KR100811537B1

KR100811537B1 - Manufacturing method and it's delivery method of creation and it's remedy of fatty tissue therapeutics

Info

Publication number: KR100811537B1
Application number: KR1020050020552A
Authority: KR
Inventors: 양영일; 조문환
Original assignee: 양영일; 조문환
Priority date: 2005-03-11
Filing date: 2005-03-11
Publication date: 2008-03-20
Also published as: KR20060099232A

Abstract

본 발명은 지방조직 치료제의 조성, 이들 치료제의 제조방법 및 그의 전달방법에 관한 것으로, 이를 보다 상세하게 서술하면, 콜라지네이즈(collagenase)와 같은 조직 분해를 위한 효소처리과정 없이 체외에서 하이드로겔(hydrogel)을 이용하여 하이드로겔 내에 지방조직을 3차원 배양한 후 지방조직에서부터 이동, 성장하여 증폭 배양된 지방조직 기원의 줄기세포(adipose tissue-derived stem cells, ASCs)를 포함한 지방조직 기원의 세포들과, 이러한 세포에서 생성하여 분비한 혈관성장인자를 포함한 성장인자 및 세포외기질, 지방조직 그리고 하이드로겔(hydrogel)로 구성되어지는 특성을 지니고 있는 지방조직 치료제의 조성, 이들 치료제의 제조방법 및 그의 전달방법에 관한 것이다.The present invention relates to a composition for treating adipose tissue, a method for preparing these agents, and a method for delivering the same. More specifically, the present invention relates to hydrogels in vitro without enzyme treatment for tissue degradation such as collagenase. Cells of adipose tissue origin, including adipose tissue-derived stem cells (ASCs), which have been amplified and cultured by amplifying and culturing adipose tissue in a hydrogel using a hydrogel) And, a composition of adipose tissue therapeutics having characteristics of being composed of growth factors and extracellular matrix, adipose tissue and hydrogel, including vascular growth factors produced and secreted by such cells, a method of preparing these therapeutic agents, and its It relates to a delivery method.

지방조직, 치료제의 조성, 치료제의 제조방법, 치료제의 전달방법, 지방조직기원 세포Adipose tissue, composition of therapeutic agent, method of manufacturing therapeutic agent, method of delivery of therapeutic agent, adipose tissue origin cell

Description

Composition of adipose tissue therapeutics, manufacturing method thereof and delivery method thereofManufacturing method and it's delivery method of creation and it's remedy of fatty tissue therapeutics

도1은 종래의 콜라지네이즈와 같은 조직분해 효소의 처리과정 없이 지방조직을 하이드로겔 내로 3차원 배양하여, 지방조직, 지방조직 기원의 세포, 세포외기질, 혈관성장인자, 하이드로겔로 구성된 지방조직 치료제를 제조하고, 막과 같은 이식편 형태와 주입형 형태로 지방조직 치료제를 단일공정으로 제조하는 모식도
도2는 본 발명에 따라 콜라지네이즈 처리과정 없이 잘게 썬 지방조직을 생체에 접합한 하이드로겔인 피브린 내로 함입 후 3차원 배양하여 지방조직으로부터 이동, 성장한 지방조직 기원세포를 현미경으로 관찰한 사진으로,
그림 A는 배양 1일째 사진
그림 B는 배양 7일째 사진
도3은 본 발명에 따라 하이드로겔 내에 함입된 지방조직을 3차원 배양한 후 분리, 배양한 지방조직 기원세포를 유세포분석기 (flow cytometry, FASC Calibur, Becton Dickinson)를 통하여 분석한 세포면역학적 특성
도4는 본 발명에 따라 하이드로겔 내에 함입된 지방조직을 3차원 배양한 후 분리, 배양한 지방조직 기원세포에서 골모세포로의 분화능을 조사한 결과
그림 A는 골모세포로의 분화배지에 배양한 후 7일째 (OM-1) 및 14 일째 (OM-2) 되는 세포에서 역전사중합효소방법으로 골모세포 특이 유전자 발현을 조사한 결과로, ALP (alkaline phosphatase), Col I (collagen type I), OP (osteopontin), OS (osteocalin) mRNA는 골모세포로 분화를 유도한 세포에서 검출되나, 골모세포로의 분화를 유도하는 제재를 첨가하지 않은 배지 (CM)에서 배양한 세포에서는 골모세포 특이 mRNA는 검출되지 않는 사진
그림 B는 14일간 골모세포로 분화를 유도한 세포에서 무기질 침착을 alizarin red 염색 후 현미경으로 촬영한 사진
도5는 본 발명에 따라 하이드로겔 내에 함입된 지방조직을 3차원 배양한 후 분리, 배양한 지방조직 기원세포에서 지방세포로의 분화능을 조사한 결과
그림 A는 지방세포로의 분화배지에서 배양한 후 7일째 (AM-1), 14일째 (AM-2) 되는 세포에서 역전사중합효소방법으로 골모세포 특이 유전자 발현을 조사한 결과로, LPL (lipoprotein lipase), PPAR-g (peroxisome proliferated-activated receptor gamma) mRNA는 지방세포로 분화를 유도한 세포에서 검출되나, 지방세포로의 분화 유도제를 첨가하지 않은 배지 (CM)에서 배양한 세포에서는 지방세포 특이 mRNA는 검출되지 않는 사진
그림 B는 14일간 지방세포로 분화를 유도한 세포질 내에 지방질 생성여부를 sudan black 염색 후 현미경으로 촬영한 사진
도6은 본 발명에 따라 하이드로겔 내에 함입된 지방조직을 3차원 배양한 후 분리, 배양한 지방조직 기원세포의 혈관내피세포로의 분화능을 조사한 결과
그림 A는 혈관내피세포로의 분화배지에 배양한 후 14 일째 되는 세포에서 혈관내피세포 특이 단백질인 Factor VIII (A), CD31 (B), Flk-1 (C), VE-cadherin이 발현되는 사진
그림 B는 지방조직 기원의 세포를 Matrigel^TM이 코팅된 배양용기에서 VEGF를 첨가한 후 배양 12시간, 2일, 5일째 세포가 모세혈관형태로 재배치되는 현상을 현미경으로 촬영한 사진
도7은 본 발명에 따라 하이드로겔 내에 함입된 지방조직을 7일 동안 3차원 배양하여 하이드로겔 내로 지방조직에서부터 이동, 성장한 세포로 가득 찬 현미경 사진
도8은 본 발명에 따라 제조한 지방조직 치료제는 지방조직에서 기원한 세포에서부터 파란색의 콜라겐 섬유가 생성되어 하이드로겔 내로 침착되는 현미경 사진 (Masson Trichrome 염색)
도9는 본 발명에 따라 제조한 지방조직 치료제에서 혈관성장인자인 VEGF, bFGF, HGF mRNA 발현을 역전사효소중합반응으로 조사한 결과로, 배양 전 지방조직 (lane 1), 7일간 배양한 지방조직 (lane 2), 지방조직에서부터 기원한 세포 (lane 3)에서는 혈관성장인자 mRNA 발현이 검출되나, 섬유모세포 (lane 4) 및 C2C12 세포 (lane 5)에서는 혈관성장인자 mRNA가 아주 미미하게 검출되는 사진
도10은 본 발명에 따라 제조한 지방조직 치료제의 조직학적 특성을 hematocryal eosin 염색 후 분석한 결과로,
그림A는 하이드로겔에 인접한 지방조직의 구조는 잘 유지되어 있으며, 지방조직으로부터 성장하는 세포를 촬영한 사진
그림B는 지방조직의 중심부에서 촬영한 사진으로 성숙한 지방세포의 구조는 파괴되어 있으나, 혈관 및 간질조직의 구조는 잘 유지되고 있는 사진
그림C는 지방조직에서부터 지방조직 기원의 세포와 더불어 모세혈관이 하이드로겔 내로 성장하는 사진 1 is a three-dimensional culture of adipose tissue into a hydrogel without the treatment of histolytic enzymes such as conventional collagenase, adipose tissue, fat cells composed of adipose tissue, extracellular matrix, vascular growth factor, hydrogel Schematic diagram of preparing a tissue treatment agent and producing adipose tissue treatment agent in a single process in the form of a graft and an injection type such as a membrane
Figure 2 is a microscopic observation of adipose tissue-derived cells grown and moved from adipose tissue by incorporating into fine fibrin, a hydrogel bonded to a living body, without a collagenase treatment, according to the present invention. ,
Figure A is photographed on day 1 of culture
Figure B is the 7th day of culture
Figure 3 is a three-dimensional culture of adipose tissue embedded in a hydrogel, isolated, and cultured adipose tissue-derived adipose tissue cells were analyzed by flow cytometry (flow cytometry, FASC Calibur, Becton Dickinson)
Figure 4 is a result of examining the differentiation ability of the adipose tissue embedded in the hydrogel three-dimensional culture after separation, cultured adipose tissue origin cells to osteoblasts according to the present invention
Figure A shows the osteoblast specific gene expression by reverse transcriptase in cells 7 days (OM-1) and 14 days (OM-2) after culturing in osteoblast differentiation medium. ALP (alkaline phosphatase) ), Col I (collagen type I), OP (osteopontin), and OS (osteocalin) mRNA are detected in cells that induce differentiation into osteoblasts, but without the addition of agents that induce differentiation into osteoblasts (CM) Osteoblast-specific mRNA was not detected in cells cultured in
Figure B shows the microscopic photograph of mineral deposition on cells induced with differentiation into osteoblasts for 14 days after alizarin red staining.
5 is a result of examining the differentiation ability of the adipose tissue-derived cells from the adipose tissue-derived cells after separating and culturing the adipose tissue embedded in the hydrogel according to the present invention in three dimensions
Figure A shows the results of the study of osteoblast specific gene expression by reverse transcriptase in cells 7 days (AM-1) and 14 days (AM-2) after incubating in differentiation medium to adipocytes. , PPAR-g (peroxisome proliferated-activated receptor gamma) mRNA is detected in cells that induce differentiation into adipocytes, but adipocyte specific mRNA is detected in cells cultured in medium (CM) without the induction of differentiation into adipocytes. Photo
Figure B is a microscopic photograph taken after sudan black staining for the formation of fat in the cytoplasm induced differentiation into fat cells for 14 days.
FIG. 6 is a three-dimensional culture of adipose tissue embedded in a hydrogel according to the present invention.
Figure A shows the expression of vascular endothelial specific proteins, Factor VIII (A), CD31 (B), Flk-1 (C), and VE-cadherin, in cells at day 14 after culture in differentiation medium into vascular endothelial cells.
Figure B is a microscope photograph of the repositioning of cells from adipose tissues in capillary form at 12 hours, 2 days, and 5 days after incubation with VEGF in a Matrigel ^TM coated culture vessel.
Figure 7 is a three-dimensional culture of adipose tissue embedded in the hydrogel for 7 days in accordance with the present invention microscopic photo filled with cells grown, moved from the adipose tissue into the hydrogel
8 is a photomicrograph of adipose tissue therapeutic agent prepared according to the present invention from which cells derived from adipose tissue originate from blue collagen fibers to be deposited into a hydrogel (Masson Trichrome staining).
9 is a result of the reverse transcriptase polymerization of VEGF, bFGF, HGF mRNA expression of the vascular growth factors in the adipose tissue treatment prepared according to the present invention, before the culture (lane 1), adipose tissue cultured for 7 days ( lane 2), vascular growth factor mRNA expression is detected in cells originating from adipose tissue (lane 3), but very little vascular growth factor mRNA is detected in fibroblasts (lane 4) and C2C12 cells (lane 5)
10 is a result of analysis after hematocryal eosin staining the histological characteristics of the adipose tissue treatment prepared according to the present invention,
Figure A shows the structure of the adipose tissue adjacent to the hydrogel is well maintained and photographs of cells growing from the adipose tissue.
Figure B is a picture taken from the center of adipose tissue. The structure of mature fat cells is destroyed, but the structure of blood vessels and interstitial tissues is well maintained.
Figure C shows capillaries growing into a hydrogel with cells from adipose tissue from adipose tissue.

삭제delete

본 발명은 지방조직 치료제의 조성, 이들 제조방법 및 그의 전달 방법에 관한 것으로, 이를 보다 상세하게 서술하면, 콜라지네이즈(collagenase)와 같은 조직을 분해하기 위한 효소처리 없이 체외에서 하이드로겔(hydrogel)을 이용하여 지방조직을 3차원 배양한 후 지방조직에서부터 이동, 성장하여 증폭 배양된 지방줄기세포 (adipose tissue-derived stem cells, ASCs)를 포함한 지방조직 기원의 세포들과, 이러한 세포에서 생성하여 분비한 혈관성장인자를 포함한 성장인자 및 세포외기질, 지방조직 그리고 하이드로겔(hydrogel)로 구성되어지는 특성을 지니고 있는 지방조직 치료제의 조성, 이들 제조방법 및 그의 전달 방법에 관한 것이다.
이러한 형태의 지방조직 치료제는 손상된 조직과 장기에 전달하여 손상된 조직과 장기의 신생혈관을 생성하고, 조직 및 장기를 구성하는 세포를 재생 혹은 복원시키고, 그 조직 및 장기의 고유기능을 담당하는 세포 및 조직을 재생시켜 그 기능을 복원하는 치료제로 사용되어지고 있다.
일반적으로 사고나 질병에 의한 조직 및 장기의 손상과 결손은 해당 조직과 장기가 동일한 세포와 조직으로 복원 되지 않으면 해당 조직과 장기는 기능 저하에 따른 이차적인 합병증을 초래할 수 있으며, 이를 치료하기 위하여 해당 조직과 장기를 자기 신체의 일부 혹은 타가 조직과 장기를 전달하여 그 기능을 복원시켜야만 치료될 수 있는 것으로 알려져 있다.
그러나 사고나 질병 등으로 인하여 조직 및 장기가 필요한 경우에는 자기 신체의 일부에서 전달할 수 있는 조직(자가)과 장기가 제한적이기 때문이 공여된 다른 생물체 조직 및 장기를 이용할 수밖에 없는 실정이다.
그러나 이와 같은 경우에는 수요에 비하여 턱없이 부족한 공급 상의 문제와 다른 생물체(타가 조직)를 구할 수 있다 하더라도 타가 조직에 대한 면역거부 반응, 질환의 전염, 윤리적인 문제 그리고 사회적인 문제 등을 야기함으로 하여 많은 문제가 대두되어져 왔다.
세계적으로 세포치료제 관련 분야 연구개발이 본격적으로 시작된 것은 1990년대 초반이며 1998년에 미국에서 배양 인공 피부가 판매허가를 받았고 본격적인 시장은 2003년부터 형성된 것으로 생각된다. 연구투자로 누적된 지출액은 세계적으로 30-40억 불에 달하는 것으로 추산되며 민간기업의 투자만 1998년에 약 10억불, 2005년에는 약 800억불에 이를 것으로 예상되고 있다 (강계원. 생체조직기술 동향. 한국과학기술정보연구원 기술동향분석보고서. 2004.12). 국내 세포치료제 연구는 1990년대 후반에 시작되었으며 인공피부, 연골, 줄기세포 연구가 중심이 되고 있다. 국내 연구 개발비 투자 규모는 집계된 자료는 없으나 현재 약 20개의 벤처기업이 연구에 참여하고 있고, 한 기업 당 연간 4-5억 원의 연구비를 지출한다고 가정할 때 연간 80-100억 원 정도로 추산할 수 있다. 줄기세포, 바이오인공장기, 세포치료제와 관련하여 정부에서 차세대지원 사업으로 지정되어 년 수백억 원 규모의 연구비를 집중 지원하고 있다.
최근 들어 기초과학의 발달로 인하여 생명공학분야의 발전이 거듭되고 있는 가운데, 줄기세포를 이용하여 조직 및 장기를 재생시켜 그 기능을 복원하기 위한 방법들이 시도되고 있다. 줄기세포는 기원세포에 따라 배아줄기세포와 성체줄기세포로 구분되어지며, 배아줄기세포는 만능으로 분화할 수 있는 능력이 있지만 목적하는 세포 및 조직으로 완벽히 분화를 제어하지 못하며, 또한 배아줄기세포는 종양을 유발할 수 있는 위험성, 윤리적 법률적 한계로 인하여 빠른 시간 내에 치료목적으로 사용되기 어려운 문제점을 가지고 있다.
반면에 성체줄기세포는 자가 조직에서 분리하여 체외에서 배양가능하기 때문에 배아줄기세포의 한계를 극복할 수 있을 뿐만 아니라 자기 자신의 조직에서 분리, 배양, 증폭하여 자기 자신에게 다시 전달하기 때문에 생리적이며 이상적인 치료목적의 세포치료제 (cell therapeutics)로 사용될 수 있다. 또한 성체줄기세포는 분화 제어가 용이하고, 종양을 유발할 수 있는 위험성을 완전히 배제할 수 없으나 그 가능성이 극히 희박하며, 또한 윤리적, 종교적, 법률적 제한이 없다는 장점을 가진다.
자가 혹은 타가 성체줄기세포를 전달하여 질환을 치료하는 방법 중에서 30년 전부터 현재까지 널리 사용되고 있는 치료법 중 골수세포전달, 즉 조혈모세포전달이 가장 대표적이며, 백혈병, 재생 불량성 빈혈, 고형 암의 방사선과 항암치료 후 저하된 골수기능을 복원하기 위해 일반적으로 널리 사용되고 있다.
조혈모세포 이외에도 여러 장기와 조직에서 다양한 기원의 성체줄기세포들이 발견되었고, 특히 골수조직에서 발견된 간엽줄기세포(mesenchymal stem cells, MSCs, Friedenstein AJ, Int. Rev. Cytol. 47: 327-345, 1976)는 중배엽 기원의 세포와 조직으로 분화하는 능력이 있을 뿐만 아니라 신경세포와 같은 외배엽 기원의 세포와 조직, 그리고 심장 근육세포로도 분화할 수 있는 다기능(multipotent) 줄기세포이다. MSCs는 조혈모세포와는 달리 체외 배양과 증폭이 가능하다는 장점을 가지고 있어 세포치료제로서의 그 가능성이 아주 높다. MSCs는 골세포, 연골세포, 반월판세포, 심장근육세포, 신경세포 등으로 분화할 수 있는 능력과 해당 결손 조직을 재건할 수 있는 능력이 실험적 혹은 임상적 연구결과로 입증되어 해당 결손 조직과 장기의 기능을 재건하기 위한 세포치료제로 사용되거나 혹은 임상시험이 진행되고 있다. 즉 MSCs는 골다공증, 골절, 관절염, 심근경색, 울혈성 심부전, 퇴행성 및 외상성 뇌질환을 치료할 수 있는 세포치료제로 개발되고 있다.
MSCs는 골수에서 자가 골수조직을 취득하여 줄기세포를 분리하고 체외에서 확대 배양하여지며, 치료용으로는 최소 500백만 개 이상의 세포가 요구되나, 골수조직 내 MSCs는 나이에 따른 편차는 있지만 약 10억 분의 1에 해당하는 세포만이 줄기세포인 것으로 알려져 있다. 골수 조직 내 줄기세포의 희귀성으로 인하여 MSCs의 체외 증폭 배양이 용이하지 않은 단점이 있다.
따라서 세포치료제 수준까지 MSCs를 배양하려면 최소 100cc 이상의 골수조직이 필요하나, 다량의 골수조직을 취득에 따른 위험을 수반하고, 체내에 자원이 풍부한 조직이 아니라는 문제점이 있다. 그러므로 MSCs는 세포치료제로서 안정적인 생물학적 유용성을 유지하고 범용화를 위해서는 체외 배양 기술의 개발과 조직수급 상의 한계점을 극복하여야만 이와 같은 문제점이 해결될 것이다.
또한, MSCs의 대안으로 신생아의 태반과 탯줄에서 추출한 줄기세포 (Erices A, et al., Br. J. Haematol. 109: 235-242, 2000)를 이용하려는 연구가 진행되었으나 MSCs와 필적할만한 유용성과 경제성을 제시하지는 못하는 등 많은 문제점을 야기 시켰다.
그러나 2001년 Zuk (Zuk PA, et al., Mol. Biol. Cell. 13: 4279-4295, 2001)등은 지방조직에서부터 자가 재생능력이 뛰어나고 간, 골, 연골, 지방, 혈관, 심장, 신경계 등 다능 분화능력을 가지는 성체줄기세포인 지방줄기세포(adipose-derived stem cells, ASCs)를 발견 되었으며, ASCs는 골수 기원의 MSCs와 비교하여 자가 재생능력이 뛰어나고 체외 배양이 용이하다는 점과, ASCs를 분리할 수 있는 지방조직이 풍부하고 채취방법이 간단하며, 안전하다는 장점을 가지고 있으며, 기능적인 측면에서의 ASCs는 골수기원의 MSCs와 비교하였을 때도 분화능력, 세포학적 특성, 면역학적 특성, 조직재생능력 등 거의 모든 특성이 동일한 것으로 밝혀졌다. 즉 ASCs는 지방조직 기원의 MSCs로서 불리어 지며, 골수 기원의 MSCs를 대체할 수 있는 높은 가능성을 지닌 줄기세포로서 의학적 유용성이 아주 크게 나타났다.
또한, ASCs는 MSCs와 비교하여 조직 취득과정이 용이하고 안전하며, 조직수급상의 제한이 없는 장점과 체외배양이 용이하여 조직 접근성, 안정성, 유효성, 그리고 경제적 측면에서 골수 기원의 MSCs 보다 우위에 있다.
성체줄기세포 중 ASCs의 특징적인 기능 중 하나가 일반적인 상처를 치유할 수 있는 능력을 가지고 있는 것으로, ASCs와 성숙한 지방세포(adipocyte)는 혈관내피성장인자(vascular endothelial growth factor, VEGF)를 다량 생성하여 분비할 수 있는 세포이며, 또한 이런 세포를 체내에 전달 시 혈관을 생성하고 분화를 촉진할 수 있는 탁월한 기능을 가진다. 또한 ASCs 자체가 혈관내피세포로 직접 분화할 수 있는 특징을 지닌다.
모든 상처수복(wound healing)의 시작은 혈관의 생성부터이며, 손상 부위 내 혈관의 생성 없이는 손상된 조직이 재생되지 않고 손상된 조직과 장기는 그 기능을 다시 회복할 수 없게 된다. 손상 받은 장기 혹은 조직 주위로 ASCs를 주입한 결과 손상된 조직주위로 새로운 혈관이 생성되고 장기 및 조직의 기능이 단기간 내에 복원되는 결과가 동물실험을 통하여 밝혀지면서, 이러한 ASCs의 생물학적 특성을 기반으로 심근경색, 뇌경색, 말초혈관성질환 등의 상처수복 및 조직 재생의 목적으로 ASCs를 세포치료제로 적용하는 임상시험이 진행되고 있다.
지방줄기세포의 분리배양 방법
이는 2001년 Zuk (Zuk PA, et al., Tissue Eng. 7: 211-228, 2001)등에 의해 ASCs의 존재가 밝혀지고, 그 이후 ASCs에 관한 연구들은 모두 이 방법을 이용하여 ASCs를 분리하고 배양하고 있는 것으로, 기존에 사용되는 ASCs 분리, 배양법은 흡입된 또는 절제된 지방을 다시 잘게 부수어 콜라지네이즈로 조직을 분해한 후, 원심분리 과정을 거치면 침전되어 분리되는 혈관간질획분 (stromal vascular fraction, SVF)에서 세포를 배양하는 방법으로, 이 방법은 콜라지네이즈를 처리 후, 약 100cc의 흡입지방조직으로부터 통상 50만개의 세포를 분리할 수 있는 것으로 알려져 있으며, 이는 전체 세포 수의 백만분의 1에 해당하는 세포만을 획득할 수 있는 비효율적인 방법이다.

또한, Clostridium histiolyticum 추출물인 콜라지네이즈는 제조회사와 제조된 batch에 따라 상당한 활성도 차이를 보이며, 결과적으로 효소의 반응온도, 반응시간 등의 분해조건에 따라 최종 획득할 수 있는 세포 수는 상당한 편차를 보이는 등 표준화하기 어려운 단점이 있다.
피부조직에서 섬유모세포(fibroblast)를 분리 배양하는 방법 중 피부를 잘게 부수어 배양용기에 옮겨서 배양하면 진피조직 내에 위치하는 섬유모세포가 배양용기로 이동하여 성장한다. 즉 생물체의 조직을 콜라지네이즈와 같은 조직분해효소를 사용하지 않고 조직단위로 배양하여 특정한 세포를 분리 배양하는 방법을 외식방법(explant method)이라고 한다. 단순하며 효율이 좋은 방법으로 섬유모세포를 분리 배양하는 경우에 가장 널리 이용되는 방법이다.
그러나 지방조직은 조직 내 지방성분이 90% 이상을 차지하는 물리적, 생화학적 특성 때문에 지방조직에 배양액과 같은 수분을 첨가하였을 때 수면위로 상승하는 문제가 발생하여 외식방법(explant method)을 사용할 수 없다. 또한 지방조직을 콜라지네이즈(collagenase)로 분해한 후 원심 분리하면 세포질 내에 지방을 많이 함유하는 성숙한 지방세포 역시 수면위로 상승하는 결과를 초래하여, 많은 조직을 효소로 처리하여 단일 세포를 분리하였어도 원심분리 후 회수할 수 있는 세포 수는 제한적이다.

또한 골수 기원 MSCs와 같이 ASCs는 지지의존성(anchorage-dependent) 특성을 가지는 세포이며, 세포가 부착할 수 있는 기질(substratum) 없이는 세포가 성장할 수 없다. 즉 지방조직뿐 만아니라 조직분해 후 분리한 세포질 내 지방성분을 포함한 세포 또한 배지를 첨가하면 세포가 배지 위로 뜨기 때문에 세포가 배양용기와 부착되지 않아 일반적인 배양방법으로는 증폭 배양할 수 없다.
지방조직의 3차원 배양방법을 통한 지방줄기세포의 배양법
1989년 일본의 Sugihara는 배양용기에 배양액을 가득 채워 지방조직이 배양용기의 천장과 물리적으로 접촉할 수 있는 방법을 고안하였고, 배양용기와 물리적으로 접촉한 지방조직에서 지방전구세포(preadipocyte)가 이동하여 성장할 수 있는 배양방법을 개발하였으며, Sugihara는 이 방법을 "천장방법(ceiling method)"으로 명명하였고(J. Lipid Res., 30:1987, 1989), Sugihara의 방법은 일종의 변형된 외식방법(explant method)이라 할 수 있다.
1987년 Sugihara는 지방조직으로부터 콜라지네이즈로 처리하여 성숙 지방세포를 분리한 후 콜라겐 겔 내에서 지방세포를 3차원 배양하였을 때, 성숙한 지방세포로부터 지방전구세포(preadipocyte)가 분열, 증식하는 사실을 발표하였다 (J. Lipid. Res. 28:1038, 1987). 2001년 Zuk등의 연구결과 발표 이전에는 ASCs는 다양한 이름으로 명명되었고, 그 중 지방전구세포도 이에 포함되었다.
Sugihara의 연구결과는 지방조직 혹은 성숙한 지방세포에 물리적, 공간적으로 지지하고 부착할 수 있는 기질만 제공한다면 지방조직과 성숙 지방세포를 콜라지네이즈 처리과정 없이 ASCs를 분리, 증폭 배양할 수 있다는 사실을 반영한다.

양등이 기술한 미국특허 2907770714에는 세포가 부착, 이동, 성장이 가능한 생체 적합한 하이드로겔 내에 지방조직을 함입시켜 3차원적으로 지방조직과 하이드로겔이 물리적으로 접촉할 수 있도록 한 후 배양하여 ASCs를 분리, 증폭 배양하는 방법이 개시되어 있다.
이 발명은 세포배양 혹은 지방조직의 3차원 배양에 사용되는 하이드로겔은 구성하는 재질을 따라 천연 혹은 합성 고분자로 구성되며, 생체 내에서 분해정도에 따라 생분해 (biodegradation) 고분자와 비분해 (non-degradable) 고분자로 구분할 수 있다. 특히 콜라겐 (collagen), 피브린 (fibrin), 히알루닌산 (hyaluronic acid), 젤라틴 (gelatin)과 같은 천연고분자는 ASCs를 분리배양하기위한 지방조직 3차원 배양의 적절한 하이드로겔의 재료로 사용할 수 있다.
하이드로겔을 구성하는 고분자만을 특이적으로 분해하는 효소인 즉 콜라겐은 콜라지네이즈, 피브린은 혈전용해제인 유로카이네이즈 (urokinase), 스트렙토카이네이즈 (streptokinase), TPA (tissue plasminogen activator), 히아루닌산은 히알루노니데이즈 (hyaluronidase), 젤라틴은 젤라티네이즈 (gelatinase) 혹은 콜라지네이즈를 사용하여 하이드로겔 구성 고분자만을 제거함으로 하이드로겔 내에서 지방조직으로부터 성장한 세포를 손상 없이 분리 회수할 수 있다.
양등이 기술한 미국특허 2907770714의 결과에서 지방조직을 하이드로겔 내에서 3차원 배양한 후 조직에서부터 이동, 성장한 세포를 고분자 특이 분해효소를 이용하여 고분자를 분해시킨 후 얻어진 세포의 특성을 생화학적, 분자생물학적, 면역학적, 그리고 동물실험을 통하여 분석하였을 때 분화능력, 성장능력 그리고 세포학적 특성이 ASCs 정의에 부합하는 결과가 기술되었고, 지방조직을 3차원 배양 방법은 소량의 조직, 냉장 및 냉동된 조직에도 적용할 수 있고, 간단한 과정과 신속성 등의 장점이 있으며, 무엇보다 1cc 지방으로부터 2주 내에 500만개의 ASCs를 배양할 수 있는 높은 효율성을 가지는 특성을 가지고 있으며, 또한 불필요한 과정을 생략할 수 있음으로 체외배양 중에 발생할 수 있는 위험성을 최소화할 수 있는 장점이 제기되었다.
조직 및 세포치료제의 전달방법
골수기원 MSCs 혹은 ASCs와 같은 성체줄기세포, 피부세포, 연골세포 등의 세포치료제를 체내에 전달하는 과정과 방법은 통상적인 배양을 통하여 목적하는 세포 수만큼 체외 증폭한 다음 트립신과 같은 세포 간 결합과 세포와 기질 (matrix) 간 결합에 관여하는 단백질을 분해하는 효소를 처리하여 배양용기에서부터 세포를 분리하여 단일세포성 현탁액(monocellular suspension)을 제조하며, 단일세포 현탁액 형태로 가공된 세포는 환부에 직접 전달하거나, 하이드로겔(hydrogel) 혹은 생체에 적합한 3차원 구조의 담체 (scaffold), 혹은 implant에 혼합 혹은 부착시켜 세포를 체내에 전달하거나, 동물 세포를 3차원 구조의 담체에 파종하여 일정기간 배양하여 제조한 세포성 인공조직, 대표적으로 세포성 인공피부 형태로 제조하여 전달하기도 한다.
생체 조직에서 분리, 증폭한 세포를 생체 내 전달을 위하여 배양용기에서부터 세포를 분리하여 단일세포성 현탁액 형태로 제조하는 공정이 선행되어야 된다. 이 과정은 트립신, 디스페이즈 (dispase), 콜라지네이즈와 같은 단백질 분해효소를 단독 혹은 혼합하여 사용하고 있다. 돼지췌장에서 추출한 트립신이 이중 가장 널리 사용되어지며, 트립신은 세포와 세포간의 접합과 세포와 배양용기 사이의 접합에 관계하는 인테그린 (integrin)과 같은 접합인자를 분해함으로써 세포를 배양용기에서 분리하고 단일세포성 현탁액을 제조한다.
트립신의 세포 분해 과정은 세포 간 그리고 세포와 배양용기 사이에 부착과 접합에 관여하는 단백질뿐만 아니라 세포막과 세포질을 구성하는 단백질도 파괴한다. 즉 과도한 트립신 처리의 결과로 비가역적인 세포손상을 초래하여 세포가 죽음에 이르는 결과를 낳을 수 있다. 또한 트립신 처리 후 원심분리 과정을 통하여 손상을 받지 않은 세포를 다시 분리하여, 이렇게 분리한 세포를 배양용기에 다시 파종하였을 때 배양용기에 부착할 수 있는 세포 수 즉 세포접착률(cell attachment rate)은 다양한 편차를 보인다. 이는 트립신(trypsin)에 대한 세포의 민감성과 세포의 분화 정도 등 세포특성에 따라 많은 차이를 초래하고, 사용한 트립신의 농도, 반응시간 및 반응온도에 따라 동일한 기원, 세포주라도 많은 차이를 나타내며, 또한 트립신 처리 후 단일세포성 현탁액은 냉장상태에서 보관하고 운반하며, 이 과정 중에도 세포 손상은 지속되며 그 손상 정도도 증가된다. 트립신 처리과정은 일정부분 세포에 손상을 줄 수밖에 없고, 손상정도의 차이에 따라 전달 후 세포의 생존율, 성장, 분화 그리고 손상된 조직의 재건의 정도는 차이가 날 수 있다.
기존의 모든 방법은 MSCs와 ASCs을 포함한 모든 종류의 세포치료제는 2차원 배양환경에서 치료수준까지 증폭한 후 트립신을 처리하여 단일세포 현탁액 형태로 제조하는 공정을 거친 후 세포를 부유 상태에서 바로 전달하거나 다양한 운반체를 이용하여 손상부위에 전달한다.

단일세포성 현탁액을 만들기 위한 효소 처리과정에서 주위조직과 그리고 세포간 부착할 수 있는 세포간 접합인자의 손상이 동반되어 있으며, 세포전달의 성공률을 높이기 위해서는 세포간 접합인자의 손상이 없이 증폭 배양한 세포를 바로 전달할 수 있는 방법이 필요하다.
지방조직의 전달방법 및 전달 형태
건강상 혹은 미용 상의 문제 때문에 자기 신체에서 지방을 흡입하여 과다한 체지방을 제거하거나 혹은 제거된 흡입지방을 미용성형 목적으로 다시 주입하는 시술이 이용되어지고 있으나, 흡입된 지방조직을 다시 자기 신체에 다시 주입하여 전달하는 경우에는 흡입된 지방조직의 손상정도, 크기에 따라 전달 성공률이 영향을 받게 된다.
전달한 흡입 지방조직이 완전히 생착되기 위해서는 주위조직에 존재하는 혈관과 전달한 지방조직 내에 있는 혈관과의 융합이 필요하며, 특히 지방조직은 대사과정이 활발하고 산소의존성이 높은 조직으로, 주위조직과의 혈관 연결이 없으면 전달된 지방조직은 저산소증으로 인한 허혈성 괴사에 빠져 전달편이 모두 소실되어 버리고 염증을 유발한다. 즉 주위조직과 주입한 조직에서 양방향으로 혈관이 생성되고 서로 연결되어야만 전달된 조직이 안정적으로 생존과 그 조직기능을 유지할 수 있다.
지방조직 주입(전달)술의 성공률을 높이기 위하여 지방 흡입 시 조직 손상을 최소화 하며 지방을 흡입하기 위한 여러 가지 방법과 기구들이 개발되고 있다. 그러나 지방조직을 채취 후 전달하기 전에 전달 성공률을 높이기 위한 전달방법, 전달 형태, 전달 전의 체외조작과 같은 기술과 방법은 부족한 실정이다.
체외에서 배양한 ASCs를 지방조직과 혼합하여 동시에 전달한 방법이 지방조직만을 단독으로 전달한 방법보다 생착 성공률이 높아진다는 연구결과가 보고 되었다 (Masuda T, et. al., Tissue Eng. 10: 1672-1683, 2004). 즉 Masuda 등의 연구결과는 세포단위의 치료제와 조직단위의 치료제를 혼합한 세포/조직 치료제는 치료제에 포함된 세포가 전달한 조직과 생체 내 주위 조직 간의 세포 접합을 통하여 전달한 조직의 생착에 중요한 가교역할을 담당하는 기능이 제시되었고, 또한 전달 시 혼합한 ASCs에서부터 분비되는 VEGF와 같은 혈관성장인자는 주위조직으로부터의 혈관생성을 촉진함으로 전달한 조직치료제의 생착률을 높인다는 기전이 제시되었다.
지방조직의 3차원 배양에서 하이드로겔 내로 분리 증폭된 ASCs 혹은 섬유모세포는 세포외기질 (extracellular matrix)을 생성하여 하이드로겔 내로 세포외기질을 분비 생성할 수 있다. 또한 지방기원의 세포는 조직재형성 (tissue remodeling)에 관계하는 인자인 기질분해효소(Matrix Metalloproteinase, MMPs) 및 조직기질분해억제효소 (Tissue inhibitor of matalloproteinase, TIMPs)를 분비하여 생체 내 성숙된 세포외기질을 생성할 수 있으며, 또한 지방조직과 지방조직 기원의 세포에서 신생혈관의 형성을 유도하고 촉진할 수 있다.
본 발명은 지방조직을 콜라지네이즈(collagenase)와 같은 효소처리 없이 체외에서 하이드로겔(hydrogel)을 이용하여 3차원 배양한 후 지방조직에서부터 이동, 성장하여 증폭 배양된 ASCs를 포함한 지방조직 기원의 세포들과, 이러한 세포에서 생성하여 분비한 혈관성장인자를 포함한 성장인자 및 세포외기질, 지방조직 그리고 하이드로겔(hydrogel)로 구성된 치료제를 이차적 트립신 처리과정 없이 막과 같은 이식편 형태나 주사기로 흡입하여 손상된 조직 부위에 주입할 수 있는 주입형 형태로 단일공정으로 제조하는 것이다.
이러한 지방조직 치료제의 조성, 제조 방법과 전달방법은 지방조직과 지방조직으로부터 증폭 배양한 세포를 체내에 전달하기 위하여 필요한 모든 2차적 과정을 생략할 수 있다. 즉 신속함과 불필요한 과정을 제거함으로 얻어지는 안전성, 그리고 경제성을 가질 수 있다.The present invention relates to the composition of adipose tissue therapeutic agent, a preparation method thereof and a delivery method thereof, which will be described in more detail, in vitro hydrogel without hydrolysis of enzymes for degrading tissues such as collagenase. After a three-dimensional culture of adipose tissue using the cells, the adipose tissue-derived stem cells (ASCs) including adipose tissue-derived stem cells (ASCs), which are moved and grown from adipose tissue, are produced and secreted from these cells. The present invention relates to a composition for the treatment of adipose tissue, which has a characteristic of being composed of a growth factor and an extracellular matrix, an adipose tissue, and a hydrogel, a preparation method thereof, and a delivery method thereof.
These forms of adipose therapeutics are delivered to damaged tissues and organs to produce new blood vessels of damaged tissues and organs, to regenerate or restore the cells that make up tissues and organs, and to perform the functions of the tissues and organs, It is used as a therapeutic agent to regenerate tissue and restore its function.
In general, damages and defects of tissues and organs due to accidents or diseases may cause secondary complications due to functional deterioration if the tissues and organs are not restored to the same cells and tissues. It is known that tissues and organs can be treated only by transferring part or other tissues and organs of their body to restore their function.
However, when tissues and organs are needed due to an accident or disease, the tissues (organisms) and organs that can be delivered from a part of one's body are limited and other living tissues and organs that are donated have to be used.
However, in this case, even if the supply problems and other organisms (tag tissues) are insufficient compared to the demands, many of them can be caused by causing immune rejection reactions, transmission of diseases, ethical problems and social problems. Problems have arisen.
In the early 1990s, research and development in the field of cell therapy began in earnest in the early 1990s. In 1998, the artificial skin was licensed for sale in the United States, and a full-scale market was formed in 2003. The cumulative expenditures from research investments are estimated to be $ 3-40 billion globally, with investments by private companies expected to reach about $ 1 billion in 1998 and $ 80 billion in 2005. Korea Institute of Science and Technology Information Technology Trend Analysis Report. Domestic cell therapy research began in the late 1990s, and research on artificial skin, cartilage and stem cells has been the focus. The amount of investment in domestic R & D expenditure is not aggregated, but it is estimated that about 20 venture companies are participating in the research, and the research expenses are estimated at 80 to 100 billion won per year. Can be. It is designated as the next generation support project by the government regarding stem cells, bioin factories, and cell therapy products, and it is intensively supporting research funds worth ten billion won annually.
Recently, with the development of basic science, the development of biotechnology has been repeated, and methods for restoring the function by regenerating tissues and organs using stem cells have been attempted. Stem cells are divided into embryonic stem cells and adult stem cells according to their origin cells. Embryonic stem cells are capable of differentiation into pluripotent cells, but they do not completely control differentiation into desired cells and tissues. Due to the risk of causing tumors and ethical and legal limitations, it is difficult to be used for therapeutic purposes as soon as possible.
On the other hand, adult stem cells can be isolated from autologous tissues and cultured in vitro, thereby not only overcoming the limitations of embryonic stem cells, but also physiological and ideal because they can be isolated, cultured and amplified in their own tissues and transferred back to themselves. It can be used as cell therapeutics for therapeutic purposes. In addition, adult stem cells are easy to control differentiation, can not completely exclude the risk of causing tumors, but the possibility is extremely rare, and also has the advantage that there is no ethical, religious, legal restrictions.
Bone marrow cell delivery, that is, hematopoietic stem cell delivery, is one of the most widely used methods for treating diseases by delivering autologous or other adult stem cells, and radiation and chemotherapy for leukemia, aplastic anemia, and solid cancer. It is generally widely used for restoring deteriorated bone marrow function.
In addition to hematopoietic stem cells, adult stem cells of various origins have been found in various organs and tissues, especially mesenchymal stem cells (MSCs, Friedenstein AJ, Int. Rev. Cytol. 47: 327-345, 1976) found in bone marrow tissue . ) Is a multipotent stem cell that is capable of differentiating into cells and tissues of mesodermal origin, as well as cells and tissues of ectoderm origin, such as neurons, and cardiac muscle cells. Unlike hematopoietic stem cells, MSCs have the advantage that they can be cultured and amplified in vitro, which is very likely as a cell therapy product. MSCs have been demonstrated experimentally and clinically by their ability to differentiate into bone cells, chondrocytes, meniscus cells, cardiomyocytes, and neurons and to reconstruct the defective tissues. Clinical trials are being used as cell therapies to rebuild their function. MSCs are being developed as cell therapies to treat osteoporosis, fractures, arthritis, myocardial infarction, congestive heart failure, degenerative and traumatic brain diseases.
MSCs acquire autologous bone marrow tissue from bone marrow, isolate stem cells, and expand and culture in vitro. At least 500 million cells are required for treatment, but MSCs in bone marrow tissue vary with age, but about 1 billion. Only one quarter of the cells are known to be stem cells. In vitro amplification of MSCs is not easy due to the rareness of stem cells in bone marrow tissue.
Therefore, to cultivate MSCs up to the level of cell therapy, at least 100cc or more bone marrow tissue is required, but the risk of acquiring a large amount of bone marrow tissue, there is a problem that the body is not rich in resources. Therefore, MSCs will be solved only by overcoming the limitations of in vitro culture technology and tissue supply and demand for stable bioavailability and generalization as cell therapy.
In addition, as an alternative to MSCs, studies have been made to use stem cells extracted from the placenta and umbilical cord of neonates (Erices A, et al., Br. J. Haematol. 109: 235-242, 2000). It did not provide economics, causing many problems.
However, in 2001, Zuk (Zuk PA, et al., Mol. Biol. Cell . 13: 4279-4295, 2001) has excellent self-renewal ability from adipose tissue, liver, bone, cartilage, fat, blood vessels, heart, nervous system, etc. Adipose-derived stem cells (ASCs), which are adult stem cells with pluripotent differentiation ability, have been found, and ASCs have superior self-renewal ability and in vitro culture compared to MSCs of bone marrow origin, and isolate ASCs. ASCs are rich in fat tissue, simple to collect and safe, and functional in terms of differentiation ability, cytological characteristics, immunological characteristics, and tissue regeneration ability when compared with MSCs from bone marrow origin. Almost all the properties were found to be the same. In other words, ASCs are referred to as MSCs of adipose tissue origin, and have great medical utility as stem cells with high potential to replace MSCs of bone marrow origin.
In addition, ASCs are easier and safer than MSCs in the tissue acquisition process, and are superior to MSCs in bone marrow origin in terms of tissue accessibility, stability, efficacy, and economics due to the advantages of unlimited tissue supply and in vitro culture.
One of the characteristic functions of ASCs among adult stem cells is the ability to heal common wounds. ASCs and mature adipocytes produce large amounts of vascular endothelial growth factor (VEGF). It is a cell that can secrete and also has an excellent function of producing blood vessels and promoting differentiation when these cells are delivered to the body. In addition, ASCs themselves are characterized by the ability to directly differentiate into vascular endothelial cells.
All wound healing begins with the creation of blood vessels, and without the production of blood vessels in the area of injury, the damaged tissue is not regenerated and the damaged tissues and organs cannot restore their function. Myocardial infarction based on the biological properties of these ASCs, based on the biological properties of these ASCs, as ASCs were injected around the damaged organs or tissues, resulting in the formation of new blood vessels around the damaged tissues and the restoration of organs and tissue function in a short period of time. Clinical trials using ASCs as cell therapeutics for wound repair and tissue regeneration, such as cerebral infarction and peripheral vascular disease, are underway.
Isolation and Culture Method of Adipose Stem Cells
The existence of ASCs was revealed by Zuk (Zuk PA, et al., Tissue Eng. 7: 211-228, 2001) in 2001. Since then, all studies on ASCs have isolated and cultured ASCs using this method. In the conventional ASCs separation and culturing method, the inhaled or excised fat is crushed again to break down the tissue into collagenase, and then centrifuged to precipitate and separate the stromal vascular fraction (SVF). This method is known to be able to separate 500,000 cells from about 100cc of inhaled adipose tissue after treatment with collagenase, which is one millionth of the total cell number. This is an inefficient method of obtaining only the corresponding cells.

In addition, Clostridium histiolyticum extract collagenase shows a significant difference in activity depending on the manufacturer and the batch prepared. As a result, the number of cells that can be finally obtained varies significantly depending on the degradation conditions such as reaction temperature and reaction time of the enzyme. There are drawbacks that are difficult to standardize.
In the method of separating and culturing fibroblasts from skin tissues, the skin is broken into small pieces and transferred to a culture vessel, whereby fibroblasts located in the dermal tissue are moved to the culture vessel and grow. That is, the explant method is a method of separating and culturing a specific cell by culturing the tissue of an organism in a tissue unit without using a histolytic enzyme such as collagenase. It is the most widely used method for separating and culturing fibroblasts in a simple and efficient manner.
However, due to the physical and biochemical properties of the fat tissue in the tissues, which account for more than 90% of the adipose tissue, when the aquatic tissue is added to the water, such as a culture solution, a problem of rising to the surface of the adipose tissue cannot be used. In addition, centrifugation after digestion of adipose tissue with collagenase (collagenase) also results in the rise of mature fat cells, which contain a lot of fat in the cytoplasm, above the water surface. The number of cells that can be recovered after isolation is limited.

Also, like MSCs of bone marrow origin, ASCs are anchorage-dependent cells, and cells cannot grow without a substratum to which cells can attach. That is, not only adipose tissue but also cells containing fat components in the cytoplasm separated after tissue decomposition also added to the medium, the cells float on the medium, so the cells do not adhere to the culture vessel and cannot be amplified and cultured in the normal culture method.
Cultivation of Adipose Stem Cells through Three-Dimensional Culture of Adipose Tissue
In 1989, Sugihara of Japan devised a method in which adipose tissue was brought into physical contact with the ceiling of a culture vessel by filling a culture vessel with a culture medium, and the preadipocytes moved from the adipose tissue in physical contact with the culture vessel. Sugihara named this method "ceiling method" ( J. Lipid Res. , 30: 1987, 1989), and Sugihara's method is a modified eating out method. explant method).
In 1987, Sugihara discovered that preadipocytes divide and proliferate from mature adipocytes when three-dimensional culturing of adipocytes in collagen gel after treatment with collagenase from adipose tissue. ( J. Lipid. Res. 28: 1038, 1987). Prior to the publication of Zuk's research in 2001, ASCs were named under a variety of names, including progenitor cells.
Sugihara's findings indicate that aSCs can be isolated, amplified and cultured in adipose tissues and mature adipocytes without collagenase treatment provided they provide a substrate that can physically and spatially support and adhere to adipose tissue or mature adipocytes. Reflect.

US Patent No. 2907770714 described by Yang et al. Incorporates adipose tissue into a biocompatible hydrogel capable of attaching, moving, and growing cells to allow physical contact between the adipose tissue and the hydrogel in three dimensions, followed by culturing to isolate ASCs. And amplification culture methods are disclosed.
The present invention is a hydrogel used for cell culture or three-dimensional culture of adipose tissue is composed of natural or synthetic polymers depending on the material, and biodegradation polymer and non-degradable depending on the degree of degradation in vivo ) Can be classified into a polymer. In particular, natural polymers such as collagen, fibrin, hyaluronic acid, and gelatin can be used as a suitable hydrogel material for adipose tissue three-dimensional culture for isolating ASCs.
The enzyme that specifically degrades only the polymer constituting the hydrogel, that is, collagen is collagenase, fibrin is a thrombolytic agent eurokinase, streptokinase, TPA (tissue plasminogen activator), and hyaluronic acid is hyaluronic acid. Nonidases (hyaluronidase), gelatin can be removed without damage to the cells grown from adipose tissue in the hydrogel by removing only the hydrogel constituent polymer using gelatinase (gelatinase) or collagenase.
According to the results of U.S. Patent 2907770714 described by Yang et al., The characteristics of the cells obtained after the three-dimensional culture of adipose tissues in a hydrogel and then the cells that have been moved and grown from the tissues by using a polymerase-specific degrading enzyme are decomposed. The results of differentiation, growth capacity and cellular characteristics in accordance with the definition of ASCs have been described in biological, immunological, and animal experiments. It can be applied to the process, and has the advantages of simple process and rapidity. Above all, it has a high efficiency of culturing 5 million ASCs in 2 weeks from 1cc fat, and also can skip unnecessary processes. This raises the advantage of minimizing the risks that can occur during in vitro culture.
Method of delivery of tissue and cell therapy
Processes and methods for delivering cell therapeutics such as adult stem cells, skin cells, and chondrocytes, such as bone marrow origin MSCs or ASCs, to amplify the desired number of cells in vitro through normal culture, and then to promote intercellular binding such as trypsin. By treating enzymes that break down proteins involved in binding between cells and the matrix, cells are separated from the culture vessel to produce a monocellular suspension, and cells processed in the form of a single cell suspension are directly in the affected area. Transfer the cells into the body by delivery or by mixing or attaching to a hydrogel or a 3D structure suitable for a living body (scaffold), or implant, or incubated for a certain period of time by sowing animal cells in a 3D structure carrier It is also manufactured and delivered in the form of cellular artificial tissue, typically cellular artificial skin.
The process of separating and amplifying cells from living tissue and preparing them in a single cell suspension form by separating the cells from the culture vessel for delivery in vivo should be preceded. This process uses proteolytic enzymes such as trypsin, dispase and collagenase, either alone or in combination. Trypsin extracted from porcine pancreas is the most widely used, and trypsin isolates cells from culture vessels by degrading integrin-like conjugates involved in cell-to-cell and cell-to-culture vessels. Prepare a cellular suspension.
Trypsin's cytolytic processes destroy not only the proteins involved in adhesion and conjugation between cells, but also between cells and culture vessels, as well as the proteins that make up the cell membrane and cytoplasm. In other words, excessive trypsin treatment may result in irreversible cell damage resulting in cell death. In addition, after trypsin treatment, undamaged cells are separated again through centrifugation, and when the cells are sown again, the number of cells that can attach to the culture vessel, that is, the cell attachment rate, is It shows various deviations. This causes a lot of difference in cell characteristics such as cell sensitivity and differentiation of trypsin, and shows many differences in the same origin and cell line according to the concentration of trypsin, reaction time and reaction temperature. After treatment, single cell suspensions are stored and transported refrigerated, during which the cell damage persists and the extent of the damage is increased. Trypsin treatment may inevitably damage cells, and depending on the degree of damage, the survival rate, growth, differentiation, and reconstruction of damaged tissue may differ after delivery.
All existing methods of cell therapy, including MSCs and ASCs, are amplified to the therapeutic level in a two-dimensional culture environment and processed into trypsin to form single cell suspensions. Various carriers are used to deliver the damaged area.

Enzyme treatment to make single cell suspension is accompanied by damage of intercellular junctions that can adhere to the surrounding tissues and between cells, and amplification culture without damage of intercellular junction factors is required to increase the success rate of cell transfer. There is a need for a method that can deliver cells immediately.
Delivery method and form of adipose tissue
Due to health and cosmetic problems, the procedure of inhaling fat from the body to remove excess body fat or injecting the removed inhaled fat for cosmetic molding purposes has been used. In case of delivery, the success rate is affected by the degree of damage and size of inhaled adipose tissue.
In order for the inhaled adipose tissue to be completely engrafted, it is necessary to fuse the blood vessels in the surrounding tissues with the blood vessels in the delivered adipose tissue.In particular, the adipose tissue is a tissue with active metabolism and high oxygen dependence. Without a connection, the delivered adipose tissue falls into ischemic necrosis due to hypoxia, and all of the delivery pieces are lost and cause inflammation. In other words, blood vessels are generated in both directions from the surrounding tissues and the injected tissues and connected to each other so that the delivered tissues can stably survive and maintain their tissue functions.
In order to increase the success rate of adipose tissue injection (delivery), various methods and devices for inhaling fat and minimizing tissue damage during liposuction are being developed. However, there is a lack of techniques and methods such as delivery methods, delivery forms, and in vitro manipulation before delivery to increase the success rate of fat tissue before delivery.
In vitro studies have shown that ASCs cultured in vitro and admixed with adipose tissue result in higher engraftment success rates than adipose tissue alone (Masuda T, et. Al., Tissue Eng . 10: 1672-1683). , 2004). In other words, Masuda et al.'S research suggests that a cell / tissue therapeutic agent, which is a combination of cell- and cell-based therapies, is an important crosslinker in the engraftment of tissues delivered through cell junctions between the tissues delivered by the cells contained in the drug and the surrounding tissues in vivo. It has been suggested that the vascular growth factors such as VEGF secreted from the mixed ASCs during delivery may increase the engraftment rate of the delivered tissue therapy by promoting angiogenesis from surrounding tissues.
ASCs or fibroblasts isolated and amplified into hydrogels in a three-dimensional culture of adipose tissue can produce extracellular matrix to secrete extracellular matrix into the hydrogel. Adipocytes also secrete matrix metalloproteinases (MMPs) and tissue inhibitors of matalloproteinases (TIMPs), which are factors involved in tissue remodeling. It can produce stroma and also induce and promote the formation of neovascularization in adipose tissue and cells of adipose tissue origin.
The present invention is a three-dimensional culture of adipose tissue using hydrogel in vitro without enzymatic treatment such as collagenase (collagenase) cells of adipose tissue origin, including ASCs cultured and grown from adipose tissue and then grown and amplified from adipose tissue. And therapeutic agents consisting of extracellular matrix, adipose tissue and hydrogel, including growth factor and vascular growth factor produced and secreted by these cells, by inhalation with a membrane-like graft or syringe without secondary trypsin treatment. It is manufactured in a single process in an injection form that can be injected into the tissue site.
The composition, preparation method, and delivery method of the adipose tissue therapeutic agent can omit all secondary processes necessary to deliver amplified cultured cells from adipose tissue and adipose tissue into the body. In other words, it can have the safety and economics that are obtained by speeding up and eliminating unnecessary processes.

삭제delete

본 발명은 상기 종래기술의 문제점을 해결하기 위해서 발명한 것으로, 생물체의 지방조직을 체내에 전달하였을 때 전달 성공률을 높이고 손상된 조직의 혈관생성을 증가시키며 조직의 재생을 촉진할 수 있는 지방조직 치료제에 관한 것으로 지방조직 치료제의 조성, 제조 방법과 공정, 그리고 전달방법을 개발함으로서 본 발명이 완성된다. The present invention has been invented to solve the problems of the prior art, when delivering the adipose tissue of the organism in the body to increase the success rate of delivery, increase the angiogenesis of damaged tissue and promote the tissue regeneration The present invention is completed by developing a composition, a manufacturing method and a process, and a delivery method of an adipose tissue therapeutic agent.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 지방조직을 콜라지네이즈와 같은 효소처리 과정 없이 체외에서 하이드로겔을 이용하여 3차원 배양한 후 지방조직에서부터 이동, 성장하여 증폭 배양된 줄기세포를 포함한 기타 지방조직 기원의 세포들과, 이러한 세포에서 생성하여 분비한 혈관성장인자를 포함한 성장인자 및 세포외기질, 지방조직 그리고 지방조직의 배양을 위하여 사용하는 하이드로겔은 생체에 무해하며 세포의 이동, 성장과 분화를 지지할 수 있는 생체에 적합한 재질은 모두 사용할 수 있는 하이드로겔로 구성되어지는 특성을 지니고 있는 지방조직 치료제의 조성, 이들 제조방법 및 그의 전달 방법에 관한 것이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 지방조직에서 조직을 분해하여 단일세포 부유액을 제조하기 위한 콜라지네이즈 처리과정 없이 지방조직을 하이드로겔 내에서 3차원 배양하여 ASCs를 증폭 배양하고, 하이드로겔 내로 성장한 ASCs 및 기타 지방조직 기원의 세포에서부터 생성 분비되는 혈관성장인자 및 세포외기질이 하이드로겔 내로 침착되어 구성되는 지방조직 치료제의 조성, 제조방법과 전달방법을 제시하고자 한다.
보다 상세히 설명하면,
1. 지방조직 치료제의 제조 및 조성:
흡입된 지방조직 혹은 절제한 지방조직은 1~10 mm³크기의 절편으로 자른 다음 지방조직을 생체적합성 하이드로겔(hydrogel) 내에 함입시켜 3차원 배양하여 하이드로겔 내에 지방조직, 지방조직기원의 세포, 혈관성장인자, 세포외기질을 포함한 지방조직 치료제를 제조하는 방법이다.

2. 지방조직 치료제의 전달방법:
본 특허에서는 지방조직의 하이드로겔 내에서 3차원 배양한 후 배양용기에서부터 지방조직 치료제를 물리적인 방법으로 떼어내어 막과 같은 형태인 지방조직 치료제와 하이드로겔만을 특이적으로 분해하는 효소를 처리함으로 하이드로겔의 점도를 낮추어 주사기로 전달할 수 있는 주입형의 지방조직 치료제를 제조하는 방법이다.
이하, 본 발명을 구체적 내용은 다음의 실시 예에 의해 상세히 설명한다.
[1] 지방조직
본 발명에서 지방조직은 동물성 조직을 말하며, 지방조직은 신선한 조직뿐만 아니라, 이송 및 처리 과정에 조직손상을 최소화하기 위하여 단기간 동안 냉장보관, 빙점 이하, 더 구체적으로 영하 80℃ 이하에서 반영구적으로 동결 보관된 조직을 모두 포함하며, 지방조직이란 성숙한 지방세포와 이를 둘러싸는 결체조직으로 구성된 것을 말하며, 지방조직은 체내 위치에 상관없이 모두 포함하며, 피부하지방(subcutaneous fat), 위장간에 위치하는 지방조직(omentum, mesentery), 골수지방조직(bone marrow fat tissue), 후복강 지방조직(retroperitoneal fat)등 모두를 포함한다.
또한, 본 발명에 사용한 지방조직은 지방을 채취할 때 사용되는 모든 방법들에 의하여 얻어지는 모든 지방조직을 포함하는 것으로, 흡입된 지방, 부분적 절개된 지방, 위장간 지방조직처럼 부분 혹은 완전 절제된 지방조직을 모두 포함된다.
절재 혹은 흡입한 지방조직은 직경이 0.1~ 10 mm³ 크기로 잘게 썰어 사용하며, 섬유막, 혈관, 응고된 혈액, 괴사된 조직 등 비지방성 조직은 제거한다.
생리적 용액을 이용하여 지방조직을 반복 세척하고 세척과정에서 생리적 용액 밑으로 침전되는 모든 조직은 반복하여 제거한다. 생리적 용액이 깨끗하고 투명해 질 때까지 세척을 반복한다. 생리적 용액이 깨끗해지면 상층에 뜨는 지방조직만을 수거하여 무균 용기에 옮긴다.
사용한 생리적 용액은 생리적 식염수, PBS (phosphate buffered saline), 혈청을 포함하지 않는 것으로, 예를 들어 DMEM, RPMI, DMEM:F12, F12과 같은 동물세포를 배양할 때 사용할 수 있는 배양액을 사용할 수 있다. 세척 및 하이드로겔(hydrogel)제조과정에서 지방조직의 보존을 위하여 플락토스, 글루코스, 콘드로이틴, 폴리페놀(fructose, glucose, chondroitin, polyphenol) 등 조직 보존제 및 항생제를 포함하여 사용할 수 있다.
[2] 하이드로겔의 제조과정
본 발명에 사용한 하이드로겔은 85% 이상 수분과 0.01 ~ 15 중량%의 겔을 형성할 수 있는 생체에 적합한 고분자로 구성되며, 이러한 고분자는 천연 고분자인 콜라겐 (collagen), 젤라틴 (gelatin), 콘드로이틴 (chondroitin), 히알루로닉 산 (hyaluronic acid, hyaluronan), 알지닌산 (alginic acid), 메트리젤 (MatrigelTM), 키토산 (chitosan), 피브린 (fibrin)등을 포함하는 생체 고분자들 뿐만 아니라, 합성 고분자로 구성된 하이드로겔(hydrogel)은 PGA (polyglycolic acid), PLA (polylactic acid), PEG (poly ethyleneglycol), 폴리아크릴아마이드 (polyacrylamide) 등이 있으며, 또한, 하이드로겔 (hydrogel)은 VEGF (vascular endothelial growth factor), bFGF (basic fibroblastic growth factor), EGF (epithelial growth factor), IGF (insulin-like growth factor), PDGF(platelet-derived growth factor), TGF(transforming growth factor)등 성장촉진인자, 호르몬, 항생제를 포함하여 제조하여 사용할 수도 있다.
이상과 같은 이러한 모든 천연, 합성, 혹은 혼합 고분자로 구성된 하이드로겔(hydrogel)은 천연 혹은 합성 고분자 단독 혹은 혼합하여 사용할 수도 있으며, 조직에 독성이 없어야 되며 조직에서 세포의 이동과 성장, 분화를 지지할 수 있어야 되며, 생체 내에서 분해되어야 된다.
- 콜라겐
콜라겐 겔은 인체기원, 동물 기원성 콜라겐을 모두 포함하는 것으로, 콜라겐은 0.1 ~ 3 중량%로 사용한다. 겔을 형성하기 위하여 화학적 가교제(cross-linker)를 사용하거나 온도 및 pH를 중성으로 조합하여 겔을 제조할 수 있다.
- 피브린
피브린은 동물 혹은 인간 기원의 피브리노젠 (fibrinogen)과 트롬빈을 사용하여 제조한다. 피브리노겐은 0.01 ~ 10 중량%에서 사용될 수 있으나, 세포의 이동과 성장에 적합한 0.1 ~ 1 중량% 사이가 가장 적합하다. 트롬빈은 ml당 0.01 ~100 unit을 사용할 수 있으나, 안전적이고 균일한 하이드로겔(hydrogel)을 만들기 위하여 ml당 0.1 ~ 10 unit가 적당하며. 또한 트롬빈과 더불어 혈액응고인자인 Factor XIII을 첨가하여 사용할 수 있다.
[3] 지방조직 치료제의 제조방법
1) 지방조직 및 하이드로겔 혼합체의 제조 과정
상기 지방조직에서와 같이, 지방조직을 직경이 0.1~ 5 mm³ 크기로 잘게 썰어 사용하며, 섬유막, 혈관, 응고된 혈액, 괴사된 조직 등 비지방성 조직은 생리적 용액으로 세척하여 제거한다.
생리적 용액을 이용하여 지방조직을 반복 세척하고 세척과정에서 생리적 용액 밑으로 침전되는 모든 조직은 반복하여 제거한다. 생리적 용액이 깨끗하고 투명해 질 때까지 세척을 반복한다. 생리적 용액이 깨끗해지면 상층에 뜨는 지방조직만을 수거하여 무균 용기에 옮긴다.
하이드로겔을 만들기 위하여 사용하는 용액은 생리적 용액이면 모두 사용 가능하다. 생리적 용액은 생리적 식염수, PBS, 혈청을 포함하지 않는 예를 들면 DMEM, RPMI, DMEM:F12, F12과 같은 동물 세포를 배양할 때 사용할 수 있는 배양액을 사용할 수 있다. 그러나 이런 생리적 용액에 국한된 것은 아니다.
잘게 썬 지방조직을 일정한 부피로 생리적 용액과 혼합하여 지방조직이 골고루 분산되도록 하고, 하이드로겔을 형성하는 가교제는 지방조직이 분산된 용액 혹은 하이드로겔을 형성할 수 있는 천연 혹은 고분자 용액에 첨가한다. 지방조직, 고분자, 가교제를 한 용기에 같이 담아 골고루 혼합한다. 혼합의 정도는 저온에서 시행하거나 혹은 가교제 농도를 조정해서 겔의 형성속도를 조정한다.
하이드로겔에 포함된 지방조직은 실온 내지 37℃ 사이에서 완전히 중합하여 겔을 형성한다. 하이드로겔을 구성하는 고분자와 가교제의 농도에 따라 중합되어 겔을 형성하는 시간이 결정되지만 1시간 ~2시간 사이, 보통 10 분 ~ 30 분 사이에 중합되도록 고분자, 가교제의 농도와 반응온도 및 반응시간을 결정한다.
2) 지방조직 및 하이드로겔 혼합체의 배양과정
상기의 혼합된 고분자, 가교제, 지방조직을 배양용기에다 옮긴다. 하이드로겔 내로 지방조직이 완전히 감싸도록 하이드로겔 용량을 결정한다. 예를 들면, 지방조직 1 gm 당 1cc에서 100 cc로 사용할 수 있으나, 통상 1gm 지방 조직 당 5~20 cc 용량의 하이드로겔이 적합하다. 또한, 지방조직을 포함한 하이드로겔의 두께는 0.1 ~ 5 cm까지 제조할 수 있으나, 0.2 ~ 0.5 cm 사이가 적합하다.
배양용기는 세포배양을 위하여 사용되는 폴리스타일렌 (polyethylene), 유리로 구성된 용기 등 동물 세포 및 세균을 배양할 때 사용될 수 있는 모든 용기를 포함하며, 또한 특정한 모양을 만들기 위해 제작된 배양 용기도 모두 포함한다.
도1은 지방조직의 선택, 불필요한 조직의 제거, 세척, 하이드로겔 내로 지방조직의 함입, 지방조직의 3차원 배양 등 지방조직 치료제 제조 공정에 대한 모식도이다.
3) 지방조직 및 하이드로겔 혼합체의 3차원 배양을 통한 지방조직 치료제 제조
지방조직이 움직이지 않고 배양액을 첨가 했을 때 수면위로 뜨지 않을 정도로 하이드로겔이 중합되면 세포 배양액을 첨가한다. 세포 배양액은 DMEM, RPMI, alpha-MEM, F12, F10, DMEM:F12 배지에 무혈청 혹은 1 ~30 부피% 동물성 혹은 인간 혈청을 첨가하여 사용한다. 세포 배양액에는 gentamicin, penicillin, streptomycin, ciprobay 등의 세균의 성장을 억제할 수 있는 항생제를 포함할 수 있다. 예시된 배양액의 조성에 국한된 것은 아니며, 동물 세포를 배양할 때 사용하는 모든 배양액과 혈청을 포함한 첨가물은 모두 사용될 수 있다.
본 발명에 사용한 세포 배양액은 VEGF(vascular endothelial growth factor), bFGF (basic fibroblastic growth factor), EGF(epithelial growth factor), IGF(insulin-like growth factor), PDGF(platelet-derived growth factor), TGF(transforming growth factor)등 성장촉진인자, 호르몬, 항생제, 비타민 등을 첨가하여 사용할 수도 있다.
하이드로겔에 포함된 지방조직이 충분히 세포 배양액에 잠길 정도로 세포 배양액을 첨가한다. 세포 배양액을 첨가한 후, 하이드로겔 내에 포함된 지방조직은 37℃ 인큐베이터에 넣어 배양하며, 이때 세포 배양액이 건조되지 않도록 습도의 조건을 50 ~90 부피% 정도의 습기를 제공되도록 한다. 또한, 배양 중에 pH를 유지하기 위하여서는 5 부피% 이산화탄소를 제공하여야 하며, 85 ~ 95 부피%는 실내 공기 혹은 0 ~ 10 부피% 산소를 제공한다. 세포 배양액은 통상 1 ~ 5일에 한 번씩 신선한 세포 배양액으로 교체한다. 하이드로겔 내부로의 물질 및 가스 교환을 촉진하기 위하여 지방조직 및 하이드로겔이 포함된 배양용기를 shaker 위에 높고 1 ~ 100 rpm 속도에서 천천히 흔들어 준다.
4) 지방조직 치료제 구성 세포의 특성
지방조직으로부터 배양 1일째부터 세포가 하이드로겔 내로 성장하는 모습을 현미경으로 관찰할 수 있었으며 (도 2), 1주일간 배양한 후 성장 증폭한 세포를 하이드로겔을 선택적으로 분해하는 효소로 처리한 후 성장 증폭한 세포의 특성을 규명하였다. 즉 콜라겐으로 하이드로겔을 제조한 경우는 0.01 ~ 0.1% 콜라게네이즈로 피브린으로 제조한 하이드로겔은 100~10,000 unit 유로카이네이즈로 처리하여 하이드로겔만 선택적으로 분해 시켜 하이드로겔 내부로 성장한 세포를 분리하여 세포표면학적 특성과 분화능력을 조사하였다.
(4-1) 세포표면학적 특성
하이드로겔로부터 분리한 세포를 PBS로 2회 세척하였다. 세포를 5x105 세포/200 ㎕ 농도로 PBS의 농도로 부유시킨 후 각 항체를 10㎕씩 첨가하고 15분간 암실에서 반응시켰다. 그 후 PBS로 2회 세척하고 500㎕ PBS로 세포를 분산시킨 후 유세포분석기 (flow cytometry, FACS Calibur, Becton Dickinson)로 분석하였다.
도3에 나타난 바와 같이, 하이드로겔에서 분리한 세포는 CD13, CD31, CD34, CD45 항원에 대한 항체에는 음성반응으로 조혈계 세포 및 혈관내피세포 기원이 아닌 것을 확인할 수 있었으며, CD3, CD4, CD8, CD19 항원에 대한 항체에도 음성반응으로 림프계열 기원의 세포가 아닌 것을 확인하였고, 지방 기원의 줄기세포에서 발현되는 CD29, CD44, CD90, CD105 항원에 대한 항체에는 양성 반응을 보여 하이드로겔 내로 성장한 세포는 ASCs와 동일한 세포표면학적 특징을 가진 것을 확인할 수 있었다.
(4-2) 지방조직 치료제 구성 세포의 골모세포, 지방세포, 혈관내피세포로의 분화능
하이드로겔 내로 성장한 세포를 5x104 세포/cm2 농도로 12-well 배양용기에 파종하였다. 세포가 배양용기에 90% 밀도로 성장할 때까지 10% 송아지 혈청 (calf serum, CS)이 포함된 DMEM 배지로 배양하였으며, 세포가 90% 밀도에 도달된 후 특정 세포로의 분화를 유도하는 배지로 교환한 후 2주간 배양하였다. 10 mM b-glycerol phosphate, 50 mg/ml ascorbic acid, 0.1 mM dexamethasone, 10% CS이 포함된 a-MEM 배지는 골모세포 (osteoblast)로의 분화유도 목적으로 사용하였고, 지방세포로의 분화를 유도하기 위하여 1 mM dexamethasone, 80 mM indomethacin, 100 mg/ml 3-isobutyl-1-methylxanthine, 10% CS가 포함된 DMEM 배지를 이용하였으며, 혈관내피세포로의 분화를 유도하기 위하여 하이드로겔에서 분리한 세포를 5x104 세포/cm2 농도로 MatrigelTM (Becton Dickinson)이 도포된 12-well 배양용기에 파종한 후 10 ng/ml VEGF 및 2% CS을 포함한 DMEM:F12 1:1 mixture 배지를 이용하였다.
지방조직의 3차원 배양으로 분리한 세포의 분화정도의 확인은 세포 내 무기질화 (mineralization)는 alizarin red 염색으로 조사하여 골모세포로의 분화를 확인하였으며, 세포질 내로의 지방침착은 sudan black 염색으로 검사하여 지방세포로의 분화를 확인하였다. 또한 골모세포로의 분화는 골모세포에서 특이적으로 발현되는 alkaline phosphatase (ALP), collagen type I, osteopontin, osteocalcin 등의 mRNA 발현은 역전사효소 중합효소반응 (reverse transcriptase polymerase chain reaction) 방법을 이용하여 확인하였으며, 지방세포의 경우는 lipoprotein lipase (LPL), peroxisome proliferated-activated receptor gamma (PPAR-g) mRNA 발현을 RT-PCR 방법으로 확인하였다. 혈관내피세포로의 분화는 모세혈관 형성도와 세포에서 CD31, VE-Cadherin, Flk-1, Factor VIII 단백질 발현으로 검증하였다.
도4에서 나타난바와 같이, 2주간 분화유도 배지에서 배양한 후 골모세포로의 분화는 세포 사이에 무기질의 침착과 ALP, collagen type I, osteopontin, osteocalcin mRNA 발현을 확인함으로, 지방조직의 3차원 배양에서 하이드로겔 내로 성장한 세포는 골모세포로의 분화능력을 확인하였다.
도5에서 나타난바와 같이, 2주간 지방세포로의 분화유도 배지에서 2주간 배양한 후 세포는 세포질 내로 지방이 축적되는 것을 sudan black 염색으로 확인하였으며, 지방세포에 특이적으로 발현되는 LPL, PPAR-g mRNA 발현이 검출되어, 지방조직의 3차원 배양에서 하이드로겔 내로 성장한 세포는 지방세포로의 분화능력을 확인하였다.
도6에서 나타난 바와 같이, Matrigel 표면에서 VEGF 투여로 파종된 세포는 24시간 내에 모세혈관 형태로 재배치되었으며, 2주간 배양 후 세포표면에 혈관내피세포에 특이한 단백질인 CD31, Factor VIII, Flk-1, VE-cadherin 단백질이 발현되었고, 이상의 결과는 지방조직 치료제를 구성하는 세포는 혈관으로 분하할 수 있는 능력을 확인하였다.
지방조직의 3차원 배양방법으로 지방조직에서 하이드로겔 내로 성장한 세포는 골모세포, 지방세포, 혈관내피세포로의 분화능력을 확인하여, 하이드로겔 내에 있는 세포는 지방조직 기원의 줄기세포임을 확인하였다.
5) 세포외기질을 포함한 지방조직 치료제
지방조직으로부터 하이드로겔 내로 세포가 이동하여 성장하기 시작하면 전체 하이드로겔(hydrogel)의 10 ~ 100 면적%까지 세포가 성장할 때까지 배양한다. 또한 지방조직에서부터 성장한 세포에서부터 혈관성장인자 및 세포외기질이 생성 분비되어 하이드로겔 내로 침착되도록 배양한다. 지방조직에서부터 하이드로겔 내로의 세포 성장은 지방조직의 상태와 지방조직과 하이드로겔의 용적 비율에 의하여 결정되나, 지방조직과 하이드로겔의 용적 비율이 1:1인 경우는 1주간의 배양기간이며 하이드로겔 100% 면적까지 세포성장이 도달된다.
도7에서 나타난바와 같이 지방조직을 피브린에서 1주간 3차원 배양하면 하이드로겔 면적의100%까지 지방조직에서 이동, 성장한 세포가 차지하는 것을 확인할 수 있었다.
하이드로겔 내의 콜라겐 생성은 지방조직 및 하이드로겔 혼합체를 1주간 배양한 후 생성한 지방조직 치료제를 4% 포르말린에 고정한 후 파라핀 블록을 제조하였다. 4 mm 두께의 조직 절편으로 박절한 후 파라핀을 제거하고, 함수 및 탈수 과정을 거친 후, 조직절편은 Masson Trichrome 염색으로 지방조직 치료제 내의 콜라겐 생성여부를 확인하였다.
도8에 나타난 바와 같이 막 구조의 지방조직 치료제 내부에 지방으로부터 성장한 세포와 하이드로겔과 세포 사이에 침착된 콜라겐 섬유를 확인할 수 있었으며, 지방조직에서 기원한 줄기세포는 세포외기질 중 중추적 골격 단백질인 콜라겐 섬유를 생성 능력을 검증하였으며, 또한 하이드로겔 내로의 3차원 배양공정을 통하여 지방조직으로부터 줄기세포의 증폭 배양과 동시에 세포외기질을 단일 공정으로 생성할 수 있는 것을 확인하였다.
6) 혈관생성인자를 포함한 지방조직 치료제
지방조직과 지방기원의 줄기세포는 혈관생성에 관여하는 인자 중 VEGF, bFGF, HGF, TGF 등과 같은 주요 혈관생성인자를 생성, 분비하는 능력이 밝혀져 있다. 1주간 배양한 지방조직 치료제를 PBS로 3차례 세척한 후 지방조직에서부터 성장한 세포와 3차원 배양한 지방조직을 하이드로겔로부터 분리하였다. 원심분리 후 침전되는 세포와 배지위로 뜨는 지방조직을 각각 분리하여 수거한 후 분리한 세포와 지방조직에서부터 각각 RNA를 추출하였다. 추출한 RNA는 RT-PCR 방법을 이용하여 VEGF, bFGF, HGF, TGF 특이 mRNA를 증폭시킨 후 발현정도를 조사하였다. 3차원 배양 전의 지방조직, 근모세포주인 C2C12 세포주 및 인간 섬유모세포를 혈관생성인자 발현 연구를 위한 대조 샘플로 이용하였다.
도9에 나타난 바와 같이 하이드로겔 내로 성장한 세포와 1주일간 3차원 배양한 지방조직에서 혈관성장인자인 VEGF, bFGF, HGF, TGF mRNA가 발현되는 것을 확인할 수 있었으나, 반면 근모세포주인 C2C12와 섬유모세포에서는 VEGF, bFGF, HGF 등의 mRNA 발현은 나타나지 않았다. 또한 1주간 3차원 배양한 지방조직에서도 VEGF, bFGF, HGF, TGF 등의 mRNA 발현은 유지되었고, 배양 전 지방조직과 비교하여 발현의 차이는 보이지 않았다.
지방조직의 하이드로겔 내에서 3차원 배양방법은 지방조직에서부터 하이드로겔 내로 성장한 세포로부터 세포외기질인 콜라겐 섬유가 생성되며, 또한 지방조직 및 지방조직 기원의 세포에서부터 혈관생성인자인 VEGF, bFGF, HGF 등이 생성되어, 지방조직 치료제의 생물학적 기능을 보강하는 과정을 단일 공정으로 제조할 수 있는 기술이다.
7) 혈관구조를 포함한 지방조직 치료제
지방조직은 99% 이상이 성숙한 지방세포로 구성되어져 있으며, 혈관을 포함한 간질 조직이 나머지 1% 차지한다. 연부조직 결손 시 지방조직은 생물적 충진제로 널리 사용되고 있다. 지방조직의 3차원 배양 과정에서 지방조직 내부로의 가스 및 영양분 공급이 제공되지 않으면 지방조직을 구성하는 세포는 죽음에 이르게 되어 생물학적 충진제 혹은 치료제로서 그 기능이 소실되거나 혹은 감소될 수 있다. 하이드로겔 내에서 1주간 배양하여 제조한 지방조직 치료제를 4% 포르말린에 고정한 후 파라핀 블록을 제조한 후 조직검사를 시행하여 지방조직의 손상여부를 조사하였다.
도10에서 나타난 바와 같이, 하이드로겔에 인접한 지방조직 내 지방세포는 1주일 동안의 배양이후에도 세포막 및 핵 등 세포학적 구조가 완벽히 유지되어 있었으나, 지방조직의 내부로 갈수록 지방세포의 핵이 소실되고 세포막의 구조가 파괴되는 즉 지방세포가 변성되는 소견이 관찰되었다. 그러나 지방조직 내 혈관 및 간질조직은 그 구조적 변성과 또한 구성 세포의 손상은 관찰되지 않았다. 하이드로겔과 인접한 지방조직 내 혈관 간질구조는 모세혈관의 형태로 하이드로겔 내로 성장하고 있었으며, 이는 지방조직의 3차원 배양은 지방조직과 더불어 지방조직 기원의 세포, 세포외기질, 혈관성장인자와 더불어 혈관구조를 포함한 하이드로겔로 구성된 지방조직 치료제를 제조할 수 있는 공정임을 확인하였다.

8) 지방조직 치료제의 전달방법
배양이 끝난 후 하이드로겔내에 포함된 세포 배양액을 생리적 용액을 이용하여 반복하여 세척한다. 특히 동물성 혈청을 사용한 경우에는 혈청에 의한 염증 및 면역 반응을 유발할 수 있으므로 이러한 혈청이 완전히 제거될 때까지 철저히 반복하여 세척한다.
세척과정이 종료된 후 지방조직, 지방조직에서 성장한 ASCs를 포함한 세포, 그리고 하이드로겔로 구성된 지방조직 치료제를 스파툴라 (spatula)를 이용하여 배양용기로부터 때어내어 막과 같은 이식편을 제조한다.
세척과정이 종료된 후 피브린으로 구성된 하이드로겔인 경우 유로카이네이즈 (urokinase) 혹은 스트렙토카이네이즈, TPA를 첨가하여 피브린을 부분적으로 분해하여 주사기로 흡입할 수 있는 점도만큼 떨어트린다. 콜라겐 혹은 젤라틴으로 하이드로겔을 제조한 경우는 콜라지네이즈를 첨가하여 하이드로겔을 부분적으로 분해시켜 점도를 떨어트린 다음 주사기로 흡입한다.
때어 낸 지방조직 치료제는 원하는 크기대로 자르거나 혹은 주사기로 전달한다. 이러한 지방조직 치료제는 결손 조직 예를 들면 피부결손, 피부궤양에 판 혹은 막 형태로 바로 전달에 사용할 수 있다. 또한 주사기로 흡입한 지방조직 치료제는 조직이 결손 된 부위 혹은 미용성형 목적으로 결손 부위 혹은 환부에 주입할 수 있다.
결과적으로 본 발명의 특징을 요약정리하면,
1) 본 발명은 콜라지네이즈 처리과정 없이 3차원 배양법을 이용하여 다양한 지방조직으로부터 하이드로겔 내로 지방조직 기원의 줄기세포 및 기타 세포를 분리 증폭시켰으며, 하이드로겔 내로 이동 증폭된 세포는 세포표현학적 특성, 분화능력으로 줄기세포임을 검증하였다.
2) 본 발명은 지방조직을 하이드로겔 내에서 3차원 배양하여 지방조직 기원의 줄기세포와 줄기세포에서 생성 분비되는 콜라겐과 같은 세포외기질, 신생혈관을 재생시키는 주요 성장인자인 VEGF, HGF, bFGF, TGF 등을 포함하는 지방조직 치료제를 세포의 분리부터 치료제 완성까지 단 한 번의 공정으로 제조할 수 있는 기술이다.
3) 본 발명의 단 한 번의 공정으로 제조한 지방조직 치료제를 전달하기 위하여 제조된 치료제를 막과 같은 이식편과 주사기로 주입할 수 있는 주입형을 동시에 제조할 수 있는 기술이다. In order to achieve the above object, the present invention is a three-dimensional culture of adipose tissue using hydrogel in vitro without enzymatic treatment such as collagenase, and then moved from adipose tissue to grow and grow other fat including stem cells amplified and cultured Cells of tissue origin, growth factors including vascular growth factors produced and secreted by these cells, and hydrogels used for the cultivation of extracellular matrix, adipose tissue and adipose tissue, are harmless to living organisms. Biomaterials that can support differentiation relate to the composition of adipose tissue therapeutics having the characteristics of being composed of hydrogels that can be used, their preparation methods, and their delivery methods.
Hereinafter, the present invention will be described in detail.
The present invention amplifies and cultures ASCs by hydrolyzing adipose tissue in hydrogel three-dimensionally without hydrolyzing the collagen to prepare single cell suspension from adipose tissue, and growing ASCs and other adipose tissues into hydrogels. To present a composition, a preparation method and a delivery method of an adipose tissue therapeutic agent composed of vascular growth factors and extracellular matrix produced and secreted from cells in the body are deposited into a hydrogel.
In more detail,
1. Preparation and Composition of Adipose Tissue Therapeutics:
Inhaled adipose tissue or resected adipose tissue is cut into 1-10 mm ³ sized sections, and the adipose tissue is embedded in a biocompatible hydrogel and cultured in a three-dimensional culture to form adipose tissue, cells of adipose tissue, It is a method for preparing adipose tissue therapeutics including vascular growth factor and extracellular matrix.

2. Delivery method of adipose tissue therapy:
In this patent, three-dimensional culture in a hydrogel of adipose tissue, and then adipose tissue treatment agent is removed from the culture vessel by a physical method, and hydrolysis treatment is performed by treating the adipose tissue treatment agent in the form of a membrane and enzyme that specifically hydrolyzes only the hydrogel. It is a method of preparing an injection-type adipose tissue therapeutic agent that can lower the viscosity of the gel and deliver it to a syringe.
Hereinafter, the present invention will be described in detail by the following examples.
[1] adipose tissue
In the present invention, the adipose tissue refers to animal tissue, and the adipose tissue is not only fresh tissue, but also semi-permanently freeze storage at refrigerated storage, freezing point or less, more specifically, below minus 80 ° C. for a short period of time in order to minimize tissue damage during transport and treatment. It includes all the tissues, and adipose tissue is composed of mature fat cells and connective tissue surrounding them.Adipose tissue is included regardless of the position of the body, subcutaneous fat, fatty tissue located between the stomach and stomach. (omentum, mesentery), bone marrow fat tissue, retroperitoneal fat, and the like.
In addition, the adipose tissue used in the present invention includes all the adipose tissue obtained by all methods used to collect fat, and partially or completely resected adipose tissue, such as inhaled fat, partially incised fat, and gastrointestinal adipose tissue. All of these are included.
Absorption or inhaled adipose tissue is cut into 0.1 ~ 10 mm ³ in diameter and used to remove non-fat tissue such as fibrous membranes, blood vessels, coagulated blood, and necrotic tissue.
Repeated rinsing of adipose tissue with physiological solution and all tissues that precipitate under physiological solution are removed repeatedly. Repeat the wash until the physiological solution is clear and clear. Once the physiological solution is clear, only the adipose tissue floating on the top is collected and transferred to a sterile container.
The physiological solution used does not include physiological saline, PBS (phosphate buffered saline), or serum, and for example, a culture solution that can be used when culturing animal cells such as DMEM, RPMI, DMEM: F12, and F12 may be used. For preservation of adipose tissue during washing and hydrogel manufacturing, it may be used to include tissue preservatives and antibiotics such as fructose, glucose, chondroitin and polyphenols (fructose, glucose, chondroitin, polyphenol).
[2] process for preparing hydrogel
The hydrogel used in the present invention is composed of a biocompatible polymer capable of forming a gel of more than 85% moisture and 0.01 to 15% by weight, such a polymer is a natural polymer collagen (collagen), gelatin (gelatin), chondroitin ( Synthetic polymers, as well as biopolymers including chondroitin, hyaluronic acid, hyaluronan, alginic acid, matrigelTM, chitosan, fibrin, etc. The hydrogel is composed of polyglycolic acid (PGA), polylactic acid (PLA), polyethyleneglycol (PEG), polyacrylamide (polyacrylamide), and the hydrogel is a vascular endothelial growth factor (VEGF). growth promoters, hormones and antibiotics, including basic fibroblastic growth factor (bFGF), epipithelial growth factor (EGF), insulin-like growth factor (IGF), platelet-derived growth factor (PDGF), and transforming growth factor (TGF) By It can also be used in combination.
Hydrogels composed of all of these natural, synthetic, or mixed polymers may be used alone or in combination with natural or synthetic polymers, and should not be toxic to tissues and support the migration, growth, and differentiation of cells in tissues. It must be able to and can be broken down in vivo.
- Collagen
Collagen gel contains both human-derived and animal-derived collagen, collagen is used in 0.1 to 3% by weight. Gels can be prepared by using chemical cross-linkers to form the gel or by combining temperature and pH in neutral.
Fibrin
Fibrin is made using fibrinogen and thrombin of animal or human origin. Fibrinogen may be used at 0.01 to 10% by weight, but between 0.1 and 1% by weight is most suitable for cell migration and growth. Thrombin can be used at 0.01 to 100 units per ml, but 0.1 to 10 units per ml is suitable to make safe and uniform hydrogels. In addition to thrombin can be used by adding a factor of blood clotting factor XIII.
[3] manufacturing methods for treating adipose tissue
1) Manufacturing process of adipose tissue and hydrogel mixture
As in the adipose tissue, the adipose tissue is used to finely cut the diameter 0.1 ~ 5 mm ³ size, non-fat tissue such as fibrous membrane, blood vessels, coagulated blood, necrotic tissue is removed by washing with physiological solution.
Repeated rinsing of adipose tissue with physiological solution and all tissues that precipitate under physiological solution are removed repeatedly. Repeat the wash until the physiological solution is clear and clear. Once the physiological solution is clear, only the adipose tissue floating on the top is collected and transferred to a sterile container.
The solution used to make the hydrogel can be used as long as it is a physiological solution. The physiological solution may be a culture medium which can be used when culturing animal cells such as DMEM, RPMI, DMEM: F12, F12, which does not contain physiological saline, PBS, or serum. But it is not limited to these physiological solutions.
The finely divided adipose tissue is mixed with a physiological solution in a constant volume so that the adipose tissue is evenly dispersed, and the crosslinking agent forming the hydrogel is added to a solution in which the adipose tissue is dispersed or a natural or polymer solution capable of forming a hydrogel. Adipose tissue, polymer and crosslinking agent together in a container and mix evenly. The degree of mixing is carried out at low temperatures or by adjusting the concentration of the crosslinker to adjust the rate of gel formation.
Adipose tissue contained in the hydrogel polymerizes completely between room temperature and 37 ° C. to form a gel. The time to form the gel is polymerized according to the concentration of the polymer and the cross-linking agent constituting the hydrogel, but the concentration of the polymer, the cross-linking agent and the reaction temperature and reaction time so as to polymerize between 1 hour to 2 hours, usually 10 minutes to 30 minutes Determine.
2) Culture process of adipose tissue and hydrogel mixture
The mixed polymer, crosslinking agent and adipose tissue are transferred to the culture vessel. The hydrogel dose is determined to completely enclose adipose tissue into the hydrogel. For example, although 1 cc to 100 cc per 1 gm of adipose tissue can be used, a hydrogel of 5-20 cc per 1 gm adipose tissue is usually suitable. In addition, the thickness of the hydrogel including adipose tissue can be prepared up to 0.1 ~ 5 cm, 0.2 ~ 0.5 cm is suitable.
The culture vessel includes all containers that can be used for culturing animal cells and bacteria, such as polyethylene and glass, which are used for cell culture, and all culture vessels designed to make a specific shape. do.
1 is a schematic diagram of a process for producing adipose tissue therapeutic agent, such as selection of adipose tissue, removal of unnecessary tissue, washing, incorporation of adipose tissue into a hydrogel, and three-dimensional culture of adipose tissue.
3) Preparation of adipose tissue therapeutic agent through three-dimensional culture of adipose tissue and hydrogel mixture
If the hydrogel polymerizes to such a degree that the adipose tissue does not move and the culture medium is added, the cell culture solution is added. Cell cultures are used with DMEM, RPMI, alpha-MEM, F12, F10, DMEM: F12 medium without serum or 1-30% by volume of animal or human serum. The cell culture may include antibiotics that can inhibit the growth of bacteria such as gentamicin, penicillin, streptomycin, ciprobay, and the like. It is not limited to the composition of the culture medium exemplified, and any culture medium and additives including serum may be used when culturing animal cells.
Cell culture medium used in the present invention is VEGF (vascular endothelial growth factor), bFGF (basic fibroblastic growth factor), EGF (epithelial growth factor), IGF (insulin-like growth factor), PDGF (platelet-derived growth factor), TGF (TGF) It can also be used by adding growth promoting factors such as transforming growth factors, hormones, antibiotics, and vitamins.
Add the cell culture so that the adipose tissue contained in the hydrogel is sufficiently submerged in the cell culture. After adding the cell culture, the adipose tissue contained in the hydrogel is incubated in a 37 ℃ incubator, at this time to provide a humidity of 50 ~ 90% by volume of humidity conditions so that the cell culture is not dried. In addition, to maintain the pH during the cultivation should provide 5% by volume carbon dioxide, 85 to 95% by volume provides room air or 0 to 10% by volume oxygen. The cell culture is usually replaced with fresh cell culture every 1 to 5 days. To facilitate the exchange of material and gas into the hydrogel, the culture vessel containing the adipose tissue and the hydrogel is shaken slowly at a high speed of 1 to 100 rpm on the shaker.
4) Characteristics of Adipose Tissue Therapeutic Cells
From the first day of culture from the adipose tissue, the growth of the cells into the hydrogel was observed under a microscope (Fig. 2). After culturing for one week, the cells after growth and amplification were treated with enzymes that selectively degrade the hydrogel. The amplified cells were characterized. In other words, when the hydrogel is prepared from collagen, the hydrogel prepared from fibrin with 0.01 to 0.1% collagenase is treated with 100 to 10,000 unit eurokinase to selectively decompose the hydrogel to separate the cells grown inside the hydrogel. The surface properties and differentiation abilities were investigated.
(4-1) Cell Surface Characteristics
Cells isolated from hydrogels were washed twice with PBS. The cells were suspended at a concentration of PBS at a concentration of 5 × 10 5 cells / 200 μl, and then 10 μl of each antibody was added and reacted in the dark for 15 minutes. Thereafter, the cells were washed twice with PBS, dispersed with 500 μl PBS, and analyzed by flow cytometry (FACS Calibur, Becton Dickinson).
As shown in FIG. 3, the cells isolated from the hydrogel were confirmed to be non-hematopoietic and vascular endothelial cells in a negative response to the CD13, CD31, CD34, and CD45 antigens. CD3, CD4, CD8, Negative responses to the CD19 antigen were confirmed to be non-lymphocyte-derived cells, and the antibodies to CD29, CD44, CD90, and CD105 antigens expressed in adipose stem cells were positive. It was confirmed that they have the same cell surface characteristics as ASCs.
(4-2) Differentiation ability of adipocyte-constituting cells into osteoblasts, adipocytes, vascular endothelial cells
Cells grown into hydrogels were seeded in 12-well culture vessels at a concentration of 5 × 10 4 cells / cm 2. The cells were cultured in DMEM medium containing 10% calf serum (CS) until the cells were grown to 90% density in the culture vessel, and after the cells reached 90% density, the medium was induced to differentiate into specific cells. After incubation for 2 weeks. A-MEM medium containing 10 mM b-glycerol phosphate, 50 mg / ml ascorbic acid, 0.1 mM dexamethasone, and 10% CS was used for induction of differentiation into osteoblasts and to induce differentiation into adipocytes. DMEM medium containing 1 mM dexamethasone, 80 mM indomethacin, 100 mg / ml 3-isobutyl-1-methylxanthine, 10% CS was used, and 5x104 cells were isolated from hydrogel to induce differentiation into vascular endothelial cells. After seeding into a 12-well culture vessel coated with MatrigelTM (Becton Dickinson) at a cell / cm 2 concentration, DMEM: F12 1: 1 mixture medium containing 10 ng / ml VEGF and 2% CS was used.
In order to confirm the differentiation of cells separated by three-dimensional culture of adipose tissue, intracellular mineralization was examined by alizarin red staining to confirm osteoblast differentiation. Differentiation into adipocytes was confirmed. In addition, the differentiation into osteoblasts was confirmed by the reverse transcriptase polymerase chain reaction method for the expression of alkaline phosphatase (ALP), collagen type I, osteopontin, osteocalcin, etc. In the case of adipocytes, lipoprotein lipase (LPL) and peroxisome proliferated-activated receptor gamma (PPAR-g) mRNA expression was confirmed by RT-PCR method. Differentiation into vascular endothelial cells was confirmed by capillary formation and expression of CD31, VE-Cadherin, Flk-1, and Factor VIII proteins.
As shown in FIG. 4, after culturing in differentiation-inducing medium for 2 weeks, the differentiation into osteoblasts was confirmed by the deposition of minerals and the expression of ALP, collagen type I, osteopontin, and osteocalcin mRNA in the cells, resulting in three-dimensional culture of adipose tissue. Cells grown into hydrogels were confirmed to differentiate into osteoblasts.
As shown in FIG. 5, after 2 weeks of culture in differentiation-inducing medium for adipocytes for 2 weeks, the cells were confirmed by sudan black staining of fat accumulation in the cytoplasm, and LPL and PPAR-g specifically expressed in adipocytes. mRNA expression was detected, the cells grown in the hydrogel in the three-dimensional culture of adipose tissue confirmed the ability to differentiate into adipocytes.
As shown in FIG. 6, cells seeded by VEGF administration on Matrigel surface were rearranged in capillary form within 24 hours, and CD31, Factor VIII, Flk-1, which are proteins specific for vascular endothelial cells on the cell surface after 2 weeks of culture. VE-cadherin protein was expressed, and the above results confirmed the ability of the cells constituting the adipose tissue to divide into blood vessels.
Cells grown into hydrogels from adipose tissues by the three-dimensional culture method of adipose tissues were confirmed to differentiate into osteoblasts, adipocytes, and vascular endothelial cells, and the cells in the hydrogels were stem cells of adipose tissue origin.
5) Adipose tissue treatment including extracellular matrix
When cells begin to grow from adipose tissue into the hydrogel, the cells are cultured until 10 to 100 area% of the total hydrogel grows. In addition, vascular growth factors and extracellular matrix are produced and secreted from cells grown from adipose tissue to be deposited into hydrogels. Cell growth from adipose tissue to hydrogel is determined by the state of adipose tissue and the volume ratio of adipose tissue and hydrogel, but when the volume ratio of adipose tissue and hydrogel is 1: 1, the culture period is one week. Cell growth is reached up to 100% gel area.
As shown in FIG. 7, three-dimensional culture of adipose tissue in fibrin for one week was confirmed to occupy cells grown and grown in adipose tissue up to 100% of the hydrogel area.
Collagen production in the hydrogel was prepared by incubating the adipose tissue and the hydrogel mixture for one week, fixing the resulting adipose tissue to 4% formalin, and then preparing a paraffin block. After cutting into 4 mm thick tissue sections, paraffin was removed, and after water and dehydration, the tissue sections were checked for collagen production in adipose tissue by Masson Trichrome staining.
As shown in FIG. 8, the cells grown from fat inside the adipose tissue therapeutic agent of the membrane structure and the collagen fibers deposited between the hydrogel and the cells were identified, and the stem cells derived from the adipose tissue are the central skeletal proteins in the extracellular matrix. The ability to generate collagen fibers was verified, and it was also confirmed that an extracellular matrix could be generated in a single process simultaneously with amplification of stem cells from adipose tissue through a three-dimensional culture process into a hydrogel.
6) Adipose tissue therapeutics including angiogenesis factors
Adipose tissue and adipose stem cells have been shown to be capable of producing and secreting major angiogenesis factors such as VEGF, bFGF, HGF and TGF. Adipose tissue treatment cultured for 1 week was washed three times with PBS, and then cells grown from adipose tissue and three-dimensional cultured adipose tissue were separated from the hydrogel. After centrifugation, the precipitated cells and the adipose tissue floating on the medium were separated and collected, and then RNA was extracted from the separated cells and the adipose tissue. The extracted RNA was amplified VEGF, bFGF, HGF, TGF-specific mRNA using RT-PCR method and the expression level was examined. Adipose tissue before 3D culture, myoblast C2C12 cell line and human fibroblasts were used as control samples for angiogenesis expression study.
As shown in FIG. 9, VEGF, bFGF, HGF, and TGF mRNA, which are vascular growth factors, were expressed in cells grown in hydrogels and in adipose tissue cultured three-dimensionally for one week, whereas C2C12 and fibroblasts, myoblasts, were expressed. MRNA expression of VEGF, bFGF, HGF, etc. was not shown. In addition, mRNA expression of VEGF, bFGF, HGF, and TGF was maintained even in adipose tissues cultured three-dimensionally for one week.
In the three-dimensional culture method in the hydrogel of adipose tissue, extracellular matrix collagen fiber is produced from cells grown from adipose tissue to hydrogel, and also VEGF, bFGF, HGF which are angiogenesis factors from cells of adipose tissue and adipose tissue. And the like to produce a process to enhance the biological function of the adipose tissue therapeutic agent in a single process.
7 ) Adipose tissue treatment including vascular structure
Adipose tissue is composed of more than 99% mature fat cells, the interstitial tissue including blood vessels account for the remaining 1%. In soft tissue defects, adipose tissue is widely used as a biological filler. If gas and nutrient supply to the adipose tissue is not provided during the three-dimensional culture of the adipose tissue, the cells constituting the adipose tissue may die, and its function as a biological filler or therapeutic agent may be lost or reduced. Adipose tissue was prepared by incubating for 1 week in hydrogel, and then fixed with 4% formalin to prepare paraffin blocks.
As shown in FIG. 10, the adipocytes in the adipose tissue adjacent to the hydrogel maintained the cellular structure such as the cell membrane and the nucleus even after one week of incubation, but the nuclei of the adipocytes disappeared toward the inside of the adipose tissue and the cell membrane. The structure of was destroyed, that is, the fat cells were denatured. However, vascular and interstitial tissues in adipose tissues were not observed for structural degeneration and damage to constituent cells. Vascular interstitial structures in the adipose tissue adjacent to the hydrogel were growing into the hydrogel in the form of capillaries. The three-dimensional culture of the adipose tissue, together with the adipose tissue, cells of extracellular matrix, vascular growth factors, It was confirmed that the process can be prepared for the treatment of adipose tissue consisting of hydrogel including the vascular structure.

8) Delivery method of adipose tissue treatment
After incubation, the cell cultures contained in the hydrogel are repeatedly washed with a physiological solution. In particular, when animal serum is used, it may cause an inflammation and immune response caused by serum, so it is washed thoroughly until such serum is completely removed.
After the washing process, adipose tissue treatment consisting of adipose tissue, cells containing ASCs grown in adipose tissue, and hydrogel is removed from the culture vessel using a spatula to prepare a membrane-like graft.
In the case of hydrogel consisting of fibrin after the washing process is finished, the fibrin is partially decomposed by adding eurokinase, streptokinase, and TPA, and dropped to a viscosity that can be inhaled by a syringe. If the hydrogel is made of collagen or gelatin, the collagenase is added to partially decompose the hydrogel to lower the viscosity, and then inhale with a syringe.
The removed adipose tissue treatment can be cut to size or delivered by syringe. Such adipose tissue therapeutics can be used for immediate delivery of defective tissues such as skin defects, skin ulcers in the form of plates or membranes. Adipose tissue treatments inhaled with a syringe may also be injected into the defect site or the affected area for cosmetic surgery.
As a result, to summarize the features of the present invention,
1) The present invention was isolated and amplified stem cells and other cells of adipose tissue origin into a hydrogel from a variety of adipose tissue using a three-dimensional culture without the process of collagenase, the cell amplified into a hydrogel Stem cells were verified by their characteristics and differentiation capacity.
2) The present invention is a three-dimensional culture of adipose tissue in a hydrogel, VEGF, HGF, bFGF are the main growth factors for regenerating extracellular matrix and neovascularization such as collagen produced and secreted from stem cells and stem cells of adipose tissue origin , A technique for producing adipose tissue therapeutics, including TGF, in a single process from the separation of cells to the completion of therapeutics.
3) It is a technology capable of simultaneously preparing an injection type for injecting a therapeutic agent prepared by a single process of the present invention into a graft such as a membrane and a syringe.

삭제delete

이상에서와 같이 본 발명은 비록 상기의 실시예에 한하여 설명하였지만 반드시 여기에만 한정되는 것은 아니며 본 발명의 범주와 사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 다양한 변형실시가 가능함은 물론이다. As described above, although the present invention has been described with reference to the above embodiments, it is not necessarily limited thereto, and various modifications may be made without departing from the scope and spirit of the present invention.

삭제delete

이상으로 살펴본 바와 같이, 본 발명은 지방조직을 콜라지네이즈와 같은 효소처리 없이 체외에서 하이드로겔을 이용하여 3차원 배양하여 지방조직에서부터 이동, 성장, 증폭된 줄기세포 및 기타 지방조직 기원의 세포들과, 이러한 세포에서 생성하여 분비한 혈관성장인자를 포함한 성장인자 및 세포외기질, 지방조직 그리고 하이드로겔(hydrogel)로 구성된 치료제를 제조하는 방법이며, 또한 제조된 치료제를 트립신과 같은 이차적인 효소 처리과정 없이 손상된 부위에 직접 전달하거나 주입하는 것으로, 이 기술로 제조된 지방조직 치료제는 상처치유효과가 높고 미용성형용도로 적용할 수 있다. As described above, the present invention is a three-dimensional culture of adipose tissue using hydrogel in vitro without enzyme treatment, such as collagenase, stem cells and cells derived from adipose tissue, growth, amplification and other adipose tissue origin from adipose tissue And a method for preparing a therapeutic agent consisting of growth factors and extracellular matrix, adipose tissue, and hydrogel, including the vascular growth factor produced and secreted by these cells, and further treating the prepared therapeutic agent with a secondary enzyme such as trypsin. By direct delivery or infusion to the damaged area without a procedure, the adipose therapeutics produced by this technique have high wound healing effects and can be applied for cosmetic surgery.

삭제delete

Claims

In adipose tissue and adipose tissue selected from the group consisting of subcutaneous fat tissue, mesenteric adipose tissue, gastrointestinal adipose tissue, retroperitoneal adipose tissue, and bone marrow adipose tissue, which were cut to 0.1-10 mm in size without the treatment of collagenase enzyme. Diabetic ulcers, pressure sores, varicose veins ulcers, myocardial infarction, heart failure disease, fractures, bone A therapeutic agent for cosmetic treatment or cosmetic surgery for adipose tissue selected from the group consisting of defect, metabolic or congenital bone disease.

delete

The method of claim 1, wherein the hydrogel is collagen (collagen), gelatin (gelatin), chondroitin (chondroitin), hyaluronic acid (hyaluronic acid, hyaluronan), alginic acid (alginic acid), Matrigel (Matrigel ^TM ), Fatty tissue therapeutic agent, characterized in that selected from natural polymers consisting of chitosan and fibrin, or synthetic polymers consisting of polyglycolic acid (PGA), polylactic acid (PLA), polyethylene glycol (PEG) and polyacrylamide.

According to claim 4, wherein the hydrogel is selected from natural polymers or synthetic polymers, adipose tissue therapeutics, characterized in that it is prepared in the form of a single or copolymer.

[Claim 2] The adipose tissue therapeutic agent according to claim 1, wherein the cells grown in the adipose tissue into the hydrogel are selected from adipose stem cells, vascular endothelial cells, vascular endothelial progenitor cells, fibroblasts or adipocytes.

[Claim 2] The adipose tissue therapeutic agent according to claim 1, wherein the cells grown and moved into the hydrogel from the adipose tissue are selected from cells differentiated into osteocytes, chondrocytes, cardiac cells, nerve cells or vascular cells.

delete

The method of claim 1, wherein the adipose tissue therapeutic agent, characterized in that the cells grown by moving into the hydrogel occupies 10 to 100% by volume of the hydrogel.

delete

The method for preparing the adipose tissue treatment of claim 1, the fat tissue is finely cut into 0.1 ~ 10 mm ³ size, removing and washing all fibrous membranes, blood vessels, coagulated blood, necrotic tissue, fat suspended in the upper physiological solution Collecting only the tissue and remixing with the physiological solution to evenly disperse the adipose tissue into the solution, mixing the solution of the adipose tissue dispersed with a polymer solution forming a hydrogel and a crosslinking agent, the polymer solution, crosslinking agent, adipose tissue Transfer all the mixed solution to the culture vessel, hydrogel containing adipose tissue is polymerized to form a gel, the adipose tissue is embedded into the hydrogel is fixed, the adipose tissue in the hydrogel does not move and do not float on the water surface When the hydrogel is polymerized to the extent that the cell culture fluid is added, the cells from the adipose tissue into the hydrogel Culturing until cells grow to 10-100 area% of the total hydrogel area after starting to grow, and removing the cell culture solution contained in the hydrogel after culturing, and repeatedly washing with physiological solution. , After the washing process is finished, the adipose tissue treatment agent is removed from the culture vessel and used in a predetermined size according to the purpose of use.

The method of claim 11, wherein the hydrogel is suitable for a dose of 5 to 20 cc per 1 gm of adipose tissue, and the thickness of the hydrogel including adipose tissue is 0.1 to 5 cm.

12. The method of claim 11, wherein the hydrogel including adipose tissue is polymerized between 1 and 2 hours to determine the concentration, reaction temperature and reaction time of the polymer or crosslinking agent to form a gel.

The method of claim 11, wherein after hydrogel is polymerized, vascular endothelial growth factor (VEGF), basic fibroblastic growth factor (bFGF), epipithelial growth factor (EGF), insulin-like growth factor (IGF), and platelet-derived growth factor) and a growth promoter selected from the group consisting of TGF (transforming growth factor) or a method for producing adipose tissue therapeutics, characterized in that the addition of hormones or antibiotics to the cell culture medium.

According to claim 11, After the addition of the cell culture medium, the adipose tissue contained in the hydrogel is incubated in a 37 ℃ incubator, the relative humidity in the incubator to maintain the relative humidity in the incubator so as not to dry the cell culture medium, and during the culture Providing air containing 5% carbon dioxide in the incubator to maintain the pH, the cell culture is a method for producing adipose tissue therapeutics, characterized in that usually replaced with fresh cell culture every 1 to 5 days.

A diabetic ulcer, pressure sores, varicose vein ulcers, myocardial infarction, heart failure diseases, fractures, bone defects, wherein the therapeutic agent for adipose tissue according to any one of claims 1, 4 to 7, or 9 is an active ingredient. Adipose tissue therapeutic composition for treatment or cosmetic cosmetic treatment of diseases selected from the group consisting of metabolic or congenital bone diseases.

17. The adipose tissue therapeutic composition according to claim 16, wherein the adipose tissue therapeutic agent is prepared by physically detaching from the culture vessel without treating enzyme after in vitro culture.

The adipose tissue therapeutic composition according to claim 17, wherein the enzyme is an enzyme that damages the cell membrane.

Claim 1, 4 to 7, or any one of the adipose tissue therapeutic agent of any one of claims 9, the diabetic is an active ingredient only cells that have been physically removed from the adipose tissue and then migrated and grown from the hydrogel and adipose tissue into the hydrogel An ulcer, pressure sore, varicose vein ulcer, myocardial infarction, heart failure disease, fracture, bone defect, metabolic or congenital bone disease disease treatment composition or cosmetic cosmetic fat tissue therapeutic composition.

delete