KR100854234B1 - 역가가 향상된 유전자 ａｒｇＦ 염기서열 및 그를 포함하는형질전환 균주를 이용한 Ｌ―알지닌의 생산방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 알지닌 생합성 관련 유전자 argF 염기서열에 관한 것으로서, 구체적으로는 argF 유전자 일부분의 염기서열 및 아미노산 서열이 치환되어 오르니틴 카바모일트렌스퍼라아제 효소 역가가 향상된 argF 유전자 염기서열 및 상기 서열을 포함하는 재조합 벡터 및 이 재조합 벡터로 형질전환된 세포에 관한 것이며, 또한 상기 형질전환 균주를 배양하여 L-알지닌을 고농도로 생산하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 유전자 재조합 미생물은 L-알지닌의 증가된 수율을 제공한다.

L-알지닌, 아미노산, argF, 오르니틴 카바모일트렌스퍼라아제, 재조합 벡터

Description

역가가 향상된 유전자 ａｒｇＦ 염기서열 및 그를 포함하는 형질전환 균주를 이용한 Ｌ―알지닌의 생산방법{A nucleotide sequence of a mutant argF with increased activity and a method for producing L-arginine using a transformed cell containing the same}

도 1은 본 발명에 따른 재조합 플라스미드 pECCG117-argF의 작제도이다.

L-알지닌은 의약품, 식품, 기타 동물사료등에 널리 이용되는 준필수 천연 아미노산의 일종으로 의약용으로는 간기능 촉진제, 뇌기능 촉진제, 남성 불임 치료제, 종합 아미노산 제제등에 사용되고 있으며, 식품 용으로는 생선묵 첨가제, 건강음료 첨가제, 고혈압 환자의 식염대체용으로 최근 각광받고 있는 물질이다.

종래에 알려져 있는 생물학적 발효법에 의한 L-알지닌의 제조방법은 탄소원, 질소원으로부터 직접 L-알지닌을 생산하는 방법으로서 글루타민산 생산균주인 브레 비박테리움 또는 코리네박테리움속 미생물로부터 유도된 변이주를 이용하는 방법(일본공개 소화 57-163487, 60-83593, 62-265988), 세포융합으로 생육 개선된 아미노산 생산균주를 이용하는 방법(일본공개 소화 59-158185)등이 있다. 최근에 알지닌 생합성 오페론의 발현을 억제하는 유전자 argR을 불활성화시킨 유전자 재조합 균주를 이용하는 방법(미국특허 US2002/0045223A1)등이 있다.

미생물에서 L-알지닌의 생합성은 선형 단계와 고리형 단계의 서로 다른 두개의 경로를 통해, L-글루타메이트(L-glutamate)로부터 8번의 효소 단계를 거쳐서 이루어진다. 선형 단계에서, L-알지닌은 L-글루타메이트에서 N-아세틸글루타메이트(N-acetylglutamate), N-아세틸오르니틴(N-acetylornithine), 오르니틴(ornithine), 시트룰린(citrulline), 그리고 아르기니노숙시네이트(argininosuccinate)를 거쳐서 합성된다. 이런 중간물은 N-아세틸글루타메이트 신세이즈(N-acetylglutamate synthase), N-아세틸글루타메이트 키나아제(N-acetylglutamate kinase), N-아세틸글루타밀포스페이트 리덕테이즈(N-acetylglutamylphosphate reductase), 아세틸오르니틴 아미노트랜스퍼라아제(acetylornithine aminotransferase), N-아세틸오르니신세이즈(N-acetylornisynthase) 그리고 아르기니노숙시네이즈(argininosuccinase)인 효소의 연속적인 화학 반응에 의해 합성된다. 이 효소는 각각 argA , argB , argC , argD , argE , argF , argG 그리고 argH에 의해 암호화된다.

본 발명자들은 L-알지닌의 생산 수율을 더욱 높일 수 있는 균주를 개발하기 위하여 알지닌 생합성 중간 단계인 오르니틴이 시투룰린으로 전환되는 반응을 촉매하는 효소 오르니틴 카바모일트랜스퍼라아제(ornithine carbamoyltransferase)를 코딩하는 argF 유전자를 증폭시키고자 하였으며, 이에 따라 야생형보다 역가가 향상된 변이 argF 유전자를 표적으로 하여 L-알지닌의 생산성 향상을 도모함으로써 본 발명을 완성하였다.

대장균에서 밝혀진 바에 의하면, argF 유전자의 발현은 argR 억제 단백질과 세포 내 알지닌에 의해서 조절되며 알지닌 농도가 높을 경우, argR 단백질이 argF 유전자의 발현을 저해하는 것으로 알려져 있고, (Dongbin Lim, Werner K. Mass, 1987, PNAS 84: 6697-6701) 몇몇 미생물에서는 고농도의 알지닌에 의해서 ArgF 단백질의 역가가 저해된다는 보고도 있다. (Raymon Cunin, Victor Stalon, 1986, Microbiological Reviews 50: 314-352) 또한 argR 유전자가 불활성화될 경우 argF 유전자 발현이 증가되며, 알지닌 생산 효율이 증가된다는 특허도 있다(미국특허 US2002/0045223A1). 현재까지 밝혀진 정보에 의하면 C. glutamicum의 경우, argCJBDFR 유전자가 오페론으로 구성되어 있으며, 다른 미생물의 ArgF 효소의 특성과 매우 유사하다. (Jae-Yeon Chun, Myeong-Sok Lee, 1999, Molecules and Cells 9:333-337) 따라서, argF 유전자의 발현을 증가시킬 경우, 세포 내외에 알지닌이 고농도로 축적되어도 알지닌에 의한 ArgF 활성 저해를 극복할 수 있고 알지닌 생합 성 플럭스(flux)를 강화시킬 수 있으므로 알지닌 생산성 향상을 기대할 수 있다.

이에 본 발명자들은 알지닌을 고농도로 생산하는 변이주로부터 유전자 재조합 기술을 활용하여 argF 유전자 발현벡터를 제작하고, 이를 알지닌 생산 균주에 도입함으로써 고농도의 L-알지닌 생산 균주를 개발하고 실질적으로 이 균주를 발효에 이용하여 현저히 증가된 수율로 L-알지닌을 얻을 수 있었다.

본 발명은 아미노산 L-알지닌을 생성할 수 있는 L-알지닌 생산용 재조합 미생물을 제공하는 것을 그 목적으로 한다.

특히, 본 발명은 야생주로부터 변이된 argF 유전자 또는 이의 DNA 절편을 제조하고, C. glutamicum 에서 발현될 수 있는 벡터를 제작하여 L-알지닌 생산 균주에 도입함으로써, 향상된 수율로 아미노산 L-알지닌을 생산하는 재조합 미생물 및 그의 제조 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 아미노산 L-알지닌을 생산할 수 있는 균주를 배양하고, 배양액으로부터 아미노산 L-알지닌을 분리함을 특징으로 하는, 아미노산 L-알지닌의 제조 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명은 오르니틴 카바모일트렌스퍼라아제 argF 유전자를 표적으로 하여 L-알지닌의 생산성 향상을 특징으로 한다. 좀더 구체적으로는, 본 발명은 유전자 재조합기술을 이용하여 L-알지닌 생산 미생물로부터 argF 유전자를 확보한 후 벡터에 삽입하여 argF 발현 벡터를 제작하고, 이 발현 벡터를 다시 L-알지닌 생산 균주에 도입함으로써 고농도 알지닌 발효조건 하에서도 L-알지닌의 생산성을 증대시키는 것이다.

이러한 본 발명의 아이디어는 원핵 및 진핵을 포함한 L-알지닌을 생성할 수 있는 모든 미생물에 적용될 수 있으며 대표적인 미생물로는 종래에 L-알지닌을 생성하기 위해 사용되어 온 것으로 대장균, 코리네형 세균, 바씰러스속 세균을 들 수 있다. 바람직하게는, L-알지닌 유사체에 대한 내성을 가지며, L-알지닌을 생산할 수 있는 코리네박테리움 글루타미컴에 속하는 미생물이다.

본 발명에 따라 L-알지닌 생성 미생물의 염색체에 존재하는 argF 유전자를 발현시키는 방법은 통상적인 유전자 재조합 기술에 의해 수행될 수 있고, 유전자의 염기서열은 형광물질을 활용한 시퀀싱 방법에 의해서 분석할 수 있다.

한 양태로서, 본 발명의 유전자 발현 벡터 제작 과정은 다음의 과정을 포함하고 있다. L-알지닌을 생산할 수 있는 균주로부터 게놈 DNA를 분리하고, 이를 주형으로 하여 통상적인 기술을 이용한 중합효소 연쇄반응(PCR)에 의해 argF 유전자 의 ORF, argC의 프로모터 부위, rrnB 터미네이터 부위를 증폭한다. 이 때, 얻어진 argF 유전자의 염기서열을 통상적인 시퀀싱 방법에 의해 분석한다. 또한 위에서 얻은 프로모터 부위, argF 유전자, 터미네이터 부위 DNA를 순서대로 적합한 플라스미드 또는 기타 벡터 내로 클로닝하고 형성된 재조합 벡터를 형질전환에 의해 대장균과 같은 숙주 세포 내로 도입한다. 형질 전환체를 배양 증식한 후 이들로부터 프로모터, argF, 터미네이터 DNA를 순서대로 삽입된 재조합 벡터를 추출한다. 추출된 재조합 벡터를 L-알지닌을 생산할 수 있는 균주에 전기충격법과 같은 통상의 기술에 의해 도입시킨 후 항생제 내성을 이용하여, 재조합 벡터를 포함하는 균주를 분리한다.

당업자는 본 발명의 염기서열 분석 및 DNA 절편의 제작이 일반적인 시퀀싱 및 클로닝 방법에 의해 이루어질 수 있음을 인지할 것이다. 본 발명에 따른 argC 프로모터, argF 유전자, rrnB 터미네이터를 표적으로 하는 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 사용한 PCR 증폭 방법이 바람직하다. PCR 증폭 방법은 본 분야에 잘 알려져 있다(참조: PCR Protocols: A Guide to Method and Application, Ed. M. Innis et al., Academic Press (1990)). PCR은 게놈 DNA, 적합한 중합효소, 프라이머 및 완충액을 포함하고 편리하게는 PTC-200 Peltier Thermal Cycler(MJ Researchh, USA)에서 실시한다. 양성 PCR 결과는 예를 들면 적절한 크기의 DNA 절편을 아가로즈 겔 전기영동에 의해 검출함으로써 결정한다.

바람직한 양태로서, 본 발명은 L-알지닌을 생산할 수 있는 변이 균주로서 L-알지닌 유사체에 대한 내성을 갖는 균주를 사용한다. L-알지닌 유사체로는 카나바틴 및 알지닌 하이드록사메이트가 포함된다.

특히 바람직한 양태로서, 본 발명자들은 재조합 플라스미드 pECCG117-argF를 제작하여 이 플라스미드를 L-알지닌 유사체에 대한 내성을 포함하는 C. glutamicum CJR0500에 전기충격법으로 유입시켜 변이 argF 유전자가 과발현 되어 모균주에 비해 고농도의 L-알지닌을 생성하는 신 균주 1종을 개발하였다. 본 출원인은 상기 미생물 코리네박테리움 CJR0586을 제3자에게 일반 분양될 수 있도록 한국미생물보존센터에 2006년 3월 15일자로 수탁번호 KCCM-10742P로 기탁하였다.

본 발명의 신 균주 CJR0586은 모 균주 CJR0500로부터 유도된 것으로 균주 CJR0500는 글루타민 생산 균주 KFCC-10680(대한민국 특허공고 번호 제91-7818호)으로부터 유도된 것이다. 모 균주 CJR0500는 코리네박테리움 글루타미컴 KFCC-10680에 일반적인 변이처리 방법인 N-methyl-N-nitro-N-nitrosoguanidine(NTG)을 처리한 후 카나바닌과 알지닌 하이드록사메이트가 첨가된 최소배지(포도당 1.0%, 황산암모늄 0.4%, 황산마그네슘 0.04%, 인산 제1칼륨 0.1%, 요소 0.1%, 티아민 0.0001%, 비오틴 200ug/L, 한천 2%, pH7.0)에 도말하여 각각에 대해 공통으로 500mg/L 내성을 가지는 균주를 획득함으로써 유도된 변이 균주이다.

L-알지닌을 생산하는데 있어 시투룰린(Cituruline)은 알지닌의 대사경로의 중간체로서 Urea 회로와 함께 질소대사에 중요한 물질이다. CJR0586 균주는 L-알지닌의 생산 균주인 상기 C. glutamicum CJR0500의 염색체로부터 중합효소 연쇄반응을 통해 얻은 오르니틴 카바모일트렌스퍼라아제 유전자(argF)를 벡터에 삽입하여 생성된 재조합 발현 벡터를 모균주인 CJR0500에 도입함으로써 argF 유전자의 발현을 증가시켰다. 그 결과, argF 유전자의 발현이 증가됨으로써 알지닌 생합성 경로가 활성화되어 알지닌 생산 수율이 증가되었다.

본 발명에 따른 L-알지닌을 대량 생산하기 위해 argF 유전자의 발현이 증가되고 L-알지닌을 효율 좋게 생성할 수 있는 재조합 균주를 발효시켜 그 발효액으로부터 목적하는 L-알지닌을 분리하는 모든 공정은 본 분야에 잘 알려져 있다.

본 발명은 하기 실시예로 보다 구체적으로 예시될 것이다. 그러나, 이들 실시예는 단지 본 발명의 구현 예이며 본 발명의 범위를 한정하는 것이 아니다.

실시예 1: 재조합 플라스미드 제작

게노믹-팁 시스템(QIAGEN Genomic-tip system)을 이용하여 L-알지닌 생산균주 CJR0500 균주로부터 게놈 DNA(genomic DNA)를 추출하였고, 이 게놈 DNA 주형(template)으로부터 중합효소 연쇄반응(PCR)을 이용하여 argC 프로모터 부위 및 argF 유전자의 ORF(Open Reading Frame)를 포함하는 DNA 절편, 각각 362bp, 1059bp 를 증폭하였다. 그리고, argC 프로모터와 argF 유전자의 융합단편을 얻기위하여 argC 프로모터 증폭단편과 argF 유전자 증폭단편을 섞어 이를 주형으로 중합효소 연쇄반응을 하였으며 이로부터 1421bp인 단편을 증폭하였다. argC 부위 프로모터 증폭에 사용된 프라이머들은 5'- cgcggatccggctacttccgaggaatcttc-3'(서열번호 3)과 5'-acaccatacacgttatgcatga-3'(서열번호 4)이며 변성(denaturation) 단계는 94℃에서 30초간, 어닐링(annealing) 단계는 55℃에서 30초간, 연장(extension) 단계는 72℃에서 30초간 실시하였고, 20 주기를 수행하였다. 이 PCR 결과물을 1.0% 아가로즈 겔에서 전기영동한 후 0.4Kb 크기의 밴드를 용출하여 얻었다.

argF 유전자 증폭에 사용된 프라이머들은 5'-tcatgcataacgtgtatggtgtatgacttcacaaccacaggttc-3'(서열번호 5)과 5'-acgcgatatccatgtcttacctcggctggt-3'(서열번호 6)이며 변성(denaturation) 단계는 94℃에서 30초간, 어닐링(annealing) 단계는 55℃에서 30초간, 연장(extension) 단계는 72℃에서 1분간 실시하였고, 20 주기를 수행하였다. 이 PCR 결과물을 0.8% 아가로즈 겔에서 전기영동한 후 1Kb 크기의 밴드를 용출하여 얻었다.

argC 프로모터와 argF 유전자 융합단편 증폭에 사용된 프라이머들은 5'- cgcggatccggctacttccgaggaatcttc-3' (서열번호 3)과 5'-acgcgatatccatgtcttacctcggctggt-3'(서열번호 6)이며 변성(denaturation) 단계는 94℃에서 30초간, 어닐링(annealing) 단계는 55℃에서 30초간, 연장(extension) 단계는 72℃에서 1분 30초간 실시하였고, 20 주기를 수행하였다. 이 PCR 결과물을 0.8% 아가로즈 겔에서 전기영동한 후 1.4Kb 크기의 밴드를 용출하여 얻었다.

rrnB 터미네이터 부위 증폭에 사용된 프라이머들은 5'-acgcgatatcctgttttggcggatgagaga-3'(서열번호 7)과 5'-cggggtacccaaaaaggccatccgtcag-3'(서열번호 8)이며 변성(denaturation) 단계는 94℃에서 30초간, 어닐링(annealing) 단계는 55℃에서 30초간, 연장(extension) 단계는 72℃에서 30초간 실시하였고, 30 주기를 수행하였고 주형 DNA로는 pKK233을 사용하였다. 이 PCR 결과물을 1.0% 아가로즈 겔에서 전기영동한 후 0.4Kb 크기의 밴드를 용출하여 얻었다.

플라스미드 pECCG117를 제한효소 BamHI과 Kpn으로 처리한 후 0.8% 아가로즈 겔에서 약 5.9Kb 크기의 밴드를 용출하고, argC 프로모터와 argF 유전자가 융합된 PCR 결과물을 제한효소 BamHI과 EcoRV로 처리한 후 0.8% 아가로즈 겔에서 약 1.4Kb 크기의 밴드를 용출하고, rrnB 터미네이터 PCR 결과물을 제한효소 EcoRV와 KpnI으로 처리한 후 1% 아가로즈 겔에서 약 0.4Kb 크기의 밴드를 용출하였다. 이들 세 가지의 DNA 절편을 연결시켜 재조합 플라스미드 pECCG117-argF (약 7.7Kb)를 얻었다(도 1).

이 재조합 플라스미드 pECCG117-argF를 L-알지닌 생산균주(CJR0500)에 전기충격요법 (electroporation)으로 유입하여 가나마이신이 포함된 고체배지에 도말한 후 선발한 콜로니에 대하여 플라스크 역가 확인 실험을 수행하였다.

실시예 2: 선별 균주에 대한 삼각 플라스크에서 알지닌 생산 역가 비교 실

항생제 가나마이신이 함유된 고체배지에 도말하여 선별한 각 균주에 대한 콜 로니 10주씩을 선발하여 주 1에 나타낸 L-알지닌 종배지에서 배양한 다음, 주 2에 나타난 역가 배지를 사용하여 삼각 플라스크에서 L-알지닌 생산성을 평균값으로 비교하였다.

주 1. L-알지닌 종배지: 포도당 5%, 박토펩톤 1%, 소듐클로라이드 0.25%, 효모엑기스 1%, 비오틴 3ug/L, 요소 0.4%, pH7.0

주 2. L-알지닌 역가배지: 포도당 4.0%, 황산암모늄 3%, 요소 0.3%, 제1인산칼륨 0.1%, 제2인산칼륨 0.1%, 황산마그네슘7수염 0.025%, CSL(옥수수 침지액) 2.0%, 비오틴 200ug/L, pH7.2

30℃의 배양기에서 종배지에서 16시간동안 배양한 다음 배양액을 24 ml의 역가배지에 1ml씩 접종하여 30℃에서 250 rpm으로 72시간 동안 배양하였다. 분석 결과를 하기 표 1에 나타내었으며 모 균주인 CJR0500 균주는 알지닌 생산량이 2.8 g/L인 반면 argF 유전자가 과발현된 재조합 균주, CJR0586는 3.1 g/L로 향상된 결과를 보였다. 이 결과를 바탕으로 농도가 모 균주 대비 10%정도 향상되었음을 관찰하였다.

재조합 균주들의 플라스크 역가 시험 결과

균주	CJR0500	CJR0586
L-알지닌	2.8	3.1

실시예 3: . argF 유전자의 염기서열 확인 실험

본 실시 예에서는 변이 부위를 확인하기 위하여, pECCG116-argF의 염기서열을 분석하였다. pECCG116-argF 0.1 ug을 주형으로 하고, 서열 3 및 서열 6의 프라이머 2 mM과 BigDye^TM Terminator Cycle Sequencing v2.0 Ready Reaction (PE Biosystems 사) 1 ㎕를 이용하여 PCR을 수행한 후 (변성 : 95 ℃ 30 초, 어닐링 : 55 ℃ 30 초, 중합 : 72 ℃ 1분 30초를 30 회 반복 후 4 ℃로 반응 종료), 1.4kb 크기의 DNA 절편을 분리하였다. 이 DNA절편과 서열 3의 프라이머를 이용하여 ABI PRISM 3100 Genetic Analyzer^TM (Applied Biosystems사)로 염기서열을 결정하였다.

염기서열을 분석한 결과, ArgF의 구조 유전자, argF의 여덟 부위의 염기 서열이 치환되었고, 그에 따라 ArgF 단백질의 88번째 아미노산 세린(S))이 쓰레오닌 (T)으로 치환되었음을 확인하였다. 얻어진 변이된 argF 유전자의 염기서열과 치환된 아미노산서열은 서열번호 1 및 2에 나타내었다.

본 발명에 따라 argF 유전자가 과발현된 L-알지닌 생성 미생물은 L-알지닌의 수율을 증대시킨다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims (8)

1. 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
2. 제1항에 있어서, 서열번호 2의 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드.
3. 제1항 또는 제2항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터.
4. 제1항 또는 제2항에 따른 폴리뉴클레오티드를 포함하며 L-알지닌을 생성할 수 있는 숙주 세포.
5. 제4항에 있어서, 코리네박테리움(Corynebacterium) 속에 속하는 미생물인 숙주 세포.
6. 제5항에 있어서, C. glutamicum KCCM-10742P인 숙주 세포.
7. 제4항에 따른 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하는 L-알지닌의 생산방법.
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