KR100984602B1 - 유전자 증폭에 의해 형성된 반복서열로부터, 발현이 억제된단백질을 발현시키는 방법, 키트, 및 형질전환체 - Google Patents

Abstract

본 발명은 유전자의 반복서열에 기인하는 전사억제를 해제하는 방법 및 키트 등을 제공하여, 단백질을 대량으로 생산하는 시스템을 수립한다. 본 발명의 방법은 (a)목적 단백질을 코딩하는 유전자를 증폭할 때에, λ-파지 DNA 등의 10kbp이상의 폴리뉴클레오티드, 또는 인슐레이터 서열을 공동증폭하는 방법, (b)유전자 증폭이 일어난 세포를 점증(漸增) 농도의 약제를 함유하는 배지에서 배양하여 선발하는 방법, (c)목적 단백질을 코딩하는 유전자의 발현을 유도하는 프로모터 활성을 향상시키는 방법, (d)증폭한 유전자 영역을 Cre-LoxP 시스템을 이용하여 염색체 밖으로 잘라내는 방법, (e)유전자 증폭이 일어난 세포를 5-아자-2'-데옥시시티딘(5-aza-2'-deoxycytidine)으로 처리하여 DNA의 메틸화 레벨을 저하시키는 방법, (f)유전자 증폭이 이중미소염색체(double minute chromosome) 상에서 일어나고 있는 상기 포유동물세포를 선택하는 방법 중 적어도 하나 이상의 방법에 의해 달성된다.

반복서열, 단백질 발현, 복제기점, 핵 매트릭스 결합 영역

Description

유전자 증폭에 의해 형성된 반복서열로부터, 발현이 억제된 단백질을 발현시키는 방법, 키트, 및 형질전환체{Method and kit for expressing protein under regulation of the expression from related sequence formed by gene amplication and transformant}

본 발명은 유전자 증폭이 유도된 포유동물세포 내에서 형성된 반복서열로부터, 발현이 억제된 단백질을 발현시키는 방법 및 키트 등에 관한 것이다.

본 발명자는 포유동물 복제 개시영역(IR; initiation region)과 핵 매트릭스 결합영역(MAR; matrix attachment region)을 갖는 플라스미드(이하, 'IR/MAR 플라스미드'라 한다)를 인간 유래의 암세포(COLO 320 대장암 세포주, 및 HeLa 세포주)에 리포펙션(lipofection)법으로 도입하고, 플라스미드 상에 존재하는 약제내성유전자(블라스티사이딘(Blasticidine) 혹은 네오마이신(Neomycine))를 이용하여 선택하는 것만으로, 원하는 단백질을 코딩하는 유전자(목적 유전자)의 세포 내 카피수를 1만 카피 정도로까지 증폭할 수 있는 점, 및 목적 유전자는 IR/MAR 플라스미드에 대해 동일한 유전자구축물(시스)로서 도입한 경우이든, 다른 유전자구축물(트랜스)로서 도입한 경우이든 고도로 증폭할 수 있다는 점을 발견하였다(특허문헌 1, 특허문헌 2, 비특허문헌 1, 및 비특허문헌 2 참조).

그러나, 상기 IR/MAR 플라스미드, 및 목적 유전자를 도입한 세포주에 대해, 목적 유전자로부터의 mRNA의 전사량을 정량했더니, 목적 유전자의 카피수가 증가하고 있음에도 불구하고, mRNA의 전사량이 증가하고 있지 않음을 알 수 있었다. 이는 목적 유전자를 포함하는 영역이 고도로 증폭함으로 인한 반복서열에 기인하여 전사 억제가 일어나고 있는 것으로 추측된다.

유전자의 반복서열에 기인하는 전사억제를 해제하는 방법으로서는, 예를 들면 트리코스타틴 A(trichostatin A) 등의 히스톤 아세틸화 효소저해제로 세포를 처리하는 방법이 알려져 있다(비특허문헌 3 참조).

[특허문헌 1] 일본 특허공개 2003-245083호 공보(공개일: 2003년 9월 2일) [특허문헌 2] 일본 특허공개 2004-337066호 공보(공개일: 2004년 12월 2일)

[비특허문헌 1]

Noriaki Shimizu, et al.(2001) Plasmids with a Mammalian Replication Origin and a Matrix Attachment Region Initiate the Event Similar to Gene Amplification. Cancer Research vol.61, no.19, p6987-6990.

[비특허문헌 2]

Noriaki Shimizu, et al(2003) Amplification of plasmids containing a mammalian replication initiation region is mediated by controllable conflict between replication and transcription. Cancer Research, vol.63, no.17, p5281-5290.

[비특허문헌 3]

McBurney, M. W. et al, Exp Cell Res(2002), vol 274, p1-8

상기와 같이, 목적 유전자를 증폭함으로써 단백질을 대량으로 생산시키기 위해, 그 증폭한 목적 유전자를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 증폭시킨 경우일지라도, 반복서열이 생겨버리면 목적 유전자의 전사가 억제되어, 최종 목적인 단백질 발현에 이르지 못한다는 문제점이 있다.

그러나, 상기 비특허문헌 3에 개시된 트리코스타틴 A(trichostatin A) 등의 히스톤 아세틸화 효소저해제로 세포를 처리하는 방법 만으로는 수천에서 1만 카피 정도로까지 증폭한 유전자의 반복서열에 기인하는 전사억제를 충분히 해제할 수 없었다.

따라서, 본 발명은 상기 유전자의 반복서열에 기인하는 전사억제를 해제하는 방법 및 키트 등을 제공하여, 유전자 증폭에 의해 유용한 단백질을 대량으로 생산하는 시스템을 수립하는 것을 목적으로 하고 있다.

본 발명자는 상기 과제를 해결하기 위해, 상기 IR/MAR 플라스미드의 시스템을 이용하여 목적 유전자를 증폭하여, 반복서열이 생긴 경우일지라도, 전사억제가 일어나지 않고 단백질을 발현할 수 있는 방법에 대해 예의 검토를 하였다. 그 결과, 본 발명을 완성시키기에 이르렀다.

즉, 본 발명에 따른 방법은 상기 과제를 해결하기 위해, 유전자 증폭이 유도된 포유동물세포 내에서 형성된 반복서열로부터, 발현이 억제된 단백질을 발현시키는 방법으로서, 해당 포유동물세포는 진핵생물세포 내에서 기능하는 복제기점 및 핵 매트릭스 결합영역을 포함하는 제 1 폴리뉴클레오티드, 및 발현시킬 단백질을 코딩하는 제 2 폴리뉴클레오티드가 동시에 도입되어 있으며, 해당 제 1 및 제 2 폴리뉴클레오티드를 도입할 때, 10kbp이상의 길이를 갖는 제 3 폴리뉴클레오티드, 또는 인슐레이터 서열을 포함하는 제 4 폴리뉴클레오티드 중 적어도 한쪽을 상기 포유동물세포에 도입하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하고 있다.

또한, 본 발명에 따른 방법은 상기 과제를 해결하기 위해, 유전자 증폭이 유도된 포유동물세포 내에서 형성된 반복서열로부터, 발현이 억제된 단백질을 발현시키는 방법으로서, 해당 포유동물세포는 진핵생물세포 내에서 기능하는 복제기점 및 핵 매트릭스 결합영역을 포함하는 제 1 폴리뉴클레오티드, 및 제 5 폴리뉴클레오티드가 동시에 도입되어 있으며, 제 5 폴리뉴클레오티드는 발현시킬 단백질을 코딩하는 제 2 폴리뉴클레오티드, 및 약제내성 유전자를 포함하고 있고, 상기 포유동물세포를 점증적 농도의 약제를 포함하는 배지중에서 배양하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하고 있다.

또한, 본 발명에 따른 방법은 상기 과제를 해결하기 위해, 유전자 증폭이 유도된 포유동물세포 내에서 형성된 반복서열로부터, 발현이 억제된 단백질을 발현시키는 방법으로서, 해당 포유동물세포는 진핵생물세포 내에서 기능하는 복제기점 및 핵 매트릭스 결합영역을 포함하는 제 1 폴리뉴클레오티드, 및 제 6 폴리뉴클레오티드가 동시에 도입되어 있으며, 제 6 폴리뉴클레오티드에 있어서, 프로모터 영역과 발현시킬 단백질을 코딩하는 제 2 폴리뉴클레오티드가 제어가능하게 연결되어 있고, 해당 프로모터의 전사활성화 인자를 코딩하는 제 7 폴리뉴클레오티드를 상기 포유동물세포에 도입하여 전사활성화 인자를 발현시키는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하고 있다.

또한, 본 발명에 따른 방법은 상기 과제를 해결하기 위해, 유전자 증폭이 유도된 포유동물세포 내에서 형성된 반복서열로부터, 발현이 억제된 단백질을 발현시키는 방법으로서, 해당 포유동물세포는 진핵생물세포 내에서 기능하는 복제기점 및 핵 매트릭스 결합영역을 포함하는 제 1 폴리뉴클레오티드, 및 제 8 폴리뉴클레오티드가 동시에 도입되어 있으며, 제 8 폴리뉴클레오티드는 발현시킬 단백질을 코딩하는 제 2 폴리뉴클레오티드 및 LoxP 유전자를 포함하고, Cre 리컴비나제(Cre Recombinase) 유전자를 포함하는 제 9 폴리뉴클레오티드를 상기 포유동물세포에 도입하여 Cre 리컴비나제(Cre Recombinase)를 발현시키는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하고 있다.

또한, 본 발명에 따른 방법은 상기 과제를 해결하기 위해, 유전자 증폭이 유도된 포유동물세포 내에서 형성된 반복서열로부터, 발현이 억제된 단백질을 발현시키는 방법으로서, 해당 포유동물세포는 진핵생물세포 내에서 기능하는 복제기점 및 핵 매트릭스 결합영역을 포함하는 제 1 폴리뉴클레오티드, 및 발현시킬 단백질을 코딩하는 제 2 폴리뉴클레오티드가 동시에 도입되어 있으며, 5-아자-2'-데옥시시티딘(5-aza-2'-deoxycytidine)으로 상기 포유동물세포를 처리하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하고 있다.

또한, 본 발명에 따른 방법은 상기 과제를 해결하기 위해, 유전자 증폭이 유도된 포유동물세포 내에서 형성된 반복서열로부터, 발현이 억제된 단백질을 발현시키는 방법으로서, 5-아자-2'-데옥시시티딘(5-aza-2'-deoxycytidine)으로 상기 포유동물세포를 처리하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하고 있다.

또한, 본 발명에 따른 방법은 상기 과제를 해결하기 위해, 유전자 증폭이 유도된 포유동물세포 내에서 형성된 반복서열로부터, 발현이 억제된 단백질을 발현시키는 방법으로서, 해당 포유동물세포는 진핵생물세포 내에서 기능하는 복제기점 및 핵 매트릭스 결합영역을 포함하는 제 1 폴리뉴클레오티드, 및 발현시킬 단백질을 코딩하는 제 2 폴리뉴클레오티드가 동시에 도입되어 있으며, 상기 유전자 증폭이 이중미소염색체(double minute chromosome) 상에서 일어나고 있는 상기 포유동물세포를 선택하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하고 있다.

또한, 본 발명에 따른 방법은 상기 과제를 해결하기 위해, 유전자 증폭이 유도된 포유동물세포 내에서 형성된 반복서열로부터, 발현이 억제된 단백질을 발현시키는 방법으로서, 상기 유전자 증폭이 이중미소염색체 상에서 일어나고 있는 상기 포유동물세포를 선택하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하고 있다.

또한, 본 발명에 따른 방법은 상기 과제를 해결하기 위해, 유전자 증폭이 유도된 포유동물세포 내에서 형성된 반복서열로부터, 발현이 억제된 단백질을 발현시키는 방법으로서, 해당 포유동물세포는 진핵생물세포 내에서 기능하는 복제기점 및 핵 매트릭스 결합영역을 포함하는 제 1 폴리뉴클레오티드, 및 제 6 폴리뉴클레오티드가 동시에 도입되어 있으며, 제 6 폴리뉴클레오티드에 있어서, 프로모터 영역과 발현시킬 단백질을 코딩하는 제 2 폴리뉴클레오티드가 제어가능하게 연결되어 있고, 해당 제 1 및 제 6 폴리뉴클레오티드를 도입할 때에, 해당 프로모터의 전사활성화 인자를 코딩하는 제 7 폴리뉴클레오티드를 상기 포유동물세포로 동시에 도입하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하고 있다.

또한, 본 발명에 따른 방법은 상기 과제를 해결하기 위해, 유전자 증폭이 유도된 포유동물세포 내에서 형성된 반복서열로부터, 발현이 억제된 단백질을 발현시킬 방법으로서, 해당 포유동물세포는 진핵생물세포 내에서 기능하는 복제기점 및 핵 매트릭스 결합영역을 포함하는 제 1 폴리뉴클레오티드, 및 발현시킬 단백질을 코딩하는 제 2 폴리뉴클레오티드가 동시에 도입되어 있으며, 상기 유전자 증폭이 이중미소염색체 상에서 일어나고 있는 상기 포유동물세포를 선택하는 공정, 및 5-아자-2'-데옥시시티딘(5-aza-2'-deoxycytidine)으로 상기 포유동물세포를 처리하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하고 있다.

또한, 본 발명에 따른 방법은 상기 과제를 해결하기 위해, 유전자 증폭이 유도된 포유동물세포 내에서 형성된 반복서열로부터, 발현이 억제된 단백질을 발현시키는 방법으로서, 해당 포유동물세포는 진핵생물세포 내에서 기능하는 복제기점 및 핵 매트릭스 결합영역을 포함하는 제 1 폴리뉴클레오티드, 및 제 6 폴리뉴클레오티드가 동시에 도입되어 있으며, 제 6 폴리뉴클레오티드에 있어서, 프로모터 영역과 발현시킬 단백질을 코딩하는 제 2 폴리뉴클레오티드가 제어가능하게 연결되어 있고, 해당 제 1 및 제 6 폴리뉴클레오티드의 폴리뉴클레오티드를 도입할 때에, 해당 프로모터의 전사활성화 인자를 코딩하는 제 7 폴리뉴클레오티드를 상기 포유동물세포로 동시에 도입하는 공정, 및 5-아자-2'-데옥시시티딘(5-aza-2'-deoxycytidine)으로 상기 포유동물세포를 처리하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하고 있다.

또한, 본 발명에 따른 방법은 상기 진핵생물세포 내에서 기능하는 복제기점이 c-myc 유전자좌, 디히드로폴레이트 환원효소 유전자좌, 또는 β-글로빈 유전자좌의 복제기점으로부터 유래하는 것이어도 좋다.

또한, 본 발명에 따른 방법은 상기 핵 매트릭스 결합영역이 Igκ 유전자좌, SV40 초기영역, 또는 디히드로폴레이트 환원효소 유전자좌의 핵 매트릭스 결합영역으로부터 유래하는 것이어도 좋다.

한편, 본 발명에 따른 키트는 유전자 증폭이 유도된 포유동물세포 내에서 형성된 반복서열로부터, 발현이 억제된 단백질을 발현시키기 위한 키트로서, 진핵생물세포 내에서 기능하는 복제기점 및 핵 매트릭스 결합영역을 포함하는 제 1 폴리뉴클레오티드와, 10kbp이상의 길이를 갖는 제 3 폴리뉴클레오티드, 또는 인슐레이터 서열을 포함하는 제 4 폴리뉴클레오티드 중 적어도 한쪽을 구비하는 것을 특징으로 하고 있다.

또한, 본 발명에 따른 키트는 유전자 증폭이 유도된 포유동물세포 내에서 형성된 반복서열로부터, 발현이 억제된 단백질을 발현시키기 위한 키트로서, 진핵생물세포 내에서 기능하는 복제기점 및 핵 매트릭스 결합영역을 포함하는 제 1 폴리뉴클레오티드, 프로모터 영역을 포함하는 폴리뉴클레오티드, 및 해당 프로모터의 전사활성화 인자를 코딩하는 제 7 폴리뉴클레오티드를 구비하는 것을 특징으로 하는 키트이어도 좋다.

또한, 본 발명에 따른 키트는 유전자 증폭이 유도된 포유동물세포 내에서 형성된 반복서열로부터, 발현이 억제된 단백질을 발현시키는 키트로서, 진핵생물세포 내에서 기능하는 복제기점 및 핵 매트릭스 결합영역을 포함하는 제 1 폴리뉴클레오티드, LoxP 유전자를 포함하는 폴리뉴클레오티드, 및 Cre 리컴비나제(Cre Recombinase) 유전자를 포함하는 제 9 폴리뉴클레오티드를 구비하는 것을 특징으로 하는 키트이어도 좋다.

또한, 본 발명에 따른 키트는 상기 구성뿐만 아니라, 5-아자-2'-데옥시시티딘(5-aza-2'-deoxycytidine)을 추가로 포함하는 키트인 것이 바람직하다.

또한, 본 발명에 따른 키트는 상기 진핵생물세포 내에서 기능하는 복제기점이 c-myc 유전자좌, 디히드로폴레이트 환원효소 유전자좌, β-글로빈 유전자좌의 복제기점으로부터 유래하는 것이어도 좋다.

또한, 본 발명에 따른 키트는 상기 핵 매트릭스 결합영역이 Igκ 유전자좌, SV40 초기영역, 또는 디히드로폴레이트 환원효소 유전자좌의 핵 매트릭스 결합영역으로부터 유래하는 것이어도 좋다.

한편, 본 발명에 따른 형질전환체는, 진핵생물세포 내에서 기능하는 복제기점 및 핵 매트릭스 결합영역을 포함하는 제 1 폴리뉴클레오티드와, 발현시킬 단백질을 코딩하는 제 2 폴리뉴클레오티드와, 10kbp이상의 길이를 갖는 제 3 폴리뉴클레오티드, 또는 인슐레이터 서열을 포함하는 제 4 폴리뉴클레오티드 중 적어도 한쪽이 포유동물세포에 도입되어 된 형질전환체이다.

또한, 본 발명에 따른 형질전환체는 진핵생물세포 내에서 기능하는 복제기점 및 핵 매트릭스 결합영역을 포함하는 제 1 폴리뉴클레오티드, 프로모터 영역과 발현시킬 단백질을 코딩하는 제 2 폴리뉴클레오티드가 제어가능하게 연결되어 된 제 6 폴리뉴클레오티드와, 해당 프로모터의 전사활성화 인자를 코딩하는 제 7 폴리뉴클레오티드가 포유동물세포에 도입되어 된 형질전환체이어도 좋다.

또한, 본 발명에 따른 형질전환체는, 진핵생물세포 내에서 기능하는 복제기점 및 핵 매트릭스 결합영역을 포함하는 제 1 폴리뉴클레오티드와, 발현시킬 단백질을 코딩하는 제 2 폴리뉴클레오티드 및 LoxP 유전자를 포함하는 제 8 폴리뉴클레오티드와, Cre 리컴비나제(Cre Recombinase) 유전자를 포함하는 제 9 폴리뉴클레오티드가 포유동물세포에 도입되어 된 형질전환체이어도 좋다.

또한, 본 발명에 따른 방법은 상기 진핵생물세포 내에서 기능하는 복제기점이 c-myc 유전자좌, 디히드로폴레이트 환원효소 유전자좌, 또는 β-글로빈 유전자좌의 복제기점으로부터 유래하는 것이어도 좋다.

또한, 본 발명에 따른 방법은 상기 핵 매트릭스 결합영역이 Igκ 유전자좌, SV40 초기영역, 또는 디히드로폴레이트 환원효소 유전자좌의 핵 매트릭스 결합영역으로부터 유래하는 것이어도 좋다.

또한, 본 발명에 따른 형질전환체는 상기 포유동물세포가 COLO 320DM 세포, COLO 320HSR 세포, Hela 세포, 및 CHO 세포로 이루어진 군에서 선택되는 어느 한 세포이어도 좋다.

본 발명에 따르면, 유전자 증폭이 유도된 포유동물세포 내에서 형성된 반복서열로부터, 발현이 억제된 단백질을 발현시킬 수 있다. 그 때문에 본 발명에 따르면, 유전자 증폭의 수법에 의해, 유용한 단백질을 대량으로 생산하는 시스템을 수립할 수 있다는 효과를 갖는다.

본 발명의 또 다른 목적, 특징 및 뛰어난 점은 이하에 나타낸 기재에 의해 충분히 알 수 있을 것이다. 또한, 본 발명의 이익은 다음의 설명으로 명확해질 것이다.

도 1(a)은 실시예 1 에 있어서, 대조군로으서 λ-파지 DNA를 혼합하지 않고 pSFVdhfr(GAP-GFP)만을 세포에 도입한 경우의 형광강도를 나타낸 도면이다.

도 1(b)는 실시예 1에 있어서, pSFVdhfr(GAP-GFP), 및 λ-파지 DNA를 혼합하여 세포에 도입한 경우(cotransfection)의 형광강도를 나타낸 도면이다.

도 2(a)는 실시예 2에 있어서, 대조군으로서 pSFVdhfr/d2EGFP만을 세포에 도입한 경우의 형광강도를 나타낸 도면이다.

도 2(b)는 실시예 2 에 있어서, pSFVdhfr/d2EGFP만을 세포에 도입하고, 80㎍/㎖의 블라스티사이딘으로 선택을 추가로 한 경우의 형광강도를 나타낸 도면이다.

도 2(c)는 실시예 2에 있어서, pSFVdhfr/d2EGFP와, 조류 유래의 HS4 인슐레이터 서열을 가진 플라스미드 DNA를 혼합하여 세포에 도입한 경우의 형광강도를 나타낸 도면이다.

도 2(d)는 실시예 2에 있어서, pSFVdhfr/d2EGFP와, 조류 유래의 HS4 인슐레이터 서열을 가진 플라스미드 DNA를 혼합하여 세포에 도입하고, 80㎍/㎖의 블라스티사이딘으로 선택을 추가로 한 경우의 형광강도를 나타낸 도면이다.

도 3(a)는 실시예 3에 있어서, 5㎍/㎖의 블라스티사이딘으로 선택을 한 세포의 형광강도를 나타낸 도면이다.

도 3(b)는 실시예 3에 있어서, 10㎍/㎖의 블라스티사이딘으로 선택을 한 세포의 형광강도를 나타낸 도면이다.

도 3(c)는 실시예 3에 있어서, 40㎍/㎖의 블라스티사이딘으로 선택을 한 세포의 형광강도를 나타낸 도면이다.

도 3(d)는 실시예 3에 있어서, 160㎍/㎖의 블라스티사이딘으로 선택을 한 세포의 형광강도를 나타낸 도면이다.

도 3(e)는 실시예 3에 있어서, 320㎍/㎖의 블라스티사이딘으로 선택을 한 세포의 형광강도를 나타낸 도면이다.

도 4(a)는 실시예 4에 있어서, Tet-ON 유전자 통상발현의 세포에 대한 위상차 현미경 이미지(×200)이다.

도 4(b)는 실시예 4에 있어서, Tet-ON 유전자 고발현의 세포에 대한 위상차 현미경 이미지(×200)이다.

도 4(c)는 실시예 4에 있어서, Tet-ON 유전자 통상발현의 세포에 대한 형광 현미경 이미지(×200)이다.

도 4(d)는 실시예 4에 있어서, Tet-ON 유전자 고발현의 세포에 대한 형광 현미경 이미지(×200)이다.

도 5(a)는 실시예 4에 있어서, pSFVdhfr/d2EGFP를 도입한 세포에 대해 Tet-ON 단백질 통상발현인 경우의 형광강도를 나타낸 도면이다.

도 5(b)는 실시예 4에 있어서, pSFVdhfr/d2EGFP를 도입한 세포에 대해 Tet-ON 단백질 고발현인 경우의 형광강도를 나타낸 도면이다.

도 5(c)는 실시예 4에 있어서, 조류 유래의 HS4 인슐레이터 서열을 pSFVdhfr/d2EGFP와 동시증폭시킨 세포에 대해, Tet-ON 단백질 통상발현인 경우의 형광강도를 나타낸 도면이다.

도 5(d)는 실시예 4에 있어서 조류 유래의 HS4 인슐레이터 서열을 pSFVdhfr/d2EGFP와 동시증폭시킨 세포에 대해, Tet-ON 단백질 고발현인 경우의 형광강도를 나타낸 도면이다.

도 6(a)는 실시예 5에 있어서, Cre 리컴비나제(Cre Recombinase) 유전자를 도입하기 전의 세포의 위상차 현미경 이미지(×200)이다

도 6(b)는 실시예 5에 있어서, Cre 리컴비나제(Cre Recombinase) 유전자를 도입한 후의 세포의 위상차 현미경 이미지(×200)이다

도 6(c)는 실시예 5에 있어서, Cre 리컴비나제(Cre Recombinase) 유전자를 도입하기 전의 세포의 형광 현미경 이미지(×200)이다.

도 6(d)는 실시예 5에 있어서, Cre 리컴비나제(Cre Recombinase) 유전자를 도입한 후의 세포의 위상차 이미지(×200)이다.

도 7(a)는 실시예 6에 있어서, 5-아자-2'-데옥시시티딘(5-aza-2'-deoxycytidine, 또는 간단히 5-aza라고도 한다) 처리전 세포의 위상차 현미경 이미지(×200)이다.

도 7(b)는 실시예 6에 있어서, 1μM의 5-aza 처리후 세포의 위상차 현미경 이미지(×200)이다.

도 7(c)는 실시예 6에 있어서, 5-aza 처리전 세포의 형광 현미경 이미지(× 200)이다.

도 7(d)는 실시예 6에 있어서, 1μM의 5-aza 처리후 세포의 형광 현미경 이미지(×200)이다.

도 8(a)는 실시예 6에 있어서, 5-아자-2'-데옥시시티딘(5-aza-2' deoxycytidine(5-aza)) 처리전 세포의 형광강도를 나타낸 도면이다.

도 8(b)는 실시예 6에 있어서, 20nM의 트리코스타틴 A(Trichostatin A, 또한 이하, 간단히 TSA라고도 한다) 처리후 세포의 형광강도를 나타낸 도면이다.

도 8(c)는 실시예 6에 있어서, 1μM의 5-aza로 처리한 세포의 형광강도를 나타낸 도면이다.

도 8(d)는 실시예 6에 있어서, 1μM의 5-aza 및 20nM의 TSA로 처리한 세포의 형광강도를 나타낸 도면이다.

도 8(e)는 실시예 6에 있어서, 3μM의 5-aza로 처리한 세포의 형광강도를 나타낸 도면이다.

도 8(f)는 실시예 6에 있어서, 3μM의 5-aza 및 20nM의 TSA로 처리한 세포의 형광강도를 나타낸 도면이다.

도 9는 실시예 7에 있어서, pSFVdhfr/d2EGFP를 도입한 Tet-ON 세포의 다클론성 집단에 대해, 독시사이클린(Doxycycline)에 의해 d2EGFP의 발현 유도를 했을 때의 d2EGFP 발현량을 셀 소터로 해석한 결과를 나타낸 도면이다.

도 10(a)는 실시예 7에 있어서, pSFVdhfr/d2EGFP를 도입한 Tet-ON 세포의 다클론성 집단으로부터 선택한 클론 4에 대해, FISH법에 의해 pSFVdhfr/d2EGFP 플라 스미드 유래의 염기서열을 검출한 결과를 나타낸 형광 현미경 이미지이다.

도 10(b)는 실시예 7에 있어서, pSFVdhfr/d2EGFP를 도입한 Tet-ON 세포의 다클론성 집단으로부터 선택한 클론 5에 대해, FISH법에 의해 pSFVdhfr/d2EGFP 플라스미드 유래의 염기서열을 검출한 결과를 나타낸 형광 현미경 이미지이다.

도 10(c)는 실시예 7에 있어서, pSFVdhfr/d2EGFP를 도입한 Tet-ON 세포의 다클론성 집단으로부터 선택한 클론 6에 대해, FISH법에 의해 pSFVdhfr/d2EGFP 플라스미드 유래의 염기서열을 검출한 결과를 나타낸 형광 현미경 이미지이다.

도 10(d)는 실시예 7에 있어서, pSFVdhfr/d2EGFP를 도입한 Tet-ON 세포의 다클론성 집단으로부터 선택한 클론 9에 대해, FISH법에 의해 pSFVdhfr/d2EGFP 플라스미드 유래의 염기서열을 검출한 결과를 나타낸 형광 현미경 이미지이다.

도 11(a)는 실시예 7에서 취득한 클론 4에 대해, 독시사이클린(Doxycycline)에 의한 d2EGFP의 발현 유도를 함과 아울러, 5-aza를 배지에 첨가하지 않고, 1주간 배양을 한 후의 d2EGFP 발현량을 셀 소터에 의해 해석한 결과를 나타낸 도면이다.

도 11(b)는 실시예 7에서 취득한 클론 4에 대해, 독시사이클린(Doxycycline)에 의한 d2EGFP의 발현 유도를 함과 아울러, 5-aza(최종농도 1μM)를 배지에 첨가하여, 1주간 배양을 한 후의 d2EGFP 발현량을 셀 소터에 의해 해석한 결과를 나타낸 도면이다.

도 11(c)는 실시예 7에서 취득한 클론 4에 대해, 독시사이클린(Doxycycline)에 의한 d2EGFP의 발현 유도를 함과 아울러, 5-aza(최종농도 3μM)를 배지에 첨가하여, 1주간 배양한 후의 d2EGFP 발현량을 셀 소터에 의해 해석한 결과를 나타낸 도면이다.

도 12(a)는 실시예 7에서 취득한 클론 5에 대해, 독시사이클린(Doxycycline)에 의한 d2EGFP의 발현 유도를 함과 아울러, 5-aza를 배지에 첨가하지 않고, 1주간 배양을 한 후의 d2EGFP 발현량을 셀 소터에 의해 해석한 결과를 나타낸 도면이다.

도 12(b)는 실시예 7에서 취득한 클론 5에 대해, 독시사이클린(Doxycycline)에 의한 d2EGFP의 발현 유도를 함과 아울러, 5-aza(최종농도 1μM)를 배지에 첨가하여, 1주간 배양을 한 후의 d2EGFP 발현량을 셀 소터에 의해 해석한 결과를 나타낸 도면이다.

도 12(c)는 실시예 7에서 취득한 클론 5에 대해, 독시사이클린(Doxycycline)에 의한 d2EGFP의 발현 유도를 함과 아울러, 5-aza(최종농도 3μM)를 배지에 첨가하여, 1주간 배양을 한 후의 d2EGFP 발현량을 셀 소터에 의해 해석한 결과를 나타낸 도면이다.

도 13(a)는 실시예 7에서 취득한 클론 6에 대해, 독시사이클린(Doxycycline)에 의한 d2EGFP의 발현 유도를 함과 아울러, 5-aza를 배지에 첨가하지 않고, 1주간 배양을 한 후의 d2EGFP 발현량을 셀 소터에 의해 해석한 결과를 나타낸 도면이다.

도 13(b)는 실시예 7에서 취득한 클론 6에 대해, 독시사이클린(Doxycycline)에 의한 d2EGFP의 발현 유도를 함과 아울러, 5-aza(최종농도 1μM)를 배지에 첨가하여, 1주간 배양을 한 후의 d2EGFP 발현량을 셀 소터에 의해 해석한 결과를 나타낸 도면이다.

도 13(c)는 실시예 7에서 취득한 클론 6에 대해, 독시사이클린(Doxycycline) 에 의한 d2EGFP의 발현 유도를 함과 아울러, 5-aza(최종농도 3μM)를 배지에 첨가하여, 1주간 배양을 한 후의 d2EGFP 발현량을 셀 소터에 의해 해석한 결과를 나타낸 도면이다.

도 14(a)는 실시예 7에서 취득한 클론 9에 대해, 독시사이클린(Doxycycline)에 의한 d2EGFP의 발현 유도를 함과 아울러, 5-aza를 배지에 첨가하지 않고, 1주간 배양을 한 후의 d2EGFP 발현량을 셀 소터에 의해 해석한 결과를 나타낸 도면이다.

도 14(b)는 실시예 7에서 취득한 클론 9에 대해, 독시사이클린(Doxycycline)에 의한 d2EGFP의 발현 유도를 함과 아울러, 5-aza(최종농도 1μM)를 배지에 첨가하여, 1주간 배양을 한 후의 d2EGFP 발현량을 셀 소터에 의해 해석한 결과를 나타낸 도면이다.

도 14(c)는 실시예 7에서 취득한 클론 9에 대해, 독시사이클린(Doxycycline)에 의한 d2EGFP의 발현 유도를 함과 아울러, 5-aza(최종농도 3μM)를 배지에 첨가하여, 1주간 배양을 한 후의 d2EGFP 발현량을 셀 소터에 의해 해석한 결과를 나타낸 도면이다.

도 15는 실시예 8에 있어서, pSFVdhfr/d2EGFP와 pTet-ON 플라스미드(Plasmid)를 동시에 인간 대장암 COLO 320DM 세포로 도입하여 취득한 형질전환세포의 다클론성 집단에 대해, 독시사이클린(Doxycycline)에 의한 d2EGFP의 발현 유도를 하기 전후의 위상차 현미경 이미지 및 형광 현미경 이미지이며, (a)는 독시사이클린(Doxycycline) 첨가 전의 위상차 현미경 이미지(×200)이며, (b)는 독시사이클린(Doxycycline) 첨가 전의 형광 현미경 이미지(×200)이며, (c)는 독시사이클 린(Doxycycline) 첨가 후의 위상차 현미경 이미지(×200)이며, (d)는 독시사이클린(Doxycycline) 첨가 후의 형광 현미경 이미지(×200)이다.

도 16(a)는 실시예 8에 있어서, pSFVdhfr/d2EGFP와 pTet-ON 플라스미드(plasmid)를 동시에 인간 대장암 COLO 320DM 세포로 도입하여 취득한 형질전환세포의 다클론성 집단에 대해, 독시사이클린(Doxycycline)에 의한 d2EGFP의 발현 유도를 하기 전에, 셀 소터에 의해 d2EGFP의 발현을 해석한 결과를 나타낸 도면이다.

도 16(b)는 실시예 8에 있어서, pSFVdhfr/d2EGFP와 pTet-ON 플라스미드(plasmid)를 동시에 인간 대장암 COLO 320DM 세포로 도입하여 취득한 형질전환세포의 다클론성 집단에 대해, 독시사이클린(Doxycycline)에 의한 d2EGFP의 발현 유도를 1시간 실시하고, 셀 소터에 의해 d2EGFP의 발현을 해석한 결과를 나타낸 도면이다.

도 16(c)는 실시예 8에 있어서 pSFVdhfr/d2EGFP와 pTet-ON 플라스미드(plamid)를 동시에 인간 대장암 COLO 320DM 세포로 도입하여 취득한 형질전환세포의 다클론성 집단에 대해, 독시사이클린(Doxycycline)에 의한 d2EGFP의 발현 유도를 3시간 실시하고, 셀 소터에 의해 d2EGFP의 발현을 해석한 결과를 나타낸 도면이다.

도 16(d)는 실시예 8에 있어서, pSFVdhfr/d2EGFP와 pTet-ON 플라스미드(plasmid)를 동시에 인간 대장암 COLO 320DM 세포로 도입하여 취득한 형질전환세포의 다클론성 집단에 대해, 독시사이클린(Doxycycline)에 의한 d2EGFP의 발현 유도를 6시간 실시하고, 셀 소터에 의해 d2EGFP의 발현을 해석한 결과를 나타낸 도면 이다.

도 16(e)는 실시예 8에 있어서, pSFVdhfr/d2EGFP와 pTet-ON 플라스미드(plasmid)를 동시에 인간 대장암 COLO 320DM 세포로 도입하여 취득한 형질전환세포의 다클론성 집단에 대해, 독시사이클린(Doxycycline)에 의한 d2EGFP의 발현 유도를 15시간 실시하고, 셀 소터에 의해 d2EGFP의 발현을 해석한 결과를 나타낸 도면이다.

도 16(f)는 실시예 8에 있어서, pSFVdhfr/d2EGFP와 pTet-ON 플라스미드(plasmid)를 동시에 인간 대장암 COLO 320DM 세포로 도입하여 취득한 형질전환세포의 다클론성 집단에 대해, 독시사이클린(Doxycycline)에 의한 d2EGFP의 발현 유도를 24시간 실시하고, 셀 소터에 의해 d2EGFP의 발현을 해석한 결과를 나타낸 도면이다.

도 16(g)는 실시예 8에 있어서, pSFVdhfr/d2EGFP와 pTet-ON 플라스미드(plasmid)를 동시에 인간 대장암 COLO 320DM 세포로 도입하여 취득한 형질전환세포의 다클론성 집단에 대해, 독시사이클린(Doxycycline)에 의한 d2EGFP의 발현 유도를 48시간 실시하고, 셀 소터에 의해 d2EGFP의 발현을 해석한 결과를 나타낸 도면이다.

도 16(h)는 실시예 8에 있어서, pSFVdhfr/d2EGFP와 pTet-ON 플라스미드(plasmid)를 동시에 인간 대장암 COLO 320DM 세포로 도입하여 취득한 형질전환세포의 다클론성 집단에 대해, 독시사이클린(Doxycycline)에 의한 d2EGFP의 발현 유도를 120시간 실시하고, 셀 소터에 의해 d2EGFP의 발현을 해석한 결과를 나타낸 도 면이다.

도 16(i)는 실시예 8에 있어서, pSFVdhfr/d2EGFP와 pTet-ON 플라스미드(plasmid)를 동시에 인간 대장암 COLO 320DM 세포로 도입하여 취득한 형질전환세포의 다클론성 집단에 대해, 독시사이클린(Doxycycline)에 의한 d2EGFP의 발현 유도를 2주간 실시하고, 셀 소터에 의해 d2EGFP의 발현을 해석한 결과를 나타낸 도면이다.

도 16(j)는 실시예 8에 있어서, 음성대조의 다클론성 집단에 대해, 독시사이클린(Doxycycline)에 의한 d2EGFP의 발현 유도를 실시하고, 셀 소터에 의해 d2EGFP의 발현을 해석한 결과를 나타낸 도면이다.

도 17은 실시예 8에 있어서, pSFVdhfr/d2EGFP와 pTet-ON 플라스미드를 동시에 인간 대장암 COLO 320DM세포로 도입하여 취득한 형질전환세포의 다클론성 집단에 대해, d2EGFP 발현량의 평균값과 생세포율을 시간에 대해 플롯한 차트이다.

도 18(a)는 실시예 8에 있어서, pSFVdhfr/d2EGFP와 pTet-ON 플라스미드를 동시에 인간 대장암 COLO 320DM세포로 도입하여 취득한 형질전환세포의 다클론성 집단으로부터 임의로 선발한 클론 A에 대해, 발현 유도 전의 d2EGFP 발현량을 셀 소터로 해석한 결과를 나타낸 도면이다.

도 18(b)는 실시예 8에 있어서, pSFVdhfr/d2EGFP와 pTet-ON 플라스미드를 동시에 인간 대장암 COLO 320DM세포로 도입하여 취득한 형질전환세포의 다클론성 집단으로부터 임의로 선발한 클론 A에 대해, 발현 유도 후의 d2EGFP 발현량을 셀 소터로 해석한 결과를 나타낸 도면이다.

도 18(c)는 실시예 8에 있어서, pSFVdhfr/d2EGFP와 pTet-ON 플라스미드를 동시에 인간 대장암 COLO 320DM세포로 도입하여 취득한 형질전환세포의 다클론성 집단으로부터 임의로 선발한 클론 B에 대해, 발현 유도 전의 d2EGFP 발현량을 셀 소터로 해석한 결과를 나타낸 도면이다.

도 18(d)는 실시예 8에 있어서, pSFVdhfr/d2EGFP와 pTet-ON 플라스미드를 동시에 인간 대장암 COLO 320DM세포로 도입하여 취득한 형질전환세포의 다클론성 집단으로부터 임의로 선발한 클론 B에 대해, 발현 유도 후의 d2EGFP 발현량을 셀 소터로 해석한 결과를 나타낸 도면이다.

도 18(e)는 실시예 8에 있어서, pSFVdhfr/d2EGFP와 pTet-ON plasmid를 동시에 인간 대장암 COLO 320DM세포로 도입하여 취득한 형질전환세포의 다클론성 집단으로부터 임의로 선발한 클론 C에 대해, 발현 유도 전의 d2EGFP 발현량을 셀 소터로 해석한 결과를 나타낸 도면이다.

도 18(f)는 실시예 8에 있어서, pSFVdhfr/d2EGFP와 pTet-ON 플라스미드를 동시에 인간 대장암 COLO 320DM세포로 도입하여 취득한 형질전환세포의 다클론성 집단으로부터 임의로 선발한 클론 C에 대해, 발현 유도 후의 d2EGFP 발현량을 셀 소터로 해석한 결과를 나타낸 도면이다.

도 19는 실시예 8에 따른 방법을 실시함으로써, 헤테로크로마틴화하였던 HSR상의 증폭유전자로부터 RNA의 전사가 활성화되는 것을 나타낸 형광 현미경 이미지이다.

도 20(a)는 실시예 9에서 분리한 HSR 클론에 대해, 도입한 pSFVdhfr/d2EGFP 플라스미드의 염기서열을 FISH법에 의해 검출한 결과를 나타낸 형광 현미경 이미지이다.

도 20(b)는 실시예 9에서 분리한 DM 클론에 대해, 도입한 pSFVdhfr/d2EGFP 플라스미드의 염기서열을 FISH법에 의해 검출한 결과를 나타낸 형광 현미경 이미지이다.

도 21(a)는 실시예 9에서 분리한 HSR 클론에 대해, Doxycycline에 의한 d2EGFP의 발현 유도를 2일간 실시하고, 셀 소터에 의해 d2EGFP의 발현을 해석한 결과를 나타낸 도면이다.

도 21(b)는 실시예 9에서 분리한 DM 클론(5-aza처리 없음)에 대해, 독시사이클린(Doxycycline)에 의한 d2EGFP의 발현 유도를 2일간 실시하고, 셀 소터에 의해 d2EGFP의 발현을 해석한 결과를 나타낸 도면이다.

도 21(c)는 실시예 9에서 분리한 DM 클론(5-aza처리 있음)에 대해, 독시사이클린에 의한 d2EGFP의 발현 유도를 2일간 실시하고, 셀 소터에 의해 d2EGFP의 발현을 해석한 결과를 나타낸 도면이다.

도 21(d)는 실시예 9에 있어서, 음성 대조, HSR 클론, 및 DM 클론(5-aza처리 있음의 경우와 없음의 경우)에 대해, 독시사이클린 첨가 2일 후의 적산형광강도(積算螢光强度)를 나타낸 막대그래프이다.

도 22(a)는 실시예 10에서 분리한 CHO 세포의 HSR 클론에 대해, 도입한 pSFVdhfr/d2EGFP 플라스미드의 염기서열을 FISH법에 의해 검출한 결과를 나타낸 형광 현미경 이미지이다.

도 22(b)는 실시예 10에서 분리한 CHO 세포의 DM 클론에 대해, 도입한 pSFVdhfr/d2EGFP 플라스미드의 염기서열을 FISH법에 의해 검출한 결과를 나타낸 형광 현미경 이미지이다.

도 23(a)는 실시예 10에서 분리한 최고 클론에 대해, 독시사이클린에 의한 d2EGFP의 발현 유도를 2일간 실시하고, 셀 소터에 의해 d2EGFP의 발현을 해석한 결과를 나타낸 도면이다.

도 23(b)는 실시예 10에 있어서, 음성 대조에서의 형질전환세포의 다클론성 집단, 본 실시예의 형질전환세포의 다클론성 집단, 및 최고 클론에 대해 독시사이클린 첨가 2일 후의 적산형광강도(積算螢光强度)를 나타낸 막대 그래프이다.

도 23(c)는 실시예 10에서 분리한 최고 클론에 대해, 도입한 pSFVdhfr/d2EGFP 플라스미드의 염기서열을 FISH법에 의해 검출한 결과를 나타낸 형광현미경 이미지이다.

이하, 본 발명의 실시형태에 대해 설명한다. 또한, 본 발명은 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명은 유전자 증폭이 유도된 포유동물세포 내에서 형성된 반복서열로부터, 발현이 억제된 단백질을 발현시키는 방법이다. 여기서, '반복서열'이란, 어떤 단위염기서열이 반복된 염기서열을 의미한다. 이러한 반복서열이 염색체 상에 존재하면, 그 유전자영역으로의 헤테로크로마틴화가 일어나 유전자의 전사가 억제되는 경우가 있음이 알려져 있다.

본 발명자는 이미 기술한 바와 같이, 포유동물 복제 개시영역(IR; initiation region)과 핵 매트릭스 결합영역(MAR; matrix attachment region)을 갖는 플라스미드(이하 'IR/MAR 플라스미드'라 한다)를 인간 유래 암세포(COLO 320 대장암 세포주), 및 HeLa 세포주)에 리포펙션법에 의해 도입하고, 플라스미드 상에 존재하는 약제내성유전자(블라스티사이딘(Balsticidine) 혹은 네오마이신(Neomycine))를 이용하여 선택하는 것만으로, 원하는 단백질을 코딩하는 유전자(목적 유전자)의 세포 내 카피수를 1만 카피 정도로까지 증폭할 수 있는 시스템(이하, '고도 유전자 증폭시스템'이라 한다)을 개발하였다(특허문헌 1, 특허문헌 2, 비특허문헌 1, 및 비특허문헌 2 참조).

그러나, 이러한 고도 유전자 증폭시스템에서는 후술하는 비교예 1에 나타낸 바와 같이, 목적 유전자인 블라스티사이딘 저항성 유전자의 카피수가 증가하여도, 블라스티사이딘 저항성 유전자의 mRNA로의 전사량이 증가하지는 않는다는 것이 판명되었다. 이 현상은 목적 유전자를 포함하는 유전자영역이 고도로 증폭함으로 인해 발생하는 반복서열에 의해, 전사억제가 일어나고 있음을 나타내었다. 본 발명은 (a)이러한 반복서열에 기인하는 전사억제를 해제하는 것, 또는 (b)그 대다수가 상기 전사억제를 일으키고 있는 세포집단(클론 집단) 중에서, 해당 전사억제가 일어나지 않은(또는 전사억제의 정도가 낮은) 세포(클론)를 선택함으로써, 발현이 억제된 단백질을 발현시키기 위해 이루어진 것이다.

따라서, 본 발명에서 '발현이 억제된 단백질을 발현시키는 방법'이란, 반복서열에 기인하는 전사억제를 해제함으로써, 발현이 억제된 단백질을 발현시키는 방 법뿐만 아니라, 그 대다수가 상기 전사억제를 일으키고 있는 세포집단(클론 집단) 중에서, 해당 전사억제가 일어나고 있지 않은(또는 전사억제의 정도가 낮은) 세포(클론)를 선택함으로써, 원하는 단백질을 발현시키는 것도 포함하는 의미이다.

여기서, 본 발명에 있어서 '유전자 증폭이 유도된 포유동물세포'는 세포 내에서 유전자(폴리뉴클레오티드)의 증폭이 유도된 포유동물세포를 말한다. 해당 포유동물세포로서는 예를 들면 상기 IR/MAR 플라스미드를 도입한 포유동물세포를 들 수 있다. 또한, 상기 포유동물세포는 특별히 한정되는 것이 아니며, 예를 들면 CHO-K1 세포(입수처 : 예를 들면 ATCC CCL-61, RIKEN RCB0285, RIKEN RCB0403 등)를 들 수 있다. 단, 상기 포유동물세포로서는 무한증식능을 갖는 종양세포가 특히 바람직하다. 상기 종양세포로서는 예를 들면 HeLa 세포(입수처 : 예를 들면 ATCC CCL-2, ATCC CCL-2.2, RIKEN RCB0007, RIKEN RCB0191 등), 인간 대장암 COLO 320DM 세포(입수처 : 예를 들면 ATCC CCL-220), 인간 대장암 COLO 320HSR 세포(입수처: 예를 들면 ATCC CCL-220.1), NS0 세포(입수처 : 예를 들면 RIKEN RCB0213) 등을 들 수 있다.

[실시형태 1]

본 실시형태에 따른 방법은, 상기 유전자 증폭이 유도된 포유동물세포가, 진핵생물세포 내에서 기능하는 복제기점 및 핵 매트릭스 결합영역을 포함하는 제 1 폴리뉴클레오티드, 및 발현시킬 단백질을 코딩하는 제 2 폴리뉴클레오티드가 동시에 도입되어 있으며, 해당 제 1 및 제 2 폴리뉴클레오티드를 도입할 때에, 10kbp 이상의 길이를 갖는 제 3 폴리뉴클레오티드, 또는 인슐레이터 서열을 포함하는 제 4 폴리뉴클레오티드 중 적어도 한쪽을 상기 포유동물세포에 도입하는 공정을 포함하고 있다.

제 1 폴리뉴클레오티드에는 진핵생물세포 내에서 기능하는 복제기점 및 핵 매트릭스 결합영역이 포함되어 있다. 이러한 제 1 폴리뉴클레오티드에 포함되는 복제기점으로서는 진핵생물세포 내에서 기능하는 것이면 특별히 한정되지 않고, c-myc 유전자좌, 디히드로폴레이트 환원효소 유전자좌, β-글로빈 유전자좌 등의 복제기점을 들 수 있다. 또한, c-myc 유전자좌의 복제기점에 대해서는 예를 들면 『McWhinney, C. et al., Nucleic Acids Res. vol. 18, p1233-1242(1990)』에 기재되어 있다. 디히드로폴레이트 환원효소 유전자좌의 복제기점에 대해서는 예를 들면 『Dijkwel, P. A. et al., Mol. Cell. Biol. vol. 8, p5398-5409(1988)』에 기재되어 있다. β-글로빈 유전자좌의 복제기점에 대해서는 예를 들면 『Aladjem, M. et al., Science vol. 281, p1005-1009(1998)』에 기재되어 있다.

또한, 이러한 제 1 폴리뉴클레오티드에 포함되는 핵 매트릭스 결합영역으로서는 진핵생물세포 내에서 기능하는 것이면 특별히 한정되지 않으며, Igκ 유전자좌, SV40 초기영역, 디히드로폴레이트 환원효소 유전자좌 등의 핵 매트릭스 결합영역으로부터 유래하는 서열을 들 수 있다. 또한, Igκ 유전자좌의 핵 매트릭스 결합영역에 대해서는 예를 들면 『Tsutsui, K. et al., J. Biol. Chem. vol. 268, p12886-12894(1993)』에 기재되어 있다. SV40 초기영역의 핵 매트릭스 결합영역에 대해서는 예를 들면 『Pommier, Y. et al., J. Virol., vol 64, p419-423(1990)』에 기재되어 있다. 디히드로폴레이트 환원효소 유전자좌의 핵 매트릭스 결합영역 에 대해서는 예를 들면 『Shimizu N. et al., Cancer Res. vol. 61, p6987-6990』에 기재되어 있다.

또한, 제 1 폴리뉴클레오티드에는, 이 외에도, 적절한 목적에 따라 대장균 내에서 클로닝을 수행하기 위해 필요한 서열, 혹은 마커 단백질로서 약제내성유전자(블라스티사이딘 저항성 유전자, 네오마이신 저항성 유전자 등) 또는 녹색형광단백질 유전자 등을 선택마커로서 가질 수도 있다. 이들 선택마커를 지표로 하여 제 1 폴리뉴클레오티드가 도입된 세포를 선별할 수 있다.

한편, 제 2 폴리뉴클레오티드는 발현시킬 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드(적당히 '목적 단백질을 코딩하는 유전자'라 칭한다)이며, 특별히 한정되지 않고, 원하는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 적절히 선택한 후, 채용하면 된다. 해당 폴리뉴클레오티드는 그 염기서열정보를 근거로 PCR 등의 공지 기술을 이용하여 취득하면 된다. 또한, 본 발명의 설명에서 '발현시킬 단백질'을 '목적 단백질'이라 칭한다.

상기 제 1 폴리뉴클레오티드, 및 발현시킬 단백질을 코딩하는 제 2 폴리뉴클레오티드가 포유동물세포로 동시에 도입됨으로 인해, 본 발명자가 특허문헌 1 등에 개시한 '고도 유전자 증폭시스템'을 구성할 수 있으며, 해당 세포는 제 2 폴리뉴클레오티드를 증폭하는 것이 가능해진다. 여기서, 상기 제 1 및 제 2 폴리뉴클레오티드가 동시에 도입된 포유동물세포는 본 발명에서 말하는 '유전자 증폭이 유도된 포유동물세포'이다. 해당 제 1 및 제 2 폴리뉴클레오티드가 도입되는 포유동물세포는 특별히 한정된 것은 아니며, 예를 들면 CHO 세포 등을 들 수 있다. 단, 상기 포유동물세포로서는 무한증식능을 갖는 종양세포가 특히 바람직하다. 상기 종양세포로서는, 예를 들면 HeLa 세포, 인간 대장암 COLO 320DM 세포, 인간 대장암 COLO 320HSR 세포, NSO 세포 등을 들 수 있다. 인간 대장암 COLO 320DM 세포 및 인간 대장암 COLO 320HSR 세포에 대해서는, 예를 들면 『Quinn, L. A., Moore, G. E., Morgan, R.T., and Woods, L. K. Cell lines from human colon carcinoma with unusual cell products, double minutes, and homogeneously staining regions. Cancer Res. 1979 39(12):4914-4924.』 및 『Shimizu, N., Kanda, T., and Wahl, G. M. Selective capture of acentricfragments by micronuclei provides a rapid method for purifying extrachromosomally amplified DNA. Nat. Genet., 12:65-71, 1996.』에 기재되어 있다.

또한, 제 1 및 제 2 폴리뉴클레오티드를 세포에 도입할 때에는 양쪽 폴리뉴클레오티드가 동시에 포유동물세포로 도입되는 양태이면 특별히 한정되지 않으며, 양 폴리뉴클레오티드를 연결하여 동일한 유전자구축물로서 도입할 수도 있고, 또 각각 별개의 유전자구축물로서 도입할 수도 있다. 또한, 유전자구축물의 형태에 대해서는 플라스미드일 수도 있고, 코스미드일 수도 있다.

또한, 제 1 및 제 2 폴리뉴클레오티드의 세포로의 도입방법은 특별히 한정되지 않으며, 리포펙션, 일렉트로포레이션법, 파티클건법(particle gun method) 등 공지의 방법을 적절히 선택하여 이용가능하다.

그런데, 제 1 및 제 2 폴리뉴클레오티드가 도입된 포유동물세포 내에서 제 2 폴리뉴클레오티드가 증폭될 때에 반복서열이 생기고, 해당 반복서열에 의해 전사억 제가 일어나며, 그 결과 단백질의 발현억제가 일어난다. 본 발명자는 이 현상을 발암과정의 유전자 증폭에서 발생하는 반복서열의 경우와 비교하였다(후술하는 '참고예 1'). 그 결과, 발암과정에서 발생하는 유전자 증폭영역으로부터 mRNA로의 전사는 억제되고 있지 않음을 알 수 있었다. 비교예 1에서 나타낸 IR과 MAR을 갖는 플라스미드(pSFVdhfr)에 의한 반복서열과, 발암과정에서 발생한 반복서열과의 차이점은, 후자에서는 반복되고 있는 서열이 긴 점(통상, 100∼200kbp), 및 반복서열이 재조합 등에 의해 복잡해지고 있는 점이다. 따라서, 비교예 1 및 참고예 1의 결과로부터, IR과 MAR를 갖는 플라스미드에 의해 발생하는 반복서열로부터 mRNA의 전사량을 높이기 위해서는, 반복단위를 길게 하고 반복구조를 복잡화하면 된다는 것이 추정된다.

본 실시형태에 따른 방법은 상기 검토를 근거로 하여 고안되었다. 즉, 해당 제 1 및 제 2 폴리뉴클레오티드를 도입할 때에, 10kbp이상의 길이를 갖는 제 3 폴리뉴클레오티드, 또는 인슐레이터 서열을 포함하는 제 4 폴리뉴클레오티드 중 적어도 한쪽을 상기 포유동물세포에 도입하는 공정을 포함하고 있다.

상기 제 3 폴리뉴클레오티드를, 상기 제 1 및 제 2 폴리뉴클레오티드와 동시에 포유동물세포로 도입함으로써, 발현시킬 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 제 3 폴리뉴클레오티드가 상기 포유동물세포 내에서 공동증폭한다. 그 결과, 폴리뉴클레오티드(유전자)의 증폭에 의해 형성되는 반복서열의 반복단위가 길어지거나, 또는 반복구조가 복잡해진다. 따라서, 반복서열에 기인하는 전사억제를 해제할 수 있어, 폴리뉴클레오티드의 카피수에 맞는 단백질을 발현시킬 수 있다는 효 과를 갖는다.

여기서 제 3 폴리뉴클레오티드의 길이는 10kbp이상이 바람직하며, 50kbp이상이 더욱 바람직하고, 100bkp이상이 가장 바람직하다. 제 3 폴리뉴클레오티드는 상기 길이의 조건을 만족하는 것이면, 염기서열에 대해서는 한정되는 것이 아니며, 단백질을 코딩하는 것일 수도 있고 코딩하지 않는 것일 수도 있다. 또한, 제 3 폴리뉴클레오티드는 임의의 폴리뉴클레오티드를 합성 등의 수법에 의해 적절히 조제하여 적용할 수도 있으며, 예를 들면 λ-파지 DNA (약 48.5kbp), 인간 게놈 DNA 등의 공지의 폴리뉴클레오티드를 적절히 선택하여 적용할 수도 있다.

한편, 제 4 폴리뉴클레오티드를, 상기 제 1 및 제 2 폴리뉴클레오티드를 동시에 포유동물세포에 도입함으로써 발현시킬 단백질, 및 인슐레이터 서열의 폴리뉴클레오티드가 상기 포유동물세포 내에서 공동증폭하면, 폴리뉴클레오티드(유전자)의 증폭에 의해 형성되는 반복서열의 반복단위가 길어지거나, 또는 반복구조가 복잡해진다. 게다가 헤테로크로마틴화가 주위로 확산되는 일이 없어지고, 반복서열에 기인하는 전사억제를 해제할 수 있어, 폴리뉴클레오티드의 카피수에 맞는 단백질을 발현시킬 수 있다는 효과를 갖는다.

여기서, '인슐레이터 서열'은 크로마틴의 경계이며, 유전자 발현의 독립성을 유지하는 DNA 서열이라는 것이 알려져 있다. 이러한 인슐레이터 서열로서는, 예를 들면 조류 유래의 HS4 인슐레이터 서열(1210bp, 『Recillas-Targa, F. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., vol. 99, p6883-6888, (2002) 참조』, 성게 유래의 ARS 인슐레이터 서열(575bp, 『Akasaka K, et al., Cell. Mol. Biol. vol. 45, p555-565(1999)』참조)을 들 수 있다.

상기 제 3 또는 제 4 폴리뉴클레오티드는 제 1 또는 제 2 폴리뉴클레오티드와 동일한 유전자구축물로서 포유동물세포에 도입할 수도 있으며, 각각 별개의 유전자구축물로서 도입할 수도 있다. 단, 제 3 및 제 4 폴리뉴클레오티드는 사이즈가 비교적 큰 점, 제 1 또는 제 2 폴리뉴클레오티드를 포함하는 유전자구축물에 추가로 삽입하는 조작이 필요로 되는 점 등의 이유로 인해, 각각 별개의 유전자구축물로서 포유동물세포에 도입하는 것이 바람직하다. 또 제 3 또는 제 4 폴리뉴클레오티드 중 어느 하나를 포유동물세포 내에 도입할 수도 있지만, 양 펩티드를 포유동물세포 내에 도입하는 편이, 더욱 전사억제를 해제하는 효과를 얻을 수 있기 때문에 바람직하다. 또한, 유전자구축물의 형태, 포유동물세포의 도입방법에 대해서는 제 1 및 제 2 폴리뉴클레오티드의 경우와 마찬가지로 하면 된다.

본 실시형태에 따른 방법의 효과에 대해서는 그 일 예로서 후술하는 실시예 1, 2에서 검토하고 있으며, 확실히 발현시킬 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 전사억제가 해제되어 있어, 목적 단백질이 고발현되고 있음을 알 수 있었다.

또한, 본 발명은 본 실시형태에 따른 방법에 의해 얻어진 형질전환체를 포함한다.

[실시형태 2]

본 실시형태에 따른 방법은 상기 유전자 증폭이 유도된 포유동물세포가 진핵생물세포 내에서 기능하는 복제기점 및 핵 매트릭스 결합영역을 포함하는 제 1 폴리뉴클레오티드, 및 제 5 폴리뉴클레오티드가 동시에 도입되어 있고, 제 5 폴리뉴 클레오티드는 발현시킬 단백질을 코딩하는 제 2 폴리뉴클레오티드, 및 약제내성유전자를 포함하고 있으며, 상기 포유동물세포를, 점증(漸增) 농도의 약제를 함유하는 배지 중에서 배양하는 공정을 포함하고 있다.

여기서 제 5 폴리뉴클레오티드란, 발현시킬 단백질을 코딩하는 제 2 폴리뉴클레오티드, 및 약제내성 유전자를 포함하는 폴리뉴클레오티드이다. 약제내성 유전자로서는 블라스티사이딘 저항성 유전자, 네오마이신 저항성 유전자, 히그로마이신 저항성 유전자 등을 들 수 있다. 이러한 제 5 폴리뉴클레오티드를 상기 유전자 증폭이 유도된 포유동물세포에 도입할 때는, 제 1 또는 제 5 폴리뉴클레오티드와 동일한 유전자구축물로서 포유동물세포에 도입할 수도 있으며, 각각 별개의 유전자구축물로서 도입할 수도 있다. 또한, 유전자구축물의 형태, 포유동물세포로의 도입방법에 대해서는 이미 기술한 제 1 및 제 2 폴리뉴클레오티드의 경우와 마찬가지로 하면 된다.

본 실시형태는 상기 제 1 및 제 5 폴리뉴클레오티드가 도입된 포유동물세포를, 점증(漸增) 농도의 약제를 함유하는 배지중에서 배양하는 공정을 포함하고 있다. 상기 제 1 및 제 5 폴리뉴클레오티드가 도입된 포유동물세포에서는, 발현시킬 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 약제내성 유전자가 공동증폭된다. 점증(漸增) 농도의 약제를 함유하는 배지중에서 상기 포유동물세포를 배양하면, 반복서열에 기인하는 전사억제가 일어나지 않은(또는 전사억제의 정도가 낮은) 포유동물세포를, 약제내성을 지표로 하여 선발할 수 있다. 따라서, 발현시킬 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 대해서도 전사억제가 일어나지 않은(또는 전사억제의 정도가 낮은) 포유동물세포를 선발할 수 있어, 해당 폴리뉴클레오티드의 카피수에 맞는 단백질을 발현시킬 수 있다는 효과를 갖는다.

여기서, 세포 배양을 할 때의 약제의 점증(漸增) 방법은, 특별히 한정되는 것은 아니며, 약제 농도가 높은 배지에 단계적으로 연이어 배양해가는 방법일 수도 있으며, 배지 중에 약제를 연속적으로 첨가해가는 방법일 수도 있다. 보다 구체적으로는, 전자의 경우 3일∼7일 간격으로 연이어 배양해가는 것이 바람직하고, 약제 농도의 증가율은 30∼100% 증가가 바람직하다. 또한, 후자의 경우는 약제 농도가 24시간당 10∼30% 증가가 되도록 약제를 첨가하는 것이 바람직하다. 후술하는 실시예 3에서는 3∼5일 간격으로 연이어 배양할 때마다 약제(블라스티사이딘) 농도를 배가시키고 있다.

또한, 배지 중에 첨가하는 약제의 상한은 약제의 종류, 세포의 종류, 상태 등에 따라 다르기 때문에 한정되는 것은 아니며, 적절히 검토한 후에 결정하면 된다.

본 실시형태에 따른 방법의 효과에 대해서는 그 일 예로서 후술하는 실시예 3에서 검토하고 있으며, 확실하게 발현시킬 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 전사억제가 해제되고 있어, 목적 단백질이 고발현하고 있음을 알 수 있었다.

[실시형태 3]

본 실시형태에 따른 방법은, 상기 유전자 증폭이 유도된 포유동물세포가, 진핵생물세포 내에서 기능하는 복제기점 및 핵 매트릭스 결합영역을 포함하는 제 1 폴리뉴클레오티드, 및 제 6 폴리뉴클레오티드가 동시에 도입되어 있으며, 제 6 폴 리뉴클레오티드에 있어서, 프로모터 영역과 발현시킬 단백질을 코딩하는 제 2 폴리뉴클레오티드가 제어가능하게 연결되어 있고, 해당 프로모터의 전사활성화 인자를 코딩하는 제 7 폴리뉴클레오티드를 상기 포유동물세포에 도입하여 전사활성화 인자를 발현시키는 공정을 포함하고 있다.

여기서 제 6 폴리뉴클레오티드란, 프로모터 영역과 발현시킬 단백질을 코딩하는 제 2 폴리뉴클레오티드가 제어가능하게 연결되어 있는 것이다. 프로모터 영역으로서는, 제 6 폴리펩티드가 도입되는 포유동물세포에서 기능하고, 동시에 전사활성화 인자에 의해 전사조절되는 것이면 특별히 한정되는 것이 아니며, 예를 들어 TRE 프로모터(클론테크사 제품), T-REX 프로모터(인비트로젠사 제품) 등이 이용가능하다. 제 6 폴리뉴클레오티드를 상기 유전자 증폭기능을 갖는 포유동물세포에 도입할 때는, 제 1 폴리뉴클레오티드와 동일한 유전자구축물로서 포유동물세포에 도입할 수도 있고, 각각 별개의 유전자구축물로서 도입할 수도 있다. 또한, 유전자구축물의 형태, 포유동물세포로의 도입방법에 대해서는 이미 기술한 제 1 및 제 2 폴리뉴클레오티드의 경우와 마찬가지로 하면 된다.

본 실시형태는 해당 프로모터의 전사활성화 인자를 코딩하는 제 7 폴리뉴클레오티드를 상기 포유동물세포에 도입하여 전사활성화 인자를 발현시키는 공정을 포함하고 있다. 이러한 공정에 따르면, 발현시킬 단백질의 발현을 제어하는 프로모터의 활성 자체를 향상시킬 수 있어, 반복서열에 의해 발현이 억제된 단백질을 발현시킬 수 있다는 효과를 갖는다. 여기서 제 7 폴리뉴클레오티드란, 상기 제 6 폴리뉴클레오티드에 포함되는 프로모터의 전사활성화 인자를 코딩하는 폴리뉴클레 오티드를 말한다. 예를 들면, 프로모터로서 TRE 프로모터를 사용한 경우에는 Tet-ON 유전자(클론테크사 제품)를 제 7 폴리뉴클레오티드로 하면 된다.

제 7 폴리뉴클레오티드를 상기 포유동물세포에 도입하여 전사활성화 인자를 발현시키는 공정에서는, 이러한 제 7 폴리뉴클레오티드와 해당 폴리뉴클레오티드를 발현시키기 위한 프로모터를 제어가능하게 연결하여 구축한 유전자구축물을 상기 포유동물세포에 도입하면 된다. 해당 제 7 폴리뉴클레오티드를 발현시키기 위한 프로모터는 포유동물세포에서 기능하는 것이면 특별히 한정되지 않으며, 유도형 프로모터일 수도 있고 비유도형 프로모터일 수도 있다. 또한, 제 7 폴리뉴클레오티드를 포함하는 유전자구축물의 포유동물세포로의 도입 시기는 상기 제 1 및 제 6 폴리뉴클레오티드의 도입 후에 제 7 폴리뉴클레오티드를 도입할 수도 있으며, 또 그 반대일 수도 있다. 또한, 유전자구축물의 형태, 포유동물세포로의 도입방법에 대해서는 이미 기술한 제 1 및 제 2 폴리뉴클레오티드의 경우와 마찬가지로 하면 된다.

본 실시형태에 따른 방법의 효과에 대해서는 그 일 예로서 후술하는 실시예 4에서 검토하고 있으며, 확실하게 발현시킬 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 전사억제가 해제되어, 목적 단백질이 고발현하고 있음을 알 수 있었다.

또한, 본 발명은 본 실시형태에 따른 방법에 의해 얻어진 형질전환체를 포함한다.

[실시형태 4]

본 실시형태에 따른 방법은, 상기 유전자 증폭이 유도된 포유동물세포가, 진 핵생물세포 내에서 기능하는 복제기점 및 핵 매트릭스 결합영역을 포함하는 제 1 폴리뉴클레오티드, 및 제 8 폴리뉴클레오티드가 동시에 도입되고 있고, 제 8 폴리뉴클레오티드는 발현시킬 단백질을 코딩하는 제 2 폴리뉴클레오티드, 및 LoxP 유전자를 포함하며, Cre 리컴비나제(Cre Recombinase) 유전자를 포함하는 제 9 폴리뉴클레오티드를 상기 포유동물세포에 도입하여 Cre 리컴비나제(Cre Recombinase)를 발현시키는 공정을 포함하고 있다.

여기에서 제 8 폴리뉴클레오티드란, 제 2 폴리뉴클레오티드 및 LoxP 유전자를 포함하는 폴리뉴클레오티드이다. LoxP 유전자는 공지의 Cre-LoxP System(크레·록스피 시스템)에 따른 유전자이다.(『"Molecular Cloning----a laboratory manual 3rd Ed.", by J. Sambrook and D. W. Russell, Cold Spring Harbor Laboratory Press(2001), page 4.82-4.85.』참조). 또한, 상기 LoxP 유전자의 양단(5' 말단 및 3' 말단)에는 클로닝을 위한 제한효소인식서열 또는 제한효소절단서열이 부가되어 있어도 좋다.

또한, 제 9 폴리뉴클레오티드는 동일 Cre-LoxP System(크레·록스피 시스템)에 따른 Cre 리컴비나제(Cre Recombinase) 유전자를 포함하는 폴리뉴클레오티드이다. 해당 제 9 폴리뉴클레오티드에는 Cre 리컴비나제(Cre Recombinase) 유전자를 발현시키기 위한 프로모터가 포함되어 있는 것이 바람직하다.

제 1 폴리뉴클레오티드, 제 8 폴리뉴클레오티드 및 제 9 폴리뉴클레오티드가 포유동물세포에 도입됨으로써, LoxP 유전자와 발현시킬 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 증폭된다. 이 때, 포유동물세포에서 발현한 Cre 리컴비나제(Cre Recombinase)가 LoxP 유전자를 인식하여, 발현시킬 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 염색체 밖으로 잘려나와 환상체 분자를 형성한다. 염색체 밖의 환상분자는 전사억제 등의 영향을 받기 어렵기 때문에, 반복서열에 기인하는 전사억제를 피할 수 있어, 폴리뉴클레오티드의 카피수에 맞는 단백질을 발현시킬 수 있다는 효과를 갖는다.

또한, 각 폴리뉴클레오티드의 포유동물세포로의 도입방법에 대해서는 이미 기술한 제 1 및 제 2 폴리뉴클레오티드의 경우와 마찬가지로 하면 된다. 또한, 도입 시기는 상기 제 1 및 제 8 폴리뉴클레오티드의 도입 후에 제 9 폴리뉴클레오티드를 도입할 수도 있으며, 또 그 반대일 수도 있다.

본 실시형태에 따른 방법의 효과에 대해서는 그 일 예로서 후술하는 실시예 5에서 검토하고 있으며, 확실하게 발현시킬 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 전사억제가 해제되어 있어, 목적 단백질이 고발현하고 있음을 알 수 있었다.

또한, 본 발명은 본 실시형태에 따른 방법에 의해 얻어진 형질전환체를 포함한다.

[실시형태 5]

본 실시형태에 따른 방법은 상기 유전자 증폭이 유도된 포유동물세포가, 진핵생물세포 내에서 기능하는 복제기점 및 핵 매트릭스 결합영역을 포함하는 제 1 폴리뉴클레오티드, 및 발현시킬 단백질을 코딩하는 제 2 폴리뉴클레오티드가 동시에 도입되고 있으며, 5-아자-2'-데옥시시티딘(5-aza-2'-deoxycytidine)으로 상기 포유동물세포를 처리하는 공정을 포함하고 있다.

본 발명자는 RNAi에서의 DNA의 사이렌싱(silencing, 전사억제)이 DNA의 메틸화를 동반하고 있기 때문에, 역으로 DNA의 메틸화 레벨을 저하시키면 전사억제를 해제할 수 있는 것은 아닌가라는 것을 독자적으로 생각해내어, 본 실시형태에 따른 방법을 고안하기에 이르렀다. 5-아자-2'-데옥시시티딘(5-aza-2'-deoxycytidine)은 DNA의 메틸화 레벨을 저하시킨다는 점이 알려져 있어, 본 발명자는 이를 채용하기로 하였다. 해당 5-아자-2'-데옥시시티딘(5-aza-2'-deoxycytidine)은 시판하는 것을 적절히 구입하여 이용하면 된다. 예를 들어 Sigma사로부터 구입할 수 있다.

5-아자-2'-데옥시시티딘(5-aza-2'-deoxycytidine)으로 포유동물세포를 처리하는 방법은 5-아자-2'-데옥시시티딘(5-aza-2'-deoxycytidine)과 포유동물세포가 접촉하는 방법이면 특별히 한정되지 않는데, 예를 들면 5-아자-2'-데옥시시티딘(5-aza-2'-deoxycytidine)을 포함하는 배지 중에서 포유동물세포를 배양하면 된다. 이 때의 5-아자-2'-데옥시시티딘(5-aza-2'-deoxycytidine)의 농도는 세포의 종류나 상태에 따라 바람직한 조건이 다르기 때문에, 적절히 검토한 후 결정하면 되는데, 통상 0.2μM∼10μM이 바람직하며, 1μM∼2μM이 더욱 바람직하다. 상기 바람직한 범위를 초과하면, 포유동물세포에 대해 독성을 발휘하는 경우가 있으며, 상기 바람직한 범위 미만이면, 전사 억제를 충분히 해제할 수는 없다. 또한, 5-아자-2'-데옥시시티딘(5-aza-2'-deoxycytidine)을 첨가하는 배지는 포유동물세포를 배양할 수 있는 것이면 특별히 한정되는 것이 아니고, 예를 들면 Dulbecco's modified Eagle's 배지(DEM 배지 ; 인비트로겐사 제품), RPMI1640 배지(닛스이(日水)제약사 제품) 등이 이용가능하며, 10%의 소태아혈청을 첨가하여 사용한다.

또한, 포유동물세포의 처리시간은 5-아자-2'-데옥시시티딘(5-aza-2'-deoxycytidine)의 농도, 세포의 종류나 상태에 따라 다르기 때문에 한정되는 것은 아니지만, 3일∼10일이 바람직하다.

본 실시형태에 따른 방법의 효과에 대해서는 그 일 예로서 후술하는 실시예 6에서 검토하고 있으며, 확실하게 발현시킬 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 전사억제가 해제되어, 목적 단백질이 고발현하고 있음을 알 수 있었다.

또한, 상기 5-아자-2'-데옥시시티딘(5-aza-2'-deoxycytidine)으로 포유동물세포를 처리하는 방법은 제 1 폴리뉴클레오티드, 및 제 2 폴리뉴클레오티드가 도입된 포유동물세포에만 적용되는 것은 아니며, 유전자 증폭이 유도된 포유동물세포에 널리 적용이 가능하다. 예를 들면, 차이니즈 햄스터 난소(CHO; Chinease Hamster Ovary) 세포에, 단백질을 코딩하는 유전자와 디히드로폴레이트 환원효소(DHFR; Dihydrofolate reductase) 유전자를 동시에 도입하여 유전자 증폭이 가능해진 포유동물세포에도 적용가능하다.

[실시형태 6]

본 실시형태에 따른 방법은 상기 유전자증폭이 유도된 포유동물세포가, 진핵생물세포 내에서 기능하는 복제기점 및 핵 매트릭스 결합영역을 포함하는 제 1 폴리뉴클레오티드, 및 발현시킬 단백질을 코딩하는 제 2 폴리뉴클레오티드가 동시에 도입되어 있으며, 상기 유전자 증폭이 이중미소염색체 상에서 일어나고 있는 상기 포유동물세포를 선택하는 공정을 포함하고 있다.

본 발명자는 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드(유전자) 및 IR/MAR 플라스미드를 도입한 포유동물세포의 안정된 형질전환세포집단에서, 목적 단백질을 발현하는 클론을 분리하여 그 목적 단백질의 발현량을 비교하였더니, 염색체의 균일염색영역(Homogenously staining regeon; 이하 'HSR'이라 한다) 상에서 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드(유전자)의 증폭이 일어나고 있는 클론에 비해, 염색체 밖의 이중미소염색체(double minute chromosome, 이하, 'DM'이라 한다) 상에서 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드(유전자)의 증폭이 일어나고 있는 클론 쪽이 훨씬 높은 발현량을 나타낸다는 사실을 발견하였다. 즉, 고도 유전자 증폭시스템을 이용하여 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드(유전자)가 고도로 증폭된 포유동물세포로부터, DM 상에서 해당 폴리뉴클레오티드(유전자)의 증폭이 일어나고 있는 클론을 선택하면, 반복서열에 기인하는 전사억제가 일어나고 있지 않은 클론을 선택할 수 있어, 해당 클론을 배양함으로써 목적 단백질을 고발현시킬 수 있다고 할 수 있다.

DM 상에서 유전자 증폭이 일어나고 있는 포유동물세포(클론)를 선택하는 방법은 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면 분열기의 염색체에 대해 공지의 FISH법(Fluorescence in situ hybridization)에 의해, 포유동물세포로 도입한 제 1∼제 9 중 어느 한 폴리뉴클레오티드를 검출하여, DM 상에 형광을 나타내는 포유동물세포(클론)을 분리하는 방법을 들 수 있다. HSR은 염색체 상의 영역인 것에 비해, DM은 염색체 밖에 존재하기 때문에, 형광 현미경 관찰에 의해 염색체 이외의 영역에 형광을 띠는 포유동물세포(클론)를 선발하면 된다. FISH법을 실시할 때의 구체적인 방법에 대해서는 특별히 한정되는 것이 아니며, 종래 공지의 방법을 적절히 선택하여 사용하면 된다.

또한, 기타, DM상에서 유전자 증폭이 일어나고 있는 포유동물세포(클론)를 선택하는 방법으로서는 락토오즈 오퍼레이터(Lactose Operator, LacO) 서열을 제 1∼9 중 어느 한 폴리뉴클레오티드에 삽입하고, 상기의 방법으로 증폭시켜, 그것을 Lactose Repressor(LacR)-Green Fluorescence Protein(GFP) 융합유전자의 발현에 의해 가시화하는 방법을 들 수 있다(『Kanda, T., and G. M. Wahl. 2000. The dynamics of acentric chromosomes in cancer cells revealed by GFP-based chromosome labeling strategies. J Cell Biochem. Suppl: 107-114.』;『Li, G., G. Sudlow and A. S. Belmont. 1998. Interphase cell cycle dynamics of a late-replicating, heterochromatic homogeneously staining region: Precise choreography of condensation/decon densation and nuclear positioning. J Cell Biol. 140;975-989.』 및 『Simizu, N., K. Shingaki, Y. Kaneko-Sasaguri, T. Hashizume, and T. Kanda. 2005. When, where and how the bridge breaks: anaphase bridge breakage plays a crucial role in gene amplification and HSR generation. Exp Cell Res. 302:233-243.』참조).

여기에서 DM 및 HSR에 대해서는 다음과 같은 것이 알려져 있다. 유전자 증폭은 종양세포의 분한증식(分限增殖) 또는 약제저항성을 획득하는 주요한 기구이며(『Benner, S. E., Wahl, G. M., and Von Hoff, D. D. Double minute chromosomes and homogeneously staining regions in tumors taken directly from patients versus in human tumor cell lines. Anti-Cancer Drugs, 2:11-25, 1991』 참조), 세포유전학적으로 말하면, 증폭유전자는 in vivo에서, 염색체 밖의 이중미소염색체(DM) 상에서 가장 빈번하게 검출된다. 그러나, 장기간에 걸친 in vitro에서의 계대에 의해, 통상적으로는 염색체의 균일염색영역(HSR; homogeneously staining region)에 증폭유전자를 갖는 세포의 우세적 증식에 이르게 된다. 이제까지의 연구에 의해, 종양세포로부터 DM 상의 증폭유전자를 제거하면, 종양표현형 및 세포분화를 띠는 상태로부터 정상상태로 복귀하는 것이 나타나 있다(『Shimizu, N.，Nakamura，H.，Kadota，T., and Kitajima，K.，Oda，T.，Hirano，T.，and Utiyama, H. Loss of amplified c-myc genes in the spontaneously differentiated HL-60 cells. Cancer Res.，54:3561-3567，1994.』,『 Von Hoff, D. D.，McGill，J. R.，Forseth，B.J.，Davidson，K.K.，Bradley，T.P.，Van Devanter，D.R.，and Wahl，G.M. Elimination of extrachromosomally amplified MYC genes from human tumor cells reduces their tumorigenicity. Proc. Natl. Acad. Sci. USA，89:8165-8169，1992』, 및 『Eckhardt，S.G.，Dai，A.，Davidson，K.K.，Forseth，B.J.，Wahl，G.M.，and Von Hoff, D.D. Induction of differentiation in HL60 cells by the reduction of extrachromosomally amplified c-myc. Proc. Natl. Acad. Sci. USA，91:6674-6678，1994.』참조). 이러한 제거과정은 분열세포로부터 방출되는 미소핵으로의 DM의 선택적 도입에 의해 중개된다(『Von Hoff，D.D.，McGill，J. R.，Forseth，B.J.，Davidson，K.K.，Bradley，T.P.，Van Devanter，D.R.，and Wahl， G.M. Elimination of extrachromosomally amplified MYC genes from human tumor cells reduces their tumorigenicity. Proc. Natl. Acad. Sci. USA，89:8165-8169，1992.』,『Shimizu，N.，Kanda，T.，and Wahl，G.M. Selective capture of acentricfragments by micronuclei provides a rapid method for purifying extrachromosomally amplified DNA. Nat. Genet.，12:65-71，1996.』, 및 『Shimizu， N.，Shimura，T.，and Tanaka，T.Selective elimination of acentric double minutes from cancer cells through the extrusion of micronuclei. Mutat. Res.，448:81-90，2000.』참조). 이와 같은 미소핵 형성(micronucleation) 과정은 세포주기시 DM의 세포 내 거동과 밀접하게 관련되어 있음이 이해되고 있다(『Tanaka, T.，and Shimizu，N. Induced detachment of acentric chromatin from mitotic chromosomes leads to their cytoplasmic localization at Gl and the micronucleation by lamin reorganization at S phase. J. Cell Sci.，113:697-707，2000.』참조). DM은 다양한 크기의 무동원체 환상 DNA로 구성되며(『Levan，A.，and Levan，G.Have double minutes functioning centromeres? Hereditas，88:81-92，1978. 참조』), 무동원체성임에도 불구하고, 유사분열하는 염색체에 부착하여 딸세포로 안정되게 분리된다(『Tanaka, T.，and Shimizu，N.Induced detachment of acentric chromatinfrom mitotic chromosomes leads to their cytoplasmic localization at G1 and the micronucleation by lamin reorganization at S phase. J. Cell Sci.，113:697-707, 2000.』,『Levan, A.，and Levan, G. H ave double minutes functioniing centromeres? Hereditas，88:81-92, 1978.』, 및 『Kanda, T.，Sullivan, K. F.，and Wahl, G. M. Histone-GFP fusion protein enables sensitive analysis of chromosome dynamics in living mammaliancells. Curr, Biol.，8:377-385，1998.』참조). 최근의 관련된 중요한 지식으로서, 소 파피로마 바이러스(『Lehman, C. W.，and Botchan, M. R. Segregation of viral plasmids depends on tethering to chromosomes and is regulated by phosphorylation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA，95:4338-4343，1998.』참조), EB 바이러스(『Mare chal, V.，Dehee, A.，Chikhi-Brachet, R., Piolot, T., Coppey-Moisan, M.，and Nicolas, J. C. Mapping EBNA-1 domains involved in binding tometaphase chromosomes. J. Virol.，73:4385-4392, 1999.』참조), 카포지육종 관련 헤르페스바이러스(『Ballestas, M. E., Chatis, P. A., and Kaye, K. M. Efficient persistence of extrachromosomal KSHV DNA mediated by latency-associated nuclear antigen. Science(Wash.DC), 284:641-644, 1999.』참조) 및 SV40(『Baiker, A., Maercker, C., Piechaczek, C., Schmidt, S. B., Bode, J., Benham, C., and Lipps, H. J. Mitotic stability of an episomal vector containing a human scaffold/ matrix-attached region is provided by association with nuclear matrix. Nature Cell Biol.，2:182-184，2000.』참조)을 포함하는 몇 개인가의 바이러스성 핵내 플라스미드(viral nuclear plasmid)가 세포분열시에 동일한 기구를 이용하는 것이 나타나 있다. 또한, 최근의 흥미로운 연구에서는 EB 바이러스 레플리콘을 갖는 플라스미드가 종양세포에서 DM에 삽입될 수 있음이 나타나 있다(『Kanda, T., Otter, M., and Wahl, G. M. Mitotic segregation of viral and cellular acentric extrachromosomal molecules by chromosome tethering. J. Cell Sci., 114:49-58, 2001.』참조).

또한, 제 1 및 제 2 폴리뉴클레오티드의 포유동물세포로의 도입방법, 해당 폴리뉴클레오티드를 포유동물세포로 도입할 때의 유전자구축물에 대해서는 [실시형태 1]의 항에서 설시한 경우와 동일하게 하면 된다.

본 실시형태에 따른 방법의 효과에 대해서는, 그 일 예로서 후술하는 실시예 7에서 검토하고 있으며, 확실히 발현시킬 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 전사억제가 해제되어, 목적 단백질이 고발현하고 있음을 알 수 있었다.

또한, 상기 본 실시형태에 따른 방법은 제 1 폴리뉴클레오티드, 및 제 2 폴리뉴클레오티드가 도입된 포유동물세포에만 적용되는 것이 아니고, 유전자 증폭이 유도된 포유동물세포로 널리 적용이 가능하다. 예를 들면, 차이니즈 햄스터 난소(CHO; Chinese Hamster Ovary) 세포에, 단백질을 코딩하는 유전자와 디히드로폴레이트 환원효소(DHFR; Dihydrofolate reductase) 유전자를 동시에 도입하여 유전자 증폭이 가능해진 포유동물세포에도 적용가능하다.

[실시형태 7]

본 실시형태에 따른 방법은, 상기 유전자 증폭이 유도된 포유동물세포가, 진핵생물세포 내에서 기능하는 복제기점 및 핵 매트릭스 결합영역을 포함하는 제 1 폴리뉴클레오티드, 및 제 6 폴리뉴클레오티드가 동시에 도입되어 있으며, 제 6 폴리뉴클레오티드에 있어서, 프로모터 영역과 발현시킬 단백질을 코딩하는 제 2 폴리뉴클레오티드가 제어가능하게 연결되어 있고, 해당 제 1 및 제 6 폴리뉴클레오티드를 도입할 때에, 해당 프로모터의 전사활성화 인자를 코딩하는 제 7 폴리뉴클레오티드를 상기 포유동물세포에 동시에 도입하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하고 있다.

여기에서 제 6 폴리뉴클레오티드란, 프로모터 영역과 발현시킬 단백질을 코딩하는 제 2 폴리뉴클레오티드가 제어가능하게 연결되어 있는 것이다. 프로모터 영역으로서는, 제 6 폴리펩티드가 도입되는 포유동물세포에서 기능하고, 또한 전사활성화 인자에 의해 전사조절되는 것이면 특별히 한정되지 않으며, 예를 들면 TRE 프로모터(클론테크사 제품), T-REX 프로모터(인비트로젠사 제품) 등이 이용가능하다. 제 6 폴리뉴클레오티드를 상기 유전자 증폭능을 갖는 포유동물세포에 도입할 때는 제 1 폴리뉴클레오티드와 동일한 유전자구축물로서 포유동물세포에 도입하여도 좋고, 각각 별개의 유전자구축물로서 도입하여도 좋다. 또한, 유전자구축물의 형태, 포유동물세포로의 도입방법에 대해서는 이미 기술한 제 1 및 제 2 폴리뉴클레오티드의 경우와 마찬가지로 하면 된다.

본 실시형태는 해당 제 1 및 제 6 폴리뉴클레오티드를 도입할 때에, 해당 프로모터의 전사활성화 인자를 코딩하는 제 7 폴리뉴클레오티드를 상기 포유동물세포에 동시에 도입하는 공정을 포함하고 있다. 이러한 공정에 따르면, 목적 단백질의 발현을 제어하는 프로모터의 활성 자체를 향상시킬 수 있어, 반복서열에 의해 발현억제되고 있는 단백질을 발현시킬 수 있다는 효과를 갖는다. 여기에서 제 7 폴리뉴클레오티드란 상기 제 6 폴리뉴클레오티드에 포함되는 프로모터의 전사활성화 인자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 말한다. 예를 들면, 프로모터로서 TRE 프로모터를 사용한 경우에는 Tet-ON 유전자(클론테크사 제품)를 제 7 폴리뉴클레오티드로 하면 된다.

제 7 폴리뉴클레오티드를 상기 포유동물세포에 도입하여 전사활성화 인자를 발현시키는 공정에서는 이러한 제 7 폴리뉴클레오티드와 해당 폴리뉴클레오티드를 발현시키기 위한 프로모터를 제어가능하게 연결하여 구축한 유전자구축물을 상기 포유동물세포에 도입하면 된다. 해당 제 7 폴뉴클레오티드를 발현시키기 위한 프로모터는 포유동물세포에서 기능하는 것이면 특별히 한정되는 것은 아니며, 유도형 포로모터일 수도 비유도형 프로모터일 수도 있다. 또한, 제 7 폴리뉴클레오티드를 포함하는 유전자구축물의 포유동물세포로의 도입 시기는 상기 제 1 및 제 6 폴리뉴클레오티드를 도입할 때에 제 7 폴리뉴클레오티드를 동시에 도입하면 된다(cotransfection). 간단하게는, 제 1 폴리뉴클레오티드 및 제 6 폴리뉴클레오티드를 포함하는 유전자구축물과 제 7 폴리뉴클레오티드를 포함하는 유전자구축물을 혼합하여, 리포펙션법 등에 의해 포유동물세포로 유전자 도입을 하면 된다. 또는 제 1 폴리뉴클레오티드를 포함하는 유전자구축물, 제 6 폴리뉴클레오티드를 포함하는 유전자구축물, 및 제 7 폴리뉴클레오티드를 포함하는 유전자구축물을 각각 혼합하여, 리포펙션법 등에 의해 포유동물세포로 유전자도입을 하면 된다. 또한, 유전자구축물의 형태, 포유동물세포로의 도입방법에 대해서는 이미 기술한 제 1 및 제 2 폴리뉴클레오티드의 경우와 마찬가지로 하면 된다.

본 실시형태에 따른 방법의 효과에 대해서는 그 일 예로서 후술하는 실시예 8에서 검토하고 있으며, 확실하게 발현시킬 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 전사억제가 해제되어, 목적 단백질이 고발현하고 있음을 알 수 있었다.

또한 본 발명은, 본 실시형태에 따른 방법에 의해 얻어진 형질전환체를 포함 한다.

또한, 상기 실시형태 1∼7에 나타낸 각 공정을 적절히 조합하여 수행하는 것도 가능하다. 이러한 경우에는 반복서열에 의한 전사억제를 해제하는 효과를 추가로 얻을 수 있으며, 발현이 억제된 단백질을 추가로 고발현시킬 수 있다는 효과를 갖는다.

[실시형태 8]

본 발명은 상기 실시형태 1∼7에서 설시한 각 폴리뉴클레오티드, 시약 등을 적절히 조합함으로써 구성한, 유전자 증폭이 유도된 포유동물세포 내에서 형성된 반복서열로부터, 발현이 억제된 단백질을 발현시키기 위한 키트도 포함한다. 본 발명에 따른 키트에 의하면, 간단하게, 유전자 증폭이 유도된 포유동물세포 내에서 형성된 반복서열로부터, 발현이 억제된 단백질을 발현시킬 수 있다.

본 발명의 키트는 특별히 한정되는 것은 아니며, 예를 들면, 진핵생물세포 내에서 기능하는 복제기점 및 핵 매트릭스 결합영역을 포함하는 제 1 폴리뉴클레오티드와, 10kbp이상의 길이를 갖는 제 3 폴리뉴클레오티드, 또는 인슐레이터 서열을 포함하는 제 4 폴리뉴클레오티드 중 적어도 한쪽을 구비하는 키트를 들 수 있다. 상기 키트는 실시형태 1에 기재한 방법에 따라 사용할 수 있다. 또한, 상기 제 1 폴리뉴클레오티드와, 제 3 및/또는 제 4 폴리뉴클레오티드는 동일한 유전자구축물로서 구성되어 있어도 좋다.

또한, 본 발명에 따른 키트(일 예)는 진핵생물세포 내에서 기능하는 복제기점 및 핵 매트릭스 결합영역을 포함하는 제 1 폴리뉴클레오티드, 프로모터 영역을 포함하는 폴리뉴클레오티드, 및 해당 프로모터의 전사활성화 인자를 코딩하는 제 7 폴리뉴클레오티드를 구비하는 것을 특징으로 하는 키트이어도 좋다. 상기 키트는 상기 프로모터 영역과 목적 유전자를 연결함으로써 제 6 폴리뉴클레오티드를 조제한 후, 실시형태 3 또는 7에 기재한 방법에 따라 사용하면 된다. 또한, 상기 제 1 폴리뉴클레오티드와, 상기 프로모터 영역을 포함하는 폴리뉴클레오티드는 동일한 유전자구축물로서 구성되어 있어도 좋다.

또한, 본 발명에 따른 키트(일 예)는 진핵생물세포 내에서 기능하는 복제기점 및 핵 매트릭스 결합영역을 포함하는 제 1 폴리뉴클레오티드, LoxP 유전자를 포함하는 폴리뉴클레오티드, 및 Cre 리컴비나제(Cre Recombinase) 유전자를 포함하는 제 9 폴리뉴클레오티드를 구비하는 것을 특징으로 하는 키트이어도 좋다. 상기 키트는 상기 LoxP 유전자를 포함하는 폴리뉴클레오티드와 목적 유전자를 연결함으로써 제 8 폴리뉴클레오티드를 조제한 후, 실시형태 4에 기재한 방법에 따라 사용하면 된다. 또한, 상기 제 1 폴리뉴클레오티드와 상기 LoxP 유전자를 포함하는 폴리뉴클레오티드는 동일한 유전자구축물로서 구성되어 있어도 좋다.

또한, 상기 키트에는 5-아자-2'-데옥시시티딘(5-aza-2'-deoxycytidine)이 포함되어 있어도 좋다. 상기 5-아자-2'-데옥시시티딘(5-aza-2'-deoxycytidine)에 따르면, 이미 기술한 바와 같이, 목적 단백질을 추가로 고발현시킬 수 있다.

기타, 상기 본 발명에 따른 키트에는 상기 실시형태 1∼7에서 설시한 본 발명의 방법을 실시하기 위해 필요한 시약, 기구 등이 포함되어 있을 수 있다. 예를 들면, 상기 각 폴리뉴클레오티드를 포유동물세포에 도입하기 위해 필요한 시약, 기 구가, 본 발명에 따른 키트에 포함되어 있어도 좋다. 게다가 상기 키트에는 포유동물세포, 해당 포유동물세포를 배양하기 위한 배지 등이 포함되어 있을 수 있다.

이하 첨부도면에 따라 실시예를 나타내며, 본 발명의 실시형태에 대해 더욱 상세하게 설명한다. 물론, 본 발명은 이하의 실시예에 한정되는 것이 아니며, 세부 사항에 대해서는 다양한 양태가 가능한 것은 물론이다. 또한, 본 발명은 상술한 실시형태에 한정되는 것은 아니며, 청구항에 나타낸 범위에서 여러 가지 변경이 가능하며, 각각 개시된 기술적 수단을 적절히 조합하여 얻어지는 실시형태에 대해서도 본 발명의 기술적 범위에 포함된다.

또한, 본 명세서 중에 기재된 학술문헌 및 특허문헌 모두가 본 명세서 중에서 참고로서 원용된다.

실시예

비교예 1, 참고예 1, 실시예 1∼10에서 사용하는 재료 및 방법을 이하에 나타낸다.

(플라스미드)

pSFVdhfr(11.0kbp)는 John Kolman 박사 및 Geoffrey M. Wahl 박사(The Salk Institute, San Diego, CA)로부터 제공받았다. pSFVdhfr은 히드로폴레이트 환원효소에 대해 3'-하류 영역으로부터 유래하는 Oriβ를 포함하는 4.6kbp 단편을 가지고 있다(『Dijkwel, P.A., and Hamlin, J. L. Matrix attachment regions are positioned near replication initiation sites, gene, and an interamplicon junction in the amplified dihydrofolate reductase domain of Chinese hamster ovary cells. Mol. Cell Biol., 8:5398-5409, 1988.』참조).

복제기점이 결여된 pSFV-V 플라스미드(6.4kbp)는 NotI 소화로 모든 디히드로폴레이트 환원효소 유래 서열을 삭제함으로써 pSFVdhfr로부터 구축되었다.

pSFVdhfr(GAP-GFP)는 pSFVdhfr의 히그로마이신 저항성 유전자 발현 유닛을 제거하고, 그 위치에, pEPBG plasmid(Salk Institute Geoffrey M. Wahl 박사로부터 수령)로부터 잘라낸 GAP-GFP 발현 유닛을, 전사가 IR의 방향을 향하도록 삽입함으로써 구축하였다.

pSFVdhfr/d2EGFP는 pSFVdhfr의 히그로마이신 저항성 유전자 발현 유닛을 제거하고, 그 위치에 TRE 프로모터, d2EGFP 구조 유전자, SV40 poly A 서열(pTRE-d2EGFP(클론테크) 유래)를 이 순서로, 전사가 IR의 방향을 향하도록 삽입함으로써 구축하였다.

(세포)

인간 결장직장의 COLO 320DM 및 COLO 320HSR 종양세포주(인간 대장암 COLO 320DM 세포주 및 인간 대장암 COLO 320HSR 세포주)는 『Shimizu, N., Kanda, T., and Wahlm G. M. Selective capture of acentricfragments by micronuclei provides a rapid method for purifying extrachromosomally amplified DNA. Nat. Genet., 12:65-71，1996.』의 기재에 따라 획득하여 유지하였다.

또한 상기 세포 및 해당 형질전환세포의 배양에 대해서도 상기 문헌에 따라 수행하였다. 간단하게는 상기 세포주를 RPMI 1640 배지(닛스이(日水)제약사 제품)으로 10% 소태아 혈청을 첨가한 배지 중에서 37℃, 5% CO₂ 존재하에서 배양하였다.

(리포펙션)

상기 모든 플라스미드를 Qiagen 플라스미드 정제 키트(Qiagen Inc., Valencia, CA)에 의해 정제하고, GenePorter 2 리포펙션 키트(Gene Therapy Systems, San Diego, CA)에 의해 세포로 트랜스펙션하였다.

(셀 소터에 의한 해석)

셀 소터를 사용하여 각 세포의 형광강도를 측정하였다. 측정은 생세포만을 게이트에 걸어 2만개의 세포를 소트하여 수행하였다. 또한, 셀 소터는 Becton Dickinson사 제품을 사용하며, 운전조건은 부속의 매뉴얼에 따랐다.

[ 비교예 1] IR 및 MAR 를 갖는 플라스미드를 사용한 유전자 증폭 및 mRNA 의 전사량의 측정

(방법)

인간 대장암 COLO 320DM 세포주는 인간 DHFR(dihydrofolate reductase) 유전자좌 유래의 IR과 MAR를 갖는 플라스미드(pSFVdhfr)을 리포펙션법으로 도입하였다. 또한, 대조군으로서, 인간 DHFR 유전자좌 유래의 IR과 MAR를 제외한 벡터 플라스미 드(pSFV)를 마찬가지로 리포펙션법에 의해 인간 대장암 COLO 320DM 세포주에 도입하였다.

양 플라스미드는 블라스티사이딘(Blasticidine) 저항성 유전자를 가지고 있어, 5㎍/ml의 블라스티사이딘(후나코시사 제품)으로 형질전환세포를 선택하였다.

(결과)

pSFVdhfr로 형질전환한 세포로부터는 플라스미드 서열이 이중미소염색체(DM) 상에서 유전자 증폭한 클론(colne 12)과 균일염색체영역(HSR) 상에서 증폭한 클론(clone 22)을 얻었다. 또한, 벡터 플라스미드 pSFV-V로 형질전환한 세포는 IR과 MAR를 갖지 않기 때문에 유전자 카피수는 증가하지 않지만, 다(多)카피 도입 형질전환세포를 얻었다.

이들 세포에 대해, 블라스티사이딘 저항성 유전자의 DNA량과, 전사된 mRNA량을 Competitive PCR법에 의해 정량하였다. 그 결과를 표 1에 나타낸다.

	유전자 카피수	RNA 발현량(상대비)
pSFV-V	12	1
pSFVdhfr clone 12	653	3.3
pSFVdhfr clone 22	3273	0.87

표 1에 나타낸 바와 같이, IR과 MAR를 갖는 플라스미드(pSFVdhfr)의 효과에 의해 블라스티사이딘 저항성 유전자의 카피수가 증가하여도, 블라스티사이딘 저항성 유전자의 mRNA의 전사량이 증가하지는 못하는 것이 판명되었다. 이는 목적 유전자를 포함하는 유전자 영역이 고도로 증폭함으로 인해 반복서열이 발생하고, 이 반복서열에 의해 전사억제가 일어나고 있는 것을 나타내었다.

[ 참고예 1] 발암과정에서 생긴 유전자 증폭영역으로부터 mRNA 로의 전사

인간 대장암 세포주 COLO 320DM(ATCC CCL220)은 환자 체내에서의 발암과정에서 c-myc 암유전자가 증폭하여, DM이나 HSR에 국소적으로 존재하는 것이 알려져 있다(『Alitalo, Kari, Schwab, Manfred, Lin, C.C., Varmus, Harold, Bishop, J. Michael, Homogenously staining chromosomal regions contain amplified copies of an abundantly expressed cellular oncogene(c-myc) in malignant neuroendocrine cells from a human colon carcinoma. Proc Natl Acad Sci USA. v80., p1701-1711』참조). 따라서, 해당세포에서 c-myc 암 유전자의 카피수와, mRNA의 전사량을 competitive PCR법으로 정량하였다. 또한, competitive PCR은 『shimizu et al., nature genetics 1996』에 기재된 방법에 준해 실시하였다.

그 결과를 표 2에 나타낸다.

	DNA 카피수	RNA 발현량(상대비)
WI-38	1	1
COLO 320DM	60	65
COLO 320HSR	24	33

표 2에 따르면 인간 대장암 세포주 COLO 320DM, 및 인간 대장암 세포주 COLO 320HSR에 대해, c-myc 암유전자의 카피 수에 비례한 mRNA의 전사가 검출되었다. 또한, 대조군으로서, 인간 정상 2배체 섬유아 세포주 WI-38을 사용하였다.

이상의 결과로부터, 발암과정에서 생긴 유전자 증폭영역으로부터 mRNA으로의 전사는 억제되고 있지 않음을 알 수 있었다.

상술한 비교예 1에서 나타낸 IR과 MAR를 갖는 플라스미드(pSFVdhfr)에 의한 반복서열과, 발암과정에서 생긴 반복서열과의 차이점은, 후자에서는 반복되고 있는 서열이 길다는 점(통상, 100∼200kbp), 및 반복서열이 재조합 등에 의해 복잡해지고 있는 점이다. 따라서, 비교예 1 및 참고예 1의 결과로부터, IR과 MAR를 갖는 플라스미드에 의해 발생하는 반복서열로부터 mRNA의 전사량을 높이기 위해서는 반복단위를 길게 하고 반복 구조를 복잡화하면 좋다는 것이 시사되었다.

[ 실시예 1] λ-파지 DNA 및 목적 유전자를 숙주세포에 도입한 경우의 효과

인간 DHFR(dihydrofolate reductase) 유전자좌 유래의 IR 및 MAR를 가지며, 항상적 프로모터(CA 프로모터)의 제어 하에, GFP(Green Fluorescence Protein) 유전자와 GAP(G-associated polypeptide) 유전자의 융합 단백질을 발현하는 플라스미드(pSFVdhfr(GAP-GFP)와 λ-파지 DNA를 중량비 1:2로 혼합하고, 이를 인간 대장암 세포 COLO 320DM 세포에 리포펙션법으로 도입하였다. 유전자 도입 2일 후부터, 플라스미드 상의 블라스티사이딘 내성 유전자에 대응하는 5㎍/ml의 블라스티사이딘(후나코시사 제품)으로 선택하고, 3∼4주간 후에 다수의 콜로니로 이루어진 형질전환세포를 얻었다.

도 1에 GFP의 형광강도를 셀 소터로 해석한 결과를 나타낸다. 도 1(a)는 대조군으로서 λ-파지 DNA를 혼합하지 않고 pSFVdhfr(GAP-GFP)만을 세포에 도입한 경우의 결과를 나타내며, 도 1(b)는 pSFVdhfr(GAP-GFP), 및 λ-파지 DNA를 혼합하여 세포를 도입한 경우(cotransfection)의 결과를 나타낸다. 동일 도면 중의 괄호 내에 형광강도의 평균값을 나타내었다.

대조군의 형광강도가 65.51이었던 것에 비해, pSFVdhfr(GAP-GFP) 및 λ-파지 DNA를 혼합하여 세포에 도입한 경우(cotransfection)의 형광강도가 85.27이었다. 따라서 코트랜스펙션함으로써, 목적 단백질인 GFP가 분명히 고발현하고 있다는 것을 알 수 있었다. 바꿔말하면, 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드와 λ-파지 DNA가 공동 증폭함으로써, 반복서열에 기인하는 단백질의 발현억제를 해제할 수 있음을 알 수 있었다.

[ 실시예 2] 인슐레이터 서열 및 목적 유전자를 숙주세포에 도입한 경우의 효과

(방법)

인간 DHFR 유전자좌 유래의 IR 및 MAR과 블라스티사이딘(Blasticidine) 저항성 유전자를 가지며, 또한, TRE-프로모터(테트라싸이클린 유도 프로모터)의 지배 하에 d2EGFP 유전자를 갖는 플라스미드(pSFVdhfr/d2EGFP)와, 조류 유래의 HS4 인슐레이터 서열(『Recillas-Traga, F. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., vol. 99, p6883-6888, (2002)』참조)를 갖는 플라스미드 DNA를 혼합하여, 인간 대장암 세포 COLO 320DM 세포에 리포펙션법으로 도입하였다. 또한, 조류 유래의 HS4 인슐레이터 서열을 갖는 플라스미드 DNA는 상기 Recillas-Targa, F.들의 논문에 기재된 1.2kbp의 5' HS4 인슐레이터 서열을 갖는 플라스미드를 사용하였다. 유전자 도입 2일 후부터, 플라스미드 상의 블라스티사이딘 내성 유전자에 대응하는 5㎍/ml의 블라스티사이딘(후나코시사 제품)으로 선택하여, 3∼4주간 후에 다수의 콜로니로 이루어진 형질전환세포를 얻었다.

유전자 도입 2일 후부터, 플라스미드 상의 블라스티사이딘 내성 유전자에 대응하는 5㎍/ml의 블라스티사이딘(후나코시사 제품)으로 선택하여, 3∼4주간 후에 다수의 콜로니로 이루어진 형질전환세포를 얻었다. 그 후, 연이은 배양(3∼6일 마다)시마다 단계적으로 배지 중의 블라스티사이딘의 농도를 배증(倍增)시켜 형질전환세포를 선택하였다(최종농도 320㎍/ml).

(결과)

도 2에 GFP의 형광강도를 셀 소터로 해석한 결과를 나타내었다.

도 2(a)는 대조군으로서 pSFVdhfr/d2EGFP만을 세포에 도입한 경우의 결과를 나타내고, 도 2(b)는 pSFVdhfr/d2EGFP만을 세포에 도입하고, 80㎍/ml의 블라스티사이딘으로 선택을 추가로 한 경우의 결과를 나타내며, 도 2(c)는 pSFVdhfr/d2EGFP와, 조류 유래의 HS4 인슐레이터 서열을 갖는 플라스미드 DNA를 혼합하여 세포에 도입한 결과를 나타내고, 도 2(d)는 pSFVdhfr/d2EGFP와, 조류 유래의 HS4 인슐레이터 서열을 갖는 플라스미드 DNA를 혼합하여 세포에 도입하고, 80㎍/ml의 블라스티사이딘으로 선택을 추가로 한 경우의 결과를 나타낸다. 동일 도면 중의 괄호 안에 형광강도의 평균값(평균형광강도)을 나타내었다.

또한, 해당 방법에 의한 형광강도의 검출한계는 1이며, 그 이하의 형광강도는 모두 1로 검출되어 버린다. 이러한 사정을 감안하여, 도 2(a)∼(d)의 결과를 보다 상세하게 검토하기 위해, 각각의 시험구에 대해, 전체 생세포(1만개) 중 형광강도가 2이상인 세포의 비율(cell %)과, 형광강도가 2 이상인 세포의 형광강도의 평균값의 곱을 구하여, 그 값(이하, '적산형광강도'라 한다. 이하에 나타낸 다른 실시예에서도 동일.)을 도면 중에 사각으로 에워싸인 문자로 표시하였다.

도 2(a)에 나타낸 대조군의 평균형광강도가 2.73이며, 적산형광강도가 61.5인 것에 비해, 도 2(c)에 나타낸 pSFVdhfr/d2EGFP와, 조류 유래의 HS4 인슐레이터 서열을 갖는 플라스미드 DNA을 혼합하여 세포에 도입한 경우의 평균형광강도가 7.14이며, 적산형광강도가 312이었다. 따라서, 목적 단백질을 코딩하는 유전자와 조류 유래의 HS4 인슐레이터 서열을 코트랜스펙션하여 공동증폭함으로써, 목적 단백질인 d2EGFP가 확실히 고발현하고 있음을 알 수 있었다.

또한, 도 2(a)에 나타낸 대조군의 평균형광강도가 2.73이며, 적산형광강도가 61.5이었던 것에 비해, 도 2(b)에 나타낸 pSFVdhfr/d2EGFP만을 세포에 도입하고, 80㎍/ml의 블라스티사이딘으로 선택을 추가로 한 경우의 평균형광강도가 6.09이며, 적산형광강도가 542이었다. 한편, 도 2(c)에 나타낸 pSFVdhfr/d2EGFP와, 조류 유래의 HS4 인슐레이터 서열을 갖는 플라스미드 DNA를 혼합하여 세포에 도입한 경우의 평균형광강도가 7.14이며, 적산형광강도가 312이었던 것에 비해, 도 2(d)에 나타낸 pSFVdhfr/d2EGFP와, 조류 유래의 HS4 인슐레이터 서열을 갖는 플라스미드 DNA를 혼합하여 세포에 도입하고, 80㎍/ml의 블라스티사이딘으로 선택을 추가로 한 경우의 평균형광강도가 9.65이며, 적산형광강도 941이었다.

따라서, 유전자 증폭이 일어난 세포를 블라스티사이딘의 농도를 단계적으로 높이면서 선택함으로써, 목적 단백질의 발현을 높일 수 있음을 알 수 있었다. 또한, 목적 단백질을 코딩하는 유전자와 조류 유래의 HS4 인슐레이터 서열을 코트랜스펙션하여 공동 증폭시킨 후에, 다시 블라스티사이딘의 농도를 단계적으로 높이면서 세포를 선택함으로써, 목적 단백질인 d2EGFP의 발현이 더욱 높아짐을 알 수 있었다. 바꿔말하면, 목적 단백질의 발현을 높이기 위한 수단을 복수 조합함으로써, 추가적인 단백질의 고발현을 수행할 수 있음을 알 수 있었다.

[ 실시예 3] 단계적으로 선택약제농도를 높여 형질전환세포를 선택하는 효과

(방법)

인간 DHFR 유전자좌 유래의 IR 및 MAR과, 블라스티사이딘(Blasticidine) 저항성 유전자를 가지며, 또한, TRE-프로모터(테트라싸이클린 유도 프로모터)의 지배하에 d2EGFP 유전자를 갖는 플라스미드(pSFVdhfr/d2EGFP)를, 인간 대장암 세포 COLO 320DM 세포에 리포펙션법으로 도입하였다. 형질전환한 세포를 5㎍/ml의 블라스티사이딘(후나코시사 제품)으로 선택하여, 형질전환한 다수의 클론을 취득하였다. 해당 클론을 혼합한 후, 배양을 계속하였다. 3∼5일 간격의 연이은 배양시마다, 배지 중의 블라스티사이딘 농도를 배증(倍增)시켰다(5㎍/ml∼320㎍/ml). 여러 가지 블라스티사이딘 농도로 선택된 세포의 각각에 대해, 독시사이클린(클론테크사 제품)을 1㎍/ml가 되도록 배지에 첨가함으로써 TRE-프로모터를 활성화하여, d2EGFP(반감기가 통상의 EGFP에 비해 훨씬 짧다)의 발현을 유도하였다.

(결과)

세포당 d2EGFP 발현량을 셀 소터로 해석한 결과를 도 3에 나타낸다.

도 3(a)는 5㎍/ml의 블라스티사이딘으로 선택한 경우의 결과를 나타내며, 도 3(b)는 10㎍/ml의 블라스티사이딘으로 선택한 경우의 결과를 나타내고, 도 3(c)는 40㎍/ml의 블라스티사이딘으로 선택한 경우의 결과를 나타내며, 도 3(d)는 160㎍/ml의 블라스티사이딘으로 선택한 경우의 결과를 나타내고, 도 3(e)는 320㎍/ml의 블라스티사이딘으로 선택한 경우의 결과를 나타내었다. 동일한 도면 중의 괄호 내에 형광강도의 평균값(평균형광강도)을 나타내었다. 또한, 동일한 도면 중, 사각으로 둘러싸인 문자로 적산형광강도를 표시하였다.

도 3(a)에 따르면, 5㎍/ml의 블라스티사이딘으로 선택을 한 세포의 평균형광강도는 2.94, 적산형광강도는 222이고, 도 3(b)에 따르면 10㎍/ml의 블라스티사이딘으로 선택을 한 세포의 평균형광강도는 3.77, 적산형광강도는 322이며, 도 3(c)에 따르면 40㎍/ml의 블라스티사이딘으로 선택을 한 세포의 평균형광강도는 6.67, 적산형광강도는 640이고, 도 3(d)에 따르면 160㎍/ml의 블라스티사이딘으로 선택을 한 세포의 평균형광강도는 9.47, 적산형광강도는 929이며, 도 3(e)에 따르면 320㎍/ml의 블라스티사이딘으로 선택을 한 세포의 평균형광강도는 18.55, 적산형광강도는 1850이었다.

따라서, 형질전환한 세포를 선택할 때 약제 농도를 점차 높임으로써, 목적 단백질의 발현량을 증가시킬 수 있음을 알 수 있었다.

[ 실시예 4] 목적 단백질의 발현을 제어하는 프로모터의 전사활성화 인자를 고발현시키는 효과

(방법)

TRE-프로모터의 전사활성화 인자(Tet-ON 단백질)를 코딩하는 Tet-ON 유전자를 갖는 pTet-ON 플라스미드(클론테크사 제품)를 인간 대장암 COLO 320DM 세포에 리포펙션법으로 도입하고, 안정된 형질전환세포를 히그로마이신으로 선택하였다. 이와 같은 세포(이하, 'Tet-ON 세포'라 한다)에, 인간 DHFR 유전자좌 유래의 IR 및 MAR과 블라스티사이딘(Blasticidine) 저항성 유전자를 가지며, 또한 TRE-promoter(테트라싸이클린 유도 프로모터)의 지배하에 d2EGFP 유전자를 갖는 플라스미드(pSFVdhfr/d2EGFP)와, 조류 유래의 HS4 인슐레이터 서열을 갖는 플라스미드를 혼합하여 리포펙션법으로 도입하고, 블라스티사이딘으로 안정된 형질전환체를 선택하였다. 또한, 해당 조류 유래의 HS4 인슐레이터 서열을 갖는 플라스미드는 실시예 2에 기재된 것을 사용하였다.

이어, 이와 같은 세포에 대해, 추가로 pTet-ON 플라스미드를 재차 리포펙션법으로 도입하여 2일 후의 일과성 발현 시기에 d2EGFP 발현량을 검토하였다.

일반적으로, 해당 안정된 형질전환세포는 Tet-ON 단백질(rtTA)의 발현레벨은 낮은 것에 비해, 일과성 발현의 경우는 그 발현레벨이 높다. 따라서, 안정된 형질전환세포의 d2EGFP의 발현량을 Tet-ON 단백질 통상발현인 경우의 결과로 하고, 일과성 발현인 경우의 d2EGFP의 발현량을 Tet-ON 단백질 고발현인 경우의 결과로 하여 비교하였다.

(결과)

도 4에 각종 세포의 위상차 현미경 이미지, 형광 현미경 이미지를 나타내었다. 또한, 각 세포당 d2EGFP 발현량을 셀 소터로 해석한 결과를 도 5에 나타내었다.

도 4(a)는 Tet-ON 단백질 통상발현 세포에 대한 위상차 현미경 이미지(×200)이며, 도 4(b)는 Tet-ON 단백질 고발현 세포에 대한 위상차 현미경 이미지(×200)이고, 도 4(c)는 Tet-ON 단백질 통상발현 세포에 대한 형광 현미경 이미지(×200)이며, 도 4(d)는 Tet-ON 단백질 고발현 세포에 대한 형광 현미경 이미지(×200)이다.

또한, 도 5(a), (b)는 복제기점도 핵 매트릭스 결합영역도 갖지 않는 상기 pSFV-V 플라스미드에 TRE-프로모터의 지배를 받은 d2EGFP 유전자를 삽입함으로써 구축한 플라스미드를 도입한 세포에 대해 Tet-ON 단백질 통상발현인 경우(도 5(a)), 및 pSFV-V 플라스미드에 TRE-프로모터의 지배를 받은 d2EGFP 유전자를 삽입함으로써 구축한 플라스미드를 도입한 세포에 대해 Tet-ON 단백질 고발현인 경우(도 5(b))의 형광강도를 각각 나타내고, 도 5(c), (d)는 조류 유래의 HS4 인슐레이터 서열을 pSFVdhfr/d2EGFP와 동시에 증폭시킨 세포에 대해 Tet-ON 단백질 통상발현인 경우의 결과(도 5(c)), 및 조류 유래의 HS4 인슐레이터 서열을 pSFVdhfr/d2EGFP와 동시 증폭시킨 세포에 대해 Tet-ON 단백질 고발현인 경우(도 5(d))의 형광강도를 나타내었다. 동일 도면 중의 괄호 안에 형광강도의 평균값(평균형강강도)을 나타내었다. 또한, 동일 도면 중, 사각으로 에워싸인 문자로 적산형광강도를 나타내었다.

도 4(a)∼(d)에 따르면, Tet-ON 단백질이 통상발현하고 있는 안정된 형질전환세포의 형광에 비해, Tet-ON 단백질이 고발현하고 있는 세포의 형광이 분명하게 증가하고 있음을 알 수 있었다(특히, 도 4(c), (d) 참조).

또한, 도 5(a)의 평균형광강도가 1.02, 적산형광강도가 0.787인 것에 비해, 도 5(b)의 평균형광강도가 1.21, 적산형광강도가 18.1로 되어 있으며, 또한 도 5(c)의 평균형광강도가 5.80, 적산형광강도가 532인 것에 비해, 도 5(d)의 평균형광강도가 8.15, 적산형광강도가 766으로 되어 있기 때문에, 유전자 증폭의 카피수에 따르지 않고, Tet-ON 단백질이 고발현하고 있는 경우에 형광강도가 증가하는, 즉 목적 단백질의 발현량이 증가함을 알 수 있었다. 또한, 조류 유래의 HS4 인슐레이터 서열과 동시에 증폭시키고, 또한 Tet-ON 단백질이 고발현하고 있는 세포의 형광강도(도 5(d))가 가장 높았기(평균형광강도: 8.15, 적산형광강도: 766)때문에, 목적 단백질의 발현을 높이기 위한 수단을 복수 조합함으로써, 추가적인 단백질의 고발현을 수행할 수 있음을 알 수 있었다.

[ 실시예 5] 증폭영역 중의 목적 단백질을 코딩하는 유전자를 염색체 밖으로 잘라내는 효과

(방법)

pSFVdhfr/d2EGFP 플라스미드의 히그로마이신(Hygromycine) 저항성 유전자를 제거하고, 합성 loxP 서열(46bp)을 블라스티사이딘(Blasticidine) 저항성 유전자의 하류에 삽입한 플라스미드를 구축하였다. 또한, 상기 loxP 서열(46bp)은 5'-GCGCGGCCGCATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTATGCGGCCGCGC-3'(서열번호 1)에 기재된 염기서열을 갖는 DNA 단편을 공지의 DNA 합성기에 의해 합성한 것을 사용하였다. 또한, 상기 loxP 서열의 양단(5' 말단 및 3' 말단)의 GCGGCCGC는 클로닝을 위한 NotⅠ인식서열이다.

상기 플라스미드를 인간 대장암 세포 COLO 320DM 세포에 리포펙션법으로 도입하였다. 형질전환한 세포를 5㎍/ml의 블라스티사이딘으로 선택하였다. 해당 형질전환세포를 Cre 리컴비나제(Cre Recombinase) 유전자를 갖는 플라스미드(Rolf Sprengel 박사(Max-Planck-Institu, Germany)로부터 수령하였다.『Shimshek, D. R., J. Kim, M. R. Hubner, D. J. Spergel, F. Buchholz, E. Casanova, A. F. Stewart, P. H. Seeburg, and R. Sprengel. 2002, Codon-improved Cre recombinase(iCre) exprossion in the mouse. Genesis. 32:19-26』참조)로 형질전환하고, 1주간 배양을 실시하였다.

(결과)

도 6에 각종 세포의 위상차 현미경 이미지, 형광 현미경 이미지를 나타내었다. 도 6(a)는 Cre 리컴비나제(Cre Recombinase) 유전자를 도입하기 전의 세포에 대한 위상차 현미경 이미지(×200)이며, 도 6(b)는 Cre 리컴비나제(Cre Recombinase) 유전자를 도입한 후의 세포에 대한 위상차 현미경 이미지(×200)이고, 도 6(c)는 Cre 리컴비나제(Cre Recombinase) 유전자를 도입하기 전의 세포에 대한 형광 현미경 이미지(×200)이며, 도 6(d)는 Cre 리컴비나제(Cre Recombinase) 유전자를 도입한 후의 세포에 대한 형광 현미경 이미지(×200)이다.

도 6(a)∼(d)에 따르면, Cre 리컴비나제(Cre Recombinase) 유전자를 도입하기 전 세포의 형광에 비해, Cre 리컴비나제(Cre Recombinase) 유전자를 도입한 후의 세포의 형광이 분명하게 증가하였었다(특히 도 6(c), (d) 참조). 따라서, 유전자 증폭에 의해 반복서열을 발생하고 있는 유전자영역을 염색체 외로 잘라냄으로써, 발현이 억제된 목적 단백질을 발현시킬 수 있음을 알 수 있었다.

[ 실시예 6] 5- 아자 -2'- 데옥시시티딘(5-aza-2'-deoxycytidine)로 세포를 처리하는 효과

(방법)

인간 DHFR 유전자좌 유래의 IR 및 MAR과, 블라스티사이딘(Blasticidine) 저항성 유전자를 가지며, 또한, TRE-프로모터(테트라싸이클린 유도 프로모터)의 지배 하에 d2EGFP 유전자를 갖는 플라스미드(pSFVdhfr/d2EGFP)와, 조류 유래의 HS4 인슐레이터 서열을 갖는 플라스미드 DNA(실시예 2에 기재된 것과 동일)를 혼합하여, 인간 대장암 세포 COLO 320DM 세포에 리포펙션법으로 도입하였다. 유전자 도입 2일 후부터, 플라스미드 상의 블라스티사이딘 내성 유전자에 대응하는 5㎍/ml의 블라스티사이딘(후나코시사 제품)으로 선택하여, 3∼4주간 후에 다수의 콜로니로 이루어진 형질전환세포를 얻었다.

해당 형질전환세포의 배양액 중에, 1μM 또는 3μM의 5-아자-2'-데옥시시티딘(5-aza-2' deoxycytidine, 적당히 '5-aza'라 한다. Sigma사 제품)을 첨가하여 3일간 처리를 하였다. 또한, 비교를 위해, 반복서열로부터의 유전자 발현을 높이는 물질로서 공지의 트리코스타틴 A(Trichostatin A, 적당히 'TSA'라 한다; 히스톤 탈아세틸화 저해제, Sigma사 제품)를 형질전환세포의 배양액 중에 20nM 첨가한 경우에 대해서도 검토하였다.

(결과)

도 7에 각종 세포의 위상차 현미경 이미지, 형광 현미경 이미지를 나타내었다. 또한, 각 세포당 d2EGFP 발현량을 셀 소터로 해석한 결과를 도 8에 나타내었다.

도 7(a)는 5-aza 처리전의 세포에 대한 위상차 현미경 이미지(×200)이며, 도 7(b)는 1μM의 5-aza 처리후의 세포에 대한 위상차 현미경 이미지(×200)이고, 도 7(c)는 5-aza 처리전 세포에 대한 형광 현미경 이미지(×200)이며, 도 7(d)는 1μM 5-aza 처리후의 세포에 관한 형광 현미경 이미지(×200)이다.

또한, 도 8(a)는 5-aza 처리전 세포의 형광강도를 나타내며, 도 8(b)는 20nM의 TSA 처리후 세포의 형광강도를 나타내고, 도 8(c)는 1μM의 5-aza로 처리한 세포의 형광강도를 나타내며, 도 8(d)는 1μM의 5-aza 및 20nM의 TSA로 처리한 세포의 형광강도를 나타내고, 도 8(e)는 3μM의 5-aza로 처리한 세포의 형광강도를 나타내며, 도 8(f)는 3μM의 5-aza 및 20nM의 TSA로 처리한 세포의 형광강도를 나타내었다. 동일 도면 중의 괄호 안에 형광강도의 평균값(평균형광강도)을 나타내었다. 또한, 동일 도면 중, 사각으로 에워싼 문자로 적산형광강도를 나타내었다.

도 7(a)∼(d)에 따르면, 5-aza 처리전 세포의 형광에 비해, 5-aza 처리후 세포의 형광이 분명하게 증가하고 있음을 알 수 있었다(특히 도 7(c) 및 (d) 참조).

또한, 도 8(a)에 나타낸 5-aza 처리전 세포의 평균형광강도가 4.29이고, 적산형광강도 364인 것에 비해, 도 8(c)에 나타낸 1μM의 5-aza로 처리한 세포의 평균형광강도가 9.48, 적산형광강도가 895이었다. 따라서, 5-aza에 의한 처리에 의해 분명하게 목적 단백질인 d2EGFP가 고발현함을 알 수 있었다. 또한, 도 8(e)에 나타낸 대로, 3μM의 5-aza로 처리한 세포의 평균형광강도가 10.93이고, 적산형광강도가 1040로서, 1μM의 5-aza로 처리한 세포의 형광강도보다도 더욱 증가하고 있는 것을 볼 때, 처리를 하는 5-aza의 농도를 증가시킴으로써, 목적 단백질의 발현을 보다 증가시킬 수 있음을 알 수 있었다.

한편, 도 8(b)에 나타낸 20nM의 TSA 처리후 세포의 평균형광강도가 3.02, 적산형광강도가 228이며, 처리전 세포의 평균형광강도가 4.29, 적산형광강도가 364(도 8(a))이었던 것을 볼 때, 20nM의 TSA 처리에 의해서는 목적 단백질을 고발현시킬 수 없음을 알 수 있었다. 또한, 1μM의 5-aza로 처리한 세포의 평균형광강도가 9.48, 적산형광강도가 895(도 8(c))인 것에 비해, 1μM의 5-aza 및 20nM의 TSA로 처리한 세포의 평균형광강도가 9.40, 적산형광강도가 878(도 8(d))이며, 3μM의 5-aza로 처리한 세포의 평균형광강도가 10.93, 적산형광강도가 1040(도 8(e))인 것에 비해, 3μM의 5-aza 및 20nM의 TSA로 처리한 세포의 평균형광강도가 11.09, 적산형광강도가 1050(도 8(f))이었다. 따라서, 5-aza와 TSA를 병용한 경우일지라도, 목적 단백질의 발현을 증가시킬 수 없음을 알 수 있었다.

[ 실시예 7] 유전자 증폭이 DM 상에서 일어나고 있는 클론을 선택하는 효과

(방법)

TRE-프로모터의 전사활성화 인자(Tet-ON 단백질)를 코딩하는 Tet-ON 유전자를 갖는 pTet-ON 플라스미드(클론테크사 제품)를, 인간 대장암 COLO 320DM에 리포펙션법으로 도입하고, Tet-ON 단백질을 안정되게 발현하는 형질전환세포(이하, 'Tet-ON 세포'라 한다)를 히그로마이신으로 선택하였다.

이어, pSFVdhfr/d2EGFP 플라스미드를, 상기 Tet-ON 세포에 리포펙션법으로 도입하고, 5㎍/ml 블라스티사이딘으로 약 3주간 선택함으로써, 안정된 형질전환세포의 다클론성 집단을 얻었다.

상기 다클론성 집단에 대해, 독시사이클린(Doxycycline, 클론텍크사 제품)을 1㎍/ml이 되도록 배지 중에 첨가함으로써 TRE-프로모터를 활성화하여, d2EGFP의 발현을 유도하였다. 이 때의 d2EGFP 발현량을 셀 소터로 해석한 결과를 도 9에 나타내었다. 동일 도면 중의 괄호 내에 형광강도의 평균값(평균형광강도)을 나타내었다. 또한, 동일 도면 중, 사각으로 에워싸인 문자로 적산형광강도를 나타내었다. 동일 도면의 결과로부터, 상기 다클론성 집단은 확실히 d2EGFP를 발현하는 집단임을 확인하였다(평균형광강도:6.25, 적산형광강도:536).

상기 다클론성 집단으로부터, 한계희석법에 의해 임의의 30클론을 얻었다. 한계희석법은 30세포/ml의 저세포농도로 6 웰 플레이트(well plate)에 접종하고 10일∼2주간 배양하여 콜로니를 형성시킴으로써 수행하였다.

이어, 각 클론에 대해, 형광 현미경으로 관찰하여 d2EGFP 발현레벨이 높은 4 클론(클론 4, 클론 5, 클론 6, 및 클론 9)을 선택하였다. 해당 4클론에 대해 분열기 염색체 표본을 조제하여, 도입한 pSFVdhfr/d2EGFP 플라스미드 유래의 염기서열을 FISH법에 의해 검출하였다. 분열기 염색체 표본의 제작과 FISH법은 『Shimizu, N., Kanda, T., and Wahl, G. M. Selective capture of acentricfragments by micronuclei provides a rapid method for purifying extrachromosomally amplified DNA. Nature Genet., 12:65-71, 1996.』에 기재된 방법에 의해 수행하였다.

FISH법에 의해 pSFVdhfr/d2EGFP 플라스미드 유래의 염기서열을 검출한 결과를 도 10에 나타낸다. 도 10(a)은 클론 4의 결과이며, 도 10(b)는 클론 5의 결과이고, 도 10(c)는 클론 6의 결과이며, 도 10(d)는 클론 9의 결과이다. 또한, 검출한 pSFVdhfr/d2EGFP 플라스미드 유래의 염기서열을 동일 도면 중 화살표로 나타내었다.

도 10의 결과로부터, 클론 4, 클론 5 및 클론 6은 pSFVdhfr/d2EGFP 플라스미드 유래의 염기서열이 HSR 상에서 증폭되었던 것에 비해, 클론 9는 DM상에서 증폭하였음을 알 수 있었다.

이어, 상기 4클론에 대해, 독시사이클린(Doxycycline, 클론테크사 제품; 1㎍/ml)에 의한 유도를 수행함과 아울러, 5-aza(0μM, 1μM, 또는 3μM)을 배지중에 첨가하였다. 배양 1주간 후, 각 클론의 d2EGFP 발현량을 셀 소터에 의해 해석하였다.

그 결과를 도 11, 12, 13 및 14에 나타내었다. 도 11은 클론 4의 결과를 나타내고 있으며, 동일 도면 (a)는 5-aza를 배지중에 첨가하지 않은 경우(0μM)의 결과를 나타내며, 동일 도면 (b)는 5-aza를 1μM이 되도록 배지 중에 첨가한 경우의 결과를 나타내고, 동일 도면 (c)는 5-aza를 3μM이 되도록 배지 중에 첨가한 경우의 결과를 나타낸다.

도 12는 클론 5의 결과를 나타내고 있으며, 동일 도면 (a)는 5-aza를 배지 중에 첨가하지 않은 경우(0μM)의 결과를 나타내고, 동일 도면 (b)는 5-aza를 1μM이 되도록 배지 중에 첨가한 경우의 결과를 나타내며, 동일 도면 (c)는 5-aza를 3μM이 되도록 배지 중에 첨가한 경우의 결과를 나타낸다.

도 13은 클론 6의 결과를 나타내고 있으며, 동일 도면 (a)는 5-aza를 배지중에 첨가하지 않은 경우(0μM)의 결과를 나타내며, 동일 도면 (b)는 5-aza를 1μM이 되도록 배지중에 첨가한 경우의 결과를 나타내고, 동일 도면 (c)는 5-aza를 3μM이 되도록 배지중에 첨가한 경우의 결과를 나타낸다.

도 14는 클론 9의 결과를 나타내고 있으며, 동일 도면 (a)는 5-aza를 배지중에 첨가하지 않은 경우(0μM)의 결과를 나타내며, 동일 도면 (b)는 5-aza를 1μM이 되도록 배지중에 첨가한 경우의 결과를 나타내고, 동일 도면 (c)는 5-aza를 3μM이 되도록 배지중에 첨가한 경우의 결과를 나타낸다.

도 11∼13 중의 괄호 안에 형광강도의 평균값(평균형광강도)을 나타내었다. 또한, 동일 도면 중, 사각으로 에워싼 문자로 적산형광강도를 표시하였다.

도 11에서, 클론 4에 대해, 5-aza를 배지 중에 첨가하지 않은 경우(0μM)의 d2EGFP의 발현레벨을 나타내는 평균형광강도는 1.89, 적산형광강도는 90.0이며, 5-aza를 1μM이 되도록 배지 중에 첨가한 경우의 평균형광강도는 5.46, 적산형광강도는 453이며, 5-aza를 3μM이 되도록 배지 중에 첨가한 경우의 평균형광강도는 23.76, 적산형광강도는 2300이었다.

도 12에서, 클론 5에 대해, 5-aza를 배지 중에 첨가하지 않은 경우(0μM)의 d2EGFP의 발현레벨을 나타내는 평균형광강도는 1.02, 적산형광강도는 1.11이며, 5-aza를 1μM이 되도록 배지 중에 첨가한 경우의 평균형광강도는 2.23, 적산형광강도는 126이며, 5-aza를 3μM이 되도록 배지 중에 첨가한 경우의 평균형광강도는 10.44, 적산형광강도는 962이었다.

도 13에서, 클론 6에 대해, 5-aza를 배지 중에 첨가하지 않은 경우(0μM)의 d2EGFP의 발현레벨을 나타내는 평균형광강도는 1.16, 적산형광강도는 8.84이며, 5-aza를 1μM이 되도록 배지중에 첨가한 경우의 평균형광강도는 2.09, 적산형광강도는 111이며, 5-aza를 3μM이 되도록 배지 중에 첨가한 경우의 평균형광강도는 10.87, 적산형광강도는 1000이었다.

도 14에서, 클론 9에 대해, 5-aza를 배지 중에 첨가하지 않은 경우(0μM)의 d2EGFP의 발현레벨을 나타내는 평균형광강도는 41.46, 적산형광강도는 4130이며, 5-aza를 1μM이 되도록 배지 중에 첨가한 경우의 평균형광강도는 131.86, 적산형광강도는 13200이며, 5-aza를 3μM이 되도록 배지 중에 첨가한 경우의 평균형광강도는 248.60, 적산형광강도는 24900이었다.

도 11∼14의 결과로부터, pSFVdhfr/d2EGFP 플라스미드 유래의 염기서열이 HSR 상에서 증폭하고 있는 클론(클론 4, 클론 5, 클론 6)에서는 d2EGFP의 발현레벨은 극히 낮지만, 5-aza를 배지 중에 첨가함으로써 향상됨을 알 수 있다. 한편, pSFVdhfr/d2EGFP 플라스미드 유래의 염기서열이 DM상에서 증폭되고 있는 클론(클론 9)에서는 5-aza를 배지중에 첨가하지 않아도 d2EGFP가 높은 발현레벨(평균형광강도: 41.46, 적산형광강도: 4130)이며, 또한 5-aza를 배지 중에 첨가함으로써 그것이 비약적으로 높아짐을 알 수 있었다(평균형광강도 : 131.86 또는 248.60, 적산형광강도 : 13200 또는 24900).

따라서, 유전자 증폭이 DM 상에서 일어난 클론을 선택하는 것에 의해, 목적 단백질을 고발현 시킬 수 있다는 것을 알 수 있었다.

[ 실시예 8] 코트랜스펙션에 의해, 목적 단백질의 발현을 제어하는 프로모터의 전사활성화 인자를 고발현시키는 효과

(방법 및 결과)

인간 DHFR 유전자좌 유래의 IR 및 MAR과, 블라스티사이딘(Blasticidine) 저항성 유전자를 가지며, 또한 TRE-프로모터(테트라싸이클린 유도 프로모터)의 지배하에 d2EGFP 유전자를 갖는 플라스미드(pSFVdhfr/d2EGFP)와 TRE-promoter의 전사활성화 인자(Tet-ON 단백질)을 코딩하는 Tet-ON 유전자를 갖는 pTet-ON 플라스미드(클론테크사 제품)를 등량 혼합하고, 동시에 리포펙션법에 의해 인간 대장암 COLO 320DM 세포로 도입하였다. 5㎍/ml 블라스티사이딘으로 선택함으로써, 형질전환세포의 다클론성 집단을 얻었다. 해당 다클론성 집단의 세포배양에, 독시사이클린(클론테크사 제품)을 1㎍/ml가 되도록 배지중에 첨가함으로써 TRE-프로모터를 활성화하여, d2EGFP의 발현을 유도하였다.

상기 다클론성 집단에 대해, 독시사이클린(Doxycycline) 첨가 전의 위상차 현미경 이미지(×200)를 도 15(a)에 나타내고, 형광 현미경 이미지(×200)를 도 15(b)에 나타내었다. 또한, 동일한 다클론성 집단에 대해, 독시사이클린(Doxycycline) 첨가 후의 위상차 현미경 이미지(×200)를 도 15(c)에 나타내었으며, 형광 현미경 이미지(×200)를 도 15(d)에 나타내었다.

도 15(a)∼(d)에 따르면, 독시사이클린(Doxycycline) 첨가 전에는 미약한 발현밖에 볼 수 없었던 d2EGFP의 형광에 대해, 독시사이클린(Doxycycline) 첨가로 인해 d2EGFP의 형광을 강하게 볼 수 있게 되었다. 따라서, pSFVdhfr/d2EGFP와 pTet-ON 플라스미드를 동시에 도입한 형질전환세포의 다클론성 집단과 관련하여, 독시사이클린(Doxycycline, 클론테크사 제품)을 배지 중에 첨가함으로써 TRE-프로모터를 활성화하여, d2EGFP의 발현을 유도할 수 있음을 확인하였다.

이어, 독시사이클린(Doxycycline) 첨가에 의한 d2EGFP의 발현 유도를 실시한 후의, d2EGFP의 발현량의 시간경과에 따른 변화를 셀 소터에 의해 해석하였다. 그 결과를 도 16에 나타내었다. 도 16(a)는 독시사이클린 첨가 전의 결과이며, 도 16(b)는 독시사이클린 첨가 1시간 후의 결과이고, 도 16(c)는 독시사이클린 첨가 3시간 후의 결과이며, 도 16(d)는 독시사이클린 첨가 6시간 후의 결과이고, 도 16(e)는 독시사이클린 첨가 15시간 후의 결과이며, 도 16(f)는 독시사이클린 첨가 24시간 후(1일 후)의 결과이고, 도 16(g)는 독시사이클린 첨가 48시간 후(2일 후)의 결과이며, 도 16(h)는 독시사이클린 첨가 120 시간 후(5일 후)의 결과이고, 도 16(i)는 독시사이클린 첨가 2주간 후의 결과이다. 동일한 각 도면 중의 괄호 안에 형광강도의 평균값(평균형광강도)을 나타내었다. 또한, 동일 도면 중, 사각으로 에워싼 문자로 적산형광강도를 나타내었다.

또한, d2EGFP 발현량의 평균값(즉, 평균형광강도 : 도면 중 검은 원의 심볼로 나타냄) 및 생세포율(전체 세포수에 대한 생세포의 비율: 도면 중 흰 원의 심볼로 나타냄)을 시간에 대해 플롯한 그래프를 도 17에 나타낸다. 도 17에 따르면, 상기에서 취득한 다클론성 집단에서는 독시사이클린을 첨가하기 전에는 d2EGFP의 발현량을 극히 낮지만, 독시사이클린 첨가 1∼2일 후에 발현량은 피크에 달했으며, 그 발현량은 2주간(동일 도면 중 '2wk'로 표기)을 경과하여도 높은 레벨에 있었다. 또한, 동일한 다클론성 집단은 독시사이클린에 의한 d2EGFP의 발현유도에 의해, 세포의 생존률이 저하되는 일이 없으며, 높은 레벨로 d2EGFP를 발현하면서 정상적으로 증식을 계속하였다.

또한, 음성 대조로서, 복제기점도 핵 매트릭스 결합 영역도 갖지 않는 상기 pSFV-V 플라스미드에 TRE-프로모터에 지배되는 d2EGFP 유전자를 삽입함으로써 구축한 플라스미드를, Tet-ON 세포에 도입하여 취득한 형질전환세포의 다클론성 집단에 대해, 상기와 마찬가지로 독시사이클린에 의한 d2EGFP의 발현 유도를 실시하고, 셀 소터에 의해 d2EGFP의 발현을 해석한 결과를 도 16(j)에 나타내었다. 도 16(j)에 따르면, 음성대조의 d2EGFP 발현레벨을 나타내는 평균형광강도는 1.02, 적산형광강도는 0.787이었다.

이에 비해, 독시사이클린(Doxycycline) 첨가 1시간 후의 평균형광강도는 2.99, 적산형광강도는 216이며(도 16(b)), 독시사이클린 첨가 3시간 후의 평균형광강도는 3.72, 적산형광강도는 293이며(도 16(c)이고, 독시사이클린 첨가 6시간 후의 평균형광강도는 4.22, 적산형광강도는 341이며(도 16(d)), 독시사이클린 첨가 15시간 후의 평균형광강도는 9.24, 적산형광강도는 841이며(도 16(e)), 독시사이클린 첨가 24시간 후의 평균형광강도는 28.77, 적산형광강도는 2800이며(도 16(f)), 독시사이클린 첨가 48시간 후(2일 후)의 평균형광강도는 53.97, 적산형광강도는 5320이며(도 16(g)), 독시사이클린 첨가 120시간 후(5일 후)의 평균형광강도는 39.56이며, 적산형광강도는 3880이고(도 16(h)), Doxycycline 첨가 2주간 후의 평균형광강도는 35.32, 적산형광강도는 3500이었다(도 16(i))이다.

이 결과로부터, 본 실시예에 따른 방법을 사용하여 얻어진 다클론성 집단의 발현유도 후의 발현레벨은 극히 높고, 그것은 적산형광강도의 비교에서, 음성대조인 경우의 약 300배∼7000배에 달해 있음을 알 수 있었다.

또한, 본 실시예에 따른 방법을 사용하여 얻어진 다클론성 집단으로부터 임의로 선발한 5개의 클론에 대해, 발현유도 전후의 d2EGFP 발현량을 셀 소터로 해석하였다. 그 결과의 대표예(3개의 클론)를 도 18에 나타내었다. 도 18(a) 및 (b)는 클론 A에 대한 결과이며, (a)는 발현유도 전의 결과를 나타내고, (b)는 발현유도 후의 결과를 나타내고 있다. 도 18(c) 및 (d)는 클론 B에 대한 결과로, (c)는 발현유도 전의 효과를 나타내며, (d)는 발현유도 후의 결과를 나타내고 있다. 도 18(e) 및 (f)에 클론 C에 대한 결과이며, (e)는 발현유도 전의 결과를 나타내고, (f)는 발현유도 후의 결과를 나타내고 있다. 동일 각 도면 중의 괄호 안에 형광강도의 평균값(평균형광강도)을 나타내었다. 또한, 동일 도면 중, 사각으로 에워싸인 문자로 적산형광강도를 나타내었다.

도 18에 따르면, 본 실시예에 따른 방법을 사용하여 얻어진 다클론성 집단으로부터, 목적 단백질(d2EGFP)의 발현량이 매우 높은 클론을 간편하게 얻을 수 있음을 알 수 있었다.

또한, 본 실시예에 따른 방법에 따르면, HSR상의 증폭유전자로부터도 목적단백질(d2EGFP)의 고발현을 기대할 수 있다. 이것은 이하의 실험에 의해 확인할 수 있다. 즉, 복제기점 서열과 핵 매트릭스 결합영역 서열을 함께 갖는 플라스미드인 상기 pSFVdhfr와, LacO(lactose operator)-repeat 서열과 TRE-프로모터의 하류에 MS2 결합서열을 갖는 플라스미드인 pECMS2Beta(Susan Janicki 박사와 David Spector 박사(cold spring Harbor Laborator)로부터 입수하였다.『Janicki, S. M., T. Tsukamoto, S. E. Salghetti, W. P. Tansey, R. Sachidanandam, K. V. Prasanth, T. Ried, Y. Shav-Tal, E. Bertrand, R. H. Singer, and D. L. Spector. 2004. From silencing to gene expression:real-time analysis in single cells. Cell. 116:683-698』를 혼합하여, 리포펙션법에 의해 인간대장암 COLO 320DM 세포로 코트랜스펙션을 실시하였다.

이 때에 사용한 인간 대장암 COLO 320DM 세포는, 미리 LacR(lactose repressor)와 CFP(cyan fluorescence protein)의 융합 단백질을 발현하는 pLacR-CFP 플라스미드(Susan Janicki 박사와 David Spector 박사(cold spring Harbor Laborator)로부터 입수하였다.『Janicki, S. M., T. Tsukamoto, S. E. Salghetti, W. P. Tansey, R. Sachidanandam, K. V. Prasanth, T. Ried, Y. Shav-Tal, E. Bertrand, R. H. Singer, and D. L. Spector. 2004. From silencing to gene expression:real-time analysis in single cells. Cell. 116:683-698』참조)를 리포펙션법으로 도입하고, 네오마이신(Neomycine) 내성이 된 클론화 세포를 사용하였다.

그 결과, 상기 양 플라스미드가 동시 증폭하여 HSR를 형성한 클론을 취득하였다. 해당 클론에서는 HSR 중의 LacO 서열에 LacR-CFP가 결합하기 때문에, HSR이 시안색의 형광을 띠고 있다.

게다가, pTet-ON 플라스미드(클론테크사 제품), 및 MS2와 YFP(yellow fluorescence protein)와의 융합 단백질을 발현하기 위한 플라스미드 (Susan Janicki 박사와 David Spector 박사(cold spring Harbor Laborator)로부터 입수하였다.『Janicki, S. M., T. Tsukamoto, S. E. Salghetti, W. P. Tansey, R. Sachidanandam, K. V. Prasanth, T. Ried, Y. Shav-Tal, E. Bertrand, R. H. Singer, and D. L. Spector. 2004. From silencing to gene expression:real-time analysis in single cells. Cell. 116:683-698』참조)를, 상기 클론으로 일렉트로포레이션법에 의해 동시에 도입하고, 2.5시간 후에 독시사이클린(Doxycycline, 클론테크사 제품)을 1㎍/ml이 되도록 배지에 첨가하였다. 이 때, 발현한 Tet-ON 단백질과 독시사이클린(Doxycycline)이 HSR 중의 TRE-프로모터를 활성화하여, MS2와 YFP(yellow fluorescence protein)의 융합 단백질을 코딩하는 RNA가 전사된다. 이러한 RNA에는 MS2 결합서열이 있기 때문에, MS2와 YFP의 융합 단백질이 결합하여 노란색의 형광을 띤다.

이 결과를 나타낸 대표적인 사진을 도 19에 나타내었다. 동일 도면 중 A, B 및 C는 독시사이클린(Doxycycline)에 의한 발현유도 전의 클론의 형광 현미경 이미지이며('-Dox'를 도면 좌단에 부여), D 및 E는 독시사이클린에 의한 발현유도 1.5시간 후의 클론의 형광 현미경 이미지이다('+Dox 1.5hr'를 도면 좌단에 부여), 또한, 동일 도면의 상부에 'LaminB'를 부여한 것은 항 Lamin B항체(Santa Cruz Biotechnologies사 제품)를 사용한 간접형광항체법으로 핵막 라미나를 가시화한 것이며, 'CFP-HSR'를 부여한 것은 HSR을 CFP(cyan fluorescence protein)로 가시화한 것이고, 'YFP-MS2 RNA'를 부여한 것은 RNA를 YFP(yellow fluorescence protein)에 의해 가시화한 것이며, 'Merge'를 부여한 것은 상기 3개의 이미지를 중첩시킨 것이다.

CFP(cyan fluorescence protein)의 시안색으로 가시화된 HSR(동일 도면 중, 화살표로 표시)은 헤테로크로마틴화하고 있기 때문에, 독시사이클린에 의한 발현유도 전에는 작은 응축된 구형상의 구조로 핵 내에 존재하고 있었다. 독시사이클린에 의한 발현유도를 실시하면, 시안색의 HSR이 크게 완화되어, 그곳으로부터 노란색 형광으로 가시화된 RNA가 나오는 모습이 뚜렷하게 나타났다(동일 도면 중, 원으로 에워쌈).

상기 결과로부터, Tet-ON 단백질과 독시사이클린에 의한 TRE-프로모터의 활성화는, IR과 MAR를 갖는 플라스미드에 의해 형성되며 헤테로크로마틴화하고 있던 HSR를 풀어, RNA의 전사를 활성화할 수 있음을 알 수 있었다.

[ 실시예 9] 코트랜스펙션에 의해 목적 단백질의 발현을 제어하는 프로모터의 전사활성화 인자를 고발현시켜 , 5- 아자 -2'- 데옥시시티딘(5-aza-2'-deoxycytidine)으로 세포를 처리하는 효과

(방법 및 결과)

인간 DHFR 유전자좌 유래의 IR 및 MAR과 블라스티사이딘(Blasticidine) 저항성 유전자를 가지며, 또한, TRE-프로모터(테트라싸이클린 유도 프로모터)의 지배하에 d2EGFP 유전자를 갖는 플라스미드(pSFVdhfr/d2EGFP)와 TRE-프로모터의 전사활성화 인자(Tet-ON 단백질)를 코딩하는 Tet-ON 유전자를 갖는 pTet-ON 플라스미드(클론테크사 제품)를 등량 혼합하고, 동시에 리포펙션법에 의해 인간 대장암 COLO 320DM 세포로 도입하였다. 5㎍/ml 블라스티사이딘으로 선택함으로써, 형질전환세포의 다클론성 집단을 얻었다. 상기 다클론성 집단으로부터, 한계희석법에 의해 임의의 10클론을 선발하고, 또한 상기 10클론으로부터 pSFVdhfr/d2EGFP 플라스미드 유래의 염기서열이 HSR상에서 증폭되고 있는 클론(편의상, 'HSR 클론'이라 한다), 및 동일 염기서열이 DM상에서 증폭하고 있는 클론(편의상, 'DM클론'이라 한다)을 선발하였다. 도 20(a) 및 도 20(b)는 HSR 클론 및 DM 클론에 대해, 도입한 pSFVdhfr/d2EGFP 플라스미드의 염기서열을 FISH법에 의해 검출한 결과를 각각 나타내고 있다. 동일 도면 중, 검출한 pSFVdhfr/d2EGFP 플라스미드 유래의 염기서열을 화살표로 나타내었다. 또한, 한계희석법, 및 HSR 클론 및 DM 클론의 선발방법은 실시예 7에 기재된 방법과 마찬가지로 하여 수행하였다.

이어, 상기 2클론의 각 배양액 중에, 3μM의 5-aza를 첨가하여 3일간 처리를 한 후, 독시사이클린(Doxycycline, 클론테크사 제품; 1㎍/ml)을 배양액에 첨가하여 2일간 d2EGFP의 발현을 유도하였다. 배양 후, 각 클론의 d2EGFP 발현량을 셀 소터에 의해 해석하였다. 또한, 음성대조로서, 복제기점도 핵 매트릭스 결합영역도 갖지 않는 pSFV-V 플라스미드를 pSFVdhfr/d2EGFP 대신에 사용하며, 상기와 마찬가지로 하여 형질전환세포의 다클론성 집단을 취득하였다. 상기 형질전환세포의 다클론성 집단에 대해, 상기와 마찬가지로 독시사이클린(Doxycycline)에 의한 d2EGFP의 발현 유도를 실시하여, d2EGFP 발현량을 셀 소터에 의해 해석하였다. 그 결과를 도 21(a)∼(c)에 나타내었다. 도 21(a)는 HSR 클론에 대해 독시사이클린 첨가 2일 후의 형광강도를 측정한 결과이며, 도 21(b)는 DM 클론(5-aza처리 없음)에 대해 독시사이클린 첨가 2일 후의 형광강도를 측정한 결과이고, 도 21(c)는 DM 클론(5-aza처리 있음)에 대해 독시사이클린 첨가 2일 후의 형광강도를 측정한 결과이다. 동일한 각 도면 중의 괄호 안에 형광강도의 평균값(평균형광강도)을 나타내었으며, 사각으로 에워싼 문자로 적산형광강도를 나타내었다. 또한, 도 21(d)는 음성대조, HSR 클론, 및 DM 클론(5-aza처리가 있는 경우와 없는 경우)에 대해, 독시사이클린 첨가 2일 후의 적산형광강도를 나타낸 막대그래프이다.

도 21(d)에 따르면, 음성대조(동일 도면 중 'N'으로 나타냄)의 적산형광강도가 1826이었던 것에 비해, HSR 클론(동일 도면 중 'HSR'로 나타냄)의 적산형광강도가 22119이고, DM 클론(5-aza처리 없음: 동일 도면 중 'DM(-)'로 나타냄)의 적산형광강도가 75099이며, DM 클론(5-aza처리 있음 : 동일 도면 중 'DM(+)'로 나타냄)의 적산형광강도가 238113이었다. 따라서, HSR 클론 및 DM 클론은 음성대조의 클론에 비해 d2EGFP 발현레벨이 현저하게 높고, DM 클론 쪽이 HSR 클론에 비해 더욱 높음을 알 수 있었다. 또한, 5-aza 처리에 의해, d2EGFP 발현레벨이 더욱 향상됨을 알 수 있었다.

[ 실시예 10] CHO 세포에서의 본 발명의 효과

(방법 및 결과)

플라스미드가 도입되는 세포가 CHO-K1 세포(입수처: 토호쿠(東北)대학 가령의학연구소/의용세포자원센터로부터 입수)인 것이외에는, 실시예 9와 동일하게 실시하였다.

그 결과, CHO 세포에 있어서도, pSFVdhfr/d2EGFP 플라스미드 유래의 염기서열이 HSR 상에서 증폭되고 있는 클론(편의상, 'HSR 클론'이라 한다), 및 동일 염기서열이 DM 상에서 증폭하고 있는 클론(편의상, 'DM 클론'이라 한다)을 분리할 수 있었다. 이는 본 발명이 COLO 320DM 세포 등의 종양세포 이외에서도 적용가능함을 나타내고 있다. 분리한 CHO 세포의 HSR 클론에 대해, 도입한 pSFVdhfr/d2EGFP 플라스미드의 염기서열을 FISH법에 의해 검출한 결과를 도 22(a)에 나타내었으며, CHO 세포의 DM클론의 결과를 도 22(b)에 나타내었다. 또한, 검출한 pSFVdhfr/d2EGFP 플라스미드 유래의 염기서열을 동일 도면 중 화살표로 표시하였다.

셀 소터에 의한 d2EGFP의 발현량이 가장 높았던 클론(편의상 '최고 클론'이란 한다)에 대해, 독시사이클린(Doxycycline) 첨가 2일 후의 형광강도를 측정한 결과를 도 23(a)에 나타내었다. 또한, 도 23(b)에, 음성대조에 있어서의 형질전환세포의 다클론성 집단, 본 실시예의 형질전환세포의 다클론성 집단, 및 최고 클론에 대해 독시사이클린 첨가 2일 후의 적산형광강도의 결과를 나타내었다.

도 23(b)에 따르면, 음성대조에서의 형질전환세포의 다클론성 집단(동일한 도면 중 'NP'로 나타낸다)의 적산형광강도가 296이었던 것에 비해, 본 실시예의 형질전환세포의 다클론성 집단(동일 도면 중 'P'로 나타냄)의 적산형광강도가 14022이며, 최고 클론(동일 도면 중 'M'으로 나타냄)의 적산형광강도가 167865이었다. 따라서, 본 실시예의 형질전환세포의 다클론성 집단 및 최고 클론은 음성대조의 형질전환세포의 다클론성 집단에 비해 d2EGFP 발현레벨이 현저하게 높음을 알 수 있었다. 특히, 다클론성 집단으로부터 분리한 최고 클론의 d2EGFP 발현레벨은 음성대조의 경우에 비해 더욱 현저하게 높았다.

최고 클론에 대해, 도입한 pSFVdhfr/d2EGFP 플라스미드의 염기서열을 FISH법에 의해 검출한 결과를 도 23(a)에 나타내었다. 또한, 검출한 pSFVdhfr/d2EGFP 플라스미드 유래의 염기서열을 동일 도면 중 화살표로 나타내었다. 도 23(c)에 따르면, 상기 최고 클론은 pSFVdhfr/d2EGFP 플라스미드 유래의 염기서열이 HSR(비교적 짧은 형상의 HSR) 상에서 증폭되고 있는 클론임을 알 수 있었다.

상술한 바와 같이, 본 발명에 따른 방법 및 키트에 따르면, 유전자의 반복서열에 기인하는 전사억제를 해제하는 방법 및 수단을 제공하여, 유전자 증폭에 의해 유용한 단백질을 대량으로 생산할 수 있다. 따라서, 본 발명은 단백질을 생산하는 산업, 예를 들면 의약품, 화학, 식품, 화장품, 섬유 등의 산업에 이용가능하다.

<110> National university of Corporation Hiroshima University <120> Method and kit for expressing protein under regulation of the expression from related sequence formed by gene amplication and transformant <130> IPA9705-0313 <150> JP2004-334984 <151> 2004-11-18 <150> JP2005-121431 <151> 2005-04-19 <160> 1 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Artificially Synthesized DNA Sequence <400> 1 gcgcggccgc ataacttcgt atagcataca ttatacgaag ttatgcggcc gcgc 54

Claims (25)

1. 유전자 증폭이 유도된 포유동물에서 분리된 세포 내에서 형성된 반복서열로부터, 발현이 억제된 단백질을 발현시키는 방법으로서,

   해당 포유동물에서 분리된 세포는 진핵생물세포 내에서 기능하는 복제기점 및 핵 매트릭스 결합영역을 포함하는 제 1 폴리뉴클레오티드, 및 발현시킬 단백질을 코딩하는 제 2 폴리뉴클레오티드가 동시에 도입되어 있으며,

   해당 제 1 및 제 2 폴리뉴클레오티드를 도입할 때에, 48.5kbp 이상의 길이를 갖는 제 3 폴리뉴클레오티드를 상기 포유동물에서 분리된 세포에 도입하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
2. 제1항에 있어서, 상기 제2 폴리뉴클레오티드는, 제2 폴리뉴클레오티드 및 약제내성유전자를 포함하는 제5 폴리뉴클레오티드로서, 상기 제1 폴리뉴클레오티드와 동시에 포유동물에서 분리된 세포에 도입되어 있으며,

   상기 포유동물에서 분리된 세포를 점증(漸增) 농도의 약제를 포함하는 배지중에서 배양하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
3. 제1항에 있어서, 유전자 증폭이 이중미소염색체(double minute chromosome) 상에서 일어나고 있는 포유동물에서 분리된 세포를 선택하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
4. 제1항에 있어서, 5-아자-2'-데옥시시티딘(5-aza-2'-deoxycytidine)으로 상기 포유동물에서 분리된 세포를 처리하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
5. 제 1 항에 있어서, 상기 진핵생물세포 내에서 기능하는 복제기점이 c-myc 유전자좌, 디히드로폴레이트 환원효소 유전자좌, 또는 β-글로빈 유전자좌의 복제기점으로부터 유래하는 것을 특징으로 하는 방법
6. 제 1 항에 있어서, 상기 핵 매트릭스 결합영역이 Igκ 유전자좌, SV40 초기영역, 또는 디히드로폴레이트 환원효소 유전자좌의 핵 매트릭스 결합영역으로부터 유래하는 것을 특징으로 하는 방법.
7. 유전자 증폭이 유도된 포유동물세포 내에서 형성된 반복서열로부터, 발현이 억제된 단백질을 발현시키기 위한 키트로서,

   진핵생물세포 내에서 기능하는 복제기점 및 핵 매트릭스 결합영역을 포함하는 제 1 폴리뉴클레오티드와,

   48.5kbp이상의 길이를 갖는 제 3 폴리뉴클레오티드를 구비하는 것을 특징으로 하는 키트.
8. 제 7 항에 있어서, 5-아자-2'-데옥시시티딘(5-aza-2'-deoxycytidine)을 추가로 포함하는 키트.
9. 제 7 항에 있어서, 상기 진핵생물세포 내에서 기능하는 복제기점이 c-myc 유전자좌, 디히드로폴레이트 환원효소 유전자좌, 또는 β-글로빈 유전자좌의 복제기점으로부터 유래하는 것을 특징으로 하는 키트.
10. 제 7 항에 있어서, 상기 핵 매트릭스 결합영역이 Igκ 유전자좌, SV40 초기영역, 또는 디히드로폴레이트 환원효소 유전자좌의 핵 매트릭스 결합영역으로부터 유래하는 것을 특징으로 하는 키트.
11. 진핵생물세포 내에서 기능하는 복제기점 및 핵 매트릭스 결합영역을 포함하는 제 1 폴리뉴클레오티드와,

    발현시킬 단백질을 코딩하는 제 2 폴리뉴클레오티드와,

    48.5kbp이상의 길이를 갖는 제 3 폴리뉴클레오티드가 인간을 제외한 포유동물세포에 도입되어 된 형질전환체.
12. 제 11 항에 있어서, 상기 진핵생물세포 내에서 기능하는 복제기점이 c-myc 유전자좌, 디히드로폴레이트 환원효소 유전자, 또는 β-글로빈 유전자좌의 복제기점으로부터 유래하는 것을 특징으로 하는 형질전환체.
13. 제 11 항에 있어서, 상기 핵 매트릭스 결합영역이 Igκ 유전자좌, SV40 초기영역, 또는 디히드로폴레이트 환원효소 유전자좌의 핵 매트릭스 결합영역으로부터 유래하는 것을 특징으로 하는 형질전환체.
14. 제 11 항에 있어서, 상기 포유동물세포가 CHO 세포인 형질전환체.
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