtcttctga 1119 <210> 3 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 gaattcatgg cgaagcagta cgactc 26 <210> 4 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 ctcgaggaag acgcgctcaa actcc 25 <210> 5 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 gaattcatgg agggagagag gaagaaca 28 <210> 6 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 gtcgacagcc tcgcatgccc tccaa 25 <210> 7 <211> 40 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> aptamer <400> 7 uuacagaaca accaacgucg cuccggguac uucuucaucg 40 <210> 8 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> aptamer <400> 8 accatcgcgg aagtccagtc tgccatcaaa atccgaagtg 40 <210> 9 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> aptamer <400> 9 aattctctct cttcataata ttccggcgtc tacatccact 40 <210> 10 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> aptamer <400> 10 cacgcgttca acccccggaa tttagcaata gcagattacg 40

Claims

다음 단계를 포함하는 단백질-단백질 상호작용을 저해하는 물질의 스크리닝 방법:

(a) 졸-겔 물질과 단백질이 혼합된 스폿이 고정화되어 있는 단백질 칩을 제작하는 단계;

(b) 상기 단백질 칩과 상기 칩에 고정화된 단백질에 결합능을 가지는 단백질 을 상기 결합을 저해하는 천연물, 화합물 및 압타머로 구성되는 군에서 선택되는 후보물질의 존재 하에 반응시키는 단계; 및

(c) 상기 칩에 고정화된 단백질과 상기 고정화된 단백질에 결합능을 가지는 단백질의 결합여부를 확인하여, 상기 후보물질이 없는 경우의 단백질-단백질 상호작용에 비해, 단백질-단백질 상호작용이 저해되는 경우의 후보물질을 단백질-단백질 상호작용을 저해하는 물질로 선정하는 단계.
삭제
제1항에 있어서, 상기 (c)단계의 결합여부는 단백질칩에 고정화된 단백질에 결합능을 가지는 단백질에 대한 항체를 이용하여 확인하는 것을 특징으로 하는 방 법.
제1항에 있어서, 상기 스폿은 96웰 플레이트에 고정되어 있는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 단백질칩에 고정화된 단백질은 CyclinT1이고, 단백질칩에 고정화된 단백질에 결합능을 가지는 단백질은 CDK9인 것을 특징으로 하는 방법.
제5항에 있어서, 상기 졸-겔 물질은 TMOS 17.5 중량부, MTMS 5~15 중량부 및 GPTMOS 0~15 중량부로 구성되는 것을 특징으로 하는 방법.