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KR100738401B1 - 급성백혈병- 및 림프모구 림프종 특이 ｃｄ43의항원결정부위 및 이의 용도 - Google Patents

급성백혈병- 및 림프모구 림프종 특이 ｃｄ43의항원결정부위 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 급성백혈병 세포의 세포 표면에 특이적으로 발현되는 CD43의 항원결정부위, 이의 항체 및 상기 항체의 용도에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 급성 백혈병, 모세포위기가 발생한 만성 백혈병 및 림프모구 림프종의 진단 및 치료에 유용하게 쓰일 수 있는 항-CD43 항체를 제공한다.
CD43, 단클론 항체, 항원결정부위, 백혈병, 림프종

Description

급성백혈병- 및 림프모구 림프종 특이 ＣＤ43의 항원결정부위 및 이의 용도{ACUTE LEUKEMIA- AND LYMPHOBLASTIC LYMPHOMA-SPECIFIC CD43 EPITOPE AND USE THEREOF}
도 1은 흉선조직을 항-CD43 단클론 항체(EB-1)으로 면역조직화학염색한 결과이다.
도 2는 가슴샘세포에 대한 항-CD43 단클론 항체(EB-1)의 반응성을 측정한 유세포 측정 그래프이다.
도 3는 말초혈액 백혈구 및 탯줄혈액 조혈줄기세포에 대한 항-CD43 단클론 항체(EB-1)의 반응성을 측정한 유세포측정 그래프이다.
도 4은 골수세포에 대한 항-CD43 단클론 항체(EB-1)의 반응성을 측정한 유세포 측정 그래프이다.
도 5는 CD43을 발현시킨 293T 세포에서 항-CD43 단클론 항체(EB-1)의 반응성을 측정한 유세포 측정 그래프이다.
도 6은 시알리데이즈 처리 전후의 Molt-4 세포주에서 항-CD43 단클론 항체(EB-1)의 반응성을 측정한 유세포 측정 그래프이다.
도 7은 시알리데이즈 처리 전후의 사람 가슴샘세포 및 Molt-4 세포에 대한 항-CD43 단클론 항체(EB-1)의 반응성을 웨스턴 블롯으로 분석한 것이다.
도 8은 11종의 CD43 결손형돌연변이(deletion mutant)를 도식적으로 나타낸 그림이다.
도 9는 11종의 CD43 결손형돌연변이에 대한 항-CD43(EB-1) 단클론 항체의 반응성을 확인한 웨스턴 블롯이다.
도 10은 항-CD43(EB-1) 단클론 항체에 대한 백혈병 세포의 반응성을 확인한 유세포측정결과이다.
도 11은 림프모구 림프종(lymphoblastic lymphoma) 조직을 항-CD43 단클론 항체(EB-1)로 면역조직화학염색한 결과이다.
도 12는 CCRF-CEM 세포를 마우스 꼬리 정맥에 주사하여 확립한 급성 백혈병 모델에서 항-CD43(EB-1) 단클론 항체 혹은 항체-사포린 접합체 투여 후 마우스 말초혈액내 존재하는 백혈병 세포를 항-사람 MHC I 항체와 항-CD43 항체(EB-1)로 염색하고 유세포측정으로 확인한 결과이다.
도 13는 CD43 폴리펩타이드를 면역하여 새롭게 제조한 두 종류의 항-CD43 항체(EB-2 및 EB-3)의 CD43 유전자 삽입 EL4 세포주, 사람 가슴샘세포, 사람 말초혈액 백혈구 및 백혈병 세포에서 반응성을 유세포측정으로 확인한 결과이다.
도 14은 5종류의 CD43 결손형돌연변이에 대한 항-CD43 EB-2 및 EB-3 항체의 반응성을 확인한 웨스턴 블롯이다.
[발명이 속하는 기술분야]
본 발명은 CD43의 항원결정부위(antigen determinant region or epitope) 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는 급성 백혈병, 모세포 위기가 발생한 만성 백혈병 및 림프모구 림프종의 진단 및 치료에 유용한 CD43 항체에 대한 CD43의 항원결정부위에 관한 것이다.
[종래기술]
Leukosialin 혹은 sialophorin이라고도 불리는 CD43은 적혈구를 제외한 대부분의 조혈세포 표면에 발현되는 주요 막성단백(transmembrance protein)이다. CD43은 235개의 아미노산으로 이루어진 점액양의 세포외 영역(extracellular domain)과 23개 아미노산으로 이루어진 세포막(transmembrance) 영역 그리고 123개 아미노산으로 이루어진 세포내 영역으로 이루어져 있다(Pallant et al., 1989; Shelle et al. 1989). 특히, 세포외 영역에 있는 46개의 세린(serine)과 47개의 스레오닌(threonine)의 대부분은 산소기 결합 탄수화물(O-linked carbohydrate)을 갖고 있으며, 질소기 결합 탄수화물(N-linked carbohydrate)도 하나가 발견되었다. 약 80개의 산소기 결합 탄수화물의 구조는 세포마다 다를 수 있다(Carlsson et al., 1986).
인간의 CD43 유전자는 16번 염색체에 위치하며, 두개의 엑손으로 이루어져 있으나 유전자암호해독 산물(translation product)은 모두 두번째 엑손에서 유래한다(Shelley et al., 1990). CD43은 정상조직중 적혈구를 제외한 모든 조혈세포에 발현되며, 비조혈세포에는 발현되지 않는다(Remold-O'Donnell et al., 1987; Fukud, 1991). 그러나, CaSKI(자궁경부암종), A549(폐암), MCF7(유방샘암종), HT-1080(섬유육종), COLO 205, HT-29, Caco-2, DLD-1 및 SW480(이상 대장샘암종) 세포주에서 발현되며(Fernandez-Rodriguez et al., 2002), 사람 대장암세포 등의 종양세포에서 발현될 수도 있다(Sikut et al., 1997; 정 등, 2004).
CD43의 전구물질(precursor)는 약 40 kDa이나, 세포내 성숙 과정에서 당화가 진행되어 세포에 따라 약 115-200 kDa의 당단백으로 세포 표면에 발현된다. 가슴샘세포 및 말초 혈액내 백혈구 및 혈소판에 발현되는 CD43은 산소기에 붙는 탄수화물 성분의 차이에 따라서 두 가지 아형(isoform)이 존재한다. 가슴샘세포와 CD4 T 림프구 및 단핵구는 주로 115 kDa 크기의 아형을 주로 발현하며, 130 kDa 크기의 아형은 주로 활성화된 CD4 T 림프구, CD8 T 림프구, 호중구, 혈소판 및 B 세포에 주로 발현된다(Rosenstein et al., 1999). 그러나 한 세포에 두 가지 아형이 함께 발현될 수도 있다. CD43 아형은 당화(glycosylation)에 작용하는 효소에 의해 결정되며, 특히 가슴샘세포와 CD4 T 림프구에 발현되는 CD43 단백의 분자량은 core 2 당화를 유도하는 core 2 ??1, 6 N-acetylgalatosamine transferease(C2GnT)의 작용에 의해 115 kDa에서 130 kDa로 증가할 수 있다(Piller et al., 1988).
현재까지 사람의 CD43 단백에 대한 항체는 17개 이상이 알려져 있으나 대부분의 항체는 주로 CD43 당단백 중 탄수화물 성분을 항원으로 인지하며(표 1), CD43에 당화되는 양상이 변하면 항-CD43 항체의 CD43에 대한 반응성이 변할 수 있다(Mukasa et al., 1999). 또한 현재까지 보고 된 항-CD43 항체들은 대부분의 성숙 백혈구와 혈소판에 발현되는 CD43을 인지한다.
항-사람 CD43 항체의 특이성
항체 CD43-양성 CD43-음성 인지항원 참고 문헌*
T305 활성화된 CD4 T 림프구, CD8 림프구, 가슴샘세포, 골수내 단핵구-과립구 전구세포 과립구, 적혈구, 혈소판 Core-2 탄수화물 1, 2
L10 T 림프구, 가슴샘세포, B 세포주, 단핵구, 호중구, 혈소판 적혈구 1-78 Sialidase 저항성 3
L2 T 림프구, 가슴샘세포, B 세포주, 단핵구, 호중구, 혈소판 적혈구 1-78 3
84-3C1 골수세포, 가슴샘세포, T 림프구, 단핵구, 과립구 혈소판, 적혈구 Sialidase 민감성 탄수화물 4
MEM-59 대부분의 백혈구, CD34-양성 골수세포 Neuraminidase 민감성 탄수화물 5, 6
MT-1, L60 T 림프구, 단핵구, B 림프구 7
DFT1 T 림프구, 단핵구 B 림프구 Neuraminidase 민감성 탄수화물 7
1G10 T 림프구, NK 세포, 과립구 B 림프구, 적혈구 8
CBF.78 T 림프구, 일부의 단핵구 일부, 일부의 과립구 Neuraminidase 저항성 9
RDF/AD-9, T 림프구, 단핵구, 과립구 B 림프구 Neuraminidase 민감성 탄수화물 9
161-46 T 림프구, 단핵구, 과립구 B 림프구 Neuraminidase 저항성 9
4D2 COLO 205, K562, Jurkat 세포내 (337-343) 10
4D1 활성화된 CD4 T 림프구, 단핵구 B 림프구 Core-2 탄수화물 11
* 1. Fox et al., J Immunol. 1983, 131:762-7 ; 2. Saitoh et al., Blood. 1991, 77:1491-9; 3. Remold-O'Donnell et al., Blood. 1987, 70:104-9; 4. Borche et al., Eur J Immunol. 1987, 17:1523-6; 5. Stefanova et al., Folia Biol (Praha). 1988, 34:255-65; 6. Alvarado et al., Eur J Immunol. 1995, 25:1051-5; 7. Stross et al, J Clin Pathol. 1989, 42:953-61; 8. Horejsi et al., 1997, In Kishimoto T, et al, Leucocyte Typing, Vol. VI: White Cell Differentiation Antigens 494. Garland, New York and London; 9. Tkaczuk et al., Tissue Antigens. 1999, 54:1-15; 10. Sikut et al., Int J Cancer. 1999, 82:52-8; 11. Mukasa et al, Int Immunol. 1999, 11:259-68.
상기 종래기술의 문제점을 해결하기 위하여 안출된 것으로서, 본 발명은 성숙 백혈구, 적혈구 및 혈소판 및 모든 비-조혈세포에는 발현되지 않으나, 급성 백혈병, 모세포 위기가 발생한 만성 백혈병 및 림프모구 림프종 세포의 세포표면에 특이적으로 발현되는 CD43 단백의 항원결정부위를 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한 본 발명은 급성 백혈병, 모세포 위기가 발생한 만성 백혈병 및 림프모구 림프종 세포의 세포표면에 특이적으로 발현되는 CD43 단백의 항원결정부위를 인지하는 물질을 제공하는 것을 목적으로 하며, 바람직하기로는 CD43 단백의 항원결정부위를 인지하는 항체이거나, 항체 절편이다.
또한 본 발명은 급성 백혈병, 모세포 위기가 발생한 만성 백혈병 및 림프모구 림프종 세포의 세포표면에 특이적으로 발현되는 CD43 단백의 항원결정부위를 인지하는 물질을 생산하는 생산주를 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한 본 발명은 급성 백혈병, 모세포 위기가 발생한 만성 백혈병 및 림프모구 림프종 세포의 세포표면에 특이적으로 발현되는 CD43 단백의 항원결정부위를 인지하는 물질을 생산하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한 본 발명은 급성 백혈병, 모세포 위기가 발생한 만성 백혈병 및 림프모구 림프종에 대한 검사방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한 본 발명은 급성 백혈병, 모세포 위기가 발생한 만성 백혈병 및 림프모구 림프종에 대한 치료방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한 본 발명은 급성 백혈병, 모세포 위기가 발생한 만성 백혈병 및 림프모구 림프종에 대한 치료제를 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한 본 발명은 급성 백혈병, 모세포 위기가 발생한 만성 백혈병 및 림프모구 림프종에 대한 진단키트를 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 급성백혈병, 모세포 위기가 발생한 만성 백혈병 및 림프모구 림프종에 발현되나 성숙 백혈구, 적혈구 및 혈소판 및 모든 비-조혈세포에는 발현되지 않는 CD43의 항원결정부위, 상기 CD43의 항원결정부위에 대한 항체, 상기 항체를 이용한 급성 백혈병, 모세포 위기가 발생한 만성 백혈병 및 림프모구 림프종 검사방법, 그리고 상기 항체를 이용한 급성 백혈병, 모세포 위기가 발생한 만성 백혈병 및 림프모구 림프종 치료방법에 관한 것이다.
본 발명의 CD43은 바람직하기로는 사람의 CD43 단백질이며, 이의 염기서열 및 아미노산 서열은 공지(NCBI GeneBank accession no. M61827)된 바와 같다.
CD43의 항원결정부위는 서열목록작성 소프트웨어로 작성한 SEQ ID NO: 1의 아미노산 서열(EP6으로 명명)을 포함하는 폴리펩타이드이며, 바람직하기로는 SEQ ID NO: 2(EP9로 명명) 의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드이다. SEQ ID NO: 1은 사람 CD43의 76-81번째 아미노산 서열에 해당하며, SEQ ID NO: 2는 사람 CD43의 73-91번째 아미노산 서열에 해당하나, 이에 국한되지는 않는다.
EP6 : Pro Leu Trp Thr Ser Ile (SEQ ID NO: 1)
EP9 : Glu Gly Ser Pro Leu Trp Thr Ser Ile (SEQ ID NO: 2)
CD43 항원결정부위는 생체시료로부터 분리하거나, 화학적으로 합성하거나 또는 유전공학기술로 생산할 수 있으며, 상기한 방법은 공지의 기술로 용이하게 실시할 수 있다.
또한 본 발명은 CD43 항원결정부위를 인지하는 물질을 제공한다. 이 물질은 항체, 항체 절편, 리간드 등으로 이루어진 군에서 선택될 수 있으며, 항체는 단클 론 또는 다클론 항체일 수 있으며, 바람직하기로는 사람과 동물에서 기원한 것이다.
CD43 항체는 중쇄(heavy chain) 다변부위(variable region) 및 경쇄(light chain) 다변부위를 포함하며, CD43 항원결정부위를 선택적으로 인식할 수 있다. 또한, 본 발병이 제공하는 물질은 F(ab')2, Fab 및 Fv 등의 항체 절편을 포함한다. 특히, Fv는 상기 중쇄 다변부위(VH) 및 경쇄 다변부위(VL)를 링커 폴리펩타이드로 연결하여 단쇄(single chain)로 만든 항체 절편이다.
CD43 항체 또는 항체 절편은 방사선동위원소, 형광 물질, 크로모젠(chromogen) 및 염색 물질로 이루어진 군으로부터 선택된 물질들로 표지될 수 있다. 형광물질로 플루오레센 이소티오시아네이트(fluorescein isothiocyanate: FITC), 피코에리트린(phycoerythrin: PE), 알로피코사이아닌 (allophycocyanin, APC) 또는 바이오틴(biotin) 등을 사용할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
CD43 항체 또는 항체 절편은 방사선동위원소, 독소 화합물, 독성 단백질 및 항암제로 이루어진 군으로부터 선택된 독성 물질들로 구성 될 수 있다. 항체 혹은 항체 절편은 독성 물질들과 결합되어 융합단백(fusion protein)을 형성한다. 독소 단백질로는 리신(ricin), 사포린(saporin), 젤로닌(gelonin), 모로딘(momordin), 디프테리아독소, 또는 녹농균독소(pseudomonas toxin)일 수 있으며, 방사선동위원소로는 131I, 188Rh와 90Y가 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 CD43 항원결정부위를 선택적으로 인지하는 물질을 생산하 는 방법과, 항체를 생산하는 생산주를 제공한다. CD43의 항원결정부위에 대한 항체 또는 항체 절편은 CD43 단백질, CD43의 항원결정부위, CD43의 항원결정부위를 포함하는 CD43 단백질 일부, 또는 CD43의 항원결정부위를 발현하는 세포를 항원으로 이용하여 통상의 방법으로 제조가능 하다. 일례로, CD43 항체 제조방법은, (a) CD43 단백질, CD43의 항원결정부위, CD43의 항원결정부위를 포함하는 CD43 단백질 일부, 또는 CD43의 항원결정부위를 발현하는 세포를 동물에 주입하여 면역화 시키는 단계, (b) CD43에 특이적인 항체를 생산하는 비장세포를 수득하는 단계 및 (c) 상기 비장세포를 골수종세포와 융합 시켜, CD43에 대한 항체를 생산하는 하이브리도마 세포를 선별하는 단계를 포함하는 CD43 항체를 생산하는 생산주 제조방법으로 통하여 실시가능 하다. 상기 생산주는 생체외(in vitro)에서 배양하거나, 생체내 주입하여 항체를 분리할 수 있다. 일례로, 마우스의 복강내에 삽입하고 복수로부터 분리, 정제한다. 단클론 항체의 분리 및 정제는 배양 상층액 또는 복수를 이온교환 크로마토그래피(DEAE 또는 DE52 등), 항 면역글로불린 칼럼 또는 프로테인 A 컬럼 등의 친화성 크로마토그래피를 이용하여 실시할 수가 있다.
CD43 항원결정부위는 가슴샘세포와 일부의 골수내 미성숙 조혈세포에서만 특이적으로 발현 노출되고, 조혈줄기세포 및 다른 정상 기관 또는 조직에서는 발현 노출되지 않으나, 종양세포인 급성 백혈병, 모세포 위기가 발생한 만성 백혈병 및 림프모구 림프종에서 발현 노출되는 것으로 확인되었다. 따라서, CD43 항원결정부위에 대한 항체는 종양세포의 검출에 유용하게 사용할 수 있을 뿐만 아니라 CD43 항원결정부위에 대한 항체에 독성물질을 포함시켜 종양세포만 특이적으로 세포살상 (cytotoxicity) 시킬 수 있다.
본 발병은 급성 백혈병, 모세포 위기가 발생한 만성 백혈병 및 림프모구 림프종을 치료하기 위해 CD43 항원결절부위에 대한 항체 또는 항체 절편과 약리학적으로 허용 가능한 부형제를 포함한 치료제를 제공한다.
본 발명에 따른 항체 혹은 항체 절편의 투여는 허용된 모든 약물 투여방법에 의해 시행될 수 있다. 구체적으로 예를 들면, CD43 항체를 유효성분으로 포함하는 치료제를 종양세포, 예컨대 급성백혈병 세포를 갖는 대상, 즉 인간 또는 동물에 경구 또는 비경구, 바람직하기로는 비경구로 투여하는 것이다. 상기 치료제는 약리학적으로 허용가능한 부형제를 포함할 수 있으며, 이의 투여량은 환자의 상태에 따라 적절히 조절하는 것이 바람직하나, 일예로 1일 3 mg 내지 6,000 mg 일 수 있다. 치료제의 제형은 액제, 산제, 유제, 현탁제 또는 주사제일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발병은 CD43 항원결정부위에 대한 항체, 항체 절편(F(ab')2, Fab 및 Fv 등), 및 리간드 이뤄진 군에서 선택된 항체를 이용하여 급성 백혈병, 모세포 위기가 발생한 만성 백혈병 및 림프모구 림프종을 치료하는 방법을 제공한다. 항체 혹은 항체 절편은 바람직하기는 단클론 또는 다클론 항체로 이루어진 군에서 선택되며, 바람직하기로는 사람과 동물에서 기원한 것이다. 상기 CD43 항체 또는 항체 절편은 상기에서 언급한 독소물질이 더욱 포함된 것일 수 있다. 독소물질은 항체에 융합, 접합, 결합, 또는 링크될 수 있으며, 이는 공지의 기술로 실시가능 하다.
CD43 단백중 상기 항원결정부위는 급성 백혈병, 모세포 위기가 발생한 만성 백혈병 및 림프모구 림프종 세포 표면에 특이적으로 발현되는 단백질이므로, CD43 항체를 급성 백혈병, 모세포 위기가 발생한 만성 백혈병 및 림프모구 림프종 세포를 검출하는 용도로 사용할 수 있다.
종양세포 검사방법은 (a) CD43 항체를 종양세포를 포함하는 시료에 반응시키고, (b) 상기 항체에 대하여 양성반응을 나타내는 시료를 종양으로 판단하는 것이다. 상기 시료는 림프액, 골수, 혈액 또는 혈구일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 종양세포는 바람직하기로는 급성 백혈병, 모세포 위기가 발생한 만성 백혈병 및 림프모구 림프종 세포이다.
상기 CD43 항체를 이용하여 종양세포를 검사하는 경우, 상기 CD43 항체는 항원-항체 반응성을 확인할 수 있는 물질로 표지된 것일 수 있다. 사용가능한 상기 물질로는 방사성동위원소, 형광물질, 발광물질, 크로모젠(chromogen), 또는 기타 염색 물질 등이 있다.
또한 본 발명의 CD43 항체는 급성 백혈병, 모세포 위기가 발생한 만성 백혈병 및 림프모구 림프종을 진단하기 위한 진단키트로 제공될 수 있다. 상기 진단키트는 CD43 항체이외에, 항원-항체반응 검출수단을 포함할 수 있다. 상기 검출수단은 유세포측정, 면역조직화학염색, 효소결합 면역흡착 분석(enzyme liked immunosorbent assay: ELISA), 방사선 면역측정법(radioimmunoassay: RIA), 효소 면역분석(enzyme immunoassay: EIA), 형광면역분석(Floresence immunoassay: FIA) 및 발광면역분석(luminescence immunoassay: LIA)으로 이루어진 군으로부터 선택된 방법을 실시하기 위한 통상의 물질 일 수 있다. 즉, 표지수단으로는 효소의 경우 HRP(horse radish peroxidase)가 있으며, 형광물질로는 FITC(Fluoresceinthiocarbamyl ethylenediamine)가, 발광물질로는 루미놀(luminol), 이소루미놀 및 루시게닌(lucigenin)이, 방사선 동위원소로는 125I, 3H, 14C 및 131I가 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 표지수단에 의한 표지여부는 효소의 기질이나, 형광, 발광 또는 방사선을 측정하기 위한 도구를 이용하여 확인가능하다. 일예로 CD43 항체는 ELISA 키트 또는 스트립 키트로 제조될 수 있다.
이하 본 발명의 실시예를 기재한다. 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 본 발명이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 사람 가슴샘세포에 특이적인 표면 단백질 검색 및 상기 단백질에 대한 단일클론 항체 제조
1-1. 단일클론항체 생산 세포 제조
가슴샘세포 의 신규 표면 단백질을 스크리닝하고자 하였다.
단일클론항체 사람 가슴샘세포를 항원 주입한 Balb/c 흰 마우스의 비장세포와 8-아자구아닌(8-azaguanine) 내성(resistant) 마우스의 골수종세포주 SP2/0-Ag14를 융합을 통하여 만들었다.
Balb/c 흰쥐에 6주간 2주 간격으로 107개의 사람 가슴샘세포를 복강내 주사하여 면역반응을 유도하였고, 마지막 추가 접종 후 3일째에 비장을 적출하여 세포 부유액을 만들었다. 켈러와 밀스테인(Koeler & Milstein 1975)의 방법에 따라, DMEM(Dulbeco's modified Eagle's medium)에서 108개의 비장세포와 107개의 골수종 세포를 50% 폴리에틸렌글라이콜 400을 사용하여 세포 융합하였다. 융합된 세포는 세척한 후, 20% 우태아혈청, 100??M 하이포크산틴(hypoxanthine), 0.44??M 아미노프테린(aminopterin) 및 16??M 티미딘(thymidine)이 보충된 DMEM 배양액(HAT 배양액)에 재부유시키고, 세포들은 96-웰 플레이트(96-well plate)에 분주하고 37??, 5% CO2가 공급되는 배양기에서 배양하였다. 2주후 집락의 형성이 관찰되면 상청액을 취하여 항체역가를 면역조직화학염색(immunohistochemistry) 및 유세포 측정(flow cytometry)을 이용하여 측정하였다.
양성집단은 웰(well)당 105개 이상의 세포가 단일로 형성된 경우로 하였다. 상청액의 항체 역가가 높은 군락이 형성된 웰에서 세포를 취하여 제한희석시험(limiting dilution assay)방법에 따라 서브클로닝하여 항체역가가 높은 단일클론세포를 수득하였다. 단일클론세포의 배양액은 상청액을 취하여 추후 실험을 위하여 보관하였다.
1-2. 가슴샘세포의 세포 표면 단백질에 대한 항체를 생산하는 단일클론 세포 선별
흉선의 동결 조직 및 파라핀 포매조직을 4마이크로미터 두께로 박절하여 사용하였다. 파라핀 포매조직은 파라핀 제거 과정을 거친 후 정상 염소 혈청(BioGenex사 제품)을 가한 후 실온에서 1시간 방치하였다. 상기 조직에 각각 일차 항체를 도포한 후 4℃ 저온실에 하룻밤 동안 두어 반응시킨 후, 다음날 인산염완충식염수로 3회 세척하였다. 이차항체로 바이오틴 결합 염소 항- 마우스 면역 글로블린(biotinylated goat anti-mouse immunoglobulin)을 사용하여 1시간 실온에 방치한 후 인산염완충식염수로 3회 세척하고, 스트렙타비딘(streptavidin)-HRP 접합체를 처리하였다. 여기에 H2O2-아미노에틸 카바졸(H2O2-aminoethyl carbazole) 용액을 도포한 후 20분간 처치하고 인산염완충식염수로 3회 수세한 후, 광학현미경에서 발색을 관찰하였다. 그 결과, 사람 가슴샘세포에만 특이하게 반응하는 항체를 생산하는 단일클론 세포주를 선별할 수 있었다.
상기 선별한 단일클론 세포주의 상청액으로 흉선조직을 면역조직화학염색 하였으며, 가슴샘세포가 양성으로 염색됨을 확인하였다(도 1). 또한 양성으로 염색된 가슴샘세포는 세포의 주변부에 강하게 염색되는 양상을 보여, 상기 단일클론 세포주는 세포 표면 단백질에 대한 항체를 생산함을 알 수 있었다.
가슴샘세포의 발달 단계에서 상기 항체의 반응을 확인하기 위하여 유세포측정을 시행하였다. 심장수술을 위하여 적출한 사람의 흉선을 작은 조각으로 자르고, 유리슬라이드로 갈아서 가슴샘세포를 채취하였다. 분리한 가슴샘세포에 상기 항체를 30분간 4℃ 에서 반응시킨 후, 차가운 인산염완충식염수로 세척하고 FITC-가 결합된 염소 항-마우스 면역글로불린 항체를 30분간 4℃ 에서 반응시켰다. 차가운 인산염완충식염수로 세척하고 PE-가 결합된 항-CD8 항체와 APC가 결합된 항-CD4 항체를 30분간 4℃ 에서 반응시켰다. 차가운 인산염완충식염수로 세척하고 FACScalibur(Becton Dickinson, Mountain View, CA)를 이용하여 유세포측정을 시행하였다. CD4와 CD8의 발현 양상에 따라서 가슴샘세포를 CD4-CD8- 가슴샘세포 -> CD4+CD8+ 가슴샘세포 -> CD4+CD8- 혹은 CD4-CD8+ 가슴샘세포로 구분하였으며, 상기 항체는 네 종류의 가슴샘세포 에 모두 반응하였으나, 특히 CD4+CD8+ 가슴샘세포에 높게 반응하였다(도 2). 도 2에서 회색 영역은 음성대조군이며, 실선은 선별된 항체로 염색한 그래프이다.
상기 항체를 EB-1이라 명명하였다.
1-3. 선별한 단클론 세포주로부터 단클론 항체 생산
10% 우태아혈청이 포함된 DMEM 배지에서 배양한 단클론 세포 107개를 프리스탄(pristane) 0.5㎖를 3주전에 미리 복강내에 주사한 Balb/c 마우스의 복강에 주사하고, 2 - 3주 후 마우스의 복수를 채취하였다. 상기 복수에서 5-10㎎/㎖의 고농도 항체를 얻을 수 있었다.
복수로부터 항체를 정제하기 위하여, Q-세파로즈(Pharmacia 제품) 크로마토그라피 및 하이드록실아파타이드(hydroxylapatite, Bio-gel HTP Gel, Pharmacia 제품) 크로마토그라피를 시행하였다. 복수 10㎖ 당 3.14g의 암모니움 설페이트((NH4)2SO4)를 가하여 얼음위에서 서서히 녹였다(50% (NH4)2SO4 침전). 이 혼합물을 15,000rpm에서 30분간 원심분리하고, 침전물을 탈이온수(deionized water)에 녹인 후 1??의 완충액(20mM phosphate, pH7.4)에 투석하였다. 상기 용액을 완충용액(20mM phosphate, pH 7.4)으로 미리 평형시킨 Q-세파로즈 칼럼에 통과시켜 흡착시 킨 다음 완충용액Ⅰ(20mM phosphate, pH 7.4) 및 완충용액Ⅱ(20mM phosphate, 0.5M NaCl, pH 7.4)를 이용하여 NaCl의 농도구배를 0M부터 0.8M의 선형구배로 흘려주어, 용출물을 수득하였다. 각 분획은 15% SDS-PAGE하여 다량의 항체가 함유된 분획을 모았다. 상기 분획은 완충액(20mM phosphate, pH 6.8)으로 투석하고, 완충용액(20mM phosphate, pH 6.8)으로 미리 평형시킨 하이드록실아파타이트 컬럼에 통과시키면서 흡착시킨 다음, 완충용액 Ⅲ(20mM phosphate, pH 6.8) 및 완충용액Ⅳ(300mM phosphate, pH 6.8)를 이용하여 인산의 농도구배가 0M부터 0.3M까지 되도록 선형구배로 흘려주어, 용출물을 수득하였다. 분획은 15% SDS-PAGE 하여 항체의 순도가 95% 이상되는 분획만을 모았다.
상기 실험으로, 복수 1㎖당 5-10㎎의 단클론 항체를 회수할 수 있었다.
1-4. 정상 조혈세포에서 EB-1 항체의 반응성 조사
선별된 단클론 항체의 정상 조혈세포에 대한 반응성을 유세포측정법으로 조사하였다. 정상인으로부터 혈액을 채혈하거나, 탯줄 혈액을 채혈하여 EDTA 튜브에 넣고, 적혈구를 제거 하였다. 분리한 세포에 FITC-가 결합된 항-CD3 혹은 AC133 항체, PE-가 결합된 항-CD19, CD14, CD16 혹은 CD34 항체 그리고 바이오틴이 결합된 EB-1 항체를 30분간 4℃에서 반응시킨 후, 차가운 인산염완충식염수로 세척하였고, APC가 결합된 스트렙타비딘(streptavidine)을 30분간 4℃에서 반응시켰다. 차가운 인산염완충식염수로 세척하고 FACScalibur를 이용하여 유세포측정을 시행하였다. 염색강도는 형광강도에 대한 log로 측정하고 10승 단위로 표시하였다. 대조군은 EB-1 항체를 제외한 나머지 항체로 염색후 사용하였다. 이 방법으로 측정하여 양성률이 10% 이상인 표본을 양성으로 판정하였다. 표 2는 유세포측정법으로 정상세포에서의 EB-1 단클론 항체의 반응성을 나타낸 것으로, 정상의 가슴샘세포만 발현되었고 성숙 적혈구, 백혈구 및 혈소판에서는 발현되지 않았다. 그리고 골수 및 탯줄혈액(cord blood)내의 조혈줄기세포인 CD34+AC133+ 세포에서 발현되지 않았다.
도 3은 정상 조혈세포에서 유세포측정 결과의 대표적인 예를 나타낸 것이다. 도 3에서 회색 영역은 음성대조군이며, 실선은 EB-1 항체로 염색한 그래프이다.
1-5. 정상 세포 및 조직에서 EB-1 항체의 반응성 조사
하기 표 3의 35개의 정상 조직에 대하여 EB-1 항체로 면역조직화학염색을 실시하였고, 그 결과를 표 4에 나타내었다. 그 결과, 흉선을 제외하고는 모든 조직에서 EB-1 항체에 대하여 음성 반응성을 나타내었다.
흉선에서는, EB-1 항체가 저온보존(cryoconserved) 또는 포르말린 고정된 파라핀 포매 조직 모두에 동일하게 작용하였다.
또한 CD43 항원 발현은 비-조혈세포뿐만 편도선, 림프절, 비장과 같은 정상
림프조직에서 검출되지 않았다(표 3).
Figure 112005046769405-pat00001
장 기 실험개수 양성개수 장 기 실험개수 양성개수
림프기관 소화기계
림프절 18 0 식도 3 0
편도 3 0 위 10 0
흉선 6 6 소장 2 0
비장 4 0 대장 2 0
간 7 0
신경계 췌장 4 0
대뇌 4 0 충수돌기 4 0
소뇌 4 0 기타 장기
생식기 폐 8 0
고환 2 0 신장 9 0
난소 8 0 부신 5 0
자궁 4 0 피부 4 0
1-6. 정상 골수세포에서 EB-1 항체의 반응성 조사
정상 골수세포에서 EB-1 항체의 반응성을 유세포측정으로 조사하기 위하여 골수세포를 FITC가 결합된 항-CD10, 항-CD33, 항-CD38, 항-CD71 혹은 항-AC133 항체와 PE가 결합된 항-CD34 항체, 그리고 바이오틴이 결합된 EB-1 항체로 30분간 4℃ 에서 반응시킨 후, 차가운 인산염완충식염수로 세척하고 APC가 결합된 스트렙타비딘으로 30분간 4℃ 에서 반응시켰다. 차가운 인산염완충식염수로 세척하고 FACScalibur를 이용하여 유세포측정을 시행하였다. 도 4는 CD34-양성 세포 중 각 항체와 EB-1 항체의 염색성을 나타낸 실험결과이다. AC133-양성(도 4A) 혹은 CD38을 낮게 발현하는(도 4B) CD34-양성 조혈줄기세포에서 EB-1는 음성이었다. 단핵과립구와 거대핵세포(megakaryocyte)로 분화할 수 있는 CD33-양성 CD34-양성 세포(도 4D)와 적혈구 전구세포인 CD71이 높게 발현되는 CD34-양성 세포(도 4E)도 EB-1 음성이었으며, 림프구 전구세포인 CD10-양성 CD34-양성 세포(도 4C)는 EB-1 양성이었다.
상기 실시예의 결과를 종합하며, EB-1 항체는 골수내 림프구 전구세포를 포함한 일부세포와 가슴샘세포를 제외한 모든 조혈세포 및 비-조혈세포에는 발현되지 않는다.
실시예 2: 단클론 항체에 대한 항원 분석
2-1. 항원 클로닝
2-1-1. cDNA 라이브러리 제작
폴리(A)+RNA 및 pcDNA3 발현벡터(Invitrogen, San Diego, CA)를 이용하여 사람 가슴샘세포 cDNA 라이브러리를 제작하였다. 상기 라이브러리는 3.5 x 106 개의 독립된 클론을 포함한다. 숙주세포로는 Escherichia coli MC1061/P3를 사용하였다. GD3 합성효소 cDNA 클론인 pD3T-31(Haraguchi et al., 1994)의 XhoI 절편을 pMIK/Neo 발현벡터에 삽입하여 pMIK/D3T-31 벡터를 제조하였다.
2-1-2. 형질전환체 제조
상기 cDNA 라이브러리의 플라스미드들을 증폭시킨 후 pMIK/D3T-31 벡터와 함께 DEAE-덱스트란(Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden)을 이용하여 293T 세포에 도입하였다(Davis et al., 1986). 10cm 배양접시상에서 1.5 x 106개의 293T 세포에 cDNA 라이브러리 플라스미드 및 pMIK/D3T-31 각 8(g을 도입하였다. 60시간 후 형질전환 세포는 배양접시에서 탈착하고, 실시예 1의 단클론 항체를 1:200로 처리하여 45분간 얼음상에 두었다. 세포는 염소 항-마우스 면역글로불린 항체(Cappel, Durham, NC)로 코팅한 배양판에 옮겼다(Wysocki & Sato, 1978). 배양판을 세척한 뒤 배양판에 부착된 세포를 얻어 이를 세포로부터 플라시미드 DNA를 회수한 후 이를 다시 293T 세포에 도입하였다. 확장된 플라스미드 DNA는 다시 형질도입하였고 상기 동일한 과정을 4회이상 반복실시하였다.
2-1-3. 단클론 항체에 양성반응을 갖는 형질전환체 선별
상기 형질전환체를 대상으로 EB-1 항체에 대한 반응성을 검색하였다. 이후, 두개의 양성 집단으로부터 17개의 클론을 검출하였고, 직접 항원 단백질을 발현하는 3개의 단일 클론을 유세포측정으로 분리하였다.
형질전환 세포에 EB-1 단클론 항체를 30분간 4℃에서 반응시킨 후, 차가운 인산염완충식염수로 세척하고 FITC-가 결합된 염소 항-마우스 면역글로불린 항체를 30분간 4℃ 에서 반응시켰다. 차가운 인산염완충식염수로 세척하고, FACScalibur를 이용하여 유세포측정하였다. 대조군은 293T 세포를 이차 항체로 염색후 사용하였다.
상기 실험으로 EB-1 단클론 항체에 대하여 양성반응을 갖는 클론을 확보하였다.
2-2. 항원의 염기서열 분석
상기 실험에서 확보한 클론의 플라스미드 DNA를 수득하고, XhoI 및 HindIII 로 절단한 다음 이를 pBSK(phagemid BlueScript KS(+)) 벡터에 삽입하였다. 상기 클론은 Kilo-Sequence 검출 키트를 이용하여 돌연변이를 검출하였다. 서열분석은 T3/T7 염색 프라이머, 또는 PRISM 염색 터미네이터 사이클 서열분석 키트 및 DNA 서열분석기(Applied Biosystems, Foster City, CA)를 이용한 4개의 디데옥시 터이네이터를 이용하여 디옥시뉴클레오타이드 터미네이션 서열 분석을 실시하였다. 분석된 염기서열을 Blast 검색한 결과 CD43인 것으로 확인되었다. 즉, EB-1 단클론 항체는 CD43을 인지하는 것이다.
2-3. CD43에 대한 항체 분석
EB-1 단클론 항체가 CD43을 인지하는 항체인지 확인하기 위하여, CD43에 대한 단클론 항체(DFT-1)를 다이노나사(DiNonA, Seoul, Korea)로부터 구입하였다.
도 5는 단클론 항체 EB-1에 대하여 양성반응을 갖는 형질전환체에 대한 유세포측정결과를 나타낸 것으로, EB-1 단클론 항체는 DFT-1 단클론 항체를 반응시켰을 때와 동일한 반응성을 나타내었다.
CD43 단백질은 당쇄화를 포함하고 있어, EB-1 항체가 CD43 단백질의 당쇄화 부분에 결합하는지는 확인하고자 하였다. CD43-양성 Molt-4 세포에 시알리데이즈(sialidase)를 처리한 후 EB-1 항체를 반응시켜 유세포 측정을 통하여 항원-항체 반응성을 확인하였고, 웨스턴 블롯을 실시하였다.
도 6은 시알리데이즈 처리한 Molt-4 세포에 대한 EB-1 항체의 반응성을 측정한 유세포측정 그래프로서, 점선 곡선은 음성 대조군이고, 곡선은 시알리데이즈 비처리 세포이고, 진한 곡선은 시알리데이즈 처리 세포이다. 즉, EB-1 항체의 반응성은 시알리데이즈 처리 여부에 상관없이 일정하게 유지됨을 알 수 있으며, 따라서, EB-1항체가 인지하는 CD43의 항원결정부위는 시알리데이즈로 제거되지 않은 당쇄화 부위이거나, 비당쇄화 부위임을 추정할 수 있다.
도 7은 시알리데이즈를 처리한 사람 가슴샘세포(A 및 B) 및 Molt-4 세포(C 및 D)에 대한 EB-1 항체의 반응성을 웨스턴 블롯으로 분석한 것으로, A 및 C는 시알리데이즈 처리전이고, B 및 D는 시알리데이즈 처리후이다. 도 7에서, 시알리데이즈 처리한 이후에도 사람 가슴샘세포 및 Molt-4 세포는 여전히 EB-1 항체에 대한 반응성을 유지하였다.
실시예 3: CD43 의 항원결정부위 분석
3-1. CD43 일부 절편을 포함하는 구조체 구축
본 실험에서는 도 8에 도시한 바와 같이, 각각의 CD43 결손형돌연변이를 제작하고, 상기 결손형돌연변이에 대한 EB-1 항체의 반응성을 확인하여 CD43의 항원결정부위를 분석하고자 하였다. CD43 단백질은 총 400개의 아미노산으로 이루어지며 1에서 19번째 아미노산 서열은 신호서열이고, 20에서 254번째 아미노산 서열은 세포외 도메인이고, 255에서 277번째 아미노산 서열은 트랜스멤브레인 도메인이고, 278에서 400번째 아미노산 서열은 세포내 도메인이다.
결손형돌연변이 각각은 글루타티온-S-전이효소(Glutathione-S- transferase, GST)의 C 말단에 융합 발현되도록 DNA 구조체를 제작한 후 이를 pGEX-2T(Pharmacia Biotech Inc., Piscataway, NJ) 벡터에 삽입하였다. 이하 CD43 단백질의 1에서 253번째 아미노산 서열을 포함하는 벡터를 pGEX1-253라 하고, 1에서 98번째 아미노산 서열을 포함하는 벡터를 pGEX1-98, 1에서 87번째 아미노산 서열을 포함하는 벡터를 pGEX1-87, 1에서 87번째 아미노산 서열을 포함하는 벡터를 pGEX1-81, 1에서 75번째 아미노산 서열을 포함하는 벡터를 pGEX1-75, 1에서 70번째 아미노산 서열을 포함하는 벡터를 pGEX1-70, 70에서 98번째 아미노산 서열을 포함하는 벡터를 pGEX70-98라 하였으며, 상기와 동일한 원리로 pGEX71-81, pGEX76-81, pGEX73-81, 그리고 pGEX73-80라 명하였다.
결손형돌연변이를 코딩하는 서열은 사람 CD43 cDNA로부터 증폭시켜 사용하였고, PCR 프라이머는 Genebank상의 서열로부터 제작하고 다만 BamHI/EcoRI 또는 BamHI/BglII 제한효소부위가 포함되도록 하였다. PCR 산물은 BamHI/EcoRI 또는 BamHI/BglII 로 절단한 후 동일 제한효소 부위의 pGEX-2T에 연결시킨 후 E. coli 컴피턴트 TOP10F' 세포[F' [lacIq, Tn10(TetR)], mcrA, D(mrr-hsdRMS-mcrBC), 80lacZDM15, lacX74, deoR, recA1, araD139 D(ara-leu)7697, galK, rpsL(StrR), endA1, nupG]에 형질도입하였다. 형질전환체의 염기서열은 분석하여 결손형돌연변이 서열을 재확인하였다.
3-2. GST-CD43 결손형돌연변이체 융합단백질의 발현
형질전환된 E. coli TOP10 세포는 50(g/ml의 암피실린이 첨가된 LB배지에서 37??로 하룻밤 배양하고, 배양된 세포를 LB 배지로 20배 희석한 다음 OD 0.6이 되도록 3 내지 4시간 배양하였다. 배양물에 IPTG(Sigma Chemical Co., St. Louis, MO)를 최종농도 1mM로 첨가하여 4시간 더욱 배양한 후 6,000g에서 15분간 원심분리하였다. 세포만을 수득하고 세포 1g 당 3ml의 용해(lysis) 완충액(50mM Tris, pH 8.0, 1mM EDTA, 100mM NaCl)으로 현탁한 후 최종농도 0.2mM 페닐메틸설포닐 플로라이드(phenylmethylsulfonyl fluoride, Sigma Chemical Co.)를 가한 다음 30분간 얼음위에 두었다.
3-3. CD43 항원결정부위 분석
총 11종의 결손형돌연변이를 발현하는 각각의 형질전환체의 용해질(lysate)을 10% SDS-PAGE한 후, EB-1 항체 및 항-GST 항체로 각각 웨스턴 블롯을 실시하였다.
도 9는 11종의 결손형돌연변이에 대한 EB-1 항체의 반응성을 확인한 웨스턴 블롯으로, A는 EB-1 항체를 사용한 것이고, B는 GST 항체를 사용한 것이다. 또한 레인1은 pGEX1-253이고, 레인2는 pGEX1-98이고, 레인3은 pGEX1-87이고, 레인4는 pGEX1-81이고, 레인5는 pGEX1-75이고, 레인6은 pGEX1-70이고, 레인7은 pGEX70-99이고, 레인8은 pGEX71-81이고, 레인9는 pGEX73-81이고, 레인10은 pGEX76-81이고, 레인11은 pGEX73-80이고, 레인12는 pGEX-2T이고, 레인13은 인간 가슴샘세포이다. 도 9에 나타난 바와 같이, EB-1 항체에 대하여 반응성을 갖는 최소 단위의 결손형돌연변이는 pGEX73-81로 확인되어, CD43의 항원결정기는 73 내지 81번째 아미노산 서열(Glu Gly Ser Pro Leu Trp Thr Ser Ile)임을 알 수 있다.
상기 실시예들을 종합하면, EB-1는 기존에 알려진 다른 항체들과는 달리 CD43 당단백의 당성분이 아닌 73-81번째 아미노사 서열을 직접 인지하며, 이 서열은 조혈세포 발달단계중 주로 림프구 전구세포와 가슴샘세포에서는 노출되어 EB-1 항체가 인지할 수 있고, 조혈줄기세포와 성숙 백혈구 및 혈소판에서는 78-81번째 아미노산 서열 주위의 당화나 구조 변화로 가려져서 EB-1 항체가 인지하지 못 함을 알 수 있다.
실시예 4: 백혈병 및 림프종 세포에서 단클론 항체의 반응성
4-1. 백혈병 세포에서 단클론 항체의 반응성
백혈병세포에서 EB-1 단클론 항체의 반응성을 조사하기 위하여 백혈병으로 진단 받은 총 38예의 말초혈액내 백혈병 세포에서 EB-1 단클론 항체의 반응성을 유세포측정법으로 조사하였다. 백혈병 환자로부터 혈액을 채혈하여 EDATA 튜브에 넣고, Ficoll-Hypaque 밀도 구배 원심분리로 말초혈액내 단핵세포(peripheral blood mononuclear cells, PBMC)를 분리하였다. 분리한 세포에 FITC-가 결합된 항체를 30분간 4??에서 반응시킨 후, 차가운 인산염완충식염수로 세척하고 FACScalibur를 이용하여 유세포측정하여 양성률이 10%이상인 표본을 양성으로 판정하였다. 총 38예의 백혈병중 31예(81.6%)가 양성이었으며, 이중 급성골수백혈병의 90.9%(22예중 20예), 급성림프구백혈병의 69.2%(13예중 9예)가 양성이었으며, 모세포위기가 발생한 만성골수백혈병의 66.7%(3예중 2예)에서도 양성이었다. 이를 종합하면 표 4와 같으며 도 10은 대표적인 유세포측정 결과이다. 도 10에서 회색 영역은 음성대조군이며, 실선은 EB-1 항체로 염색한 그래프이다.
백혈병종류 증례수 항체반응 양성
증례수 백분율
급성골수백혈병 M1 M2 M2 M4 기타 22 6 8 1 4 3 20 6 7 1 4 2 90.9 100.0 87.5 100.0 100.0 66.7
급성림프구백혈병 13 9 69.2
만성골수백혈병의 모세포위기 3 2 66.7
계 38 31 81.6
4-2. 림프종 세포에서 단클론 항체의 반응성
림프모구 림프종 조직을 대상으로, 실시예 1-2에 기술된 방법으로 면역조직화학염색법을 시행하여 림프종 세포에서 EB-1 항체의 반응성을 조사하였다. 총 9예의 림프모구 림프종 중 4예(44.4%)에서 EB-1이 양성 반응을 보였다 (도 11)
실시예 5: 단클론 항체의 백혈병 치료효과
EB-1 단클론 항체의 치료 목적으로의 사용 가능성을 조사하기 위하여 다음과 같은 동물 실험을 시행하였다.
5-1. 단클론항체에 사포린(saporin)이 접합된 접합물 제조
단클론항체의 사포린(Sigma, St. Louis, MO) 접합은 기존 방법에 따라 실시하였다(Polito et al., 2004). 항체와 사포린을 각각 2 mg/ml과 8 mg/ml의 농도로 50 mM sodium borate buffer(pH 9.0)에 녹인 후 2-iminothiolane(Sigma)를 각각 0.4 mM과 1.0mM 농도로 처리하였다. 그 후, 항체와 사포린을 10:1의 비율로 혼합하여 실온에서 16시간 반응시키고 항체-사포린 접합체를 젤여과(gel filtration)로 정제하였다.
이하 사포린 접합된 EB-1 단클론항체는 EB-1-사포린 접합체라 기재한다.
5-2. EB-1-사포린 접합체의 백혈병 치료 효과
EB-1-사포린 접합체의 백혈병 치료 효과는 EB-1-양성인 CCRF-CEM 세포를 이용하였다. RAG-1 유전자 결핍 마우스의 꼬리정맥에 2 x 106개의 CCRF-CEM 세포를 주사하였다. 7일후부터 이틀 간격으로 총 4회에 걸쳐서 EB-1 항체 단독 혹은 EB-1-사포린 접합체를 한번에 100 마이크로그램씩 정맥으로 투여하였다. 4주째 각 마우스의 안와정맥총에서 혈액을 채취한 뒤, 적혈구를 제거하고 FITC-가 결합된 EB-1 항체와 PE-가 결합된 항-사람 MHC I 항체로 30분간 4℃ 에서 반응시킨 후, 차가운 인산염완충식염수로 세척하고 FACScalibur를 이용하여 유세포측정하였다. 도 12에 나타낸 바와 같이 대조군에서는 말초혈액내 세포중 23.4%가 백혈병 세포였으나, EB-1 항체 단독 처리만으로도 백혈병 세포가 11.3%로 감소하였고, EB-1-사포린 접합체를 처리하면 말초혈액내 백혈병 세포가 1.3%로 크게 감소하였다.
실시예 6: CD43 아미노산 서열(Glu Gly Ser Pro Leu Trp Thr Ser Ile)-특이 항체의 제조
5-1. CD43 아미노산 서열(Glu Gly Ser Pro Leu Trp Thr Ser Ile)-특이 항체의 제조
CD43 cDNA중 Glu Gly Ser Pro Leu Trp Thr Ser Ile 서열을 포함하는 70 내지 98번째 아미노산 서열을 부호화(coding)하는 DNA 조각을 pQE-40 벡터에 삽입하였고, 이를 E.coli 컴피턴트 TOP10F' 세포에 형질도입하였다.
형질전환된 E.coli TOP10F' 세포는 실시예 3-2에 기술된 방법으로 배양하였고, 형질전환체의 용해질을 니켈칼럼(Nickel column; Pharmacia Biotech Inc., iscataway, JN)에 걸어서 CD43 펩타이드를 분리하였다.
분리한 CD43 펩타이드 100(g을 완전프로인트항원보강제(complete Freund's adjuvant)와 1:1로 혼합하여 Babl/c 마우스에 주사하였다. 4주후, 2주간격으로 2회에 걸쳐 CD43 펩타이드 100(g을 불완전프로인트항원보강제(incomplete Freund's adjuvant)와 1:1로 혼합하여 마우스 복강에 다시 주사하였다.
마지막 추가 접종 후 3일째 비장을 적출하여 세포부유액을 만들었으며, 실시예 1-1예 기술된 방법으로 단클론항체를 생산하는 세포를 제조하였으며, 생산된 세포의 세포배양액으로 사람 CD43 유전자를 삽입한 EL4 마우스 세포를 염색한 후 유세포측정을 시행하여, 반응하는 단일클론 세포주를 2개 얻어 이를 각각 EB-2와 EB-3로 명명하였다 (도 13). 도 13에 나타낸 바와 같이, EB-1 항체와 유사하게, 이 두 종류의 단세포항체는 사람 CD43 유전자를 삽입한 EL4 세포주와 정상 사람 가슴샘세포에는 양성이었고, 정상 사람 혈액 백혈구에는 음성이었으나, 급성 백혈병 세포에는 양성이었다.
5-2. 새로운 항-CD43 항체가 인지하는 CD43의 항원결정부위 분석
실시예 3에 기술된 CD43의 결손형돌연변이에 대한 EB-1 및 EB-2 항체의 반응성을 웨스턴 블롯으로 확인하였다(도 13). 도 13에 나타낸 바와 같이 두 항체 중 EB-3 항체는 EB-1 항체와 유사하게 CD43의 73 내지 81번째 아미노산 서열(Glu Gly Ser Pro Leu Trp Thr Ser Ile)을 인지하였으나, EB-2 항체는 CD43의 76 내지 81번째 아미노산 서열(Pro Leu Trp Thr Ser Ile)을 인지하였다.
이상 살펴본 바와 같이, 본 발명의 CD43의 항원결정부위는 급성 백혈병, 모세포위기가 발생한 만성 백혈병 및 림프모구 림프종 세포의 세포표면에 특이적으로 발현되어, 상기 질환의 진단에 매우 유용하다. 또한 CD43 항체는 독소물질을 접합시킴으로써 정상세포에 심각한 영향 없이 림프종 세포 및 백혈병 세포만을 특이적으로 사멸시켜, 상기 질환의 치료제로 사용할 수 있다.
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서열목록 전자파일 첨부

Claims (26)

  1. SEQ ID NO: 1(Pro Leu Trp Thr Ser Ile)에 기재된 아미노산 서열을 갖는 CD43의 항원결정부위(epitope)인 폴리펩타이드.
  2. 삭제
  3. SEQ ID NO:2(Glu Gly Ser Pro Leu Trp Thr Ser Ile) 기재된 아미노산 서열중에서 SEQ ID NO: 1(Pro Leu Trp Thr Ser Ile)의 아미노산 서열을 필수적으로 포함하는 아미노산 6개 내지 9개로 구성되는 펩타이드로 이루어지는 군에서 선택되는 CD43의 항원결정부위(epitope)인 폴리펩타이드.
  4. 제 3항에 있어서, 상기 항원결정부위는 SEQ ID NO: 2의 아미노산 서열을 갖는 것인 폴리펩타이드.
  5. 제 1항 또는 3항에 있어서, 상기 SEQ ID NO: 1에 기재된 아미노산 서열은 인간 CD43의 76번째 아미노산부터 81번째 아미노산 서열인 것인 폴리펩타이드.
  6. 제 4항에 있어서, 상기 SEQ ID NO: 2에 기재된 아미노산 서열은 인간 CD43의 73번째 아미노산부터 81번째 아미노산 서열인 것인 폴리펩타이드.
  7. 다음과 같이 정의되는 펩타이드를 갖는 CD43 항원결정부위를 특이적으로 인지하는 항체 또는 항체 절편:
    i) SEQ ID NO: 1에 기재된 아미노산 서열을 갖는 펩타이드,
    ii) SEQ ID NO:2(Glu Gly Ser Pro Leu Trp Thr Ser Ile) 기재된 아미노산 서열을 갖는 펩타이드, 또는
    iii) SEQ ID NO:2(Glu Gly Ser Pro Leu Trp Thr Ser Ile) 기재된 아미노산
    서열중에서 SEQ ID NO: 1(Pro Leu Trp Thr Ser Ile)의 아미노산 서열을 필수적으로 포함하는 아미노산 6개 내지 9개로 구성되는 펩타이드로 이루어지는 군에서 선택되는 펩타이드.
  8. 삭제
  9. 제 7항에 있어서, 상기 항원결정부위는 급성 백혈병, 모세포위기가 발생한 만성 백혈병 및 림프모구 림프종 세포 표면에 특이적으로 발현되는 것으로 이를 인지하는 항체 또는 항체 절편.
  10. 제 7항에 있어서, 상기 항체 또는 항체 절편은 SEQ ID NO: 1에 기재된 아미노산 서열을 갖는 CD43 항원결정부위인 폴리펩타이드를 항원으로 하여 제조되며, SEQ ID NO: 1에 기재된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 인지하는 항체 또는 항체 절편.
  11. 제 10항에 있어서, 상기 항체 또는 항체 절편은 SEQ ID NO: 2에 기재된 아미노산 서열을 갖는 CD43 항원결정부위인 폴리펩타이드를 항원으로 하여 제조되며, SEQ ID NO: 2에 기재된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 인지하는 항체 또는 항체 절편.
  12. 제 7항에 있어서, 상기 항체는 단클론 또는 다클론 항체인, 항체 또는 항체 절편.
  13. 제 7항에 있어서, 상기 항체는 사람 또는 동물의 항체인 항체 또는 항체 절편.
  14. 제 7항에 있어서, 상기 항체 또는 항체 절편은 방사선동위원소, 형광물질, 발광물질, 효소, 크로모젠(chromogen) 또는 염색 물질로 구성된 군에서 선택된 물질로 표지된 것인 항체 또는 항체 절편.
  15. 제 7항에 있어서, 상기 항체 또는 항체 절편은 방사선동위원소, 독소 화합물, 독소 단백질 및 항암제로 이루어진 군으로부터 선택되는 독성물질이 접합된 것인 항체 또는 항체 절편.
  16. 제 15항에 있어서, 상기 항체 또는 항체 절편은 독성 물질과 결합되어 융합단백질(fusion protein)을 형성하는 것인 항체 또는 항체 절편.
  17. 제 7항, 및 9항 내지 제13항중 어느 한항에 따른 CD43 항원결정부위에 대한 항체 또는 항체 절편을 생산하는 세포주.
  18. 제 7항, 및 9항 내지 제 16항중 어느 한항에 따른 CD43에 대한 항체 또는 항체 절편을 유효성분으로 포함하고, 백혈병 세포를 포함하는 시료와 상기 항체 또는 항체 절편의 양성반응을 나타내는 시료를 급성 백혈병으로 판단하는, 급성 백혈병 진단용 조성물.
  19. 제 18항에 있어서, 양성반응은 효소 반응, 형광, 발광 또는 방사선을 검출하여 판단하는 것인 급성 백혈병 진단용 조성물.
  20. 제 7항, 및 9항 내지 16항중 어느 한항에 따른 CD43에 대한 항체 또는 항체 절편을 유효성분으로 포함하고, 모세포위기가 발생한 만성 백혈병 세포를 포함하는 시료와 상기 항체 또는 항체 절편의 양성반응을 나타내는 시료를 모세포위기가 발생한 만성 백혈병으로 판단하는, 모세포위기가 발생한 만성 백혈병 진단용 조성물.
  21. 제 7항, 및 9항 내지 제 16항중 어느 한항에 따른 CD43에 대한 항체 또는 항체 절편을 유효성분으로 포함하고, 모세포위기가 발생한 만성 백혈병 세포를 포함하는 시료와 상기 항체 또는 항체 절편의 양성반응을 나타내는 시료를 림프모구 림프종으로 판단하는, 림프모구 림프종 진단용 조성물.
  22. 제 7항, 및 9항 내지 제 16항중 어느 한항에 따른 항체와 약리학적으로 허용가능한 부형제를 포함한 급성 백혈병 치료제.
  23. 제 7항, 및 9항 내지 제 16중 어느 한항에 따른 항체와 약리학적으로 허용가능한 부형제를 포함한 모세포위기가 발생한 만성 백혈병 치료제.
  24. 제 7항, 및 9항 내지 제 16항중 어느 한항에 따른 항체와 약리학적으로 허용가능한 부형제를 포함한 림프모구 림프종 치료제.
  25. 제 7항, 및 9항 내지 제 16항중 어느 한항에 따른 항체를 포함하는 백혈병 진단용 키트.
  26. 제 7항, 및 9항 내지 제 16항중 어느 한항에 따른 항체를 포함하는 림프종 진단용 키트.
KR1020050077906A 2005-05-11 2005-08-24 급성백혈병- 및 림프모구 림프종 특이 ｃｄ43의항원결정부위 및 이의 용도 KR100738401B1 (ko)

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