KR100833612B1

KR100833612B1 - Pharmaceutical composition containing the neural cell differentated from mesenchymal stem cell for neurodegenerative disease

Info

Publication number: KR100833612B1
Application number: KR1020040115502A
Authority: KR
Inventors: 김현수; 강영모; 이경복; 박상교; 이상갑
Original assignee: 에프씨비파미셀 주식회사; 김현수
Priority date: 2004-12-29
Filing date: 2004-12-29
Publication date: 2008-05-30
Also published as: KR20050012208A

Abstract

본 발명은 간엽 간세포를 상피세포 성장 인자(epidermal growth factor)와 간세포 성장 인자(hepatocyte growth factor)를 포함하는 배지에서 배양하여 신경세포로 분화 및 증식시키는 방법에 있어서, 간엽 간세포를 혼탁 배양한 후 배지에서 배양하는 것을 특징으로 하는 간세포로부터 신경세포를 제조하는 방법을 제공함으로서, 기존의 방법에 비하여 골수 유래 간엽 간세포 또는 이를 포함하는 단핵세포들을 뉴런 및 성상교세포로 구성되는 신경세포를 시간면, 효율면, 성숙도에서 더욱 효과적으로 분화 및 증식시킬 수 있는 효과를 얻을 수 있다.
The present invention provides a method of differentiating and proliferating mesenchymal stem cells into neurons by culturing the mesenchymal stem cells in a medium containing epidermal growth factor and hepatocyte growth factor, and then culture the mesenchymal stem cells after turbid culture. By providing a method for producing neurons from hepatocytes, characterized in that the culturing in the bone marrow-derived mesenchymal stem cells or mononuclear cells including the same compared to the conventional method, the neurons composed of neurons and astrocytes in terms of time, efficiency In addition, the effect of differentiation and multiplication can be obtained more effectively in maturity.

Description

Pharmaceutical composition for treating neurological diseases containing neurons differentiated from mesenchymal stem cells as active ingredients {PHARMACEUTICAL COMPOSITION CONTAINING THE NEURAL CELL DIFFERENTATED FROM MESENCHYMAL STEM CELL FOR NEURODEGENERATIVE DISEASE}

도 1은 24시간 혼탁배양(confluent culture)된 골수 단핵세포를 상피세포 성장 인자 10ng/ml과 간세포 성장 인자 20ng/ml을 배지에 첨가하여 1주 동안 배양한 골수 단핵세포 중 부착세포를 광학현미경으로 관찰한 사진(×100, 이하 동일),Figure 1 shows the adherent cells in bone marrow mononuclear cells cultured for one week by adding 10 ng / ml epithelial growth factor and 20 ng / ml hepatocyte growth factor to the medium. Observed photograph (* 100, same as below),

도 2는 24시간 혼탁 배양된 골수 단핵세포를 상피세포 성장 인자 10ng/ml과 간세포 성장 인자 20ng/ml을 포함하는 배지에서 2주 동안 골수 단핵세포를 배양하여 분화 증식시킨 신경세포를 광학현미경으로 관찰한 사진,FIG. 2 is an optical microscope of bone marrow mononuclear cells cultured for 24 hours in cultured bone marrow mononuclear cells for 2 weeks in culture medium containing epithelial growth factor 10ng / ml and hepatocyte growth factor 20ng / ml. One Photo,

도 3은 도 2의 분화된 신경세포를 분리하여 관찰한 광학현미경 사진으로서, 도 3a는 뉴런을, 도 3b는 성상교세포를 보여주는 사진,FIG. 3 is an optical microscope photograph of the differentiated neurons of FIG. 2, wherein FIG. 3a is a neuron and FIG. 3b is an astrocyte.

도 4는 도 2의 분화된 신경세포를 면역세포화학염색법으로 염색하여 관찰한 사진으로, 도 4a는 NSE 양성 염색 세포, 도 4b는 NeuN 양성 염색 세포, 도 4c는 GFAP 양성 염색세포, 도 4d는 MAP-2 양성 염색 세포를 보여주는 사진,Figure 4 is a photograph observed by staining the differentiated neurons of Figure 2 by immunocytochemical staining method, Figure 4a is NSE positive staining cells, Figure 4b is NeuN positive staining cells, Figure 4c is GFAP positive staining cells, Figure 4d Photo showing MAP-2 positive staining cells,

도 5는 골수에서 분리한 단핵세포들을 낮은 포도당 농도의 배지에서 배양하 여 간엽 간세포만을 분리한 후 이를 골아세포(도 5a), 연골아 세포(도 5b) 및 지방세포(도 5c)로 각각 분화시킨 다음 분화된 세포를 염색하여 현미경으로 관찰한 사진,FIG. 5 shows that mononuclear cells isolated from bone marrow are cultured in a medium of low glucose concentration to separate mesenchymal stem cells, and then differentiate into osteoblasts (FIG. 5A), chondrocytes (FIG. 5B) and adipocytes (FIG. 5C), respectively. And then stained the differentiated cells and observed under a microscope,

도 6은 상피세포 성장 인자 10ng/ml과 간세포 성장 인자 20ng/ml을 포함하는 배지에서 1주 동안 배양한 간엽 간세포의 광학현미경 사진,6 is an optical micrograph of mesenchymal stem cells cultured for 1 week in a medium containing epidermal growth factor 10ng / ml and hepatocyte growth factor 20ng / ml.

도 7은 상피세포 성장 인자 10ng/ml과 간세포 성장 인자 20ng/ml을 포함하는 배지에서 간엽 간세포를 2주간 배양하여 분화 증식된 신경세포의 광학현미경 사진,7 is an optical micrograph of neurons differentiated and expanded by culturing mesenchymal stem cells for 2 weeks in a medium containing epidermal growth factor 10ng / ml and hepatocyte growth factor 20ng / ml,

도 8은 도 6에서부터 분화된 신경세포를 면역세포화학염색법으로 염색하여 관찰한 사진으로, 도 8a는 NSE 양성 염색 세포, 도 8b는 NeuN 양성 염색 세포, 도 8c는 GFAP 양성 염색세포, 도 8d는 MAP-2 양성 염색세포를 보여주는 사진,Figure 8 is a photograph observed by staining neuronal cells differentiated from Figure 6 by immunocytochemical staining method, Figure 8a is NSE positive staining cells, Figure 8b is NeuN positive staining cells, Figure 8c is a GFAP positive staining cells, Figure 8d Photo showing MAP-2 positive staining cells,

도 9는 국소적 허혈성 질환을 유도한 쥐의 정맥에 간엽 간세포 유래 신경세포를 3×10⁵개 주사하고, 2주 후 쥐의 뇌를 절개하여 현미경으로 관찰한 결과를 나타낸 것으로서, 도 9a는 국소적 허혈성 질환을 유도하기 전의 뇌의 상태를 나타낸 사진이고, 도 9b는 국소적 허혈성 질환을 유도한 후 분화시킨 신경세포를 정맥주사한 다음 2주 후 뇌의 상태를 나타낸 사진이고, 도 9c는 도 9b의 국소적 허열부위의 확대사진.
FIG. 9 is a 3 × 10 ⁵ injection of mesenchymal stem cell-derived neurons into a vein of a rat induced local ischemic disease, and two weeks later, the brain of the rat was dissected and the result of microscopic observation was shown. FIG. Figure 9b is a picture showing the state of the brain before inducing ischemic disease, Figure 9b is a picture showing the state of the brain 2 weeks after intravenous injection of differentiated neurons after inducing local ischemic disease, Figure 9c Magnified image of focal scarring at 9b.

본 발명은 골수 유래 간엽 간세포로부터 신경세포를 제조하는 방법과, 그 제조방법에 의해 제조된 신경세포를 유효성분으로 함유하는 신경계 질환치료용 조성물에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 골수 내에 존재하는 간엽 간세포를 1일 혼탁배양(confluent culture)후 상피세포 성장 인자, 간세포 성장 인자를 포함하는 배지에서 배양하여 신경세포를 생산하는 방법 및 상이한 방법에 의해 골수 유래 간엽 간세포로부터 생산된 신경세포를 유효성분으로 함유하는 신경계 질환 치료용 조성물에 관한 것이다.
The present invention relates to a method for producing neurons from bone marrow-derived mesenchymal stem cells, and to a composition for treating neurological diseases containing neurons prepared by the method as an active ingredient, and more particularly, mesenchymal stem cells present in bone marrow. It is cultured in a medium containing epithelial growth factor, hepatocyte growth factor after 1 day confluent culture to produce neurons and contains nerve cells produced from bone marrow-derived mesenchymal stem cells by different methods as an active ingredient. It relates to a composition for treating neurological diseases.

근래에 들어 인간으로부터의 배아 간세포 분리가 성공한 이후, 그 임상적 적용에 관심이 고조되고 있다. 간세포의 적용 분야로서 가장 주목받고 있는 것은 세포 대체 요법(cell replacement therapy)을 위한 완벽한 세포 공급원으로서의 이용이다. 특히, 난치병으로 알려진 파킨슨씨병, 알쯔하이머와 같은 신경퇴행성 질환, 척추 손상에 의한 사지마비, 백혈병, 중풍, 소아당뇨병, 심근경색, 간경화 등의 질환은 조직을 구성하는 세포의 파괴 및 영구적 기능 장애에 의해 초래되는데, 이들 질환에 의해 파괴되어 부족한 세포를 외부로부터 공급해주는 세포 대체 요법이 효과적인 치료법으로 제시되고 있다.Recently, after the successful separation of embryonic stem cells from humans, interest in its clinical application has been increasing. Most notable as a field of application of hepatocytes is their use as a complete cell source for cell replacement therapy. In particular, Parkinson's disease, known as intractable disease, neurodegenerative diseases such as Alzheimer's disease, limb paralysis due to spinal cord injury, leukemia, stroke, childhood diabetes, myocardial infarction and liver cirrhosis are caused by the destruction of cells constituting tissue and permanent dysfunction. It is caused, cell replacement therapy that provides cells from the outside destroyed by these diseases has been suggested as an effective treatment.

그러나, 세포 대체 요법의 가능성은 실제 임상에 적용하는 데에는 많은 한계가 있다. 즉, 분화가 완전히 진행된 세포를 공급자의 조직으로부터 분리하여 환자에게 이식하는 전통적인 방법은 환자에게 공급할 충분한 세포를 얻는데 어려움이 있다. However, the possibility of cell replacement therapy has many limitations in its practical application. That is, the traditional method of separating fully transplanted cells from a provider's tissue and transplanting them into a patient has a difficulty in obtaining sufficient cells to supply the patient.

이러한 세포 공급의 문제를 해결하기 위해 배아 간세포를 분리하여 특정 조직의 세포로 분화시켜 사용하거나, 조직 특이적 간세포를 분리하고 이를 배양하여 증식시킨 다음 분화를 유도하여 세포 대체 요법에 사용할 수 있다. In order to solve the problem of cell supply, embryonic hepatocytes may be isolated and used to differentiate into cells of a specific tissue, or tissue specific hepatocytes may be isolated, cultured, expanded, and induced to differentiate and used for cell replacement therapy.

그러나 배아 간세포는 서로 다른 인체로부터 만들어져 이로부터 유래된 신경 세포는 다른 개체에 이식되기 어려우며 배아를 만드는데 사용된 세포를 공여한 두 남녀 개체에도 이식될 경우 면역학적 장벽이 커 실제 이식되기는 힘들다. However, embryonic hepatocytes are made from different human bodies, and nerve cells derived from them are difficult to transplant into other individuals, and when transplanted into two male and female individuals that donate the cells used to make an embryo, it is difficult to actually transplant due to the large immunological barrier.

지금까지 배양접시 상에서 마우스의 배아 간세포로부터 조혈세포, 심근세포, 인슐린 분비 췌장세포 및 신경세포로의 분화가 증명되었다. 또한, 배아 간세포로부터 수초(myelin) 생성 세포인 다수상돌기세포(oligodendrocyte)로 분화를 유도한 후 이를 마우스에 이식하여 수초 생성을 증가시키거나(Brustle et al., Science 285:754-756, 1999), 배아 간세포에서 분화된 인슐린 분비 세포를 당뇨병 모델 쥐에 이식하여 혈당량을 조절하거나(Soria et al., Diabetes 49:157-162, 2000), 배아 간세포에서 분화된 신경세포를 척추 손상을 입은 쥐에 이식하여 척추 손상에 의한 운동장애의 현저한 개선을 확인한 연구(McDonald et al., Nat. Med. 5(12):1410-1412, 1999) 등은 간세포로부터 분화 증식시킨 세포를 이식하는 방법이 세포의 손실에 의한 질병의 치료에 효과적임을 보여주고 있다.To date, differentiation from embryonic stem cells of mice to hematopoietic cells, cardiomyocytes, insulin-secreting pancreatic cells and neurons has been demonstrated in culture dishes. In addition, differentiation may be induced from embryonic stem cells into oligodendrocytes, myelin producing cells, and then transplanted into mice to increase myelogenesis (Brustle et al ., Science 285: 754-756, 1999). To control blood glucose levels by transplanting insulin-secreting cells differentiated from embryonic hepatocytes into diabetic model mice (Soria et al ., Diabetes 49: 157-162, 2000), or neurons differentiated from embryonic stem cells into spinal cord-damaged mice. Studies that have shown significant improvement in motor impairment due to spinal injury by transplantation (McDonald et al., Nat. Med. 5 (12): 1410-1412, 1999) and others have described the method of transplanting differentiated and proliferated cells from hepatocytes. It is shown to be effective in the treatment of diseases caused by loss.

그러나, 인간 배아 간세포의 분리가 성공한 것은 최근의 일이며, 신경세포로의 분화 외에는 배양접시 상에서 다른 특정한 세포로의 분화에 성공한 보고가 없는 실정이어서 세포 대체 요법에 배아 간세포로부터 분화된 특정 조직 세포를 임상 적 용하는 것은 아직 가능성의 수준에 머물러 있을 뿐이다.However, the recent isolation of human embryonic stem cells has been successful, and there have been no reports of differentiation into other specific cells on culture dishes except for differentiation into neurons. Therefore, specific tissue cells differentiated from embryonic stem cells in cell replacement therapy have been reported. Clinical application remains only at the level of potential.

이처럼 배아 간세포로부터 분화된 세포를 세포 대체 요법에 이용하는 것이 현재로서는 가장 효과적인 방법인 것으로 여겨지지만, 면역학적 장벽 외에도 배아 간세포로부터 필요로 하는 특정 세포로 분화되는 효율이 낮기 때문에 환자에게 이식할 경우 혼합된 다른 세포로 인한 부작용의 위험성이 있어, 보다 안전한 임상 적용을 위해서는 정교한 분화발생법에 대한 연구가 요구되고 있다.
Although the use of cells differentiated from embryonic hepatocytes for cell replacement therapy is considered to be the most effective at present, in addition to immunological barriers, the efficiency of differentiation from embryonic hepatocytes to the specific cells needed is low. There is a risk of side effects from other cells, so the study of sophisticated differentiation methods is required for safer clinical application.

한편, 세포 대체 요법을 위해 조직 특이적인 간세포를 이용하는 경우에 있어서는, 장기간 배양시 세포 증식 능력이 감소하거나 분화 잠재력이 변형되어 원치 않는 세포로의 분화가 일어나기도 하는 등의 문제가 있다. 더욱이 파킨슨씨병과 같은 퇴행성 뇌신경 질환(neurodegenerative disease)의 경우 신경세포의 이식이 필요한데, 신경 간세포(neural stem cell)를 환자로부터 직접 얻는 것이 어렵기 때문에 이식에 필요한 신경세포는 주로 태아의 뇌조직으로부터 분리한 신경 간세포를 배양하여 신경세포로 분화 및 증식시킴으로써 얻어진다. 이 때 한 사람의 환자를 치료하기 위해서는 대략 두 명 정도의 태아의 뇌가 필요하므로, 윤리적인 문제 및 원활한 공급에 있어 문제가 있을 뿐만 아니라 대부분의 신경 간세포가 신경 세포로 분화되기보다는 성상교세포(astrocyte)로 분화되기 쉽고, 면역 거부 반응을 일으키는 등의 문제점이 있다.On the other hand, in the case of using tissue-specific hepatocytes for cell replacement therapy, there are problems such as decreased cell proliferative capacity or long-term culture differentiation into unwanted cells due to decreased cell proliferation ability. Furthermore, neurodegenerative diseases such as Parkinson's disease require transplantation of neurons, which are often isolated from fetal brain tissue because it is difficult to obtain neural stem cells directly from the patient. It is obtained by culturing one neural stem cell to differentiate and proliferate into neurons. At this time, the treatment of a single patient requires approximately two fetuses' brains, which is not only problematic for ethical problems and smooth supply, but also for most neural stem cells, rather than differentiating into neural cells. Easy to differentiate into), causing an immune rejection reaction and the like.

따라서, 골수에 존재하는 간엽 간세포로부터 신경세포를 분화시켜 사용할 수 있다면 세포 공급 문제를 해결할 수 있을 뿐만 아니라 자가 골수를 이용하므로 면 역 거부 반응을 포함한 치료 상의 문제점도 해결할 수 있는 이점을 갖는다. 그러나 간엽 간세포는 중배엽성 세포로 현재까지의 지식으로는 외배엽성인 신경 세포로의 분화가 가능한가에 대하여는 의문이나 최근 교차분화(trans-differentiation)가 가능함이 알려지면서 가능성이 높아지고 있다.Therefore, if the neurons can be differentiated from mesenchymal stem cells present in the bone marrow, not only can the cell supply problem be solved, but also the autologous bone marrow has the advantage of solving the therapeutic problems including immune rejection. However, as mesenchymal stem cells are mesodermal cells, the possibility of differentiation into ectoderm neurons is known to date, but the possibility of differentiation is increasing with the recent discovery that trans-differentiation is possible.

이전까지 한 종류의 간세포는 특정 계통에 속하는 조직 세포들만으로 분화되는 것으로 여겨져 왔다. 간엽 간세포의 경우에는, 혈청 염기성 섬유아세포 성장 인자(basic fibroblast growth factor), TGF-β(transforming growth factor-β) 또는 EGF 등을 포함한 여러 가지 성장인자들의 존재 하에서 생체외 군집(in vitro colonies)을 형성할 수 있으며(Kuznetsov et al., Br. J. Haematol. 97:561, 1997; van den Bos C et al., Human Cell 10:45, 1997), 대략 초기 부착 세포의 1/3 정도가 다분화능력을 지니고 있어 골아세포, 연골아세포, 지방세포 등의 결합조직 세포로 분화할 수 있다고 보고 되어 있다(Pttenger MF et al., Science 284:143, 1999). 또한, 페라리 등은 골수가 새로운 근육을 형성할 수 있는 근형성 전구세포(myogenic precursor cell)의 원천이라고 보고하였다(Ferrari G et al., Science 279:1528, 1998).Previously, one type of hepatocyte was considered to differentiate into tissue cells belonging to a particular lineage. In the case of mesenchymal hepatocytes, in vitro colonies were developed in the presence of various growth factors, including serum basic fibroblast growth factor, transforming growth factor-β (TGF-β) or EGF. (Kuznetsov et al., Br. J. Haematol . 97: 561, 1997; van den Bos C et al., Human Cell 10:45, 1997), approximately one third of the initial adherent cells. It is reported that it has differentiation ability and can differentiate into connective tissue cells such as osteoblasts, chondrocytes and adipocytes (Pttenger MF et al., Scienc e 284: 143, 1999). Ferrari et al. Also reported that bone marrow is the source of myogenic precursor cells that can form new muscles (Ferrari G et al., Science 279: 1528, 1998).

그러나 최근 일련의 연구들은 결합조직으로만 분화되는 것으로 여겨져 왔던 간엽 간세포가 신경 계통 세포들로 분화될 수 있음을 보고하고 있다. 예를 들어 산체스 등(Sanchez-Ramos et al., Exp. Neurology 164:247-256, 2000)은 레티논산(retinoic acid)과 BDNF(brain-derived neurotrophic factor)을 첨가하여 배양하였을 때 골수 간엽 간세포로부터 신경세포 및 성상교세포가 분화됨을 보고하고 있고, 데일 우드베리 등(Dale Woodbury et al., J. Neuro. Res. 61:364-370, 2000)은 β-머캅토에탄올(β-mercaptoethanol) 또는 DMSO(dimethyl sulfoxide)와 같은 항 산화 물질이 골수 간엽 간세포를 신경세포로 분화시킬 수 있음을 보고한 바 있다. However, recent studies have reported that mesenchymal stem cells, which have been thought to only differentiate into connective tissue, can be differentiated into neuronal cells. For example, Sanchez et al. (Sanchez-Ramos et al., Exp. Neurology 164: 247-256, 2000), have been developed from bone marrow mesenchymal stem cells when cultured with retinoic acid and brain-derived neurotrophic factor (BDNF). Nerve cells and astrocytes have been reported to differentiate, and Dale Woodbury et al. (J. Neuro. Res. 61: 364-370, 2000) reported β-mercaptoethanol or DMSO. Antioxidants such as (dimethyl sulfoxide) have been reported to differentiate bone marrow mesenchymal stem cells into neurons.

상기 골수 간엽 간세포를 신경세포로 분화시키는 과정에서 DMSO와 같이 강력한 화학적 분화 유도제를 사용할 경우 자체의 독성이 있어 이에 영향을 받은 간세포의 변화 가능성 등의 문제로 실제 임상에 사용되기 위하여 보다 안전한 방법이 요구되고 있다.
In the process of differentiating bone marrow mesenchymal stem cells into neurons, when a strong chemical differentiation inducer such as DMSO is used, it is toxic and requires a safer method for actual clinical use due to the possibility of change of affected liver cells. It is becoming.

이에 본 발명자는 인체에 존재하여 안전성이 높으면서도, 효과적으로 골수 내에 존재하는 간세포를 신경세포로 분화시키는 방법을 연구한 결과의 일환으로서 국내특허출원번호 제2001-21064호의 "간엽 간세포를 신경세포로 분화시키는 방법"에 관한 기술을 선출원한 바 있다. 상기 기술은 간세포 성장 인자(hepatocyte growth factor; HGF)와 상피세포 성장 인자(epidermal growth factor; EGF)를 배양배지에 첨가하여 간엽 간세포를 신경세포로 분화 및 증식시키는 방법에 관한 것이다. The present inventors, as part of the results of a method for differentiating liver cells present in the bone marrow into nerve cells while being present in the human body with high safety, differentiates the mesenchymal stem cells into neurons of Korean Patent Application No. 2001-21064. And how to make it. " The technique relates to a method for differentiating and proliferating mesenchymal stem cells into neurons by adding hepatocyte growth factor (HGF) and epidermal growth factor (EGF) to a culture medium.

그러나, 상기 특허출원번호 제2001-21064호에서 개시하고 있는 간엽 간세포를 신경세포로 분화 및 증식시키는 방법은 신경 세포로의 분화속도가 늦을 뿐만 아니라 분화율이 80% 정도로 낮다는 단점을 가지고 있다. 특히 증식 배양중인 세포를 배지에서 키울 경우 분화속도가 늦어 4주 이상 배양한 후 형태학적 변화가 나타나므로 배양시 오염의 문제와 시약 및 초자기구의 소모가 많고, 이식에 필요시 4주 이상의 기간이 필요하다는 단점을 가지고 있다. However, the method of differentiating and proliferating mesenchymal stem cells disclosed in Patent Application No. 2001-21064 into neurons has a disadvantage in that the rate of differentiation into neurons is low and the rate of differentiation is low as 80%. In particular, when growing cells in culture, the differentiation rate is slow and morphological changes appear after 4 weeks of culture.Therefore, there are many problems of contamination during culture, consumption of reagents and vitreous tools, and more than 4 weeks if necessary for transplantation. It has the disadvantage of being necessary.

또한, 상기 특허출원번호 제2001-21064호에서는 간엽간세포에서 분화 증식된 신경세포가 파킨슨병, 알츠하이머, 피크병(Pick's disease), 헌팅톤병(Huntington's disease), 근위축성 측면 경화증(amyotriophic lateral sclerosis) 및 허혈성 뇌질환(ischemic brain disease: stroke)과 같은 퇴행성 뇌신경 질환에 유용할 것이라는 가능성을 제시하고 있으나, 실제 시험관내 시험, 동물시험 또는 임상시험이 이루어진 바 없으며, 의학적 약리효과에 관하여는 어떠한 사항도 확인되지는 않았다.
In addition, Patent Application No. 2001-21064 discloses that neurons differentiated and proliferated from mesenchymal stem cells include Parkinson's disease, Alzheimer's disease, Pick's disease, Huntington's disease, amyotriophic lateral sclerosis and It has been suggested to be useful for degenerative neurological diseases such as ischemic brain disease (stroke), but no in vitro, animal or clinical trials have been conducted. It didn't work.

이에 본 발명자는 상기한 종래의 방법을 개선하여 골수 내에 존재하는 간엽 간세포를 신경세포로 분화시키는 과정에서 분화속도의 개선과 분화율 향상을 도모할 수 있는 방법과 약리효과에 대한 연구를 수행한 결과 본 발명을 완성하였다.
Therefore, the present inventors have conducted research on methods and pharmacological effects that can improve the differentiation rate and differentiation rate in the process of differentiating mesenchymal stem cells present in bone marrow into neurons by improving the conventional method described above. The present invention has been completed.

따라서 본 발명은 간엽세포를 신경세포로 분화시키는 과정에서 분화속도의 개선과 분화율을 향상시킬 수 있는 골수 간엽 간세포로부터 신경세포를 제조하는 방법을 제공하는데 그 목적이 있다. Accordingly, an object of the present invention is to provide a method for producing neurons from bone marrow mesenchymal stem cells that can improve the differentiation rate and differentiation rate in the process of differentiating mesenchymal cells into neurons.

또한, 본 발명은 상기한 방법에 의해 간세포로부터 분화 생산된 신경세포를 유효성분으로 함유하는 신경계 질환 치료용 약학 조성물을 제공하는 데 다른 목적이 있다.
In addition, the present invention has another object to provide a pharmaceutical composition for treating neurological diseases containing neurons differentiated and produced from hepatocytes by the above method as an active ingredient.

상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 The present invention to achieve the above object

간엽 간세포를 상피세포 성장 인자(epidermal growth factor)와 간세포 성장 인자(hepatocyte growth factor)를 포함하는 배지에서 배양하여 신경세포로 분화 및 증식시키는 방법에 있어서, In the method of mesenchymal stem cells are cultured in a medium containing epidermal growth factor and hepatocyte growth factor to differentiate and proliferate into neurons,

상기 간엽 간세포를 혼탁 배양한 후 배지에서 배양하는 것을 특징으로 하는 간세포로부터 신경세포를 제조하는 방법을 제공한다. Provided is a method for producing neurons from hepatocytes, characterized in that the mesenchymal stem cells are cultured in a turbid culture.

또한, 본 발명은 상기 제조방법에 의해 제조된 신경세포를 유효성분으로 함유하는 파킨슨씨병, 알츠하이머, 피크병(Pick's disease), 헌팅톤병(Huntington's disease), 근위축성 측면 경화증(Amyotrophic lateral sclerosis), 허혈성 뇌질환(Ischemic brain disease; stroke), 및 외상성 중추 신경계 질환(traumatic central nervous system diseases)을 포함하는 퇴행성 신경 질환 또는 척추손상에 의한 운동 장애를 치료하기 위한 신경계 질환 치료용 약학 조성물을 제공한다.
In addition, the present invention, Parkinson's disease, Alzheimer's disease, Pick's disease, Huntington's disease, Amyotrophic lateral sclerosis, Ischemic, containing neurons prepared by the above production method as an active ingredient Provided are pharmaceutical compositions for treating neurological diseases for treating degenerative neurological diseases or spinal injuries, including ischemic brain disease (stroke), and traumatic central nervous system diseases.

이하 본 발명을 보다 상세하게 설명하면 다음과 같다. Hereinafter, the present invention will be described in more detail.

본 발명에서는 간엽 간세포를 혼탁배양 시킨 다음 상피세포 성장 인자와 간세포 성장 인자로 처리된 배지에서 배양하여 신경세포를 제조하는 방법을 제공한다. The present invention provides a method for producing neurons by turbid culture of mesenchymal stem cells and then cultured in a medium treated with epidermal growth factor and hepatocyte growth factor.

통상의 간세포 배양은 세포들의 계속적인 증식을 위하여 배양기의 표면을 차 지하는 세포들의 비율을 70%정도로 유지시키면서 배양하나, 본 발명에 따른 혼탁배양은 세포들이 완전히 배양기 표면을 차지한 후 지속적으로 더 배양하게 된다. 이것은 세포들이 서로 붙어 증식보다는 분화의 특성을 갖도록 하기 위함이다. 즉, 본 발명에 따른 혼탁 배양을 실시한 후 분화의 자극을 주게 되면 더욱 신속하고 효율적인 분화가 진행되게 된다. Conventional hepatocyte culture is carried out while maintaining the proportion of cells occupying the surface of the incubator at about 70% for continuous proliferation of cells, but turbid culture according to the present invention is further cultured after the cells completely occupy the surface of the incubator Done. This is to allow the cells to stick together and have differentiation characteristics rather than proliferation. In other words, if the stimulation of differentiation is performed after the turbid culture according to the present invention, more rapid and efficient differentiation proceeds.

이때, 간엽 간세포의 전처리 단계인 혼탁 배양은 1∼50시간 실시하는 것이 바람직하며, 이와 같이 혼탁 배양한 간엽세포를 상피세포 성장 인자 1∼10,000ng/ml, 간세포 성장 인자 1∼10,000ng/ml를 포함하는 배지에서 1주 이상 배양하는 것이 바람직하다. At this time, turbid culture, which is a pretreatment step of mesenchymal hepatocytes, is preferably carried out for 1 to 50 hours, and the mesenchymal cells cultured in this manner are epithelial growth factor 1 to 10,000 ng / ml and hepatocyte growth factor 1 to 10,000 ng / ml. It is preferable to culture at least one week in a containing medium.

특히, 간엽 간세포의 전처리 단계인 혼탁 배양은 24시간 실시하고, 혼탁 배양 후 상기 간엽 간세포는 상피세포 성장 인자 10ng/ml, 간세포 성장 인자 20ng/ml을 포함하는 배지에서 1주 이상 배양하는 것이 더욱 바람직하다. In particular, turbid culture, which is a pretreatment step of mesenchymal stem cells, is carried out for 24 hours, and after turbid culture, the mesenchymal stem cells are more preferably cultured for at least one week in a medium containing epithelial growth factor 10ng / ml and hepatocyte growth factor 20ng / ml. Do.

상기한 조건에서 간엽 간세포를 배양하게 되면 배양 4일 후에는 몇 개의 세포로 구성된 신경세포 집단이 형성되며, 약 1주 후에는 상기 신경세포 집단이 계속적으로 성장 증식하여 신경세포를 대량으로 얻을 수 있게 된다.When the mesenchymal stem cells are cultured under the above conditions, a neuronal cell population consisting of several cells is formed after 4 days of culture. After about 1 week, the neuronal cell population is continuously grown and proliferated to obtain a large amount of neurons. do.

특히, 이와 같이 상피세포 성장 인자, 간세포 성장 인자를 동시에 포함하는 배지에서 약 2주간 배양하여 완전히 분화 증식시킨 후에는 상피세포 성장 인자만으로 처리한 배지에서 증식하여도 신경세포의 특성을 그대로 유지하면서 계속적으로 증식된다. In particular, after cultured for about two weeks in a medium containing epithelial growth factor and hepatocyte growth factor at the same time and completely differentiated and propagated, the growth of the epithelial growth factor and hepatocyte growth factor in the medium treated with epithelial growth factor alone was maintained while maintaining the characteristics of the neurons. Multiplies.

그러나, 약 2주간의 배양으로 충분히 분화 증식된 신경세포에 간세포 성장인 자 단독 처리하여 배양시키면 분화만이 진행되어 오히려 세포수가 감소하므로, 약 2주의 분화기간 이후에는 상피세포 성장 인자만 포함하는 배지로 교환하여 계속 증식시키는 것이 바람직하다.However, if the cultured by treatment with hepatocyte growth factor alone to fully differentiated and propagated neurons in culture for about 2 weeks, the differentiation progresses and the cell number decreases. Thus, the medium containing only epithelial growth factor after the differentiation period of about 2 weeks. It is preferable to continue to grow by exchanging with.

본 발명에서 사용되는 간엽 간세포는 바람직하게는 인간의 골수로부터 분리하여 사용할 수 있는데, 골수에서 단핵세포를 분리한 후 이들을 1 내지 2주간 배양하면 분화되기 쉬운 조혈 간세포는 모두 분화되어 성숙한 혈구 세포들을 만들기 때문에 남아 있는 무한 증식 세포인 간세포만을 분리하는 방법에 의해서 간엽 간세포만을 얻을 수 있다. The mesenchymal stem cells used in the present invention may be preferably separated from human bone marrow, and after separating mononuclear cells from the bone marrow for 1 to 2 weeks, all hematopoietic stem cells are easily differentiated to make mature blood cell cells. Therefore, only mesenchymal stem cells can be obtained by separating only hepatocytes, which are infinite proliferating cells.

그러나 골수에서 분리한 단핵세포에서 간엽 간세포를 분리해내지 않고 간엽 간세포를 포함하는 단핵세포들 전체를 본 발명의 방법에 따라 배양하여도 신경세포의 대량 제조라는 동일한 효과를 얻을 수 있으므로 반드시 간엽 간세포만을 사용할 필요는 없다.However, even if the mononuclear cells including mesenchymal stem cells are cultured according to the method of the present invention without separating the mesenchymal stem cells from the monocytes isolated from the bone marrow, the same effect of mass production of neurons is obtained. There is no need to use it.

상술한 바와 같이 상피세포 성장 인자, 간세포 성장 인자를 동시에 사용하여 간엽 간세포로부터 분화 증식시키게 되면 총 세포의 약 90% 이상이 신경세포로 분화되는데, 분화된 신경세포 중 대략 70% 정도는 뉴런, 약 30%는 성상교세포로 구성되며, 미세신경교세포로는 분화되지 않는다.As described above, when epithelial growth factor and hepatocyte growth factor are simultaneously used to differentiate and proliferate from mesenchymal stem cells, about 90% or more of the total cells differentiate into neurons, and about 70% of the differentiated neurons are neurons, about 30% are composed of astrocytes and do not differentiate into microglial cells.

본 발명에서 '신경세포'라 함은 뉴런(neuron), 성상교세포(astrocyte) 및 미세신경교세포(microglial cell)를 포함하는 세포들을 의미한다.In the present invention, the term "nerve cell" refers to cells including neurons, astrocytes and microglial cells.

한편, 본 발명의 방법으로 제조되는 간엽 간세포로부터 분화된 신경세포는 신경 질환 등을 치료하기 위한 세포 대체 요법용 세포 조성물의 유효 성분으로 이 용될 수 있다. On the other hand, neurons differentiated from mesenchymal stem cells produced by the method of the present invention can be used as an active ingredient of the cell composition for cell replacement therapy for treating neurological diseases and the like.

따라서 본 발명에서는 본 발명의 제조방법에 의해 제조된 신경세포를 유효성분으로 함유하는 파킨슨씨병, 알츠하이머, 피크병(Pick's disease), 헌팅톤병(Huntington's disease), 근위축성 측면 경화증(Amyotrophic lateral sclerosis), 허혈성 뇌질환(Ischemic brain disease; stroke), 및 외상성 중추 신경계 질환(traumatic central nervous system diseases)을 포함하는 퇴행성 신경 질환 또는 척추손상에 의한 운동 장애를 치료하기 위한 신경계 질환 치료용 약학 조성물을 제공한다. Therefore, in the present invention, Parkinson's disease, Alzheimer's disease, Pick's disease, Huntington's disease, Amyotrophic lateral sclerosis, containing neurons prepared by the method of the present invention as an active ingredient, It provides a pharmaceutical composition for treating neurological diseases for treating degenerative neurological disorders or movement disorders caused by spinal injury, including ischemic brain disease (stroke), and traumatic central nervous system diseases.

상기 신경세포를 유효성분으로 하는 신경계 질환 치료용 약학 조성물은 실제 사용시 약학적 분야에서 통상의 방법에 따라 인체 투여에 적합한 단위투여형의 제제로 제형화시켜 투여할 수 있다. 이러한 목적에 적합한 제형에는 비경구투여 제제로서 주사제 등이 바람직하다.The pharmaceutical composition for treating neurological diseases using the nerve cells as an active ingredient may be formulated in a unit dosage form suitable for human administration according to a conventional method in the pharmaceutical field in actual use. For formulations suitable for this purpose, injections and the like are preferred as parenteral administration formulations.

상기 제제에는 본 발명에 따른 유효성분인 신경세포 이외에 하나 또는 그 이상의 약학적으로 허용되는 통상적인 불활성 담체들이 포함될 수 있으며, 예를 들면 주사제의 경우 보존제, 무통화제, 가용화제 또는 안정화제 등이 있고, 국소투여용 제제의 경우 기제, 부형제, 윤활제 또는 보존제 등이 있다. The preparation may include one or more pharmaceutically acceptable conventional inert carriers, in addition to neurons, the active ingredient according to the present invention. For example, in the case of injections, there may be preservatives, analgesics, solubilizers or stabilizers, and the like. In the case of formulations for topical administration, there are bases, excipients, lubricants or preservatives.

이렇게 제조된 약학적 제제는 비경구적으로, 예를 들면 정맥내, 피하, 복강내 투여 또는 국소적용될 수 있다. Pharmaceutical preparations thus prepared may be parenterally, for example, intravenously, subcutaneously, intraperitoneally, or topically.

예를 들어 더글라스 콘치올카(Douglas Kondziolka, Pittsburgh, 1998)가 발표한 임상 방법을 이용할 수 있다. 즉 , 먼저 환자의 두개골을 약 지름 1Cm 정도의 완두콩 크기로 절개한 다음, HBSS(Hank's balanced salt solution)와 혼합된 신경 세포 용액을 3군데 정도로 주입하는 방법이 이용될 수 있다. 이때 세포용액의 주입은 긴 바늘이 달려 있는 주사기와, 뇌심부에 목적하는 세포용액을 정좌표로 삽입하기 위한 틀(stereotactic frame)을 이용하여 이루어진다. 또한 직접 병변에 투여하는 것 외에 정맥이나 병변에 혈류를 공급하는 동맥을 통하여도 이식할 수 있다.For example, a clinical method published by Douglas Kondziolka (Pittsburgh, 1998) can be used. In other words, the skull of the patient may be incised into a pea size of about 1Cm in diameter, and then a method of injecting about 3 neuronal cell solutions mixed with Hanks' balanced salt solution (HBSS) may be used. In this case, the injection of the cell solution is performed using a syringe having a long needle, and a stereotactic frame for inserting the cell solution of interest into the coordinates of the brain. In addition to direct administration to the lesion, it can also be implanted through a vein or an artery that supplies blood to the lesion.

상기 신경세포의 1회 투여량은 1×10⁶∼1×10⁹세포수인 것이 바람직하며, 치료하고자 하는 질환, 질환의 중증도, 투여 경로, 환자의 체중, 연령 및 성별 등의 여러 관련 인자를 고려하여 증감이 가능하다.The dose of the neuron is preferably 1 × 10 ^{6 to} 1 × 10 ⁹ cells, and various related factors such as the disease to be treated, the severity of the disease, the route of administration, and the weight, age and sex of the patient. It is possible to increase or decrease in consideration.

전술한 바와 같이 간세포 성장 인자와 상피세포 성장인자를 동시에 사용하여 간엽 간세포로부터 신경세포를 분화 증식시킬 수 있다는 사실은 전 연구에서 밝혀진바 있으나, 혼탁 배양 후 상피세포 성장 인자, 간세포 성장 인자를 동시에 사용하여 간엽 간세포로부터 신경세포를 분화 증식시키는 것이 신경세포로의 분화를 1주내에 신속히 시킬 수 있으며 증식율이나 신경세포의 성숙도가 높다는 사실은 본 발명에 의해 최초로 밝혀진 것이다. As described above, it has been found in the previous studies that differentiation and proliferation of neural cells from mesenchymal stem cells by using hepatocyte growth factor and epithelial growth factor at the same time, but epithelial growth factor and hepatocyte growth factor at the same time after turbid culture Therefore, the differentiation and proliferation of neurons from mesenchymal stem cells can accelerate the differentiation into neurons within a week, and it is first revealed by the present invention that the proliferation rate and the maturity of neurons are high.

본 발명에서는 골수로부터 단핵세포만을 분리하여 24시간 혼탁배양 후 이들에 대해 상피세포 성장 인자, 간세포 성장 인자를 동시 처리한 경우와, 골수유래 단핵세포를 혼탁배양 하지 않고 각각 처리한 경우의 신경세포로의 분화 및 증식 정도를 조사하였으며, 그 결과, 혼탁 배양과 함께 상기 인자들을 동시 처리한 경우에는 약 1주 후 신경세포 집단들이 나타나기 시작하여 2주 후까지 계속 증식하였지 만, 상피세포 성장 인자만을 처리한 경우에는 신경세포로 분화하지 못하였고, 간세포 성장 인자만을 처리한 경우에는 세포가 일찍 분화되어 성장 증식하지 못하였다. In the present invention, only mononuclear cells are separated from the bone marrow and then treated with epithelial growth factor and hepatocyte growth factor at the same time for 24 hours turbid culture, and when treated with bone marrow-derived mononuclear cells without turbid culture. The degree of differentiation and proliferation of was investigated. As a result, when co-treatment with these factors was performed simultaneously with the turbid culture, neuronal cell populations began to appear after about 1 week and continued to proliferate until 2 weeks, but treated only with epidermal growth factor. In one case, the cells did not differentiate into neural cells, and when treated only with hepatocyte growth factor, the cells differentiated early and failed to grow and proliferate.

따라서, 간엽 간세포 또는 이를 포함하는 골수 유래 단핵세포들을 배양하여 신경세포로 분화 증식시킴에 있어, 24시간 혼탁배양은 성장 인자들의 효과가 빠르게 나타날 수 있도록 하는 효과를 나타내며, 상피세포 성장 인자는 주로 세포의 증식 자극 효과를, 간세포 성장 인자는 신경세포로의 분화를 자극하는 효과를 나타내는 것으로 판단되며, 이 인자들 중 어느 하나만에 의해서는 목적하는 충분한 양의 신경세포를 얻을 수 없다.Therefore, in the differentiation and proliferation of mesenchymal stem cells or bone marrow-derived mononuclear cells including the same, the 24-hour turbidity culture has an effect of allowing the effect of growth factors to be rapid, and epithelial growth factor is mainly a cell. It is judged that the proliferation stimulating effect of, the hepatocyte growth factor has an effect of stimulating differentiation into neurons, and only one of these factors can not obtain the desired sufficient amount of neurons.

또, 본 발명에서는 간엽세포 또는 이를 포함하는 골수 유래 단핵세포들을 24시간 혼탁배양 후 상피세포 성장 인자, 간세포 성장 인자를 첨가하여 2주 동안 배양한 후 분화 증식된 세포들을 단일세포로 분리하여 광학현미경으로 관찰한 결과, 축색과 같은 긴 돌기와 신경돌기와 같은 짧은 돌기들로 구성된 뉴런과 짧은 신경돌기만으로 구성된 성상교세포들로 구성되어 있음을 확인할 수 있었다.In the present invention, the mesenchymal cells or the bone marrow-derived mononuclear cells including the same are cultured for 24 hours after addition of epithelial growth factor and hepatocyte growth factor after turbid culture, and then differentiated and propagated cells into single cells. As a result, it was confirmed that the neurons were composed of long projections such as axons and short projections such as neurites and astrocytes composed of only short neurites.

또한, 본 발명에서는 분화 증식된 세포들에 대해 면역세포화학 염색을 수행한 결과, 뉴런 표지인 NSE, NeuN, MAP-2와 성상교세포 표지인 GFAP에 대해 양성으로 염색되는 것으로 나타나 상기 세포들이 뉴런 및 성상교세포로 구성되어 있음을 보다 확실히 알 수 있었다. 미세신경교세포 표지인 OX-42에는 음성 반응을 보여 미세신경교세포로는 분화하지 않음을 알 수 있었다.In addition, in the present invention, as a result of immunocytochemical staining of the differentiated and expanded cells, it was shown that the cells are positively stained for the neuronal markers NSE, NeuN, MAP-2 and the astroglia marker GFAP. It was clear that it is composed of astrocytes. It was found that OX-42, a microglial cell marker, showed a negative response and did not differentiate into microglial cells.

한편, 간엽세포 또는 이를 포함하는 골수 유래 단핵세포들을 24시간 혼탁배양 후 상피세포 성장 인자, 간세포 성장 인자를 동시 처리하였을 때, 약 2주 후에 는 약 90% 정도가 신경세포로 분화하였으며, 이 중 뉴런이 약 70%, 성상교세포가 약 30%를 차지하였다. 약 2주 후 신경세포로의 분화 및 증식이 충분히 일어난 후부터는 상피세포 성장 인자만을 처리하여도 신경세포 형태를 그대로 유지한 채 연속적으로 증식하였다. 그러나, 간세포 성장 인자만을 처리한 경우에는 분화만 진행되어 계속 증식하지 못했다.On the other hand, mesenchymal cells or bone marrow-derived mononuclear cells including the same were treated with epithelial growth factor and hepatocyte growth factor after 24 hours turbid culture, and after about 2 weeks, about 90% of them differentiated into neurons. About 70% of neurons and about 30% of astrocytes. After about two weeks, after the differentiation and proliferation of the neurons was sufficient, the epithelial growth factor was treated, and the cells proliferated continuously while maintaining the neuronal morphology. However, when only hepatocyte growth factor was treated, only differentiation proceeded and continued to proliferate.

이상과 같이 상피세포 성장 인자, 간세포 성장 인자를 이용하여 골수 내 단핵세포로부터 분화되는 신경세포가 간엽 간세포로부터 분화되는 것인지 확인하기 위하여 상기 단핵세포들 중 간엽 간세포만을 분리하였다. 골수 유래 단핵세포들 중에는 조혈 간세포와 간엽 간세포의 두 가지 종류의 간세포가 존재하는데, 조혈 간세포는 일반적인 배양 조건하에서 쉽게 혈구 세포들로 분화되어 버리므로 약 1 내지 2주간 배양한 후 계속적인 증식이 가능한 것으로 나타나는 간세포는 간엽 간세포이다. 이와 같은 방법으로 20회 이상 계대 배양할 수 있는 간엽 간세포만을 분리한 뒤, 다양한 결합 조직 세포로의 분화능을 가진 간엽 간세포임을 확인하기 위하여 다양한 결합 조직으로의 분화 실험을 수행하였다. 그 결과, 골아세포, 연골아세포, 지방세포로의 분화능을 가진 간엽 간세포임을 확인하였다. As described above, only epithelial growth factor and hepatocyte growth factor were used to separate mesenchymal stem cells from the mononuclear cells in order to determine whether the neurons differentiated from the monocytes in the bone marrow are differentiated from the mesenchymal stem cells. Among the bone marrow-derived mononuclear cells, there are two types of hepatocytes, hematopoietic stem cells and mesenchymal stem cells. Since hematopoietic stem cells easily differentiate into blood cells under normal culture conditions, they can be cultured continuously for about 1 to 2 weeks. Hepatocytes that appear to be mesenchymal stem cells. After separating only mesenchymal stem cells that can be passaged more than 20 times in this manner, differentiation experiments were performed on various connective tissues to identify mesenchymal stem cells with differentiation ability to various connective tissue cells. As a result, it was confirmed that the mesenchymal stem cells have differentiation ability into osteoblasts, chondrocytes, and adipocytes.

또한 본 발명에서는 상기 분리된 간엽 간세포에 대해 골수 유래 단핵세포의 경우와 마찬가지로 신경세포로의 분화 및 증식 실험, 광학현미경 관찰, 면역세포화학 염색 등을 통해, 상피세포 성장 인자, 간세포 성장 인자에 의해 간엽 간세포가 효과적으로 뉴런과 성상교세포로 분화되고 계속적으로 증식함을 확인하였다.
In the present invention, the isolated mesenchymal stem cells, as in the case of the bone marrow-derived mononuclear cells, through the differentiation and proliferation experiments into neurons, optical microscopy, immunocytochemical staining, etc., by epidermal growth factor and hepatocyte growth factor Mesenchymal stem cells were effectively differentiated into neurons and astrocytes and continued to proliferate.

이하, 본 발명을 하기 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명하기로 하나, 이는 본 발명의 이해를 돕기 위하여 제시된 것일 뿐, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.
Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to the following examples, which are only presented to aid the understanding of the present invention, but the present invention is not limited thereto.

<실시예 1> 골수 내 단핵세포(mononuclear cells)의 분리Example 1 Isolation of Mononuclear Cells in Bone Marrow

병력이 없는 정상 지원자들을 대상으로 골반(pelvis)으로부터 골수 약 10ml 정도를 채취하여 헤파린이 함유된 유리관으로 옮겨 저장하였다. 10ml의 골수에 30ml의 인산 완충 식염수(phosphate buffered saline; PBS)를 첨가하고, 혼합용액 20ml를 10ml의 Ficoll-Paque^TM plus(1.077g/ml, Amersham Pharmacia Biotech) 용액 위로 천천히 흘려보낸 후 2,000rpm으로 20분간 밀도 구배 원심분리(density gradient centrifugation) 하였다. 다음 맨 위층과 Ficoll-Paque^TM plus 계면에 있는 단핵세포 층을 회수하고 다시 1,800rpm으로 5분간 원심분리를 하여 단핵세포만을 회수하였다.
About 10 ml of bone marrow was collected from the pelvis and transferred to a glass tube containing heparin. 30 ml of phosphate buffered saline (PBS) was added to 10 ml of bone marrow, and 20 ml of the mixed solution was slowly flowed over 10 ml of Ficoll-Paque ^TM plus (1.077 g / ml, Amersham Pharmacia Biotech) solution at 2,000 rpm. Density gradient centrifugation was performed for 20 minutes. Next, the monocyte layer at the top layer and the Ficoll-Paque ^TM plus interface was recovered and centrifuged at 1,800 rpm for 5 minutes to recover only monocytes.

<실시예 2> 단핵세포 배양Example 2 Mononuclear Cell Culture

상기 실시예 1에서 얻어진 단핵세포를 1×10⁶cells/cm²로 배양 플라스크에 접종하고, 4시간 후 새로운 기초 배지로 세척하여 비부착 세포를 제거하였다. 상기에서 기초 배지로는 3.5μM의 하이드로코르티손(hydrocortisone, Sigma), 지방산이 제거된 우 혈청 알부민(fatty acid free bovine serum albumin, Gibco BRL)과 동일 몰 비로 혼합된 50ng/ml의 리놀렌산(linoleic acid, Sigma Co.), CuSO₄·5H₂O(0.1μM, Sigma), ZnSO₄·7H₂O(50pM, Sigma), H₂SeO ₃(3ng/ml, Sigma), NaHCO₃(1.05mg/ml, Sigma Co.), HEPES(1.19mg/ml, Sigma), 페니실린(100U/ml, Gibco BRL), 스트렙토마이신(10mg/ml, Gibco BRL), 암포테리신(25μg/ml, Gibco BRL)을 포함하는 윌리암 E 배지(Williams' E medium, Gibco BRL)를 사용하였다.
Mononuclear cells obtained in Example 1 were inoculated into a culture flask at 1 × 10 ⁶ cells / cm ² , and after 4 hours, washed with fresh basal medium to remove nonadherent cells. In the basal medium, 3.5 μM of hydrocortisone (Sigma), fatty acid-free bovine serum albumin (fatty acid free bovine serum albumin, Gibco BRL) mixed with the same molar ratio of 50ng / ml linoleic acid (linoleic acid, Sigma Co.), CuSO ₄ · 5H ₂ O (0.1 μM, Sigma), ZnSO ₄ · 7H ₂ O (50 pM, Sigma), H ₂ SeO ₃ (3 ng / ml, Sigma), NaHCO ₃ (1.05 mg / ml, Sigma Co.), HEPES (1.19 mg / ml, Sigma), penicillin (100 U / ml, Gibco BRL), streptomycin (10 mg / ml, Gibco BRL), amphotericin (25 μg / ml, Gibco BRL) Williams E medium (Gibco BRL) was used.

<실시예 3> 단핵세포의 혼탁배양 없이 신경세포로의 분화Example 3 Differentiation of Neurons into Neurons Without Turbidity

기초 배지에 실시예 2의 단핵세포를 혼탁 배양 없이 상피세포 성장 인자(Gibco BRL) 10ng/ml과 간세포 성장 인자(hepatocyte growth factor, R&D Systems) 20ng/ml을 첨가한 분화 배지를 이용하여 신경세포로 분화되는지 확인하였다. 이 때 분화 배지는 일주일에 두 번씩 교체하며 배양하였다.In the basal medium, the mononuclear cells of Example 2 were added to neurons using differentiation medium containing 10ng / ml of epithelial growth factor (Gibco BRL) and 20ng / ml of hepatocyte growth factor (R & D Systems) without turbid culture. Check for differentiation. At this time, the differentiation medium was cultured twice a week.

상기 분화 배지를 이용하여 단핵세포를 배양하면 약 1주 후 형태상 변화는 없었고, 4주 후 신경세포 집단(neural cell colonies)이 나타나기 시작하여 계속 증식해 나갔다. 그리고 분화 배지에서 배양한지 약 8주 후에는, 축색(axon)과 같은 긴 돌기와 신경돌기(dendrite)와 같은 짧은 돌기들로 구성된 신경세포(neuron)와 짧은 신경돌기들로만 구성된 성상교세포(astrocyte)의 형태를 지닌 세포들만이 관찰되었다. 또한, 8주 후부터는 상피세포 성장 인자로만 처리하여도 형태는 그대로 유지한 채 증식함을 확인하였다.When mononuclear cells were cultured using the differentiation medium, there was no morphological change after about 1 week, and after 4 weeks, neural cell colonies began to appear and continued to grow. After about 8 weeks of incubation in differentiation medium, neurons composed of long and short neurites, such as axons and dendrites, were formed of astrocytes. Only cells with were observed. In addition, it was confirmed that after 8 weeks, even if treated only with epidermal growth factor, it proliferated while maintaining its form.

그러나, 상기와 같이 EGF, HGF를 병용처리한 경우와는 달리, EGF만 처리한 경우에는 신경세포로 분화하지 못하였고, HGF만 처리한 경우에는 세포가 일찍 분화되어 성장 증식하지 못했다.However, unlike the combination treatment of EGF and HGF as described above, EGF-only treatment did not differentiate into neurons, and only HGF treatment resulted in early differentiation and growth and proliferation.

하기 표 1에 골수 유래 단핵세포를 혼탁 배양 없이 EGF, HGF로 4주 처리한 후 증식한 세포 수를 나타내었으며, 표 2에 4주 동안 EGF, HGF로 전처리된 세포를 다시 각 성장인자로 4주 및 8주 처리 후 세포의 증식 거동(초기 접종 세포수는 1×10⁵)을 나타내었다.
Table 1 shows the number of cells proliferated after treatment with bone marrow-derived mononuclear cells with EGF and HGF for 4 weeks without turbid culture. Table 2 shows the cells pretreated with EGF and HGF for 4 weeks. And proliferation behavior of the cells after the 8-week treatment (initial inoculation cell number was 1 × 10 ⁵ ).

<실시예 4> 단핵세포의 혼탁배양 후 신경세포로의 분화Example 4 Differentiation into Neurons after Turbid Culture of Mononuclear Cells

기초 배지에 실시예 2의 단핵세포를 24시간 혼탁배양 후 상피세포 성장 인자(Gibco BRL) 10ng/ml과 간세포 성장 인자(hepatocyte growth factor, R&D Systems) 20ng/ml을 첨가한 분화 배지를 이용하여 신경세포로 분화되는지 확인하였다. 이 때 분화 배지는 일주일에 두 번씩 교체하며 배양하였다.After 24-hour turbid culture of mononuclear cells of Example 2 in basal medium, the cells were cultured using differentiation medium containing 10ng / ml of epithelial growth factor (Gibco BRL) and 20ng / ml of hepatocyte growth factor (R & D Systems). It was confirmed to differentiate into cells. At this time, the differentiation medium was cultured twice a week.

상기 분화 배지를 이용하여 단핵세포를 배양하면 약 1주 후 신경세포 집단(neural cell colonies)이 나타나기 시작하여 계속 증식해 나갔다(도 1). 그리고 분화 배지에서 배양한지 약 2주 후에는, 축색(axon)과 같은 긴 돌기와 신경돌기(dendrite)와 같은 짧은 돌기들로 구성된 신경세포(neuron)와 짧은 신경돌기들로만 구성된 성상교세포(astrocyte)의 형태를 지닌 세포들만이 관찰되었다(도 2 및 도 3). 또한, 2주 후부터는 상피세포 성장 인자로만 처리하여도 형태는 그대로 유지한 채 증식함을 확인하였다. When mononuclear cells were cultured using the differentiation medium, neuronal cell colonies began to appear after about 1 week and continued to proliferate (FIG. 1). And about 2 weeks after incubation in differentiation medium, forms of neurons consisting of long and short neurites and long neurites such as axons and dendrites. Only cells with were observed (FIGS. 2 and 3). In addition, it was confirmed that after 2 weeks, the cells proliferated while maintaining their morphology even when treated only with epidermal growth factor.

하기 표 1에 골수 유래 단핵세포를 24시간 혼탁배양후 EGF, HGF로 2주 처리한 후 증식한 세포 수를 나타내었으며, 표 2에 2주 동안 EGF, HGF로 전처리된 세포를 다시 각 성장인자로 4주 및 8주 처리 후 세포의 증식 거동(초기 접종 세포수는 1×10⁵)을 나타내었다.Table 1 shows the number of cells proliferated after treatment with bone marrow-derived mononuclear cells for 24 hours after 2-hour incubation with EGF and HGF, and in Table 2, the cells pre-treated with EGF and HGF for 2 weeks as the growth factors. Cell proliferation behavior (initial inoculated cell number was 1 × 10 ⁵ ) after 4 and 8 weeks of treatment.

전처리Pretreatment 기간term 초기 접종 단핵세포 수Initial inoculation monocyte count HGF만 처리HGF only treatment EGF만 처리EGF only processing EGF, HGF로 병용처리Combined treatment with EGF and HGF 무처리 (비 혼탁배양)No treatment (non turbid culture) 4주4 Weeks 7.5×10⁷ 7.5 × 10 ⁷ 증식 않함Do not multiply 1×10⁵ 1 × 10 ⁵ 2.0×10⁵ 2.0 × 10 ⁵ 혼탁배양Turbidity culture 2주2 weeks 7.5×10⁷ 7.5 × 10 ⁷ 증식 않함Do not multiply 1.2×10⁵ 1.2 × 10 ⁵ 1.8×10⁵ 1.8 × 10 ⁵

전처리Pretreatment 기간term HGF만 처리HGF only treatment EGF만 처리EGF only processing EGF, HGF로 병용처리Combined treatment with EGF and HGF 무처리 (비 혼탁배양)No treatment (non turbid culture) 4주 후4 weeks later 증식 않함Do not multiply 2×10⁵ 2 × 10 ⁵ 2×10⁵ 2 × 10 ⁵ 8주 후8 weeks later 증식 않함Do not multiply 5×10⁵ 5 × 10 ⁵ 1×10⁵ 1 × 10 ⁵ 혼탁배양Turbidity culture 4주 후4 weeks later 증식 않함Do not multiply 2×10⁵ 2 × 10 ⁵ 1.7×10⁵ 1.7 × 10 ⁵ 8주 후8 weeks later 증식 않함Do not multiply 5×10⁵ 5 × 10 ⁵ 1.3×10⁵ 1.3 × 10 ⁵

<실시예 5> 세포면역화학 염색(immunocytochemistry) IExample 5 Immunocytochemistry I

상기 실시예 3과 4에서 분화된 세포를 1cm²의 커버 글라스 위에 1×10⁴cells/cm²로 부착시켰다. 다음 0.1M 인산완충액(phosphate buffer)으로 5분간 세척한 후 4% 파라포름알데히드를 포함하는 0.1M 인산완충액으로 15분간 고정시키고, 0.1M 인산완충식염수(phosphate buffered saline; PBS)로 5분간 두 번 세척하였다. 이후 1% BSA와 0.2% Triton X-100이 들어있는 0.1M PBS로 5분간 처리한 후 일차 항체를 첨가하여 16시간 동안 반응시켰다. 상기 일차항체로는 항-인간 NSE(neuron-specific enolase; Chemicon Inc.), 항-인간 NeuN(Chemicon Inc.), 항-인간 β-튜불린 Ⅲ(Sigma Co.), 항-인간 GFAP(glial fibrillary acidic protein; Sigma Co.) 및 항-인간 MAP-2(microtubule-associated protein-2) 항체를 사용하였다. 일차 항체와의 반응이 종료된 후 반응에 참여하지 않은 일차 항체를 제거하고 0.5% BSA가 포함된 0.1M PBS로 15분간 두 번 세척하였다. 이차 항체를 넣고 30분간 배양한 다음 0.5% BSA가 포함된 0.1M PBS로 5분간 두 번 세척하였다. 이후 아비딘-바이오틴(avidin-biotin)이 들어있는 키트(Vectastain Elite ABC kit; Vector Laboratory Inc.)를 이용하여 30분간 반응을 수행하였다. 0.1M 인산완충액으로 5분간 두 번 세척한 다음 발색 기질로서 DAB(3,3'-diaminobenzidine tetrahydrochloride dehydrate, Sigma Co.)을 넣어 5분간 반응시켰다. 0.1M 인산완충액으로 5분간 처리하여 반응을 중지시키고 상기 완충액으로 5분간 두 번 세척하였다. 반응물을 건조시킨 후 증류수로 5분간 세척하였다. 이후 증류수, 70, 80, 95 및 100% 에탄올을 이용하여 차례로 탈수시키고, 고정하였다.The cells differentiated in Examples 3 and 4 were attached at 1 × 10 ⁴ cells / cm ² onto a 1 cm ² cover glass. After washing for 5 minutes with 0.1M phosphate buffer, it was fixed for 15 minutes with 0.1M phosphate buffer containing 4% paraformaldehyde, twice for 5 minutes with 0.1M phosphate buffered saline (PBS). Washed. After treatment for 5 minutes with 0.1M PBS containing 1% BSA and 0.2% Triton X-100, the reaction was added for 16 hours by adding a primary antibody. The primary antibodies include anti-human NSE (neuron-specific enolase; Chemicon Inc.), anti-human NeuN (Chemicon Inc.), anti-human β-tubulin III (Sigma Co.), anti-human GFAP (glial) fibrillary acidic protein (Sigma Co.) and anti-human microtubule-associated protein-2 (MAP-2) antibodies were used. After the reaction with the primary antibody was terminated, the primary antibody that did not participate in the reaction was removed and washed twice with 0.1M PBS containing 0.5% BSA for 15 minutes. Secondary antibody was added and incubated for 30 minutes, and then washed twice with 0.1M PBS containing 0.5% BSA for 5 minutes. Then, the reaction was performed for 30 minutes using a kit containing avidin-biotin (Vectastain Elite ABC kit; Vector Laboratory Inc.). After washing twice with 0.1 M phosphate buffer solution for 5 minutes, DAB (3,3'-diaminobenzidine tetrahydrochloride dehydrate, Sigma Co.) was added as a coloring substrate and reacted for 5 minutes. The reaction was stopped by treatment with 0.1 M phosphate buffer for 5 minutes and washed twice with the buffer for 5 minutes. The reaction was dried and washed with distilled water for 5 minutes. Then dehydrated with distilled water, 70, 80, 95 and 100% ethanol in turn and fixed.

세포면역화학 염색 결과, 도 4에서 보는 바와 같이, 골수 단핵세포로부터 EGF, HGF를 이용하여 분화시킨 세포들은 신경세포 표지인 NeuN, NSE, MAP-2 및 β-튜불린 Ⅲ와 성상교세포 표지인 GFAP에 대해 양성으로 염색되는 것으로 보아 형태 학적 특징뿐만 아니라 생화학적으로도 신경세포와 성상교세포의 두 가지 세포로 모두 분화되었음을 확인할 수 있었다. 그러나 미세신경교세포 표지(microglia marker)인 OX-42에는 음성적으로 염색되어 미세신경교세포로는 분화하지 않았음을 알 수 있었다.As shown in FIG. 4, the cells differentiated with EGF and HGF from bone marrow mononuclear cells were shown to be neuronal markers NeuN, NSE, MAP-2 and β-tubulin III and astrocyte marker GFAP. Staining positive for, it was confirmed that not only morphological characteristics but also biochemically differentiated into both cells of neurons and astrocytes. However, it was found that OX-42, a microglia marker, was negatively stained and did not differentiate into microglia.

상기 골수 내 단핵세포들을 EGF 단독, EGF와 HGF 처리, 혹은 24시간 혼탁 배양후 EGF, HGF로 병용처리하여 2주간 배양한 후 NSE, NeuN, MAP-2에 양성적으로 염색되는 세포인 신경세포(neuron)와 GFAP에 양성으로 염색되는 성상교세포의 비율을 조사하여 하기 표 3에 나타내었다.The mononuclear cells in the bone marrow were treated with EGF alone, EGF and HGF, or co-treated with EGF and HGF for 24 hours and then cultured for 2 weeks and then neurons (positive staining of NSE, NeuN, MAP-2). neuron) and the ratio of astrocytes stained positively in GFAP is shown in Table 3 below.

기간term NSENSE NeuNNeun GFAPGFAP Map 2Map 2 음성 세포Voice cell EGF 단독 처리EGF only treatment 4주4 Weeks 0.9%0.9% 0.8%0.8% 1.2%1.2% .. 89%89% EGF + HGF 처리EGF + HGF Treatment 2주2 weeks 10%10% 25%25% 4%4% .. 70%70% EGF + HGF 처리EGF + HGF Treatment 4주4 Weeks 56%56% 75%75% 24%24% .. 20%20% 24시간 혼탁 배양후 EGF + HGF 처리EGF + HGF treatment after 24 hours turbid culture 2주2 weeks 62%62% 88%88% 31%31% 11%11% 10%10%

상기 표 3의 결과로부터 알 수 있듯이, EGF, HGF를 약 2주간 처리한 경우 전체 세포의 90%가 신경세포로 분화하였으며, 분화된 신경세포 중 약 70%는 뉴런, 약 30%는 성상교세포인 것으로 나타났다.
As can be seen from the results of Table 3, when EGF and HGF were treated for about two weeks, 90% of all cells differentiated into neurons, and about 70% of differentiated neurons were neurons and about 30% were astrocytes. Appeared.

<실시예 6> 골수 간엽 간세포(mesenchymal stem cell)의 분리 및 배양Example 6 Isolation and Culture of Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells

골수 유래의 단핵세포 중 신경세포로 분화한 것이 간엽 간세포인지 확인하기 위하여, 단핵세포를 배양하여 간엽 간세포만을 분리하여 각종 세포로의 분화능을 조사하였다.In order to determine whether the mesenchymal stem cells differentiated from the bone marrow-derived mononuclear cells, the mononuclear cells were cultured, and only the mesenchymal stem cells were isolated and examined for differentiation into various cells.

10% FBS(fetal bovine serum)가 첨가된, 낮은 포도당 농도의 DMEM(Gibco BRL) 배지를 배양배지로 하여 상기 실시예 2의 단핵세포를 1×10⁶cells/cm²로 배양 플라스크에 접종하였다. 상기 플라스크를 CO₂ 존재 하에 37℃에서 배양하였으며, 배양 후 약 1∼2주가 지나면 계대배양이 가능할 정도로 세포가 증식하였는데, 20회 이상 계대배양 하여도 계속 증식되었다.The mononuclear cells of Example 2 were inoculated into the culture flask at 1 × 10 ⁶ cells / cm ² using a low glucose DMEM (Gibco BRL) medium to which 10% FBS (fetal bovine serum) was added as a culture medium. The flask was incubated at 37 ° C. in the presence of CO ₂ , and the cells proliferated to allow passage in about 1 to 2 weeks after the culture, but continued to grow even after passage at least 20 times.

골수에서 얻어지는 단핵세포군에는 성숙된 백혈구, 림프구, 조골세포, 연골세포, 근육세포, 섬유아세포, 지방세포는 물론 이들 세포로 분화될 수 있는 간(幹)세포가 존재하는데, 조혈 간세포와 간엽 간세포가 그들이다. 적혈구, 백혈구, 림프구와 같은 혈구세포들을 만드는 조혈 간세포는 일반적인 배양 배지에서는 계속하여 증식하지 못하고 모두 성숙된 세포로 분화되어 버리므로, 상기에서 계속하여 증식 배양되는 세포는 간엽 간세포임을 알 수 있다.Mononuclear cell populations obtained from the bone marrow include mature white blood cells, lymphocytes, osteoblasts, chondrocytes, muscle cells, fibroblasts, adipocytes, as well as liver cells that can differentiate into these cells, including hematopoietic stem cells and mesenchymal stem cells. They are. Hematopoietic stem cells that produce blood cells such as red blood cells, white blood cells, and lymphocytes do not continue to proliferate in a general culture medium, and all are differentiated into mature cells, and thus the cells proliferated and cultured continuously are mesenchymal stem cells.

이를 보다 확실하게 확인하기 위하여, 상기에서 얻어진 세포에 각종 사이토카인 및 시약들을 처리하여 간엽 간세포의 특성, 즉 골아세포(osteoblasts), 연골아세포(chondroblasts) 및 지방세포(fat cells)와 같은 각종 결합조직 세포로의 분화 가능성을 갖고 있는지를 확인하였다.In order to confirm this more clearly, various cytokines and reagents are treated on the cells obtained above, and characteristics of mesenchymal stem cells, that is, various connective tissues such as osteoblasts, chondrocytes, and fat cells. It was confirmed whether there was a possibility of differentiation into cells.

먼저, 골아세포로 분화시키기 위해 100mM 덱사메타손(dexamethasone), 10mM β-글리세롤 인산염(β-glycerol phosphate) 및 50nM 아스코르브산-2-인산염(ascorbate-2-phosphate)과 10% 우태아혈청으로 처리하였다. 또한, 연골아세포로의 분화 가능성을 조사하기 위하여, 배양된 세포를 1500rpm, 10분간 원심분리하여 펠렛 형태를 만든 다음, 무혈청 상태 하에서 100nM 덱사메타손과 10ng/ml TGF-β3를 처리하였다. 한편, 지방세포로의 분화는 0.5mM 1-메틸-3-이소부틸잔틴(1-methyl- 3-isobutylxanthine), 1mM 덱사메타손, 10g/ml 인슐린 및 10nM 인도메타신(indomethacine)을 각각 처리하였다(이상 Pittenger et al., Science 284:143-147, 1999).First, in order to differentiate into osteoblasts, 100 mM dexamethasone, 10 mM β-glycerol phosphate and 50 nM ascorbic acid 2-phosphate and 10% fetal bovine serum were treated. In addition, to investigate the possibility of differentiation into chondrocytes, the cultured cells were centrifuged at 1500 rpm for 10 minutes to form pellets, and then treated with 100 nM dexamethasone and 10 ng / ml TGF-β3 under serum-free conditions. On the other hand, differentiation into adipocytes was treated with 0.5 mM 1-methyl-3-isobutylxanthine, 1 mM dexamethasone, 10 g / ml insulin and 10 nM indomethacin (above Pittenger). et al., Science 284: 143-147, 1999).

각각의 세포로 분화되었는지 여부는, 골아세포의 경우 알칼라인 포스파타제 염색법(alkaline phosphatase staning; Jaiswal et al., J. Cell Biochem. 64(2)143-147,1999)으로, 연골아세포의 경우 콜라겐 타입 Ⅱ 염색반응(type Ⅱ collagen staining RT-PCR; Mackay et al., Tissue Eng. 4(4):415-428, 1998)으로 확인하였으며 톨루이딘 블루(Toluidine blue)로 염색하였고, 지방세포의 경우 오일 레드 O 염색법(oil red O staining)으로 확인하였다.Differentiation into individual cells was performed by alkaline phosphatase staning for osteoblasts (Jaiswal et al., J. Cell Biochem . 64 (2) 143-147,1999) and collagen type II for chondrocytes. Staining reaction (type II collagen staining RT-PCR; Mackay et al., Tissue Eng. 4 (4): 415-428, 1998), stained with toluidine blue, and oil red O for adipocytes. It was confirmed by staining (oil red O staining).

그 결과, 도 5a, 5b 및 5c에 나타난 바와 같이 모두 양성으로 나타나, 생체 외에서 배양 증식된 간엽 간세포가 여전히 골아세포, 연골아세포 및 지방세포와 같은 다양한 결합조직으로 분화될 수 있는 간세포의 특성을 가지고 있음을 확인할 수 있었다.
As a result, as shown in Figs. 5A, 5B and 5C, all of the mesenchymal stem cells that appeared positive in culture in vitro and still have the characteristics of hepatocytes that can be differentiated into various connective tissues such as osteoblasts, chondrocytes and adipocytes. It could be confirmed.

<실시예 7> 골수 유래 간엽 간세포의 혼탁배양 없이 신경세포로의 분화Example 7 Differentiation of Bone Marrow-derived Mesenchymal Hepatocytes into Neurons without Turbid Culture

상기 실시예 6에서 분리된 간엽 간세포가 신경세포로 분화될 수 있는지를 확인하기 위해, 10% FBS(fetal bovine serum)을 포함하는 낮은 포도당 농도의 DMEM으 로 생체 외에서(ex vivo) 배양·증식된 골수 간엽 간세포를 실시예 3과 동일한 방법으로 혼탁배양 없이 EGF(Gibco BRL) 10ng/ml, HGF(R&D Systems) 20ng/ml을 첨가한 분화 배지에서 8주 동안 배양하였다.In order to confirm whether the mesenchymal stem cells isolated in Example 6 can be differentiated into neurons, the cells were cultured and expanded ex vivo with a low glucose concentration of DMEM containing 10% FBS (fetal bovine serum). Bone marrow mesenchymal stem cells were cultured for 8 weeks in a differentiation medium to which 10ng / ml of EGF (Gibco BRL) and 20ng / ml of HGF (R & D Systems) were added without turbid culture in the same manner as in Example 3.

그 결과, 골수 단핵세포로부터 분화된 신경세포의 경우와 마찬가지로 약 1주 후 형태상 변화는 없었고, 4주 후 신경세포 집단(neural cell colonies)이 나타나기 시작하여 계속 증식해 나갔다. 계속하여 5주까지 지속적으로 성장, 증식하였다. 8주 후에는 EGF만을 처리하여도 신경세포로서의 형태를 그대로 유지한 채 계속적으로 증식하였다.
As a result, as in the case of neurons differentiated from bone marrow mononuclear cells, there was no morphological change after about 1 week, and after 4 weeks, neural cell colonies began to appear and continued to proliferate. It continued to grow and proliferate for up to 5 weeks. Eight weeks later, EGF-only treatment continued to proliferate while maintaining its morphology as a neuron.

<실시예 8> 골수 유래 간엽 간세포의 혼탁배양 후 신경세포로의 분화Example 8 Differentiation of Bone Marrow-derived Mesenchymal Hepatocytes into Neurons after Turbid Culture

상기 실시예 6에서 분리된 간엽 간세포가 실시예 4와 같이 혼탁배양 후 신경세포로 빠르게 분화될 수 있는지를 확인하기 위해, 10% FBS(fetal bovine serum)을 포함하는 낮은 포도당 농도의 DMEM으로 생체 외에서(ex vivo) 배양·증식된 골수 간엽 간세포를 실시예 4와 동일한 방법으로 1일간 혼탁배양 후 EGF(Gibco BRL) 10ng/ml, HGF(R&D Systems) 20ng/ml을 첨가한 분화 배지에서 2주 동안 배양하였다.In order to determine whether the mesenchymal stem cells isolated in Example 6 can rapidly differentiate into neurons after turbid culture as in Example 4, in vitro with low glucose concentration of DMEM containing 10% FBS (fetal bovine serum) (Ex vivo) cultured and propagated bone marrow mesenchymal stem cells in the same manner as in Example 4, and then cultured for 1 week in a differentiation medium to which 10ng / ml of EGF (Gibco BRL) and 20ng / ml of HGF (R & D Systems) were added. Incubated.

그 결과, 골수 단핵세포로부터 분화된 신경세포의 경우와 마찬가지로 약 1주 후부터 신경세포 집단이 형성되었고, 계속하여 2주까지 지속적으로 성장, 증식하였다(도 6 및 도 7). 2주 후에는 EGF만을 처리하여도 신경세포로서의 형태를 그대로 유지한 채 계속적으로 증식하였다.
As a result, as in the case of neurons differentiated from bone marrow mononuclear cells, neuronal cell populations were formed after about 1 week, and continued to grow and proliferate for 2 weeks (FIGS. 6 and 7). Two weeks later, EGF-only treatment continued to proliferate while maintaining its morphology as a neuron.

<실시예 9> 세포면역화학 염색(immunocytochemistry) Example 9 Immunocytochemistry

실험예 7과 8의 분화된 세포들에 대해 실시예 5와 동일한 방법으로 면역세포화학 염색법을 수행한 결과, 골수 내 단핵세포에서 유래한 신경세포 검사 결과와 유사하게 면역세포화학적으로 신경세포 표지인 NeuN, NSE, MAP-2, β-튜불린 Ⅲ와 성상교세포 표지인 GFAP에 양성 염색되는 것으로 나타났다(도 8a, 8b, 8c,8d). 따라서, 간엽 간세포는 신경세포(neuron)와 성상교세포(astrocyte)의 두 가지 세포로 모두 분화된 것으로 확인되었고, 전처리로 혼탁배양을 하였을 때 전처리없이 분화시킨 것보다 2배 빠르고 분화율 또한 80%에서 90%로 향상됨을 볼수 있었다.
Immunohistochemical staining was performed on the differentiated cells of Experimental Examples 7 and 8 in the same manner as in Example 5, and the immunocytochemical markers were similar to those of the neuronal tests derived from the mononuclear cells in the bone marrow. It was shown to be positively stained for NeuN, NSE, MAP-2, β-tubulin III and GFAP, an astrocyte marker (Figs. 8A, 8B, 8C, 8D). Therefore, mesenchymal stem cells were identified as differentiated into both cells, neurons and astrocytes, and two times faster than the differentiation without pretreatment when the culture was turbid by pretreatment. It can be seen that it improved to 90%.

<실시예 10><Example 10>

상기 실시예 8의 간엽 간세포로부터 분화된 신경세포가 인체에서 발견할 수 있는 신경세포와 기능적으로 동일한 일을 할 수 있는지를 확인하고자 동물의 질환에 분화된 신경세포를 이식하여 손상 받은 부위에 잘 도달하여 정착하는가에 대한 실험을 실시하였다. In order to check whether the neurons differentiated from the mesenchymal stem cells of Example 8 can perform functionally the same as those found in the human body, transplanted neurons differentiated to animal diseases to reach the damaged sites well. Experiment was conducted to determine whether to settle.

이를 위해 인간에 가장 흔한 신경계질환인 허혈성 뇌질환을 조성하기 위하여 실험쥐의 뇌를 절개하여 middle cerebral artery를 1시간 동안 묶은 후 다시 풀어 대뇌 피질에 국소적 허혈성 질환을 만든 후 정맥을 통하여 상기 실시예 8에서 얻은 신경세포 3×10⁵개를 주사하였다. 상기 주입세포들은 주변 세포들과 구분 가능하도록 LacZ 염색을 실시하였다. To this end, in order to form ischemic brain disease, which is the most common neurological disease in humans, the brain of the mouse is incised, the middle cerebral artery is tied for 1 hour, and then loosened again to make a local ischemic disease in the cerebral cortex, and then through the vein. 3 x 10 ⁵ neurons obtained at 8 were injected. The injected cells were subjected to LacZ staining to distinguish them from surrounding cells.

정맥 주사 1주후에 쥐의 뇌를 절개하여 이를 현미경으로 관찰하고 이를 도 9에 나타내었으며, 도 9a는 국소적 허혈성 질환을 유도하기 전의 뇌의 상태를 나타낸 사진이고, 도 9b는 국소적 허혈성 질환을 유도한 후 분화시킨 신경세포를 정맥주사한 다음 2주 후 뇌의 상태를 나타낸 사진이고, 도 9c는 도 9b의 국소적 허열부위의 확대사진이다. One week after intravenous injection, the brain of the rat was dissected and observed under a microscope and shown in FIG. 9. FIG. 9A is a photograph showing the state of the brain before inducing local ischemic disease, and FIG. 9B is a diagram showing focal ischemic disease. Two weeks after intravenous injection of differentiated neurons after induction, it is a photograph showing the state of the brain, and FIG. 9C is an enlarged photograph of the local hypotension region of FIG. 9B.

상기 도 9a와 도 9b에서 보는 바와 같이 허혈성 질환을 갖지 않는 정상의 뇌와 허혈성 질환을 갖는 뇌의 차이를 명백히 확인할 수 있다. 특히 도 9b와 도 9c에서 연하게 염색된 부위에 LacZ 염색에 의하여 짙은 색으로 염색이 되는 세포들의 침착을 발견할 수 있는데 이는 인간의 간엽 줄기세포 기원의 신경세포가 손상 받은 부위에만 선택적으로 도달한 것을 보여 주며, 결국 이것은 정상적으로 신경 세포 분화를 시작하여 자신이 잘 존재 할 수 있는 부위를 찾아간 것으로 볼 수 있다. 따라서 본 발명에 의해 제조된 간엽유래 신경세포는 손상받은 신경계의 치료에 유용하게 적용될 수 있음을 알 수 있다.
As shown in FIG. 9A and FIG. 9B, the difference between a normal brain having no ischemic disease and a brain having an ischemic disease can be clearly identified. In particular, in FIG. 9B and FIG. 9C, the deposition of cells stained with dark color by LacZ staining can be found on the lightly stained area, which selectively reaches only the damaged area of neurons derived from human mesenchymal stem cells. Eventually, it can be seen that it started neuronal differentiation normally and found a place where it could exist well. Therefore, it can be seen that mesenchymal-derived neurons prepared by the present invention can be usefully applied to the treatment of the damaged nervous system.

상기에서 설명한 바와 같이 본 발명은 기존의 방법에 비하여 골수 유래 간엽 간세포 또는 이를 포함하는 단핵세포들을 뉴런 및 성상교세포로 구성되는 신경세포를 시간면, 효율면, 성숙도에서 더욱 효과적으로 분화 및 증식시킬 수 있으므로, 신경 질환의 치료를 위한 세포 치료용 조성물을 제조하기 위한 신경세포를 대량으로 제공할 수 있다. 또한, 세포 내에 존재하는 자연 물질을 이용하여 증식 분화시 키므로 안전성 면에서 효과적이고, 실제 임상 적용시에 문제점이 적다. 또한, 환자 자신의 골수로부터 치료에 필요한 신경세포를 충분히 얻을 수 있어 면역 거부 반응 등의 부작용이 적고, 신경세포를 원활하게 공급할 수 있는 장점이 있다.As described above, the present invention can more effectively differentiate and proliferate bone marrow-derived mesenchymal stem cells or mononuclear cells comprising the same, in the time, efficiency, and maturity of neurons composed of neurons and astrocytes. It can provide a large amount of nerve cells for producing a composition for treating cells for the treatment of neurological diseases. In addition, the proliferation and differentiation using natural substances present in the cell is effective in terms of safety, and there are few problems in actual clinical application. In addition, the patient's own bone marrow can sufficiently obtain the neurons necessary for treatment, there is less side effects such as immune rejection reaction, there is an advantage that can supply the neurons smoothly.

Claims

Pretreatment step of turbid culture of mesenchymal stem cells; And culturing the turbidly cultured mesenchymal stem cells in a medium containing epidermal growth factor and hepatocyte growth factor. Pharmaceutical composition for treating ischemic brain disease (stroke) containing neurons prepared by the active ingredient.