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KR100832867B1 - 사스 코로나바이러스 뉴클레오캡시드 단백질에 대한 단클론항체 및 이것의 용도 - Google Patents

사스 코로나바이러스 뉴클레오캡시드 단백질에 대한 단클론항체 및 이것의 용도 Download PDF

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KR100832867B1
KR100832867B1 KR1020060035230A KR20060035230A KR100832867B1 KR 100832867 B1 KR100832867 B1 KR 100832867B1 KR 1020060035230 A KR1020060035230 A KR 1020060035230A KR 20060035230 A KR20060035230 A KR 20060035230A KR 100832867 B1 KR100832867 B1 KR 100832867B1
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sars coronavirus
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sars
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조해월
정윤석
신구철
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대한민국
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Abstract

본 발명은 사스 코로나바이러스 진단용 단클론 항체에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 재조합 사스 코로나바이러스 뉴클레오캡시드 항원을 면역원으로 이용하여 마우스에 면역하고, 세포융합에 의해 하이브리도마 클론을 제조하였다. 본 발명에 따른 하이브리도마 클론에서 생산되는 단클론 항체는 감수성 및 특이성이 우수하여, 사스 코로나바이러스 감염의 진단 및 예방 등에 매우 유용하게 이용될 수 있다.
사스 코로나바이러스, 뉴클레오캡시드 항원, 하이브리도마 클론, 단클론 항체

Description

사스 코로나바이러스 뉴클레오캡시드 단백질에 대한 단클론 항체 및 이것의 용도 {Monoclonal antibody against nucleocapsid protein of SARS coronavirus and the use thereof}
도 1은 사스 코로나바이러스의 뉴클레오캡시드 단백질에 대한 단클론 항체를 생산하는 17개의 하이브리도마 세포 클론의 배양 사진이다.
도 2는 17개의 하이브리도마 세포 배양액에서 사스 코로나바이러스의 뉴클레오캡시드 단백질에 대한 단클론 항체의 생산유무를 간접 ELISA법으로 조사한 결과이다.
도 3은 17개의 하이브리도마 세포 배양액에서 사스 코로나바이러스의 뉴클레오캡시드 단백질에 대한 단클론 항체를 단백질 G 컬럼으로 정제한 양상을 관찰하기 위해 SDS-PAGE를 수행한 결과이다.
도 4는 샌드위치 ELISA법으로 사스 코로나바이러스의 뉴클레오캡시드 단백질에 대한 단클론 항체가 비변성 항원에 대한 반응성을 분석한 그래프이다.
도 5는 면역블롯으로 사스 코로나바이러스의 뉴클레오캡시드 단백질에 대한 단클론 항체가 변성 항원에 대한 반응성 및 선형 항원결정기를 분석한 결과이다.
도 6은 뉴클레오캡시드 단백질의 아미노산 서열에 근거한 펩타이드를 이용하여 경쟁 ELISA를 통해 얻은 단클론 항체의 항원결정기에 대한 모식도이다.
도 7은 간접면역형광항체법으로 사스 코로나바이러스의 뉴클레오캡시드 단백질에 대한 단클론 항체가 바이러스가 감염된 세포에서 항원의 검출능을 조사한 결과이다.
도 8은 간접면역형광항체법으로 사스 코로나바이러스의 뉴클레오캡시드 단백질에 대한 단클론 항체가 사람코로나바이러스에 대한 교차반응을 조사한 결과이다.
기술분야
본 발명은 사스 진단에 유용한 단클론 항체에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 사스 코로나바이러스 뉴클레오캡시드 (nucleocapsid) 항원으로 면역시킨 마우스 비장 (spleen) 세포와 골수종 세포가 융합된 하이브리도마 (hybridoma) 클론, 하이브리도마로부터 생산되는 단클론 항체 및 이들을 제조하는 방법에 관한 것이다. 또한 본 발명은 사스 코로나바이러스의 단클론항체를 이용한 진단시약 및 진단키트에 관한 것이다.
종래기술
사스 (중증급성호흡기증후군, Severe Acute Respiratory Syndrome, SARS)는 2002년 11월부터 중국 광동지역을 중심으로 발생하여 홍콩, 싱가포르, 캐나다 등 전 세계적으로 확산되었던 신종 전염병으로 발열과 기침, 호흡곤란, 폐렴 등의 증상을 보이는 증후군이다. 사스는 전염성과 치사율이 높은 질환으로서 WHO에 따르면 발병 이후 2003년 8월 7일까지 32개국에서 8,422명의 환자가 발생했고, 이중 916명이 사망한 것으로 보고 되었다. 따라서 사스는 감염의 조기 진단이 매우 중요하다. 그러나 사스는 다른 호흡기증상과 임상적으로 유사하여 이들을 구분하는 것은 용이하지 않다. 비록 현재까지 한국 내에서 사스 발병사례가 없고, 전 세계적으로 이 질병의 전파가 통제되고 있지만 재발의 위험과 국내유입 가능성을 간과할 수는 없다. 따라서 사스의 국내유입 여부를 신속히 판정하고, 질병의 빠른 확산을 막기 위해 감염여부를 초기에 진단할 수 있는 효과적이고 신속한 진단법의 개발이 절실히 요구된다. 특히 기타 호흡기바이러스 및 사람 코로나바이러스와의 감별진단이 가능한 방법의 개발이 매우 시급한 실정이다.
사스 병원체는 사스 코로나바이러스임이 밝혀졌고, 바이러스 전체 게놈의 염기 서열 분석이 이루어졌다. 사스 코로나바이러스는 외피를 지닌 양성가닥 (positive stranded) RNA 바이러스로서 전체 게놈이 29,727 뉴클레오타이드로 구성되며, 현재까지 알려진 RNA 바이러스 중에서 가장 큰 게놈을 갖는 바이러스이다. 사스 코로나바이러스의 게놈은 11개의 오픈리딩프레임 (open reading frame, ORF)을 갖고 있으며 23종에 달하는 단백질을 코딩하고 있는 것으로 알려졌다. 사스 코로나바이러스의 주요 구조단백질은 뉴클레오캡시드 (nucleocapsid, N), 스파이크 (spike, S), 멤브레인 (membrane, M), 스몰 엔벨로프 (small envelope, E) 단백질임이 밝혀졌다. 이들 단백질에 대한 염기서열 분석결과, 사스 코로나바이러스가 다른 코로나바이러스와 비교하여 약 40 ~ 50% 정도의 매우 낮은 서열 상동성을 가짐이 밝혀졌다. 코로나바이러스의 항원성에 따른 계통발생학적 분류에 따르면, 사스 코로나바이러스는 I, II 및 III 그룹 중 II 그룹과 유연관계가 높은 것으로 나타났다.
사스 코로나바이러스의 조기 진단을 위해, 검출 용이성, 신속진단 및 바이러스 핵산에 대한 안정성 등을 고려하여 항원검출법이 이용되어 왔다. 대표적인 항원검출법은 간접면역형광항체법 (indirect immunofluorescence assay, indirect IFA)과 항원 검출용 효소면역항체법 (sandwich ELISA) 이다. 그러나 항원 검출용 간접면역형광항체법과 효소면역항체법을 구축하기 위해서는 바이러스 항원에 특이적인 항체가 반드시 필요하다. 종래에는 사스 코로나바이러스 전체 항원에 대한 항혈청을 이용하여 진단하였다. 그러나 항혈청내에는 바이러스배양에 이용된 세포성분에 대한 항체를 포함하고 있기 때문에 사람세포와 위양성을 보일 수 있고, 사스 코로나바이러스는 사람코로나바이러스와 유연관계가 비교적 높기 때문에 전체 항원에 대한 항혈청내에는 사람 코로나바이러스에 대한 항원과 비특이 반응을 보이는 항체가 포함되어 있기 때문에 사람 코로나바이러스와 감별진단이 어렵다. 그러나 단클론 항체는 단일 항원결정기 (epitope)를 인식하기 때문에 특이반응을 보이는 단클론 항체만을 선별할 수 있다. 또한 전체 항원내에는 항체형성에 큰 영향을 미치는 주요항원부위가 존재하는데, 이 항원부위에 대한 단클론 항체의 이용은 항혈청을 이용한 항원진단법에 비해 민감도를 향상시킬 수 있다. 따라서 특이적인 항원에 대한 단클론 항체의 생산 및 이를 이용한 진단제에 대한 개발의 요구가 지속되어 왔다.
본 발명자들은 특이적인 항원으로 판정된, 재조합 베큘로바이러스에서 생산 된 사스 코로나바이러스 N 항원 (특허출원:10-2005-0109726)을 면역원으로 이용하여 마우스에 면역시키고, 면역된 마우스의 비장세포와 골수종세포가 융합된 하이브리도마 클론을 제조하고 이로부터 사스 코로나바이러스 N 항원에 대한 단클론항체를 생산함으로써 본 발명을 완성하였다. 본 발명에 따른 단클론 항체는 사스 코로나바이러스 N 항원에 대해 우수한 친화성 (affinity)을 나타내고, 특히 사람 코로나바이러스 혈청에 대하여 교차반응성하지 않았으며, 간접면역형광항체, 효소면역항체법 및 웨스턴 블롯법 등의 다양한 진단법에 이용 가능한 진단용 항체이다.
본 발명은 사스 진단을 위해 사스 코로나바이러스 N 항원에 대한 단클론 항체를 생산하는 하이브리도마 클론을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한 본 발명의 목적은 사스 코로나바이러스 N 항원에 대한 정제된 단클론 항체를 제공하는 것이다.
또한 본 발명의 목적은 단클론 항체를 이용한 사스 진단방법을 제공하는 것이다.
또한 본 발명의 목적은 사스 진단을 위한 진단키트를 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 사스 진단을 위해 사스 코로나바이러스 N 항원에 대한 단클론 항체를 생산하는 하이브리도마 클론을 제공한다. 바람직하게는 상기 단클론 항체를 생산하는 하이브리도마 클론은 단클론 항체를 장기적으로 생산할 수 있도록 마우스 비장세포와 골수종세포를 융합시킨 것으로, 제한 희 석법(limited dilution method)에 의해 단일 항원결정기(epitope)에 대한 항체만을 생산하는 세포클론이다. 또한 본 발명은 사스 코로나바이러스의 구조 단백질인 N 항원을 특이적으로 인식하는, 정제된 단클론항체를 제공한다.
또한 본 발명은 사스 코로나바이러스 N 항원을 면역원으로 마우스에 면역시키고, 면역된 마우스의 비장세포와 골수종세포를 융합하여 하이브리도마 클론을 선별하는 단계를 포함하는 항체 생산방법을 제공한다. 바람직하게는 본 발명의 제조방법은 단백질 G-레진(resin)을 이용한 크로마토그래피에 의한 항체 정제공정을 추가로 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 사스 진단용 키트를 제공한다. 본 발명의 진단키트는 상기 단클론항체, 기질과 반응하여 발색하는 표지체와 축합된 항체 및 발색기질을 포함한다. 본 발명의 진단키트에서 상기 단클론항체는 기판에 흡착된 상태로 제공된다. 상기 기판으로는 PVDF 막, 플레이트 및 슬라이드가 사용될 수 있다. 표지체로는 HRP, FITC (fluorescein isothiocyanate), 발색기질로는 TMB가 바람직하지만 이에 한정되는 것은 아니다. 이렇게 본 발명은 본 발명의 제조방법에 따라 제조된 사스 코로나바이러스 N 항원에 특이적인 단클론 항체를 이용하여 사람에서 사스를 진단하기 위한 진단키트를 제공한다. 진단키트의 최종 검출방법으로는 효소면역항체법 (ELISA), 웨스턴 블롯 또는 IFA가 이용될 수 있다. 바람직하게는 본 발명의 진단키트에 사용되는 검출방법은 효소면역항체법이다. 효소면역항체법을 이용한 키트의 경우, 본 발명의 단클론 항체가 코팅된 플레이트의 각 웰에 사스 의심환자로부터 채취된 검체를 반응시키고, HRP (Horseradish peroxidase)-축합 사스 단클론 항체를 첨가한 후, TMB (3,3',5,5' - tetramethylbenzidine) 기질용액을 각 웰에 처리하여 발색반응을 흡광도로 측정하는 것으로 구성된다. 바람직하게는, 본 발명의 진단 키트는 사람 코로나바이러스로부터 사스의 감별진단을 위한 특이적인 단클론 항체를 이용하며 양성대조군 및 정량적 분석이 가능하도록 본 발명자들에 의해 특허출원된 재조합 N 항원 (한국특허출원:10-2005-0109726)을 추가로 포함할 수 있다.
이와 같이, 본 발명자들은 사스를 보다 더 신속하고 정확하게 진단하기 위해, 사스 코로나바이러스 N 항원에 높은 친화도와 특이도를 갖는 단클론 항체를 제조하였다. 먼저, 정제된 사스 코로나바이러스 N 항원을 면역증강제와 함께 섞어 balb/c 마우스의 복강내에 1차 면역시키고, 2주 간격으로 추가 면역시켰으며 마우스의 비장세포와 골수종세포를 폴리에틸렌글리콜을 이용하여 융합된 하이브리도마 세포를 제조하였다. 다음 HAT(hypoxanthine, aminopteri, thymidine) 배지에서 배양하여 융합되지 않은 마우스 비장세포와 골수종 세포로부터 융합된 하이브리도마 세포를 선별한 후, 제한 희석법에 의해 단일 항원 결정기에 대한 항체만을 생산하는 하이브리도마 세포 클론을 제조하고, 재조합 사스 코로나바이러스 N 항원을 이용한 간접 ELISA에 의해 단클론항체를 생산하는 하이브리도마 클론을 선별하였다.
본 발명에 따른 단클론항체는 사스 코로나바이러스 감염에 대한 진단 시약, 진단 키트 또는 사스의 예방 및 항체치료제의 제조에 유용한 성분으로서 이용될 수 있을 것이다.
본 발명에 사용된 용어 사스 코로나바이러스 N 단백질과 사스 코로나바이러 스 N 항원은 의미상 동일한 표현이다.
이하 실시예에 기초하여 본 발명을 기술한다. 하기 실시예들은 본 발명을 예시하고자 하는 것으로, 본 발명을 제한하고자 하는 것이 아니다. 본 발명에 개시된 모든 문헌은 참조로서 통합된다.
실시예
실시예 1: 사스 코로나바이러스 N 항원을 이용한 면역
본 발명자들에 의해 특허출원된 재조합 사스 코로나바이러스 N 항원 (서열번호: 1) (특허출원:10-2005-0109726)을 프로인트완전애주번트 (Freund's complete adjuvant)와 동량으로 혼합하고, balb/c 마우스(샘타코, 9주령)의 복강 내에 주입하여 1차 면역을 실시하였다. 1차 면역 후 2주 간격으로 정제된 항원과 프로인트불완전애주번트 (Freund's incomplete adjuvant)를 동량으로 혼합하여 2회 추가 면역을 실시한 후 세포융합 3일 전에 항원 성분만 마우스의 꼬리정맥 내로 주입하여 2차 면역 (booster)을 유도하였다.
실시예 2: 하이브리도마 세포 제조
면역시킨 마우스의 비장(spleen)을 무균적으로 적출하여 얻어진 비장세포와 골수종세포(myeloma cell)인 SP-2 세포 (메타볼렙사)의 세포융합(cell fusion)은 폴리에틸렌글리콜 1500 (PEG 1500, Boehringer Mannheim)을 이용하여 콜러 (Kohler) 및 밀스테인 (Milstein)의 방법 (참고문헌: Kohler G., and Milstein C. (1975) Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature 256:495-497)에 따라 실시하였다. 최종 면역 3~4일 후 마우스 의 비장을 무균적으로 적출하고 26-게이지 (gauge) 주사바늘로 적출한 비장을 세절한 후 혈청이 첨가되지 않은 얼음 냉각 DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's medium)에 부유시켰다. 부유액은 50 ㎖ 코니컬 튜브 (cornical tube)에 수집하여 2분간 정치시킨 후 DMEM으로 1,000 rpm에서 10분씩 3회 원심 및 세척하였다. 침전된 림프구를 SP-2 세포와 7:1 내지 10:1 정도의 비율로 혼합하고 37℃로 미리 가온한 DMEM으로 1회 세척한 후 파스퇴르 피펫 (pasteur pipet)을 이용하여 상층액을 완전히 제거하였다. 이 혼합세포에 37℃로 미리 가온한 50% PEG 1500 1 ㎖를 1분에 걸쳐 첨가했다. PEG를 가한 후 2분간 혼합 세포가 들어있는 튜브를 흔들어주며 세포 융합을 유도하였다. 이 튜브에 DMEM 10 ㎖를 천천히 첨가한 후 37℃ 항온수조에서 5분간 정치시켰다. 혼합액을 1,000 rpm에서 10분간 원심분리한 후 상층액을 제거하였다. 침전된 세포는 HAT (0.1mM hypoxanthine, 0.4 μM aminopteri, 16 μM thymidine, SIGMA)와 20% 우태아혈청이 첨가된 DMEM에 1 x 106 세포/㎖의 농도로 부유시켰다. 이 부유액을 96 웰 마이크로플레이트에 100 ㎕씩 분주하고, 37℃, 5% CO2 항온기에서 하룻밤 배양한 다음 배지를 2일 간격으로 첨가해 주며 2주간 배양함으로써 융합된 세포를 선별하였다. 융합 2주 후부터는 HT 보충액 (100 μM hypoxanthine, 16 μM thymidine, SIGMA)과 10% 우태아혈청이 첨가된 DMEM으로 배양하였고, 3주 후부터는 10% 우태아 혈청만 첨가된 DMEM으로 배양하였다 (도 1 참조).
실시예 3: 하이브리도마 세포의 클로닝
융합된 세포의 단클론을 확보하기 위해 96 웰 플레이트의 첫 번째 웰에 약 10개의 세포가 들어가도록 세포 부유액을 넣은 후 행으로 2배 단계 희석하고, 이를 다시 열로 2배 단계 희석하는 방법으로 2회 클로닝 하였다.
실시예 4: 하이브리도마 클론에서 항체생성 조사
융합된 세포의 항체 생성 여부는 정제된 N 항원과 융합된 세포 배양액을 이용하여 간접 ELISA를 실시하여 관찰하였다. 정제된 사스 코로나바이러스 N 항원 단백질을 탄산염 완충액 (carbonate buffer) (pH 9.4)으로 10 ㎍/㎖ 농도로 희석한 다음 Maxisorp ELISA 플레이트 (Nunc사)의 각 웰 당 100 ㎕씩 첨가하고, 상온에서 16시간 반응시켜 항원을 코팅하였다. 항원이 코팅된 각 웰에 1% BSA (Bovine Serum Albumin)가 포함된 인산완충용액을 처리하여 37℃에서 1시간 동안 비특이 반응을 차단하였다. 각 웰에 융합된 세포배양액을 100 ㎕씩 첨가하고, 37℃에서 1 시간 반응한 다음 인산완충용액으로 3회 세척하였다. 세척 후 1:1000배 희석한 HRP (Horseradish peroxidase)-축합 항-마우스 IgG+IgA+IgM 항체 (Abcam, 1:2000)를 각 웰 당 100 ㎕씩 첨가하고 37℃에서 1 시간 반응시킨 다음 인산완충용액으로 3회 세척하였다. 세척 후 TMB (3,3',5,5' - tetramethylbenzidine) (입수처: Dade behring사) 기질용액을 각 웰에 100 ㎕씩 첨가하고 암소에서 30분간 반응시켜 발색한 후 1N H2SO4를 처리하여 효소반응을 정지시켰다. 반응 후 ELISA 리더를 이용하여 405 nm에서 흡광도를 측정하였다. 그 결과 사스 코로나바이러스 N 항원과 반응하는 17개의 하이브리도마 클론을 얻었다 (도 2 참조). 이들 중 07-19-11 하이브리도마 세포를 한국세포주연구재단에 수탁번호 KCLRF-BP-00126으로 2005년 12월 28일에 기탁하였다. 선별된 하이브리도마 클론은 10% 우태아 혈청과 5% DMSO (dimethyl sulfoxide)가 함유된 DMEM배지에 현탁시켜 액체질소에 보관하였다.
실시예 5: 단클론 항체의 정제
항체를 생성하는 융합 세포를 25 cm2 배양 플라스크로 옮겨서 배양한 뒤 제한 희석법(limited dilution method)을 이용하여 클로닝을 실시하고 37℃, 5% CO2 항온기에서 배양하였다. 클로닝된 융합 세포들의 항체 생성 여부를 다시 한번 확인한 후 항체를 생성하는 융합세포를 선별하여 배양하고, 배양 후 얻어진 세포 상층액으로부터 항체를 정제하였다. 항체의 정제는 이뮤노퓨어 (ImmunoPure) (G) IgG 정제 키트 (PIERCE)를 이용하였으며 실험과정은 제조사의 방법에 따라 수행하였다. BCA 단백질 분석 키트 (PIERCE)를 이용하여 정제된 항체량을 측정한 후 정제양상을 SDS-PAGE를 실시하여 확인하였다. 각 하이브리도마 클론으로부터 생산되는 단클론 항체를 단백질 G 컬럼을 이용하여 손쉽게 정제할 수 있었으며 SDS-PAGE로 분석한 결과 정제도 (purity)가 약 90% 이상에, 융합된 세포배양액 1㎖당 약 1mg/㎖ 농도의 정제된 항체를 수득할 수 있었다 (도 3 참조). 레인 M은 단백질표준분자량 표지(standard protein marker) 이고, 레인 1은 단백질 G 레진에서 3번째로 추출된 단클론 항체이고, 레인 2는 단백질 G 레진에서 4번째로 추출된 단클론 항체를 보여준다.
실시예 6: 이소타이핑에 의한 단클론 항체의 선별
선별된 17개의 하이브리도마 클론으로부터 정제된 단클론 항체의 이소타입 (isotype)의 결정은 이뮤노퓨어 단클론항체 이소타이핑 키트 (ImmunoPure Monoclonal Antibody Isotyping Kit) II (PIERCE)를 이용하여 공지된 제조사의 방법에 따라 수행되었다. 정제된 항원을 탄산염 완충액 (carbonate buffer) (pH 9.4)로 10 ㎍/㎖ 농도로 희석한 다음 Maxisorp ELISA 플레이트 (Nunc)의 각 웰 당 100 ㎕씩 첨가하고, 상온에서 16시간 반응시켜 항원을 코팅하였다. 항원이 코팅된 각 웰에 1% BSA가 포함된 인산완충용액을 처리하여 37℃에서 1시간 동안 비특이 반응을 차단하였다. 각 단클론 항체를 1% BSA가 포함된 인산완충용액을 이용하여 20 ㎍/㎖ 농도로 희석한 다음 각 웰에 100 ㎕씩 첨가하고, 37℃에서 1 시간 반응한 다음 인산완충용액으로 3회 세척하였다. 50 ㎕의 정상 토끼 혈청 (음성 대조군)과 서브클래스-특이적 항-마우스 Ig을 각 웰에 첨가하고, 37℃에서 1 시간 반응한 다음 인산완충용액으로 3회 세척하였다. 세척 후 1:500배 희석한 알칼라인 탈인산화효소 축합 항-토끼 (Alkaline phosphatase-conjugated anti-rabbit) IgG를 각 웰 당 100 ㎕씩 첨가하고, 37℃에서 1 시간 반응시킨 다음 인산완충용액으로 3회 세척하였다. 세척 후 기질용액(1 mg/㎖, pNPP)을 각 웰에 100 ㎕씩 첨가하고 암소에서 30분간 반응시켜 발색하였다. 반응 후 ELISA 리더를 이용하여 405 nm에서 흡광도를 측정하였다. 이소타입을 결정한 결과, 표 1에 정리된 바와 같이 중쇄 (heavy chain)의 서브클래스에 따라서 분류하면 2개는 IgG1 서브클래스, 3개는 IgG2b 서브클래스, 나머지 12개는 IgM 서브클래스였고, 모든 단클론 항체의 경쇄 (light chain)는 카파 사 슬 (kappa chain)으로 구성되어 있었다. 일반적으로 IgM 항체는 진단제 개발을 위해 이용되는 고상표면이나 표적 (target) 항원 이외의 다른 성분과 비특이적으로 흡착하는 특성을 갖고 있다. 따라서 본 발명을 통해 진단용 단클론 항체로 이용 가능한 항체는 5개의 IgG 서브클래스 항체로 선정하였다. 이후 제반실험에서는 이 항체만을 이용하여 특성분석을 실시하였다.
표 1. 단클론항체 이소타입
항-SARS-CoV N 단클론항체 서브클래스 (중쇄, 경쇄)
21-10-06, 21-10-11 IgG1, κ
22-05-03, 07-19-11, 07-19-21 IgG2b, κ
21-03-05, 21-24-03, 21-22-16, 21-02-04, 21-26-01, 21-28-15 21-02-08, 21-03-12, 21-22-03, 21-26-19, 21-28-10, 21-24-15 IgM, κ
실시예 7: 단클론 항체의 친화도 분석
진단용 단클론 항체의 선별을 위한 단클론 항체의 친화도 조사는 정제된 N 항원과 단계희석된 단클론 항체를 이용하여 간접 ELISA법에 의해 실시되었다. 정제된 항원을 탄산염 완충액(pH 9.4)로 10 ㎍/㎖ 농도로 희석한 다음 Maxisorp ELISA 플레이트 (Nunc)의 각 웰 당 100 ㎕씩 첨가하고, 상온에서 16시간 반응시켜 항원을 코팅하였다. 항원이 코팅된 각 웰에 1% BSA가 포함된 인산완충용액을 처리하여 37℃에서 1시간 동안 비특이 반응을 차단하였다. 각 단클론 항체를 1% BSA가 포함된 인산완충용액을 이용하여 200, 100, 50, 25, 12.5, 6.25, 3.125, 1.56, 0.78, 0.39, 및 0.3 nM 농도로 희석한 다음 각 웰에 첨가하고, 37℃에서 1 시간 반응시킨 다음 인산완충용액으로 3회 세척하였다. 세척 후 1:2000배 희석한 HRP-축합 항-마우스 IgG+IgA+IgM 항체 (Abcam)를 각 웰에 100 ㎕씩 첨가하고 37℃에서 1 시간 반 응시킨 다음 인산완충용액으로 3회 세척하였다. 세척 후 TMB 기질용액을 각 웰에 100 ㎕씩 첨가하고, 암소에서 30분간 반응시켜 발색한 후 1N H2SO4를 처리하여 효소반응을 정지시켰다. 반응 후 ELISA 리더를 이용하여 405 nm에서 흡광도를 측정하였다. 간접 ELISA를 수행한 결과, 단클론 항체의 농도에 따른 친화도를 보이는 용량-의존적 곡선 (dose-response curve)를 얻을 수 있었다. 이 곡선으로부터 1.00의 흡광도 (OD405)를 보이는 단클론 항체의 농도를 산출한 결과, 21-10-06 단클론 항체는 4.55 nM, 22-05-03 단클론 항체는 1.19 nM, 07-19-11 단클론 항체는 1.45 nM, 07-19-21 단클론 항체는 2.23 nM, 그리고 21-10-11 단클론 항체는 14.54 nM로 나타났다 (표 2 참조). 따라서 21-10-11 단클론 항체를 제외한 나머지 항체는 항원과의 친화도가 뛰어났으며, 향후 진단제 개발을 위해 유용할 것이다.
표 2. 흡광도
하이브리도마 클론 OD450 = 1 (nM)
21-10-06 4.55
22-05-03 1.19
07-19-11 1.45
07-19-21 2.23
21-10-11 14.54
실시예 8: 비변성 N 항원에 대한 단클론 항체의 반응성 분석
본 발명을 통해 확보된 단클론 항체는 항원진단용 키트의 개발 및 면역정제법 (Immunoprecipitation)등에 이용될 수 있기 때문에 비변성의 N 단백질과의 반응성에 따른 단클론 항체의 특성을 조사할 필요가 있었다. 이에 본 발명에서는 단클론 항체와 비변성 단백질과의 반응성을 확인하기 위해 정제된 단클론 항체와 항원을 이용하여 샌드위치 ELISA를 수행하였다. 우선 정제된 22-05-03 단클론항체에 비 오틴을 표지하기 위해 EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotinylation kit (PIERCE)를 이용하여 제조사의 방법에 따라 실시하였다. 정제된 단클론 항체 (표지되지 않은 22-05-03 단클론항체)를 탄산염 완충액 (pH 9.4)로 10 ㎍/㎖ 농도로 희석한 다음 Maxisorp ELISA 플레이트 (Nunc)의 각 웰 당 100 ㎕씩 첨가하고, 상온에서 16시간 반응시켜 항체를 코팅하였다. 50 ㎕의 각 단클론 항체(20 ㎍/㎖)와 50 ㎕의 정제된 N 항원 (10㎍/㎖)을 혼합하고, 37℃에서 30분간 반응시킨 후, 항체가 코팅된 웰에 항체-항원 반응액 전량을 첨가하고, 37℃에서 60분간 반응시켰다. 인산완충용액으로 3회 세척하고, 1:2000배 희석한 HRP-축합 사스 단클론항체 (07-19-11 단클론항체)를 각 웰 당 100 ㎕씩 첨가하여 37℃에서 60분간 반응시킨 다음 인산완충용액으로 3회 세척하였다. 세척 후 TMB (3,3',5,5' - tetramethylbenzidine) (입수처: Dade behring사) 기질용액을 각 웰에 100 ㎕씩 첨가하고, 암소에서 30분간 반응시켜 발색한 후 1N H2SO4를 처리하여 효소반응을 정지시켰다. 반응 후 ELISA 리더를 이용하여 405 nm에서 흡광도를 측정하였다. 단클론 항체와 비변성의 N 항원과의 반응성을 분석한 결과, 21-10-06과 21-10-11 단클론 항체에 비해 22-05-03, 07-19-11, 07-19-21 단클론 항체가 비변성 N 항원과 다소 높은 반응성을 보였다 (도 4 참조). 비록 반응도에 차이는 보였지만 5개의 IgG 서브클래스의 단클론항체는 모두 항원진단용 키트의 개발 및 면역정제법에 이용 가능할 것이다.
실시예 9: 변성 N 항원에 대한 단클론 항체의 반응성 분석 및 항원결정기 분석
특정 항원에 특이적인 단클론 항체는 면역블롯처럼 변성조건에서 항원을 검출하는 진단제 개발에 이용될 수 있다. 이에 본 발명에서는 정제된 사스 코로나바이러스 N 항원을 환원제인 β-메르캅토에탄올 (mercaptoethanol)로 처리하여 이황화결합을 끊어준 후, SDS-PAGE와 면역블롯을 실시하여 각 단클론 항체의 반응성을 조사하였다. 정제된 N 항원 (1 ㎍/㎖)을 이용하여 라엠리 (Laemmli) 등의 방법 (참고문헌: Laemmli UK. (1970) Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 227:680-685)에 따라 10% 아크릴아미드겔 (acrylamide gel)에서 SDS-PAGE를 실시하고, 영동이 끝난 후 겔 상의 N 항원은 타우빈 (Towbin) 등 의 방법(참고문헌: Towbin H, Staehelin T, Gordon J. (1979) Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proc Natl Acad Sci USA 76:4350-4354)에 따라 PVDF (Polyvinylidene fluoride) 막으로 이적시켰다. 단백질이 이적된 막은 적정한 크기의 스트립 (strip)으로 절단하고, 3% 탈지유 (skim milk)가 포함된 인산완충용액으로 비특이 반응을 차단하였다. 3% 탈지유가 함유된 인산완충용액에 100 ㎍/㎖ 농도가 되도록 희석한 각 단클론 항체를 각 막 스트립에 처리하여 상온에서 1시간 반응시켰다. 반응 후 인산완충용액으로 3회 세척하고, HRP-축합 항-마우스 IgG+IgA+IgM 항체 (Abcam)를 3% 탈지유가 포함된 인산완충용액으로 1:4,000으로 희석하여 첨가한 후 상온에서 1시간 동안 반응시켰다. 반응 후 인산완충용액으로 3회 세척하고, DAB 기질용액 (Sigma)을 이용하여 발색시켰다. 도 5에서 레인 1은 21-10-06 단클론 항체, 레인 2는 22-05-03 단클론 항체, 레인 3은 07-19-11 단클론 항체, 레인 4는 07-19-21 단클론 항체, 레인 5는 21-10-11 단클론 항체, 레인 P는 양성대조군인 항-His 항체로 처리한 결과를 보여 주고 있는데, 도 5에서 보는 바와 같이 21-10-06, 21-10-11, 22-05-03, 07-19-11, 07-19-21 단클론 항체는 49kDa의 전체크기의 N 항원과 반응하는 것으로 나타났다. 따라서 모든 단클론 항체는 선형의 항원결정기(epitope)와 반응함을 알 수 있으며, 변성된 항원검출을 위한 진단제 개발에 본 발명에서 확보된 단클론 항체는 유용할 것이다.
또한 도 5에서 양성대조군인 항-His 항체와 반응하는 단편(약 25kDa)은 아미노말단 단편이고, 반응하지 않는 단편(약 28kDa)은 카르복시말단 단편이었다. 따라서 22-05-03, 07-19-11, 07-19-21 단클론항체는 사스 코로나바이러스 N 항원의 아미노말단부위와 반응하고, 21-10-06과 21-10-11 단클론 항체는 카르복시 말단부위와 반응함을 알 수 있다. 이를 확인하고, 단클론 항체의 항원결정기를 조사하기 위해 사스 코로나바이러스 N 단백질에 대한 15 내지 20개 길이의 아미노산으로 구성된 펩타이드(Peptron Inc.)를 이용하여 경쟁 ELISA (competition ELISA)를 실시하였다 (표 4 참조). 그 결과, 21-10-06과 21-10-11 단클론 항체는 사스 코로나바이러스 N 단백질의 아미노 말단에서부터 215 ~ 239 아미노산 부위와 반응하고, 22-05-03, 07-19-11, 07-19-21 단클론 항체는 135 ~ 150 아미노산 부위와 반응하였고, 17 ~ 32 아미노산 부위와는 약하게 반응하였다. 따라서 22-05-03, 07-19-11, 07-19-21 단클론항체가 도 5에서의 결과와 같이 전체 사스 코로나바이러스 N 항원의 아미노 말단부위, 특히 135 ~ 150 및 17 ~32 아미노산 부위와 반응하고, 21-10-06과 21-10-11 단클론항체는 카르복시 말단부위, 특히 215 ~ 239 아미노산 부위와 반 응함을 알 수 있다. 따라서 본 발명을 통해 항원결정기가 다른 2 그룹의 단클론 항체를 확보할 수 있었으며 각 그룹의 단클론 항체들은 사스 항원진단제 개발뿐만 아니라 사스 코로나바이러스에 대한 기초연구에서도 유용하게 이용될 수 있다 (도 6 참조).
표 4. 사스 코로나바이러스 N 단백질의 아미노산 단편
펩타이드 서열 위치 친수성 서열번호
N1 MSDNGPGSNQRSAPRI 1-16 + 2
N17 TFGGPTDSTDNNQNGG 17-32 + 3
N35 GARPKQRRPQGLPNNT 35-50 + 4
N50 TASWFTALTQHGKEE 50-65 + 5
N65 LRFPRGQGVPI 65-75 + 6
N76 NTNSGPDDQIGYYRRATRRVRGGDGK 76-101 + 7
N101 KMKELSPRWYFYYLGT 101-116 + 8
N117 GPEASLPYGANKEGIV 117-132 + 9
N135 ATEGALNTPKDHIGTR 135-150 + 10
N153 NNNAATVLQLPQGTTLPKGFYAEGS 153-178 ± 11
N177 SRGGSQASSRSSSRSRGNSRNS 177-198 + 12
N196 RNSTPGSSRGNSPARMASGGGE 196-217 + 13
N215 GGETALALLLLDRLNQLESKVSGKG 215-239 - 14
N245 QTVTKKSAAEASKKPRQKRTATKQ 245-268 + 15
N258 KPRQKRTATKQYNVTQAFGRRG 258-279 + 16
N355 NKHIDAYKTFPPTEPKKDKKKK 355-376 + 17
N371 KDKKKKTDEAQPLPQRQKKQ 371-390 + 18
N385 QRQKKQPTVTLLPAADMDDFSRQ 385-407 + 19
N401 MDDFSRQLQNSMSGASADSTQA 401-422 + 20
실시예 10: 사스 코로나바이러스가 감염된 세포에서 단클론 항체의 반응성 분석
최근 까지는 바이러스 진단을 위해 표준진단법으로 면역형광항체법 (immunofluorescence assay)이 널리 이용되어 왔기 때문에 본 발명에서 확보된 단클론 항체들과 사스 코로나바이러스의 반응성을 조사하기 위해 바이러스가 접종된 베로 (vero) 세포 (ATCC, CCL-81)를 이용하여 간접면역형광항체법을 수행하였다. 사스 코로나바이러스를 단층배양된 베로세포에 접종하고, 세포병변효과가 관찰될 때 세포침전물을 수확하였다. 세포침전물을 인산완충용액으로 3회 세척한 후 FA (fluorescence assay)용 슬라이드에 도말하여 건조시키고, 바이러스를 불활성화하기 위해 UVC (ultra-violet C)를 30분간 처리하였다. FA 슬라이드는 제반실험을 수행하기 전까지 -70 ℃보관하거나 100% 메탄올에서 5분간 고정하였다. 고정된 FA 슬라이드에 각 단클론 항체를 1% BSA가 포함된 인산완충용액을 이용하여 20 ㎍/㎖ 농도로 희석하여 처리하고, 37 ℃에서 30분간 반응시킨 후 인산완충용액을 이용해서 3회 세척하였다. 세척 후 FITC 축합 항-마우스 IgG+IgA+IgM 항체 (Cappel, 20 ㎍/㎖)를 처리하고, 37 ℃에서 30분간 반응시킨 후 인산완충용액을 이용해서 3회 세척하였다. 세척 후 FITC 축합 항-마우스 IgG+IgA+IgM 항체 (Cappel, 20 ㎍/㎖)를 처리하고, 37 ℃에서 30분간 반응시켰다. 반응 후 인산완충용액으로 3회 세척하고, 증류수로 1회 세척하였다. FA 슬라이드를 건조시킨 후 형광현미경하에서 관찰하였다. 도 7에서 보는 바와 같이, 21-10-06을 제외한 22-05-03, 07-19-11, 07-19-21 단클론항체는 모두 사스 코로나바이러스가 감염된 세포에서 N 항원을 검출할 수 있었다. 따라서, 22-05-03, 07-19-11, 07-19-21 단클론항체는 사스 코로나바이러스가 감염된 세포에서 N 항원의 검출용 진단제 개발을 위해 유용할 것이다.
실시예 11: 단클론 항체의 사람 코로나바이러스에 대한 교차반응 조사
사스 코로나바이러스의 진단제 개발을 위해서는 비교적 높은 유연관계를 보이는 사람 코로나바이러스와의 감별진단이 매우 중요하다. 이에 본 실시예에서는 사스 코로나바이러스 N 항원에 대한 단클론 항체가 사람 코로나바이러스와 교차반응하는 지를 조사하기 위해 MRC-5 세포 (ATCC, CCL-171)에서 배양된 바이러스를 이 용해 간접면역형광항체법을 수행하였다. 각 사람코로나바이러스 OC43 주(ATCC, VR-1558)를 단층배양된 MRC-5 세포에 접종하고, 세포병변효과가 관찰될 때 세포침전물을 수확하였다. 세포침전물을 인산완충용액으로 3회 세척한 후 FA용 슬라이드에 도말하여 건조시키고, 바이러스를 불활성화하기 위해 UVC를 30분간 처리하였다. FA 슬라이드는 제반실험을 수행하기 전까지 -70℃에서 보관하거나 100% 메탄올에서 5분간 고정하였다. 고정된 FA 슬라이드에 각 단클론 항체, 사람 코로나바이러스 OC43 N 항원에 대한 항체(Chemicon, MAB 9013)를 1:100배 희석하여 처리하고, 37 ℃에서 30분간 반응시킨 후 인산완충용액을 이용해서 3회 세척하였다. 세척 후 FITC 축합 항-마우스 IgG (Abicam, 20 ㎍/㎖)를 처리하고, 37 ℃에서 30분간 반응시켰다. 반응 후 인산완충용액으로 3회 세척하고, 증류수로 1회 세척하였다. FA 슬라이드를 건조시킨 후 형광현미경하에서 관찰하였다. 도 8에서 보는 바와 같이 본 발명의 각 단클론 항체는 사람 코로나바이러스와 교차반응하지 않는 것으로 관찰되었다. 따라서 본 발명을 통해 획득된 단클론 항체는 사스 코로나바이러스의 감염을 감별진단 할 수 있는 특이적인 항체임을 알 수 있었다.
실시예 12: 진단키트
본 발명은 본 발명의 단클론항체를 포함하는, 사스 코로나바이러스의 감염을 진단할 수 있는 진단키트를 제공한다. 본 발명의 진단키트는 본 발명의 단클론항체, 기질과 반응하여 발색하는 표지체와 축합된 항체 및 발색기질을 포함한다. 상세하게는, 상기 진단키트는 본 발명의 단클론항체를 탄산염 (pH 9.4)으로 희석하여 최종 농도가 10 ㎍/㎖인 단클론항체 희석액이 코팅된 플레이트, 1:2,000배로 희석 된 HRP-축합 사스 단클론항체, 인산완충용액, TMB 및 1N H2SO4 로 구성된다.
본 발명의 진단키트를 이용하여, 사스 의심 환자 (피검자)에 대해 사스 코로나바이러스 감염여부를 진단하는 방법은 다음과 같다. 단클론항체가 코팅된 플레이트에 피검자로부터 채취한 검체 (여기서, 검체는 피검자의 비강세척액, 인후도말액, 대변 또는 혈액이다)를 각 웰 당 100 ㎕ 씩 첨가하고 37 ℃에서 60분 동안 반응시킨 다음 인산완충용액으로 플레이트를 3회 세척한다. 다음으로, HRP-축합 사스 단클론항체를 플레이트의 각 웰 당 100 ㎕ 씩 첨가하고 37 ℃에서 60분 동안 반응시킨 다음 인산완충용액으로 플레이트를 3회 세척한다. 그런 다음, HRP의 기질인 TMB를 플레이트의 각 웰 당 100 ㎕ 씩 첨가하고 암소에서 30분 동안 반응시켜 발색반응을 유도한다. 그런 다음, 1N H2SO4를 플레이트의 각 웰 당 100 ㎕ 씩 첨가하여 효소반응을 정지시킨다. 본 발명의 진단키트를 이용하여 이렇게 처리한 플레이트를 ELISA 리더 (reader)를 사용하여 405 nm에서 흡광도를 측정한다. 측정 결과, 흡광도가 0.2 이상인 경우 양성으로 판정한다.
또한, 본 발명의 진단키트는 FA 슬라이드, 100% 메탄올, 1% BSA가 포함된 인산완충용액으로 희석하여 최종 농도가 20 ㎍/㎖인 단클론항체, FITC 축합 항-마우스 IgG+IgA+IgM 항체 (20 ㎍/㎖), 인산완충용액 및 증류수로 구성될 수도 있다. 이렇게 구성된 진단키트를 이용하여, 사스 의심 환자 (피검자)에 대해 사스 코로나바이러스 감염여부를 진단하는 방법은 다음과 같다.
피검자로부터 채취한 검체 100 ㎕를 FA 슬라이드에 도말하여 건조시키고, 바 이러스를 불활성화하기 위해 UVC (ultra-violet C)를 30분 동안 처리한다. 그런 다음, FA 슬라이드를 -70 ℃에 보관하거나 100% 메탄올에 5분 동안 처리하여 고정시킨다. 고정된 FA 슬라이드에 1% BSA가 포함된 인산완충용액으로 희석하여 최종 농도가 20 ㎍/㎖인 단클론항체에 처리하고 37 ℃에서 30분 동안 반응시킨 후 인산완충용액으로 3회 세척한다. 세척 후, FITC 축합 항-마우스 IgG+IgA+IgM 항체 (20 ㎍/㎖)를 처리하고 37 ℃에서 30분 동안 반응시킨다. 반응 후, 인산완충용액으로 3회 세척하고 증류수로 1회 세척한다. 그런 다음, FA 슬라이드를 건조시키고 형광현미경하에서 관찰한다.
본 발명의 진단 키트는 사람 코로나바이러스로부터 사스의 감별진단을 위한 특이적인 단클론 항체를 이용하며 양성대조군 및 정량적 분석이 가능하도록 본 발명자들에 의해 특허출원된 재조합 N 항원 (한국특허출원:10-2005-0109726) (서열번호: 1)을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 사스 코로나바이러스 N 항원에 대한 17개의 단클론 항체중에 5개의 IgG 서브클래스의 항체는 진단제 개발을 위해 매우 유용한 진단용 항체를 제공하고, 이들 단클론 항체는 하이브리도마 클론 세포의 배양을 통해 지속적으로 생산이 가능할 뿐만 아니라 높은 순도로 정제가 용이하였고, 사람 코로나바이러스 항원에 대해 교차반응하지 않았으며 사스 코로나바이러스 N 항원과 친화도가 매우 뛰어났다. 또한 이들 단클론 항체는 N 항원의 아미노말단과 카르복시말단과 반응하는 두 그룹의 단클론 항체들로 구분할 수 있었다. 특히 21-10-06, 22-05-03, 07-19-11, 07-19-21 단클론 항체는 높은 친화도를 보이면서 간접 ELISA, 면역블롯, 면역 형광항체법(IFA), 샌드위치 ELISA와 같은 다양한 진단제 개발에 이용 가능하였다 (표 5 참조). 따라서 이와 같은 N 단백질에 대한 단클론 항체는 사스 코로나바이러스의 감염에 대한 진단시약 또는 진단키트, 사스 예방 또는 항체치료제의 제조 등에 이용될 수 있다.
표 5. 하이브리도마 클론으로부터 생산된 단클론항체 검출방법 및 유용성
하이브리도마 클론 실험결과
간접 ELISA 웨스턴 블롯 IFA 샌드위치 ELISA
21-10-06 + + - +
22-05-03 ++ ++ ++ ++
07-19-11 ++ ++ ++ ++
07-19-21 ++ ++ ++ ++
21-10-11 + + + +
a: ++ = 강한 양성; + = 양성; - = 음성.
이상 살펴본 바와 같이, 본 발명의 하이브리도마 클론에서 생산되는 단클론 항체는 감수성 및 특이성이 우수하여, 사스 코로나바이러스 감염에 대한 진단시약 또는 진단키트, 사스 예방 또는 항체치료제의 제조 등에 매우 유용하게 이용될 수 있다.
서열목록 전자파일 첨부

Claims (7)

  1. 수탁번호가 KCLRF-BP-00126인 하이브리도마 세포 (07-19-11 하이브리도마 세포)에 의해 생산되는, 사스 코로나바이러스 뉴클레오캡시드 (N) 항원 (서열번호: 1)의 아미노말단으로부터 135번 ~ 150번 아미노산 및 17번 ~ 32번 아미노산부위와 반응하는 단클론 항체.
  2. 삭제
  3. 제 1항의 단클론 항체;
    기질과 반응하여 발색하는 표지체와 축합된 항체; 및
    발색기질을 포함하는 사스 코로나바이러스 검출용 진단키트.
  4. 제 3항에 있어서, 양성대조군으로서 사스 코로나바이러스 N 항원 (서열번호: 1)을 추가로 포함함을 특징으로 하는 진단키트.
  5. 제 3항에 있어서, 표지체가 HRP (Horseradish peroxidase) 또는 FITC (fluorescein isothiocyanate)임을 특징으로 하는 진단키트.
  6. 제 3항에 있어서, 발색기질이 TMB (3,3',5,5'-tetramethylbenzidine)임을 특징으로 하는 진단키트.
  7. 제 3항에 있어서, 효소-항체 결합반응을 ELISA(Enzyme-linked immunosorbent assay), 웨스턴 블롯 또는 IFA(immunofluorescence assay)로 측정함을 특징으로 하는 진단키트.
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