KR100942389B1 - 캠필로박터균의 배양 또는 수송용 배지 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 캠필로박터(Campylobacter)균의 배양(culture) 또는 수송(transport)용 배지에 관한 것이다. 본 발명의 배지는 겔화제로서 젤라틴 성분을 포함시킴으로써 캠필로박터균의 분리를 위해 채취한 시료를 연구기관으로 운반하는 동안 온도 조건에 영향을 받지 않으며 산소와의 접촉을 최소화하여 캠필로박터균의 생존율을 높게 유지시킬 수 있는 효과를 갖는다.
캠필로박터(campylobacter), 배양 배지, 수송 배지(transfer media), 젤라틴(gelatin)
Description
본 발명은 캠필로박터(Campylobacter)균의 배양(culture) 또는 수송(transport)용 배지에 관한 것이다.
캠필로박터균은 그람 음성세균이며 호리호리한 나선형 간균으로 크기는 0.2-0.5 × 0.5-5.0 ㎛이다.
1972년에 Butzler 등은 설사를 하는 벨기에 소년들 중 5％에서 캠필로박터균에 속하는 캠필로박터 제주니(Campylobacter jejuni)를 분리하였다. 이 결과는 후에 Skirrow에 의해 확인되었다. 그 이후 많은 연구자들이 비슷한 발견을 하였으며 일부 실험실에서는 캠필로박터균 분리가 살모넬라와 쉬겔라를 합친 것보다 많이 분리하기도 하였다. 과거 30년 전에는 캠필로박터균은 급성 설사환자의 25％를 차지하였는데 오늘날에는 급성환자의 65-85％를 차지하고 있을 정도로 많이 분리되고 있다.
캠필로박터균에 속하는 캠필로박터 제주니(Campylobacter jejuni)는 동물의 배설물에서 주로 발견되며, 작고 꼬인 나선형이고, 공기에 노출되면 빠르게 구형 몸체를 형성한다. 또 한, 37-42 ℃에서는 생장하나 25 ℃에서는 생장을 하지 않는다. 또한, 캠필로박터 제주니(Campylobacter jejuni)는 캠필로박터균에서 가장 흔하게 분리되는 균 중의 하나이다. 1971년에 사람 설사 분변에서 최초로 분리된 이래, 캠필로박터 제주니(Campylobacter jejuni)는 위장염의 중요한 원인균 중의 하나로 인식하게 되었다. Finch와 Riley는 1982년에 미국에서 1600명 이상이 캠필로박터균에 감염되었다고 추정하였다. 그들은 또한 캠필로박터균에 의한 설사는 살모넬라균만큼 흔하며 쉬겔라균보다는 훨씬 많다고 결론지었다. 1982년 미국에서 캠필로박터균 추정 감염수는 B형 감염 추정환자와 거의 같으며 인플루엔자 추정환자의 10배이다. 그러나 최근 들어 캠필로박터 균에 의한 환자가 매년 240만명 이상이 발생하는 것으로 추정하고 있다(참조: http;//www.cdc.gov).
캠필로박터균을 분리하기 위한 다양한 농축 배지(enrichment media) 또는 배양배지가 제안되었다 [Park et al, Campylobacter, In: Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods, second edit., M. L. Speck (ed.), Am. Pub. Hlth. Assoc., Washington, D.C., 1984, p. 386-404]. 한편, 캠필로박터균의 성장은 종종 분리 소스에 존재하는 다른 유기체의 성장에 의해 저해를 받기 때문에 이 균의 배양을 위해서 항생제 및/또는 항미생물제를 포함하는 선택배지를 사용한다. Butzler는 영양 아가 베이스(nutrient agar base), 혈액 및 5 가지의 선택제(selective agent)인 사이클로헥시미드(cycloheximide), 세파졸 린(cefazolin), 바시트라신(bacitracin), 콜리스틴 설페이트(colistin sulfate) 및 노보비오신(novobiocin)을 포함하는 캠필로박터 제주니(Campylobacter jejuni) 선택 배지를 개발하였다 [Canpylobaceer, In: Bergey's Manual of Systematic bacteriology, Vol. 1, Krieg and Holt (ed.), Williams and Wilkins, Baltimore, Md., 1984, pages 111-115]. 이후에 다음의 다른 선택 배지들이 개발되었다. ⅰ) Preston medium : 영양 브로스(nutrient broth), 아가(agar), 용혈된 말 혈액(lysed horse blood), 사이클로헥사미드(cyclohemimide), 폴리믹신 설페이트(polymyxin sulphate), 트리메소프림 락테이트(trimethoprim lactate) 및 리팜시신(rifampicin)을 함유(Hut hinson and Bolton, J. Clin. Pathol., 1983, 36:1350-1352); ⅱ) Skirrow's medium : 영양 아가 베이스(nutrient agar base), 용혈된 말 혈액, 바노마이신(vancomycin), 폴리믹신 및 트리메소프림을 함유 (Skirrow, Br. Med. J., 1977, ii:9-11); ⅲ) Camipy-BAP : 브루셀라 아가(brucella agar), 염소 적혈구, 바노마이신, 트리메소프림, 폴리믹신(polymyxin) B, 세팔로틴(cephalothin) 및 암포테리신(amphotericin) B (Blaser et al., 1979, Ann. Intern. Med., 91:179-185). 아가(agar) 포함 배지, 특히 CCDA는 캠필로박터균을 분리하는데 많이 사용되는데, 초기 CCDA 배지 조성에는 영양 브로스, 아가, 숯(charcoal), 카제인 가수분해물(casein hydrolysates), 소디엄 피루베이트(sodium pyruvate) 및 선택제로서 소디엄 디옥시콜레이트(sodium deoxyoholate) 및 세파졸린(cephazolin)을 포함하였다(Hutchinson and Bolton, 1983, J. Clin. Pathol., 36:1350-1352). 이후 CCDA 배지 조성에서는 선택도를 높이기 위해 세포 퍼라존(cefoperazone)을 세포졸린(cephazolin)으로 대체하여 사용하였다(Hutchinson and Bolton, 1984, J. Clin. Pathol., 37:956-957).
국내에서는 2006년 설사 환자의 검체를 대상으로 설사 원인 병원체를 분리한 결과 0.1％ 만이 설사 원인균으로 캠필로박터 제주니(Campylobacter jejuni ) 가 분리되었다(질병관리본부. 2006). 지역적 특성으로 국내에 캠필로박터증(Campylobacteriosis)의 발생율이 낮을 수도 있으나, 검체를 채취하고, 검체를 수송하는 단계에서 외부 환경적인 요인으로 인해 분리율이 낮은 것으로 추정된다. 예를 들어, 보건소나 병원에서 검체를 채취 후 병원체를 분리하는 기관으로 보내지기까지 24시간 이상이 소요되며, 수송과정중에 온도와 산소의 조건(미호기 조건)을 유지시키기가 현실적으로 어렵다. 위와 같은 원인으로 인해 캠필로박터균(특히 캠필로박터 제주니)의 검체 및 병원체의 수송과정에서 사용될 수 있는 외부 환경에 민감하지 않은 배양 및 수송용 배지의 필요성이 절실하다.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
본 발명자들은 캠필로박터(Campylobacter)균의 분리를 위해 채취한 시료를 연구기관으로 운반하는 동안 온도 조건에 영향을 받지 않고 동시에 산소와의 접촉을 최소화함으로써 캠필로박터균의 생존율을 높게 유지시킬 수 있는 배지 조성물을 개발하고자 연구 노력하였다. 그 결과 기본 영양 배지 조성에 젤라틴(gelatin) 성분을 첨가하여 배지를 제조하면 산소와의 접촉이 최소화되고 온도에 민감하게 반응하지 않는 반고체 상태의 배지를 제조할 수 있어, 이를 캠필로박터균의 배양용 또는 수송용 배지로 사용하면 캠필로박터균의 분리율 및 생존율을 높일 수 있음을 실험적으로 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 캠필로박터(Campylobacter) 균의 배양용 또는 수송용 배지 조성물을 제공하는 것에 있다.
본 발명의 목적 및 장점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구의 범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 성분을 포함하는 캠필로박터(Campylobacter)균의 배양(culture)용 또는 수송(transport)용 배지 조성물을 제공한다: (a) 캠필로박터균의 성장 유지에 유효한 에너지원(energy source)을 포함하는 영양 배지(nutrient medium); (b) 혈액(blood) 또는 혈청(serum); 및 (c) 젤 라틴(gelatin).
본 발명자들은 캠필로박터(Campylobacter)균의 분리를 위해 채취한 시료를 연구기관으로 운반하는 동안 온도조건에 영향을 받지 않고 동시에 산소와의 접촉을 최소화함으로써 캠필로박터균의 생존율을 높게 유지시킬 수 있는 배지 조성물을 개발하고자 연구 노력하였다. 그 결과 기본 영양 배지 조성에 젤라틴(gelatin) 성분을 첨가하여 배지를 제조하면 산소와의 접촉이 최소화되고 온도에 민감하게 반응하지 않는 반고체 상태의 배지를 제조할 수 있어, 이를 캠필로박터 균의 배양용 또는 수송용 배지로 사용하면 캠필로박터균의 분리율 및 생존율을 높일 수 있음을 실험적으로 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
캠필로박터균은 온도와 산소에 매우 민감하여 생존 조건이 맞지 않는 경우 배양 및 분리가 어려운 것으로 알려져 있다. 따라서 채취한 검체로부터 캠필로박터균의 분리를 위해서는 수송시 적정한 온도를 유지시키고 산소와의 접촉을 피하며 가능하면 24시간 이내에 균을 분리하여야 한다. 그러나, 검체의 채취 후에 분리를 위한 실험 및 연구기관으로 수송하는 과정은 통상적인 상업적 운송방법을 이용하므로 적정한 온도를 별도로 유지하는 것이 어렵고, 일반적으로 사용되는 겔화제인 아가(agar)가 첨가된 배지에 의해서는 산소와의 접촉을 최소화하기 어려운 점이 있다.
본 발명의 배지 조성물은 배지에 일반적으로 사용되는 겔화제(gelling agent)인 아가(agar) 대신에 젤라틴을 첨가하여 반고체 상태의 배지를 제조하기 위한 것으로써, 본 발명의 배지를 사용하면 캠필로박터균의 배양 및 수송시에 산소와 의 접촉이 최소화되고 온도 조건에 영향을 받지 않으므로 캠필로박터균의 생존율 및 분리율을 현저히 증가시킬 수 있다.
본 발명의 배지가 적용되는 "캠필로박터" 속(genus) 균은 그람-음성(gram-negative), 나선형(spiral), 미호기성(microaerophilic) 박테리아(bacteria)이다. 본 발명의 배지를 적용할 수 있는 캠필로박터 속에 속하는 종(species)은 바람직하게는 캠필로박터 제주니(Campylobacter jejuni), 캠필로박터 콜라이(Campylobacter coli), 캠필로박터 피터스(Campylobacter fetus), 캠필로박터 콘시서스(C. concisus), 캠필로박터 커버스(C. curvus), 캠필로박터 그라실리스(C. gracilis), 캠필로박터 벨베티커스(C. helveticus), 캠필로박터 호미니스(C. hominis), 캠필로박터 히오인테스티날리스(C. hyointestinalis), 캠필로박터 인설래니그리(C. insulaenigrae), 캠필로박터 라니에니(C. lanienae), 캠필로박터 라리(C. lari), 캠필로박터 뮤코살리스(C. mucosalis), 캠필로박터 렉터스(C. rectus), 캠필로박터 쇼와에(C. showae), 캠필로박터 스푸토룸(C. sputorum), 캠필로박터 웁살리엔시스(C. upsaliensis)를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 보다 바람직하게는, 본 발명의 배지가 적용되는 캠필로박터균은 캠필로박터 제주니(Campylobacter jejuni) 또는 캠필로박터 콜라이(Campylobacter coli) 이다.
본 발명의 배지 조성물은 배양(culture)용 또는 수송(transport)용으로 사용될 수 있다. 본 발명의 명세서에서 용어 "배양용 배지 조성물" 은 캠필로박터 균의 성장(growth)을 위한 배지 조성물을 의미하며, 용어 "수송용 배지 조성물"은 채취한 시료(sample)를 배양(cultivation) 또는 선택(selection)을 위해 연구기관 또 는 실험실로 운송하는 동안 일시적으로 보관하기 위해 사용되는 배지 조성물을 의미한다.
본 발명의 배지 조성물에서 "영양배지(nutrient medium)"는 캠필로박터균의 성장에 적합한 기본 성분을 포함하는 불확정(undefined) 배지를 의미한다. 본 발명의 영양배지에는 다양한 화합물(compound) 및 원소(element)가 포함될 수 있고, 이러한 화합물 및 원소들은 당업계에서 통상의 지식을 가진 당업자에게 공지되어 있다. 예를 들어, 본 발명의 영양배지에 포함되는 성분은 수소 공여자(hydrogen donor) 및 수용자(acceptor)의 소스(source), 탄소, 질소, 황(sulfur), 인(phosphorus), 무기염, 비타민, 아미노산 및 다른 성장-촉진 물질(growth-promoting substance)을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 또한, 영양 배지에는 탄수화물, 다양한 염(칼슘, 마그네슘, 망간, 나트륨, 칼륨, 인 및 황의 염을 포함하나 이에 한정되지 않는다)이 첨가될 수 있다.
본 발명의 명세서에서 용어 "캠필로박터균의 성장 유지에 유효한 에너지원"은 캠필로박터균의 성장을 유지시키는데 적합한 에너지원을 의미한다. 이러한 에너지원은 상업적으로 구입 가능한 영양 배지에 이미 혼입되어 있을 수도 있고, 별도로 첨가할 수도 있다. 본 발명의 배지 조성물에 사용하기에 적합한 에너지원으로는 Smibert에 의해 기술된 Bergey's Manual에 상세히 기술되어 있으며 상기 문헌은 본 발명의 명세서에 참조로써 삽입된다. 바람직하게는, 본 발명의 배지 조성물에 첨가되는 에너지원은 글루코오스(glucose), 수크로오스(sucrose), 말토오스(maltose), 프럭토오스(fructose), 락토오스(lactose), 자일로스(xylose), 갈락 토오스(galactose), 피루브산염(pyruvate), 시트르산염(citrate), 석신산염(succinate), 시스-아코니테이트(cis-aconitate), 알파-케토글루타르산염(α-ketoglutarate), 푸마르산염(fumarate), 말산염(malate) 또는 옥살아세트산염(oxalacetate)를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 배지 조성물에는 복합영양(complex nutrient)성분으로서 혈액(blood) 또는 혈청(serum)이 포함된다. 혈액은 다양한 동물유래의 혈액을 사용할 수 있으며, 바람직하게는, 말(horse) 또는 염소(sheep)의 혈액을 사용할 수 있다. 바람직하게는 혈액은 용혈된 혈액(lysed blood)를 사용하며, 보다 바람직하게는 혈청을 사용한다. 본 발명의 배지 조성물에 포함될 수 있는 혈청은 바람직하게는 우혈청(bovine serum) 또는 우태아혈청(fetal bovine serum)이다.
본 발명의 배지 조성물에는 겔화제(gelling agent) 성분으로서 젤라틴이 포함된다. 본 명세서에서 용어 "겔화제"는 배지 조성물을 고체(solid)화 또는 반고체(semi-solid)화시키는 물질을 의미한다.
본 발명의 명세서에서 용어 "젤라틴"은 동물의 뼈(bone) 또는 결합 조직(connective tissue)으로부터 추출한 콜라겐(collagen)을 부분 가수분해 하여 얻은 물질을 의미한다.
젤라틴은 열에 의해 액화되고 이를 냉각시키면 다시 고체화되는 특성을 갖는다. 물과 함께 존재하는 경우에는 반-고체 콜로이드성(semi-solid colloid) 겔을 형성하는데, 이 반고체 콜로이드성 겔은 상온에서는 고점도(high viscosity) 용액 특성을 나타지만 냉각에 의해 고체 겔을 형성하는 특성도 갖는다.
본 발명자들은 다양한 겔화제 중에서도 젤라틴이 배지를 반고체(semi-solid)상태로 유지시켜 미호기성 세균인 캠필로박터균의 수송 및 배양중에 산소와의 접촉을 최소화시키고 온도에 대한 민감성을 낮추어 캠필로박터의 생존율 및 분리율을 향상시키는데 있어서 최적의 효과를 발휘한다는 것을 발견하였다.
본 발명의 배지 조성물에서 젤라틴은 전체 배지 조성물에 대해 6-14중량％, 바람직하게는 8-12중량％의 함량으로 포함된다. 젤라틴이 전체 배지 조성물에 대해 6중량％ 미만의 함량으로 포함되는 경우 배지 조성물이 반고체 상태가 되기 어려워 본 발명의 효과를 달성하기 어렵고, 14중량％를 초과하는 경우 젤라틴이 용해되기 어려워 배지 조성물 제조에 어려움이 따른다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 배지 조성물은 항생제(antibiotic agent)가 더욱 포함된다. 상기 항생제는 시료에 존재하는 캠필로박터균 이외의 성장을 억제하며 캠필로박터균의 성장을 저해하지 않는 작용을 하는 것이라면 어떠한 항생제라도 사용할 수 있다. 예를 들어, 상기 항생제는 사이클로헥사미드(cycloheximide), 세포퍼라존(cefoperazon), 암포테리신(amphotericin) 및 이들의 염(salt)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 화합물이나, 이에 한정되지 않는다. 배지 조성물중의 항생제의 함량은 캠필로박터균 이외의 균의 성장을 억제하며 동시에 캠필로박터균의 성장은 억제하지 않는 함량이며, 바람직하게는 배지조성물 1ℓ당 5-600mg, 보다 바람직하게는 10-500mg, 보다 더 바람직하게는 20-400mg이다.
본 발명의 배지 조성물에 포함되는 상기 각 성분들의 양은 가변적(variable) 이며 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가지는 당업자라면 용이하게 결정할 수 있다.
본 발명의 배지 조성물은 다양한 시료 소스(source)로부터 분리된 캠필로박터균의 배양 및 수송용 배지로의 사용에 적합하다. 상기 시료 소스(source)는 소(cattle), 양(sheep)과 같은 동물의 사체, 음식물, 우유, 물은 물론 동물 또는 인간의 배설물이나 혈액과 같은 임상학적인 시료를 포함하며 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 배지는 일반적인 배지의 제조방법을 통해 제조할 수 있다. 영양 성분을 포함하는 배지의 기본 성분을 에너지원과 혼합한 후 오토클레이빙(autoclaving)에 의해 멸균함으로써 제조할 수 있다. 멸균된 기본 배지를 50-55℃ 정도 까지 냉각시킨다. 젤라틴을 증류수에 넣고 열을 가하여 녹인 후 고온에서 가압 멸균하여 제조한 멸균 젤라틴 용액을 상기 기본 배지에 첨가하여 혼합한다. 또한, 혈액, 용혈된 혈액 또는 혈청을 기본 배지에 첨가한 후 혼합한다. 필요한 경우 여과 멸균한 항생제 성분을 배지에 추가하여 혼합할 수 있다. 배지는 페트리 디쉬(petri dish) 또는 플라스크(flask)와 같은 일정한 형태의 용기에 부어 식힌 후에 젤라틴이 응고하도록 일정시간 방치하여 배지를 완성시킨다. 본 발명의 배지의 최종 pH는 일반적으로 6.5-7.5의 범위에 있을 수 있다.
본 발명의 배지 조성물은 기본 영양배지에 젤라틴(gelatin)을 첨가하여 배지 를 제조함으로써 산소와의 접촉이 최소화되고 온도에 민감하게 반응하지 않는 반고체 상태의 배지를 제조할 수 있다. 본 발명의 배지 조성물에 의한 배지를 캠필로박터균의 배양 및 수송용 배지로 사용하면 아가(Agar)가 첨가된 배지를 사용한 경우에 비해 캠필로박터균의 분리율 및 생존율을 현저히 증가시킬 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실험방법
배지의 제조
세포배양에 사용되는 DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium, GIBCO. Cat. No. 11995-065) 또는 MEM (Minimum Essential Medium, GIBCO. cat. No. 41500-034) 309㎖에 우혈청 (Bovine serum, GIBCO. Cat. No. 16170-078) 25㎖을 첨가하였다.
젤라틴(gelatin) 81g을 3차 증류수에 첨가하고 최종 부피가 300㎖이 되도록 3차 증류수를 추가로 첨가하였다. 젤라틴 혼합된 증류수에 열을 가하며 천천히 녹이고 가압 고온 멸균을 통해 멸균하였다. 멸균된 27％ 젤라틴 용액 166 ㎖을 상기 혈청이 첨가된 DMEM 또는 MEM 배지에 첨가한 후 4℃에서 보관하였다. 본 발명의 배지(STAR-A 배지, 이하 본 발명의 배지를 'STAR-A' 배지로도 기재함)는 사용하기 전에 37℃ 항온 수조에 10분간 정치 후 사용하였다.
배지 첨가물
캠필로박터 제주니(C. jejuni)외의 다른 장내세균의 성장을 억제하기 위하여 항생제를 첨가하였다. 항생제로서는 사이클로헥사미드(cycloheximide, Sigma, C4859, 최종농도: 5mg/500㎖), 세포퍼라존 (cefoperazon, 최종농도: 16mg/500㎖, Sigma, C4292), 암포테리신(amphotericin, Sigma, A2942, 최종농도: 5mg/500㎖)을 사용하였다.
종래
수송배지와의
비교실험
종래 캠필로박터 제주니(C. jejuni) 의심 검체 수송용으로 사용하고 있는 3가지 수송배지와, 본 발명의 'STAR-A' 배지를 수송용 배지로 사용한 경우에 검체내의 병원체의 생존율을 온도 및 시간별로 비교 측정하였다.
종래의 수송배지로는 현재 국내에서 주로 사용되는 가장 일반적인 검체 채취 및 수송 배지인 Sterile, Single swab (Catalog No. 260210, 4360210, BD (Becton, Dickinson and Company), NJ, USA) 배지와, 국제적으로 사용되어지는 호기성 혐기성 세균 수송 배지 ESwab 배지, 및 가장 많이 사용되는 캠필로박터 제주니(C. jejuni) 수송 배지 Cary-Blair Agar 배지와 비교하였다.
하기의 표에 종래 수송용 배지의 성분을 나타내었다 (참조: http://www.bd.com).
| Cary - Blair Agar Medium | ESwab medium formulation |
| Bacteriological Agar 5.60 g | Sodium Chloride |
| Calcium Chloride 0.09 g | Potassium Chloride |
| Disodium Hydrogen Phosphate 1.10 g | Calcium Chloride |
| Sodium Chloride 5.00 g | Magnesium Chloride |
| Sodium Thiogycollate 1.15 g | Monopotassium phosphate |
| Add distilled water to 1 liter | Disodium phosphate |
| Sodium thioglycollate |
실험에는 캠필로박터 제주니(C. jejuni, ATCC 33091) 균주를 사용하였다. 균주는 선택배지인 mCCDA에 스트리킹(streaking) 하여 37℃에서 48시간 배양 후, 저온배지(cryomedia)에 넣어 -70 ℃에 보관 후 사용하였다. 각각의 배지에 접종하는 균주는 500 CFU의 농도로 접종하였다. 이러한 농도는 캠필로박터 제주니(C. jejuni)의 감염량으로 최소한의 균주 안정성을 확보하기 위한 접종 농도이다.
ESwab 배지와 본 발명의 STAR-A 배지는 37 ℃에서 각각 용액과 반고체의 형태를 하고 있어 균주를 직접 배지에 접종하였으며, Sterile, single swab 배지와 Cary-Blair agar 배지의 경우에는 고체의 형태를 하고 있으므로 배지 내에 들어있는 면봉에 500 CFU를 접종한 후 면봉을 배지에 삽입하였다. 각각의 배지는 4℃, 20℃ 와 37℃에 정치 후 24시간 간격으로 균수를 측정하였다.
STAR
-A 배지의 보존기간 측정 실험
위의 실험 방법과 동일한 조건으로 균주를 접종한 후 5주 까지 균주의 생존 여부를 확인하였다.
실험 결과
본 발명의 STAR-A 배지와 비교하기 위해 비교 배지를 준비하였다. 비교 배지인, 0.1％ Agar 배지와 0.1％ Agarose 배지는 젤라틴 대신에 각각 0.1％의 Agar와 0.1％ Agarose를 포함하는 것을 제외하고는 본 발명의 STAR-A 배지에 포함되는 성분 및 함량과 동일하도록 제조하였다. Cary-Blair Agar 배지 및 ESwab 배지는 상기 "종래 수송배지와의 비교실험"의 항목에서 설명된 성분을 포함하도록 제조된 제품을 구입하여 사용하였다.
본 발명의 STAR-A 배지와 비교배지인 0.1％ Agar 배지, 0.1％ Agarose 배지, Cary-Blair Agar 배지 및 ESwab 배지에 500 CFU의 캠필로박터 제주니(C. jejuni)를 접종한 후, 각각 4℃, 20℃, 37℃에 정치하였다. 정치 후 24, 48, 72시간 별로 배지에서 균을 희석하여 혈액 아가 플레이트(blood agar plate)에 도말(spreading) 한 후 미호기성 조건에서 48시간 배양하였다. 배양한 후 균의 콜로니(colony)수를 측정하였다.
도 1의 결과에 보여지는 바와 같이, 4℃에서 정치하였을 경우, 24시간 경과 후 본 발명의 STAR-A 배지는 Cary-Blair Agar 배지에 비해 5배 정도의 균이 측정되었으며, ESwab 배지에 비해 2배 정도의 균이 측정되었다. 48시간 경과 후에는 본 발명의 STAR-A 배지는 Cary-Blair Agar 배지에 비해 1.7 배 정도의 균이 측정되었으며, ESwab 배지에 비해 3배 정도의 균이 측정되었다. 72시간 경과 후에는 본 발 명의 STAR-A 배지는 Cary-Blair Agar 배지에 비해 1.3배 정도의 균이 측정되었으며, ESwab 배지에 비해 2.2배 정도의 균이 측정되었다. 그러나 본 발명의 STAR-A 배지와 동일한 성분을 포함하나 젤라틴이 포함되지 않은 배지인 0.1％ agar 배지나 0.1％ agarose 배지의 경우에는 종래의 배지들과 유사한 결과를 보였다.
20℃에 정치하였을 경우는 STAR-A 배지를 제외하고는 캠필로박터 제주니 (C. jejuni)가 생존하지 못하였다. 그러나 STAR-A 배지의 경우에도 균수가 다른 온도에 비하여 현저히 감소하였으며, 24시간 이후에는 현저한 균수의 감소를 볼 수 있다(도 2의 결과 참조).
37℃에 정치하였을 경우 STAR-A 배지를 제외한 다른 배지에서는 균이 측정되지 않았으며, STAR-A 배지의 경우 시간대 별로 급격한 균수의 증가가 측정되었다(도 3의 결과 참조).
배지에 따른 캠필로박터균의 생존 실험의 결과, 본 발명의 STAR-A 배지를 사용한 경우 캠필로박터 제주니(C. jejuni)균이 4℃에서 7일, 37℃에서는 35일까지 생존하였으나, 기존에 사용하던 수송배지(Sterile, Single Swab)의 경우에는 3일 이후에는 균의 생존이 유지되지 않은 결과를 얻었다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
도 1은 본 발명의 STAR-A 배지와, 비교 배지로서 0.1％ Agar 배지, 0.1％ Agarose 배지, Cary-Blair Agar 배지 및 ESwab 배지를 캠필로박터 제주니(C. jejuni)의 수송 배지로 하여 4℃ 정치 배양에 사용한 경우 시간별 균체 수의 측정 결과를 보여주는 그래프이다.
도 2는 본 발명의 STAR-A 배지와, 비교 배지로서 0.1％ Agar 배지, 0.1％ Agarose 배지, Cary-Blair Agar 배지 및 ESwab 배지를 캠필로박터 제주니(C. jejuni)의 수송 배지로 하여 20℃ 정치 배양에 사용한 경우 시간별 균체 수의 측정 결과를 보여주는 그래프이다.
도 3은 본 발명의 STAR-A 배지와, 비교 배지로서 0.1％ Agar 배지, 0.1％ Agarose 배지, Cary-Blair Agar 배지 및 ESwab 배지를 캠필로박터 제주니(C. jejuni)의 수송 배지로 하여 37℃ 정치 배양에 사용한 경우 시간별 균체 수의 측정 결과를 보여주는 그래프이다.
Claims (7)
- 다음의 성분을 포함하는 캠필로박터(Campylobacter) 균의 배양(culture) 또는 수송(transport)용 배지 조성물:(a) 캠필로박터(Campylobacter)균 성장 유지에 유효한 에너지원(energy source)을 포함하는 영양 배지(nutrient medium);(b) 혈액(blood) 또는 혈청(serum); 및(c) 젤라틴(gelatin).
- 제 1 항에 있어서, 상기 성분 (c)의 젤라틴의 함량은 전체 배지 조성물에 대해 6-14 중량％인 것을 특징으로 하는 배지 조성물.
- 제 1 항에 있어서, 상기 배지 조성물에 항생제(antibiotic agent)가 더욱 포함되어 있는 것을 특징으로 하는 배지 조성물.
- 제 3 항에 있어서, 상기 항생제는 사이클로헥사미드(cycloheximide), 세포퍼라존(cefoperazon), 암포테리신(amphotericin) 및 이들의 염(salt)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 화합물인 것을 특징으로 하는 배지 조성물.
- 제 1 항에 있어서, 상기 성분 (b)의 혈액은 말의 혈액(horse blood), 염소의 혈액(sheep blood) 또는 이들의 용혈된 형태이고, 상기 성분 (b)의 혈청은 우혈청(bovine serum) 또는 우태아혈청(fetal bovine serum)인 것을 특징으로 하는 배지 조성물.
- 제 1 항에 있어서, 상기 성분 (a)의 캠필로박터균 성장 유지에 유효한 에너지원은 글루코오스(glucose), 피루브산염(pyruvate), 시트르산염(citrate), 석신산염(succinate), 시스-아코니테이트(cis-aconitate), 알파-케토글루타르산염(α-ketoglutarate), 푸마르산염(fumarate), 말산염(malate), 및 옥살아세트산염(oxalacetate)으로 이루어지는 군으로부터 선택된 에너지원인 것을 특징으로 하는 배지 조성물.
- 제 1 항에 있어서, 상기 캠필로박터(Campylobacter)균은 캠필로박터 제주니(campylobacter jejuni), 캠필로박터 콜라이(campylobacter coli), 캠필로박터 피터스(campylobacter fetus), 캠필로박터 콘시서스(C. concisus), 캠필로박터 커 버스(C. curvus), 캠필로박터 그라실리스(C. gracilis), 캠필로박터 벨베티커스(C. helveticus), 캠필로박터 호미니스(C. hominis), 캠필로박터 히오인테스티날리스(C. hyointestinalis), 캠필로박터 인설래니그리(C. insulaenigrae), 캠필로박터 라니에니(C. lanienae), 캠필로박터 라리(C. lari), 캠필로박터 뮤코살리스(C. mucosalis), 캠필로박터 렉터스(C. rectus), 캠필로박터 쇼와에(C. showae), 캠필로박터 스푸토룸(C. sputorum) 또는 캠필로박터 웁살리엔시스(C. upsaliensis)인 것을 특징으로 하는 배지 조성물.
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