KR100934411B1 - 면역반응을 조절하기 위한 에나멜 기질 단백질 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 면역반응을 조절하기 위한 약제학적 조성물의 제조를 위한, 아멜로게닌과 같은 활성 에나멜 기질 물질 제제의 용도에 관한 것이다. 상기 조성물은 내부 및/또는 외부 자극에 대한 천연적인 면역반응에서의 불균형을 나타내는 포유동물의 특징을 나타내는 포유동물의 상태 또는 질환을 예방 및/또는 치료하기 위해 사용될 수 있다. 즉 상기 포유동물의 면역 계의 적어도 일부는 비-차별적으로 자극되어 상기 면역원에 대하여 과민반응하거나 상기 자극에 대하여 반응하지 못한다. 이러한 상태는 전형적으로 전신적 및/또는 외상후 전신 염증 또는 자가면역 질병과 같은 전신적이거나 국소적일 수 있다.

활성 에나멜 기질, 과민반응, 면역원, 아멜로게닌, 자가면역 질병

Description

면역반응을 조절하기 위한 에나멜 기질 단백질 조성물{Enamel matrix protein compositions for modulating immune response}

본 발명은 면역반응을 조절하기 위한 약제학적 조성물의 제조를 위한, 아멜로게닌, 가공된 아멜로게닌 산물 또는 그의 대사산물과 같은 활성 에나멜 기질 물질 제제의 용도에 관한 것이다. 상기 조성물은 내부 및/또는 외부 자극에 대한 천연적인 면역반응에서의 불균형을 나타내는 것을 특징으로 하는 포유동물의 상태 또는 질환을 예방 및/또는 치료하기 위해 사용될 수 있다. 상기 상태는 전형적으로 전신적 및/또는 외상후의 전신 염증 또는 자가면역 질병과 같은 전신적이거나 국소적일 수 있다.

면역계의 정상 작용은 세균 및 바이러스와 같은 외래 미생물을 공격해서 파괴하는 것에 의해 몸을 보호하는 것이다. 정상 조건하에서 이들 외래 미생물은 침입자로 인식되어 무해하게 될 것이다.

사람의 면역반응에 관여하는 것은 림프계이다; 림프계는 림프구, 이들의 전구체와 유도체 및 모든 지지세포의 집합을 의미한다. 비정상적인 조건하 또는 면역계가 불균형일 때, 림프계는 외래 미생물에 반응해서 파괴하지 못하게되고, 자신의 세포와 조직을 외래물질로 오인하여 이들을 공격하거나 또는 과민한 방식으로 부적절하게 활성화된다.

외래항원 또는 자가항원이든 항원제에 대한 면역반응은 일반적으로 B 림프구에 의한 항체 생산 및 T 림프구 또는 천연의 킬러(NK) 세포에 의한 이들 항원을 나타내는 세포의 파괴를 특징으로 한다. 그러나 B 또는 T 림프 세포의 결함은 면역결핍 질환 또는 면역반응 기능의 손상을 초래할 수 있다. 면역결핍 또는 결함은 유전자의 돌연변이에 의해 유발되는 것과 같이 선척적인 것일 수 있거나, 바이러스 감염을 통하거나 또는 노화 과정의 결과로 후천적인 것일 수도 있다. 따라서 생겨난 결함은 그 결함이 생기는 줄기세포 또는 림프구 분화 단계에 따라 치명적이거나 비치명적일 수 있다.

항원 이외에도, 림프구는 충분히 활성화되기 위해 림포카인을 필요로한다. 예컨대, T-헬퍼 세포는 대식세포로 부터 신호를 받지 않는 한 증식되지 않으며, 또 T-세포독소 세포 및 B-세포는 충분히 발달하기 위해 T-헬퍼 세포 및 아마도 대식세포로 부터의 신호에 의존한다. 적합한 면역반응은 몇개 세포 유형이 조합된 활성을 필요로 하는데, 이는 림포카인의 발현 또는 활성을 조절하는 것이 나쁜 면역반응에 대한 유리한 효과를 갖는다는 것을 의미한다.

쇼크, 화상, 광범위한 외과처치 또는 외상성 상해후, 면역계의 작용은 전신적, 비-차별적, 과도한 전신 염증으로 과도하게 자극될 수 있는 반면에, 다른 작용은 현저하게 마비된다. 면역학적 숙주반응이 제어되지 않을 때, 관찰된 세포성 활성화의 불균형 상태가 연속적인 임상 상태를 초래한다. 이러한 상태는 급성 상 반응, 전신 염증, 아네르기(anergy), 패혈증, 감염 또는 기관 손상일 수 있고 또 결 국 다발성 기관 손상을 초래할 수 있다. 다발성 기관 손상 또는 기능장애는 중환자실에서 가장 일반적인 사망원인이다. 현재로서는, 제어되지 않는 면역반응의 예방 또는 개선에 관련한 치료법은 그 성과를 현저하게 변화시킬 수는 없는 실정이었다.

불균형 상황의 다른 예는 면역계가 자신의 몸을 공격하는 경우이다. 이들 상황은 공격을 유발하는 항원의 기원과 메카니즘 및 공격의 표현면에서 상이하다. 이들 반응을 흔히 앨러지, 지연된 유형의 과민증, 동종이식(allograft) 및 자가면역으로 각기 칭한다.

아네르기는 다른 종류의 불균형 상태로서, 인체는 주입된 알레르겐 또는 항원에 반응할 수 없다. 아네르기는 "공동자극적" 신호의 부재하에 T-세포 수용체(TCR)와 펩티드-제공 주요 조직적합 복합체(MHC) 사이의 상호작용 후 세포내 신호의 결과로 보여진다. 이러한 공동자극적 신호는 보통 항원-제공 세포(APC)의 세포 표면상에 제공된다.

면역계는 그 작용을 국소적으로 및 전신적으로 조절한다. 예컨대 지연된 유형의 과민증은 특징적인 피부반응에서 국소적으로 나타나거나, 다량의 항원이 혈류에 들어가서 관절부위에서 열, 불편 및 통증과 순환성 림프구의 갯수 감소를 특징으로 하는 전신반응으로 나타날 수 있다. 염증은 일반적으로 세포성 손상에 대한 국소적 반응으로 정의되는 반면에, 전신적 염증 또는 다발성 기관 손상은 전신 염증으로 정의된다.

외상후, 단구 및 대식세포는 즉각적으로 과민반응되어 프로염증성 사이토카 인을 과도하게 방출한다. 이러한 과도한 방출은 전신 염증의 발생을 초래하게되며, 이어 대부분의 환자에서 세포작용의 마비가 유발된다. 3 내지 5일 후, 상기 상태는 미성숙한 것이어서 완전한 활성 스펙트럼을 갖지 않는 새로이 보충된 단구/대식세포에 의해 극복된다. 또한, 환자는 항-염증 상(보상성 항-염증 반응 신드롬)을 거칠 수 있고 또 경우에 따라 프로- 및 항-염증 성분과 혼합 반응(혼합된 길항작용적 반응 신드롬)을 보일 수 있다.

세포 매개된 면역 조절에 대한 외상후의 충격은 단구/대식세포 유대와 T세포에 대한 동시 공격에 의해 주로 유발되며, 완전한 세포 상호작용의 분해를 초래한다. 외상성 스트레스는 각 세포 유형의 적합한 및 특수한 성능의 능력에 영향을 줄 뿐만 아니라 단구/대식세포 유대 및 T 세포가 다수의 조절 루프내에서 서로 보유하는 제어능력과 조절 감시에 영향을 준다. 조절 작용의 손실은 상해 순간과 동시에 발생한다.

상술한 초기 전신의 초염증을 유발하는 것으로 공지된 염증성 사이토카인은 예컨대 종양 괴저 인자-a (TNF-알파), 인터루킨-1(IL-1), IL-6 및 인터페론 감마이며, 이들은 TNF-알파와 함께 상승작용적으로 작용할 수 있다. 예컨대 엔도톡신에 대한 항체, TNF-알파, IL-1의 길항물질 또는 혈소판 활성화 인자를 사용한 상기 매개체의 하향 조절을 목적으로 한 임상시험은 대체로 지금까지 실망스러웠다. 이들 물질은 조절효과를 갖는 것 조차 확인되지 않았고, 이들은 치사율을 증가시키기도 하였다.

또한, 스트레스를 받는 조건하에서, 단구/대식세포 유대는 용이하게 자극되 어 가장 강력한 내인성 면역 억제제일 수 있는 프로스타글란딘 E₂ (PGE₂)을 생성 및 방출한다. PGE₂는 T 세포 유사분열생식, IL-2 수용체 발현 및 B세포에 의한 IgM 항체 합성의 억제제이다. cAMP 레벨의 세포내 증가를 통하여, PGE₂는 TNF_α 및 IL-1의 단구/대식세포 유대 합성을 음성적으로 제어한다. PGE₂는 TH₁ 사이토카인(IL-2, IFN_γ)의 합성 뿐만 아니라 TH₂ 세포에 의한 IL-4의 합성도 억제할 수 있다. 따라서, PGE₂ 분비는 TH₂ 유형의 반응을 선호하는 균형을 알려주어, IgM에서부터 IgG1 및 IgE로의 B 세포 생산 변화를 초래한다. 따라서 균형에 대한 정보는 TH₁ 또는 TH₂-우세 반응의 발달에 영향을 줄 것이다.

환자의 면역반응을 조절하기 위해 사용되는 전통적인 시약 및 방법은 원하지 않는 부작용을 흔히 초래한다. 예컨대, 시클로스포린 A, 아자티오프린 및 프레드니손과 같은 면역억제제는 자가면역 질환에 걸린 환자 또는 이식을 받는 환자의 면역계를 억제하기 위해 사용된다. 그러나 이러한 시약은 환자의 전체 면역반응을 억제하기 때문에, 원래 질병에 관여되지 않은 감염원에 대한 면역반응을 개시할 환자의 능력을 손상시킨다. 이러한 유해한 부작용과 면역조절의 의료적 중요성으로 인하여, 면역계의 특정 부분을 조절하는 시약과 방법에 대한 연구는 다년간의 연구의 주제로 되어 있었다.

에나멜 기질에 존재하는 에나멜 기질 단백질은 흔히 에나멜에 대한 전구체로 가장 잘 알려져 있다. 시멘트질 형성 전에, 에나멜 기질 단백질은 생장하는 치근 의 정점 단부에 있는 치근 표면에 침적된다. 침적된 에나멜 기질는 시멘트질을 형성하기 위한 개시인자이다. 다시, 시멘트질 그 자체의 형성은 치주인대 및 치조골의 발육과 관련된다. 본 발명 이전에 본 발명자에 의해 밝혀진 바와 같이, 에나멜 기질 단백질은 치아에서 자연적인 부착 발달을 흉내내는 것을 통하여 치주재생을 촉진할 수 있다(Gestrelius S, Lyngstadaas SP, Hammarstroem L. Emdogain-periodontal regeneration based on biomimicry. Clin Oral Invest 4: 120-125 (2000)).

에나멜 기질은 아멜로게닌, 에나멜린, 터프트(tuft) 단백질, 프로테아제 및 알부민과 같은 다수의 단백질로 구성된다. 에나멜 기질의 주요 성분인 아멜로게닌은 선택적인 스플라이싱 및 제어되는 후 분비성 가공에 의해 단일 유전자로 부터 유도되는 소수성 단백질의 집합체이다. 이들은 척추류 분화를 통하여 고도로 보존되며 조사된 모든 고등 척추류중에서 높은 전체적인 서열상동성 수준을 나타낸다(>80%). 실제로, 돼지 및 인간의 아멜로게닌 유전자 전사물의 서열은 염기의 4% 정도만 상이할 뿐이다. 따라서, 돼지 기원의 에나멜 기질 단백질은 인체에서 발견될 때 "자신"으로 인식되어 앨러지 반응 또는 기타 바람직하지 않은 반응을 유발하지 않고 인체에서 치과적 재생을 증진시킬 수 있다.

에나멜 기질 단백질 및 에나멜 기질 유도체(EMD)는 경질 조직 형성(즉 에나멜 형성, 미국특허 4,672,032호(슬라프킨)), 경질조직간의 결합(EP-B-0 337 967호 및 EP-B-0 263 086호) 및 피부와 점막과 같은 상처 치료(WO 99/43344호)를 유발할 수 있는 것으로 특허문헌에 예전부터 기재되어 있었다.

발명의 요약

본 발명은 활성 에나멜 물질이 포유류의 면역 메카니즘을 조절하는 능력을 갖고 있다는 놀라운 발견을 기초로 하고 있다. 면역반응 정도를 증가 또는 향상시키는 것으로 정의되는 여기서의 면역조절은 다양한 특정 및 비특정 수단에 의해 생긴 것이다.

따라서 본 발명의 바람직한 구체예는 외부 또는 내부 자극 인자와 같은 면역원에 대한 포유동물의 면역반응 불균일을 특징으로 하는 포유류 상태를 예방 및/또는 치료하기 위한 약제학적 조성물을 제조하기 위한 활성 에나멜 물질의 용도를 포함한다.

"면역반응 불균형"은 쇼크, 화상, 광범위한 외과적 처치 및/또는 외상성 상해후 생길 수 있다. 상기 용어는 1개 이상의 면역계의 작용이 전신적, 비-차별적, 과도한 전신 염증으로 과도하게 자극될 수 있는 반면에, 다른 작용들은 동시에 또는 독립적으로 불충분하게 자극될 수 있는 상황/조건을 설명한다. 용어 "면역반응 불균형"은 면역학적 숙주반응이 제어되지 않는 상황/조건 및 연속적인 임상 상태를 초래하는 것으로 관찰된 세포 활성화의 불균형 상태를 의미한다. 이러한 상태는 급성 상 반응, 전신적 염증, 아네르기, 쇼크, 패혈증, 감염 및/또는 기관 손상일 수 있고 마지막으로 다발성 기관 손상을 초래할 수 있다.

"면역반응 불균형"에 대한 다른 예는 사람의 불활성 면역계가 그 자신의 몸을 공격하는 상황/조건이다. 이들 상황은 공격을 유발하는 항원의 기원 및 공격의 메카니즘과 징후면에서 상이하다. 이들 반응을 흔히 앨러지, 지연된 유형의 과민증, 동종이식(allograft) 및 자가면역 반응이라 칭한다.

용어 "면역반응 불균형"은 상기 기재한 바와 같은 국소적 및 전신적 상황 모두를 기재할 수 있다. 예컨대, 염증은 일반적으로 세포성 손상에 대한 국소적 반응으로 규정되는 반면에, 전신 염증 또는 다발성 기관 손상은 전신 염증의 예이다.

본 발명에서, 용어 "면역원"은 면역반응을 유발할 수 있는 인자를 기재하기 위해 사용된다. 이것은 예컨대 독소, 진균, 기생충, 바이러스, 세균, 화분, 먼지, 오염 입자, 사이토카인, 호르몬, 스트레스, 수술, 화상, 이식된 기관 또는 혈액, 조직편, 쇼크, 외상 또는 비-자가 항원 또는 자가 항원일 수 있다.

면역학적 과민반응은 조직 손상 또는 손상된 체내 작용을 초래하는 면역반응이다. 이들은 조직손상의 메카니즘에 따라서 5개 유형(I-V)으로 분류되며, 이들은 과민증, 천식, 음식 앨러지, 중증근무력증 및 원판상 홍반성루푸스와 같은 다수의 중요한 인간의 질병과 장애에 관여된다.

본 발명의 일개 구체예로서, 활성 에나멜 물질은 면역계의 적어도 일부가 면역원에 대하여 과민반응하는 포유동물에서 상태를 예방 및/또는 치료하기 위한 약제학적 조성물을 제조하기 위해 사용된다. 바람직한 구체예로서, 상기 포유동물의 면역계의 적어도 일부는 따라서 비-차별적으로 자극된다.

본 발명으로 부터 이득을 볼 수 있는 상태는 상기 포유동물의 면역반응의 불균형이 국소적 및/또는 전신적인 상태를 포함한다. 이와 관련하여 전신적이라는 것은 전신에 관련되거나 전신에 공통적인 것으로 규정되며, 즉 국소적인 것과 대조 적으로 전신에 대하여 일반적으로 영향을 주는 것을 의미한다. 상기 상태는 예컨대 류마티스성 관절염, 피부질병, 앨러지, 경화증, 동맥경화증, 다발성 경화증, 천식, 건선, 루푸스, 전신성 원판상 홍반성루푸스, 당뇨병, 중증근무력증, 만성 피로 증후군, 섬유근통, 만성 피로 증후군, 크론씨병, 하시모토씨 갑상선염, 그레이브씨 질병, 아디슨씨 질병, 길리안 바레(Guillian Barre) 증후군 및 피부경화증으로 구성된 군으로부터 선택된 자가면역 질병일 수 있다.

본 발명과 관련하여, 용어 "자가면역 질병"은 80개 이상의 상이한 심각한 만성적 질병을 지칭한다. 자가면역 질병은 암 및 심장병 다음의 미국에서 세번째의 주요 질병군이다. 모든 자가면역 질병의 75 내지 90%가 여성에서, 흔히 출산연령대에서 발병한다. 체내 기관 이외에, 자가면역 질병은 또한 신경, 근육, 혈액, 연결조직, 위장관계 및 모든 체내 계에 영향을 줄 수 있다.

자가면역 질병의 원인은 완전히 알려져 있거나 파악되어 있지 않지만, 호르몬, 유전 및 환경적 요인이 이들의 원인 및 발명에 주요 역할을 하는 것으로 추정된다. 이들 질병의 대부분의 경로는 개별적이며 예상하기 아주 어렵다. 자가면역 질병은 내성 메카니즘의 일반화된 손상을 대표하는 것이 아니라 이들은 특정 자가 항원에 대한 특정 반응 모습을 반영한다.

본 발명에서 예상되는 다른 상태는 전신 염증 및/또는 감염으로 특징화되며 이들은 외상, 화상, 외과수술, 투석, 쇼크 및/또는 세균 감염 또는 바이러스 감염과 관련될 수 있다. 본 발명의 바람직한 구체예로서, 전신 상태는 체외막 산소화(ECMO), 쇼크, 전신 염증성 반응 증후군(SIRS), 패혈증, 다발성 기관 손상, 기관 및/또는 인공삽입물과 같은 이식편의 거부, 심장 및 폐 측관수술, 만성적 염증, 천식 및/또는 폐의 스트레스 관련 질병, 세균 감염, 괴저, 연질 조직 감염 및 상처 감염으로 구성된 군으로부터 선택된 질병과 관련된다.

주요 수술, 전신 염증, 화상 또는 쇼크와 같은 몇개의 심각한 외상은 환자의 면역학적 반응성의 상당한 손상을 초래할 수 있고, 그의 임상적 결과로 심각한 조직파괴와 기관 손상을 유발할 수 있는 심각한 전신 감염에 대한 상해를 입은 개인의 감수성이 높아진다.

본 발명의 일개 구체예로서, 활성 에나멜 물질은, 면역계의 적어도 일부가 이들을 생성하는 기관의 분자, 세포, 또는 조직을 공격하는, 포유동물의 상태를 예방 및/또는 치료하기 위한 약제학적 조성물의 제조를 위해 사용된다. 활성 에나멜 물질은 전신염증 및/또는 감염을 특징으로 하는 포유동물의 상태를 예방 및/또는 치료하기 위한 약제학적 조성물의 제조를 위해 사용된다.

전신적, 비-차별적, 과도한 전신 염증의 경우, 면역계의 일부는 자극되는 반면에, 세포-매개 면역(CMI)의 복합체내의 다른 작용은 현저하게 마비된다. 외상 이후의 면역이상은 세포성 활성화 상태의 결과로 복합체 등급으로 생기며, 이러한 것은 아직 잘 알려져있지 않다. 한가지 알려진 사실은 외상성 스트레스가 완전한 단구-T 세포 상호작용의 분리를 유발하며, 이것은 단구 조절의 현저한 변화 및 T 세포 작용의 실제적인 저하와 관련된다. 본 발명의 바람직한 구체예에서, 활성 에나멜 물질은 환자의 단구-T 세포 상호작용의 균형을 회복하기 위한, 즉 건강한 단구 조절 및 T 세포 작용을 회복하기 위한 약제학적 조성물을 제조하기 위해 사용된 다.

상기와 관련하여, 염증은 모세관 확장, 백혈구 침투, 홍조, 열, 통증, 부종, 및/또는 기능손실 등의 특징을 갖고 또 통상 독성 물질과 손상된 조직의 제거를 개시하는 메카니즘으로 작용하는 세포 손상에 대한 국소적 감응으로 정의된다.

활성 에나멜 물질은 포유동물에서 T-헬퍼 세포 활성화의 개념을 조절하기 위한 약제학적 조성물을 제조하기 위해 본 발명에서 사용된다. 상기 약제학적 조성물에 포함된 활성 에나멜 물질은 세포내 및/또는 세포간 신호생성 물질의 발현, 방출 및/또는 작용 수준을 조절할 수 있다. 약제학적 조성물에 포함된 상기 활성 에나멜 물질은 다르게는 포유동물의 면역 메카니즘에 관여된 하나 이상의 사이토카인의 발현, 방출 및/또는 작용 수준을 조절할 수 있거나, 또는 상기 동일 포유동물의 면역 메카니즘에 관여하는 세포 신호 캐스케이드를 조절할 수 있다.

류마티스성 관절염, 천식, 결핵, 나병, 주혈흡충병, 만성 간염, 갑상선염 및 다발성 경화증과 같은 다수의 공통되고 임상적으로 중요한 질병 상태는 만성 염증 및 그 결과의 예이다. 만성 염증은 자가항원에 대한 자가면역 반응으로 부터 급성 염증성 자극물질을 제거하지 못한 것에 기인할 수 있거나, 또는 지속되는 약한 세기의 천연 만성 자극물질에 의해 유발될 수 있다. 사이토카인 및 성장인자의 공동작용에 의해 유발된 대식세포, 림프구 및 다른 세포의 점증 및 활성화에 의한 동시 염증 및 치료를 특징으로 한다. 본 발명의 바람직한 구체예는 만성 염증을 치료 및/또는 예방하기 위한 약제학적 조성물을 제조하기 위해 활성 에나멜 물질을 사용하는 것을 포함한다.

만성 염증은 과정면에서 가장 적합하게 정의된 것이며, 연속적인 염증과 치료에 의한 조직 치료 시도가 동시에 발생한다. 만성 염증은 흔히 시간 경과면으로 단순히 정의되긴 하지만, 6주간에 걸친 병소의 존재는 전통적으로 만성적인 것으로 간주되며, 이러한 정의는 전체적으로는 자유재량이다. 현미경적 수준에서는, 만성 염증은 때때로 세포 반응 패턴 측면으로 정의되지만, 이것은 가변적이고 전체적으로 신뢰성있는 것은 아니다.

이러한 과정의 특징적인 특성은 급성 염증 반응과 비교하는 것에 의해 가장 잘 알 수 있다. 주요 반응이 자극물질의 제거, 이어 조직 재생 또는 치료를 포함한 회복을 유발하는 급성 염증과 대조적으로, 만성 염증은 염증과 치료가 연속적으로 발생하는 것이 아니라 동시적으로 발생하는 것을 특징으로 한다. 치료는 조직 구조의 파괴를 유발하는 자극물질과 관련되기 때문에 언제나 만성 염증의 특징이다. 치료는 전형적으로 대식세포, 섬유아세포 및 신규 혈관을 포함하는 과립화 조직의 내부성장에 의해 달성된다.

급성 염증과 만성 염증 사이의 다른 중요한 구별점은 염증 반응에서 우세한 세포 유형 뿐만 아니라 삼출 및 세포 점증 사이의 상대적 균형에 관한 것이다. 만성 염증의 경우, 삼출성 반응이 덜 현저하고 염증성 세포 점증은 전형적으로 증가하며, 이것은 국소적 세포 증식을 동반할 수 있다. 다수의 호중구 백혈구의 점증을 통상 특징으로 하는 급성 염증과 대조적으로, 모든 형태의 만성 염증에서 우세한 침투 세포는 대식세포이다. 자극물질의 성질에 따라서, 상이한 특징의 염증 매개제와 성장인자(집합적으로 사이토카인이라 칭함)가 국소적으로 생성되어, 상이한 형태학적 패턴의 만성염증을 유발한다.

염증의 전신적 효과는 만성 염증 질병에서 더욱 현저하며 임상적 결과에도 상당하게 영향을 줄 수 있다. 이들 전신적 효과는 주로 사이토카인에 의해 매개된다. 급성 염증의 대부분의 유명한 전신적 효과는 발열 및 백혈구증가증인 반면에, 만성염증은 통상 피로, 졸음, 체중감소 및 쇠약화와 관련된다.

본 발명에 관련된 상태 및/또는 질병이 감염으로 특징화되면, 상기 상태는 그램 양성 미생물 및 그램 음성 미생물 1) G+: G+ 미생물의 특수한 세포벽 성분인 내독소 펩티도글리칸(PepG)을 방출할 수 있는 예컨대 포도상구균(Staphylococci) 및 연쇄상구균(Streptococci); 및 2) G-: 대장균군(Coli-forms) 및 감염중에 외부 세포 엔빌로프로 부터 LPS(lipopolysaccharide)를 방출하는 기타 미생물로 구성된 군으로부터 선택된(이들에 한정되는 것은 아님) 세균에 의한 감염에 의해 유발될 수 있다. 면역학적 상태는 상기 감염성 미생물에 의해 생성된 내독소 및/또는 외독소에 의해 유발된다.

본 발명에서, 황색포도상구균(Staphylococcus aureus)으로 부터 얻은 내독소(PepG) 및 대장균으로부터 얻은 내독소(LPS)에 의해 유발된 인간의 혈액에서 세포성 반응은 실시예 1에 도시한 바와 같이 아멜로게닌을 투여하는 것에 의해 효과적으로 조절할 수 있다. 이들 결과는 포유동물에서의 면역 메카니즘에 대한 활성 에나멜 물질의 강력한 조절 효과를 분명하게 나타낸다.

본 발명자에 의해 실시되고 본 출원에 실시예 2로서 인용증거가 첨부되어 있는 다른 실험으로서, 패혈증에 대한 모델로 돼지를 사용하여 에나멜 기질 유도체의 치료 능력을 생체내에서 조사한다.

대형 거환(big bolus) 주사에 의해서도 전달되는 EMD는 고 투여량을 전신적으로 투여하기에 안정한 것으로 나타낸 실험 2에 있다. 또한, 에나멜 기질 유도체의 전신적 주사는 돼지에서 내독소(LPS)의 효과를 상쇄시키는 것으로 밝혀져 있다. 일반적으로, 샴 수술받은 돼지와 비교하여, 치료된 돼지에서 패혈증 쇼크의 개시는 지연된다. 이러한 지연은 투여량에 따라 다르며, 1 mg/kg(체중)은 짧은 지연(약 30분)을 유발하지만, 5 mg/kg 투여량은 패혈증 쇼크의 개시와 그와 관련된 다발성 기관 손상의 개시를 방지하거나 적어도 현저히 지연(>5시간)시킨다.

LPS 유도된 쇼크에 대한 에나멜 기질 유도체의 유리한 효과를 설명할 수 있는 한가지 가능한 메카니즘은 에나멜 기질 유도체가 LPS에 결합함으로써 독성 효과를 불활성화시키는 것이다. 다르게는, 마찬가지로 상상할 수 있는 가능성은 에나멜 기질 유도체가 예컨대 백혈구 세포, 대식세포, 뼈파괴세포 및/또는 비만세포상의 동일 수용체에 대하여 LPS와 경쟁하는 것이다. 따라서, 본 발명의 바람직한 구체예는 약제학적 조성물을 제조하기 위한 활성 에나멜 물질의 용도에 관한 것으로, 상기 활성 에나멜 물질은 내독소 및/또는 외독소에 직접적으로 결합되는 것에 의해 및/또는 내독소 및/또는 외독소에 대한 세포성 수용체에 결합되는 것에 의해, 미생물에 의해 생산된 내독소 및/또는 외독소의 독성 효과를 불활성화시키는 것을 특징으로 한다.

세번째의 가능성이 아주 높은 메카니즘은 에나멜 기질 유도체가 LPS 유도된 패혈증 쇼크에서 주요한 역할을 하는 사이토카인 및 시그널 분자의 발현 캐스케이 드를 바람직한 방식으로 조절하는 것에 의해 직접적으로 면역반응을 조절하는 것이다. 본 출원에는 기재되어 있지 않은 종전의 체외 실험을 기준으로 하면, 에나멜 기질 유도체의 효과의 적어도 일부를 후자 메카니즘 탓으로 보는 것이 합리적일 것으로 보인다. 또한, 실시한 혈액 분석도 또한 에나멜 기질 유도체가 백혈구 세포에서 사이토카인 발현에 대하여 직접적인 효과를 갖는다는 것을 제시한다. 이러한 효과는 TNF 및 IL-6에 대해서는 강한 효과를 나타내지만 IL-1β에 대해서는 아무런 효과를 갖지 않는 특이성을 나타내는 것으로 보인다. 결국, 상기에서 제시된 모든 메카니즘이 관여하고 또 상기 모델에서 에나멜 기질 유도체의 이로운 효과를 내는 상기 효과의 조합이라는 것도 가능하다.

실시예 2에 보고된 것과 같은 패혈증 쇼크의 개시 지연은 중요한 임상적 의의를 갖는다. 본 발명의 예상가능한 일개 구체예에서, 상기 지연은 혈액에서 "자유" LPS의 양과 직접적으로 관련되며 또 에나멜 기질 유도체는 심각한 균혈증 및 수막염과 같은 감염증에서 항생물질에 대한 첨가물로서 전달되어 독소의 효과를 지연 및/또는 감소시킬 것이다. 이러한 치료는 항생물질 치료의 개시 이후의 중대한 시간 동안 환자의 생존에 대하여 결정적일 것이다.

다른, 동일하게 바람직한 구체예로서, 에나멜 기질 유도체의 효과는 염증 반응의 직접적 조절에 의해 유발되므로, 에나멜 기질 유도체는 쇼크가 가능한 복합증인 다양한 임상적 상황에서 이용될 수 있다. 이것은 모든 주요 수술, 이식, 외상, ECMO, 급성 투석, 심각한 감염, 심각한 앨러지 및 그밖의 다수를 포함한다.

본 발명의 범위를 한정하려는 의도가 아닌 본 명세서에 기재된 활성 에나멜 물질이 포유동물의 면역계를 조절할 수 있는 메카니즘에 대한 한가지 이론적 설명은 ICAM, HLA 항원, 인터루킨 1 수용체, 인터루킨 2 수용체, 인터루킨 3 수용체, 인터루킨 4 수용체, 인터루킨 5 수용체, 인터루킨 6 수용체, 인터루킨 7 수용체, 인터루킨 8 수용체, 인터루킨 9 수용체, 인터루킨 10 수용체, 인터루킨 11 수용체, 인터루킨 12 수용체, 인터루킨 13 수용체, 인터루킨 14 수용체, 인터루킨 15 수용체, 인터루킨 16 수용체, 인터루킨 17 수용체, 인터루킨 18 수용체, IFNα 수용체, IFNβ 수용체, IFNΔ수용체, IFNγ 수용체, IFNΩ 수용체 PDGF 수용체, TGF 수용체, TNF 수용체, EGF 수용체, CD44 변이체 및 인테그린 수용체 패밀리로 구성된 군으로부터 선택된, 세포 표면 수용체 및/또는 세포 표면 구조와의 상호작용이다.

세포 표면 수용체는 각 신호 분자, 리간드에 의해 활성화될 때 세포 전달의 공지된 매개체이다. 세포 표면 수용체는 높은 친화성 또는 낮은 친화성으로 리간드와 반응하여 세포외 신호를 표적 세포의 거동을 변경시키는 1개 이상의 세포내 신호로 전환시킨다. 활성 에나멜 물질은 유사한 방식을 통하여 표적 세포의 거동을 변경시키는 것에 의해 면역 계를 조절할 수 있다. 따라서, 본 발명의 일개 구체예에서, 활성 에나멜 물질은 세포 표면 수용체를 활성화하는 것에 의해, 수용체 특이적 세포내 신호 캐스케이드를 유발하고 1개 이상의 유전자의 발현을 변경시켜 상기 세포 거동의 변경을 초래한다.

본 발명의 다른 구체예로서, 활성 에나멜 물질은 소위 촉매적 수용체로 불리는 효소로서, 직접적으로 작용하는 세포 표면 수용체를 활성화시킬 수 있고, 그 예는 티로신 키나제로 작용하는 세포질 도메인을 갖는 막관통(transmembrane) 단백질 이다.

본 발명의 다른 바람직한 구체예로서, 활성 에나멜 물질은 별도의 플라즈마 막 결합 효소 또는 이온 채널을 간접적으로 활성화하거나 불활성화하는 G-단백질-결합된 표면 수용체를 활성화한다. 수용체 및 효소 및/또는 이온 채널간의 상화작용은 전형적으로 비제한적인 시클릭 AMP, InsP3 및 Ca²⁺과 같은 세포내 매개제를 활성화하는 G 단백질(GTP-결합 조절 단백질)과 같은 제3 단백질에 의해 매개된다.

인터루킨, IFNγ 및 TNFα와 같은 사이토카인은 면역반응의 조절에 중요한 역할을 발휘한다. T 세포가 TH₁ 및 TH₂ 부분집합으로 분화함에 따른 사이토카인 유전자 조절에 대하여 특별한 관심이 집중되었다. 사이토카인의 효과는 예컨대 시그널 도입 경로를 개시하는 특정 수용체를 통하여 매개될 수 있으며, 이는 그 자체로 피드백 메카니즘에서 사이토카인의 방출을 초래할 수 있다.

실시예 1에 예시된 바와 같이, 아멜로게닌은 세균의 세포벽 산물에 대응한 염증성 표면 수용체의 사이토카인 방출 및 조절에 대하여 조절 효과를 갖는다. 따라서 본 발명의 구체예는 IL-2R, IL-4R, IL-10R, IFNγR 및 TNFαR과 같은 사이토카인 수용체를 통한 신호를 매개에 의해 면역반응을 조절하기 위한 약제학적 조성물을 제조하기 위한 활성 에나멜 물질의 용도를 개시한다. 다르게는, 사이토카인의 방출은 이들의 발현 수준에 의해 조절되므로, 활성 에나멜 물질은 포유동물에서 하나 이상의 사이토카인의 발현 수준의 상향 및/또는 하향 조절을 개시하는 것에 의해 면역반응을 조절할 수 있으므로, 하나 이상의 사이토카인의 방출 및/또는 작 용을 조절한다.

본 발명의 특히 바람직한 구체예로서, 활성 에나멜 물질은 TNFαR을 통한 면역반응의 조절을 매개한다. TNFα 수용체는 적혈구를 제외한 모든 체세포 유형 상에서 발현된다. 55 kDa (TNF-R1; CD120a로도 나타냄: TNF 수용체 수퍼패밀리 멤버 1A (TNF-RSF1A)로도 지칭함) 및 75 kDa (TNF-R2; CD120b로도 나타냄, TNF 수용체 수퍼패밀리 멤버 1B (TNF-RSF1B)로도 지칭함)의 2개의 수용체가 기재되었다. TNFαR은 NGF의 저친화성 수용체 및 인간의 세포 표면 항원 CD40에 관련된 것이고 자극된 T-세포 및 B-림프구상에서 강하게 발현된다. 제3 수용체 서브타입은 정상 인간 간에서 발현된다. 이것은 TNFα에는 결합되지만 TNFβ에만 결합되지 않는다.

2개의 수용체 서브타입의 상이한 효과가 밝혀졌다. p55 수용체의 관여는 세포성 접착 분자 ICAM-1, E-셀렉틴, V-CAM-1 및 CD44의 도입을 특이적으로 초래하는 반면에, p55 및 p75 수용체의 관여는 α-2 인테그린의 발현을 유도한다. 막-결합 수용체와는 별도로, TNF에 결합되는 몇개의 용해성 단백질이 기재되었다. 약 30 kDa의 이들 단백질- T-BP-1 및 T-BP-2(종양 괴저 인자 결합 단백질)로 불림-은 막 수용체의 TNF-결합 도메인으로부터 유도된다. 이들은 TNF가 그의 수용체에 결합되는 것을 억제하는 것에 의해 TNF 활성의 생리학적 조절제로서 작용한다.

IL-2의 생물학적 활성은 배타적으로 활성화된 T-세포상에서만 발현되고 휴지기 T-세포상에서는 발현되지 않는 막 수용체에 의해 매개된다. IL-5 및 IL-6은 IL-2 수용체의 발현을 조절한다. 본 발명의 다른 바람직한 구체예로서, 활성 에나멜 물질은 IL-2R을 통한 면역반응의 조절을 매개하는 것을 포함한다.

IL-2 수용체의 3가지의 상이한 유형은 상이하고 또 독립적으로 발현되는 것으로 구별된다. 고친화성 IL-2 수용체는 세포에 의해 발현된 모든 IL-2 수용체의 약 10%를 구성한다. 이 수용체는 2개의 서브유닛 IL-2R-알파 (TAC 항원 = T-세포 활성화 항원; p55) 및 IL-2R-베타 (p75; 새로이 CD122로 표시)로 구성된 막 수용체 착물이다. p75는 휴지기 T-림프구, NK-세포 및 다수의 다른 세포 유형 상에서 구성적으로 발현되는 반면에, p55의 발현은 세포 활성화 이후에만 통상 관찰되었다. p75는 IL-2 매개 신호 도입에 관여한다. 또한, IL-2 수용체는 수용체 사슬이 구조적 변화, 수용체-매개된 내식작용, 및 다른 신호 도입 과정을 매개하는데 관여하는 것으로 추정되는 다수의 다른 단백질(p22, p40, p100)과 관련된다. 확인된 단백질의 하나는 세포-대-세포 접촉 영역에서 IL-2 수용체를 집중시키는 95 kDa 세포 접착 분자 ICAM-1이며 따라서 T-세포의 IL-2 매개된 자극동안 측분비(paracrine) 활성을 매개할 수 있다. p75와 관련된 다른 단백질은 Ick로 불리는 티로신-특이적 단백질 키나제이며, 다른 키나제는 IL-2 수용체와 관련될 수 있다. fyn 및 lyn으로 불리는 이러한 2개의 키나제가 확인되어 있다. 또한, IL-2 수용체 신호는 vav에 의해 또한 매개될 수 있다. 감마로도 표시되는 IL-2 수용체의 제3 64 kDa 서브유닛이 최근 개시되었다. 이 서브유닛은 고치환성 및 중간정도의 친화성 IL-2 수용체의 생성에 필요하지만 IL-2 자체에 결합하지는 않는다. IL-2 수용체의 감마 서브유닛은 IL-4 및 IL-7에 대한 수용체의 성분인 것으로 최근 밝혀졌다. 이것은 또한 IL-13 수용체의 성분이기도 하다.

활성화된 림프구는 연속적으로 TAC 항원의 42 kDa 단편을 분비한다. 이 단 편은 혈청과 혈장 사이를 순환하고 용해성 IL-2 수용체(sIL-2R)로 작용한다. 용해성 수용체의 농도는 상이한 병인성 상황으로 현저하게 변화한다.

본 발명의 다른 바람직한 구체예로서, 활성 에나멜 물질은 IFNγR을 활성화한다. 70 내지 160 kDa 범위의 분자량을 갖는 다수의 결합 단백질이 IFNγR로 기재되어 있다. 이들은 성숙한 적혈구를 제외한 모든 유형의 인간 세포상에서 발현된다. 단구 및 기타 조혈세포에서 발현된 수용체는 140 kDa의 분자량을 갖는다. 54 kDa 단백질은 다른 세포 유형에서 관찰된다.

IL-4의 생물학적 활성은 IL-4 수용체(IL-4R)에 의해 매개된다. 본 발명의 바람직한 구체예로서, 활성 에나멜 물질은 IL-4R을 활성화시킨다. IL-4 수용체의 세포외 도메인은 Epo의 수용체, IL-6 및 IL-2 수용체의 베타 사슬과 관련된다. 이것을 CD124로 명명하였다. 2개 형태의 수용체가 기재되었으며, 그중 하나는 분비된다. 분비된 수용체는 세포외 IL-4 결합 도메인만을 함유하며 IL-4 활성을 차단시킬 수 있다. IL-4 수용체와 동일한 친화도로 IL-4에 결합되는 IL-4 결합 단백질(IL-4-BP)는 용해성 IL-4 수용체 변이인 것으로 드러났다. 용해성 수용체는 수용체 결합을 억제하는 것에 의해 또는 수송 단백질로 작용하는 것에 의해 사이토카인 활성의 생리학적 조절제로서 작용한다. IL-4 매개된 세포내 신호 도입의 메카니즘은 거의 알려져 있지 않다. IL-4는 세포내 칼슘 수준에 영향을 주며 또 이노시톨 인지질 및 단백질 키나제 C의 대사에도 영향을 준다.

사람에서, IL10은 활성화된 CD8⁺ 말초혈액 T-세포에 의해, 항원-특이적 및 폴리클로날 활성화 후 Th₀, Th₁- 및 Th₂-유사 CD4⁺ T 세포 클론에 의해, B-세포 림프종에 의해 및 LPS-활성화된 단구 및 비만세포에 의해 생성된다. IL-4 및 IL-10은 단구에 의한 IL10의 합성을 억제한다. 본 발명의 바람직한 구체예에서, 활성 에나멜 물질은 IL-10 수용체(IL-10R)을 활성화시킨다. 쥐의 IL-10 수용체는 클로닝되었다. 이 수용체는 쥐의 IL-10과 특이적으로 결합되는 약 110 kDa의 단백질이다. 이 수용체는 IFN에 대한 수용체와 구조적으로 관련이 있다.

말초 림프구에 대한 에나멜 기질 유도체의 효과는 돼지의 아멜로게닌 유도체 Emdogain®가 시험관내에서 CD25/CD4 양성 림프구 증식을 약간 증가시키고 또 CD19 양성 B-림프구의 동시적 감소를 유도함을 보여준다(Petinaki, E., S. Nikolopoulos 및 E. Castanas. 1998. Low Stimulation of peripheral lymphocytes,following in vitro application of Emdogain. J Clin Periodontol. 25: 715-20). 그러나 상기 작가들은 면역글로불린 및/또는 사이토카인(IL-2 및 IL-6) 생산에 대한 어떠한 중요한 영향을 증명하지 못하였다.

흥미로운 것은, 본 발명자들은 섬유아세포의 다양한 세포 배양액(치주인대, 물고기 지느러미 또는 새의 피부로 부터 유도된 배, 피부)은 EMDOGAIN® (BIORA AB 제조, 스웨덴)으로 자극될 때, 자극되지 않은 배양액과 비교하여, 형질전환성 성장인자(TGF-β1)를 2배 정도 생산함을 밝혀내었다. 이러한 발견은 활성 에나멜 물질이 면역반응 불균형에 대하여 강력한 조절 영향을 갖는다는 개념을 지지해준다.

에나멜 기질는 에나멜의 전구체이며 관련된 천연 공급원, 즉 치아가 발육중 인 포유동물로 부터 얻을 수 있다. 적합한 공급원은 도살된 동물, 예컨대 송아지, 돼지 또는 양으로 부터 얻은 발육중인 치아이다. 다른 공급원은 예컨대 물고기 지느러미이다.

에나멜 기질는 종래기술에 기재된 바와 같이(EP-B-0 337 967호 및 EP-B-0 263 086호) 발육중인 치아로 부터 제조할 수 있다. 에나멜 기질는 긁어낼 수 있고 또 에나멜 기질 유도체(EMD)는 예컨대 완충액, 희석 산 또는 염기 또는 물/용매 혼합물과 같은 수용액을 사용하여 추출한 다음, 크기배제 추출하고, 탈염 또는 기타 정제 단계를 거치거나, 다르게는 동결건조시키는 것에 의해 제조한다. 효소는 열처리 또는 용매처리에 의해 탈활성화될 수 있으며, 이 경우 상기 유도체는 동결건조없이 액체 형태로 저장될 수 있다.

에나멜 기질 유도체 또는 단백질의 다른 공급원으로서, 당업자에게 널리 공지된 일반적으로 이용가능한 합성 경로를 이용하거나, 또는 DNA-수법에 의해 경우에 따라 변형될 수 있는 배양된 진핵생물 세포 및/또는 원핵생물 세포를 사용할 수 있다. 상기 에나멜 기질 단백질은 재조합 기원일 수 있고 또 다르게는 유전적으로 변형된 것일 수 있다(예컨대 Sambrook, J. 등: Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989 참조).

본 발명과 관련하여, 에나멜 기질 유도체, 또는 에나멜 기질 단백질 유도체(EMD)는 접합(스플라이싱) 또는 가공에 의해 천연적으로 또는 천연 길이의 단백질을 효소적으로 또는 화학적으로 분해시키는 것에 의해, 또는 시험관내 또는 생체내에서 폴리펩티드를 합성하는 것에 의해 (재조합 DNA법 또는 식물 또는 동물 세포인 2배체 세포의 배양) 1개 또는 몇개의 에나멜 기질 단백질 또는 그러한 단백질의 일부를 포함하는 에나멜 기질의 유도체이다. 에나멜 기질 단백질 유도체는 또한 에나멜 기질 관련된 폴리펩티드 또는 단백질을 포함한다. 이들 폴리펩티드 또는 단백질은 폴리아민 산 또는 다당류 또는 이들의 조합과 같은 적합한 생분해성 담체 분자에 결합될 수 있다. 또한 상기 용어 에나멜 기질 유도체는 또한 합성 유사체 물질도 포함한다.

단백질은 펩티드 결합에 의해 함께 결합된 아미노산 잔기에 의해 구성된 생물학적 고분자이다. 아미노산의 선형 중합체인 단백질은 또한 폴리펩티드로 불린다. 전형적으로, 단백질은 50-800개 아미노산 잔기를 가지므로 약 6,000 내지 약 수십만 달톤 이상의 범위의 분자량을 갖는다. 작은 단백질은 펩티드 또는 올리고펩티드라 칭한다.

에나멜 기질 단백질은 에나멜 기질, 즉 에나멜의 전구체에 보통 존재하는 단백질(Ten Cate: Oral Histology, 1994; Robinson: Eur. J. Oral Science, Jan. 1998, 106 Suppl. 1: 282-91), 또는 그러한 단백질의 분해에 의해 얻을 수 있는 단백질이다. 일반적으로, 이러한 단백질은 120,000 달톤 이하의 분자량을 갖고 또 아멜로게닌, 비-아멜로게닌, 프롤린-풍부한 비-아멜로게닌 및 투프트엘린(tuftelin)을 포함한다.

본 발명에 따라 사용될 수 있는 단백질의 예는 아멜로게닌, 프롤린-풍부 비-아멜로게닌, 투프트엘린, 투프트 단백질, 혈청 단백질, 타액 단백질, 아멜로블라스틴, 에나멜 초 단백질(sheathlin) 및 그의 유도체, 및 그의 혼합물이다. 본 발명 에 따라 사용하기 위한 활성 에나멜 물질을 함유하는 제제는 2개 이상의 상술한 단백질성 물질을 함유할 수 있다. 또한, 본 발명에 따라 사용하기 위한 다른 단백질은 시판되는 제품 EMDOGAIN® (BIORA AB 제조, 스웨덴)에서 찾아 볼 수 있다.

EMDOGAIN® (BIORA AB 제조, S-205 12 말뫼, 스웨덴)은 잔류하는 프로테아제를 불활성화시키기 위하여 약 80℃에서 3시간 동안 가열된 30 mg의 에나멜 기질 단백질 및 1 ml 운반체 용액(프로필렌 글리콜 알기네이트)를 함유하며, 이들은 상기 단백질과 운반체가 별도로 시험되지 않는 한 적용하기 전에 혼합된다. 중량비는 20, 14 및 5 kDa에서 각기 주요 단백질 피이크 사이의 80/8/12 이다.

일반적으로, 에나멜 기질의 주요 단백질은 아멜로게닌으로 알려져 있다. 이들은 기질 단백질의 약 90% w/w를 구성한다. 나머지 10% w/w는 프롤린-풍부 비-아멜로게닌, 투프트엘린, 투프트 단백질, 혈청 단백질 및 하나 이상의 타액 단백질을 포함한다; 그러나, 다른 단백질은 예컨대 에나멜 기질과 관련된 것으로 확인된 아멜린(아멜로블라스틴, 에나멜 초 단백질)과 같은 것일 수 있다. 또한, 다양한 단백질은 몇개의 상이한 크기(즉, 상이한 분자량)로 합성되거나 및/또는 가공될 수 있다. 따라서, 에나멜 기질에서 주요 단백질, 아멜로게닌은 초분자량 응집물을 함께 형성하는 몇개의 상이한 크기로 존재하는 것으로 밝혀졌다. 이들은 생리학적 조건하에서 응집물을 형성하는 현저한 소수성 물질이다. 이들은 다른 단백질 또는 펩티드를 전달하거나 그에 대한 담체일 수 있다.

형성되는 치아 에나멜의 아멜로게닌은 조직 특이적 단백질이며, 프롤린, 로이신, 히스티딘 및 글루타밀 잔기가 풍부하며 또 내부 에나멜 상피의 에나멜아세포(아멜로블라스트) 세포에 의해 합성된다. 이들 단백질은 히드록시아파타이트 상에 의해 무기화되는 세포외 기질의 괴상을 포함하여 성숙 에나멜로 된다. 다수의 포유동물로 부터 얻은 아멜로게닌의 아미노산 서열을 조사하면 고도의 진화성 서열 보존을 나타내는데, 이는 특정 기능을 제시한다. 최근 기질에서 발견된 복수의 아멜로게닌 성분은 분비후 일련의 단백질 분해 처리에 의해 및 다르게는 성 염색체상에 취이하는 아멜로게닌 유전자로 부터 생성된 접합된 mRNA의 발현에 의해 생성된다는 것이 밝혀졌다. 재조합 아멜로게닌의 물리화학적 연구는 이들이 시험관내에서 자가-조립을 거쳐 초-분자량 '나노구' 구조를 생성함을 나타내었고 또 생체내에서 최근의 발견은 최초의 무기 결정체(crystallite)의 조직화된 형성에 공헌하는 무기 결정분비성 에나멜 기질의 울트라구조의 조직의 나노구에 대한 기능적 역할을 제시한다.

아멜로게닌 발현에 대한 최근의 연구는 마우스 아멜로게닌 RNA를 교대로 접합하면 7개의 뚜렷한 mRNA를 생성하며, 이것은 194 내지 44 아미노산 잔기 길이의 아멜로게닌 단백질을 코딩한다.

다른 단백질 물질도 또한 본 발명에 따라 적합하게 사용될 수 있다. 그 예는 프롤린-풍부 단백질 및 폴리프롤린과 같은 단백질이다. 본 발명에 따라 적합하게 사용될 수 있는 것으로 생각할 수 있는 물질의 다른 예는 단백질의 응집물, 에나멜 기질 유도체 및/또는 에나멜 기질 단백질 뿐만 아니라 에나멜 기질, 에나멜 기질 유도체 및 에나멜 기질 단백질의 대사물질을 포함한다. 상기 대사물질은 단백질의 크기에서 부터 짧은 펩티드의 크기에 이르는 크기일 수 있다.

상술한 바와 같이, 본 발명에 따라 사용될 수 있는 단백질, 폴리펩티드 또는 펩티드는 전형적으로 SDS PAGE 전기영동법에 의해 결정된 바와 같은 많아야 100 kDa, 90 kDa, 80 kDa, 70 kDa 또는 60 kDa와 같은 많아야 120 kDa의 분자량을 갖는다.

본 발명에 따라 사용될 수 있는 단백질은 보통 제제 형태로 존재할 수 있으며, 이때 제제중의 활성 에나멜 물질의 단백질 함량은 약 0.005% w/w 내지 100%w/w, 예컨대 약 0.5-99% w/w, 약 1-95% w/w, 약 10-95% w/w, 약 10-90% w/w, 약 15-90% w/w, 약 20-90% w/w, 약 30-90% w/w, 약 40-85% w/w, 약 50-80% w/w, 약 60-70% w/w, 약 70-90% w/w, 또는 약 80-90% w/w 범위이다.

본 발명에 따라 사용하기 위한 활성 에나멜 물질의 제제는 상이한 분자량을 갖는 활성 에나멜 물질의 혼합물을 또한 함유할 수 있다.

에나멜 기질의 단백질은 고분자량 부분과 저분자량 부분으로 대별될 수 있으며, 또 에나멜 기질 단백질의 잘 정의된 분획은 치주 결함(즉, 치주 상처) 치료와 관련한 중요한 특성을 보유하고 있음이 밝혀졌다. 이 분획은 일반적으로 아멜로게닌으로 불리는 아세트산 추출가능한 단백질을 함유하며 또 에나멜 기질의 저분자량 부분을 구성한다(EP-B-0 337 967호 및 EP-B-0 263 086호 참조).

본 발명과 관련하여, 활성 단백질은 에나멜 기질의 저분자량 부분에 한정되지 않는다. 현재로서, 바람직한 단백질은 약 60,000 달톤 이하의 분자량(SDS-PAGE를 이용하여 시험관내에서 측정)을 갖는 아멜로게닌, 투프트엘린 등과 같은 에나멜 기질 단백질을 포함하지만, 60,000 달톤 이상의 분자량을 갖는 단백질은 연결조직 성장을 촉진하기 위한 물질로서 유망한 특성을 갖는다.

따라서, 본 발명에 따라 사용하기 위한 활성 에나멜 물질은 약 5,000 Da 및 약 25,000 Da의 분자량과 같은 약 40,000 Da 이하의 분자량을 갖는다.

석출, 이온 교환 크로마토그래피, 보존적 전기영동법, 겔 투과 크로마토그래피, 역상 크로마토그래피 또는 친화성 크로마토그래피에 의해 단백질을 분해함으로써, 상이한 분자량을 갖는 아멜로게닌을 정제할 수 있다.

조합된 분자량의 아멜로게닌은 주된 20 kDa 화합물에서부터 40 내지 5 kDa 범위의 상이한 분자량을 갖는 아멜로게닌의 응집물 및 주된 5 kDa 화합물에 이르기 까지 다양할 수 있다. 에나멜 기질에서 흔히 볼 수 있는 투프트엘린 또는 단백질 분해 효소와 같은 다른 에나멜 기질 단백질은 부가되어 아멜로게닌 응집물에 의해 전달될 수 있다.

본 발명의 특히 바람직한 구체예로서, 면역원에 대한 포유동물의 면역반응의 불균형을 특징으로 하는 포유동물의 상태를 예방 및/또는 치료하기 위한 약제학적 조성물을 제조하기 위해 사용되는 상기 활성 에나멜 물질은 도 2에 도시된 바와 같은 가공된 아멜로게닌의 HPLC 분석의 제3 및/또는 제4 피이크로 표시되는 용출물에 포함되는, 예컨대 2-4.5 kDa, 3-5.5 kDa, 4-6.5 kDa, 5-7.5 kDa 또는 5-13 kDa 아미노산 길이를 갖는 펩티드를 기본으로 하는 용해성 아멜로게닌을 비롯한 약 2-13 kDa의 아미노산 길이를 갖는 펩티드를 기본으로 하는 용해성 아멜로게닌으로 구성된 군으로부터 선택된다.

본 발명의 바람직한 구체예에서, 상기 가공된 아멜로게닌 산물은 5 kDa 폴리 펩티드이다.

본 발명에 따르면, 활성 에나멜 물질은 항균, 항염증, 항바이러스, 항진균 물질과 같은 다른 활성 약물 물질과 함께 또는 국소적 화학요법, 세포자살의 유도물질, 성장인자, 예컨대 TGFβ, PDGF, IGF, FGF, EGF, 케라티노사이트 성장인자 또는 그의 펩티드 유사체와 조합하여 사용할 수 있다. 에나멜 기질 또는 그의 제제에 고유하게 존재하거나 또는 부가된 효소는 에나멜 기질, 에나멜 기질 유도체 및/또는 에나멜 기질 단백질, 특히 프로테아제와 함께 사용될 수 있다.

개체(동물 또는 인간)에 투여되면, 활성 에나멜 물질 및/또는 그의 제제는 바람직하게는 활성 에나멜 물질 및 경우에 따라 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 부형제를 함유하는 약제학적 조성물로 제형화된다.

투여할 활성 에나멜 물질을 포함하는 조성물은 적합한 경로에 의해, 예컨대 호스, 주사기, 분무 또는 드레인 기구를 통하여 환자에 전신투여하는 것에 의해 투여에 맞게 개질될 수 있다. 또한, 조성물은 혈액, 림프, 복수 또는 척수액으로 주입하는 것에 의해 또는 흡입에 의해 전신 투여하는 등의 수술과 관련하여 투여하도록 개질될 수 있다.

이하에서는, 활성 에나멜 물질을 함유하는 적합한 조성물의 예를 설명한다.

개체(동물 또는 인간)에게 투여하기 위해, 상기 물질은 상기 물질 및 경우에 따라 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 부형제를 함유하는 약제학적 조성물로 제형화되는 것이 바람직하다.

상기 조성물은 액체, 반고체 또는 고체 조성물 형태일 수 있지만, 멸균 염 수, 링거액, 글루코오스 용액, 인산염 완충액 염수, 혈액, 혈장 또는 물, 분말, 미세캡슐, 미세구, 나노입자, 스프레이, 에어로졸, 흡입기구, 용액, 분산제, 현탁제, 유제, 혼합물과 같은 용해된 주입 액체에 한정되는 것은 아니다.

상기 조성물은 통상의 약제학적 실시방법에 따라 제형화될 수 있다. 예컨대 "Remington: The sceince and practice of pharmacy" 20^th ed. Mack Publishing, Easton PA, 2000 ISBN 0-912734-04-3 및 "Encyclopaedia of Pharmaceutical Technology", edited by Swarbrick, J. & J. C. Boylan, Marcel Dekker, Inc., New York, 1988 ISBN 0-8247-2800-9 참조.

활성 물질을 포함하는 약제학적 조성물은 약물 전달 계로 작용한다. 본 발명과 관련하여, 용어 "약물 전달 계"는 투여되면 활성물질을 인체 또는 동물 체내로 제공하는 약제학적 조성물(약제학적 제형 또는 투여형태)을 의미한다. 따라서 용어 "약물 전달 계"는 액체, 분말 및 스프레이와 같은 보통의 약제학적 조성물을 포함한다.

본 발명에 따라 사용하기 위한 조성물에서 약제학적으로 허용되는 부형제 및 그의 최적 농도의 선택은 일반적으로 예상할 수 없고 그의 실험 측정을 기초로 하여 결정되어야한다. 약제학적으로 허용되는 부형제가 약제학적 조성물에 사용하기에 적합한지 여부는 일반적으로 어떤 종류의 투여형태를 선택하는지에 따라 달라진다. 그러나, 약제학적 조성물 분야의 당업자들은 "Remington: The sceince and practice of pharmacy" 20^th ed. Mack Publishing, Easton PA, 2000 ISBN 0-912734- 04-3"에서 모범을 찾을 수 있다.

약제학적으로 허용되는 부형제는 조성물이 투여될 개체에 대해서는 실질적으로 무해한 물질이다. 이러한 부형제는 일반적으로 천연 약제에 의한 요건을 충족한다. 영국 약전, 미국 약전 및 유럽 약전과 같은 공식적인 약전은 주지된 약제학적으로 허용되는 부형제에 대한 기준을 설정하고 있다.

이하에서는 본 발명에 따라 사용하기 위한 관련 약제학적 조성물에 대한 개요를 나타낸다. 이 개요는 특정 투여 경로를 기초로 하고 있다. 그러나, 약제학적으로 허용되는 부형제가 상이한 투여 형태로 이용될 수 있는 경우에 있어서, 특정 약제학적으로 허용되는 부형제의 적용은 특정 투여형태 또는 특정 부형제 작용에 한정되지 않는다.

비경구적 조성물:

전신 적용을 위하여, 본 발명에 따른 조성물은 미세구 및 리포좀을 비롯한 본 발명에 따른 통상적인 비독성의 약제학적으로 허용되는 담체 및 부형제를 함유할 수 있다.

본 발명에 따라 사용하기 위한 조성물은 모든 종류의 고체, 반고체 및 액체 조성물을 포함한다. 특정 관련의 조성물은 예컨대 용액, 현탁액, 유제이다.

약제학적으로 허용되는 부형제는 용매, 완충제, 보존제, 킬레이트제, 산화방지제, 안정화제, 유화제, 현탁제, 희석제를 포함할 수 있다. 상이한 물질의 예는 이하에 나타낸다.

가장 바람직한 구체예로서, Emdogain® (BIORA AB 제조, 스웨덴 말뫼 소재) 의 동결건조된 분말을 인산염 완충된 염수(PBS)에 최종 농도 30 mg/ml로 용해시킨다.

다른, 동일하게 바람직한 구체예는 0.01-50 mg/ml의 최종 농도, 예컨대 0.01-10 mg/ml, 0.1-10 mg/ml, 0.01 - 5 mg/ml, 0.1-5 mg/ml, 0.01-1 mg/ml, 0.1-1 mg/ml 또는 0.01-0.05 mg/ml로 인산염 완충된 염수(PBs)에 용해되며, 약 0.01 mg/ml, 0.02 mg/ml, 0.03 mg/ml, 0.04 mg/ml, 0.05 mg/ml, 0.06 mg/ml, 0.07 mg/ml, 0.08 mg/ml, 0.09 mg/ml, 0.1 mg/ml, 0.2 mg/ml, 0.3 mg/ml, 0.4 mg/ml, 0.5 mg/ml, 1 mg/ml, 10 mg/ml, 20 mg/ml, 30 mg/ml, 35 mg/ml, 40 mg/ml, 45 mg/ml 또는 50 mg/ml의 농도를 포함하는 Emdogain® (BIORA AB 제조, 스웨덴 말뫼 소재)의 동결건조된 분말이다.

실시예 2에 기재된 바와 같이, 투여를 필요로하는 포유동물에 투여된 에나멜 기질 유도체의 투여중량은 치료될 포유동물의 개별 체중 및 EMD의 소망하는 효과에 따라 물론 조정되며, 또 가장 바람직하게는 에나멜 기질 유도체가 고투여량 또는 저투여량으로 투여되는지 여부에 따라 약 0.01-100 mgEMD/kg 체중 범위, 예컨대 약 0.01-50 mg EMD/kg, 0.05-10 mgEMD/kg, 0.01-1 mg EMD/kg, 0.1-50 mg EMD/kg, 0.1-25 mg EMD/kg, 0.1-15 mg EMD/kg 또는 0.1-10 mg EMD/kg 또는 0.1-1 mg EMD/kg 체중이다.

전형적인 저 투여량은 많아야 0.01, 0.02, 0.03, 0.04, 0.05, 0.06, 0.07, 0.08, 0.09, 0.1, 0.12, 0.15, 0.17, 0.2, 0.5, 1, 1.2, 1.5, 1.6, 1.8, 2, 2.5, 5, 6, 7, 8, 9 또는 9.9 mg EMD/kg 체중을 포함하는 반면에, 전형적인 고투여량은 많아야 10, 15, 18, 20, 25, 50, 75 또는 50 mg EMD/kg 체중을 포함한다.

상기 기재된 투여량은 적어도 1 내지 30일 동안, 또는 다르게는 적어도 10-90일 동안 또는 그 보다 오래 1주당 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7회 또는 그 이상과 같이 적어도 1회/1주로 투여된다.

다양한 물질의 예는 다음과 같다:

용매의 예는 물, 알코올, 혈액, 혈장, 척수액, 복수액 및 림프액이며, 이들에 한정되는 것은 아니다.

완충제의 예는 시트르산, 아세트산, 타르타르산, 젖산, 수소인산, 중탄산염, 인산염, 디에틸아민 등이며, 이들에 한정되지 않는다.

킬레이트화제의 예는 나트륨 EDTA 및 시트르산이며, 이들에 한정되지 않는다.

산화방지제의 예는 부틸화된 히드록시 아니솔(BHA), 아스코르브산 및 그의 유도체, 토코페롤 및 그의 유도체, 시스테인, 및 이들의 혼합물이며, 이들에 한정되지 않는다.

분말 성분의 예는 알기네이트, 콜라겐, 락토오스, 상처에 투여되면 겔을 형성할 수 있는 분말(액체/상처 삼출물을 흡수)이며, 이들에 한정되지 않는다.

희석제 및 붕해제의 예는 락토오스, 사카로오스, 엠덱스, 인산칼슘, 탄산칼슘, 황산칼슘, 만니톨, 녹말 및 미세결정성 셀룰로오스이며, 이들에 한정되지 않는다.

결합제의 예는 사카로오스, 소르비톨, 검 아카시아, 나트륨 알기네이트, 젤 라틴, 녹말, 셀룰로오스, 나트륨 카르복시메틸셀룰로오스, 메틸셀룰로오스, 히드록시프로필셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈 및 폴리에틸렌글리콜이며, 이들에 한정되지 않는다.

참고문헌 목록:

도 1:

LPS, PepG 및 기질 단백질 조성물로 처리된 전체 혈액 샘플을 10 ㎕ FITC 또는 PE 콘쥬게이트된 모노클로날 항체와 함께 배양하였다. 항원의 발현은 유세포 분석기(flow cytometry)에 의해 10 ㎕ 항-CD14, 항-CD44, 항-ICAM-1 뿐만 아니라 동위원소 음성 대조용 항-IgG₁ 및 항-IgG₂를 사용하여 분석하였다. 모든 샘플은 CellQuest 소프트웨어를 이용하여 FACScan상에서 분석하였다.

도 2:

Gestrellius 등, 1997에 따라 미성숙 돼지의 에나멜로 부터 아멜로게닌을 추 출하였다. 30% 아세토니트릴중의 용액으로 만든 후, 샘플을 Jasco HPLC상에서 크기-배제 칼럼을 이용하여 분리하였다. 4개의 분명한 피이크는 복잡하고, 전체 길이의 단백질 및 용해성, 가공된 아멜로게닌 펩티드를 나타낸다.

도 3:

에나멜 기질 유도체는 항염증성 사이토카인 IL-10의 방출 증가에 의해 일치되는 프로-염증성 사이토카인 종양 괴저 인자 알파(TNF-α)의 생산 감소를 유발하였다.

실험부분

실시예 1

본 연구의 목적은 인간의 전체 혈액에서 천연의 면역 메카니즘에 대한 아멜로게닌의 강력한 조절 효과를 연구하기 위한 것이었다. 세균의 세포벽 산물에 대응한 염증성 표면 수용체의 사이토카인 방출 및 조절이 특히 중요하다.

재료 및 시약.

건강한 직원으로부터 말초 정맥 혈액을 취하고 0.129 M CitNa를 함유하는 베큐테이너(Becton Dickinson Vacutainer Systems Eur, 프랑스 메일란 세덱스 소재)에 수집하였다. 동결건조된 Emdogain® (BIORA AB 제조, 스웨덴 말뫼 소재) 분말을인산염 완충된 염수(PBS)에 최종 농도 30 ㎍/ml로 용해시켰다. 대장균(Escherichia coli) O26: B6 지질다당류(LPS; Difco Laboratories 제조, 미국 미시간 디트로이트 소재)를 발열원이 없는 멸균 염수에 현탁시키고 10 ng/ml의 LPS를 미세원심분리관중의 혈액샘플에 직접적으로 부가하였다. LTA(Lipoteichoic cid)를 시그마 케미컬사(미국 미주리주 세인트루이스 소재)로부터 구입하였다. 펩티도글리칸(PepG)은 앞서 기재한 바와 같이(Foster, S.J. 1992 J Bacteriol. 174: 464-70) 황색포도상구균(Staphylococcus aureus)으로부터 분리하였다. 영양 성장기 및 분화하는 동안 고초균(Bacillus subtilis) 168의 자가리신(autolysines)의 분석은 재생 폴리아크릴아미드 겔 전기영동을 이용하여 실시하였고, 상기 자가리신은 10 ㎍/ml의 농도로 혈액 샘플에 직접 부가되었다.

전체 혈액 실험.

건강한 직원으로부터 말초 정맥 혈액을 취하고 0.129 M CitNa를 함유하는 베큐테이너(Becton Dickinson Vacutainer Systems Eur, 프랑스 메일란 세덱스 소재)에 수집하였다. 전체 혈액 샘플은 등량으로 나눠 1.5 ml 미세원심분리관(소렌슨 바이오사이언스 인코포레이티드 제조, 미국 유타주 솔트 레이트시티 소재)에 넣었다. LPS, PepG 또는 LTA로 자극하기 전에, 혈액 샘플을 최종 농도 0, 45, 150, 300, 450, 600 또는 750 g/ml로 용해된 Emdogain®와 함께 37℃에서 2시간 동안 예비배양하였다. 혈액 샘플을 10 ng/ml의 LPS, 10 g/ml의 PepG 또는 100 g/ml의 LTA와 함께 4 또는 6시간 동안 자극시켰다. 상기 혈액을 얼음상에서 냉각시키고 원심분리(14,000 g에서 1분간)시켰다. 혈액을 이어 얼음상에서 냉각시키고 원심분리(14,000 g에서 1분)시킨 다음 사이토카인 단백질 검출을 위해 혈장을 피펫으로 제거하였다. 대조를 위하여, 동부피의 0.9% NaCl을 세균 생성물 대신 부가하였다. 혈액을 빼낸 직후의 기저 사이토카인 수준을 조사하였다. 예비 연구에 의 해 PepG 및 LTA는 LPS 자극에 의한 4시간과 대조적으로 자극후 TNF-a의 피크값 6시간을 나타냄이 밝혀졌다. 따라서, 4시간의 LPS 자극 및 6시간의 PepG 및 LTA 자극을 선택하였다.

ELISA 수법.

TNF-α, IL-6 및 IL-10의 혈장 농도는 시판중인 고상 샌드위치 효소 결합된 면역흡착 에세이법(ELISA) 키트(펠리킨 컴팩트, CLB 랩스 제조, 네델란드 암스테르담 소재)를 이용하여 제조사의 지시에 따라서 결정하였다. TNF-α, IL-6 및 IL-10의 검출 한도는 각각 3, 0.4 및 3 pg/ml 이었다. 플레이트는 ELISA 판독기(Thermo max microplate reader, 몰리큘라 디바이스 제조, 미국 캘리포니아 멘로 파크 소재)로 450 nm에서 판독하였다.

항체 표지 및 유세포측정법.

자극시킨 다음, 전체 혈액 샘플을 즉시 100 ㎕ 동량으로 나누어 팔콘 폴리스티렌관(Becton Dickinson 제조, 미국 뉴저지 링컨 파크 소재)에 넣고 10 ㎕ FITC 또는 PE 콘쥬게이트된 모노클로날 항체와 함께 실온의 암소에서 30분간 배양하였다. 세척 및 고정하기 전에, FACS 용균용액(Becton Dickinson 제조, 미국 캘리포니아 산호세 소재)을 이용하여 적혈구 세포를 용균시켰다. 포름알데히드 1% (CellFIX, 벡톤 디킨슨 제조, 벨기에 에렘보데겜 소재)를 사용하여 고정하기 전에 CellWash(벡톤 디킨슨 제조)를 사용하여 3회 샘플을 세척하였다. 항원의 발현은 10 ㎕ 항-CD14 (18D11, Diatec AS 제조, 노르웨이 오슬로 소재), 항-CD44 (Diatec AS 제조, 노르웨이 오슬로 소재), 항-ICAM-1 (Diactec AS 제조, 노르웨이 오슬로 소 재) 뿐만 아니라 동위원소 음성 대조용 항-IgG₁ (1B9) 및 항-IgG₂ (5A7)(양쪽 모두 Diatec AS 제조)를 사용하여 유세포측정법에 의해 분석하였다. 모든 샘플은 CellQuest software를 이용하여 FACScan (Becton Dickinson 제조)상에서 분석하였다. 결과를 도 1에 나타내었다.

각 실험에서, 단구 집단은 스캐터 다이아그램에서 특징적인 위치를 갖는 CD14 양성 세포로 확인되었다. 형광세기(FI)는 이들 특징에 따라 적합한 게이팅한 후 단구 집단에서 측정하였으며, 각 측정에 대해 평균 FI(기하학적 평균)를 기록하였다.

정적 분석.

데이터는 평균의 평균±표준편차(SEM)로 나타내었다. 이들 데이터는 변동의 1-웨이 방식 분석(ANOVA)에 이어 터키 시험을 실시하였다. P<0.05는 중요한 것으로 간주되었다.

도 3에 도시한 바와 같이, 에나멜 기질 유도체는 염증전 사이토카인 종양 괴저 인자 알파(TNF-α)의 생산감소를 유발하였으며, 이것은 항-염증성 사이토카인 IL-10의 방출증가에 필적하였다. 이들 결과는 에나멜 기질 유도체가 강력한 면역조절 특성을 갖는다는 것을 나타낸다. 이것은 또한 에나멜 기질 유도체가 다발성 기관 손상과 관련된 패혈증에서 치료적 효능을 가질 수 있다는 것도 또한 제시한다. 또한, 에나멜 기질 유도체는 염증성 장 질병, 이식 기관 또는 정형외과 이식편의 거부, 류마티스성 관절염, 동맥경화증 및 몇개 질병과 같은 급성 또는 만성 염증과 관련된 기타 질병의 치료적 효능을 가질 수 있다.

실시예 2

패혈증의 돼지 모델을 사용한 본 연구에서, 에나멜 기질 유도체의 치료적 효능을 생체내에서 조사하였다. 이 모델은 대장균 LPS의 연속적인 융합을 기초로 하며, 급성 염증 반응을 초래하였다. 잠시 후(전형적으로 LPS 주사한지 30분 내지 1시간 후), 상기 동물은 패혈증 쇼크에 들어가 몇몇 패혈증의 중요한 병리-생리학적 특징을 나타내었다. 이 모델은 시험관내의 발견들을 가능한 임상적 실험과 연결시키는 강력한 도구이다.

패혈증이 개시(= LPS의 주사, 1.7 ㎍/킬로 체중/시간)되기 30분 전에 돼지에게 에나멜 기질 유도체(최대 투여량 5 mg/kg 체중, 즉 약 100 mg/l의 계산된 혈청 농도)를 정맥 거환주사에 의해 투여하였다. 에나멜 기질 유도체의 혈액중에서 반감기는 240분인 것으로 보고되었다. 따라서, EMD의 치료적 혈청 수준을 유지하기 위하여, 시간당 100 ml 링거액(pH = 6)에서 50 mg의 에나멜 기질 유도체를 전달하기 위해 정맥 주입 장비를 이용하였다. 대조를 위하여, EMD를 투여하는 것 대신 혈청 알부민("위약")을 주사 주입하는 것을 제외하고는 3마리의 "샴" 돼지를 동일하게 처리하였다.

조혈역학적 변수를 연속적으로 등록하였으며, 세균 독소(LPS)를 주입한 후 5시간에서 실험의 끝까지 매시간 기록하였다. 혈액 샘플 및 임상적 변수의 기록은 실험을 개시하기 전(시간 0)에, 에나멜 기질 유도체 또는 위약 주사를 개시한 즉시(시간 0-a) 및 간장 및 문정맥, 복부 동맥, 및 폐 동맥으로 부터 패혈증이 개 시한 후 매 시간 측정하고 혈액 항상성 변수, 기관 작용 마커(혈청 아스퍼테이트 아미노트랜스퍼라제(ASAT), 혈청 알라민 아미노트랜스퍼라제(ALAT) 및 간 기능 마커인 혈청 알칼리성 포스파타제 활성 및 신장 기능에 대한 마커인 감마-글루타밀트랜스퍼라제(γ-GT) 및 크레아틴, 염증성 매개제(TNF-α, IL-1β 및 IL-6)에 대해 분석하였다. 기관 기능 마커는 소정의 시간 지점에서 실험하는 동안 매시간 돼지로부터 취한 혈액 샘플에서 분석하였다. 혈액 샘플은 Norwegian National Hospital의 조혈 실험실의 표준 병원 수순을 이용하여 분석하였다. 염증 마커는 ELISA를 사용하고, 돼지 TNF-α/TNFSF2 Quantikine P ELISA 키트(#PTA00), 돼지 IL-6 Quantikine P 면역에세이 키트(#P6000) 및 돼지 IL-1β/IL-1F2 Quantikine P ELISA 키트(#PTA00)(이들 모두 R&D Systmes Inc. (미국 미네소타 미니아폴리스 소재)에 의해 제조)를 적용하여 동일 혈액 샘플에서 분석하였다. 제조자가 제시한 표준 수법을 빼먹거나 수정함없이 이용하였다.

실험을 완료한 후(동물의 치사후, 또는 에나멜 기질 유도체 또는 위약 및 LPS를 연속 주사한지 5시간 후), 동물을 안락사시키고 검시를 실시하였다. 내부 순환 기관은 육안으로 조사하였고 조직은 연구 계획에 따라 조직학적 평가를 위해 샘플링하였다.

결과

돼지 1

물리적 데이터: 자성; 23.5 kg 총 체중; 건강함

수술: 합병증 없음

치료: 위약(50 ml PBS 거환 주사액중의 25 mg 혈청 알부민, 시간 주입당 100 ml 링거액중의 10 mg SA, 전체 SA 투여량 = 75 mg), LPS(4.5 ml PBS중 40 ㎍/시간, 5시간 동안 연속 주사; 전체 LPS 투여량 = 200 ㎍).

혈행동태적 관찰: 이 동물은 위약 주사에 대해 아무런 반응을 나타내지 않았다. 실험을 통하여 지속된 패혈증 쇼크 조건에 처리된 후 LPS 주사에 대해 강한 초기 반응이 나타났다. 쇼크의 개시는 LPS 주사를 개시한 지 1시간 전에 나타났다.

치사시의 순환성 기관의 해부 및 육안에 의한 외관: 모든 순환성 기관은 정상 구조를 나타내었다. 병리적 징후는 울혈 및 지혈의 징후를 나타낸 간에서 발견되었다.

혈액학: 상기 동물은 초기에는 정상적인 혈액학적 값을 나타내었다. 대부분의 값은 실험하는 동안 정상범위내에 존재하였다. 예외적인 것은 LPS 주사한지 4 및 5시간 후에 관찰되었으며, 이때 B-호중구의 증가 및 B 림프구의 감소가 관찰되었다.

생화학: 모든 효소 활성 및 크레아티닌은 실험동안 정상치내에 머물렀다. 크레아티닌의 느리지만 일정한 감소가 관찰되었지만, 그 값은 정상치 아래로는 절대로 감소되지 않았다. 돼지는 초기에는 ALP가 약간 증가하였지만, LPS를 투여하기 전에 정상화되었다. ASAT 값은 실험하는 동안 높은 측에 존재하였지만, LPS 주사로 부터 유의한 변화는 나타내지 않았다.

사이토카인: 이 돼지는 LPS를 투여한 후 TNF 값의 급등을 나타내었다. 이 값은 LPS 주사를 개시한 지 1시간 전에 검출 한도(1500 ㎍/l) 이상으로 달하였고 실험하는 동안 이 수준으로 유지되었다. IL-6 또한 LPS 주사 개시후 급등하였다. IL-6 수준은 이 실험하는 동안 줄곧 일정하게 증가하여 3500 ㎍/l 수준으로 이르렀다. IL-1β는 LPS 주사에 의해 유발된 느린 증가를 나타내며, 5시간 후 약 700 ㎍/l에 이르렀다.

해설: 조혈역학적 변수는 실험의 마지막에 대하여 간장 및 폐 손상을 나타내었다. 낮은 이뇨 및 감소된 이뇨는 신장 무력을 나타내었다. 기관 무력의 첫 징후는 LPS 주사를 개시한 지 2시간 후에 관찰되었다. LPS를 투여한 지 30분 부터 경련이 관찰되었다. 혈액학 및 생화학값은 생명유지장치가 정상적으로 작동함을 나타내었고 또 관찰된 효과는 독소 주사에 의해 유발되었고 수술에 의한 외상에 의한 것이 아니었다. 염증 상태는 돼지가 패혈증 쇼크에 걸려 있음을 나타내었다. 사이토카인 값에서는 회복의 기미가 보이지 않았다. 이 돼지는 이 실험동안 생존할 가능성이 매우 낮다.

돼지 2

물리적 데이터: 자성; 21.5 kg 총 체중; 건강함

수술: 합병증 없음

치료: 에나멜 기질 유도체(50 ml PBS 거환 주사액중의 21.5 mg 에나멜 기질 유도체, 시간 주입당 100 ml 링거액중의 10 mg 에나멜 기질 유도체, 전체 에나멜 기질 유도체 투여량 = 71.5 mg), LPS(4.5 ml PBS중 37 ㎍/시간, 5시간 동안 연속 주사; 전체 LPS 투여량 = 185 ㎍).

혈행동태적 관찰: 이 동물은 EMD의 거환 주사에 대해 아무런 반응을 나타내지 않았다. LPS 주사를 개시한 지 약 1시간에서 패혈증 쇼크 상태의 개시에 이어 LPS 주사에 대한 매우 신속하고 강한 초기 반응이 나타났다. 이 단계에서, 초기 징후 또는 다발성 기관 손상이 관찰되었다. 그러나 그후 혈행동태적 값은 안정화되었고 기관 기능은 회복되었다.

치사시의 순환성 기관의 해부 및 육안에 의한 외관: 모든 순환성 기관은 정상 구조를 나타내었다. 병리의 육안의 징후는 조사된 기관에서 발견되지 않았다.

혈액학: 상기 동물은 초기에는 정상적인 혈액학적 값을 나타내었다. 대부분의 값은 실험하는 동안 정상범위내에 존재하였다.

생화학: 모든 효소 활성 및 크레아티닌은 실험동안 정상치내에 머물렀다. 돼지는 초기에는 ALP가 약간 증가하였지만, 에나멜 기질 유도체 또는 LPS 주사에 의해서는 변화되지 않고 유지되었다. ASAT값은 실험의 종료직전을 향하여 약간 증가하였지만, 에나멜 기질 유도체 또는 LPS 주사로 부터 유의한 변화는 나타내지 않았다.

사이토카인: 에나멜 기질 유도체 주사는 분석된 순환 사이토카인에서 어떠한 증가도 유발하지 않았다. 그러나, 이 돼지는 LPS를 투여한 후 TNF 값의 급등을 나타내었다. 이 값은 LPS 주사를 개시한 후 1시간이 되기 전에 검출 한도(1500 ㎍/l) 이상으로 달하였고 약 4시간 동안 이 수준으로 유지되었다. 4시간 후, TNF 값은 감소되었고 정상화 징후를 나타내었다. IL-6 또한 LPS 주사 개시후 급등하였다. IL-6 수준은 이 실험하는 동안 줄곧 일정하게 증가하여 4시간 후 4800 ㎍/l 수준으로 이르렀다. 5시간 후 IL-6 값은 감소하는 듯 하였지만, (계획된) 실험 종료로 인하여, 이 경향은 확인되지 않았다. IL-1β는 LPS 주사에 의해 유발된 느린 증가를 나타내었으며, 5시간 후 약 1000 ㎍/l에 이르렀다.

해설: 혈행동태학적 변수에 의해 및 신장 기능(이뇨)의 회복과 복수의 감소에 의해 관찰되는 바와 같이, 이 동물은 분명한 패혈증 쇼크와 기관 부진의 개시로 부터 회복된 것처럼 보였다. LPS를 투여한 지 1시간후부터 경련이 관찰되었다. 이들 발견은 흔하지 않은 것으로, 내독소(LPS)에 대한 강한 초기 반응으로 이어진다. 혈액학 및 생화학 값은 생명유지장치가 정상적으로 작동함을 나타내었고 또 관찰된 효과는 독소 주사에 의해 유발되었고 수술에 의한 외상에 의한 것이 아니었다. 염증 상태는 돼지가 패혈증 쇼크에 걸려 있음을 나타내었다. 그러나, IL-6 및 TNF 값에서 느린 회복의 기미가 보였다. IL-1β값은 에나멜 기질 유도체 투여에 의해서는 영향을 받지 않는 것으로 보였다. 염증 사이토카인 수준의 연속적인 감소 및 시간을 고려할 때, 이 돼지는 이 실험동안 생존할 것으로 보인다.

돼지 3

물리적 데이터: 자성; 25.0 kg 총 체중; 건강함

수술: 합병증 없음

치료: 위약(100 ml PBS 거환 주사액중의 125 mg SA, 시간 주입당 100 ml 링거액중의 50 mg SA, 전체 SA 투여량 = 375 mg), LPS(4.5 ml PBS중 43 ㎍/시간, 5시간 동안 연속 주사; 전체 LPS 투여량 = 215 ㎍).

혈행동태적 관찰: 이 동물은 위약 주사에 대해 아무런 반응을 나타내지 않았 다. 실험을 통하여 지속된 패혈증 쇼크 조건에 처리된 후 LPS 주사에 대해 낮거나 중간정도의 초기 반응이 나타났다. 쇼크의 개시는 LPS 주사를 개시한 지 1시간 후였다.

치사시의 순환성 기관의 해부 및 육안에 의한 외관: 모든 순환성 기관은 정상 구조를 나타내었다. 병리적 징후는 울혈(부종 및 붉은 기) 및 지혈의 징후를 나타낸 간에서만 발견되었다.

혈액학: 이 동물은 초기에는 정상적인 혈액학적 값을 나타내었다. 대부분의 값은 실험하는 동안 정상범위내에 존재하였다. 예외적인 것은 LPS 주사한지 4 및 5시간 후에 관찰되었으며, 이때 B-호중구의 증가 및 B 림프구의 감소가 관찰되었다.

생화학: 모든 효소 활성 및 크레아티닌은 실험동안 정상치내에 머물렀다. 크레아티닌의 느리지만 일정한 감소가 관찰되었고, LPS 주사한지 2시간 후, 크레아티닌 수준은 정상치 아래로 감소하였고 실험의 나머지 동안 낮게 유지되었다. 이 돼지는 초기에는 ALP가 약간 증가하였지만, 이 값은 안정하였고 LPS 주사에 의해 영향을 받지 않았다. 염증 상태는 이 돼지가 패혈증 쇼크에 걸렸음을 나타낸다. 사이토카인 값에서의 회복 징후는 없었다. 본 실험동안 이 돼지는 생존할 가능성이 아주 적을 것이다.

사이토카인: 이 돼지는 LPS를 투여한 후 TNF 값의 급등을 나타내었다. 이 값은 LPS 주사를 개시한 후 1시간이 되기 전에 검출 한도(1500 ㎍/l) 이상으로 달하였고 실험하는 동안 이 수준으로 유지되었다. IL-6 또한 LPS 주사 개시후 급등 하였다. IL-6 수준은 이 실험하는 동안 줄곧 일정하게 증가하여 LPS주사한지 3시간 후에 5000 ㎍/l 수준으로 이르렀고, 3900 ㎍/l 수준으로 끝마쳤다. IL-1β는 LPS 주사에 의해 유발된 느린 증가를 나내며, 5시간 후 약 700 ㎍/l으로 끝마쳤다.

해설: 조혈역학적 변수는 실험의 마지막에 대하여 간장 및 폐 손상을 나타내었다. 낮은 이뇨 및 감소된 이뇨는 신장 무력을 나타내었다. 기관 무력의 첫 징후는 LPS 주사를 개시한 지 3시간 후에 관찰되었다. LPS를 투여한 지 30분 부터 경련이 관찰되었다. 혈액학 및 생화학값은 생명유지장치가 정상적으로 작동함을 나타내었고 또 관찰된 효과는 독소 주사에 의해 유발되었고 수술에 의한 외상에 의한 것이 아니었다. 염증 상태는 돼지가 패혈증 쇼크에 걸려 있음을 나타내었다. 사이토카인 값에서는 회복의 기미가 보이지 않았다. 이 돼지는 이 실험동안 생존할 가능성이 매우 낮다.

돼지 4

물리적 데이터: 자성; 24.5 kg 총 체중; 건강함

수술: 합병증 없음

치료: 에나멜 기질 유도체(100 ml PBS 거환 주사액중의 125 mg 에나멜 기질 유도체, 시간 주입당 100 ml 링거액중의 50 mg 에나멜 기질 유도체, 전체 에나멜 기질 유도체 투여량 = 375 mg), LPS(4.5 ml PBS중 42 ㎍/시간, 5시간 동안 연속 주사; 전체 LPS 투여량 = 210 ㎍).

혈행동태적 관찰: 이 동물은 EMD의 거환 주사에 대해 아무런 반응을 나타내지 않았다. LPS 주사에 대한 강한 초기 반응이 나타낸 다음 LPS 주사를 개시한 지 3시간 후에 약한 패혈증 쇼크 상태를 나타내었다. 그러나, 이 시간 이후에서는 혈행동태학적 값은 안정화되었고 모든 기관 기능은 회복되었다.

치사시의 순환성 기관의 해부 및 육안에 의한 외관: 모든 순환성 기관은 정상 구조를 나타내었다. 병리의 육안의 징후는 조사된 기관에서 발견되지 않았다.

혈액학: 이 동물은 초기에는 정상적인 혈액학적 값을 나타내었다. 대부분의 값은 실험하는 동안 정상범위내에 존재하였다.

생화학: 모든 효소 활성 및 크레아티닌은 실험동안 정상치내에 머물렀다. 이 돼지는 초기에는 ALP가 약간 증가하였지만, 에나멜 기질 유도체 또는 LPS 주사에 의해서는 변화되지 않고 유지되었다. ASAT값은 실험의 종료직전을 향하여 약간 증가하였지만, 에나멜 기질 유도체 또는 LPS 주사로 부터 유의한 변화는 나타내지 않았다.

사이토카인: 에나멜 기질 유도체 주사는 분석된 순환 사이토카인에서 어떠한 증가도 유발하지 않았다. 그러나, 이 돼지는 LPS를 투여한 후 TNF 값의 급등을 나타내었다. 이 값은 LPS 주사를 개시한 후 1시간이 되기 전에 검출 한도(1500 ㎍/l) 이상으로 달하였고 실험하는 동안 이 수준으로 유지되었다. IL-6 또한 LPS 주사 개시후 급등하였다. IL-6 수준은 이 실험하는 동안 줄곧 일정하게 증가하여 3시간 후 검출 수준 이상(>5000 ㎍/l)으로 증가하였다. 4시간 후 IL-6 값은 감소하는 듯 보였고, 이러한 경향은 5시간에서도 확인되었다. IL-1β는 LPS 주사에 의해 유발된 느린 증가를 나타내었으며, 5시간 후 약 700 ㎍/l으로 끝마쳤다.

해설: 임상적 변수 및 혈행동태학적 변수에 의해 관찰되는 바와 같이, 이 동 물은 분명한 패혈증 쇼크와 기관 부진으로부터 보호된 것으로 보였다. 어떠한 기관 부진도 관찰되지 않았지만, 이 실험 전체 동안 이뇨는 낮았다. 복수의 생산은 아주 적었고 경련은 관찰되지 않았다. 이들 발견은 흔하지 않은 것으로, 내독소(LPS)에 대한 강한 초기 반응으로 이어진다. 혈액학 및 생화학 값은 생명유지장치가 정상적으로 작동함을 나타내었고 또 관찰된 효과는 독소 주사에 의해 유발되었고 수술에 의한 외상에 의한 것이 아니었다. 염증 상태는 돼지가 패혈증 쇼크에 걸려 있음을 나타내었다. 그러나, IL-6 및 TNF 값에서 느린 회복의 기미가 보였다. IL-1β값은 에나멜 기질 유도체 투여에 의해서는 영향을 받지 않는 것으로 보였다. 염증 사이토카인 수준의 연속적인 감소 및 시간을 고려할 때, 이 돼지는 이 실험동안 생존할 것으로 보인다.

돼지 5

물리적 데이터: 자성; 25.0 kg 총 체중; 건강함

수술: 합병증 없음

치료: 에나멜 기질 유도체(100 ml PBS 거환 주사액중의 125 mg 에나멜 기질 유도체, 시간 주입당 100 ml 링거액중의 50 mg 에나멜 기질 유도체, 전체 에나멜 기질 유도체 투여량 = 375 mg), LPS(4.5 ml PBS중 43 ㎍/시간, 5시간 동안 연속 주사; 전체 LPS 투여량 = 215 ㎍).

혈행동태적 관찰: 이 동물은 EMD의 거환 주사의 개시에 대한 반응으로 폐 혈압의 초기 증가를 나타내었다. 이러한 효과는 매우 일시적인(수분) 것으로 투여량 의존적인 것이 아니므로, 에나멜 기질 유도체 용액은 폐 모세관상에 간단한 혈관수 축 효과를 가지고 있음을 나타낸다. 관찰된 효과는 거환 주사가 완료되기 전에 정상화되었다. 에나멜 기질 유도체 주사로 부터 다른 효과는 관찰되지 않았다. 이 동물은 LPS 주사에 대하여 그리 현저한 반응을 나타내지 않았다. 패혈증 쇼크 상태의 어떠한 징후도 발견되지 않았고 기관 순환은 실험동안 안정하였다. LPS가 실험 계획에 따라 확실히 전달되도록 실험하는 동안 수회 LPS 유동 및 LPS 카테터의 위치를 조절하였다.

치사시의 순환성 기관의 해부 및 육안에 의한 외관: 모든 순환성 기관은 정상 구조를 나타내었다. 병리의 육안의 징후는 조사된 기관에서 발견되지 않았다.

혈액학: 이 동물은 수술의 개시로 부터(0-샘플) 백혈구 세포의 갯수가 현저히 증가(정상치의 2배)한 이외에는 초기에는 정상적인 혈액학적 값을 나타내었다. 상이한 백혈구 세포의 상대치는 정상적인 것으로 보였으나, 실험하는 동안 안정하게 유지되었다. 모든 다른 값은 실험하는 동안 정상범위내에 유지되었다.

생화학: 모든 효소 활성 및 크레아티닌은, 실험의 개시로부터 증가하지만 관찰 기간동안 안정하게 유지된 ALP를 제외하고는 실험동안 정상치내에 머물렀다. ALP 수준은 에나멜 기질 유도체 또는 LPS 주사에 의해서는 변화되지 않고 유지되었다. ASAT값은 실험의 종료직전을 향하여 약간 증가하였다. 그러나 이러한 증가는 아주 적어서 가까스로 정상치 한도 위로 나타났다.

사이토카인: 에나멜 기질 유도체 주사는 분석된 순환 사이토카인에서 어떠한 증가도 유발하지 않았다. 그러나, 이 돼지는 실험을 개시하기 전에도 현저한 TNF 값의 급등을 나타내었다(>1500 ㎍/l). 이 값은 LPS 주사를 개시한 지 2시간 후까 지 검출 범위 이상으로 존재하였다. 그러나, TNF 값의 급감이 관찰되었고 이 실험이 끝나기 전에 TNF 수준은 거의 정상화되었다. IL-6은 LPS 주사 개시 직후 급등하였다. IL-6 수준은 이 실험하는 동안 줄곧 일정하게 증가하여 2500 ㎍/l 까지 이르렀다. 이후 IL-6 값은 감소되어 LPS 주사한지 5시간 후에 정상값에 도달하였다. IL-1β는 LPS 주사에 의해 유발된 느리지만 일정한 증가를 나타내었으며, 5시간 후 약 900 ㎍/l으로 끝마쳤다.

해설: 임상적 변수 및 혈행동태학적 변수에 의해 관찰되는 바와 같이, 이 동물은 분명한 패혈증 쇼크와 기관 부진으로부터 보호된 것으로 보였다. 어떠한 기관 부진도 관찰되지 않았지만, 이 실험 전체 동안 이뇨는 양호하고 안정하였다. 복수의 생산은 아주 적었고 경련은 관찰되지 않았다. 이들 발견은 흔하지 않은 것으로, 내독소(LPS)에 대한 강한 초기 반응으로 이어진다. 혈액학 및 생화학 값은 생명유지장치가 정상적으로 작동함을 나타내었고 또 관찰된 효과는 독소 주사에 의해 유발되었고 수술에 의한 외상에 의한 것이 아니었다. 염증 상태는 돼지가 패혈증 쇼크에 걸려 있음을 나타내었다. 그러나, IL-6 및 TNF 값에서 신속한 회복의 분명한 징후가 보였다. IL-1β값은 에나멜 기질 유도체 투여에 의해서는 영향을 받지 않는 것으로 보였다. 이 동물이 실험동안 생존할 것이라는 것은 의심의 여지가 없다.

돼지 6

물리적 데이터: 자성; 23.0 kg 총 체중; 건강함

수술: 합병증 없음

치료: 에나멜 기질 유도체(100 ml PBS 거환 주사액중의 115 mg 에나멜 기질 유도체, 시간 주입당 100 ml 링거액중의 50 mg 에나멜 기질 유도체, 전체 에나멜 기질 유도체 투여량 = 365 mg), LPS(4.5 ml PBS중 39 ㎍/시간, 5시간 동안 연속 주사; 전체 LPS 투여량 = 195 ㎍).

혈행동태적 관찰: 이 동물은 EMD의 거환 주사의 개시에 대한 반응으로서 폐 혈압의 초기 증가를 나타내었다. 이 반응은 즉각적이고 일시적인(수분) 것으로 투여량 의존적인 것이 아니므로, 에나멜 기질 유도체 용액은 폐 모세관상에 간단한 혈관수축 효과를 가지고 있음을 나타낸다. 관찰된 효과는 거환 주사가 완료되기 전에 정상화되었다.

LPS 주사에 대하여 강한 초기 반응이 관찰(심박수와 동맥 흐름의 급속적이고, 일시적인 증가)된 다음 실험 동안 지속된 보통의 고비중 상태가 이어졌다. 패혈증 쇼크의 어떠한 징후도 발견되지 않았고 기관 부진의 징후도 없었다.

치사시의 순환성 기관의 해부 및 육안에 의한 외관: 모든 순환성 기관은 정상 구조를 나타내었다. 병리의 육안의 징후는 조사된 기관에서 발견되지 않았다.

혈액학: 이 동물은 초기에는 정상적인 혈액학적 값을 나타내었다. 모든 다른 값은 실험하는 동안 정상범위내에 유지되었다.

생화학: 모든 효소 활성 및 크레아티닌은, 실험의 개시로부터 증가하지만 관찰 기간동안 안정하게 유지된 ALP를 제외하고는 실험동안 정상치내에 머물렀다. ALP 및 ASAT 수준은 에나멜 기질 유도체 또는 LPS 주사에 의해서 변화되지 않고 유지되었다.

사이토카인: 에나멜 기질 유도체 주사는 분석된 순환 사이토카인에서 어떠한 증가도 유발하지 않았다. 그러나, 이 돼지는 LPS를 투여한 후 TNF 값의 급등을 나타내었다. 이 값은 LPS 주사를 개시한 후 1시간이 되기 전에 검출 한도(1500 ㎍/l) 이상이었고 이 수준은 약 3시간 동안 유지되었다. 3시간 후, TNF 값이 급감하였고, 관찰기간의 마지막에 정상화되었다. IL-6은 LPS 주사 개시 직후 급등하였다. IL-6 수준은 LPS 주사한지 2시간 후 2700 ㎍/l 에 이르렀다. 그러나, 실험의 마지막에, IL-6 값은 거의 정상치(350 ㎍/l)로 감소되었다. IL-1β는 LPS 주사에 의해 유발된 느리지만 일정한 증가를 나타내었으며, 4시간 후 약 1200 ㎍/l 에 도달하였다.

해설: 혈행동태학적 변수 및 임상적 변수에 의해 관찰되는 바와 같이, 이 동물은 심각한 패혈증 쇼크와 기관 부진으로부터 보호된 것으로 보였다. 어떠한 기관 부진도 관찰되지 않았고 이 실험 전체 동안 이뇨는 높았고 안정하였다. 복수의 생산은 아주 적었고 LPS 주입한지 약 4시간 후에 경련이 관찰되었다. 이들 발견은 흔하지 않은 것으로, 내독소(LPS)에 대한 강한 초기 반응으로 이어진다. 혈액학 및 생화학 값은 생명유지장치가 정상적으로 작동함을 나타내었고 또 관찰된 효과는 독소 주사에 의해 유발되었고 수술에 의한 외상에 의한 것이 아니었다. 염증 상태는 돼지가 강한 패혈증 쇼크(TNF 및 IL-6의 급격하고 강한 증가)에 걸려 있음을 나타내었다. 그러나, IL-6 및 TNF 값에서 신속한 회복의 분명한 징후가 보였다. IL-1β값은 에나멜 기질 유도체 투여에 의해서는 영향을 받지 않는 것으로 보였다. 이 동물이 실험동안 생존할 것이라는 것은 의심의 여지가 없다.

요약

대조용(돼지 1 및 3)

대조용은 모두 정상적으로 반응하였다. 즉 이들은 모두 LPS 주사 개시한지 약 30분후에 패혈증 쇼크 상태로 들어갔다. 양쪽 돼지는 LPS 주사한지 5시간 후에 생존하였지만, 이들은 체온증가, 다발성 기관 부진, 신장 부전, 고혈압 및 심박량 감소를 나타내는 심각한 제어되지 않는 패혈증 쇼크의 분명한 임상적 징후를 나타내었다. 혈액 분석 또한 패혈증 쇼크의 분명한 징후를 나타내었다. 염증 상태는 TNF-α 및 인터루킨-6의 강한 발현을 나타내는 급성 독소 유발된 패혈증 쇼크에 상응하였다. 상기 실험의 종료점 근처에서 이들 돼지의 상태는 너무 심각하여서 계속 생존이 어려울 것으로 판정되었다.

저투여량의 에나멜 기질 유도체 (돼지 2)

낮은 투여량의 에나멜 기질 유도체가 투여된 돼지 또한 패혈증 쇼크 상태로 들어갔다. 그러나, LPS에 대한 급성 염증 반응의 개시는 샴 동물에 비하여 약 30 내지 60분 지연되었다. 패혈증 개시후, 돼지는 안정화된 다음 쇼크로부터 서서히 회복하였다. 이 동물은 약간 더 우수한 임상적 변수를 나타내었고 신장 부전(이뇨에 의해 측정)의 징후를 나타내지 않았다. LPS 주사 개시한지 5시간 후 게획한 대로 돼지를 안락사시켰다. 거환 주사 및 뒤이은 저투여량의 에나멜 기질 유도체의 주입은 이 돼지에서 어떠한 나쁜 반응의 임상적 징후를 유발하지 않았고 에나멜 기질 유도체 주사에 대한 제어된 변수 반응도 유발하지 않았다. 이 돼지는 TNF 및 IL-6 값에서 감소 경향을 나타내었다. 이러한 관찰과 더불어 임상적 관찰은 상기 동물이 쇼크로부터 회복되고 있음을 제시한다.

고투여량의 에나멜 기질 유도체 (돼지 4, 돼지 5 및 돼지 6)

고투여량의 에나멜 기질 유도체가 투여된 세마리 돼지 어떤 것도 LPS 주사로 부터 심각한 패혈증 쇼크 상태를 경험하지 않았다. 2마리 동물(돼지 4 및 돼지 6)은 초기의 일시적인 내독소 반응을 경험하였지만, 이러한 상태는 즉시 안정화되었고 상기 동물들은 즉시 회복되어 실험하는 동안 "제어되는 상태"로 유지되었다. 세번째 동물(돼지 5)은 LPS 주사에 대하여 전혀 반응하지 않았다. 이들 동물중 어떤 것도 다발성 기관 부전 또는 신장 부전의 징후를 나타내지 않았다. 상기 돼지중 오직 한마리(돼지 6)는 LPS 주사에 의해 유도된 전형적인 경련을 경험하였다. 경련의 개시는 대조용에 비하여 현저히 지연되었다(4시간). LPS 주사 개시한지 5시간 후 계획대로 돼지를 안락사시켰다.

거환 주사에 이은 "고투여량"의 에나멜 기질 유도체의 주입은 이들 돼지에서 어떤한 영숙적인 임상적 징후 또는 나쁜 반응을 유발하지 않았다. 돼지중 2마리(돼지 5 및 돼지 6)에서, 거환 주사에 대한 초기 반응을 관찰하였다. 이 반응은 폐 동맥혈압에서 신속하지만 일시적인 증가로 발견되며, 이는 고노동의 에나멜 기질 유도체 용액의 센트럴 거환 주사(약 1.25 mg/ml)가 폐 동맥 및/또는 모세관의 자연적인 수축을 유발함을 의미한다. 이러한 효과는 즉각적이고 투여량 관련된 것은 아니다. 관찰된 효과는 부분내에 정상화되고 돼지들은 안정하며, 이는 거환 주사의 완료 전에 정상적인 혈행형태학적 변수 및 임상적 상태를 나타낸다.

이들 돼지는 초기 LPS 반응후 TNF 및 Il-6값에서 감소되는 경향을 나타내었 다. 실제로, 세마리 동물중 2마리(돼지 5 및 돼지 6)에서 TNF 및 Il-6값은 관찰기간의 종료전에 거의 정상화되었다. 이러한 관찰과 더불어 임상적 관찰은 이들 동물이 LPS 유도된 쇼크와 그에 따른 다발성 기관 부전으로부터 보호됨을 제시한다. 이들 돼지에 투여된 에나멜 기질 유사체 주사액은 상기 동물들을 독소주입에 의한 심각한 손상으로부터 보호되므로, 동물을 패혈증 쇼크로부터 지켰다. 모든 세마리 동물은 상기 실험동안 살아남았다.

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69. 포유동물에서 전신 염증성 반응 증후군(SIRS)을 예방 또는 치료하기 위한 전신 투여용의 아멜로게닌의 약제학적 조성물.
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74. 제69항에 있어서, 상기 전신 염증성 반응 증후군(SIRS)은 외상, 화상, 수술, 투석, 쇼크 또는 세균 또는 바이러스성 감염으로부터 생기는 약제학적 조성물.
75. 제 69항에 있어서, 상기 전신 염증성 반응 증후군(SIRS)은 체외막 산소화(ECMO), 쇼크, 패혈증, 다발성 기관 손상, 기관 또는 인공삽입물과 같은 이식편의 거부, 심장 및 폐 측관수술, 만성적 염증, 천식 또는 폐의 스트레스 관련 질병, 세균 감염, 괴저, 연질 조직 감염 및 상처 감염으로 구성된 군으로부터 선택된 질병으로부터 생기는 약제학적 조성물.
76. 제 74항에 있어서, 상기 전신 염증성 반응 증후군(SIRS)은 그램 음성 미생물 및 그램 양성 미생물로 구성된 군으로부터 선택된 세균에 의한 오염에 의해 유발되는 약제학적 조성물.
77. 제 76항에 있어서, 상기 미생물에 의해 생산된 내독소 또는 외독소에 의해 전신 염증성 반응 증후군(SIRS)이 유발되는 약제학적 조성물.
78. 제 77항에 있어서, 상기 전신 염증성 반응 증후군(SIRS)은 황색포도상구균(Staphylococcus aureus)으로부터의 PepG(PeptidoGlycan: 펩티도글리칸)에 의해 유발되는 약제학적 조성물.
79. 제 77항에 있어서, 상기 전신 염증성 반응 증후군(SIRS)은 대장균(Escherichia coli)으로부터의 LPS(lipopolysaccharide)에 의해 유발되는 약제학적 조성물.
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100. 제 69항에 있어서, 상기 아멜로게닌의 함량은 0.005% w/w 내지 100%w/w, 0.5-99% w/w, 1-95% w/w, 10-95% w/w, 10-90% w/w, 15-90% w/w, 20-90% w/w, 30-90% w/w, 40-85% w/w, 50-80% w/w, 60-70% w/w, 70-90% w/w, 또는 80-90% w/w 범위인 약제학적 조성물.
101. 제 69항에 있어서, 상기 약제학적 조성물은 또한 약제학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 약제학적 조성물.
102. 제 101항에 있어서, 상기 약제학적으로 허용되는 부형제는 인산염 완충액 염수(PBS)인 약제학적 조성물.

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